TW201819403A

TW201819403A - 雜合神經毒素

Info

Publication number: TW201819403A
Application number: TW106133552A
Authority: TW
Inventors: 伊莉娜方富瑞蘇比羅斯; 大衛伯金
Original assignee: 英商艾普森生物製藥有限公司
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2018-06-01
Also published as: JP2022081642A; JP7118055B2; WO2018060351A1; US20210277071A1; CN109790204A; RU2019112106A; JP2019531733A; TWI796305B; EP3519430A1; RU2019112106A3

Abstract

本發明係關於一種包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分(selective ganglioside binding moiety)之雜合神經毒素及其於治療之用途。

Description

雜合神經毒素

本發明係關於具有增進治療性質之雜合神經毒素，特別是對神經節苷脂更具選擇性之結合親和力。

梭狀芽孢桿菌屬(genus Clostridia)中的細菌產生高強力且特異性的蛋白質毒素，其可毒害其此等被遞送至的神經元及其他細胞。此種梭狀芽孢桿菌毒素之例包括由破傷風桿菌(C.tetani)所產生的神經毒素(TeNT)及由肉毒桿菌(Clostridia botulinum)血清型A-G所產生的神經毒素(BoNT)、以及由巴氏梭菌(C.baratii)及酪酸梭菌(C.butyricum)所產生的神經毒素。

於梭狀芽孢桿菌神經毒素中有一些為已知最強效力的毒素。舉例而言，肉毒桿菌神經毒素依其血清型而定，對於小鼠具有範圍從0.5至5ng/kg之半數致死劑量(LD₅₀)值。破傷風及肉毒桿菌毒素兩者係藉由抑制受影響之神經元的功能而作用，特別是神經傳導物的釋放。而肉毒桿菌毒素作用於神經肌肉會合處且於周圍神經系統中抑制膽鹼性傳導，而破傷風毒素則作用於中樞神經系統。

自然界中，梭狀芽孢桿菌神經毒素係以單鏈多肽的方式被合成，其係藉由蛋白酶切割事件進行轉譯後修飾，而形成藉由雙硫鍵連結在一起的兩條多肽鏈。切割發生於特定切割位(cleavage site)，通常稱為活化位(活化位)，其位於提供鏈間(inter-chain)雙硫鍵之半胱胺酸殘基之間。其為此種雙鏈型，為此毒素之最活性型式。此兩條鏈被稱為：重鏈(H-鏈)，其具有大約100kDa之分子量；及輕鏈(L-鏈)，其具有大約50kDa之分子量。此H-鏈包含N-端轉位組件(translocation component)(H_N域)及C-端目標組件(targeting component)(H_C域)。切割位係位於L-鏈及轉位域組件之間。於H_C域結合至其目標神經元且所結合的毒素經由胞內體(endosome)內化至細胞中後，H_N域將L-鏈轉位通過胞內體膜並進入細胞質液內，且L-鏈提供一種蛋白酶功能(亦已知為無細胞毒性蛋白酶)。

無細胞毒性蛋白酶係藉由將已知為SNARE蛋白質(例如，SNAP-25、VAMP、或突觸融合蛋白(syntaxin))之細胞內運輸蛋白進行蛋白酶切割而作用-參見Gerald K(2002)「Cell and Molecular Biology」(第4版)John Wiley & Sons,Inc.。首字母縮略詞SNARE衍生自可溶性NSF附著受體(Soluble NSF Attachment Receptor)一詞，其中NSF意指N-乙基馬來醯亞胺-敏感性因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白質對於細胞內囊泡融合為不可或缺的，因此對於自細胞經由囊泡運輸之分子分泌為不可或缺的。此蛋白酶功能為鋅依賴型內肽酶(zinc-dependent endopeptidase)活性且展現對SNARE蛋白質之高受質特異性。因此，一旦被遞送至所欲標的細胞，此無細胞毒性蛋白酶能夠抑制來自標的細胞的細胞分泌。梭狀芽孢桿菌神經毒素之L-鏈蛋白酶係切割SNARE蛋白質之無細胞毒性蛋白酶。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F及BoNT/G之L-鏈蛋白酶切割VAMP，BoNT/A及BoNT/E之L-鏈蛋白酶切割SNAP25且BoNT/C之L-鏈蛋白酶切割SNAP25及突觸融合蛋白兩者，其造成神經傳導物釋放的抑制及隨後的神經麻痺(Rossetto,O.et al.,"Botulinum neurotoxins：genetic,structural and mechanistic insights." Nature Reviews Microbiology 12.8(2014)：535-549)。

鑑於SNARE蛋白質之普遍存在的性質，梭狀芽孢桿菌神經毒素如肉毒桿菌毒素已被成功地應用於廣泛的療法。目前，包含BoNT的所有批准的藥物/化妝品製劑皆含有自梭狀芽孢桿菌株純化的天然存在的神經毒素(於DYSPORT®、BOTOX®或XEOMIN®的情形為BoNT/A，於MYOBLOC®的情形為BoNT/B)。

舉例而言，吾人參考William J.Lipham,Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin(Slack,Inc.,2004)，其描述梭狀芽孢桿菌神經毒素諸如肉毒桿菌神經毒素(BoNTs)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F及BoNT/G、以及破傷風神經毒素(TeNT)之用途，其係用於在許多治療及化妝或美容之應用中抑制神經元傳導，例如市售肉毒桿菌毒素產品目前被核准作為包括下列適應症之治療劑：局部痙攣狀態、上肢痙攣狀態、下肢痙攣狀態、頸肌張力不全(cervical dystonia)、瞼痙攣、半面痙攣、腋多汗症(hyperhidrosis of the axillae)、慢性偏頭痛、神經性逼尿肌過動(neurogenic detrusor overactivity)、眉間紋(glabellar lines)、及嚴重魚尾紋(lateral canthal lines)。此外，梭狀芽孢桿菌神經毒素療法被描述用於治療神經肌肉障礙(參見US 6,872,397)；用於治療子宮障礙(uterine disorders)(參見US 2004/0175399)；用於治療潰瘍及胃食道逆流疾病(參見US 2004/0086531)；用於治療肌張力不全(dystonia)(參見US 6,319,505)；用於治療眼障礙(eye disorders)(參見US 2004/0234532)；用於治療瞼痙攣(參見US 2004/0151740)；用於治療斜視(參見US 2004/0126396)；用於治療疼痛(參見US 6,869,610、US 6,641,820、US 6,464,986、及US 6,113,915)；用於治療纖維肌痛(參見US 6,623,742、US 2004/0062776)；用於治療下背痛(參見US 2004/0037852)；用於治療肌肉傷害(參見US 6,423,319)；用於治療竇性頭痛(參見US 6,838,434)；用於治療緊張性頭痛(參見US 6,776,992)；用於治療頭痛(參見US 6,458,365)；用於減緩偏頭痛疼痛(參見US 5,714,469)；用於治療心血管疾病(參見US 6,767,544)；用於治療神經障礙(neurological disorders)諸如帕金森氏病(Parkinson's disease)(參見US 6,620,415、US 6,306,403)；用於治療神經精神障礙(neuropsychiatric disorders)(參見US 2004/0180061、US 2003/0211121)；用於治療內分泌障礙(endocrine disorders)(參見US 6,827,931)；用於治療甲狀腺障礙(thyroid disorders)(參見US 6,740,321)；用於治療膽鹼性影響的汗腺障礙(cholinergic influenced sweat gland disorders)(參見US 6,683,049)；用於治療糖尿病(參見US 6,337,075、US 6,416,765)；用於治療胰臟障礙(pancreatic disorder)(參見US 6,261,572、US 6,143,306)；用於治療癌症諸如骨腫瘤(參見US 6,565,870、US 6,368,605、US 6,139,845、US 2005/0031648)；用於治療耳障礙(otic disorders)(參見US 6,358,926、US 6,265,379)；用於治療自主神經系統障礙(autonomic disorders)諸如胃腸肌肉障礙及其他平滑肌功能異常(參見US 5,437,291)；用於治療與皮膚細胞增生性障礙有關的皮膚病灶(參見US 5,670,484)；用於處理神經性發炎性障礙(inflammatory disorders)(參見US 6,063,768)；用於減緩掉髮及刺激毛髮生長(參見US 6,299,893)；用於治療下垂嘴(downturned mouth)(參見US 6,358,917)；用於降低食慾(參見US 2004/40253274)；用於牙齒療法及處置(參見US 2004/0115139)；用於治療神經肌肉障礙及症狀(參見US 2002/0010138)；用於治療各種障礙及症狀以及相關的疼痛(參見US 2004/0013692)；用於治療由黏膜過度分泌造成的症狀，諸如氣喘及COPD(參見WO 00/10598)；及用於治療非神經元性症狀諸如炎症、內分泌症狀、外分泌症狀、免疫症狀、心血管症狀、骨症狀(參見WO 01/21213)。藉由引用將所有上述出版物全文併入本文。

然而，天然BoNTs並未區分神經肌肉會合處或不同類型神經元的空間分布，這可能導致副作用。例如，以BoNT治療上肢痙攣狀態可能會導致不良事件，諸如口乾及吞嚥困難(Nair,K.P.,and Jonathan Marsden."The management of spasticity in adults." Bmj 349(2014)：g4737.)。

增加梭狀芽孢桿菌神經毒素對於特定神經元群體的特異性將允許訂製梭狀芽孢桿菌神經毒素為具有增加安全性及減少副作用的特定病理學的梭狀芽孢桿菌神經毒素。

本發明提供具有增進治療性質的神經毒素，特別是對於促進肌肉收縮(神經肌肉會合)或膽鹼能分泌物(cholinergic secretions)之特定神經元之更具選擇性的結合親和力。

