CN102573877A - 使用神经营养蛋白再靶向内肽酶治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本说明书公开了TVEMP、包含此类TVEMP的组合物和使用此类TVEMP组合物治疗哺乳动物的癌症的方法。

Description

使用神经营养蛋白再靶向内肽酶治疗癌症的方法
本专利申请依据35 U.S.C.§119(e)要求于2009年8月14日提交的第61/233,969号美国临时专利申请(将其通过引用整体并入本文)的优先权。
癌症是超过100种疾病的组群，在所述疾病中一组细胞显示不受控制的生长(超出正常限制的细胞分裂)。在大多数情况下，癌细胞形成一团称为肿瘤的细胞，尽管在某些癌症如白血病中，细胞不形成肿瘤。肿瘤可以是恶性的或良性的。此外，恶性肿瘤(或癌症)包括具有异常遗传物质的细胞并且通常经历快速不受控制的细胞生长，侵袭并且破坏邻近组织，并且有时通过淋巴液或血液扩散至身体的其它位置(即，转移)。癌症与死亡的高发生率相关，因为如果不终止癌症在整个身体中的侵袭和转移，那么癌细胞将侵袭生命器官，并且导致器官的功能障碍，最终导致死亡。癌症的恶性性质使它们区别于良性肿瘤，所述良性肿瘤通常缓慢生长并且具有自限性，不侵袭或转移，这样，它们通常不威胁生命。在局部、局域或远距离阶段上的癌症被认为是侵袭性的。仅在少数几层细胞中发现的非常早期的癌症(称为原位癌)被认为是非侵袭性的。
癌症是它们的病因和生物学有很大不同的不同种类的疾病。癌症可由多种单独作用或组合作用的因素引起。某些癌症由外部因素例如烟草、饮食、某些化学药品、辐射和病毒引起。其它癌症由内部因素例如激素、免疫状况和固有的遗传突变引起。从暴露于引发癌症的因素至疾病可被检测通常经历10年或更多年的时间。
癌症通常通过与肿瘤相似的细胞的类型来分类，因此，组织假定为肿瘤的来源。癌是衍生自上皮细胞的恶性肿瘤。该组代表最常见的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。肉瘤是衍生自结缔组织或间充质细胞的恶性肿瘤。胚细胞瘤通常是与未成熟或胚胎组织相似的恶性肿瘤。此类肿瘤中的许多肿瘤在儿童中最常见。淋巴瘤和白血病是衍生自造血(形成血液的)细胞的恶性肿瘤。最后，生殖细胞肿瘤是衍生自全能细胞的肿瘤。在成人中，最常见地见于睾丸和卵巢中；在胎儿、婴儿和幼儿中，最常见地见于身体中线，特别地在尾骨的尖端。
癌症是美国的第二大死亡原因，据估计在1998年发生1,228,600例新病例和564,800例死亡。在过去的50年中，癌症的死亡率一直在稳定上升，主要归因于因吸烟引起的肺癌死亡率的大大上升。癌症在所有年龄的人中发生，但其发生在45岁以上的人中极大地增加。然而，癌症是美国35至65岁的人的第一大死因，并且其也是15岁以下美国儿童中的非事故死亡的第一大原因。男性因癌症而具有比女性更高的死亡率，并且黑人具有任何主要人种组的最高癌症死亡率。在美国，男性发生癌症的终生危险为约1/2，女性具有约1/3的终身风险。随着预期的心脏病和中风引起的死亡的持续减少，癌症到2010年将成为整个美国人口的总体上第一大死因。
癌症的诊断通常需要由病理学家对组织活检样本进行组织学检查，虽然恶性肿瘤的最初指标可以是症状或放射摄影影像异常。一旦被诊断，通常通过手术、化学疗法、放射疗法或靶向疗法如免疫疗法、激素疗法或血管生成抑制剂疗法来治疗癌症。治疗的选择取决于肿瘤的位置和分级及疾病的分期，以及患者的一般健康状况(体力状态)。此外，取决于癌症的类型和分期，可同时组合或相继使用这些类型的癌症治疗的两种或更多种治疗。虽然完全除去癌症而不损害身体的其余部分是治疗的目的，但目前治疗癌症的方法只获得有限的成功。关于手术，这部分归因于个别或少数癌细胞侵袭邻近组织或转移至远距离部位的倾向性，从而限制局部手术治疗的功效。化学疗法和放射疗法的功效通常受到对身体正常组织的毒性和损伤的限制。虽然靶向疗法具有前景，但正如它们的名称所暗示的，这类治疗通常特异于一种特定类型的癌症。因此，对于癌症的治疗高度期望可靶向癌细胞(无论它们的位置如何)的化合物和方法。此外，可靶向目前无靶向疗法的特定类型的癌症的化合物和方法也是高度期望的。
梭菌毒素例如肉毒毒素(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(TeNT)抑制神经元传递的能力正被用于许多治疗和美容应用中，参见例如William J.Lipham，Cosmetic and Clinical Applications of BotulinumToxin(Slack，Inc.，2004)。作为药物组合物的商购可得的梭菌毒素包括BoNT/A制剂，例如BOTOX
Figure BDA0000152179730000031
(Allergan，Inc.，Irvine，CA)、DYSPORT
Figure BDA0000152179730000032
/RELOXIN
Figure BDA0000152179730000033
，(Beaufour Ipsen，Porton Down，England)、NEURONOX
Figure BDA0000152179730000034
(Medy-Tox，Inc.，Ochang-myeon，SouthKorea)BTX-A(Lanzhou Institute Biological Products，China)和XEOMIN
Figure BDA0000152179730000035
(Merz Pharmaceuticals，GmbH.，Frankfurt，Germany)；以及BoNT/B制剂，例如，MYOBLOCTM/NEUROBLOCTM(SolsticeNeurosciences，Inc.San Francisco，CA)。例如，BOTOX
Figure BDA0000152179730000036
目前在一个或多个国家被批准用于下列适应症：失弛缓症、成人痉挛状态(adultspasticity)、肛门裂、背痛、眼睑痉挛、夜磨牙症、颈肌张力障碍、特发性震颤、眉间皱纹(glabellar lines)或运动过度面部皱纹(hyperkineticfacial lines)、头痛、半面痉挛、膀胱的活动过度、多汗症、青少年脑瘫、多发性硬化、肌阵挛障碍(myoclonic disorder)、鼻唇皱纹(nasallabial lines)、痉挛性发音困难(spasmodic dysphonia)、斜视和VII神经障碍。
梭菌毒素治疗通过中断用于将神经递质分泌入突触间隙的胞吐过程来抑制神经递质释放。该中断最终通过包含酶促结构域的梭菌毒素轻链的细胞内递送来实现，所述轻链在所述酶促结构域中切割胞吐过程所必需的SNARE蛋白。制药工业极其期望使梭菌毒素疗法的用途超出其目前的肌肉松弛应用，扩展至治疗其它疾病例如多种基于感觉神经的疾病如慢性疼痛、神经原性感染和泌尿生殖器疾病以及基于非神经障碍例如胰腺炎和癌症。目前被利用于扩展基于梭菌毒素的治疗的一个方法包括修饰梭菌毒素以便经修饰的毒素对于非梭菌毒素靶细胞具有改变的细胞靶向能力。该再靶向能力通过用靶向性结构域(显示对于存在于非梭菌毒素靶细胞中的非梭菌毒素受体的选择性结合活性)替代梭菌毒素的天然存在的靶向性结构域来实现。对靶向性结构域的此类修饰导致能够选择性结合存在于非梭菌毒素靶细胞的非梭菌毒素受体(靶受体)(被再靶向)。具有对于非梭菌毒素靶细胞的靶向性活性的经修饰的梭菌毒素可结合存在于非梭菌毒素靶细胞上的受体，转移进入细胞质，然后对非梭菌毒素靶细胞的SNARE复合物发挥其蛋白水解作用。在本质上，通过选择适当的靶向性结构域将包含酶促结构域的梭菌毒素轻链细胞内递送至任何期望的细胞。
本说明书公开了一类再靶向称为靶向囊泡胞吐调节蛋白(Targeted Vesicular Exocytosis Modulating Protein)(TVEMP)的非梭菌毒素受体的经修饰的梭菌毒素、包含TVEMP的组合物和用于治疗患有癌症的个体的方法。TVEMP是重组产生的蛋白质，其包含靶向性结构域以及梭菌毒素的转位结构域和酶促结构域。选择靶向的结合存在于目的靶癌细胞上的受体的能力。梭菌毒素转位结构域和酶促结构域用于将酶促结构域递送入靶细胞的细胞质，在所述细胞质中其切割其同源SNARE底物。SNARE蛋白切割中断胞吐作用，其中细胞内囊泡中包含的物质通过囊泡膜与外细胞膜的融合从细胞排出的细胞分泌和排泄的过程。该中断阻止细胞的许多重要过程，包括但不限于跨膜蛋白(包括细胞表面受体和信号转导蛋白)的插入；细胞外基质蛋白至细胞外隙的运输；蛋白质(包括生长因子、血管生成因子、神经递质、激素和参与细胞通讯的任何其它分子)的分泌；和物质(包括废物、代谢产物和其它不想要的或有害分子)的排除。这样，胞吐中断严重地影响了细胞代谢，并且最终影响细胞存活力。因此减少或抑制细胞的胞吐的治疗性分子削弱了细胞存活的能力。基于该假定，本文中公开的TVEMP经设计靶向癌细胞，其中酶促结构域的随后转移通过SNARE蛋白切割中断胞吐，从而削弱癌细胞存活的能力。
因此，本发明的方面提供了包含TVEMP的组合物，所述TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域。用于此类组合物的开发的TVEMP描述于例如Steward，L.E.等人，Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilitiesand Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells，第11/776,075号美国专利申请(2007年7月11日)；Dolly，J.O.等人，Activatable Clostridial Toxins，第11/829,475号美国专利申请(2007年7月27日)；Foster，K.A.等人，Fusion Proteins，第WO 2006/059093号国际专利公布(2006年6月8日)；和Foster，K.A.等人，Non-CytotoxicProtein Conjugates，第WO 2006/059105号国际专利公布(2006年6月8日)(将所述每一个专利通过引用并入本文)。包含TVEMP的组合物可以是药物组合物。除TVEMP以外，此类药物组合物还可包括药用载体、药用组分或两者。
本发明的其它方面提供了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含TVEMP的组合物的步骤，所述TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域，其中组合物的施用减轻与癌症相关的症状。预期可使用本文中公开的任何TVEMP，包括在例如Steward，同上(2007)；Dolly，同上(2007)；Foster，同上，WO 2006/059093(2006)；和Foster，同上，WO 2006/059105(2006年6月8日)中公开的TVEMP。公开的方法提供了用于治疗癌症的安全、价廉、基于门诊患者的治疗。
本发明的其它方面提供了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的包含TVEMP的组合物，所述TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素酶促结构域以及外源蛋白酶切割位点，其中组合物的施用减轻与癌症相关的症状。设想可使用本文中公开的任何TVEMP，包括在例如Steward，同上(2007)；Dolly，同上(2007)；Foster，同上，WO2006/059093(2006)；和Foster，同上，WO 2006/059105(2006年6月8日)中公开的TVEMP。
本发明的其它方面提供了TVEMP在制造用于治疗有此需要的哺乳动物的癌症的药物中的用途，其中TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域并且其中给哺乳动物施用治疗有效量的药物减轻与癌症相关的症状。设想可使用本文中公开的任何TVEMP，包括例如例如Steward，同上(2007)；Dolly，同上(2007)；Foster，同上，WO 2006/059093(2006)；和Foster，同上，WO2006/059105(2006年6月8日)中公开的TVEMP。
本发明的其它方面提供了TVEMP在治疗有此需要的哺乳动物的癌症中的应用，所述应用包括给哺乳动物施用治疗有效量的TVEMP的步骤，其中TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素酶促结构域并且其中TVEMP的施用减轻与癌症相关的症状。设想可使用本文中公开的任何TVEMP，包括例如Steward等人，(2007)；Dolly，同上(2007)；Foster等人，WO 2006/059093(2006)；和Foster等人，WO 2006/059105(2006年6月8日)中公开的TVEMP。
附图简述
图1显示中枢和周围神经无的神经递质释放和梭菌毒素中毒的当前范例的示意图。图1A显示中枢和周围神经元的神经递质释放机制的示意图。释放过程可描述为包括两个步骤：1)囊泡停靠(vesicledocking)，其中包含神经递质分子的囊泡的囊泡结合SNARE蛋白与位于质膜上的膜结合SNARE蛋白结合；和2)神经递质释放，其中囊泡与质膜融合并且神经神经递质分子被外排。图1B显示中枢和周围神经元的破伤风和肉毒毒素的中毒机制的示意图。该中毒过程可被描述为包括4个步骤：1)受体结合，其中梭菌毒素结合梭菌属受体系统并且起始中毒过程；2)复合物内化，其中在毒素结合后，包含毒素/受体系统复合物的囊泡被胞吞入细胞；3)轻链转位(translocation)，其中多个事件被认为发生，包括例如囊泡的内pH的改变，包含梭菌毒素重链的HN结构域的通道孔的形成，梭菌毒素轻链与重链的分离以及活性轻链的释放和4)酶促靶修饰，其中梭菌毒素的激活轻链蛋白水解切割其靶SNARE底物，例如，SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白，从而阻止囊泡停靠和神经递质释放。
图2显示天然存在的梭菌毒素的结构域组织。轻链形式描绘了包括酶促结构域、转位结构域和靶向性结构域的氨基至羧基线性组织。位于转位结构域与酶促结构域之间的双链环区域被描绘为双SS挂件(bracket)。该区域包含内源双链环蛋白酶切割位点，该切割位点当被天然存在的蛋白酶例如，内源梭菌毒素蛋白酶或环境中产生的天然存在的蛋白酶蛋白水解切割时，将毒素的单链形式转变成双链形式。在单链形式上方，描绘了梭菌毒素结合结构域的HCC区域。该区域包括β-三叶草结构域，所述结构域在氨基至羧基的线性组织中包含α-折叠、β4/β5发夹转角、β-折叠、β8/β9发夹转角和γ-折叠。
图3显示具有位于氨基末端的靶向性结构域的TVEMP。图3A描绘了包括靶向性结构域、转位结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、和酶促结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割时，将毒素的单链形式转变成双链形式。图3B描绘了包括靶向性结构域、酶促结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、和转位结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割时，毒素的单链形式被转变成双链形式。
图4显示具有位于其它两个结构域之间的靶向性结构域的TVEMP。图4A描绘了具有包括酶促结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、靶向性结构域和转位结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割时，将毒素的单链形式转变成双链形式。图4B描绘了具有包括转位结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、靶向性结构域和酶促结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割后，将毒素的单链形式转变成双链形式。图4C描绘了具有包括酶促结构域、靶向性结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、和转位结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割后，将毒素的单链形式转变成双链形式。图4D描绘了具有包括转位结构域、靶向性结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、和酶促结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。当用P蛋白酶蛋白水解切割后，将毒素的单链形式转变成双链形式。
图5显示具有位于羧基末端的靶向性结构域的TVEMP。图5A描绘了具有包含酶促结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、转位结构域和靶向性结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。在用P蛋白酶蛋白水解切割后，毒素的单链形式被转变成双链形式。图5B描绘了具有包括转位结构域、包含外源蛋白酶切割位点(P)的双链环区域、酶促结构域和靶向性结构域的氨基至羧基线性组织的TVEMP的单链多肽形式。在用P蛋白酶进行蛋白水解切割后，将毒素的单链形式转变成双链形式。
详述
癌症是指哺乳动物身体中细胞的不受控制的生长，这样其本质上为影响身体用于控制细胞生长的调控机制的疾病。为了正常细胞转化成癌细胞，必须改变调节细胞生长和分化的基因。遗传改变可在从完整染色体的获得或丢失至影响单个DNA核苷酸的突变的许多水平上发生。癌细胞基因型的巨大目录是一起指示恶性生长的细胞生理学的6个必要改变的表现：1)生长信号的自足性；2)对生长抑制性(抗生长)信号的不敏感性；3)程序化细胞死亡(细胞凋亡)的逃脱；4)无限的复制潜能；5)持续的血管生成；以及6)组织侵袭和转移。Hanahan和Weinberg，The Hallmarks of Cancer，Cell 100(1)：57-70(2000)。
癌细胞显示生长信号的自足性的一个方式是癌基因的表达。癌基因可以是以不适当的高水平表达的正常基因，或具有新的性质的改变的基因。在任一种情况下，这些基因的表达都通过多种方式促进由癌细胞显示的细胞生长的恶性表型。许多细胞可在细胞之间产生分泌性因子如激素，其促进有丝分裂，其作用取决于接受组织或细胞的信号转导。因此，当刺激受体细胞上的激素受体时，信号从细胞的表面传导至细胞核以在细胞核水平上产生基因转录调控的某些改变。某些癌基因本身为信号转导系统的部分，或本身为细胞和组织的信号受体，从而控制对此类激素的敏感性。癌基因通常产生促分裂原，或在蛋白质合成中参与DNA的转录，这产生了负责产生所述产物以及细胞使用和与其相互作用的生化药剂的蛋白质和酶。通常为癌基因的静止对应物的原癌基因的突变可改变它们的表达和功能，从而增加所述产物蛋白质的量或活性。当这发生时，原癌基因变成癌基因，并且该转变扰乱了细胞的细胞周期调控的正常平衡，从而使得不受控制的生长成为可能。癌症的概率不能通过从基因组除去原癌基因(即使这是可能的)而降低，因为它们对于生物体的生长、修复和动态平衡是至关重要的。只有当它们突变时，生长的信号才变得过度。因此，抑制癌细胞的细胞生长信号的治疗策略具有提供治疗癌症的强有力工具，所述癌症因癌基因表达而显示生长信号的自足性。此外，许多癌细胞表达生长因子受体和激活此类受体的配体(自分泌回路)。在正常组织中，一种类型的细胞表达生长因子受体并且另一种类型产生配体(旁分泌回路)以试图维持动态平衡。癌细胞通过表达配体和受体获得生长的自足性。
癌细胞显示对生长抑制性(抗生长)信号的不敏感性的一种方式是对肿瘤抑制基因的表达的抑制。肿瘤抑制基因是抑制癌细胞的细胞分裂、存活或其它性质的基因。肿瘤抑制基因通常因促进癌症的遗传改变而失能。通常，许多基因的改变是将正常细胞转化成癌细胞所必需的。一般而言，肿瘤抑制基因是被细胞应激或DNA损伤激活的转录因子。通常DNA损伤将引起自由飘移的遗传物质以及其它征兆的存在，并且可触发导致肿瘤抑制基因激活的酶和途径。此类基因的功能是阻止细胞周期的进展以进行DNA修复，从而防止突变传递至子代细胞。因此，抑制癌细胞中的细胞分裂信号的治疗策略具有提供强有力的治疗癌症的工具的潜能，所述癌症因肿瘤抑制基因表达的抑制而显示对生长抑制性信号的不敏感。
癌细胞逃避程序化细胞死亡(细胞凋亡)的一种方式是对细胞存活信号(抗细胞凋亡信号)的持续暴露。诱导细胞存活或细胞死亡的信号由质膜中的传感器(即死亡受体)和由细胞内传感器提供。细胞内传感器监控细胞的健康和响应检测异常如DNA损伤、癌基因作用、存活因子不足或缺氧，它们激活死亡途径。因此，当它们具有DNA损伤、激活的癌基因或缺氧(在肿瘤的中心)，癌细胞应当遭受细胞凋亡。几种类型的癌细胞依赖通过自分泌回路递送的存活信号来抵抗由存在于这些细胞中的DNA损伤触发的细胞凋亡信号。这些自分泌回路由癌细胞通过表达生长因子配体和它们的同源受体来建立。因此，抑制由癌细胞产生的细胞存活信号的治疗策略具有提供强有力的治疗癌症的工具的潜力，所述癌症过度激活抗细胞凋亡信号。事实上，文献中存在激素和/或生长因子的撤除可产生癌细胞的细胞凋亡(因为存活与细胞凋亡信号之间的平衡被恢复)的证据。
癌细胞的另一个获得的能力是肿瘤细胞的无限复制潜能。癌细胞通过维持端粒的完整性和逃避因侵蚀端粒的连续倍增而引起的危机状态克服了增殖的限制。癌细胞过表达端粒酶，该端粒酶维持端粒的大小并且允许无限复制潜能。而另一个重要步骤是将膜递送至质膜以完成有丝分裂过程的能力。
当细胞在肿瘤内增殖时，它们也面临其它挑战，如有限的氧和营养物的供给，这可诱导细胞凋亡。因此为了能够维持生长和增殖，肿瘤需要促进现有血管的生长以及新血管的生长(在成熟组织中受到高度调控的过程)。癌细胞分泌促血管生成因子以激活内皮细胞中的受体。此外，隔离在细胞外基质中的促血管生成因子可通过由肿瘤细胞分泌的蛋白酶进行的基质降解获得释放。血管生成的抑制是经验证的治疗性靶，因为几种批准的药物靶向该途径(作为癌症和其它促血管生成疾病的治疗)。
最后，肿瘤细胞获得侵袭邻近组织和转移至远距离位置的能力。为了实现该能力，肿瘤细胞首先可以能够通过改变粘着蛋白和整联蛋白的表达来改变它们的粘着能力。更重要地，为了能够迁移，癌细胞必须能够降解它们周围的细胞外基质。癌细胞以分泌性因子或膜锚定的蛋白酶的形式过表达基质降解蛋白酶并且下调蛋白酶抑制剂的表达。
由于不受控制的细胞生长是所有癌症的根本原因，因此可减少或阻止不受控制的细胞生长的化合物和方法将是癌症的有效治疗。本说明书公开了可减少或阻止由癌细胞显示的不受控制的细胞生长的化合物和方法。新型再靶向内肽酶部分地包括结合结构域和酶促结构域。结合结构域将再靶向内肽酶导向正在表达所述结合结构域的同源受体的特定癌细胞类型。酶促结构域的内肽酶活性性通过切割适当的靶SNARE蛋白抑制胞吐，从而中断胞吐以及受体和膜至质膜的递送。阻止癌细胞的胞吐在治疗上是有用的，因为中断可以例如1)阻止由癌细胞产生的促进有丝分裂的分泌性生长因子的释放；或2)阻止受体至癌细胞的质膜的递送，这可干扰癌细胞接受癌症促进信号例如接受生长刺激信号或细胞存活信号的能力，后者在通过使平衡向癌细胞的细胞凋亡倾斜来消除癌细胞中是有用的；3)阻止膜至质膜的递送，从而终止只可在净获得膜以产生子代细胞的情况下才发生的有丝分裂的过程；4)通过抑制肿瘤细胞或细胞外基质的促血管生成因子的释放减少血管生成；5)通过抑制蛋白酶的释放和通过干扰粘附蛋白和整联蛋白的转换来抑制侵袭和转移。
因此，虽然当前市售的癌症治疗剂一次只靶向一个途径，从而只部分有效，并且允许癌细胞获得对该治疗的抗性，通过抑制胞吐、受体递送和膜递送进行的基于TEVMP的疗法利用单一药物靶向几个途径，从而递送更强的对肿瘤细胞的冲击，从而变得更加有效。此外，当正常细胞不增殖并且不太依赖于存活信号时，它们不受该疗法影响。
本发明的方面部分地提供了TVEMP。如本文中所使用的，“TVEMP”意指包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域的任何分子。用于实施本发明的方面的示例性TVEMP公开于例如Steward，同上，(2007)；Dolly，同上(2007)；Foster，同上，WO 2006/059093(2006)；Foster，同上，WO 2006/059105(2006年6月8日)中。
梭菌毒素各自被翻译为约150kDa的单链多肽，所述多肽随后被天然存在的蛋白酶在二硫化物环内通过蛋白水解切割(图1)。该切割在两个形成二硫桥的半胱氨酸残基之间产生的不连续双链环区域内发生。该翻译后加工产生双链分子，所述分子包含通过两条链之间的单个二硫键和非共价相互作用保持在一起的约50kDa的轻链(LC)和约100kDa的重链(HC)。用于将单链分子转变成双链的天然存在的蛋白酶目前还不清楚。在某些血清型中，例如，BoNT/A(天然存在的蛋白酶)由细菌血清型内源产生并且切割在毒素被释放进环境之前在细胞内发生。然而，在其它血清型中，例如，BoNT/E，细菌菌株似乎不产生能够将毒素的单链形式转变成双链形式的内源蛋白酶。在这些情况下，毒素以单链毒素形式从细胞释放，其随后被环境中发现的天然存在的蛋白酶转变成双链形式。
每一个成熟的双链分子包含3个功能不同的结构域：1)位于LC中的酶促结构域，其包括含有特异性靶向神经递质释放器的核心组分的锌依赖性内肽酶活性的金属蛋白酶区域；2)HC的氨基端半部分(HN)内包含的转位结构域，其促进LC从细胞内小囊泡至靶细胞的细胞质中的释放；和3)在HC的羧基端半部分(HC)中发现的结合结构域，其决定毒素对位于靶细胞表面上的受体复合物的结合活性和结合特异性。D.B.Lacy和R.C.Stevens，Sequence Homology and StructuralAnalysis of the Clostridial Neurotoxins，J.Mol.Biol.291：1091-1104(1999)。HC结构域包含大小大致相同，被α-螺旋分隔，称为HCN和HCC亚域(subdomain)的两个不同的结构特征。表1给出了示例性梭菌毒素中发现的每一个结构域和亚域的近似边界区域。
Figure BDA0000152179730000131
这三个功能结构域的结合、转移和酶促活性全都是毒性所必需的。虽然该过程的所有细节仍然还不十分清楚，但梭菌毒素籍以进入神经元和抑制神经递质释放的总体细胞中毒机制是类似的，无论血清型还是亚型。虽然本申请人不希望受下列描述限制，但中毒机制可被描述为包括至少4个步骤：1)受体结合，2)复合物内化，3)轻链转位，和4)酶促靶修饰(图3)。当梭菌毒素的HC结构域结合位于靶细胞的质膜表面上的毒素特异性受体系统时，该过程被启动。受体复合物的结合特异性被认为部分地通过神经节苷脂与蛋白质受体的特异性组合获得，所述组合似乎很显然包括每一种梭菌毒素受体复合物。当结合后，毒素/受体复合物通过胞吞内化并且内化的囊泡被分选至特定的细胞内途径。转移步骤似乎通过囊泡区室的酸化触发。该过程似乎启动两个重要的pH-依赖性结构重排，所述重排增加毒素的疏水性和促进形成毒素的双链形式。当被激活后，毒素的轻链内肽酶从细胞内囊泡释放进细胞溶胶，在细胞溶胶中其似乎特异性靶向神经递质释放器的3个已知的核心组分之一。这些核心蛋白、囊泡结合膜蛋白(VAMP)/突触泡蛋白、25kDa(SNAP-25)的突触泡蛋白结合蛋白和突触融合蛋白是突触囊泡停靠和在神经末梢融合所必需的并且构成可溶性N-乙基马来酰亚胺-敏感因子-粘附蛋白-受体(SNARE)家族的成员。BoNT/A和BoNT/E切割羧基末端区域中的SNAP-25，从而分别释放9个或26个氨基酸的区段，BoNT/C1还在羧基末端附近切割SNAP-25。肉毒毒素血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风毒素作用于VAMP的保守中心部分，并且将VAMP的氨基端部分释放至胞质溶胶中。BoNT/C1在靠近细胞溶胶膜表面的单个位点上切割突触融合蛋白。突触SNARE的选择性蛋白水解解释了在体内由梭菌毒素引起的神经递质释放的阻断。梭菌毒素的SNARE蛋白靶在多种非神经元类型中对胞吐是共同的；在这些细胞中，如在神经元中，轻链肽酶活性抑制胞吐，参见，例如，Yann Humeau等人，How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block NeurotransmitterRelease，82(5)Biochimie.427-446(2000)；Kathryn Turton等人，Botulinum and Tetanus Neurotoxins：Structure，Function and TherapeuticUtility，27(11)Trends Biochem.Sci.552-558.(2002)；Giovanna Lalli等人，The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons，11(9)Trends Microbiol.431-437(2003)。
本发说明书的方面部分地提供了包含梭菌毒素酶促结构域的TVEMP。如本文中所使用的，术语“梭菌毒素酶促结构域”是指可执行中毒过程的酶促靶修饰步骤的任何梭菌毒素多肽。因此，梭菌毒素酶促结构域特异性靶向梭菌毒素底物并且包括梭菌毒素底物例如SNARE蛋白如SNAP-25底物、VAMP底物和突触融合蛋白底物的蛋白水解切割。梭菌毒素酶促结构域的非限定性实例包括例如BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域和BuNT酶促结构域。
梭菌毒素酶促结构域包括但不限于天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体，例如，梭菌毒素酶促结构域同种型和梭菌毒素酶促结构域亚型；和非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体，例如，保守梭菌毒素酶促结构域变体、非保守梭菌毒素酶促结构域变体、其活性梭菌毒素酶促结构域片段或其任何组合。
如本文中所使用的，术语“梭菌毒素酶促结构域变体”，无论是天然存在的还是非天然存在的，都是指与公开的参照序列(表1)的相应区域具有至少一个氨基酸改变并且可以以与该参照序列的相应区域的同一性百分比来描述的梭菌毒素酶促结构域。除非明确地指出，否则用于实施公开的实施方案的梭菌毒素酶促结构域变体是执行中毒过程的酶促靶修饰步骤的变体。作为非限定性实例，BoNT/A酶促结构域变体与SEQ ID NO：1的氨基酸1/2-429相比较可具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/B酶促结构域变体与SEQ ID NO：6的氨基酸1/2-436相比较可具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/C1酶促结构域变体与SEQ ID NO：11的氨基酸1/2-436相比较可具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/D酶促结构域变体与SEQID NO：13的氨基酸1/2-436相比较可具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/E酶促结构域变体与SEQ ID NO：15的氨基酸1/2-411相比较可具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/F酶促结构域变体与SEQ ID NO：18的氨基酸1/2-428相比较可具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/G酶促结构域变体与SEQ ID NO：21的氨基酸1/2-438相比较可具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；TeNT酶促结构域变体与SEQ ID NO：22的氨基酸1/2-438相比较可具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BaNT酶促结构域变体与SEQ ID NO：23的氨基酸1/2-420相比较可具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；以及BuNT酶促结构域变体与SEQ ID NO：24的氨基酸1/2-411相比较可具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加。
本领域技术人员承认，在梭菌毒素的每一个血清型中，可存在它们的氨基酸序列、同样地编码此类蛋白质的核酸也稍有不同的天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体。例如，目前存在5个BoNT/A亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5，特定的酶促结构域亚型当与SEQ ID NO：1的BoNT/A酶促结构域相比较显示约80％至95％氨基酸同一性。如本文中所使用的，术语“天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体”是指通过天然存在的过程产生的任何梭菌毒素酶促结构域，包括但不限于从选择性剪接的转录物产生的梭菌毒素酶促结构域同种型，通过自发突变产生的梭菌毒素酶促结构域同种型和梭菌毒素酶促结构域亚型。天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体可以以与天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参照梭菌毒素酶促结构域大体上相同的方式起作用，并且可在本说明书的任何方面替代参照梭菌毒素酶促结构域。
天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体的非限定性实例为梭菌毒素酶促结构域同种型例如BoNT/A酶促结构域同种型、BoNT/B酶促结构域同种型、BoNT/C1酶促结构域同种型、BoNT/D酶促结构域同种型、BoNT/E酶促结构域同种型、BoNT/F酶促结构域同种型、BoNT/G酶促结构域同种型、TeNT酶促结构域同种型、BaNT酶促结构域同种型和BuNT酶促结构域同种型。天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体的另一种非限定性实例为梭菌毒素酶促结构域亚型例如，来自亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4或BoNT/A5的酶促结构域；来自BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/Bbv或BoNT/Bnp的酶促结构域；来自亚型BoNT/C1-1或BoNT/C1-2的酶促结构域；来自亚型BoNT/E1、BoNT/E2和BoNT/E3的酶促结构域；来自亚型BoNT/F1、BoNT/F2或BoNT/F3的酶促结构域；以及来自亚型BuNT-1或BuNT-2的酶促结构域。
如本文中所使用的，术语“非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体”是指借助于人操作产生的任何梭菌毒素酶促结构域，包括但不限于，使用随机诱变或推理设计通过基因工程产生的梭菌毒素酶促结构域和通过化学合成产生的梭菌毒素酶促结构域。非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体的非限定性实例包括例如保守梭菌毒素酶促结构域变体、非保守梭菌毒素酶促结构域变体、梭菌毒素酶促结构域嵌合变体以及活性梭菌毒素酶促结构域片段。
如本文中所使用的，术语“保守梭菌毒素酶促结构域变体”是指这样的梭菌毒素酶促结构域，所述酶促结构域具有至少一个被具有至少一种与参照梭菌毒素酶促结构域序列的原始氨基酸的性质相似的性质的另一个氨基酸或氨基酸类似物置换的氨基酸(表1)。性质的实例包括但不限于相似的大小、拓扑学(topography)、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价结合能力、氢键合能力、物理化学性质等或其任何组合。保守梭菌毒素酶促结构域变体可以以与保守梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参照梭菌毒素酶促结构域大体上相似的方式起作用，并且可在本说明书的任何方面替代参照梭菌毒素酶促结构域。保守梭菌毒素酶促结构域变体的非限定性实例包括例如保守BoNT/A酶促结构域变体、保守BoNT/B酶促结构域变体、保守BoNT/C1酶促结构域变体、保守BoNT/D酶促结构域变体、保守BoNT/E酶促结构域变体、保守BoNT/F酶促结构域变体、保守BoNT/G酶促结构域变体、保守TeNT酶促结构域变体、保守BaNT酶促结构域变以及保守BuNT酶促结构域变体。