於第一態樣，本發明提供一種包含梭狀芽孢桿菌輕鏈(L)及選擇性神經節苷脂結合部分(ganglioside binding moiety(GBM))之雜合神經毒素，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域。

於另一態樣，本發明提供一種編碼依據本發明之雜合神經毒素之核苷酸序列。

於另一態樣，本發明提供一種包含依據本發明之核苷酸序列之載體。

於另一態樣，本發明提供一種包含依據本發明之核苷酸序列或載體之細胞。

於另一態樣，本發明提供一種包含依據本發明之雜合神經毒素之醫藥組成物。

於另一態樣，本發明提供一種用於治療之依據本發明之雜合神經毒素或醫藥組成物。

於另一態樣，本發明提供一種依據本發明之雜合神經毒素或醫藥組成物之非治療性用途。

於另一態樣，本發明提供一種包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素，其用於治療與不必要的神經元活性有關之肢體障礙，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自GM1a、GM1b、GD1a及GalNAc-GD1a之一種以上的神經節苷脂。

於另一態樣，本發明提供一種包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及一選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素，其用於治療與不必要的神經元活性有關之頭或頸障礙，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自GT1a及GQ1b之一種以上的神經節苷脂。

於另一態樣，本發明提供一種治療方法，其包含投予治療上有效量之的依據本發明之雜合神經毒素或醫藥組成物至需要其之病患。

於另一態樣，本發明提供一種包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及一選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素，其用於治療流涎(sialorrhea)(或過度流涎(excessive salivation)或流涎(drooling))，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至GM1。

於另一態樣，本發明提供一種包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素，其用於治療癌症，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3及GD2之一種以上的神經節苷脂。

於另一態樣，本發明提供一種治療與不必要的神經元活性有關之肢體障礙之方法，其包含投予治療上有效量的包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素至需要其之病患，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自GM1a、GM1b、GD1a及GalNAc-GD1a之一種以上的神經節苷脂。

於另一態樣，本發明提供一種治療與不必要的神經元活性有關之頭或頸障礙之方法，其包含投予治療上有效量的包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素至需要其之病患，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自GT1a及GQ1b之一種以上的神經節苷脂。

於另一態樣，本發明提供一種治療流涎(或過度流涎或流涎)之方法，其包含投予治療上有效量的包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素至需要其之病患，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至GM1。

於另一態樣，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含投予治療上有效量的包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素至需要其之病，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3及GD2之一種以上的神經節苷脂。

本發明基於本發明人等之發現，可以藉由將外源性(非梭狀芽孢桿菌)神經節苷脂結合域工程改造至梭狀芽孢桿菌神經毒素來改變梭狀芽孢桿菌神經毒素對神經肌肉會合的選擇性。

肉毒桿菌神經毒素(BoNTs)以使用涉及蛋白質受體及細胞膜神經節苷脂的雙重受體結合機制的神經元為目標。BoNT/B、BoNT/G、及BoNT/DC已被顯示辨識SytI及SytII(突觸结合蛋白(synaptotagmin)之兩種主要異型體)之腔內域(luminal domain)。包括三種異型體SV2A、SV2B、及SV2C之突觸囊泡糖蛋白2(Synaptic vesicle glycoprotein(SV2))已顯示為BoNT/A、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F之蛋白質受體。

神經節苷脂係衍生自乳糖神經醯胺及含有唾液酸殘基如N-乙醯神經胺酸(「NANA'或「SA」或「Neu5Ac」或「NeuAc」)的寡聚糖基神經醯胺。於一些情形，唾液酸組分係N-羥乙醯神經胺酸(N-glycolyl-neuraminic acid，Neu5Gc)、或其中胺基被OH取代之Neu5Ac類似物(3-去氧-D-甘油-D-半乳-壬酮糖酸(3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nonulosonic acid)，給予縮寫「KDN」)。神經節苷脂由Svennerholm提出的命名系統定義，其中M、D、T及Q分别指單唾液酸神經節苷脂、雙唾液酸神經節苷脂、三唾液酸神經節苷脂及四唾液酸神經節苷脂，數字1、2、3等係指神經節苷脂於薄層層析上的遷移順序。例如，單唾液酸神經節苷脂的遷移順序為GM3>GM2>GM1。為了指示基本結構內的差異，加入另外的術語，例如GM1a、GD1b等。具有與內部半乳糖單元連接之0、1、2及3個唾液酸殘基的醣神經鞘脂質(Glycosphingolipid)分别被稱為去唾液酸(asialo-或0-)、a-、b-及c-系列神經節苷脂，而具有連結至內部N-半乳糖胺(N-galactosamine)殘基的唾液酸殘基的神經節苷脂被分類為α系列神經節苷脂。用於生物合成0-、a-、b-及c-系列之神經節苷脂的路徑涉及唾液酸轉移酶及糖基轉移酶的連續活性，例如，於Ledeen等人，2015年(Ledeen,Robert W.,and Gusheng Wu.「The multi-tasked life of GM1 ganglioside,a true factotum of nature.」Trends in biochemical sciences 40.7(2015)：407-418)。可以產生碳水化合物鏈中的每個系列及不同位置的進一步唾液酸化(sialization)，以得到越來越複雜及異質的產物範圍，例如具有與內部N-乙醯半乳糖胺殘基連接的唾液酸殘基的α-系列神經節苷脂。

神經節苷脂藉由涉及囊泡形成的運輸系統轉移到細胞膜的外部小葉上。神經節苷脂存在並集中於細胞表面上，其中神經醯胺部分的兩個烴鏈嵌入細胞膜中，寡糖位於細胞外表面，其中它們呈現細胞外分子或相鄰細胞表面的識別點。神經節苷脂的唾液酸聚糖(sialoglycan)組分自細胞表面延伸出來，在那裡它們可以參與分子間相互作用。它們藉由辨識細胞表面的特定分子並藉由調節細胞膜中的蛋白質的活性而作用。神經節苷脂亦特異性結合病毒及細菌毒素，諸如來自肉毒桿菌、破傷風及霍亂者。例如，對於霍亂毒素的特異性細胞表面受體為神經節苷脂GM1(或GM1a)：Neu5Acα2-3(Galβ1-3GalNAcβ1-4)Galβ1-4Glcβ1Cer。

BoNT於H_CC域中具有兩個獨立的結合區，對於神經節苷脂及神經元蛋白受體。BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E、BoNT/F及BoNT/G於H_CC域具有保留的神經節苷脂結合位，由「E(Q)...H(K)...SXWY...G」模體(motif)所組成，而BoNT/C、BoNT/D及BoNT/DC顯示兩種獨立的神經節苷脂結合位(Lam,Kwok-Ho,et al.“Diverse binding modes,same goal：The receptor recognition mechanism of botulinum neurotoxin.”Progress in biophysics and molecular biology 117.2(2015)：225-231.)。大多數BoNT僅與具有連接到寡糖核心的Gal4的2,3-連接的N-乙醯神經胺酸殘基(表示為Sia5)的神經節苷脂結合，而TeNT上相應的神經節苷脂結合口袋亦可以結合GM1a，缺乏此種Sia5糖殘基的神經節苷脂。已經顯示將H1241K突變引入至重組物BoNT/F會賦予GM1結合能力(Benson,Marc A.,et al.“Unique ganglioside recognition strategies for clostridial neurotoxins.”Journal of Biological Chemistry 286.39(2011)：34015-34022)，BoNT/D已被發現結合GM1a及GD1a(Kroken,Abby R.,et al.“Novel ganglioside-mediated entry of botulinum neurotoxin serotype D into neurons.”Journal of Biological Chemistry 286.30(2011)：26828-26837.)。

結合源自神經節苷脂缺陷型小鼠的數據及生物化學測定，BoNT/A、E、F及G表現出對GD1a及GT1b中存在的終端NAcGal-Gal-NAcNeu部分的偏好，而BoNT/B、C、D及TeNT需要於GD1b、GT1b及GQ1b中發現的二唾液酸模體。因此豐富的複合多唾液酸神經節苷脂(polysialo-gangliosides)諸如GD1a、GD1b及GT1b對於作為中毒的第一步於神經元細胞表面特異性地積累所有BoNT血清型及TeNT顯示為必要的(Rummel,Andreas.“Double receptor anchorage of botulinum neurotoxins accounts for their exquisite neurospecificity.”Botulinum Neurotoxins.Springer Berlin Heidelberg,2012.61-90.)。

本發明人等提出下列假設：可以利用神經節苷脂於體內的差異定位來增進梭狀芽孢桿菌神經毒素對於特定位置處的神經元的選擇性。本發明人等已特別表明出霍亂毒素之B次單元可用於將GM1結合能力工程改造至BoNT/A中。

於第一態樣，本發明提供一種包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域。

於本文中使用時，術語「神經毒素」意指進入神經元並抑制神經傳導物釋放之任一多肽。此過程涵括神經毒素結合至低或高親和性受體、神經毒素的內化、神經毒素的內肽酶部分轉位到細胞質中及神經毒素基質的酶修飾。更具體而言，術語「神經毒素」涵括進入神經元並抑制神經傳導物釋放之任一梭狀芽孢桿菌產生的多肽(梭狀芽孢桿菌神經毒素)，且此種多肽係藉由重組技術或化學技術產生。此種二鏈形式為毒素之活性形式。此兩鏈被稱為重鏈(H-鏈)，其具有約100kDa之分子量；及輕鏈(L-鏈)，其具有約50kDa之分子量。

可基於利用特異性中和抗血清的去活性化來區分不同的肉毒桿菌神經毒素(BoNT)血清型，此種利用血清型之分類係與胺基酸程度的序列同一性(sequence identity)百分比相關。基於胺基酸序列同一性百分比，特定的血清型之BoNT蛋白質被進一步分成不同的亞型。提供BoNT/A胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：1(UniProt登錄號A5HZZ9)。提供BoNT/B胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：2(UniProt登錄號B1INP5)。提供BoNT/C胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：3(UniProt登錄號 P18640)。提供BoNT/D胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：4(UniProt登錄號P19321)。提供BoNT/E胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：5(UniProt登錄號Q00496)。提供BoNT/F胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：6(UniProt登錄號Q57236)。提供BoNT/G胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：7(UniProt登錄號Q60393)。提供TeNT(破傷風神經毒素)胺基酸序列之一例為SEQ ID NO：8(UniProt登錄號P04958)。

如本文使用之術語「梭狀芽孢桿菌輕鏈」(或「L」)意指具約50kDa分子量之梭狀芽孢桿菌內肽酶域(或非細胞毒性蛋白酶)，其具有切割SNARE蛋白質的能力，因而擾亂神經傳導物自標的細胞的釋放。

如本文使用之術語「H_N域」意指神經毒素重鏈之功能上獨特區，具分子量約50kDa，其具有將梭狀芽孢桿菌輕鏈轉位至標的細胞之細胞質內的能力。

如本文使用之術語「LH_N域」意指缺少H_C域且由內肽酶域(「L」或「輕鏈」)及負責將內肽酶轉位至細胞質的域(重鏈之H_N域)所組成之神經毒素。LH_N域包含介於L域及H_N域之間的活化位。於活化位的蛋白水解切割時，L域及H_N域藉由雙硫鍵一起連結。

如本文使用之術語「H_C域」意指神經毒素重鏈之功能上獨特區，具分子量約50kDa，其能夠使神經毒素與位於目標細胞表面的受體結合。H_C域由兩個結構上獨特的亞域(subdomain)所組成，「H_CN亞域」(H_C域之N-端部分)及「H_CC亞域」(H_C域之C-端部分)，其每一者具有約25kDa的分子量。

例示的L、H_N、H_CN及H_CC域示於表1。

上述參考序列應被視為指引，因依據亞血清型可能會發生輕微的變化。舉例來說，US 2007/0166332(藉由引用將其全文併入本文)引用些微不同的梭菌序列。

於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌輕鏈係來自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或TeNT。

於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌輕鏈域包含選自下列的序列：-SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至448，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1至441，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：3之胺基酸殘基1至449，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性， -SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1至442，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：5之胺基酸殘基1至423，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1至439，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1至446，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，及-SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至456，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性。

應了解依據本發明之梭狀芽孢桿菌輕鏈具有切割SNARE蛋白質的能力。

於一具體實施例中，雜合神經毒素包含轉位部分。

如本文使用之術語「轉位部分」(或「轉位域」)意指具有轉位梭狀芽孢桿菌輕鏈至目標細胞的細胞質中的能力。

適當的轉位部分包括細菌毒素轉位域諸如梭狀芽孢桿菌H_N域及/或來自霍亂毒素(CtxA2)的次單元A2、細胞穿透肽，尤其是pH敏感性細胞穿透肽。pH-敏感性細胞穿透肽之例為HBHAc(KKAAPAKKA-AAKKAPAKKAAAKK)併入pH-敏感性遮蔽肽，組胺酸麩胺酸(HE)(Yeh等人，Mol Pharm 2016「Selective Intracellular Delivery of Recombinant Arginine Deiminase(ADI)Using pH-Sensitive Cell Penetrating Peptides To Overcome ADI Resistance in Hypoxic Breast Cancer Cells.」)。

於一較佳具體實施例，雜合神經毒素包含為梭狀芽孢桿菌H_N域之轉位部分。於一更佳具體實施例，雜合神經毒素包含位於輕鏈及梭狀芽孢桿菌H_N域之間的活化位。

於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌H_N域包含選自下列的序列：-SEQ ID NO：1之胺基酸殘基449至872，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：2之胺基酸殘基442至859，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：3之胺基酸殘基450至867，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：4之胺基酸殘基442至863，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性， -SEQ ID NO：5之胺基酸殘基423至846，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基440至865，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：7之胺基酸殘基447至864，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，及-SEQ ID NO：8之胺基酸殘基457至880，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性。

應了解依據本發明之梭狀芽孢桿菌H_N域具有轉位輕鏈至目標細胞的細胞質的能力。

於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌L及H_N域係來自相同梭狀芽孢桿菌血清型。

於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌L及H_N域係來自不同梭狀芽孢桿菌血清型。

於一具體實施例中，雜合神經毒素包含目標部分(targeting moiety)。

如本文使用之術語「目標部分」(或「目標域」)意指具有結合至目標細胞上的受體的能力。較佳地，目標部分具有結合至目標細胞上的蛋白質受體的能力。

適當的目標部分包括細胞毒素目標域，諸如梭狀芽孢桿菌H_C或H_CC域、胜肽、抗體或抗體片段。

於一具體實施例中，雜合神經毒素包含目標部分(Targeting Moiety，(TM))，其結合至非梭狀芽孢桿菌受體。該TM可替換梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之部分或所有的H_C或H_CC域。包含非梭狀芽孢桿菌TM之雜合神經毒素可被稱為「再標的神經毒素(retargeted neurotoxin「(或「標的分泌抑制劑(targeted secretion inhibitors)」、「TSIs」、「TVEMPs」或「TEMs」)。適合於再標的神經毒素TMs之例揭示於WO96/33273、WO98/07864、WO00/10598、WO01/21213、WO01/53336、WO02/07759、WO2005/023309、WO2006/026780、WO2006/099590、WO2006/056093、WO2006/059105、WO2006/059113、WO2007/138339、WO2007/106115、WO2007/106799、WO2009/150469、WO2009/150470、WO2010/055358、WO2010/020811、WO2010/138379、WO2010/138395、WO2010/138382、WO2011/020052、WO2011/020056、WO2011/020114、WO2011/020117、WO2011/20119、WO2012/156743、WO2012/134900、WO2012/134897、WO2012/134904、WO2012/134902、WO2012/135343、WO2012/135448、WO2012/135304、WO2012/134902、WO2014/033441、WO2014/128497、WO2014/053651、WO2015/004464，藉由引用將其全部內容併入本文。

於一具體實施例中，雜合神經毒素包含梭狀芽孢桿菌H_CN及/或H_CC域。較佳地，梭狀芽孢桿菌H_CN及/或H_CC域係來自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或TeNT。

於一具體實施例中，雜合神經毒素包含梭狀芽孢桿菌H_CN域，其包含選自下列的序列：-SEQ ID NO：1之胺基酸殘基873至1094，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：2之胺基酸殘基860至1081，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：3之胺基酸殘基868至1095，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：4之胺基酸殘基864至1082，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：5之胺基酸殘基847至1069，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基866至1087，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：7之胺基酸殘基865至1089，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，或-SEQ ID NO：8之胺基酸殘基881至1111，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75% 、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性。

於一具體實施例中，雜合神經毒素包含狀芽孢桿菌H_CC域，其包含選自下列的序列：-SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1095至1296，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1082至1291，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：3之胺基酸殘基1096至1291，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1083至1276，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：5之胺基酸殘基1070至1252，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1088至1278，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，-SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1090至1297，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性，或-SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1112至1315，或具有與其之同一性為至少70%之多肽序列，較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性。

應了解依據本發明之H_CC能夠結合至梭狀芽孢桿菌神經毒素蛋白質受體。

於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌H_CN及/或H_CC域係選自相同梭狀芽孢桿菌血清型作為輕鏈。

於一具體實施例中，梭狀芽孢桿菌H_CN及/或H_CC域係選自不同梭狀芽孢桿菌血清型作為輕鏈。

於一具體實施例中，雜合神經毒素包含梭狀芽孢桿菌H_CN域及梭狀芽孢桿菌H_CC域。適當地，該梭狀芽孢桿菌H_CN及H_CC域可來自相同血清型。適當地，該梭狀芽孢桿菌H_CN及H_CC域可來自不同血清型。於一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌輕鏈，H_CN及H_CC域來自相同血清型。於一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌輕鏈及H_CN來自相同血清型及H_CC域來自不同血清型。

於一具體實施例中，該雜合神經毒素包含梭狀芽孢桿菌H_N域、梭狀芽孢桿菌H_CN域及梭狀芽孢桿菌H_CC域。適當地，該梭狀芽孢桿菌H_N、H_CN及H_CC域可來自相同血清型。適當地，該梭狀芽孢桿菌H_N、H_CN及H_CC域可來自不同血清型。於一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌輕鏈、H_N、H_CN及H_CC域來自相同血清型。於一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌輕鏈、H_N及H_CN域來自相同血清型且H_CC域來自不同血清型。於一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌輕鏈及H_N域來自相同血清型且H_CN及H_CC域來自不同血清型。

於一具體實施例中，當雜合神經毒素包含梭狀芽孢桿菌H_CC域，該梭狀芽孢桿菌H_CC域具有結合至神經節苷脂的能力，且其與天然梭狀芽孢桿菌H_CC域相比係被減少或取消。其可藉由導入突變至該H_CC域的神經節苷脂結合基序(binding motif)來達成。