如本文中所使用的，术语“非保守梭菌毒素酶促结构域变体”是指这样的梭菌毒素酶促结构域，其中1)至少一个氨基酸从非保守梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参照梭菌毒素酶促结构域缺失；2)至少一个氨基酸被添加至非保守梭菌毒素酶促结构域所基于的参照梭菌毒素酶促结构域；或3)至少一个氨基酸被不共有与参照梭菌毒素酶促结构域序列的原始氨基酸的性质相似的任何性质的另一个氨基酸或氨基酸类似物置换(表1)。非保守梭菌毒素酶促结构域变体可以以与非保守梭菌毒素酶促结构域变体所基于的参照梭菌毒素酶促结构域大体上相似的方式起作用，并且可在本说明书的任何方面替代参照梭菌毒素酶促结构域。非保守梭菌毒素酶促结构域变体的非限定性实例包括例如非保守BoNT/A酶促结构域变体、非保守BoNT/B酶促结构域变体、非保守BoNT/C1酶促结构域变体、非保守BoNT/D酶促结构域变体、非保守BoNT/E酶促结构域变体、非保守BoNT/F酶促结构域变体、非保守BoNT/G酶促结构域变体和非保守TeNT酶促结构域变体、非保守BaNT酶促结构域变体和非保守BuNT酶促结构域变体。
如本文中所使用的，术语“活性梭菌毒素酶促结构域片段”是指许多种包含酶促结构域的梭菌毒素片段的任一种，其可用于本说明书的方面，但条件是这些酶促结构域片段可特异性靶向神经递质释放器的核心组分，从而参与执行梭菌毒素籍以蛋白水解切割底物的总体细胞机制。梭菌毒素的酶促结构域在长度上为约420-460个氨基酸并且包含酶促结构域(表1)。研究已显示梭菌毒素酶促结构域的完整长度不是酶促结构域的酶促活性所必需的。作为非限定性实例，BoNT/A酶促结构域的前8个氨基酸不是酶促活性所需要的。作为另一个非限定性实例，TeNT酶促结构域的前8个氨基酸不是酶促活性所需要的。同样地，酶促结构域的羧基末端不是活性所必需的。作为非限定性实例，BoNT/A酶促结构域的最后32个氨基酸不是酶促活性所需要的。作为另一个非限定性实例，TeNT酶促结构域的最后31个氨基酸不是酶促活性所需要的。因此，本实施方案的方面包括包含具有长度为例如至少350、375、400、425或450个氨基酸的酶促结构域的梭菌毒素酶促结构域。本发明的其它方面包括包含具有长度为例如至多350、375、400、425或450个氨基酸的酶促结构域的梭菌毒素酶促结构域。
许多种序列比对法的任一种可用于测定同一性百分比，包括但不限于全局法、局部法和杂交法(hybrid method)，例如，区段逼近法(segment approach method)。测定同一性百分比的方案是在本领域技术人员的能力范围内和来自本文中的教导的常规方法。
全局法将分子的从头至尾的序列对齐，通过合计单个残基对的评分和通过加上空位罚分来确定最佳比对。非限定性方法包括例如CLUSTAL W，参见，例如Julie D.Thompson等人，CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence AlignmentThrough Sequence Weighting，Position-Specific Gap Penalties andWeight Matrix Choice，22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代细化(iterative refinement)，参见，例如，Osamu Gotoh，SignificantImprovement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments byIterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments，264(4)J.Mol.Biol.823-838(1996)。
局部方法通过鉴定由所有输入序列共有的一个或多个保守基序对齐序列。非限定性方法包括例如，匹配盒(Match-box)，参见，例如，Eric Depiereux和Ernest Feytmans，Match-Box：A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences，8(5)CABIOS 501-509(1992)；Gibbs采样(Gibbs sampling)，参见，例如，C.E.Lawrence等人，Detecting Subtle Sequence Signals：A GibbsSampling Strategy for Multiple Alignment，262(5131)Science208-214(1993)；Align-M，参见，例如，Ivo Van Walle等人，Align-MA New Algorithm for Multiple Alignment of Highly DivergentSequences，20(9)Bioinformatics，：1428-1435(2004)。
杂交法组合全局和局部比对法的功能方面。非限定性方法包括例如，段对段比对，参见，例如，Burkhard Morgenstern等人，MultipleDNA and Protein Sequence Alignment Based On Segment-To-SegmentComparison，93(22)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.12098-12103(1996)；T-Coffee，参见，例如，Cédric Notredame等人，T-Coffee：A NovelAlgorithm for Multiple Sequence Alignment，302(1)J.Mol.Biol.205-217(2000)；MUSCLE，参见，例如，Robert C.Edgar，MUSCLE：Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and HighThroughput，32(5)Nucleic Acids Res.1792-1797(2004)；以及DIALIGN-T，参见，例如，Amarendran R Subramanian等人，DIALIGN-T：An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple SequenceAlignment，6(1)BMC Bioinformatics 66(2005)。
本说明书描述了其中一个氨基酸置换另一个氨基酸的不同多肽变体，例如，梭菌毒素酶促结构域变体、梭菌毒素转位结构域变体、靶向结构域变体和蛋白酶切割位点变体。可通过多种因素例如被置换的氨基酸的物理性质(表2)或原始氨基酸如何耐受置换(表3)来评估置换。哪一个氨基酸可被选择来置换多肽中的另一个氨基酸对于本领域技术人员来说是已知的。
Figure BDA0000152179730000201
Figure BDA0000152179730000211
因此，在一个实施方案中，本文中公开的TVEMP包含梭菌毒素酶促结构域。在本实施方案的方面，梭菌毒素酶促结构域包含天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体，例如梭菌毒素酶促结构域同种型或梭菌毒素酶促结构域亚型。在本实施方案的另一个方面，梭菌毒素酶促结构域包含非天然存在的梭菌毒素酶促结构域变体，例如，保守梭菌毒素酶促结构域变体、非保守梭菌毒素酶促结构域变体、活性梭菌毒素酶促结构域片段或其任何组合。
在另一个实施方案中，可用另一个疏水性氨基酸置换梭菌毒素酶促结构域的多肽链中一个特定位置上的疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括例如C、F、I、L、M、V和W。在本实施方案的另一个方面，可用另一个脂肪族氨基酸置换梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸的实例包括例如A、I、L、P和V。在本实施方案的另一个方面，可用另一个芳香族氨基酸置换梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的一个实例包括例如F、H、W和Y。在本实施方案的另一个方面，可用另一个堆叠氨基酸置换梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的堆叠氨基酸。堆叠氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在本实施方案的其它方面，可用另一个极性氨基酸置换梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性氨基酸。极性氨基酸的实例包括例如D、E、K、N、Q和R。在本实施方案的其它方面，可用另一个极性不太强或中性的氨基酸置换梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性不太强或中性的氨基酸。极性不太强或中性的氨基酸的实例包括例如A、H、G、P、S、T和Y。在本实施方案的其它方面，可用另一个带正电荷的氨基酸置换梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的带正电荷的氨基酸。带正电荷的氨基酸的实例包括例如K、R和H。在本实施方案的其它方面，可用另一个带负电荷的氨基酸置换梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的带负电荷的氨基酸。带负电荷的氨基酸的实例包括例如D和E。在本实施方案的另一个方面，可用另一个小的氨基酸置换梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的小的氨基酸。小的氨基酸的实例包括例如A、D、G、N、P、S和T。在本实施方案的另一个方面，可用另一个C-β分枝氨基酸置换梭菌毒素酶促结构域的多肽链中的一个特定位置上的C-β分枝氨基酸置换。C-β分枝氨基酸置换的实例包括例如I、T和V。
在另一个实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包含BoNT/A酶促结构域。在本实施方案的方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的酶促结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQID NO：1的氨基酸1/2-429。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A酶促结构域包含天然存在的BoNT/A酶促结构域变体，例如来自BoNT/A同种型的酶促结构域或来自BoNT/A亚型的酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的天然存在的BoNT/A酶促结构域变体，例如，BoNT/A同种型酶促结构域或BoNT/A亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQ ID NO：1的天然存在的BoNT/A酶促结构域变体的氨基酸1/2-429，例如，BoNT/A同种型酶促结构域或BoNT/A亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A酶促结构域包含非天然存在的BoNT/A酶促结构域变体，例如，保守BoNT/A酶促结构域变体、非保守BoNT/A酶促结构域变体、活性BoNT/A酶促结构域片段，或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5的非天然存在的BoNT/A酶促结构域变体的酶促结构域，例如，保守BoNT/A酶促结构域变体、非保守BoNT/A酶促结构域变体、活性BoNT/A酶促结构域片段，或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A酶促结构域包含SEQ ID NO：1的非天然存在的BoNT/A酶促结构域变体的氨基酸1/2-429，例如，保守BoNT/A酶促结构域变体、非保守BoNT/A酶促结构域变体、活性BoNT/A酶促结构域片段，或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含多肽，所述多肽与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的酶促结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的酶促结构域具有至少至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含多肽，所述多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸1/2-429具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：1的氨基酸1/2-429具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4或SEQ ID NO：5的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：1的氨基酸1/2-429具以例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：1的氨基酸1/2-429具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/A酶促结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：1的氨基酸1/2-429具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：1的氨基酸1/2-429具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包括BoNT/B酶促结构域。在本实施方案的方面，BoNT/B酶促结构域包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的酶促结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包括SEQID NO：6的氨基酸1/2-436。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B酶促结构域包括天然存在的BoNT/B酶促结构域变体，例如，来自BoNT/B同种型的酶促结构域或来自BoNT/B亚型的酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B酶促结构域包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的天然存在的BoNT/B酶促结构域变体，例如，BoNT/B同种型酶促结构域或BoNT/B亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B酶促结构域包括SEQ ID NO：6的天然存在的BoNT/B酶促结构域变体的氨基酸1/2-436，例如，BoNT/B同种型酶促结构域变体或BoNT/B亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B酶促结构域包括非天然存在的BoNT/B酶促结构域变体，例如，保守BoNT/B酶促结构域变体、非保守BoNT/B酶促结构域变体、活性BoNT/B酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B酶促结构域包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10的非天然存在的BoNT/B酶促结构域变体的酶促结构域，例如，保守BoNT/B酶促结构域变体、非保守BoNT/B酶促结构域变体、活性BoNT/B酶促结构域片段，或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B酶促结构域包括SEQ ID NO：6的非天然存在的BoNT/B酶促结构域变体的氨基酸1/2-436，例如，保守BoNT/B酶促结构域变体、非保守BoNT/B酶促结构域变体、活性BoNT/B酶促结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的酶促结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的酶促结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：6的氨基酸1/2-436具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：6的氨基酸1/2-436具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：6的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：6的氨基酸1/2-436具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/B酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：6的氨基酸1/2-436具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：6的氨基酸1/2-436具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包括BoNT/C1酶促结构域。在本实施方案的方面，BoNT/C1酶促结构域包括SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的酶促结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包括SEQ ID NO：11的氨基酸1/2-436。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1酶促结构域包括天然存在的BoNT/C1酶促结构域变体，例如，来自BoNT/C1同种型的酶促结构域或来自BoNT/C1亚型的酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1酶促结构域包括SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的天然存在的BoNT/C1酶促结构域变体，例如，BoNT/C1同种型酶促结构域或BoNT/C1亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1酶促结构域包括SEQ ID NO：11的天然存在的BoNT/C1酶促结构域变体的氨基酸1/2-436，例如，BoNT/C1同种型酶促结构域或BoNT/C1亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1酶促结构域包括非天然存在的BoNT/C1酶促结构域变体，例如，保守BoNT/C1酶促结构域变体、非保守BoNT/C1酶促结构域变体、活性BoNT/C1酶促结构域片段，或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1酶促结构域包括SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的非天然存在的BoNT/C1酶促结构域变体的酶促结构域，例如，保守BoNT/C1酶促结构域变体、非保守BoNT/C1酶促结构域变体、活性BoNT/C1酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1酶促结构域包括SEQ ID NO：11的非天然存在的BoNT/C1酶促结构域变体的氨基酸1/2-436，例如，保守BoNT/C1酶促结构域变体、非保守BoNT/C1酶促结构域变体、活性BoNT/C1酶促结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的酶促结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的酶促结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：11的氨基酸1/2-436具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：11的氨基酸1/2-436具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：11或SEQID NO：12的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：11的氨基酸1/2-436具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：11的氨基酸1/2-436具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ IDNO：11或SEQ ID NO：12的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/C1酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：11的氨基酸1/2-436具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：11的氨基酸1/2-436具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包括BoNT/D酶促结构域。在本实施方案的方面，BoNT/D酶促结构域包括SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的酶促结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包括SEQ ID NO：13的氨基酸1/2-436。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D酶促结构域包括天然存在的BoNT/D酶促结构域变体，例如，来自BoNT/D同种型的酶促结构域或来自BoNT/D亚型的酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D酶促结构域包括SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的天然存在的BoNT/D酶促结构域变体，例如，BoNT/D同种型酶促结构域或BoNT/D亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D酶促结构域包括SEQ IDNO：13的天然存在的BoNT/D酶促结构域变体的氨基酸1/2-436，例如，BoNT/D同种型酶促结构域或BoNT/D亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D酶促结构域包括非天然存在的BoNT/D酶促结构域变体，例如，保守BoNT/D酶促结构域变体、非保守BoNT/D酶促结构域变体、活性BoNT/D酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D酶促结构域包括SEQID NO：13或SEQ ID NO：14的非天然存在的BoNT/D酶促结构域变体的酶促结构域，例如，保守BoNT/D酶促结构域变体、非保守BoNT/D酶促结构域变体、活性BoNT/D酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D酶促结构域包括SEQ ID NO：13的非天然存在的BoNT/D酶促结构域变体的氨基酸1/2-436，例如，保守BoNT/D酶促结构域变体、非保守BoNT/D酶促结构域变体、活性BoNT/D酶促结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的酶促结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的酶促结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：13的氨基酸1/2-436具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：13的氨基酸1/2-436具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：14的酶促结构域具有相对于至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：13的氨基酸1/2-436具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：13的氨基酸1/2-436具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQID NO：13或SEQ ID NO：14的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/D酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：13的氨基酸1/2-436具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：13的氨基酸1/2-436具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包括BoNT/E酶促结构域。在本实施方案的方面，BoNT/E酶促结构域包括SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的酶促结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包括SEQ ID NO：15的氨基酸1/2-411。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E酶促结构域包括天然存在的BoNT/E酶促结构域变体，例如，来自BoNT/E同种型的酶促结构域或来自BoNT/E亚型的酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E酶促结构域包括SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：17的天然存在的BoNT/E酶促结构域变体，例如，BoNT/E同种型酶促结构域或BoNT/E亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E酶促结构域包括SEQ ID NO：15的天然存在的BoNT/E酶促结构域变体的氨基酸1/2-411，例如，BoNT/E同种型酶促结构域或BoNT/E亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E酶促结构域包括非天然存在的BoNT/E酶促结构域变体，例如，保守BoNT/E酶促结构域变体、非保守BoNT/E酶促结构域变体、活性BoNT/E酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E酶促结构域包SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的非天然存在的BoNT/E酶促结构域变体的酶促结构域，例如，保守BoNT/E酶促结构域变体、非保守BoNT/E酶促结构域变体、活性BoNT/E酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E酶促结构域包括SEQ ID NO：15的非天然存在的BoNT/E酶促结构域变体的氨基酸1/2-411，例如，保守BoNT/E酶促结构域变体、非保守BoNT/E酶促结构域变体、活性BoNT/E酶促结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的酶促结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的酶促结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：15的氨基酸1/2-411具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：15的氨基酸1/2-411具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：15的氨基酸1/2-411具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：15的氨基酸1/2-411具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/E酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：15的氨基酸1/2-411具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：15的氨基酸1/2-411具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包括BoNT/F酶促结构域。在本实施方案的方面，BoNT/F酶促结构域包括SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的酶促结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包括SEQ ID NO：18的氨基酸1/2-428。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F酶促结构域包括天然存在的BoNT/F酶促结构域变体，例如，来自BoNT/F同种型的酶促结构域或来自BoNT/F亚型的酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F酶促结构域包括SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：20的天然存在的BoNT/F酶促结构域变体，例如，BoNT/F同种型酶促结构域或BoNT/F亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F酶促结构域包括SEQ ID NO：18的天然存在的BoNT/F酶促结构域变体的氨基酸1/2-428，例如，BoNT/F同种型酶促结构域或BoNT/F亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F酶促结构域包括非天然存在的BoNT/F酶促结构域变体，例如，保守BoNT/F酶促结构域变体、非保守BoNT/F酶促结构域变体、活性BoNT/F酶促结构域片段，或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F酶促结构域包括SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQID NO：20的非天然存在的BoNT/F酶促结构域变体的酶促结构域，例如，保守BoNT/F酶促结构域变体、非保守BoNT/F酶促结构域变体、活性BoNT/F酶促结构域片段，或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F酶促结构域包括SEQ ID NO：18的非天然存在的BoNT/F酶促结构域变体的氨基酸1/2-428，例如，保守BoNT/F酶促结构域变体、非保守BoNT/F酶促结构域变体、活性BoNT/F酶促结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的酶促结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的酶促结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：18的氨基酸1/2-428具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或至SEQ ID NO：18的氨基酸1/2-428具有与多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：18的氨基酸1/2-428具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：18的氨基酸1/2-428具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/F酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：18的氨基酸1/2-428具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：18的氨基酸1/2-428具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包括BoNT/G酶促结构域。在本实施方案的方面，BoNT/G酶促结构域包括SEQ ID NO：21的酶促结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包括SEQ ID NO：21的氨基酸1/2-4435。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G酶促结构域包括天然存在的BoNT/G酶促结构域变体，例如，来自BoNT/G同种型的酶促结构域或来自BoNT/G亚型的酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G酶促结构域包括SEQ ID NO：21的天然存在的BoNT/G酶促结构域变体，例如，BoNT/G同种型酶促结构域或BoNT/G亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G酶促结构域包括SEQ ID NO：21的天然存在的BoNT/G酶促结构域变体的氨基酸1/2-4435，例如，BoNT/G同种型酶促结构域或BoNT/G亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G酶促结构域包括非天然存在的BoNT/G酶促结构域变体，例如，保守BoNT/G酶促结构域变体、非保守BoNT/G酶促结构域变体、活性BoNT/G酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G酶促结构域包括SEQ ID NO：21的非天然存在的BoNT/G酶促结构域变体的酶促结构域，例如，保守BoNT/G酶促结构域变体、非保守BoNT/G酶促结构域变体、活性BoNT/G酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G酶促结构域包括EQID NO：21的非天然存在的BoNT/G酶促结构域变体的氨基酸1/2-4435，例如，保守BoNT/G酶促结构域变体、非保守BoNT/G酶促结构域变体、活性BoNT/G酶促结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：21的酶促结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：21的酶促结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：21的氨基酸1/2-4435具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：21的氨基酸1/2-4435具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：21的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：21的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：21的氨基酸1/2-4435具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：21的氨基酸1/2-4435具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：21的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：21的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/G酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：21的氨基酸1/2-4435具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：21的氨基酸1/2-4435具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包括TeNT酶促结构域。