二或多個核酸或胺基酸序列之間的「序列同一性百分比」係序列共有的相同位置的數目的函數。如此，可以將於比對序列的每一位置上相同的核苷酸/胺基酸的數目除以於此比對序列的核苷酸/胺基酸的總數乘以100來計算同一性%。序列同一性%之計算亦可考量為了最佳化兩個或更多個序列的比對所需要導入之間隙的數目，以及需要導入的每個間隙的長度以最佳化兩個或更多個序列的比對。兩個或更多個序列之間的序列比較及百分比同一性的確定可使用使用特定的數學算法來進行，其對於本項技術領域中具通常知識者為熟悉的，例如整體排比(global alignment)數學算法(諸如Needleman及Wunsch,J.所述，Mol.Biol.48(3),443-453,1972)。

該輕鏈、H_N、H_CN及H_CC域可來自鑲嵌神經毒素(mosaic neurotoxin)。如本文中使用的術語「鑲嵌神經毒素」係指包含來自另一型梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如，不同血清型之梭狀芽孢桿菌神經毒素)之至少一個功能域的天然發生的梭狀芽孢桿菌神經毒素，該梭狀芽孢桿菌神經毒素通常不包含該至少一個功能域。鑲嵌神經毒素之例為天然發生的BoNT/DC及BoNT/CD。BoNT/DC包含血清型D之L鏈及H_N域及血清型C之H_C域，因而 BoNT/CD由血清型C之L鏈及H_N域及血清型D之H_C域所組成。

輕鏈、H_N、H_CN及H_CC域可來自修飾的神經毒素及其衍生物，包括但不限於彼等下述者。修飾的神經毒素或衍生物可含有與天然(未修飾的)型神經毒素相比已修飾的一個以上的胺基酸，或可含有不存於天然(未修飾的)型毒素之經插入的胺基酸。舉例來說，相對於天然(未修飾的)梭菌神經毒素序列，修飾的梭菌神經毒素可以在一個或多個域中具有修飾的胺基酸序列。此種修飾可修飾神經毒素的功能方面，例如生物活性或持久性。

修飾的神經毒素保留神經毒素的功能中的至少一種，該功能選自與目標細胞上的低或高親和性神經毒素受體結合的能力、將神經毒素(輕鏈)的內肽酶部分轉位至細胞質中、及切割SNARE蛋白質。較佳地，修飾的神經毒素保留此等功能中之至少兩個。更佳地，修飾的神經毒素保留了此等三種功能。

修飾的神經毒素可於重鏈的胺基酸序列(諸如修飾的H_C域)中具有一個或多個修飾，其中該修飾的重鏈以比天然(未修飾的)神經毒素更高或更低的親和力結合至目標神經細胞。H_C域中的此等修飾可包括修飾H_C域的神經節苷脂結合位中的殘基或改變與神經節苷脂受體及/或目標神經細胞的蛋白質受體的結合的蛋白質(SV2或突觸結合蛋白)結合位中的殘基。WO2006/027207及WO2006/114308中描述了此等修飾之神經毒素之例，兩者均藉由引用整體併入本文中。

修飾的神經毒素可於輕鏈的胺基酸序列中具有一個或多個修飾，例如可以改變或修飾此經修飾的LC之SNARE蛋白質特異性的基質結合域或催化域中的修飾。WO2010/120766及US2011/0318385中描述此種修飾之神經毒素之例，其兩者之全部內容藉由引用併入本文。

修飾的神經毒素可包含增加或減少修飾的神經毒素的生物學活性及/或生物學持久性之一種或多種修飾。例如，修飾的神經毒素可以包含白胺酸或酪胺酸系的基序，其中該基序增加或降低修飾的神經毒素之生物學活性及/或生物學持久性。適合的白胺酸的基序包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL及xExxxLM(其中x為任何胺基酸)。適合的酪胺酸系的基序包括Y-x-x-Hy(其中Hy為疏水胺基酸)。WO2002/08268中描述了包含白胺酸及酪胺酸系的基序之修飾的神經毒素之例，其藉由引用將其全文併入本文中。

如本文使用的術語「選擇性神經節苷脂結合部分」意指以比其他神經節苷脂更高的親和力與一種類型的神經節苷脂結合的部分。可藉由確定神經節苷脂與結合部分之間的平衡解離常數或K_d(K_d越低，親和力越高)來定量結合親和力。用於確定對神經節苷脂的結合親和力的方法於本領域中為公知，且包括例如表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)，例如Kuziemko,Geoffrey M.等人所述，「Cholera toxin binding affinity and specificity for gangliosides determined by surface plasmon resonance.」Biochemistry 35.20(1996) ：6375-6384，或於MacKenzie,C.Roger等人，「Quantitative analysis of bacterial toxin affinity and specificity for glycolipid receptors by surface plasmon resonance.」Journal of Biological Chemistry 272.9(1997)：5533-5538。尤其，Kuziemko等人，1996(上列引述)藉由使用SPR發現霍亂毒素較佳以下列順序結合至神經節苷脂：GM1>GM2>GD1A>GM3>GT1B>GD1B>去唾液酸GM1，及所測量的霍亂毒素對神經節苷脂序列之結合親和力(K_d)範圍由GM1之4.61x10^-12M至去唾液酸GM1之1.88x10^-10M。MacKenzie等人，1997(上列引述)使用脂質體捕獲方法的表面電漿共振(SPR)測定：CtxB以分別為7.3x10^-10M及8x10^-9M之親和力結合至GM1及GD1b；大腸桿菌熱不穩定腸毒素(E.coli heat labile enterotoxin，LT)以分別為5.7x10^-10M及3.0x10^-9M結合至GM1及GD1b；且破傷風毒素C片段以分別為1.5x10^-7M及1.7x10^-7M之親和力結合至GD1b及GT1b。

神經節苷脂的結合親和力亦可藉由使用競爭性ELISA試驗來確定，例如Sinclair，Haydn R.等人所述，「Sialyloligosaccharides inhibit cholera toxin binding to the GM1 receptor.」Carbohydrate research 343.15(2008)：2589-2594。另一種測定神經節苷脂結合親和力的方法係基於使用放射性標記的配位體(例如¹²⁵I標記)，例如描述於Nishiki,Tei-ichi等人，「The high-affinity binding of Clostridium botulinum type B neurotoxin to synaptotagmin II associated with gangliosides GT1b/GD1a.」FEBS letters 378.3(1996)：253-257。另一種測定神經節苷脂結合親和力的方法係使用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry)，如Turnbull，W.Bruce等人所述，「Dissecting the cholera toxin-ganglioside GM1 interaction by isothermal titration calorimetry.」，Journal of the American Chemical Society 126.4(2004)：1047-1054。

於一具體實施例中，選擇性神經節苷脂結合部分與神經節苷脂之間的K_d係低於約10^-9M，較佳低於約10^-10M，更佳低於約10^-11M，更佳低於約5 x 10^-12M。

適合的神經節苷脂結合部分(ganglioside binding moieties，GBM)包括細菌毒素GBM(非梭狀芽孢桿菌H_C或H_CC域的細菌毒素)、胜肽、蛋白質或蛋白質片段、抗體或抗體片段。

於一具體實施例中，該GBM為一胜肽。適合使用作為GBM的胜肽之例包括：阿滋海默症β-類澱粉肽(Alzheimer’s β-amyloid peptide)(Aβ)，其結合至GM1；與帕金森氏症有關的蛋白質α-突觸核蛋白(Parkinson’s disease associated protein α-synuclein)，其結合至GM3；及嵌合胜肽，諸如α-突觸核蛋白/Aβ，述於Yahi及Fantini 2014，其結合至GM1及GM3(Yahi,Nouara,and Jacques Fantini.“Deciphering the glycolipid code of Alzheimer's and Parkinson's amyloid proteins allowed the creation of a universal ganglioside-binding Peptide.”PloS one 9.8(2014)：e104751)。

於一具體實施例中，該GBM為蛋白質或蛋白質片段。適合使用作為GBM之蛋白質之例包括：生長因子受體，諸如上皮生長因子受體(EGFR)，其結合至GM3、GM1、GM2、GM4、GD3、GD1a及GT1b；及血管內皮生長因子受體(VEGFR)，其結合至GM3、GD1a及GT1b(Krengel,Ute,and Paula A.Bousquet.“Molecular recognition of gangliosides and their potential for cancer immunotherapies.”Frontiers in Immunology,2014,vol 5,article 325)。

於一較佳具體實施例，該GBM係來自細菌毒素，例如該GBM選自霍亂毒素B次單元(CtxB)及大腸桿菌熱不穩定腸毒素(LT)。

GM1(或GM1a)係霍亂毒素B次單元(CtxB)的唯一已知受體。因此，藉由將霍亂毒素的B次單元工程改造至梭狀芽孢桿菌神經毒素或其片段，可能將其選擇性地靶向含GM1的神經元。GM1亦為大腸桿菌熱不穩定腸毒素的受體。(Zoeteweij,J.Paul,et al.“GM1 binding-deficient exotoxin is a potent noninflammatory broad spectrum intradermal immunoadjuvant.”The Journal of Immunology 177.2(2006)：1197-1207)。

亦假設其中GBM來自細菌毒素之根據本發明的雜合神經毒素特別適合雜合神經毒素之局部遞送。確實已經顯示，細菌外毒素可以安全地用於人體皮膚上(Zoeteweij,J.Paul,et al.“GM1 binding-deficient exotoxin is a potent noninflammatory broad spectrum intradermal immunoadjuvant.”The Journal of Immunology 177.2(2006)：1197-1207)。