在本实施方案的方面，TeNT酶促结构域包括SEQ ID NO：22的酶促结构域。本实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包括SEQ IDNO：22的氨基酸1/2-438。在本实施方案的另一个方面，TeNT酶促结构域包括天然存在的TeNT酶促结构域变体，例如，来自TeNT同种型的酶促结构域或来自TeNT亚型的酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，TeNT酶促结构域包括SEQ ID NO：22的天然存在的TeNT酶促结构域变体，例如，TeNT同种型酶促结构域或TeNT亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，TeNT酶促结构域包括SEQ IDNO：22的天然存在的TeNT酶促结构域变体的氨基酸1/2-438，例如，TeNT同种型酶促结构域或TeNT亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，TeNT酶促结构域包括非天然存在的TeNT酶促结构域变体，例如，保守TeNT酶促结构域变体、非保守TeNT酶促结构域变体、活性TeNT酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，TeNT酶促结构域包括SEQ ID NO：22的非天然存在的TeNT酶促结构域变体的酶促结构域，例如，保守TeNT酶促结构域变体、非保守TeNT酶促结构域变体、活性TeNT酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，TeNT酶促结构域包括SEQID NO：22的非天然存在的TeNT酶促结构域变体的氨基酸1/2-438，例如，保守TeNT酶促结构域变体、非保守TeNT酶促结构域变体、活性TeNT酶促结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：22的酶促结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQID NO：22的酶促结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：22的氨基酸1/2-438具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：22的氨基酸1/2-438具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：22的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：22的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：22的氨基酸1/2-438具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：22的氨基酸1/2-438具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：22的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQID NO：22的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，TeNT酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：22的氨基酸1/2-438具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：22的氨基酸1/2-438具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包括BaNT酶促结构域。在本实施方案的方面，BaNT酶促结构域包括SEQ ID NO：23的酶促结构域。在本实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包括SEQID NO：23的氨基酸1/2-420。在本实施方案的另一个方面，BaNT酶促结构域包括天然存在的BaNT酶促结构域变体，例如，来自BaNT同种型的酶促结构域或来自BaNT亚型的酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BaNT酶促结构域包括SEQ ID NO：23的天然存在的BaNT酶促结构域变体，例如，BaNT同种型酶促结构域或BaNT亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BaNT酶促结构域包括SEQ ID NO：23的天然存在的BaNT酶促结构域变体的氨基酸1/2-420，例如，BaNT同种型酶促结构域或BaNT亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BaNT酶促结构域包括非天然存在的BaNT酶促结构域变体，例如，保守BaNT酶促结构域变体、非保守BaNT酶促结构域变体、活性BaNT酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BaNT酶促结构域包括SEQ ID NO：23的非天然存在的BaNT酶促结构域变体的酶促结构域，例如，保守BaNT酶促结构域变体、非保守BaNT酶促结构域变体、活性BaNT酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BaNT酶促结构域包括SEQ ID NO：23的非天然存在的BaNT酶促结构域变体的氨基酸1/2-420，例如，保守BaNT酶促结构域变体、非保守BaNT酶促结构域变体、活性BaNT酶促结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：23的酶促结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQID NO：23的酶促结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：23的氨基酸1/2-420具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：23的氨基酸1/2-420具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：23的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：23的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：23的氨基酸1/2-420具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：23的氨基酸1/2-420具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：23的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQID NO：23的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BaNT酶促结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：23的氨基酸1/2-420具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：23的氨基酸1/2-420具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素酶促结构域包括BuNT酶促结构域。在本实施方案的方面，BuNT酶促结构域包括SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的酶促结构域。在本实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包括SEQ ID NO：24的氨基酸1/2-411。在本实施方案的另一个方面，BuNT酶促结构域包括天然存在的BuNT酶促结构域变体，例如，来自BuNT同种型的酶促结构域或来自BuNT的酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BuNT酶促结构域包括SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的天然存在的BuNT酶促结构域变体，例如，BuNT同种型酶促结构域或BuNT亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BuNT酶促结构域包括SEQ ID NO：24的天然存在的BuNT酶促结构域变体的氨基酸1/2-411，例如，BuNT同种型酶促结构域或BuNT亚型酶促结构域。在本实施方案的另一个方面，BuNT酶促结构域包括非天然存在的BuNT酶促结构域变体，例如，保守BuNT酶促结构域变体、非保守BuNT酶促结构域变体、活性BuNT酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BuNT酶促结构域包括SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的非天然存在的BuNT酶促结构域变体的酶促结构域，例如，保守BuNT酶促结构域变体、非保守BuNT酶促结构域变体、活性BuNT酶促结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BuNT酶促结构域包括SEQID NO：24的非天然存在的BuNT酶促结构域变体的氨基酸1/2-411，例如，保守BuNT酶促结构域变体、非保守BuNT酶促结构域变体、活性BuNT酶促结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含多肽，所述多肽与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的酶促结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的酶促结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含多肽，所述多肽与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸1/2-411具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸1/2-411具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的酶促结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：24或SEQ IDNO：25的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸1/2-411具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸1/2-411具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的酶促结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的酶促结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BuNT酶促结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸1/2-411具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸1/2-411具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
“转位结构域”包含具有转移活性的梭菌神经毒素重链的一部分。“转位”意指促进多肽转运通过囊泡膜，从而将一些或所有多肽暴露于细胞质的能力。在多种肉毒毒素中，转位被认为包括因内体内的pH的降低而引起的重链的变构构象变化。该构象变化似乎牵涉重链的N端半部分和由重链的N端半部分介导，并且似乎导致囊泡膜的孔的形成；该变化允许蛋白水解的轻链从内体囊泡内移动至细胞质中。参见，例如，Lacy等人，Nature Struct.Biol.5：898-902(October 1998)。
肉毒毒素重链的转位介导部分的氨基酸序列对于本领域技术人员来说是已知的；此外，已知为赋予转位活性所必需的该部分中的那些氨基酸残基也是已知的。从而例如使用多种破伤风梭菌(Clostridiumtetanus)或肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神经毒素亚型的任一种的重链的天然存在的N端肽半部分作为转位结构域，或通过比对多种重链的N端半部分的一级序列和基于序列之间的保守氨基酸、极性、立体化学和疏水性特征选择共有一级转位序列而设计类似的转位结构域，完全在本领域技术人员的能力之内。
本说明书的方面部分地提供了包含梭菌毒素转位结构域的TVEMP。如本文中所使用的，术语“梭菌毒素转位结构域”是指可执行中毒过程的转位步骤的任何梭菌毒素多肽，所述梭菌毒素多肽介导梭菌毒素轻链转位。因此，菌毒素转位结构域有助于梭菌毒素轻链移动穿过膜，包括梭菌毒素轻链通过细胞内囊泡的膜进入细胞的细胞质的移动。梭菌毒素转位结构域的非限定性实例包括例如BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域和BuNT转位结构域。
梭菌毒素转位结构域包括但不限于天然存在的梭菌毒素转位结构域变体，例如，梭菌毒素转位结构域同种型和梭菌毒素转位结构域亚型；非天然存在的梭菌毒素转位结构域变体，例如，保守梭菌毒素转位结构域变体、非保守梭菌毒素转位结构域变体、其活性梭菌毒素转位结构域片段或其任何组合。
如本文中所使用的，术语“梭菌毒素转位结构域变体”，无论是天然存在的还是非天然存在的，都指与公开的参照序列的相应区域相比较具有至少一个氨基酸改变(表1)的梭菌毒素转位结构域，其可以以对该参照序列的相应区域的同一性％来描述。除非明确地指出，否则用于实施公开的实施方案的梭菌毒素转位结构域变体是执行中毒过程的转位步骤的变体，所述变体介导梭菌毒素轻链转位。作为非限定性实例，BoNT/A转位结构域变体与SEQ ID NO：1的氨基酸455-873具比较将具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/B转位结构域变体与SEQ ID NO：6的氨基酸447-860相比较将具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/C1转位结构域变体与SEQ ID NO：11的氨基酸454-868相比较将具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/D转位结构域变体与SEQ ID NO：13的氨基酸451-864相比较将具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/E转位结构域变体与SEQ ID NO：15的氨基酸427-847相比较将具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/F转位结构域变体与SEQ ID NO：18的氨基酸446-865相比较将具有至少一个氨基酸差，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BoNT/G转位结构域变体与SEQID NO：21的氨基酸451-865相比较将具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；TeNT转位结构域变体与SEQ ID NO：22的氨基酸468-881相比较将具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；BaNT转位结构域变体与SEQ ID NO：23的氨基酸436-857相比较将具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加；以及BuNT转位结构域变体与SEQ ID NO：24的氨基酸427-847相比较将具有至少一个氨基酸差异，例如，氨基酸置换、缺失或添加。
本领域技术人员承认，在梭菌毒素的每一个血清型内，可存在在它们的氨基酸序列中，同样地也在编码这些蛋白质的核酸序列中稍有不同的天然存在的梭菌毒素转位结构域。例如，目前存在5个BoNT/A亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5，当与SEQ ID NO：1的BoNT/A转位结构域亚型相比较时特定的转位结构域亚型显示约85-87％氨基酸同一性。如本文中所使用的，术语“天然存在的梭菌毒素转位结构域变体”是指通过天然存在的过程产生的任何梭菌毒素转位结构域，包括但不限于从可选择地剪接的转录物产生的梭菌毒素转位结构域同种型、通过自发突变产生的梭菌毒素转位结构域同种型和梭菌毒素转位结构域亚型。天然存在的梭菌毒素转位结构域变体可以以大体上与天然存在的梭菌毒素转位结构域所基于的参照梭菌毒素转位结构域相同的方式起作用，并且可在本说明书的任何方面替代参照梭菌毒素转位结构域。
天然存在的梭菌毒素转位结构域变体的非限定性实例为梭菌毒素转位结构域同种型例如BoNT/A转位结构域同种型、BoNT/B转位结构域同种型、BoNT/C1转位结构域同种型、BoNT/D转位结构域同种型、BoNT/E转位结构域同种型、BoNT/F转位结构域同种型、BoNT/G转位结构域同种型、TeNT转位结构域同种型、BaNT转位结构域同种型和BuNT转位结构域同种型。天然存在的梭菌毒素转位结构域变体的另一个非限定性实例为梭菌毒素转位结构域亚型例如来自亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5的转位结构域；来自亚型BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B二价体和BoNT/B非蛋白质水解的转位结构域；来自亚型BoNT/C1-1和BoNT/C1-2的转位结构域；来自亚型BoNT/E1、BoNT/E2和BoNT/E3的转位结构域；来自亚型BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3的转位结构域；和来自亚型BuNT-1和BuNT-2的转位结构域。
如本文中所使用的，术语“非天然存在的梭菌毒素转位结构域变体”是指借助于人操作产生的任何梭菌毒素转位结构域，包括但不限于，通过遗传工程，使用随机诱变或合理设计产生的梭菌毒素转位结构域，以及通过化学合成产生的梭菌毒素转位结构域。非天然存在的梭菌毒素转位结构域变体的非限定性实例包括例如保守梭菌毒素转位结构域变体、非保守梭菌毒素转位结构域变体和活性梭菌毒素转位结构域片段。
如本文中所使用的，术语“保守梭菌毒素转位结构域变体”是指至少一个氨基酸被另一个氨基酸或氨基酸类似物(所述氨基酸或氨基酸类似物具有至少一个与来自参照梭菌毒素转位结构域序列(表1)的原始氨基酸的性质相似的性质)置换的梭菌毒素转位结构域，性质的实例包括但不限于相似的大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价健合能力、氢键合能力、物理化学性质等或其任何组合。保守梭菌毒素转位结构域变体可以以与保守梭菌毒素转位结构域变体所基于的参照梭菌毒素转位结构域大体上相同的方式起作用，并且可在本说明书的任何方面替代参照梭菌毒素转位结构域。保守梭菌毒素转位结构域变体的非限定性实例包括例如保守BoNT/A转位结构域变体、保守BoNT/B转位结构域变体、保守BoNT/C1转位结构域变体、保守BoNT/D转位结构域变体、保守BoNT/E转位结构域变体、保守BoNT/F转位结构域变体、保守BoNT/G转位结构域变体、保守TeNT转位结构域变体、保守BaNT转位结构域变体和保守BuNT转位结构域变体。
如本文中所使用的，术语“非保守梭菌毒素转位结构域变体”是指梭菌毒素转位结构域，在所述结构域中1)至少一个氨基酸从非保守梭菌毒素转位结构域变体所基于的参照梭菌毒素转位结构域缺失；2)至少一个氨基酸被添加至非保守梭菌毒素转位结构域变体所基于的参照梭菌毒素转位结构域；或3)至少一个氨基酸被不共有与来自参照梭菌毒素转位结构域序列(表1)的原始氨基酸的性质相似的任何性质的另一个氨基酸或氨基酸类似物置换。非保守梭菌毒素转位结构域变体可以以与非保守梭菌毒素转位结构域变体所基于的参照梭菌毒素转位结构域大体上相同的方式起作用，并且可在本说明书的任何方面替代参照梭菌毒素转位结构域。非保守梭菌毒素转位结构域变体的非限定性实例包括例如非保守BoNT/A转位结构域变体、非保守BoNT/B转位结构域变体、非保守BoNT/C1转位结构域变体、非保守BoNT/D转位结构域变体、非保守BoNT/E转位结构域变体、非保守BoNT/F转位结构域变体、非保守BoNT/G转位结构域变体以及非保守TeNT转位结构域变体、非保守BaNT转位结构域变体和非保守BuNT转位结构域变体。
如本文中所使用的，术语“活性梭菌毒素转位结构域片段”是指多种包含转位结构域的梭菌毒素片段的任何片段，所述片段可用于本说明书的方面，条件是这些活性片段可有利于LC从细胞内囊泡释放至靶细胞的细胞质中，从而参与执行梭菌毒素籍以蛋白水解切割底物的总体细胞机制。来自梭菌毒素的重链的转位结构域在长度上为约410-430个氨基酸并且包括转位结构域(表1)。研究显示来自梭菌毒素重链的转位结构域的完整长度不是转位结构域的转位活性所必需的。因此，本实施方案的方面包括具有长度为例如至少350、375、400或425个氨基酸的梭菌毒素转位结构域。本实施方案的其它方面包括具有长度为例如至多350、375、400或425氨基酸的梭菌毒素转位结构域。
可使用多种序列比对法的任一种来测定天然存在的梭菌毒素转位结构域变体和非天然存在的梭菌毒素转位结构域变体的同一性百分比，所述方法包括但不限于全局法、局部法和杂交法，例如，区段逼近法。测定同一性百分比的方案是在本领域技术人员能力范围内和来自本文中的教导的方法。
因此，在一个实施方案中，本文中公开的TVEMP包含梭菌毒素转位结构域。在本实施方案的方面，梭菌毒素转位结构域包含天然存在的梭菌毒素转位结构域变体，例如，梭菌毒素转位结构域同种型或梭菌毒素转位结构域亚型。在本实施方案的另一个方面，梭菌毒素转位结构域包含非天然存在的梭菌毒素转位结构域变体，例如，保守梭菌毒素转位结构域变体、非保守梭菌毒素转位结构域变体和活性梭菌毒素转位结构域片段，或其任何组合。
在另一个实施方案中，可用另一个疏水性氨基酸置换梭菌毒素转位结构域的多肽链中的一个特定位置上的疏水性氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括例如C、F、I、L、M、V和W。在本实施方案的另一个方面，可用另一个脂肪族氨基酸置换梭菌毒素转位结构域的多肽链中的一个特定位置上的脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸的实例包括例如A、I、L、P和V。在本实施方案的另一个方面，可用另一个芳香族氨基酸置换梭菌毒素转位结构域的多肽链中的一个特定位置上的芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在本实施方案的另一个方面，可用另一个堆叠氨基酸置换梭菌毒素转位结构域的多肽链中的一个特定位置上的堆叠氨基酸。堆叠氨基酸的实例包括例如F、H、W和Y。在本实施方案的其它方面，可用另一个极性氨基酸置换梭菌毒素转位结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性氨基酸。极性氨基酸的实例包括例如D、E、K、N、Q和R。在本实施方案的其它方面，可用另一个极性不太强的或中性氨基酸置换梭菌毒素转位结构域的多肽链中的一个特定位置上的极性不太强的或中性氨基酸。极性不太强的或中性氨基酸的实例包括例如A、H、G、P、S、T和Y。在本实施方案的其它方面，可用另一个带正电荷的氨基酸置换梭菌毒素转位结构域的多肽链中的一个特定位置上的带正电荷的氨基酸。带正电荷的氨基酸的实例包括例如K、R和H。在本实施方案的其它方面，可用另一个带负电荷的氨基酸置换梭菌毒素转位结构域的多肽链中的一个特定位置上的带负电荷的氨基酸。带负电荷的氨基酸的实例包括例如D和E。在本实施方案的另一个方面，可用另一个小氨基酸置换梭菌毒素转位结构域的多肽链中的一个特定位置上的小氨基酸。小氨基酸的实例包括例如A、D、G、N、P、S和T。在本实施方案的另一个方面，可用另一个C-β分枝氨基酸置换梭菌毒素转位结构域的多肽链中的一个特定位置上的C-β分枝氨基酸。C-β分枝氨基酸的实例包括例如I、T和V。
在另一个实施方案中，梭菌毒素转位结构域包括BoNT/A转位结构域。在本实施方案的方面，BoNT/A转位结构域包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的转位结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/A转位结构域包括SEQID NO：1的氨基酸455-873。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A转位结构域包括天然存在的BoNT/A转位结构域变体，例如，来自BoNT/A同种型的转位结构域或来自BoNT/A亚型的转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A转位结构域包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的天然存在的BoNT/A转位结构域变体，例如，BoNT/A同种型转位结构域或BoNT/A亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A转位结构域包括SEQ ID NO：1的天然存在的BoNT/A转位结构域变体的氨基酸455-873，例如，BoNT/A同种型转位结构域或BoNT/A亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A转位结构域包括非天然存在的BoNT/A转位结构域变体，例如，保守BoNT/A转位结构域变体、非保守BoNT/A转位结构域变体、活性BoNT/A转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A转位结构域包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5的非天然存在的BoNT/A转位结构域变体的转位结构域，例如，保守BoNT/A转位结构域变体、非保守BoNT/A转位结构域变体、活性BoNT/A转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/A转位结构域包括SEQ ID NO：1的非天然存在的BoNT/A转位结构域变体的氨基酸455-873，例如，保守BoNT/A转位结构域变体、非保守BoNT/A转位结构域变体、活性BoNT/A转位结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/A转位结构域包含多肽，所述多肽与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的转位结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的转位结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/A转位结构域包含多肽，所述多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸455-873具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：1的氨基酸455-873具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/A转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的转位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4或SEQ ID NO：5的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/A转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：1的氨基酸455-873具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：1的氨基酸455-873具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/A转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的转位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/A转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：1的氨基酸455-873具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：1的氨基酸455-873具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素转位结构域包括BoNT/B转位结构域。在本实施方案的方面，BoNT/B转位结构域包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的转位结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/B转位结构域包括SEQID NO：6的氨基酸447-860。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B转位结构域包括天然存在的BoNT/B转位结构域变体，例如，来自BoNT/B同种型的转位结构域或来自BoNT/B亚型的转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B转位结构域包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的天然存在的BoNT/B转位结构域变体，例如，BoNT/B同种型转位结构域或BoNT/B亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B转位结构域包括SEQ ID NO：6的天然存在的BoNT/B转位结构域变体的氨基酸447-860，例如，例如BoNT/B同种型转位结构域或BoNT/B亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B转位结构域包括非天然存在的BoNT/B转位结构域变体，例如，保守BoNT/B转位结构域变体、非保守BoNT/B转位结构域变体、活性BoNT/B转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B转位结构域包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的非天然存在的BoNT/B转位结构域变体的转位结构域，例如，保守BoNT/B转位结构域变体、非保守BoNT/B转位结构域变体、活性BoNT/B转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/B转位结构域包括SEQ IDNO：6的非天然存在的BoNT/B转位结构域变体的氨基酸447-860，例如，保守BoNT/B转位结构域变体、非保守BoNT/B转位结构域变体、活性BoNT/B转位结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/B转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的转位结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的；或与SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的转位结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/B转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：6的氨基酸447-860具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：6的氨基酸447-860具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/B转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的转位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/B转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：6的氨基酸447-860具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：6的氨基酸447-860具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/B转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的转位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/B转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：6的氨基酸447-860具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：6的氨基酸447-860具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素转位结构域包括BoNT/C1转位结构域。在本实施方案的方面，BoNT/C1转位结构域包括SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的转位结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/C1转位结构域包括SEQ ID NO：11的氨基酸454-868。