於一具體實施例中，該神經節苷脂為GM1，且該GBM選自CtxB及大腸桿菌熱不穩定腸毒素(LT)。

霍亂毒素(CT)係由革蘭氏陰性菌霍亂弧菌分泌。CT屬於更大的AB毒素家族，其具有負責誘導毒性的酶促活性A-域及負責細胞進入的細胞結合B-域。CT屬於AB₅亞家族，其包含六個多肽，單個A-次單元及同源五聚體B-次單元在分泌之前自組裝形成全毒素(holotoxin)。其他AB₅毒素包括熱不穩定的腸毒素、志賀毒素、志賀樣毒素及百日咳毒素。CT A-及B-次單元(分別是CtxA及CtxB)係非共價連接的。27kDa的A-次單元含有位於殘基192和195之間的絲胺酸-蛋白酶切割位點，其允許將A-次單元切割成兩條多肽：A2-鏈及A1-鏈。殘基187及199之間的雙硫鍵將此等鏈連接在一起。A1鏈負責CT的酶活性。五個11.5kDa B次單元非共價組裝形成與細胞膜上的神經節苷脂GM1結合的同源五聚體。B₅次單元GM1複合體攜帶A次單元進入內質網。於逆轉位(retro-translocation)後，A1鏈作為活化的ADP-核糖基轉移酶進入胞質液，其修飾異源三聚G蛋白質Gsα。該G蛋白的修飾導致腺苷酸環化酶的組成活化及cAMP的快速生成。在腸細胞中，此誘導了腸的氯離子分泌，伴隨著水的大量移動和作為霍亂特徵的腹瀉。(Wernick,Naomi LB,et al."Cholera toxin：an intracellular journey into the cytosol by way of the endoplasmic reticulum." Toxins 2.3 (2010)：310-325.)。

霍亂毒素B次單元胺基酸序列之例提供為SEQ ID NO：9(UniProtKB登錄號P01556)，其由訊息肽(SEQ ID NO：9之胺基酸殘基1至21)及B次單元SEQ ID NO：9之胺基酸殘基22至124)所構成。

霍亂毒素A次單元胺基酸序列之例提供為SEQ ID NO：10(UniProtKB登錄號P01555)，其由訊息肽(SEQ ID NO：10之胺基酸殘基1至18)、A1域(SEQ ID NO：10之胺基酸殘基19至212)及A2域(SEQ ID NO：10之胺基酸殘基213至258)所構成。

已經顯示單體B次單元足以結合細胞並完成中毒途徑(Jobling,Michael G.,et al."A single native ganglioside GM1-binding site is sufficient for cholera toxin to bind to cells and complete the intoxication pathway." MBio 3.6(2012)：e00401-12)。

本發明人已顯示：向endonegative BoNT/A1(BoNT/A1(0))給予CtxB域賦予BoNT/A1結合GM1的能力，該GM1為一種神經節苷脂，其並非為BoNT/A1的天然受體(natural receptor)。

不希望受理論束縛，假設CtxB次單元將導致效力增加，因為霍亂毒素對於GM1的結合親和力比BoNT對其相應的神經節苷脂具有更大的結合親和力。例如，已經顯示BoNT/B對與GT1b/GD1a(雙受體模型)相關的複雜突觸結合蛋白的親和力處於nM範圍(「高親和力0.4nM，低親和力4.1nM」)(Nishiki et al,FEBS Letters 1996) ，其比Kuzimeko等人報告的Ctx-B及GM1之間的pM親和力高1000倍，Biochemistry 1996。

根據本發明之CtxB域較佳包含SEQ ID NO：9之胺基酸殘基22至124，或具有至少70%的序列同一性，較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。可以理解，根據本發明之CtxB域能夠與GM1結合。

於一較佳具體實施例，選擇性神經節苷脂結合部分分包含一個以上的霍亂毒素B次單元(CtxB)。

於一具體實施例中，輕鏈係共價結合至該一個以上的霍亂毒素B次單元(CtxB)。

於一具體實施例中，選擇性神經節苷脂結合部包含一個CtxB。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分包含二個CtxB。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分包含三個CtxB。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分包含四個CtxB。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分包含五個CtxB。

於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分包含一個以上的CtxB，其為C-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分包含一個以上的CtxB，其為N-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由一C-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由一N-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由兩個C-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由兩個N-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由三個C-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由三個N-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由四個C-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由四個N-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由五個C-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由五個N-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈之CtxB所構成。

於一具體實施例中，該雜合神經毒素包含梭狀芽孢桿菌H_N域及選擇性神經節苷脂結合部分包含一個以上的CtxB，其為C-端對梭狀芽孢桿菌H_N域。於另一具體實施例中，一個以上的CtxB為N-端對梭狀芽孢桿菌H_N域。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由一個C-端對梭狀芽孢桿菌H_N之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由一個N-端對梭狀芽孢桿菌H_N之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由二個C-端對梭狀芽孢桿菌H_N之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由二個N-端對梭狀芽孢桿菌H_N之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由三個C-端對梭狀芽孢桿菌H_N之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由三個N-端對梭狀芽孢桿菌H_N之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由四個C-端對梭狀芽孢桿菌H_N之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由四個N-端對梭狀芽孢桿菌H_N之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由五個C-端對梭狀芽孢桿菌H_N之CtxB所構成。於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分由五個N-端對梭狀芽孢桿菌H_N之CtxB所構成。

於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分包含一個以上的霍亂毒素B次單元(CtxB)且該雜合神經毒素進一步包含霍亂毒素A2次單元(CtxA2)。較佳地，CtxA2係共價結合至梭狀芽孢桿菌輕鏈。更較佳地，CtxA2係共價結合至梭狀芽孢桿菌輕鏈且CtxB與梭狀芽孢桿菌輕鏈形成非共價連結(non covalent link)。特別考慮霍亂毒素A2次單元(CtxA2)可以作為一個繫鏈與B次單元五聚體(CtxB₅)形成非共價連接，其將與目標細胞上的神經節苷脂結合，並將梭狀芽孢桿菌輕鏈內化至細胞內。

不受理論束縛，假設其中CtxB通過非共價連結(至CtxA2次單元)結合至雜合神經毒素的此種具體實施例允許CtxB次單元(CtxB₅)的五聚體排列，因而造成增加了雜合神經毒素對GM1的結合親和力。

根據本發明的CtxA2域較佳包含SEQ ID NO ：10之胺基酸殘基213至258，或具有至少70%的序列同一性，較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。可以理解，根據本發明的CtxA2域能夠結合CtxB域。較佳地，CtxA2域包含SEQ ID NO：10之殘基255至258(KDEL)。

該CtxA2域可為C-端或N-端對梭狀芽孢桿菌輕鏈。

於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分包含一個以上的霍亂毒素B次單元(CtxB)，其非共價連結至梭狀芽孢桿菌輕鏈，該雜合神經毒素進一步包含霍亂毒素A2次單元(CtxA2)及H_N域，其共價結合至梭狀芽孢桿菌輕鏈。於一具體實施例中，該CtxA2域為N-端對梭狀芽孢桿菌H_N域且較佳位於活化位及該H_N域之間(「中心表現(central presentation)」)。於一具體實施例中，該CtxA2域為C-端對梭狀芽孢桿菌H_N域，當雜合神經毒素包括H_CN及/或H_CC域時，該神經節苷脂結合部分可位於對H_CN或H_CC域之C-端或N-端。該雜合神經毒素可包含於CtxA2域及L、H_N、H_CN及/或H_CC域之間的連接子(linker)。

於一具體實施例中，該梭狀芽孢桿菌輕鏈係共價結合至選擇性神經節苷脂結合部分。該選擇性神經節苷脂結合部分可為對梭狀芽孢桿菌輕鏈之C-端或N-端。

於一具體實施例中，該雜合神經毒素包含梭狀芽孢桿菌H_N域及梭狀芽孢桿菌H_N域共價連結至選擇性神經節苷脂結合部分。選擇性神經節苷脂結合部分可為C-端或N-端對梭狀芽孢桿菌H_N域。當選擇性神經節苷脂結合部分為N-端對梭狀芽孢桿菌H_N域，其較佳位於活化位及H_N域之間(「中心表現」)。

當選擇性神經節苷脂結合部分為C-端對梭狀芽孢桿菌H_N域且當雜合神經毒素進一步包含H_CN域及/或H_CC域，神經節苷脂結合部分可位於C-端或N-端對H_CN或H_CC域。

雜合神經毒素可以包含神經節苷脂結合域與L、H_N、H_CN及/或H_CC域之間的連接子。不受理論束縛，假設連接子的存在可增強雜合神經毒素的穩定性及/或神經節苷脂結合部分對其目標神經節苷脂的可利用性，及/或增加表現。

適當的連接子之例包括長度變化的GS連接子，例如GS5、GS10、GS15、GS18及GS20、N10、HX27、(EAAAK)₃及A(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄A。另外的例子被提供於文獻，例如Chen,Xiaoying,et al.“Fusion protein linkers：property,design and functionality.”Avanced drug delivery reviews 65.10(2013)：1357-1369，藉由引用併入本文中。

依據本發明之雜合神經毒素之結構的排列之例示於下文(GBM：神經節苷脂結合部分；TD：轉位域；BD：蛋白質受體結合域；L、H_N、H_CN、H_CC：如本文所定義之梭狀芽孢桿菌域；AS：活化位；由左至右：C-端至N-端)：

‧L-GBM

‧GBM-L

‧L-AS-GBM

‧GBM-AS-L

‧L-AS-GBM-TD

‧L-AS-TD-GBM

‧GBM-TD-AS-L

‧TD-GBM-AS-L

‧GBM-L-AS-TD

‧L-AS-GBM-TD-BD

‧L-AS-BD-TD-GBM

‧GBM-TD-BD-AS-L

‧BD-TD-GBM-AS-L

‧L-AS-GBM-H_N

‧L-AS-H_N-GBM

‧GBM-H_N-AS-L

‧H_N-GBM-AS-L

‧GBM-L-AS-HN

‧L-AS-GBM-H_N-H_CN

‧L-AS-GBM-H_N-H_CN-H_CC

‧L-AS-H_N-GBM

‧L-AS-H_N-H_CN-GBM

‧L-AS-H_N-H_CN-H_CC-GBM

‧L-AS-GBM-連接子-H_N

‧L-AS-GBM-連接子-H_N-H_CN

‧L-AS-GBM-連接子-H_N-H_CN-H_CC

‧L-AS-H_N-連接子-GBM

‧L-AS-H_N-H_CN-連接子-GBM

‧L-AS-H_N-H_CN-H_CC-連接子-GBM

‧GBM-L-AS-H_N-H_CN-H_CC

‧L-AS-連接子-GBM-H_N

‧L-AS-連接子-GBM-H_N-H_CN

‧L-AS-連接子-GBM-H_N-H_CN-H_CC

‧L-AS-連接子-GBM-連接子-H_N

‧L-AS-連接子-GBM-連接子-H_N-H_CN

‧L-AS-連接子-GBM-連接子-H_N-H_CN-H_CC

於一具體實施例中，本發明之雜合神經毒素包含H_N域且為雙鏈型式，並於L域及H_N域之間包含雙硫鍵。

較佳地，雜合神經毒素之結構排列使得GBM具有游離N端或C端末端。於包含允許轉化雜合神經毒素成雙鏈型式的活化位(AS)的具體實施例中，雜合神經毒素之結構排列較佳於轉化成雙鏈型式後使得GBM具有游離N端或C端末端。

於包含蛋白質受體結合域(BD)之具體實施例中，例如H_C或H_CC，雜合神經毒素之結構排列較佳使得BD具有游離N端或C端末端，更佳為GBM及BD兩者具有游離N端或C端末端。於包含允許轉化雜合神經毒素成雙鏈型式的活化位(AS)的具體實施例中，雜合神經毒素之結構排列較佳於轉化成雙鏈型式後使得BD具有游離N端或C端末端，更佳為於轉化成雙鏈型式後GBM及BD兩者具有游離N端或C端末端。

本發明之雜合神經毒素可使用重組技術來製造。因此，於一具體實施例中，依據本發明之雜合神經毒素為重組雜合神經毒素。

於另一態樣，本發明提供一種編碼依據本發明之雜合神經毒素之核苷酸序列，例如DNA或RNA序列。於一較佳具體實施例，該核苷酸序列為DNA序列。

本發明之核酸分子可使用本項領域中已知的任何適合方式來製造。因此，該核酸分子可使用化學合成技術來製造。或者，本發明之核酸分子可使用分子生物技術來製造。

本發明之DNA序列較佳經由電腦模擬來設計，然後藉由習用DNA合成技術來合成。

依據要被使用之最終宿主細胞(例如大腸桿菌)表現系統，上述核酸序列訊息可選擇地被修飾用於密碼子偏移(codon-biasing)。

於另一態樣，本發明提供一種包含依據本發明之核苷酸序列之載。於一具體實施例中，該核酸序列被製備作為包含啟動子及終止子的DNA載體之一部分。於一較佳具體實施例，載體具有選自Tac、AraBAD、T7-Lac、或T5-Lac之啟動子。

載體可為適合於上述核酸序列的活體外及/或活體內表現。載體可為暫時基因表現用載體及/或穩定基因表現。載體可另外包含調節元件及/或選擇標記。載體可以是病毒來源、噬菌體來源或細菌來源。例如，表現載體可為pET、pJ401、pGEX載體或其衍生物。

於另一態樣，本發明提供一種包含依據本發明之核苷酸序列或載體之細胞。適合的細胞類型包括原核細胞，例如大腸桿菌，及真核細胞，例如酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞...。較佳地，該細胞為大腸桿菌。

本發明之雜合神經毒素特別適合用於治療。

格林-巴利徵候群(Guillain-Barré syndrome)係一種急性炎症性疾病，其影響周圍神經系統，且係由免疫系統產生的抗體與神經節苷脂結合所引起。基於格林-巴利徵候群臨床亞型的研究結果，神經節苷脂GM1a、GM1b、GD1a、GalNAc-GD1a與四肢神經肌肉接點相連，神經節苷脂GT1a、GQ1b與頭頸部神經肌肉會合處(head-and-neck neuromuscular junctions)相連(Van Den Berg,Bianca,et al.“Guillain-Barré syndrome：pathogenesis,diagnosis,treatment and prognosis.”Nature reviews.Neurology 10.8(2014)：469；Willison,Hugh J.,and Jaap J.Plomp.“Anti-ganglioside Antibodies and the Presynaptic Motor Nerve Terminal.”Annals of the New York Academy of Sciences 1132.1(2008)：114-123).GM1亦被證明於腮腺(唾液腺)中為豐富的(Nowroozi,Nakisa,et al.“HIGH LEVELS OF GM 1-GANGLIOSIDE AND GM 1-GANGLIOSIDE β-GALACTOSIDASE IN THE PAROTID GLAND：A New Model for Secretory Mechanisms of the Parotid Gland.”Otolaryngologic Clinics of North America 32.5(1999)：779-791)。

阿茲海默病(AD)患者的額顳葉皮質脂膜筏中的GM1和GM2濃度較高已被報告。GM1集群於背根神經節神經元(感覺神經元)中被證實。(Aureli,Massimo,etal.“GM1 ganglioside：past studies and future potential”Molecular neurobiology 53.3(2016)：1824-1842.)

神經節苷脂NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3及GD2已顯示於人類腫瘤細胞中表現(Krengel,Ute,and Paula A.Bousquet.“Molecular recognition of gangliosides and their potential for cancer immunotherapies.”Frontiers in Immunology,July 2014,vol.5,article 325).

於一具體實施例中，選擇性神經節苷脂結合部分結合至一種以上的神經節苷脂，其選自GM1a、GM1b、GD1a及GalNAc-GD1a。咸信此等具體實施例特別適合於治療肢體障礙諸如上肢痙攣狀態、下肢痙攣狀態、局部手肌張力不全、四肢肌肉拉傷、重複性勞損(RSI)、累積創傷障礙或職業過度使用徵候群。實際上，不希望受理論束縛，假設將雜合神經毒素標定於四肢神經肌肉會合處發現的神經節苷脂允許增加對四肢神經肌肉會合的選擇性，並避免由於脫靶效應(off-target effects)而引起的副作用。

於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分結合至一種以上的神經節苷脂，其選自GT1a及GQ1b。咸信此等具體實施例特別適合治療頭及頸障礙，諸如頸部肌張力障礙、瞼痙攣、偏頭痛、肌筋膜疼痛、斜視、半面痙攣、眼瞼障礙、痙攣性發音困難(spasmodic dysphonia)、喉肌張力不全(laryngeal dystonia)、口下頜發音困難(oromandibular dysphonia)、舌肌張力不全(lingual dystonia)、磨牙症及吞嚥困難。實際上，不希望受理論束縛，假設將雜合神經毒素標定於頭及頸神經肌肉會合處發現的神經節苷脂允許增加對頭及頸神經肌肉會合的選擇性，並避免由於脫靶效應而引起的副作用。

於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分結合至GM1。咸信此具體實施例特別適合治療流涎(過度流涎、流涎)。亦假設此具體實施例可適合治療罹患阿茲海默症或其他神經障礙的病患。

於一具體實施例中，該選擇性神經節苷脂結合部分結合至一種以上的神經節苷脂，其選自NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3及GD2。咸信此等具體實施例特別適合治療癌症。

於另一態樣，本發明提供一種醫藥組成物，其包含依據本發明之雜合神經毒素。較佳地，該醫藥組成物同時包含雜合神經毒素與至少一個選自醫藥上可接受的載劑(carrier)、賦形劑、佐劑、推進劑(propellant)及/或鹽之組分。

依據本發明之雜合神經毒素或醫藥組成物適合用於治療與不必要的神經元活性有關之病症，例如選自以下組成的群組的病症：痙攣性發音困難、痙攣性斜頸(spasmodic torticollis)、喉肌張力不全、口下頷發音困難、舌肌張力不全、頸肌張力不全、局部性手肌張力不全、瞼痙攣、斜視、半面痙攣、眼瞼障礙、腦性麻痺、局部痙攣狀態及其他聲音障礙、痙攣性結腸炎、神經性膀胱障礙、肛門痙攣、肢體痙攣狀態(limb spasticity)、抽搐(tics)、震顫、磨牙、肛裂、弛緩不能、吞嚥困難及其他肌張力障礙、及以肌肉群的不自主運動為特徵的其他障礙、流淚、多汗症(hyperhidrosis)、過度流涎、胃腸道分泌過多、分泌障礙、來自肌肉痙攣的疼痛、頭痛、偏頭痛及皮膚病症狀。

於另一態樣，本發明提供一種依據本發明之雜合神經毒素或醫藥組成物之非治療用途，其係用於處理美容或化妝的情況。依據本發明之此態樣，於美容或化妝的情況備處理的受試者係較佳為未罹患本文所述的病理障礙或病症之任一者。更佳地，該受試者為一健康受試者(即，未罹患任何病理疾病或病症)。