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1转位结构域包括天然存在的BoNT/C1转位结构域变体，例如，来自BoNT/C1同种型的转位结构域或来自BoNT/C1亚型的转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1转位结构域包括SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的天然存在的BoNT/C1转位结构域变体，例如，BoNT/C1同种型转位结构域或BoNT/C1亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1转位结构域包括SEQ ID NO：11的天然存在的BoNT/C1转位结构域变体的氨基酸454-868，例如，BoNT/C1同种型转位结构域或BoNT/C1亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1转位结构域包括非天然存在的BoNT/C1转位结构域变体，例如，保守BoNT/C1转位结构域变体、非保守BoNT/C1转位结构域变体、活性BoNT/C1转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1转位结构域包括SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的非天然存在的BoNT/C1转位结构域变体的转位结构域，例如，保守BoNT/C1转位结构域变体、非保守BoNT/C1转位结构域变体、活性BoNT/C1转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/C1转位结构域包括SEQ ID NO：11的非天然存在的BoNT/C1转位结构域变体的氨基酸454-868，例如，保守BoNT/C1转位结构域变体、非保守BoNT/C1转位结构域变体、活性BoNT/C1转位结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/C1转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的转位结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的转位结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/C1转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：11的氨基酸454-868具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：11的氨基酸454-868具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/C1转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的转位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：11或SEQID NO：12的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/C1转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：11的氨基酸454-868具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：11的氨基酸454-868具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/C1转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的转位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQID NO：11或SEQ ID NO：12的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/C1转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：11的氨基酸454-868具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：11的氨基酸454-868具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素转位结构域包括BoNT/D转位结构域。在本实施方案的方面，BoNT/D转位结构域包括SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的转位结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/D转位结构域包括SEQ ID NO：13的氨基酸451-864。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D转位结构域包括天然存在的BoNT/D转位结构域变体，例如，来自BoNT/D同种型的转位结构域或来自BoNT/D亚型的转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D转位结构域包括SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的天然存在的BoNT/D转位结构域变体，例如，BoNT/D同种型转位结构域或BoNT/D亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D转位结构域包括SEQ IDNO：13的天然存在的BoNT/D转位结构域的氨基酸451-864，例如，BoNT/D同种型转位结构域或BoNT/D亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D转位结构域包括非天然存在的BoNT/D转位结构域变体，例如，保守BoNT/D转位结构域变体、非保守BoNT/D转位结构域变体、活性BoNT/D转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D转位结构域包括SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的天然存在的BoNT/D转位结构域变体的转位结构域，例如，保守BoNT/D转位结构域变体、非保守BoNT/D转位结构域变体、活性BoNT/D转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/D转位结构域包括SEQ ID NO：13的非天然存在的BoNT/D转位结构域变体的氨基酸451-864，例如，保守BoNT/D转位结构域变体、非保守BoNT/D转位结构域变体、活性BoNT/D转位结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/D转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的转位结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的转位结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/D转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：13的氨基酸451-864具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：13的氨基酸451-864具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/D转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的转位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：14的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/D转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：13的氨基酸451-864具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：13的氨基酸451-864具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/D转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的转位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/D转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：13的氨基酸451-864具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：13的氨基酸451-864具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素转位结构域包括BoNT/E转位结构域。在本实施方案的方面，BoNT/E转位结构域包括SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的转位结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/E转位结构域包括SEQ ID NO：15的氨基酸427-847。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E转位结构域包括天然存在的BoNT/E转位结构域变体，例如，来自BoNT/E同种型的转位结构域或来自BoNT/E亚型的转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E转位结构域包括SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：17的天然存在的BoNT/E转位结构域变体，例如，BoNT/E同种型转位结构域或BoNT/E亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E转位结构域包括SEQ ID NO：15的天然存在的BoNT/E转位结构域变体的氨基酸427-847，例如，BoNT/E同种型转位结构域或BoNT/E亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E转位结构域包括非天然存在的BoNT/E转位结构域变体，例如，保守BoNT/E转位结构域变体、非保守BoNT/E转位结构域变体、活性BoNT/E转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E转位结构域包括SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：17的非天然存在的BoNT/E转位结构域变体的转位结构域，例如，保守BoNT/E转位结构域变体、非保守BoNT/E转位结构域变体、活性BoNT/E转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/E转位结构域包括SEQ ID NO：15的非天然存在的BoNT/E转位结构域变体的氨基酸427-847，例如，保守BoNT/E转位结构域变体、非保守BoNT/E转位结构域变体、活性BoNT/E转位结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/E转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的转位结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的转位结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/E转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：15的氨基酸427-847具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：15的氨基酸427-847具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/E转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的转位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/E转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：15的氨基酸427-847具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：15的氨基酸427-847具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/E转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的转位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/E转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：15的氨基酸427-847具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：15的氨基酸427-847具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素转位结构域包括BoNT/F转位结构域。在本实施方案的方面，BoNT/F转位结构域包括SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的转位结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/F转位结构域包括SEQ ID NO：18的氨基酸446-865。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F转位结构域包括天然存在的BoNT/F转位结构域变体，例如，来自BoNT/F同种型的转位结构域或来自BoNT/F亚型的转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F转位结构域包括SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：20的天然存在的BoNT/F转位结构域变体，例如，BoNT/F同种型转位结构域或BoNT/F亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F转位结构域包括SEQ ID NO：18的天然存在的BoNT/F转位结构域变体的氨基酸446-865，例如，BoNT/F同种型转位结构域或BoNT/F亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F转位结构域包括非天然存在的BoNT/F转位结构域变体，例如，保守BoNT/F转位结构域变体、非保守BoNT/F转位结构域变体、活性BoNT/F转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F转位结构域包括SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：20的非天然存在的BoNT/F转位结构域变体的转位结构域，例如，保守BoNT/F转位结构域变体、非保守BoNT/F转位结构域变体、活性BoNT/F转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/F转位结构域包括SEQ ID NO：18的非天然存在的BoNT/F转位结构域变体的氨基酸446-865，例如，保守BoNT/F转位结构域变体、非保守BoNT/F转位结构域变体、活性BoNT/F转位结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/F转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的转位结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的转位结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/F转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：18的氨基酸446-865具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：18的氨基酸446-865具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％。
在本实施方案的其它方面，BoNT/F转位结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的转位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/F转位结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：18的氨基酸446-865具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：18的氨基酸446-865具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/F转位结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的转位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/F转位结构域包含多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：18的氨基酸446-865具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：18的氨基酸446-865具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素转位结构域包含BoNT/G转位结构域。在本实施方案的方面，BoNT/G转位结构域包含SEQ ID NO：21的转位结构域。在本实施方案的其它方面，BoNT/G转位结构域包含SEQ ID NO：21的氨基酸451-865。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G转位结构域包含天然存在的BoNT/G转位结构域变体，例如，来自BoNT/G同种型的转位结构域或来自BoNT/G来型的转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G转位结构域包含SEQ ID NO：21的天然存在的BoNT/G转位结构域变体，例如，BoNT/G同种型转位结构域或BoNT/G亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G转位结构域包含SEQ ID NO：21的天然存在的BoNT/G转位结构域的氨基酸，例如，BoNT/G同种型转位结构域或BoNT/G亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G转位结构域包含非天然存在的BoNT/G转位结构域变体，例如，保守BoNT/G转位结构域变体、非保守BoNT/G转位结构域变体、活性BoNT/G转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G转位结构域包括SEQ ID NO：21的非天然存在的BoNT/G转位结构域变体的转位结构域，例如，保守BoNT/G转位结构域变体、非保守BoNT/G转位结构域变体、活性BoNT/G转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BoNT/G转位结构域包括SEQ ID NO：21的非天然存在的BoNT/G转位结构域变体的氨基酸451-865，例如，保守BoNT/G转位结构域变体、非保守BoNT/G转位结构域变体、活性BoNT/G转位结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BoNT/G转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：21的转位结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：21的转位结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BoNT/G转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：21的氨基酸451-865具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：21的氨基酸451-865具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BoNT/G转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：21的转位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：21的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/G转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：21的氨基酸451-865具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：21的氨基酸451-865具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/G转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：21的转位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：21的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BoNT/G转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：21的氨基酸451-865具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：21的氨基酸451-865具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素转位结构域包括TeNT转位结构域。在本实施方案的方面，TeNT转位结构域包括SEQ ID NO：22的转位结构域。在本实施方案的其它方面，TeNT转位结构域包括SEQID NO：22的氨基酸468-881。在本实施方案的另一个方面，TeNT转位结构域包括天然存在的TeNT转位结构域变体，例如，来自TeNT同种型的转位结构域或来自TeNT亚型的转位结构域。在本实施方案的另一个方面，TeNT转位结构域包括SEQ ID NO：22的天然存在的TeNT转位结构域变体，例如，TeNT同种型转位结构域或TeNT亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，TeNT转位结构域包括SEQID NO：22的天然存在的TeNT转位结构域变体的氨基酸468-881，例如，TeNT同种型转位结构域或TeNT亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，TeNT转位结构域包括非天然存在的TeNT转位结构域变体，例如，保守TeNT转位结构域变体、非保守TeNT转位结构域变体、活性TeNT转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，TeNT转位结构域包括SEQ ID NO：22的非天然存在的TeNT转位结构域的转位结构域，例如，保守TeNT转位结构域变体、非保守TeNT转位结构域变体、活性TeNT转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，TeNT转位结构域包括SEQID NO：22的非天然存在的TeNT转位结构域变体的氨基酸468-881，例如，保守TeNT转位结构域变体、非保守TeNT转位结构域变体、活性TeNT转位结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，TeNT转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：22的转位结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQID NO：22的转位结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％。在本实施方案的其它方面，TeNT转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：22的氨基酸468-881具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：22的氨基酸468-881具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％。
在本实施方案的其它方面，TeNT转位结构域包括多肽，所述多肽与相对于SEQ ID NO：22的转位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：22的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，TeNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：22的氨基酸468-881具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：22的氨基酸468-881具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，TeNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：22的转位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：22的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，TeNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：22的氨基酸468-881具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：22的氨基酸468-881具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素转位结构域包括BaNT转位结构域。在本实施方案的方面，BaNT转位结构域包括SEQ ID NO：23的转位结构域。在本实施方案的其它方面，BaNT转位结构域包括SEQID NO：23的氨基酸436-857。在本实施方案的另一个方面，BaNT转位结构域包括天然存在的BaNT转位结构域变体，例如，来自BaNT同种型的转位结构域或来自BaNT亚型的转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BaNT转位结构域包括SEQ ID NO：23的天然存在的BaNT转位结构域变体，例如，BaNT同种型转位结构域或BaNT亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BaNT转位结构域包括SEQ ID NO：23的天然存在的BaNT转位结构域的氨基酸436-857，例如，BaNT同种型转位结构域或BaNT亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BaNT转位结构域包括非天然存在的BaNT转位结构域变体，例如，保守BaNT转位结构域变体、非保守BaNT转位结构域变体、活性BaNT转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BaNT转位结构域包括SEQ ID NO：23的非天然存在的BaNT转位结构域变体的转位结构域，例如，保守BaNT转位结构域变体、非保守BaNT转位结构域变体、活性BaNT转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BaNT转位结构域包括SEQ ID NO：23的非天然存在的BaNT转位结构域变体的氨基酸436-857，例如，保守BaNT转位结构域变体、非保守BaNT转位结构域变体、活性BaNT转位结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BaNT转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：23的转位结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQID NO：23的转位结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％。在本实施方案的其它方面，BaNT转位结构域多肽，所述多肽包括与SEQ ID NO：23的氨基酸436-857具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：23的氨基酸436-857具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BaNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：23的转位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：23的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BaNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：23的氨基酸436-857具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：23的氨基酸436-857具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BaNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：23的转位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQID NO：23的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BaNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：23的氨基酸436-857具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：23的氨基酸436-857具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在另一个实施方案中，梭菌毒素转位结构域包括BuNT转位结构域。在本实施方案的方面，BuNT转位结构域包括SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的转位结构域。在本实施方案的其它方面，BuNT转位结构域包括SEQ ID NO：24的氨基酸427-847。在本实施方案的另一个方面，BuNT转位结构域包括天然存在的BuNT转位结构域变体，例如，来自BuNT同种型的转位结构域或来自BuNT亚型的转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BuNT转位结构域包括SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的天然存在的BuNT转位结构域变体，例如，BuNT同种型转位结构域或BuNT亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BuNT转位结构域包括SEQ ID NO：24的天然存在的BuNT转位结构域变体的氨基酸427-847，例如，BuNT同种型转位结构域或BuNT亚型转位结构域。在本实施方案的另一个方面，BuNT转位结构域包括非天然存在的BuNT转位结构域变体，例如，保守BuNT转位结构域变体、非保守BuNT转位结构域变体、活性BuNT转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BuNT转位结构域包括SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的非天然存在的BuNT转位结构域变体的转位结构域，例如，保守BuNT转位结构域变体、非保守BuNT转位结构域变体、活性BuNT转位结构域片段或其任何组合。在本实施方案的另一个方面，BuNT转位结构域包括SEQID NO：24的非天然存在的BuNT转位结构域变体的氨基酸427-847，例如，保守BuNT转位结构域变体、非保守BuNT转位结构域变体、活性BuNT转位结构域片段或其任何组合。
在本实施方案的其它方面，BuNT转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的转位结构域具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的转位结构域具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，BuNT转位结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸427-847具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸427-847具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。