於另一態樣，本發明提供一種包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素，其用於治療與不必要的神經元活性有關之肢體障礙，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自GM1a、GM1b、GD1a及GalNAc-GD1a之一種以上的神經節苷脂。於一具體實施例中，該肢體障礙係選自上肢痙攣狀態、下肌痙攣狀態及局部手肌張力不全。於一較佳具體實施例，該神經節苷脂為GM1a。

於另一態樣，本發明提供一種包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素，其用於治療與不必要的神經元活性有關之頭及頸障礙，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自GT1a及GQ1b之一種以上的神經節苷脂。於一具體實施例中，該頭及頸障礙係選自頸部肌張力障礙、瞼痙攣、偏頭痛、肌筋膜疼痛、斜視、半面痙攣、眼瞼障礙、痙攣性發音困難、喉肌張力不全、口下頜發音困難、舌肌張力不全、磨牙症及吞嚥困難。

於另一態樣，本發明提供一種包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素，其用於治療流涎(過度流涎、流涎)，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至GM1。

於另一態樣，本發明提供一種治療方法，包含投予治療上有效量的依據本發明之雜合神經毒素或醫藥組成物至需要其之病患。

於另一態樣，本發明提供提供一種治療與不必要的神經元活性有關之肢體障礙之方法，其包含：投予治療上有效量之包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素至需要其之病患，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自GM1a、GM1b、GD1a及GalNAc-GD1a之一種以上的神經節苷脂。

於另一態樣，本發明提供一種治療與不必要的神經元活性有關之頭或頸障礙之方法，其包含：投予治療上有效量的包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素至需要其之病患，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自GT1a及GQ1b之一種以上的神經節苷脂。

於另一態樣，本發明提供一種治療流涎(過度流涎、流涎)之方法，其包含：投予治療上有效量的包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素至需要其之病患，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至GM1。

於另一態樣，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含：投予治療上有效量的包含梭狀芽孢桿菌輕鏈及選擇性神經節苷脂結合部分之雜合神經毒素至需要其之病患，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H_CC或H_C域，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3及GD2之一種以上的神經節苷脂。

應瞭解與本文所述之雜合神經毒素及較佳具體實施例有關之所有其他各種特徵經過必要的修改適用於本發明之治療及美容方面。

亦應瞭解根據本發明之醫藥組成物可用於本發明之治療及美容目的。

本發明之工程改造的雜合神經毒素可被配製用於口服、非腸胃道、連續輸注、吸入或局部施用。適於注射的組成物可為溶液、懸浮液或乳液、或者使用前溶解或懸浮於適當的媒液(vehicle)中的乾粉之形式。

於雜合神經毒素被局部遞送的情形，雜合神經毒素可以霜劑(例如用於局部施用)或用於皮下注射的方式配製。

局部遞送方式可包括氣溶膠(aerosol)或其它噴霧(例如噴霧器(nebuliser))。以此方面，遞送到肺及/或其他鼻及/或支氣管或呼吸道通道。

本發明之雜合神經毒素可藉由鞘內注射或硬膜外注射於涉及受影響的器官的神經支配的脊髓段部位的脊柱中來投予至患者。

較佳投予途徑係經由腹腔鏡及/或局部的(特別是肌肉內)注射。

用於投予本發明之神經毒素之劑量範圍係產生所欲治療效果的劑量範圍。應當理解，所需的劑量範圍取決於雜合神經毒素或組成物之精確性質、投予途徑、製劑的性質、患者年齡、患者病症的性質、範圍或嚴重性、禁忌(若有的話)、以及主治醫師的判斷。可使用用以最佳化之標準經驗慣例來調整於此等劑量程度的變動。

一般利用雜合神經毒素及無熱原無菌媒液製備流體劑型。依所使用的媒液及濃度，工程改造的雜合神經毒素可溶解或懸浮於媒液中。於製備溶液時，雜合神經毒素可溶解在媒液中，若需要，藉由添加氯化鈉使溶液為等滲透壓，且於填充到適當的無菌小瓶或安瓿中並密封之前，透過使用無菌技術的無菌過濾器來過濾滅菌。或者，若溶液安定性為適當的，則其密封容器中的溶液可以藉由高壓蒸氣滅菌來滅菌。有利的是，如緩衝劑、助溶劑、安定劑、防腐劑或殺菌劑、懸浮劑或乳化劑及/或局部麻醉劑之添加劑可被溶解於媒液中。

使用前溶解或懸浮於適當的媒液之乾粉可藉由使用無菌技術於無菌區中填充經預滅菌的成分至無菌容器來製備。或者，可使用無菌技術於無菌區中將成分溶解於適當的容器。然後將產品冷凍乾燥並將容器無菌密封。

適合用於肌肉內、皮下或皮內注射之非腸胃道懸浮液，除了無菌組份係被懸浮於無菌媒液而替代溶解，且滅菌無法藉由過濾而完成以外，係以實質上相同的方式被製備。組份可在無菌狀態下被單離，或者其可在單離後藉由例如γ射線照射而滅菌。

依據本發明之投予可利用多種遞送技術，包括微粒子包囊(microparticle encapsulation)、病毒遞送系統或高壓氣溶膠衝擊(high-pressure aerosol impingement)。

本揭示並未受限於本文所揭示之示例性方法及材料，且於本文所述為類似或相等之任何方法及材料皆可用於本文揭示的具體實施例的實踐或測試。數字範圍包括定義範圍之數字。除非另有指明，任何核酸序列皆以5'至3'的方向從左到右寫入；胺基酸序列以胺基至羧基的方向從左到右寫入。

在提供一數值範圍時，應當理解，除非上下文另有明確指明，否則在該範圍的上限及下限之間的每個居中值(intervening value)至下限單位的十分之一亦被具體揭示。在本揭示內容中包含「在所述範圍內的任何所述值或居中值」與「所述範圍內的任何其他所述或居中值」之間的每個較小範圍。此等較小範圍的上限及下限可獨立地在該範圍內被包括或排除，且其中於較小範圍內包含此限值中的任一個、兩個皆不包含或兩者皆包含之每個範圍亦被包括於本揭示內容中，受到於所述範圍內任何明確排除的限制。當於所述範圍包括此限值的一個或兩個時，排除彼等所包含的限值之一個或兩個的範圍亦包括於本揭示內容。

必須注意於本文及所附申請專利範圍中使用時，單數形式「一」(「a」、「an」)、及「此」(「the」)包括複數的指涉對象，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及「一種梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括多種的此種候選藥劑及提及「此梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括提及本技術領域中具有通常知識者已知的一種或多種梭狀芽孢桿菌神經毒素及其等效物(equivalent)等。

序列資訊

‧SEQ ID NO：1-BoNT/A1-UniProtKB登錄號P10845(肉毒桿菌)

‧SEQ ID NO：2-BoNT/B1-UniProtKB登錄號P10844(肉毒桿菌)

‧SEQ ID NO：3-BoNT/C1-UniProtKB登錄號P18640(肉毒桿菌)

‧SEQ ID NO：4-BoNT/D-UniProtKB登錄號P19321(肉毒桿菌)

‧SEQ ID NO：5-BoNT/E-登錄號WP_003372387(肉毒桿菌)

‧SEQ ID NO：6-BoNT/F-UniProtKB登錄號YP_001390123(肉毒桿菌)

‧SEQ ID NO：7-BoNT/G-UniProtKB登錄號WP_039635782(肉毒桿菌)

‧SEQ ID NO：8-TeNT-UniProtKB登錄號P04958(破傷風桿菌)

‧SEQ ID NO：9-霍亂毒素B次單元(霍亂弧菌)

‧SEQ ID NO：10-霍亂毒素A次單元(霍亂弧菌)

‧SEQ ID NO：11-BoNT/A1(0)-CtxBCP(人工序列)

現僅藉由示例的方式，參考下列圖式及實施例來描述本發明。

圖1：Ctx-BoNT雜合神經毒素之範例。

圖2：藉由HisTrap HP捕獲管柱之SDS-PAGE分析的級分。目標構建體於級分E3-F6(250mM-500mM咪唑)中洗脫。

圖3：藉由第二層析步驟之SDS-PAGE，陰離子交換分析的級分。目標蛋白質於級分13-30(越來越多的NaCl濃度)中洗脫。

圖4：以腸激酶活化後藉由SDS-PAGE分析的級分。此分析顯示蛋白質於蛋白質水解活化之前係不穩定的，儘管一些構建體似乎保持完整。腸激酶活化確實於輕鏈及重鏈之間切割構建體，且由SDS-PAGE分析暗示，至少一些產物具有預測的組成，即完整的輕鏈及重鏈以及於中央呈現時附著的GS20及CtxB。

圖5：以腸激酶活化後的西方墨點轉漬法分析。5A-以單株tetra his抗體(monoclonal tetra his antibody)、二抗鼠共軛物(secondary anti-mouse conjugate)處理的墨點；5B-以抗-LcA抗體及二抗兔共軛物(secondary anti-rabbit conjugate)處理的墨點。

圖6：於GM1競爭性結合試驗中評估游離Ctx-B、BoNT/A1(0)-CtxBCP及BoNT/A1(0)。

[實施例]

實施例1 -BoNT/A1(0)-CtxBCP之表現及純化

基於CtxB初級蛋白質序列(SEQ ID NO：11之殘基22至103)設計經理想化的(用於大腸桿菌的)構建體之密碼子，並將其次選殖至具有T5啟動子的pJ401質體中的endonegative BoNT/A中以產生具有腸激酶活化位點(EK)、GS20連接子及C端His-標籤：LcA(0)-EK-CtxB-GS20-H_cA-6HT的集中呈現的構建體(BoNT/A1(0)-CtxBCP)。

將該構建體轉形至大腸桿菌菌株BL21(DE3)，於補充有甘油(0.4%Sigma)、葡糖胺(0.2%，Sigma)及30μg/ml Kan(Sigma)的mTB培養基(胰腖12g/l、酵母提取物24g/l、磷酸二氫鈉9.4g/l、磷酸二氫鉀2.2g/l，Melford)。挑選單個菌落接種一小瓶微型珠子。將接種的珠子儲存在-80℃直到需要。使用一個珠子於37℃下接種於100ml的mTB培養基。當於600nm處之吸光度達到4.6時，將100ml培養物之10ml加入2L燒瓶中的1L培養基中，培養物於37℃生長至OD 6001.0。將溫度降至16℃，使培養物冷卻1小時，然後加入IPTG至終濃度為1mM。誘導持續20小時。然後藉由於4℃以6000g離心20分鐘收取培養物。傾倒出用過培養基，並將沉澱物冷凍並儲存於-80℃直至需要。

將細胞沉澱物解凍並再懸浮於6ml/g裂解緩衝液(50mM Tris pH 8.0，200mM NaCl)中。於20kpsi單次通過均質器裂解細胞。藉由於30,000g下離心30分鐘來清除細胞碎片及不溶性物質。收集上清液並裝載到5ml HisTrap管柱(預先裝有Ni²⁺且經裂解緩衝液平衡)。裝載後以裂解緩衝液洗滌清洗此管柱50ml，之後洗脫蛋白質，以遞增的咪唑濃度梯度梯度25ml 40mM、50ml 80mM、25ml 125mM、25ml 250mM及25ml 500mM。全部收集2.5毫升級分，並藉由SDS-PAGE確定目標嵌合體的位置(圖2)。

將含有目標蛋白質的級分E3-F6(250mM-500mM咪唑)合併，並使用53ml 26/10的脫鹽管柱進行脫鹽。將物質脫鹽到QHP結合緩衝液(50mM Tris pH 8.0)中。將緩衝液交換的材料保持成為一個池(pool)，並藉由陰離子交換進一步處理。

使用5ml HiTrap QHP管柱進一步純化嵌合體。裝載脫鹽池之前，將該管柱於結合緩衝液(50mM Tris pH8.0)中預平衡。將管柱以結合緩衝液洗滌25ml，然後以100ml的0-350mM NaCl線性梯度洗脫蛋白質。然後以25毫升350mM-1M NaCl的高鹽步驟洗滌管柱。收集2.5ml級分全部並藉由SDS-PAGE分析以確定哪一級分含有目標蛋白質(圖3)。

將含有目標蛋白質的級分13-30合併並濃縮，然後於4℃下以腸激酶活化18小時，並添加AEBSF以終止反應。

藉由SDS-PAGE分析此最終材料(圖4)。

此分析顯示蛋白質於蛋白水解活化之前為不穩定的，儘管一些構建體似乎保持完整。腸激酶活化確實於輕鏈及重鏈之間切割構建體，且由SDS-PAGE分析暗示至少一些產物具有預測的組成，即完整的輕鏈及重鏈以及在中央呈現時附著的GS20和CtxB。

亦藉由西方墨點轉漬法分析樣品以確認輕鏈及his標籤的存在(圖5)。使用Bio-Rad trans-blot渦輪轉移系統將蛋白質從凝膠轉移到硝基纖維素膜上。於PBST 0.5%BSA中封阻墨點。墨點以單株tetra his抗體、二抗鼠共軛物處理，或者以抗-LcA及二抗兔處理。使用超級信號基質產生信號，並於Pxi 4中檢測。西方墨點轉漬法顯示全長目標以及產物相關的截短物。

實施例2 -BoNT/A1(0)-CtxBCP對GM1之結合

簡而言之，以100ng/ml GM1塗覆透明的F96 Maxisorp板隔夜，以2%BSA-PBS溶液封阻並以游離霍亂毒素B次單元(游離Ctx-B)、BoNT/A1(0)-CtxBCP或BoNT/A1(0)於指定的濃度下預溫育。將該板與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)共軛的40μg/ml霍亂毒素B次單元(Ctx-B-HRP)進一步溫育。以顯影液測定洗滌後的平板上的HRP活性，在反應停止後測定450nm的吸光度。數據為一式三份的孔(triplicate wells)之平均值±s.e.平均值(圖6)。

圖6顯示：‧如預期的，BoNT/A1(0)並未與Ctx-B(Ctx-B-HRP)競爭結合至GM1；‧如預期的，游離的Ctx-B確實與Ctx-B-HRP競爭，且以0.2μg/ml之pEC₅₀；BoNT/A1(0)-CtxBCP能夠競爭Ctx-B-HRP，顯示比游離Ctx-B(49μg/ml)低約100倍的pEC₅₀

總之，Ctx-B域的加入賦予BoNT/A1(0)結合GM1的能力，GM1為一種神經節苷脂，其並非BoNT/A1(0)的天然受體。

<110> 艾普森生物製藥有限公司

<120> 雜合神經毒素

<130> IBL 005-EP-PCT

<150> EP16191468.4

<151> 2016-09-29

<160> 11

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1296

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 1291

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 2

<210> 3

<211> 1291

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 3

<210> 4

<211> 1276

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 4

<210> 5

<211> 1252

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 5

<210> 6

<211> 1278

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 6

<210> 7

<211> 1297

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

<400> 7

<210> 8

<211> 1315

<212> PRT

<213> 破傷風桿菌

<400> 8

<210> 9

<211> 124

<212> PRT

<213> 霍亂弧菌

<400> 9

<210> 10

<211> 258

<212> PRT

<213> 霍亂弧菌

<400> 10

<210> 11

<211> 1430

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BoNT/A1(0)-CtxBCP

<400> 11

Claims

一種雜合神經毒素，其包含梭狀芽孢桿菌輕鏈(L)及選擇性神經節苷脂結合部分(selective ganglioside binding moiety)，其中該選擇性神經節苷脂結合部分並非梭狀芽孢桿菌H _CC或H _C域。
如請求項1之雜合神經毒素，其中該雜合神經毒素進一步包含轉位部分(translocation moiety)。
如請求項2之雜合神經毒素，其中該轉位部分係選自由下列組成的群組：梭狀芽孢桿菌H _N域、霍亂毒素A2次單元(CtxA2)、及細胞穿透肽(cell penetrating peptides)。
如請求項2或3之雜合神經毒素，其中該轉位部分為梭狀芽孢桿菌H _N域，且其中該雜合神經毒素包含於輕鏈及梭狀芽孢桿菌H _N域之間的活化位。
如請求項1至4中任一項之雜合神經毒素，其中該雜合神經毒素進一步包含梭狀芽孢桿菌H _CN及/或H _CC域。
如請求項1至5中任一項之雜合神經毒素，其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至一種以上的神經節苷脂，其選自由下列組成的群組：GM1，如GM1a或GM1b；GM2；GM3，如NeuAc GM3或NeuGc GM3；GM4；GD1a；GalNAc-GD1a；GT1a；GT1b；GQ1b；GD2；GD3；及其組合。
如請求項6之雜合神經毒素，其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至GM1，且其中該選擇性神經節苷脂結合部分包含一個以上的霍亂毒素B次單元(CtxB)或大腸桿菌熱不穩定腸毒素( E.coli heat labile enterotoxin，LT)。
如請求項7之雜合神經毒素，其中該選擇性神經節苷脂結合部分包含一個以上的霍亂毒素B次單元(CtxB)且該輕鏈共價結合至該一個以上的霍亂毒素B次單元(CtxB)。
如請求項7之雜合神經毒素，其中該選擇性神經節苷脂結合部分包含一個以上的霍亂毒素B次單元(CtxB)且該雜合神經毒素包含霍亂毒素A2次單元(CtxA2)，其中該CtxA2共價結合至該梭狀芽孢桿菌輕鏈，且其中該CtxB與該梭狀芽孢桿菌輕鏈形成非共價連結(non covalent link)。
如請求項1至9中任一項之雜合神經毒素，其中該梭狀芽孢桿菌輕鏈係來自BoNT A型、B型、C1型、D型、E型、F型或G型、或TeNT。
一種核苷酸序列，其編碼如請求項1至10中任一項之雜合神經毒素。
一種載體，其包含如請求項11之核苷酸序列。
一種細胞，其包含如請求項11之核苷酸序列或如請求項12之載體。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至10中任一項之雜合神經毒素。
如請求項1至10之雜合神經毒素或如請求項14之醫藥組成物，其使用於治療。
如請求項1至10中任一項之雜合神經毒素或如請求項14之醫藥組成物，其使用於治療與不必要的神經元活性有關之肢體障礙，其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至其選自GM1a、GM1b、GD1a及GalNAc-GD1a之一種以上的神經節苷脂。
如請求項1至10中任一項之雜合神經毒素或如請求項14之醫藥組成物，其使用於治療與不必要的神經元活性有關之頭或頸障礙，其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自GT1a及GQ1b之一種以上的神經節苷脂。
如請求項1至10中任一項之雜合神經毒素或如請求項14之醫藥組成物，其使用於治療流涎，其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至神經節苷脂部分GM1。
如請求項1至10中任一項之雜合神經毒素或如請求項14之醫藥組成物，其使用於治療癌症，其中該選擇性神經節苷脂結合部分結合至選自NeuAc GM3、NeuGc GM3、GM2、GM1、GD3及GD2之一種以上的神經節苷脂。
一種如請求項1至10中任一項之雜合神經毒素或如請求項14之醫藥組成物之非治療用途，其用於處理美容狀況(aesthetic condition)。