在本实施方案的其它方面，BuNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的转位结构域具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：24或SEQ IDNO：25的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BuNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸427-847具有例如至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸427-847具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BuNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的转位结构域具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的转位结构域具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，BuNT转位结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸427-847具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸427-847具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或100个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
本说明书的方面部分地提供了包含靶向性结构域的TVEMP。如本文中所使用的，术语“靶向性结构域”与“结合结构域”、“配体”或“靶向性部分”同义，是指能够优先结合细胞表面标志如受体(是靶细胞在生理条件下的特征)的氨基酸序列区域。细胞表面标志可包括多肽、多糖、脂质、糖蛋白、脂蛋白，或可具有超过1个此类标志的结构特征。如本文中所使用的，术语“优先相互作用”是指分子能够在生理条件下或大体上接近生理条件的体外条件下对其靶细胞表面标志的结合相对于对其它非靶细胞表面标志的结合达到统计上显著更大的程度。参考本文中公开的靶向性结构域，靶向性结构域对其同源受体相对于对其它受体存在差别结合。在例如Steward，L.E.等人，ModifiedClostridial Toxins with Enhanced Translocation Capability and EnhancedTargetingActivity，第11/776,043号美国专利申请(2007年7月11日)；Steward，L.E.等人，Modified Clostridial Toxins with EnhancedTranslocation Capabilities and Altered Targeting Activity For ClostridialToxin Target Cells，第11/776,052号美国专利公布(2007年7月11日)；和Steward，L.E.等人，Modified Clostridial Toxins with EnhancedTranslocation Capabilities and Altered Targeting Activity ForNon-Clostridial Toxin Target Cells，第11/776,075号美国专利申请(2007年7月11日)(将所述每一个专利公布和专利申请通过引用整体并入本文)中描述了结合结构域的实例。
在实施方案中，选择性结合靶受体的靶向性结构域对于靶受体的解离平衡常数(KD)为非靶受体的例如至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少1000、至少10,000或至少100,000倍。
本文中公开的靶向性结构域的实例为神经营养蛋白肽靶向性结构域。神经营养蛋白肽靶向性结构域的非限定性实例包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)。肿瘤坏死因子(TNF)和淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白神经营养蛋白(APP)。神经营养蛋白肽结合蛋白质受体的家族。例如，NGF、BDNF、NTF3、NTF4、TNF和APP结合神经生长因子受体(NGFR)；NGF、BDNF、NTF3和NTF4结合神经营养酪氨酸激酶受体1型(NTRK1)；NGF、BDNF、NTF3、NTF4结合神经营养酪氨酸激酶受体2型(NTRK2)；以及NGF、BDGF、NTF3和NTF4结合神经营养酪氨酸激酶受体3型(NTRK3)。
已在几种不同类型的癌细胞的表面上检测到神经营养蛋白肽受体。例如，NGFR在乳腺癌、神经母细胞瘤、黑素瘤、许旺细胞瘤、胰岛素瘤、肝细胞瘤、泌乳素瘤、结肠癌、慢性髓性白血病、肥大细胞白血病、子宫内膜癌和嗜铬细胞瘤中表达。参见，例如，A.Chiarenza等人，Tamoxifen inhibits nerve growth factor-induced proliferation of thehuman breast cancerous cell line MCF-7，Cancer Res.61(7)：3002-3008(2001)；S.Descamps等人，Nerve growth factor is mitogenicfor cancerous but not normal human breast epithelial cells，J.Biol.Chem.273(27)：16659-16662(1998)；G.Perini等人，Role of p75 neurotrophinreceptor in the neurotoxicity by beta-amyloid peptides and synergisticeffect of inflammatory cytokines，J.Exp.Med.195(7)：907-918(2002)；M.Kajiya等人，Brain-derived neurotrophic factor stimulatesbone/cementum-related protein gene expression in cementoblasts，J.Biol.Chem.283(23)：16259-16267(2008)；A.Nakagawara等人，Associationbetween high levels of expression of the TRK gene and favorableoutcome in human neuroblastoma，N.Engl.J.Med.328(12)：847-854(1993)；C.Azar等人，Multiple defects of the nerve growth factorreceptor in human neuroblastomas，Prog.Clin.Biol.Res.366：219-26(1991)；S.Y.Tam等人，Expression of functional TrkA receptortyrosine kinase in the HMC-1 human mast cell line and in human mastcells，Blood 90(5)：1807-1820(1997)；O.Shonukan等人，Neurotrophin-induced melanoma cell migration is mediated through theactin-bundling protein fascin，Oncogene 22(23)：3616-3623(2003)；J.A.Reed等人，Divergent cellular differentiation pathways during theinvasive stage of cutaneous malignant melanoma progression，Am.J.Pathol.155(2)：549-555(1999)；K.J.Busam等人，Distinction ofdesmoplastic melanoma from non-desmoplastic melanoma by geneexpression profiling，J.Invest.Dermatol.124(2)：412-418(2005)；D.G.Menter等人，Involvement of neurotrophins and growth factors in brainmetastasis formation，Invasion Metastasis 14(1-6)：372-384(1994)；J.J.Gentry等人，Nerve growth factor activation of nuclear factor kappaBthrough its p75 receptor is an anti-apoptotic signal in RN22 schwannomacells，J.Biol.Chem.275(11)：7558-7565(2000)；M.Polak等人，Nervegrowth factor induces neuron-like differentiation of an insulin-secretingpancreatic beta cell line，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(12)：5781-5785(1993)；S.Preiss等人，Characterization of the innate immunesignalling pathways in hepatocyte cell lines，J.Viral Hepat.15(12)：888-900(2008)；C.Fiorentini等人，Nerve growth factor regulatesdopamine D(2)receptor expression in prolactinoma cell lines viap75(NGFR)-mediated activation of nuclear factor-kappaB，Mol.Endocrinol.16(2)：353-366(2002)；L.Monlauzeur等人，PutativeO-glycosylation sites and a membrane anchor are necessary for apicaldelivery of the human neurotrophin receptor in Caco-2 cells，J.Biol.Chem.273(46)：30263-30270(1998)；E.K.Ininns等人，Growth of theendometrial adenocarcinoma cell line AN3 CA is modulated by tumornecrosis factor and its receptor is up-regulated by estrogen in vitro，Endocrinology 130(4)：1852-1856(1992)；J.L.Urdiales等人，Cell cyclephase-specific surface expression of nerve growth factor receptors TrkAand p75(NTR)，J.Neurosci.18(17)：6767-6775(1998)。
作为另一个实例，NTRK1在乳腺癌、神经母细胞瘤、许旺细胞瘤、泌乳素瘤、白血病、前列腺癌、甲状腺癌、肺鳞状细胞癌和嗜铬细胞瘤中表达。参见，例如，E.Tagliabue等人，Nerve growth factorcooperates with p185(HER2)in activating growth of human breastcarcinoma cells，J.Biol.Chem.275(8)：5388-5394(2000)；S.Descamps等人，Nerve growth factor is mitogenic for cancerous but not normalhuman breast epithelial cells，J.Biol.Chem.273(27)：16659-16662(1998)；S.Descamps等人，Nerve growth factorstimulates proliferation and survival of human breast cancer cells throughtwo distinct signaling pathways，J.Biol.Chem.276(21)：17864-17870(2001)；D.Melck等人，Suppression of nerve growth factorTrk receptors and prolactin receptors by endocannabinoids leads toinhibition of human breast and prostate cancer cell proliferation，Endocrinology 141(1)：118-126(2000)；S.J.Pollack和S.J.Harper，Smallmolecule Trk receptor agonists and other neurotrophic factor mimetics，Curr.Drug Targets CNS Neurol.Disord.1(1)：59-80(2002)；D.S.Middlemas等人，Brain-derived neurotrophic factor promotes survivaland chemoprotection of human neuroblastoma cells，J.Biol.Chem.274(23)：16451-16460(1999)；K.Matsumoto等人，Expression ofbrain-derived neurotrophic factor and p145TrkB affects survival，differentiation，and invasiveness of human neuroblastoma cells，CancerRes.55(8)：1798-1806(1999)；K.Kramer等人，Prognostic value of TrkAprotein detection by monoclonal antibody 5C3 in neuroblastoma，Clin.Cancer Res.2(8)：1361(1996)；M.Polak等人，Nerve growth factorinduces neuron-like differentiation of an insulin-secreting pancreatic betacell line，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(12)：5781-5785(1993)；C.Fiorentini等人，Nerve growth factor regulates dopamine D(2)receptorexpression in prolactinoma cell lines via p75(NGFR)-mediated activationof nuclear factor-kappaB，Mol.Endocrinol.16(2)：353-366(2002)；M.Eguchi等人，Fusion of ETV6 to neurotrophin-3 receptor TRKC in acutemyeloid leukemia with t(12；15)(p13；q25)，Blood 93(4)：1355-1363(1999)；M.A.Sortino等人，Mitogenic effect of nerve growthfactor(NGF)in LNCaP prostate adenocarcinoma cells：role of the high-and low-affinity NGF receptors，Mol.Endocrinol.14(1)：124-136(2000)；B.R.Pflug等人，Expression of a Trk high affinity nerve growth factorreceptor in the human prostate，Endocrinology 136(1)：262-268(1995)；R.A.Segal，Selectivity in neurotrophin signaling：theme and variations，Annu.Rev.Neurosci.26：299-330(2003)；L.M.McGregor等人，Roles oftrk family neurotrophin receptors in medullary thyroid carcinomadevelopment and progression，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(8)：4540-4545(1999)；S.Amatschek等人，Tissue-wide expression profilingusing cDNA subtraction and microarrays to identify tumor-specificgenes，Cancer Res.64(3)：844-856(2004)；X.Lou等人，GIPC and GAIPform a complex with TrkA：a putative link between G protein andreceptor tyrosine kinase pathways，Mol.Biol.Cell 12(3)：615-627(2001)；和J.L.Urdiales等人，Cell cycle phase-specific surface expression ofnerve growth factor receptors TrkA and p75(NTR)，J.Neurosci.18(17)：6767-6775(1998)。
作为另一个实例，NTRK2在神经母细胞瘤、结肠癌、白血病、前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中表达。参见，例如，S.J.Pollack和S.J.Harper，Small molecule Trk receptoragonists and other neurotrophic factor mimetics，Curr.Drug Targets CNSNeurol.Disord.1(1)：59-80(2002)；D.S.Middlemas等人，Brain-derivedneurotrophic factor promotes survival and chemoprotection of humanneuroblastoma cells，J.Biol.Chem.274(23)：16451-16460(1999)；S.Scala等人，Brain-derived neurotrophic factor protects neuroblastomacells from vinblastine toxicity，Cancer Res.56(16)：3737-3742(1996)；J.Zhang等人，The studies on the correlation for gene expression oftyrosine-kinase receptors and vascular endothelial growth factor in humanneuroblastomas，J.Pediatr.Hematol.Oncol.32(3)：180(2010)；J.B.Easton等人，Brain-derived neurotrophic factor induces phosphorylationof fibroblast growth factor receptor substrate 2，J.Biol.Chem.274(16)：11321-11327(1999)；W.Jin等人，TrkC Binds to the Bone MorphogeneticProtein Type II Receptor to Suppress Bone Morphogenetic ProteinSignaling，Cancer Res.67(20)：9869-9877(2007)；T.Powles等人，Cannabis-induced cytotoxicity in leukemic cell lines：the role of thecannabinoid receptors and the MAPK pathway，Blood 105(3)：1214-12121(2005)；B.R.Pflug等人，Expression of a Trk high affinitynerve growth factor receptor in the human prostate，Endocrinology 136(1)：262-268(1995)；L.M.McGregor等人，Roles of trk family neurotrophinreceptors in medullary thyroid carcinoma development and progression，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(8)：4540-4545(1999)；J.Shen等人，Identification and validation of differences in protein levels in normal，premalignant，and malignant lung cells and tissues using high-throughputWestern array and immunohistochemistry，Cancer Res.66(23)：11194-11206(2006)；和J.Y.Ljubimova等人，Overexpression of alpha4chain-containing laminins in human glial tumors identified by genemicroarray analysis，Cancer Res.61(14)：5601-5610(2001)。
作为另一个实例，NTRK3在乳腺癌、神经母细胞瘤、胰岛素瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、白血病、前列腺癌、甲状腺癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤和纤维肉瘤中表达。参见，例如，Jin W等人，c-Src IsRequired for Tropomyosin Receptor Kinase C(TrkC)-induced Activationof the Phosphatidylinositol 3-Kinase(PI3K)-AKT Pathway.J Biol Chem2008 Jan 18；283(3)：1391-400；Pollack SJ，Harper SJ.Small molecule Trkreceptor agonists and other neurotrophic factor mimetics.Curr DrugTargets CNS Neurol Disord 2002 Feb 01；1(1)：59-80；Laneve P等人，Theinterplay between microRNAs and the neurotrophin receptortropomyosin-related kinase C controls proliferation of humanneuroblastoma cells.Proc Natl Acad Sci U S A 2007 May08；104(19)：7957-62；Fu AK等人，Muscle-derived neurotrophin-3increases the aggregation of acetylcholine receptors in neuron-muscleco-cultures.Neuroreport 1997 Dec 22；8(18)：3895-900；Tazi A等人，Neurotrophin-3 increases intracellular calcium in a rat insulin-secretingcell line through its action on a functional TrkC receptor.J Biol Chem1996 Apr 26；271(17)：10154-60；Segal RA等人，Expression of theneurotrophin receptor TrkC is linked to a favorable outcome inmedulloblastoma.Proc Natl Acad Sci U S A 1994 Dec20；91(26)：12867-71；Jin W等人，TrkC Binds to the Bone MorphogeneticProtein Type II Receptor to Suppress Bone Morphogenetic ProteinSignaling.Cancer Res 2007 Oct 15；67(20)：9869-77；Eguchi M等人，Fusion of ETV6 to neurotrophin-3 receptor TRKC in acute myeloidleukemia with t(12；15)(p13；q25).Blood 1999 Feb 15；93(4)：1355-63；Pflug BR等人，Expression of a Trk high affinity nerve growth factorreceptor in the human prostate.Endocrinology 1995 Jan；136(1)：262-8；McGregor LM等人，Roles of trk family neurotrophin receptors inmedullary thyroid carcinoma development and progression.Proc NatlAcad Sci U S A 1999 Apr 13；96(8)：4540-5；Bruce AW等人，Genome-wide analysis of repressor element 1 silencing transcriptionfactor/neuron-restrictive silencing factor(REST/NRSF)target genes.ProcNatl Acad Sci U S A 2004 Jul 13；101(28)：10458-63；和Segal RA.Selectivity in neurotrophin signaling：theme and variations.Annu RevNeurosci 2003 Jan 01；26：299-330。
这样，包括神经营养蛋白肽靶向性结构域的TVEMP在治疗癌症中将是有效的，所述癌症包括乳腺癌、神经母细胞瘤、黑素瘤、许旺细胞瘤、胰岛素瘤、肝细胞瘤、髓母细胞瘤、泌乳素瘤、结肠癌、白血病、慢性髓性白血病、肥大细胞白血病、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞肺癌、肺癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、纤维肉瘤或嗜铬细胞瘤。
因此，在实施方案中，再靶向靶向性结构域包括神经营养蛋白肽靶向性结构域。在本实施方案的方面，神经营养蛋白肽靶向性结构域包括NGF、BDNF、NT-3或NT-4/5。在本实施方案的其它方面，神经营养蛋白肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85。在本实施方案的其它方面，神经营养蛋白肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：82的氨基酸139-257、SEQ ID NO：83的氨基酸133-240或氨基酸129-247、SEQ ID NO：84的氨基酸144-249或氨基酸19-257或SEQ ID NO：85的氨基酸89-202或氨基酸81-210。
在本实施方案的其它方面，神经营养蛋白靶向性结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，神经营养蛋白靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，神经营养蛋白靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在本实施方案的其它方面，神经营养蛋白靶向性结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：82的氨基酸139-257、SEQ ID NO：83的氨基酸133-240或氨基酸129-247、SEQ ID NO：84的氨基酸144-249或氨基酸19-257或SEQ ID NO：85的氨基酸89-202或氨基酸81-210具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：82的氨基酸139-257、SEQ ID NO：83的氨基酸133-240或氨基酸129-247、SEQ ID NO：84的氨基酸144-249或氨基酸19-257或SEQ ID NO：85的氨基酸89-202或氨基酸81-210具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，神经营养蛋白靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：82的氨基酸139-257、SEQ ID NO：83的氨基酸133-240或氨基酸129-247、SEQ ID NO：84的氨基酸144-249或氨基酸19-257或SEQ IDNO：85的氨基酸89-202或氨基酸81-210具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：82的氨基酸139-257、SEQ ID NO：83的氨基酸133-240或氨基酸129-247、SEQ ID NO：84的氨基酸144-249或氨基酸19-257或SEQ ID NO：85的氨基酸89-202或氨基酸81-210具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，神经营养蛋白靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：82的氨基酸139-257、SEQ ID NO：83的氨基酸133-240或氨基酸129-247、SEQ ID NO：84的氨基酸144-249或氨基酸19-257或SEQ ID NO：85的氨基酸89-202或氨基酸81-210具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：82的氨基酸139-257、SEQ ID NO：83的氨基酸133-240或氨基酸129-247、SEQ ID NO：84的氨基酸144-249或氨基酸19-257或SEQ IDNO：85的氨基酸89-202或氨基酸81-210具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
本文中公开的靶向性结构域的另一个实例为头激活物(Headactivator)(HA)肽。因此，在实施方案中，再靶向靶向性结构域包括HA肽靶向性结构域。在本实施方案的方面，神经营养蛋白肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：86。HA肽结合蛋白质受体的家族。例如，HA肽结合孤儿G偶联受体GPR37(也称为内皮素受体B型样)和分拣蛋白相关受体(Sortilin-related receptor)(SRR)。
已在几种不同类型的癌细胞的表面上检测到头激活物肽受体。例如GPR37在乳腺癌中表达。参见，例如，G.Deblois等人，Genome-wideidentification of direct target genes implicates estrogen-related receptoralpha as a determinant of breast cancer heterogeneity，Cancer Res.69(15)：6149-6157(2009)。作为另一个实例，SRR在乳腺癌中表达。参见，例如，S.Ashida等人，Molecular Features of the Transition from ProstaticIntraepithelial Neoplasia(PIN)to Prostate Cancer：Genome-wideGene-expression Profiles of Prostate Cancers and PINs，Cancer Res.64(17)：5963-5972(2004)。
这样，包括头激活物肽靶向性结构域的TVEMP在治疗癌症(包括乳腺癌)中将是有效的。
在本实施方案的其它方面，HA靶向性结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：86具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：86具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，HA靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：86具有例如至少1、2、3、4或5个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：86具有至多1、2、3、4或5个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，HA靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：86具有例如至少1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：86具有至多1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
本文中公开的靶向性结构域的另一个实例为配体(GFL)肽靶向性结构域的胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)家族。GFL肽靶向性结构域的非限定性实例包括GDNF、Neurturin(NRTN)、Persephrin(PSPN)或Artemin(ARTN)。CDNF-GFL肽结合G偶联蛋白受体的家族。例如，GDNF和NRTN结合GDNF家族受体α1和2(GFRA1和GFRA2)；GNDF和ARTN结合GDNF家族受体α3(GFRA3)；GDNF和PSPN结合GDNF家族受体α4(GFRA4)；以及GDNF、NRTN和GFRA1结合Ret原癌基因(RET)。
已在几种不同类型的癌细胞的表面上检测到CDNF-GFL肽受体肽受体。例如，GFRA1在乳腺癌、胰腺癌和甲状腺癌中表达。参见，例如，Naderi A等人，BEX2is overexpressed in a subset of primarybreast cancers and mediates nerve growth factor/nuclear factor-kappaBinhibition of apoptosis in breast cancer cell lines.Cancer Res 2007 Jul15；67(14)：6725-36；Funahashi，H.等人，The role of glial cell line-derivedneurotrophic factor(GDNF)and integrins for invasion and metastasis inhuman pancreatic cancer cells.J Surg Oncol.2005Jul 1；91(1)：77-83；Borrego S等人，Evaluation of germline sequence variants of GFRA1，GFRA2，and GFRA3 genes in a cohort of Spanish patients with sporadicmedullary thyroid cancer.Thyroid 2002 Nov；12(11)：1017-22；Gimm O等人，Over-representation of a germline variant in the gene encodingRET co-receptor GFRalpha-1 but not GFRalpha-2 or GFRalpha-3 incases with sporadic medullary thyroid carcinoma.Oncogene.2001 Apr19；20(17)：2161-70；和Wells等人，Targeting the RET pathway in thyroidcancer.Clin Cancer Res.2009 Dec 1；15(23)：7119-23。
作为另一个实例，GFRA2在甲状腺癌中表达。参见，例如，S.Borrego等人，Evaluation of germline sequence variants of GFRA1，GFRA2，and GFRA3 genes in a cohort of Spanish patients with sporadicmedullary thyroid cancer，Thyroid 12(11)：1017-1022(2002)。
作为另一个实例，GFRA3在甲状腺癌中表达。参见，例如，S.Borrego等人，Evaluation of germline sequence variants of GFRA1，GFRA2，and GFRA3 genes in a cohort of Spanish patients with sporadicmedullary thyroid cancer，Thyroid 12(11)：1017-1022(2002)。
作为另一个实例，GFRA4在甲状腺癌中表达。参见，例如，Lindahl等人，Human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha 4is the receptor for persephin and is predominantly expressed in normaland malignant thyroid medullary cells，J.Biol.Chem.276(12)：9344-9351(2001)。
作为另一个实例，RET在甲状腺癌、肾癌、腺癌、黑素瘤和膀胱癌中表达。参见，例如，La Perle KM等人，Loss of p53 promotesanaplasia and local invasion in ret/PTC1-induced thyroid carcinomas.AmJ Pathol 2000 Aug 1；157(2)：671-7；Blume-Jensen P等人，Oncogenickinase signalling.Nature 2001 May 17；411(6835)：355-65；Schmid M等人，Cell Cycle Regulation and Hematological Disorders WilliamsHematology 6th Edition，Chapter 12：131-140；Kitamura Y等人，Novelgermline RET proto-oncogene mutations associated with medullarythyroid carcinoma(MTC)：mutation analysis in Japanese patients withMTC.Oncogene 1997 Jun 26；14(25)：3103-6；Gimm O等人，Over-representation of a germline RET sequence variant in patients withsporadic medullary thyroid carcinoma and somatic RET codon 918mutation.Oncogene 1999 Feb 11；18(6)：1369-73；Michiels FM等人，Development of medullary thyroid carcinoma in transgenic miceexpressing the RET protooncogene altered by a multiple endocrineneoplasia type 2A mutation.Proc Natl Acad Sci U S A 1997 Apr1；94(7)：3330-5；Jhiang SM等人，Targeted expression of the ret/PTC1oncogene induces papillary thyroid carcinomas.Endocrinology 1996Jan；137(1)：375-8；van der Geer P等人，Receptor protein-tyrosine kinasesand their signal transduction pathways.Annu Rev Cell Biol1994；10：251-337；Qiao S等人，Differential effects of leukocyte commonantigen-related protein on biochemical and biological activities ofRET-MEN2A and RET-MEN2B mutant proteins.J Biol Chem 2001 Mar23；276(12)：9460-7；Sweetser DA等人，Ganglioneuromas and renalanomalies are induced by activated RET(MEN2B)in transgenic mice.Oncogene 1999 Jan 28；18(4)：877-86；Kawai K等人，Tissue-specificcarcinogenesis in transgenic mice expressing the RET proto-oncogenewith a multiple endocrine neoplasia type 2A mutation.Cancer Res 2000Sep 15；60(18)：5254-60；Kato M等人，Transgenic mouse model for skinmalignant melanoma.Oncogene 1998 Oct 8；17(14)：1885-8；KumasakaMY等人，A novel mouse model for de novo Melanoma.Cancer Res2010 Jan 01；70(1)：24-9；和Staack A等人，Combined determination ofplasma MMP2，MMP9，and TIMP1 improves the non-invasive detectionof transitional cell carcinoma of the bladder.BMC Urol 2006 Jan01；6：19。
这样，包括CDNF-GFL肽靶向性结构域的TVEMP在治疗癌症中将是有效的，所述癌症包括乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、腺癌、黑素瘤或膀胱癌。
因此，在实施方案中，靶向性结构域包括GFL肽靶向性结构域。在本实施方案的方面，GFL肽靶向性结构域包括GDNF、NRTN、PSPN或ARTN。在本实施方案的其它方面，GFL肽靶向性结构域包括SEQID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：90。在本实施方案的其它方面，GFL肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：87的氨基酸118-211、SEQ ID NO：88的氨基酸107-196或氨基酸96-197、SEQID NO：89的氨基酸66-155或SEQ ID NO：90的氨基酸123-218。
在本实施方案的其它方面，GFL靶向性结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：90具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：90具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，GFL靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：90具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：90具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，GFL靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：90具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：90具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在本实施方案的其它方面，GFL靶向性结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：87的氨基酸118-211、SEQ ID NO：88的氨基酸107-196或氨基酸96-197、SEQ ID NO：89的氨基酸66-155或SEQ IDNO：90的氨基酸123-218具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：87的氨基酸118-211、SEQ ID NO：88的氨基酸107-196或氨基酸96-197、SEQ ID NO：89的氨基酸66-155或SEQ ID NO：90的氨基酸123-218具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，GFL靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：87的氨基酸118-211、SEQ ID NO：88的氨基酸107-196或氨基酸96-197、SEQ IDNO：89的氨基酸66-155或SEQ ID NO：90的氨基酸123-218具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：87的氨基酸118-211、SEQ ID NO：88的氨基酸107-196或氨基酸96-197、SEQ ID NO：89的氨基酸66-155或SEQ ID NO：90的氨基酸123-218具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，GFL靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：87的氨基酸118-211、SEQ ID NO：88的氨基酸107-196或氨基酸96-197、SEQ ID NO：89的氨基酸66-155或SEQ ID NO：90的氨基酸123-218具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：87的氨基酸118-211、SEQ ID NO：88的氨基酸107-196或氨基酸96-197、SEQ ID NO：89的氨基酸66-155或SEQ ID NO：90的氨基酸123-218具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
本文中公开的靶向性结构域的另一个实例为RF酰胺相关肽(RFRP)肽靶向性结构域。RFRP肽靶向性结构域的非限定性实例包括RFRP-1、RFRP-2、RFRP-3、神经肽AF(NPAF)和神经肽FF(NPFF)。RFRP肽结合G偶联蛋白受体的家族。例如，NPVF、1DME-NPFF、NPFF结合神经肽FF受体1(NPFFR1)；以及NPFF、胰多肽、NPY、NPVF、PRLH(泌乳素释放激素)、1DME-NPFF、EYFSLAAPQRF-NH2结合神经肽FF受体2(NPFFR2)。
已在几种不同类型的癌细胞的表面上检测到RFRP肽受体。例如，NPFFR2在乳腺癌中表达。参见，例如，K.B.Hendricks等人，Role for BRG1 in cell cycle control and tumor suppression，Mol.CellBiol.24(1)：362-376(2004)。
这样，包括RFRP肽靶向性结构域的TVEMP在治疗癌症(包括乳腺癌)中是有效的。
因此，在实施方案中，靶向性结构域包括RFRP肽靶向性结构域。在本实施方案的方面，RFRP肽靶向性结构域包括RFRP-1、RFRP-2、RFRP-3、NPAF或NPFF。在本实施方案的其它方面，RFRP肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93或SEQID NO：94。在本实施方案的其它方面，RFRP肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：91的氨基酸81-92、氨基酸101-112或氨基酸124-131、SEQ ID NO：92的氨基酸58-92或氨基酸104-131、SEQ ID NO：93的氨基酸83-94或氨基酸109-125或SEQ ID NO：94的氨基酸65-77或氨基酸92-111。
在本实施方案的其它方面，RFRP靶向性结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：94具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：94具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，RFRP靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：94具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：94具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，RFRP靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：94具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：94具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在本实施方案的其它方面，RFRP靶向性结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：91的氨基酸81-92、氨基酸101-112或氨基酸124-131、SEQ ID NO：92的氨基酸58-92或氨基酸104-131、SEQ IDNO：93的氨基酸83-94或氨基酸109-125或SEQ ID NO：94的氨基酸65-77或氨基酸92-111具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：91的氨基酸81-92，氨基酸101-112或氨基酸124-131、SEQ ID NO：92的氨基酸58-92或氨基酸104-131、SEQ ID NO：93的氨基酸83-94或氨基酸109-125或SEQ ID NO：94的氨基酸65-77或氨基酸92-111具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，RFRP靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：91的氨基酸81-92、氨基酸101-112或氨基酸124-131、SEQ ID NO：92的氨基酸58-92或氨基酸104-131、SEQ ID NO：93的氨基酸83-94或氨基酸109-125或SEQ IDNO：94的氨基酸65-77或氨基酸92-111具有例如至少1、2、3、4或5个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：91的氨基酸81-92、氨基酸101-112或氨基酸124-131、SEQ ID NO：92的氨基酸58-92或氨基酸104-131、SEQ ID NO：93的氨基酸83-94或氨基酸109-125或SEQ ID NO：94的氨基酸65-77或氨基酸92-111具有至多1、2、3、4或5个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，RFRP靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：91的氨基酸81-92、氨基酸101-112或氨基酸124-131、SEQ ID NO：92的氨基酸58-92或氨基酸104-131、SEQ ID NO：93的氨基酸83-94或氨基酸109-125或SEQ ID NO：94的氨基酸65-77或氨基酸92-111具有例如至少1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：91的氨基酸81-92、氨基酸101-112或氨基酸124-131、SEQ ID NO：92的氨基酸58-92或氨基酸104-131、SEQ ID NO：93的氨基酸83-94或氨基酸109-125或SEQ IDNO：94的氨基酸65-77或氨基酸92-111具有至多1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
本文中公开的靶向性结构域的另一个实例为神经激素肽靶向性结构域。神经激素肽靶向性结构域的非限定性实例包括促肾上腺皮质素释放激素(CCRH)、甲状旁腺素(PTH)、甲状旁腺素样激素(PTHLH)、PHYH、促甲状腺素释放激素(TRH)、尿皮质素-1(UCN1)、尿皮质素-2(UCN2)、尿皮质素-3(UCN3)或urotensin 2(UTS2)。神经激素肽结合G偶联蛋白受体的家族。例如，CRH、PTH和UCN结合促肾上腺皮质素释放激素受体1(CRHR1)；CRH、UTS2、UCN、UCN2、UCN3结合促肾上腺皮质素释放激素受体2(CRHR2)；PTH和PTHLH结合甲状旁腺素1受体(PTH1R)；PTH、PTHLH和PHYH结合甲状旁腺素2受体(PTH2R)；以及TRH结合促甲状腺激素释放激素受体(TRHR)和促甲状腺激素释放激素受体2(TRHR2)。
已在几种不同类型的癌细胞的表面上检测到神经激素肽受体。例如，CRHR1在乳腺癌、子宫癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、垂体瘤、神经母细胞瘤、小细胞肺癌、子宫内膜癌、嗜铬细胞瘤和鳞状细胞癌中表达。参见，例如，Yuan R等人，Altered gene expression pattern incultured human breast cancer cells treated with hepatocyte  growthfactor/scatter factor in the setting of DNA damage.Cancer Res 2001 Nov1；61(21)：8022-31；Graziani G等人，CRH inhibits cell growth of humanendometrial adenocarcinoma cells via CRH-receptor 1-mediatedactivation of cAMP-PKA pathway.Endocrinology 2002Mar；143(3)：807-13；Pisarchik A，Slominski AT.Alternative splicing ofCRH-R1 receptors in human and mouse skin：identification of newvariants and their differential expression.FASEB J 2001 Dec1；15(14)：2754-6；Pisarchik A，Slominski AT.Alternative splicing ofCRH-R1 receptors in human and mouse skin：identification of newvariants and their differential expression.FASEB J 2001 Dec1；15(14)：2754-6；Peeters PJ等人，Transcriptional Response toCorticotropin-Releasing Factor in AtT-20 Cells.Mol Pharmacol 2004Nov 01；66(5)：1083-92；Brar BK等人，Specificity and regulation ofERK1/2 phosphorylation through CRF receptors 1 and 2{beta}by theCRF/Ucn family of peptides.Endocrinology 2004 04 1；145(4)：1718-29；Dieterich KD等人，Corticotropin-releasing factor receptors in humansmall cell lung carcinoma cells：radioligand binding，second messenger，and northern blot analysis data.Endocrinology 1994 Oct；135(4)：1551-8；Graziani G等人，CRH inhibits cell growth of human endometrialadenocarcinoma cells via CRH-receptor 1-mediated activation ofcAMP-PKA pathway.Endocrinology 2002 Mar；143(3)：807-13；Dermitzaki E等人，Corticotropin-Releasing Factor(CRF)and theUrocortins Differentially Regulate Catecholamine Secretion in Humanand Rat Adrenals，in a CRF Receptor Type-Specific Manner.Endocrinology 2007 Apr 01；148(4)：1524-38；和PisarchikA，SlominskiAT.Alternative splicing of CRH-R1 receptors in human and mouse skin：identification of new variants and their differential expression.FASEB J2001 Dec 1；15(14)：2754-6。
作为另一个实例，CRHR2在神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤和结肠癌中表达。参见，例如，Brar BK等人，Specificity and regulation ofERK1/2 phosphorylation through CRF receptors 1 and 2{beta}by theCRF/Ucn family of peptides.Endocrinology 2004 04 1；145(4)：1718-29；Dermitzaki E等人，Corticotropin-Releasing Factor(CRF)and theUrocortins Differentially Regulate Catecholamine Secretion in Humanand Rat Adrenals，in a CRF Receptor Type-Specific Manner.Endocrinology 2007 Apr 01；148(4)：1524-38；和Kokkotou E等人，Corticotropin-releasing hormone receptor 2-deficient mice have reducedintestinal inflammatory responses.J Immunol 2006 Sep01；177(5)：3355-61。
作为另一个实例，PTH1R在肺泡基底上皮癌、睾丸癌和骨肉瘤中表达。参见，例如，Hastings RH等人，Parathyroid hormone-relatedprotein，an autocrine regulatory factor in alveolar epithelial cells.Am JPhysiol 1996 Mar 1；270(3Pt 1)：L353-61；Tfelt-Hansen J等人，Calcium-Sensing Receptor Induces Proliferation through p38Mitogen-Activated Protein Kinase and Phosphatidylinositol 3-Kinase ButNot Extracellularly Regulated Kinase in a Model of HumoralHypercalcemia of Malignancy.Endocrinology 2004 Mar 01；145(3)：1211-7；和Williams LJ，Abou-Samra AB.The transcription factors SP1and MAZ regulate expression of the parathyroid hormone/parathyroidhormone-related peptide receptor gene.J Mol Endocrinol 2000 121；25(3)：309-19。
作为另一个实例，TRHR在垂体癌中表达。参见，例如，Yang J，Tashjian AH Jr.Transcriptional regulation by dexamethasone ofendogenous thyrotropin-releasing hormone receptor messengerribonucleic acid in rat pituitary GH4C1 cells.Endocrinology 1993Aug；133(2)：487-90；Yamada M等人，Pituitary adenomas of patients withacromegaly express thyrotropin-releasing hormone receptor messengerRNA：cloning and functional expression of the humanthyrotropin-releasing hormone receptor gene.Biochem Biophys ResCommun 1993 Sep 15；195(2)：737-45；和Sortino M等人，Protein kinaseC inhibits TRH-stimulated phosphoinositide hydrolysis in GH3 cells.EurJ Pharmacol 1987 Mar 3；135(1)：77-83。
这样，包括神经激素肽靶向性结构域的TVEMP在治疗癌症中将是有效的，所述癌症包括乳腺癌、子宫癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、垂体癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌、子宫内膜癌、嗜铬细胞瘤、鳞状细胞癌、结肠癌、肺泡基底上皮癌、睾丸癌或骨肉瘤。
因此，在实施方案中，靶向性结构域包括神经激素肽靶向性结构域。在本实施方案的方面，神经激素肽靶向性结构域包括CCRH、PTH或TRH。在本实施方案的其它方面，神经激素肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97。在本实施方案的其它方面，神经激素肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：95的氨基酸159-193或氨基酸154-194、SEQ ID NO：96的氨基酸35-70或氨基酸145-177或SEQ ID NO：97的氨基酸39-206。
在本实施方案的其它方面，神经激素靶向性结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，神经激素靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，神经激素靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ IDNO：97具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
在本实施方案的其它方面，神经激素靶向性结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：95的氨基酸159-193或氨基酸154-194、SEQ IDNO：96的氨基酸35-70或氨基酸145-177或SEQ ID NO：97的氨基酸39-206具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：95的氨基酸159-193或氨基酸154-194、SEQ ID NO：96的氨基酸35-70或氨基酸145-177或SEQ ID NO：97的氨基酸39-206具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，神经激素靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：95的氨基酸159-193或氨基酸154-194、SEQ ID NO：96的氨基酸35-70或氨基酸145-177或SEQ ID NO：97的氨基酸39-206具有例如至少1、2、3、4或5个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：95的氨基酸159-193或氨基酸154-194、SEQ ID NO：96的氨基酸35-70或氨基酸145-177或SEQ IDNO：97的氨基酸39-206具有至多1、2、3、4或5个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，神经激素靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：95的氨基酸159-193或氨基酸154-194、SEQ ID NO：96的氨基酸35-70或氨基酸145-177或SEQ ID NO：97的氨基酸39-206具有例如至少1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：95的氨基酸159-193或氨基酸154-194、SEQ ID NO：96的氨基酸35-70或氨基酸145-177或SEQ ID NO：97的氨基酸39-206具有至多1、2、3、4或5个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
本文中公开的靶向性结构域的另一个实例为神经调节细胞因子肽靶向性结构域。神经调节细胞因子肽靶向性结构域的非限定性实例包括睫状神经营养因子(CNTF)、血型糖蛋白-A(GPA)、白血病抑制因子(LIF)(也称为胆碱能分化因子(CDF)、心肌营养蛋白-1(CT-1)、心肌营养蛋白-样细胞因子(CLC)、神经白细胞素(也称为磷酸葡糖异构酶(GPI))、自分泌活动因子(autocrine motility factor)(AMF)、成熟和分化因子(MF)以及制癌蛋白M(OSM)。神经调节细胞因子肽结合G偶联蛋白受体的家族。例如，CNTF结合CNTF受体(CNTFR)、白细胞介素6信号转导物(IL6ST)(也称为gp130)、制癌蛋白M受体、白血病抑制因子受体α(LIFR)和白细胞介素6受体(IL6R)；LIF结合LIFR、IL6ST和胰岛素样生长因子2受体(IGF2R)；CTF1结合LIFR和IL6ST；CLCF1结合CNTFR、IL6ST和LIFR；AMF和VCP结合自分泌活动因子受体(AMFR)；以及OSM结合LIFR和IL6ST的异二聚体。
已在几种不同类型的癌细胞的表面上检测到神经调节细胞因子肽受体。例如，CNTFR在肝癌中表达。参见，例如，X.Hu等人，Ciliary neurotrophic factor receptor alpha subunit-modulated multipledownstream signaling pathways in hepatic cancer cell lines and theirbiological implications，Hepatology 47(4)：1298-1308(2008)。
作为另一个实例，IL6ST在胃癌中表达。参见，例如，Tebbutt NC等人，Reciprocal regulation of gastrointestinal homeostasis by SHP2 andSTAT-mediated trefoil gene activation in gp130 mutant mice.Nat Med2002 10 1；8(10)：1089-97。
作为另一个实例，LIFR在淋巴瘤中表达。参见，例如，PiccalugaPP等人，Gene expression analysis of peripheral T cell lymphoma，unspecified，reveals distinct profiles and new potential therapeutic targets.J Clin Invest 2007 Mar 01；117(3)：823-34；和Piccaluga PP等人，Geneexpression analysis of angioimmunoblastic lymphoma indicatesderivation from T follicular helper cells and vascular endothelial growthfactor deregulation.Cancer Res 2007 Nov 15；67(22)：10703-10。
作为另一个实例，IL-6R在结肠癌中表达。参见，例如，A.M.
Figure BDA0000152179730000911
等人，Parallels between global transcriptional programs of polarizingCaco-2 intestinal epithelial cells in vitro and gene expression programs innormal colon and colon cancer，Mol.Biol.Cell.18(11)：4245-4260(2007)。
作为另一个实例，IGF2R在胃癌和肝癌中表达。参见，例如，L.Ottini等人，Mutations at coding mononucleotide repeats in gastric cancerwith the microsatellite mutator phenotype，Oncogene 16(21)：2767-2772(1998)；以及Y.J.Chung等人，Evidence of genetic progressionin human gastric carcinomas with microsatellite instability，Oncogene15(14)：1719-1726(1997)；和J.J.Mills等人，Imprinted M6p/Igf2 receptoris mutated in rat liver tumors，Oncogene 16(21)：2797-2802(1998)。
这样，包含神经调节细胞因子肽靶向性结构域的TVEMP在治疗癌症中将是有效的，所述癌症包括肝癌、胃癌、淋巴瘤、结肠癌、胃癌。
因此，在实施方案中，靶向性结构域包括神经调节细胞因子肽靶向性结构域。在本实施方案的方面，神经调节细胞因子肽靶向性结构域包括CNTF、GPA、LIF、CT-1、CLC、神经白细胞素或OSM。在本实施方案的其它方面，神经激素肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103。
在本实施方案的其它方面，神经调节细胞因子靶向性结构域包括多肽，所述多肽与SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103具有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸同一性；或与SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103具有至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％或至多95％的氨基酸同一性。在本实施方案的其它方面，神经调节细胞因子靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个非连续氨基酸缺失、添加和/或置换。在本实施方案的其它方面，神经调节细胞因子靶向性结构域包括多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：98、SEQID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换；或相对于SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个连续氨基酸缺失、添加和/或置换。
梭菌毒素各自被翻译为约150kDa的单链多肽，其随后被天然存在的蛋白酶在二硫环内通过蛋白水解切割(图18)。该切割发生在形成二硫桥的两个半胱氨酸残基之间产生的不连续的双链环区域内。该翻译后加工产生双链分子，所述双链分子包括通过两条链之间的单个二硫键和非共价相互作用保持在一起的约50kDa的轻链(LC)和约100kDa重链(HC)(图2)。为了有利于TVEMP的重组产生，可使用外源蛋白酶切割位点将本文中公开的TVEMP的单链多肽形式转变成双链形式。参见，例如，Steward，L.E.等人，Modified Clostridial Toxins withEnhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial ToxinReceptor Systems，第US 2008/0096248号美国专利公布(2008年4月24日)；Steward，L.E.等人，Activatable Clostridial Toxins，第US2008/0032930号美国专利公布(2008年2月7日)；Steward，同上(2007)；Dolly，同上(2007)；Foster，同上，WO 2006/059093(2006)；和Foster，同上，WO 2006/059105(2006)，将每一个所述专利公布和文献通过引用整体并入本文。
预期可使用任何和所有蛋白酶切割位点来将梭菌毒素的单链多肽形式转化成双链形式，所述蛋白酶切割位点包括但不限于内源双链环蛋白酶切割位点和外源蛋白酶切割位点。因此，在本发明的方面中，TVEMP部分地包含双链环区域内的内源蛋白酶切割位点。在本发明的另一个方面，TVEMP部分地包含内源双链环区域内的外源蛋白酶切割位点。如本文中所使用的，术语“双链环区域”意指包含用于将梭菌毒素的单链形式转化成双链形式的蛋白酶切割位点的梭菌毒素的氨基酸序列。梭菌毒素的双链环区域的非限定性实例包括：包括SEQID NO：1的氨基酸430-454的BoNT/A的双链环区域；包括SEQ IDNO：2的氨基酸437-446的BoNT/B的双链环区域；包括SEQ ID NO：3的氨基酸437-453的BoNT/C1的双链环区域；包括SEQ ID NO：4的氨基酸437-450的BoNT/D的双链环区域；包括SEQ ID NO：5的氨基酸412-426的BoNT/E的双链环区域；包括SEQ ID NO：6的氨基酸429-445的BoNT/F的双链环区域；包括SEQ ID NO：7的氨基酸436-450的BoNT/G的双链环区域；和包括SEQ ID NO：8的氨基酸439-467的TeNT的双链环区域(表4)。
Figure BDA0000152179730000931
Figure BDA0000152179730000941
如本文中所使用的，术语“内源双链环蛋白酶切割位点”与“天然存在的双链环蛋白酶切割位点”同义，意指在天然存在的梭菌毒素的双链环区域内发现的天然存在的蛋白酶切割位点，包括但不限于天然存在的梭菌毒素双链环蛋白酶切割位点变体，例如，梭菌毒素双链环蛋白酶切割位点同种型和梭菌毒素双链环蛋白酶切割位点亚型。内源蛋白酶切割位点的非限定性实例包括例如BoNT/A双链环蛋白酶切割位点、BoNT/B双链环蛋白酶切割位点、BoNT/C1双链环蛋白酶切割位点、BoNT/D双链环蛋白酶切割位点、BoNT/E双链环蛋白酶切割位点、BoNT/F双链环蛋白酶切割位点、BoNT/G双链环蛋白酶切割位点和TeNT双链环蛋白酶切割位点。
如上文中所提及的，梭菌毒素被翻译为约150kDa的单链多肽，随后其被天然存在的蛋白酶在二硫环内通过蛋白水解分离切割。该翻译后加工产生双链分子，所述分子包含通过单个二硫键和非共价相互作用保持在一起的约50kDa的轻链(LC)和约100kDa的重链(HC)。虽然所述蛋白酶的身份目前还不清楚，但已确定许多梭菌毒素的双链环蛋白酶切割位点。在BoNT中，K448-A449上的切割使BoNT/A的单链多肽形式转化成双链形式；K441-A442上的切割使BoNT/B的单链多肽形式转化成双链形式；K449-T450上的切割使BoNT/C1的单链多肽形式转化成双链形式；R445-D446上的切割使BoNT/D的单链多肽形式转化成双链形式；R422-K423上的切割使BoNT/E的单链多肽形式转化成双链形式；K439-A440上的切割使BoNT/F的单链多肽形式转化成双链形式；以及K446-S447上的切割使BoNT/G的单链多肽形式转化成双链形式。TeNT的单链多肽形式在A457-S458上的蛋白水解切割导致双链形式。BaNT的单链多肽形式在K431-N432上的蛋白水解切割导致双链形式。BuNT的单链多肽形式在R422-K423上的蛋白水解切割导致双链形式。这样的双链环蛋白酶切割位点框内有效地连接于TVEMP成为功能蛋白。然而，还应当指出，双链环内的其它切割位点似乎也可被切割，从而导致将被丢失的小肽片段的产生。作为非限定性实例，BoNT/A单链多肽切割最终导致双链环内10个氨基酸的片段的丢失。
因此，在一个实施方案中，将包括内源梭菌毒素双链环蛋白酶切割位点的蛋白酶切割位点用于将单链毒素转变成双链形式。在本实施方案的方面，通过蛋白水解切割进行的至双链形式的转变可从位点发生，所述位点包括例如BoNT/A双链蛋白酶切割位点、BoNT/B双链环蛋白酶切割位点、BoNT/C1双链环蛋白酶切割位点、BoNT/D双链环蛋白酶切割位点、BoNT/E双链环蛋白酶切割位点、BoNT/F双链环蛋白酶切割位点、BoNT/G双链环蛋白酶切割位点、TeNT双链环蛋白酶切割位点、BaNT双链环蛋白酶切割位点或BuNT双链环蛋白酶切割位点。
在本实施方案的其它方面，通过蛋白水解切割进行的至双链形式的转变可从位点发生，所述位点包括例如包括SEQ ID NO：1的氨基酸430-454的BoNT/A的双链环区域；包括SEQ ID NO：2的氨基酸437-446的BoNT/B的双链环区域；包括SEQ ID NO：3的氨基酸437-453的BoNT/C1的双链环区域；包括SEQ ID NO：4的氨基酸437-450的BoNT/D的双链环区域；包括SEQ ID NO：5的氨基酸412-426的BoNT/E的双链环区域；包括SEQ ID NO：6的氨基酸429-445的BoNT/F的双链环区域；包括SEQ ID NO：7的氨基酸436-450的BoNT/G的双链环区域；或包括SEQ ID NO：8的氨基酸439-467的TeNT的双链环区域；包括SEQ ID NO：9的氨基酸421-435的BaNT的双链环区域；或包括SEQ ID NO：10的氨基酸412-426的BuNT的双链环区域。
预期可使用外源蛋白酶切割位点将本文中公开的TVEMP的单链多肽形式转变成双链形式。如本文中所使用的，术语“外源蛋白酶切割位点”与“非天然存在的蛋白酶切割位点”或“非天然蛋白酶切割位点”同义，意指通常不存在于来自天然存在的梭菌毒素的双链环区域的蛋白酶切割位点，条件是外源蛋白酶切割位点不是人蛋白酶切割位点或对在宿主细胞中表达的蛋白酶易感的蛋白酶切割位点，所述宿主细胞表达编码本文中公开的可激活多肽的构建体。预期可用于将梭菌毒素的单链多肽形式转变成双链形式的任何和所有外源蛋白酶切割位点对于实施本发明的方面是有用的。外源蛋白酶切割位点的非限定性实例包括例如植物木瓜蛋白酶切割位点、昆虫蛋白酶切割位点、甲壳动物木瓜蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、人鼻病毒3C蛋白酶切割位点、人肠道病毒3C蛋白酶切割位点、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点、烟草叶脉斑点病毒(TVMV)切割位点、枯草杆菌蛋白酶切割位点、羟胺切割位点或胱天蛋白酶3切割位点。
预期任何和所有长度的外源蛋白酶切割位点可用于本发明的方面，条件是外源蛋白酶切割位点能够被其各自的蛋白酶切割。因此，在本实施方案的方面，外源蛋白酶切割位点具有例如至少6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或至少60个氨基酸；或至多6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或至少60个氨基酸的长度。
在实施方案中，外源蛋白酶切割位点位于TVEMP的双链环内。在本实施方案的方面，TVEMP包括外源蛋白酶切割位点，所述切割位点包括例如植物木瓜蛋白酶切割位点、昆虫蛋白酶切割位点、甲壳动物木瓜蛋白酶切割位点、非人肠激酶切割位点、烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点、烟草叶脉斑点病毒切割位点、人鼻病毒3C蛋白酶切割位点、人肠道病毒3C蛋白酶切割位点、枯草杆菌蛋白酶切割位点、羟胺切割位点、SUMO/ULP-1蛋白酶切割位点和非人胱天蛋白酶3切割位点。在本实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点位于例如经修饰的BoNT/A、经修饰的BoNT/B、经修饰的BoNT/C1、经修饰的BoNT/D、经修饰的BoNT/E、经修饰的BoNT/F、经修饰的BoNT/G、经修饰的TeNT、经修饰的BaNT或经修饰的BuNT的双链环内。
在本实施方案的方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的非人肠激酶切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的牛肠激酶蛋白酶切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的牛肠激酶蛋白酶切割位点，其包括SEQ ID NO：36。在本实施方案的其它方面，牛肠激酶蛋白酶切割位点位于例如经修饰的BoNT/A、经修饰的BoNT/B、经修饰的BoNT/C1、经修饰的BoNT/D、经修饰的BoNT/E、经修饰的BoNT/F、经修饰的BoNT/G、经修饰的TeNT、经修饰的BaNT或经修饰的BuNT的双链环内。
在本实施方案的另一个方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点，其包括共有序列E-P5-P4-Y-P2-Q*-G(SEQ ID NO：377)或E-P5-P4-Y-P2-Q*-S(SEQ IDNO：38)，其中P2、P4和P5可以是任何氨基酸。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括位于TVEMP的双链环内的烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点，其包括SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：48。在本实施方案的其它方面，烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点位于例如经修饰的BoNT/A、经修饰的BoNT/B、经修饰的BoNT/C1、经修饰的BoNT/D、经修饰的BoNT/E、经修饰的BoNT/F、经修饰的BoNT/G、经修饰的TeNT、经修饰的BaNT或经修饰的BuNT的双链环内。
在本实施方案的另一个方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的烟草叶脉斑点病毒蛋白酶切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的烟草叶脉斑点病毒蛋白酶切割位点，其包含共有序列P6-P5-V-R-F-Q*-G(SEQ ID NO：49)或P6-P5-V-R-F-Q*-S(SEQ ID NO：50)，其中P5和P6可以是任何氨基酸。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的烟草叶脉斑点病毒蛋白酶切割位点，其包括SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQID NO：53或SEQ ID NO：54。在本实施方案的其它方面，烟草叶脉斑点病毒毒蛋白酶切割位点位于例如经修饰的BoNT/A、经修饰的BoNT/B、经修饰的BoNT/C1、经修饰的BoNT/D、经修饰的BoNT/E、经修饰的BoNT/F、经修饰的BoNT/G、经修饰的TeNT、经修饰的BaNT或经修饰的BuNT的双链环内。
在本实施方案的另一个方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的人鼻病毒3C蛋白酶切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的人鼻病毒3C蛋白酶切割位点，其包含共有序列P5-P4-L-F-Q*-G-P(SEQ ID NO：55)，其中P4为G、A、V、L、I、M、S或T并且P5可以是任何氨基酸，D或E是优选的。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的人鼻病毒3C蛋白酶切割位点，其包括SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的人鼻病毒3C蛋白酶，其可被PRESCISSION
Figure BDA0000152179730000981
切割。在本实施方案的其它方面，人鼻病毒3C蛋白酶切割位点位于例如经修饰的BoNT/A、经修饰的BoNT/B、经修饰的BoNT/C1、经修饰的BoNT/D、经修饰的BoNT/E、经修饰的BoNT/F、经修饰的BoNT/G、经修饰的TeNT、经修饰的BaNT或经修饰的BuNT的双链环内。
在本实施方案的另一个方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的枯草杆菌蛋白酶切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的枯草杆菌蛋白酶切割位点，其包括共有序列P6-P5-P4-P3-H*-Y(SEQID NO：62)或P6-P5-P4-P3-Y-H*(SEQ ID NO：63)，其中P3、P4以及P5和P6可以是任何氨基酸。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链区内的枯草杆菌蛋白酶切割位点，其包括SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的枯草杆菌蛋白酶切割位点，其可被GENENASE
Figure BDA0000152179730000991
切割。在本实施方案的其它方面，枯草杆菌蛋白酶切割位点位于例如经修饰的BoNT/A、经修饰的BoNT/B、经修饰的BoNT/C1、经修饰的BoNT/D、经修饰的BoNT/E、经修饰的BoNT/F、经修饰的BoNT/G、经修饰的TeNT、经修饰的BaNT或经修饰的BuNT的双链环内。
在本实施方案的另一个方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位TVEMP的双链环内的羟胺切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如包含多个二肽N*G的羟胺切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括位于TVEMP的双链环内的羟胺切割位点，其包括SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68。在本实施方案的其它方面，羟胺切割位点位于例如经修饰的BoNT/A、经修饰的BoNT/B、经修饰的BoNT/C1、经修饰的BoNT/D、经修饰的BoNT/E、经修饰的BoNT/F、经修饰的BoNT/G、经修饰的TeNT、经修饰的BaNT或经修饰的BuNT的双链环内。
在本实施方案的另一个方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的SUMO/ULP-1蛋白酶切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的SUMO/ULP-1蛋白酶切割位点，其包括共有序列G-G*-P1’-P2’-P3’(SEQ ID NO：69)，其中P1’、P2’和P3’可以是任何氨基酸。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的SUMO/ULP-1蛋白酶切割位点，其包括SEQID NO：70。在本实施方案的其它方面，SUMO/ULP-1蛋白酶切割位点位于例如经修饰的BoNT/A、经修饰的BoNT/B、经修饰的BoNT/C1、经修饰的BoNT/D、经修饰的BoNT/E、经修饰的BoNT/F、经修饰的BoNT/G、经修饰的TeNT、经修饰的BaNT或经修饰的BuNT的双链环内。
在本实施方案的方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的非人胱天蛋白酶3切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的小鼠胱天蛋白酶3蛋白酶切割位点。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的非人胱天蛋白酶3蛋白酶切割位点，其包括共有序列D-P3-P2-D*P1’(SEQ ID NO：71)，其中P3可以是任何氨基酸，E是优选的，P2可以是任何氨基酸，P1’可以是任何氨基酸，G或S是优选的。在实施方案的其它方面，外源蛋白酶切割位点可包括例如位于TVEMP的双链环内的非人胱天蛋白酶3蛋白酶切割位点，其包括SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77。在本实施方案的其它方面，牛肠激酶蛋白酶切割位点位于例如经修饰的BoNT/A、经修饰的BoNT/B、经修饰的BoNT/C1、经修饰的BoNT/D、经修饰的BoNT/E、经修饰的BoNT/F、经修饰的BoNT/G、经修饰的TeNT、经修饰的BaNT或经修饰的BuNT的双链环内。
修饰双链环区域以用外源蛋白酶切割位点替代天然存在的双链环蛋白酶切割位点。在该修饰中，天然存在的双链环蛋白酶切割位点是不可操作的，从而不能被其蛋白酶切割。只有外源蛋白酶切割位点才可被相应的外源蛋白酶切割。在该类型的修饰中，外源蛋白酶切割位点框内有效地连接于TVEMP作为融合蛋白，并且所述位点可被其各自的外源蛋白酶切割。用外源蛋白酶切割位点替代内源双链环蛋白酶切割位点可以是位点的置换，其中在邻近内源位点的切割位点位置的位置上进行外源位点改造。用外源蛋白酶切割位点替代内源双链环蛋白酶切割位点可以是外源位点的添加，其中在与内源位点的切割位点位置不同的位置上进行外源位点改造，内源位点被改造成为不可操作的。蛋白酶切割位点的位置和种类可以是至关重要的，因为某些靶向性结构域需要游离氨基末端或羧基末端氨基酸。例如，当将肽靶向性结构域置于两个其它结构域之间时，例如，参见图4，选择蛋白酶酶切割位点的标准可以是切割其位点的蛋白酶是否留下平齐切口(flush cut)，从而暴露靶向性结构域对其受体的选择性结合所必需的靶向性结构域的游离氨基末端或羧基末端。
可通过改变两个侧翼连接被天然存在的双链环蛋白酶切割的肽键的氨基酸中的至少一个来使天然存在的蛋白酶切割位点成为不可操作的。可进行更广泛的改变，条件是双链环区域的两个半胱氨酸残基保持完整并且所述区域可以仍然形成二硫桥。氨基酸改变的非限定性实例包括氨基酸的缺失或用不同氨基酸对原始氨基酸的替换。因此，在一个实施方案中，通过改变至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个氨基酸(包括两个侧翼连接被天然存在的蛋白酶切割的肽键的氨基酸中的至少一个)来使天然存在的蛋白酶切割位点成为不可损伤的。在另一个实施方案中，通过改变至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个氨基酸(包括两个侧翼连接被天然存在的蛋白酶切割的肽键的氨基酸中的至少一个)来使天然存在的蛋白酶切割位点成为不可操作的。
应理解，本文中公开的TVEMP还可任选包括包含柔性间隔区的柔性区域。包含柔性间隔区的柔性区域可用于调整多肽区域的长度以最优化多肽的特征、属性或性质。作为非限定性实例，串联包含一个或多个柔性间隔区的多肽区域可用于更好地暴露蛋白酶切割位点，从而有利于蛋白酶对该位点的切割。作为另一个非限定性实例，串联包含一个或多个柔性间隔区的多肽区域可用于更好地呈递肽靶向性区域，从而有利于该靶向性结构域对其受体的结合。
包含肽的柔性间隔区在长度上为至少一个氨基酸并且包括具有小侧链R基的不带电荷的氨基酸，例如，甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或丝氨酸。因此，在实施方案中，柔性间隔区可具有例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸；或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，柔性间隔区可以为例如1至3个氨基酸、2至4个氨基酸、3至5个氨基酸、4至6个氨基酸或5至7个氨基酸。柔性间隔区的非限定性实例包括例如G-间隔区例如GGG、GGGG(SEQ ID NO：78)，和GGGGS(SEQ ID NO：79)或A-间隔区例如AAA、AAAA(SEQ ID NO：80)和AAAAV(SEQ IDNO：81)。将这样的柔性区域框内有效地连接于TVEMP作为融合蛋白。
因此，在一个实施方案中，本文中公开的TVEMP还可包括包含柔性间隔区的柔性区域。在另一个实施方案中，本文中公开的TVEMP还可包括包含多个串联的柔性间隔区的柔性区。在本实施方案的方面，柔性区可串联地包括例如至少1、2、3、4或5个G-间隔区；或至多1、2、3、4或5个G-间隔区。在本实施方案的其它方面，柔性区可串联地包含例如至少1、2、3、4或5个A-间隔区；或至多1、2、3、4或5个A-间隔区。在本实施方案的另一个方面，TVEMP可包括包含一个或多个拷贝的相同柔性间隔区、一个或多个拷贝的不同柔性间隔区或其任何组合的柔性区。
在本实施方案的其它方面，包含柔性间隔区的TVEMP可以是例如经修饰的BoNT/A、经修饰的BoNT/B、经修饰的BoNT/C1、经修饰的BoNT/D、经修饰的BoNT/E、经修饰的BoNT/F、经修饰的BoNT/G、经修饰的TeNT、经修饰的BaNT或经修饰的BuNT。
预期本文中公开的TVEMP可以在任何和所有位置包含柔性间隔区，条件是TVEMP能够进行中毒过程。在本实施方案的方面，柔性间隔区位于例如酶促结构域与转位结构域之间、酶促结构域与肽靶向性结构域之间、酶促结构域与外源蛋白酶切割位点之间。在本实施方案的其它方面，G间隔区位于例如酶促结构域与转位结构域之间、酶促结构域与肽靶向性结构域之间、酶促结构域与外源蛋白酶切割位点之间。在本实施方案的其它方面，A间隔区位于例如酶促结构域与转位结构域之间、酶促结构域与肽靶向性结构域之间、酶促结构域与外源蛋白酶切割位点之间。
在本实施方案的其它方面，柔性间隔区位于例如肽靶向性结构域与转位结构域之间、肽靶向性结构域与酶促结构域之间、肽靶向性结构域与外源蛋白酶切割位点之间。在本实施方案的其它方面，G间隔区位于例如肽靶向性结构域与转位结构域之间、肽靶向性结构域与酶促结构域之间、肽靶向性结构域与外源蛋白酶切割位点之间。在本实施方案的其它方面，A间隔区位于例如肽靶向性结构域与转位结构域之间、肽靶向性结构域与酶促结构域之间、肽靶向性结构域与外源蛋白酶切割位点之间。
在本实施方案的其它方面，柔性间隔区位于例如转位结构域与酶促结构域之间、转位结构域与肽靶向性结构域之间、转位结构域与外源蛋白酶切割位点之间。在本实施方案的其它方面，G间隔区位于例如转位结构域与酶促结构域之间、转位结构域与肽靶向性结构域之间、转位结构域与外源蛋白酶切割位点之间。在本实施方案的其它方面，A间隔区位于例如转位结构域与酶促结构域之间、转位结构域与肽靶向性结构域之间、转位结构域与外源蛋白酶切割位点之间。
预期本文中公开的TVEMP可在任何和所有位置包括肽靶向性结构域，前题是TVEMP能够进行中毒过程。非限定性实例包括，将肽靶向性结构域置于TVEMP的氨基末端；将肽靶向性结构域置于TVEMP的梭菌毒素酶促结构域与转位结构域之间；和将肽靶向性结构域置于TVEMP的羧基末端。其它非限定性实例包括，将肽靶向性结构域置于TVEMP的梭菌毒素酶促结构域与梭菌毒素转位结构域之间。天然存在的梭菌毒素的酶促结构域包含天然起始甲硫氨酸。因此，在其中酶促结构域不在氨基末端位置中的结构域组织中，应当将包含起始甲硫氨酸的氨基酸序列置于氨基末端结构域之前。同样地，当肽靶向性结构域位于氨基末端位置时，可在其中肽靶向性结构域需要游离氨基末端的情况下，有效地连接包含起始甲硫氨酸和蛋白酶切割位点的氨基酸序列，参见，例如，Shengwen Li等人，DegradableClostridial Toxins，第11/572,512号美国专利申请(2007年1月23日)，将其通过引用整体并入本文。此外，在本领域已知当添加有效地连接于包含起始甲硫氨酸的另一个多肽的氨基末端的多肽时，可缺失原始甲硫氨酸残基。
因此，在一个实施方案中，TVEMP可包括包含肽靶向性结构域、转位结构域、外源蛋白酶切割位点和酶促结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序(图3A)。在本实施方案的方面，TVEMP可包括包含肽靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点和梭菌毒素酶促结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序。
在另一个实施方案中，TVEMP可包括包含肽靶向性结构域、酶促结构域、外源蛋白酶切割位点和转位结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序(图3B)。在本实施方案的方面，TVEMP可包括包含肽靶向性结构域、梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序。
在另一个实施方案中，TVEMP可包括包含酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、肽靶向性结构域和转位结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序(图4A)。在本实施方案的方面，TVEMP可包括包含梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、肽靶向性结构域和梭菌毒素转位结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序。
在另一个实施方案中，TVEMP可包括包含转位结构域、外源蛋白酶切割位点、肽靶向性结构域和酶促结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序(图4B)。在本实施方案的方面，TVEMP可包括包含梭菌毒素转位结构域、肽靶向性结构域、外源蛋白酶切割位点和梭菌毒素酶促结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序。
在另一个实施方案中，TVEMP可包括包含酶促结构域、肽靶向性结构域、外源蛋白酶切割位点和转位结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序(图4C)。在本实施方案的方面，TVEMP可包括包含梭菌毒素酶促结构域、肽靶向性结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序。
在另一个实施方案中，TVEMP可包括包含转位结构域、肽靶向性结构域、外源蛋白酶切割位点和酶促结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序(图4D)。在本实施方案的方面，TVEMP可包括包含梭菌毒素转位结构域、肽靶向性结构域、外源蛋白酶切割位点和梭菌毒素酶促结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序。
在另一个实施方案中，TVEMP可包括包含酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、转位结构域和肽靶向性结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序(图5A)。在本实施方案的方面，TVEMP可包括包含梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域和肽靶向性结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序。
在另一个实施方案中，TVEMP可包括包含转位结构域、外源蛋白酶切割位点、酶促结构域和肽靶向性结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序(图5B)。在本实施方案的方面，TVEMP可包括包含梭菌毒素转位结构域、肽靶向性结构域、外源蛋白酶切割位点和梭菌毒素酶促结构域的氨基至羧基的单链多肽线性顺序。
通过以包含TVEMP的药学上可接受的组合物形式施用用于本发明的组合物。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的”意指当给个体施用时不产生有害的、过敏的或其它不利的或不想要的反应的任何分子实体或组合物。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的组合物”与“药用组合物”同义，意指治疗有效浓度的活性成分，例如，本文中公开的TVEMP的任何一种。包含TVEMP的药物组合物对于医学和兽医学应用是有用的。可将药物组合物单独地或与其它补充活性成分、试剂、药物或激素组合来给患者施用。可使用多种方法的任一种来制造药物组合物，所述方法包括但不限于常规混合、溶解、粒化、制备糖粒(dragee-making)、研磨(levigating)、乳化、封装、捕获(entrapping)和冻干。药物组合物可采取多种形式，包括但不限于无菌溶液、悬浮液、乳剂、冻干产物(lyophilizate)、片剂、丸剂、小丸剂(pellet)、胶囊、粉剂、糖浆剂、酏剂或适合于施用的任何其它剂型。
本发明的方面部分地提供了包含TVEMP的组合物。预期本文中公开的组合物的任一种可用于治疗有此需要的哺乳动物的神经原性炎症的方法，前提是组合物预防或减轻与神经原性炎症相关的症状。包含TVEMP的组合物的非限定性实例包括包含肽靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域的TVEMP。预期可使用本文中公开的任何TVEMP，包括在例如Steward，同上(2007)；Dolly，同上(2007)；Foster，同上，WO 2006/059093(2006)；Foster，同上，WO 2006/059105(2006年6月8日)中公开的那些TVEMP。还应理解，可将两种或更多种不同的TVEMP作为分开的组合物或作为单一组合物的部分来提供。
还预期包含TVEMP的药物组合物可任选地包括促进活性成分加工成药学上可接受的组合物的药学上可接受的载体。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”与“药用载体”同义并且意指当施用时基本上无长期或永久性有害效应的任何载体，包括术语例如“药学上可接受的媒介物、稳定剂、稀释剂、添加剂、助剂或赋形剂”。通常将这样的载体与活性化合物混合，或允许将其稀释或封装活性化合物，所述载体可以是固体、半固体或液体试剂。应理解，活性成分可以是可溶性的或可作为期望的载体或稀释剂中的悬浮液被递送。可使用多种药学上可接受的载体中的任一种载体，所述载体包括但不限于水性介质例如水、盐水、甘氨酸、透明质酸等；固体载体例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等；溶剂；分散介质；包衣剂；抗菌剂和抗真菌剂；等渗剂和吸收延迟剂；或任何其它惰性成分。药学上可接受的载体的选择可取决于施用的模式。除非任何药学上可接受的载体与活性成分不相容，否则考虑其在药学上可接受的组合物中的用途。此类药用载体的具体用途的非限定性实例可见于PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS(Howard C.Ansel等人编，Lippincott Williams &Wilkins Publishers，第7版.1999)；REMINGTON：THE SCIENCE ANDPRACTICE OF PHARMACY(Alfonso R.Gennaro ed.，Lippincott，Williams &Wilkins，第20版.2000)；GOODMAN & GILMAN′S THE PHARMACOLOGICALBASIS OF THERAPEUTICS(Joel G.Hardman等人编，McGraw-HillProfessional，第10版.2001)；和HANDBOOK OF PHARMACEUTICALEXCIPIENTS(Raymond C.Rowe等人，APhA Publications，第4版2003)。这些方案是常规方法并且任何改进在本领域技术人员的能力范围之内和来自本文中的教导。
还预期本文中公开的药物组合物可任选地包括但不限于其它药学上可接受的组分(或药用组分)，包括但不限于缓冲剂、防腐剂、张度调节剂(tonicity adjuster)、盐、抗氧化剂、渗透压调节剂(osmolalityadjusting agent)、生理物质、药理物质(pharmacological substances)、填充剂(bulking agent)、乳化剂、湿润剂、甜味剂或调味剂等。可使用多种用于调节pH的缓冲剂和方法制备本文中公开的药物组合物，只要所得的制剂是药学上可接受的。此类缓冲剂包括但不限于醋酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂和硼酸盐缓冲剂。应理解，可使用酸或碱按需调节组合物的pH。药学上可接受的抗氧化剂包括但不限于焦亚硫酸纳、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁羟茴醚和丁羟甲苯。有用的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、三氯叔丁醇、硫柳汞、醋酸苯汞、硝酸苯汞、稳定型氧氯组合物和螯合剂例如DTPA或DTPA-双酰胺、DTPA钙和CaNaDTPA-双酰胺。用于药物组合物的张度调节剂包括但不限于盐，例如氯化钠、氯化钾、甘露醇或甘油以及其它可药用张度调节剂。药物组合物可以盐形式提供并且可用许多酸来形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐比相应的游离碱形式倾向于更易溶解于水性溶剂或其它质子性溶剂中。应理解，药物学领域中已知的此类和其它物质可包含在药物组合物中。
在实施方案中，包含TVEMP的组合物为包含TVEMP的药物组合物。在本实施方案的方面，包含TVEMP的药物组合物还包含药用载体、药用组分或药用载体和药用组分两者。在本实施方案的其它方面，包含TVEMP的药物组合物还包含至少一种药用载体、至少一种药用组分或至少一种药用载体和至少一种药用组分。
本发明的方面部分地提供了癌症。如本文中所使用的，术语“癌症”意指展示具有不受控制的生长的细胞，所述细胞具有病理生理效应。预期可将本文中公开的TVEMP、组合物和方法可用于治疗任何癌症，所述癌症包括表达存在于TVEMP中的靶向性结构域的同源受体的细胞。例如，包含神经营养蛋白肽靶向性结构域的TVEMP可用于治疗表达神经营养蛋白受体的癌细胞；包含头激活物肽靶向性结构域的TVEMP可用于治疗表达头激活物受体的癌细胞；包含配体(GFL)肽靶向性结构域的胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)家族的TVEMP可用于治疗表达GDNF-GFL受体的癌细胞；包含RF酰胺相关肽(RFRP)靶向性结构域的TVEMP可用于治疗表达RFRP受体的癌细胞；包含神经激素肽靶向性结构域的TVEMP可用于治疗表达神经激素受体的癌细胞；以及包含神经调节细胞因子肽靶向性结构域的TVEMP可用于治疗表达神经调节细胞因子受体的癌细胞。
本发明的方面部分提供了减轻与癌症相关的症状。在一个方面，减轻的症状是癌细胞的生长速率的增加。在另一个方面，减轻的症状是癌细胞的细胞分裂速率的增加。在另一个方面，减轻的症状是癌细胞侵入邻近组织或器官的程度的增加。在另一个方面，减轻的症状是转移的程度的增加。在其它方面，减轻的症状是血管生成的增加。在其它方面，减轻的症状是血管生成的增加。在其它方面，减轻的症状是细胞凋亡的减少。在其它方面，减轻的症状是细胞死亡或细胞坏死的减少。因此，TVEMP治疗将降低癌细胞的生长速率，降低癌细胞的细胞分裂速率，降低癌细胞至相邻组织或器官的侵袭程度，降低转移的程度，减少血管生成，增加细胞凋亡和/或增加细胞死亡和/或细胞坏死。
本发明的方面部分地提供了哺乳动物。哺乳动物包括人，并且人可以是患者。本发明的其它方面部分地提供了个体。个体包括人，人可以是患者。
本发明的方面部分地提供了施用包含TVEMP的组合物。如本文中所使用的，术语“施用”意指给患者施用包含TVEMP的组合物的任何递送机制，所述递送机制潜在地导致临床上、治疗上或实验上有益的结果。据信可使用其中细胞内递送TVEMP的细胞吸收方法或其中从前体RNA(从表达载体表达的)表达TVEMP的基因疗法给患者递送TVEMP。
可使用细胞吸收法将包含本文中公开的TVEMP的组合物给哺乳动物施用。使用细胞吸收法施用包含TVEMP的组合物包括多种肠内或胃肠外法，包括但不限于以任何可接受的形式(例如，片剂、液体、胶囊、粉剂等)进行的口服施用；以任何可接受的形式(例如，滴剂、喷雾剂、乳膏剂、凝胶剂或软膏剂)进行的局部施用；以任何可接受的形式(例如，进入血管的静脉内团注、静脉内输注、动脉内团注(intra-arterial bolus injection)、动脉内输注和导管滴注)进行的静脉内施用；以任何可接受的形式(例如，腹膜内注射、肌内注射、皮下注射、皮下输注、眼内注射、视网膜注射或视网膜下注射或硬膜外注射)进行的组织周围和组织内施用；以任何可接受的形式(例如，导管滴注)进行的囊内施用；和利用安放装置，例如，植入物、贴剂、小丸剂、导管、渗透泵、栓剂、生物蚀解递送系统、非生物蚀解递送系统或另一种植入的延长释放或缓释系统。生物可降解聚合物的示例性目录和使用方法描述于例如Handbook of Biodegradable Polymers(Abraham J.Domb等人编，Overseas Publishers Association，1997)中。
可通过多种本领域技术人员已知的方法将包含TVEMP的组合物给哺乳动物施用，所述方法包括但不限于封装在脂质体中，利用离子电泳，或通过掺入其它媒介物例如水凝胶、环糊精、生物可降解纳米囊和生物粘附微球体，或利用蛋白质载体。用于将包含TVEMP的组合物给患者施用的递送机制描述于例如Leonid Beigelman等人，Compositions for the Delivery of Negativery Charged Molecules，美国专利6,395,713；和Achim Aigner，Delivery Systems for the DirectApplication of siRNAs to Induce RNA Interference(RNAi)in vivo，2006(716559)J.Biomed.Biotech.1-15(2006)；Controlled Drug Delivery：Designing Technologies for the Future(Kinam Park & Randy J.Mrsny编，American Chemical Association，2000)；Vernon G.Wong & Mae W.L.Hu，Methods for Treating Inflammation-mediated Conditions of theEye，美国专利No.6,726,918；David A.Weber等人，Methods andApparatus for Delivery of Ocular Implants，第US2004/0054374号美国专利公布；Thierry Nivaggioli等人，Biodegradable Ocular Implant，第US2004/0137059号号美国专利公布；Patrick M.Hughes等人，Anti-Angiogenic Sustained Release Intraocular Implants and RelatedMethods，第11/364,687号美国专利申请；和Patrick M.Hughes等人，Sustained Release Intraocular Drug Delivery Systems，第2006/0182783号美国专利公布(将每一篇所述文献或专利通过引用并入本文)中。
还可使用基因疗法，通过在表现促成癌症的基于神经的病因学的细胞中表达TVEMP来给患者施用包含本文中公开的TVEMP的组合物。可从有效地连接于表达载体的核酸分子表达TVEMP，参见，例如，P.D.Good等人，Expression of Small，Therapeutic RNAs in HumanCell Nuclei，4(1)Gene Ther.45-54(1997)；James D.Thompson，Polymerase III-based expression of therapeutic RNAs，美国专利6,852,535(2005年2月8日)；Maciej Wiznerowicz等人，Tuning Silence：Conditional Systems for RNA Interference，3(9)Nat.Methods682-688m(2006)；Ola
Figure BDA0000152179730001101
和John J.Rossi，Expressing Short HairpinRNAi in vivo，3(9)Nat.Methods 689-698(2006)；和Charles X.Li等人，Delivery of RNA Interference，5(18)Cell Cycle 2103-2109(2006)。本领域技术人员将认识到，可使用适当的表达载体在真核细胞中表达任何TVEMP。
能够表达TVEMP的表达载体可在表现促成癌症的基于神经的病因学的细胞中提供TVEMP的持久或稳定的表达。可选择地，能够表达TVEMP的表达载体可在表现促成癌症的基于神经的病因学的细胞中提供TVEMP的瞬时表达。此类瞬时表达载体必要时可重复施用。TVEMP表达载体可通过上述递送机制和施用途径，通过施用至从患者外植的靶细胞、然后再引入患者，或通过可允许引入至期望的靶细胞中的任何其它方法来施用，参见，例如，LarryA.Couture和Dan T.Stinchcomb，Anti-gene Therapy：The Use of Ribozymes to Inhibit GeneFunction，12(12)Trends Genet.510-515(1996)。
用于将包含TVEMP的组合物施用至哺乳动物的实际递送机制可由本领域技术人员通过考虑因素(包括但不限于癌症的种类、癌症的位置、癌症的病因、癌症的严重度、期望缓解的程度、期望的缓解的持续时间、所使用的具体的TVEMP、所使用的TVEMP的排泄速率、所使用的TVEMP的药效学、包含在组合物中的其它化合物的性质、施用的具体途径、患者的具体特征、历史和风险因素例如年龄、体重、一般健康状况等或其任何组合)来确定。
在实施方案中，通过注射给待治疗的部位施用包含TVEMP的组合物。在本实施方案的方面，包含TVEMP的组合物的注射是例如肌内注射、器官内注射、皮下注射、真皮注射或用于有效施用包含TVEMP的组合物的至任何其它身体区域中的注射。在本实施方案的方面，包含TVEMP的组合物的注射是至肿瘤或肿瘤周围的区域中的注射。
可使用多种途径给哺乳动物施用包含TVEMP的组合物。适合于治疗本文中公开的癌症的方法的施用途径包括局部施用和全身性施用。局部施用导致与哺乳动物的整个身体相比较显著更多的组合物至特定位置的递送，然而，全身性施用导致组合物至患者的基本上整个身体的递送。适合于治疗本文中公开的癌症的方法的施用途径也包括中央施用和外周施用。中央施用导致组合物至基本上患者的中枢神经系统的递送，包括例如鞘内施用、硬膜外施用以及颅注射或植入。外周施用导致组合物至患者的除中枢神经系统以外的基本上任何区域的递送，包括除了至脊柱或脑的直接施用外的任何施用途径。用于哺乳动物的包含TVEMP的组合物的实际施用途径可由本领域技术人员通过考虑因素(包括但不限于癌症的种类、癌症的位置、癌症的病因、癌症的严重度、期望缓解的程度、期望的缓解的持续时间、所使用的具体的TVEMP、所使用的TVEMP的排泄速率、所使用的TVEMP的药效学、包含在组合物中的其它化合物的性质、施用的具体途径、哺乳动物的具体特征、历史和风险因素例如年龄、体重、一般健康状况等或其任何组合)来确定。
在实施方案中，给哺乳动物全身性施用包含TVEMP的组合物。在另一个实施方案中，给哺乳动物局部施用包含TVEMP的组合物。在本实施方案的方面，给哺乳动物的肿瘤施用包含TVEMP的组合物。在本实施方案的另一个方面，给哺乳动物的肿瘤周围的区域施用包含TVEMP的组合物。
本发明的方面部分地提供了施用治疗有效量的包含TVEMP的组合物。如本文中所使用的，术语“治疗有效量”与“治疗有效剂量”同义，当用于提及治疗癌症时意指达到期望的疗效所必需的TVEMP的最低剂量，包括足以减轻与癌症相关的症状的剂量。在本实施方案的方面，治疗有效量的包含TVEMP的组合物使与癌症相关的症状减轻例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。在本实施方案的其它方面，治疗有效量的包含TVEMP的组合物使与癌症相关的症状减轻例如至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％、至多90％或至多100％。在本实施方案的其它方面，治疗有效量的包含TVEMP的组合物使与癌症相关的症状减轻例如约10％至约100％、约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约10％至约50％、约10％至约40％、约20％至约100％、约20％至约90％、约20％至约80％、约20％至约20％、约20％至约60％、约20％至约50％、约20％至约40％、约30％至约100％、约30％至约90％、约30％至约80％、约30％至约70％、约30％至约60％或约30％至约50％。如本文中所使用的，术语“约”当定量所提及的条目、数目、百分比或项的值时，是指所述条目、百分比、参数或项的值的正或负10％的范围。在本实施方案的其它方面，治疗有效量的TVEMP是足以抑制神经元活性例如至少1周，至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月的剂量。
可由本领域技术人员通过考虑因素(包括但不限于癌症的种类、癌症的位置、癌症的病因、癌症的严重度、期望缓解的程度、期望的缓解的持续时间、所使用的具体的TVEMP、所使用的TVEMP的排泄速率、所使用的TVEMP的药效学、包含在组合物中的其它化合物的性质、施用的具体途径、患者的具体特征、历史和风险因素例如年龄、体重、一般健康状况等或其任何组合)来确定待给哺乳动物施用的包含TVEMP的组合物的实际治疗有效量。此外，在使用包含TVEMP的组合物的重复施用的情况下，包含TVEMP的组合物的实际有效量还将取决于因素，包括但不限于施用的频率、包含TVEMP的组合物的半衰期或其任何组合。本领域技术人员已知可在给人施用之前，使用动物模型从体外测定和体内施用研究推知包含TVEMP的组合物的有效量。鉴于各种施用途径的不同效率，预期必需有效量存在较大的变化。例如，通常预期口服施用需要比通过静脉内或玻璃体内注射的施用更高的剂量水平。可使用最佳化的标准经验例程来调整这些剂量水平的变化，这对于本领域技术人员来说是公知的。确切的治疗有效剂量水平和模式优选由主治医生考虑上述因素来确定。
作为非限定性实例，当给哺乳动物施用包含TVEMP的组合物时，治疗有效量通常在约1fg至约3.0mg的范围内。在本实施方案的方面，包含TVEMP的组合物的治疗有效量可以是例如约100fg至约3.0mg，约100pg至约3.0mg，约100ng至约3.0mg或约100μg至约3.0mg。在本实施方案的其它方面，包含TVEMP的组合物的治疗有效量可以是例如约100fg至约750μg、约100pg至约750μg、约100ng至约750μg或1μg至约750μg。在本实施方案的其它方面，包含TVEMP的组合物的治疗有效量可以是例如至少1fg、至少250fg、至少500fg、至少750fg、至少1pg、至少250pg、至少500pg、至少750pg、至少1ng、至少250ng、至少500ng、至少750ng、至少1μg、至少250μg、至少500μg、至少750μg或至少1mg。在本实施方案的其它方面，包含TVEMP的组合物的治疗有效量可以是例如至多1fg、至多250fg、至多500fg、至多750fg、至多1pg、至多250pg、至多500pg、至多750pg、至多1ng、至多250ng、至多500ng、至多750ng、至多1μg、至少250μg、至多500μg、至多750μg或至多1mg。
作为另一个非限定性实例，当给哺乳动物施用包含TVEMP的组合物时，治疗有效量通常在约0.00001mg/kg至约3.0mg/kg的范围内。在本实施方案的方面，有效量的包含TVEMP的组合物可以是例如约0.0001mg/kg至约0.001mg/kg、约0.03mg/kg至约3.0mg/kg、约0.1mg/kg至约3.0mg/kg或约0.3mg/kg至约3.0mg/kg。在本实施方案的其它方面，治疗有效量的包含TVEMP的组合物可以是例如至少0.00001mg/kg、至少0.0001mg/kg、至少0.001mg/kg、至少0.01mg/kg、至少0.1mg/kg或至少1mg/kg。在本实施方案的其它方面，治疗有效量的包含TVEMP的组合物可以是例如至多0.00001mg/kg，至多0.0001mg/kg、多0.001mg/kg、至多0.01mg/kg、至多0.1mg/kg或至多1mg/kg。
给药可以是单剂量或累积的(连续给药)，并且可由本领域技术人员容易地确定。例如，癌症的治疗可包括有效剂量的包含TVEMP的组合物的一次施用。作为非限定性实例，可给患者施用有效剂量的包含TVEMP的组合物一次，例如通过在展示癌症的症状的部位上或其附近单次注射或沉积来施用。可选择地，癌症的治疗可包括在一段时间内多次施用有效剂量的包含TVEMP的组合物，例如，每天一次、数天一次、每周一次、每月一次或每年一次。作为非限定性实例，可每年一次或两次给哺乳动物施用包含TVEMP的组合物。取决于这样的因素如哺乳动物的症状的严重性，施用的时间安排在哺乳动物之间可变化。例如，可每月1次给哺乳动物施用有效剂量的包含TVEMP的组合物，进行无限期的时间，或直至患者不再需要治疗。本领域技术人员将承认，可在整个治疗过程中监控哺乳动物的病况并且可相应地调整被施用的包含TVEMP的组合物的有效量。
还可将包含本文中公开的TVEMP的组合物与其它治疗性化合物组合来给哺乳动物施用以增加治疗的总体治疗效果。使用多种化合物治疗适应症可增加有益作用同时减少副作用的存在。
还可如下描述本发明的方面：
1.治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的组合物的步骤，所述组合物包括包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域的TVEMP，其中所述组合物的施用减轻与癌症相关的症状。
2.TVEMP在制造用于治疗有此需要的哺乳动物的癌症的药物中的用途，其中TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域，并且其中给所述哺乳动物施用治疗有效量的药物减轻与癌症相关的症状。
3.TVEMP用于治疗有此需要的哺乳动物的癌症的用途，所述用途包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的TVEMP的步骤，其中TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域，并且其中TVEMP的施用减轻与癌症相关的症状。
4.治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的组合物的步骤，所述组合物包括包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域以及外源蛋白酶切割位点的TVEMP，其中所述组合物的施用减轻与癌症相关的症状。
5.TVEMP在制造用于治疗有此需要的哺乳动物的癌症的药物中的用途，其中所述TVEMP包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域和外源蛋白酶切割位点，并且其中给所述哺乳动物施用治疗有效量的药物减轻与癌症相关的症状。
6.TVEMP用于治疗有此需要的哺乳动物的癌症的用途，所述用途包括给所述哺乳动物施用治疗有效量的TVEMP的步骤，其中所述TVEMP包含靶向结构域、梭菌毒素转位结构域、梭菌毒素酶促结构域和外源蛋白酶切割位点，并且其中TVEMP的施用减轻与癌症相关的症状。
7.1-3所述的方法，其中所述TVEMP包括如下的氨基至羧基单链多肽线性顺序：1)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域、靶向性结构域，2)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域，3)靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点和梭菌毒素酶促结构域，4)靶向性结构域、梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域，5)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素酶促结构域和靶向性结构域，或6)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域和梭菌毒素酶促结构域。
8.4-6所述的方法，其中所述TVEMP包括如下的氨基至羧基单链多肽线性顺序：1)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域、靶向性结构域，2)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域，3)靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点和梭菌毒素酶促结构域，4)靶向性结构域、梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域，5)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素酶促结构域和靶向性结构域或6)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域和梭菌毒素酶促结构域。
9.1-8所述的方法，其中所述靶向性结构域为神经营养蛋白肽、头激活物肽、配体(GFL)肽的胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)家族、RF-酰胺相关肽、神经激素肽或神经调节细胞因子肽。
10.9所述的方法，其中所述神经营养蛋白肽靶向性结构域为神经生长因子(NGF)肽、脑源性神经营养因子(BDNF)肽、神经营养蛋白-3(NT-3)肽或神经营养蛋白4/5(NT-4/5)肽。
11.10所述的方法，其中所述神经营养蛋白肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：82的氨基酸139-257、SEQ ID NO：83的氨基酸133-240或氨基酸129-247、SEQ ID NO：84的氨基酸144-249或氨基酸19-257或SEQ ID NO：85的氨基酸89-202或氨基酸81-210。
12.10-11所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、神经母细胞瘤、黑素瘤、许旺细胞瘤、胰岛素瘤、肝细胞瘤、髓母细胞瘤、泌乳素瘤、结肠癌、白血病、慢性髓性白血病、肥大细胞白血病、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞肺癌、肺癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、纤维肉瘤或嗜铬细胞瘤。
13.9所述的方法，其中所述头激活物肽靶向性结构域为头激活物肽。
14.13所述的方法，其中所述头激活物肽靶向性结构域包括SEQID NO：86。
15.13-14所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
16.9所述的方法，其中所述配体肽靶向性结构域的胶质细胞系源性神经营养因子家族为胶质细胞系源性神经营养蛋白肽、Neurturin肽、Persephrin肽或Artemin肽。
17.16所述的方法，其中所述配体肽靶向性结构域的胶质细胞源性神经营养因子家族包括SEQ ID NO：87的氨基酸118-211、SEQ IDNO：88的氨基酸107-196或氨基酸96-197、SEQ ID NO：89的氨基酸66-155或SEQ ID NO：90的氨基酸123-218。
18.16-17所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、腺癌、黑素瘤或膀胱癌。
19.9的方法，其中所述RF酰胺相关肽靶向性结构域为RF酰胺相关肽-1、RF酰胺相关肽-2、RF酰胺相关肽-3、神经肽AF或神经肽FF。
20.19所述的方法，其中所述RF酰胺相关肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：91的氨基酸81-92、氨基酸101-112或氨基酸124-131、SEQ ID NO：92的氨基酸58-92或氨基酸104-131、SEQ ID NO：93的氨基酸83-94或氨基酸109-125或SEQ ID NO：94的氨基酸65-77或氨基酸92-111。
21.19-20所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
22.9所述的方法，其中所述神经激素肽靶向性结构域为肾上腺皮质素释放激素(CCRH)、甲状旁腺素(PTH)、甲状旁腺素样激素(PTHLH)、PHYH、促甲状腺素释放激素(TRH)、尿皮质素-1(UCN1)、尿皮质素-2(UCN2)、尿皮质素-3(UCN3)或urotensin 2(UTS2)。
23.22所述的方法，其中所述神经激素肽靶向性结构域包括SEQID NO：95的氨基酸159-193或氨基酸154-194、SEQ ID NO：96的氨基酸35-70或氨基酸145-177或SEQ ID NO：97的氨基酸39-206。
24.22-23所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、子宫癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、垂体癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌、子宫内膜癌、嗜铬细胞瘤、鳞状细胞癌、结肠癌、肺泡基底上皮癌、睾丸癌或骨肉瘤。
25.9所述的方法，其中所述神经调节细胞因子肽靶向性结构域为睫状神经营养蛋白肽、血型糖蛋白-A肽、白血病抑制因子肽、心肌营养蛋白-1肽、心肌营养蛋白-样细胞因子肽、神经白细胞素肽和制癌蛋白M肽。
26.25所述的方法，其中所述神经调节细胞因子肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103。
27.25-26所述的方法，其中所述癌症为肝癌、胃癌、淋巴瘤、结肠癌、胃癌。
28.1-27所述的方法，其中所述梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。
29.1-27所述的方法，其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。
30.4-6和8所述的方法，其中所述外源蛋白酶切割位点为植物木瓜蛋白酶切割位点、昆虫木瓜蛋白酶切割位点、甲壳动物木瓜蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、人鼻病毒3C蛋白酶切割位点、人肠道病毒3C蛋白酶切割位点、烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点、烟草叶脉斑点病毒切割位点、枯草杆菌蛋白酶切割位点、羟胺切割位点或胱天蛋白酶3切割位点。
31.包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域和梭菌毒素酶促结构域的TVEMP，其中所述组合物的施用减轻与癌症相关的症状。
32.包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域以及梭菌毒素酶促结构域和外源蛋白酶切割位点的TVEMP，其中所述组合物的施用减轻与癌症相关的症状。
33.31所述的TVEMP，其中所述TVEMP包括如下的氨基至羧基单链多肽线性顺序：1)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域、靶向性结构域，2)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域，3)靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点和梭菌毒素酶促结构域，4)靶向性结构域、梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域，5)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素酶促结构域和靶向性结构域，或6)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域和梭菌毒素酶促结构域。
34.32所述的TVEMP，其中所述TVEMP包括如下的氨基至羧基单链多肽线性顺序：1)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域、靶向性结构域，2)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域，3)靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点和梭菌毒素酶促结构域，4)靶向性结构域、梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域，5)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素酶促结构域和靶向性结构域或6)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域和梭菌毒素酶促结构域。
35.31-34所述的TVEMP，其中所述靶向性结构域为神经营养蛋白肽、头激活物肽、配体(GFL)肽的胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)家族、RF-酰胺相关肽、神经激素肽或神经调节细胞因子肽。
36.35所述的TVEMP，其中所述神经营养蛋白肽靶向性结构域为神经生长因子(NGF)肽、脑源性神经营养因子(BDNF)肽、神经营养蛋白-3(NT-3)肽或神经营养蛋白4/5(NT-4/5)肽。
37.36所述的TVEMP，其中所述神经营养蛋白肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：82的氨基酸139-257、SEQ ID NO：83的氨基酸133-240或氨基酸129-247、SEQ ID NO：84的氨基酸144-249或氨基酸19-257或SEQ ID NO：85的氨基酸89-202或氨基酸81-210。
38.35所述的TVEMP，其中所述头激活物肽靶向性结构域为头激活物肽。
39.38所述的TVEMP，其中所述头激活物肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：86。
40.35所述的TVEMP，其中所述配体肽靶向性结构域的胶质细胞系源性神经营养因子家族为胶质细胞系源性神经营养蛋白肽、Neurturin肽、Persephrin肽或Artemin肽。
41.40所述的TVEMP，其中所述配体肽靶向性结构域的胶质细胞系源性神经营养因子家族包括SEQ ID NO：87的氨基酸118-211、SEQ ID NO：88的氨基酸107-196或氨基酸96-197、SEQ ID NO：89的氨基酸66-155或SEQ ID NO：90的氨基酸123-218。
42.35所述的TVEMP，其中所述RF酰胺相关肽靶向性结构域为RF酰胺相关肽-1、RF酰胺相关肽-2、RF酰胺相关肽-3、神经肽AF或神经肽FF。
43.42所述的TVEMP，其中所述RF酰胺相关肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：91的氨基酸81-92、氨基酸101-112或氨基酸124-131、SEQ ID NO：92的氨基酸58-92或氨基酸104-131、SEQ ID NO：93的氨基酸83-94或氨基酸109-125或SEQ ID NO：94的氨基酸65-77或氨基酸92-111。
44.35所述的TVEMP，其中所述神经激素肽靶向性结构域为肾上腺皮质素释放激素(CCRH)、甲状旁腺素(PTH)、甲状旁腺素样激素(PTHLH)、PHYH、促甲状腺素释放激素(TRH)、尿皮质素-1(UCN1)、尿皮质素-2(UCN2)、尿皮质素-3(UCN3)或urotensin 2(UTS2)。
45.44所述的TVEMP，其中所述神经激素肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：95的氨基酸159-193或氨基酸154-194、SEQ ID NO：96的氨基酸35-70或氨基酸145-177或SEQ ID NO：97的氨基酸39-206。
46.35所述的TVEMP，其中所述神经调节细胞因子肽靶向性结构域为睫状神经营养蛋白肽、血型糖蛋白-A肽、白血病抑制因子肽、心肌营养蛋白-1肽、心肌营养蛋白-样细胞因子肽、神经白细胞素肽和制癌蛋白M肽。
47.46所述的TVEMP，其中所述神经调节细胞因子肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ IDNO：101、SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103。
48.31-47所述的TVEMP，其中所述梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。
49.31-47所述的TVEMP，其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。
50.32和34所述的TVEMP，其中所述外源蛋白酶切割位点是植物木瓜蛋白酶切割位点、昆虫木瓜蛋白酶切割位点、甲壳动物木瓜蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、人肠激酶3C蛋白酶切割位点、人肠道病毒3C蛋白酶切割位点、烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点、烟草叶脉斑点病毒切割位点、枯草杆菌蛋白酶切割位点、羟胺切割位点或胱天蛋白酶3切割位点。
51.包含31-50所述的TVEMP的组合物。
52.51所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
53.52所述的组合物，其中所述药物组合物包含药用载体、药用赋形剂或其任何组合。
实施例
下列实施例举例说明了现设想的代表性实施方案，但不应当被解释为限定公开的TVEMP、包含TVEMP的组合物以及使用此类组合物治疗癌症的方法。
实施例1
轻链测定
本实施例举例说明如何筛选癌细胞以确定具有足以在癌症治疗中提供治疗益处的作用的梭菌毒素轻链。
为了鉴定在使用本文中描述的方法制备用于治疗癌症的TVEMP中是有用的梭菌毒素轻链或其活性片段，进行梭菌毒素轻链切割测定。这些测定解决了两个基本问题。首先，多种肉毒神经毒素血清型的轻链切割不同的SNARE底物。此外，某些细胞只可表达不能被天然存在的肉毒神经毒素切割的SNAP-23。这些细胞可对LC/A不敏感，但如果它们表达突触泡蛋白-2(VAMP-2)和/或突触融合蛋白则可分别对LC/B和LC/C1敏感。其次，该转染测定允许检查轻链以不依赖于受体结合和至细胞内的转位的方式对癌细胞产生的细胞作用。综合起来，该测定法允许检查切割SNARE蛋白对多种癌细胞系(包括几种类型的人癌症)的作用。
使用标准方法制备编码包含连接于不同肉毒毒素血清型的轻链的绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白的哺乳动物表达构建体。这些表达构建体被命名为1)pQBI25/GFP，表达由SEQ ID NO：105的多核苷酸编码的SEQ ID NO：104的GFP的构建体；2)pQBI25/GFP-LC/A，表达由SEQ ID NO：107的多核苷酸编码的SEQ ID NO：106的GFP-LC/A融合蛋白的构建体；3)pQBI/GFP-LC/B，表达由SEQ ID NO：109的多核苷酸编码的SEQ ID NO：108的GFP-LC/B的融合蛋白的构建体；4)pQBI/GFP-LC/C1，表达由SEQ ID NO：111的多核苷酸编码的SEQ ID NO：110的GFP-LC/C1的融合蛋白的构建体；和5)pQBI/GFP-LC/E，表达由SEQ ID NO：113的多核苷酸编码的SEQ IDNO：112的GFP-LC/E融合蛋白的构建体。选择这些特定肉毒毒素血清型的轻链，因为总体上，轻链切割三种主要SNARE蛋白SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白的之一。
为了培养细胞，将适当密度的细胞涂铺在含有3mL适当培养基(表5)的6孔组织培养板的孔内。将细胞在37℃的培养箱中于5％二氧化碳下生长，直至细胞达到适当的密度(约1x 106个细胞)。通过向250μL含有5μg的期望的哺乳动物表达构建体的OPTI-MEM减少血清培养基加入于室温下温育5分钟的250μL含有10μLLipofectAmine 2000(Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA)的OPTI-MEM减少血清培养基来制备500μL转染溶液。将该转染混合物于室温下温育约25分钟。用新鲜无补充的无血清培养基替换生长培养基，向细胞加入500μL转染溶液。随后将细胞在37℃培养箱中在5％二氧化碳下温育约8小时。用新鲜无补充的无血清培养基替换转染培养基，随后将细胞在37℃培养箱中于5％二氧化碳下温育约48小时。在该温育后，通过吸出培养基，用3mL 1x PBS漂洗每一个孔来洗涤细胞。
Figure BDA0000152179730001251
首先使用荧光显微镜分析细胞的GFP表达，所述GFP的表达也表示连接的轻链的同时表达。为了检测GFP-LC融合蛋白的表达和亚细胞定位，利用共聚焦显微镜术检查细胞。利用4％多聚甲醛固定如上所述转染和洗涤的来自细胞系RT4、P19、NCI H69、NCI H82、DU145、T24和J82的细胞。利用共聚焦显微镜，使用488nm的激发激光和510-530nm的发射路径对固定的细胞成像。数据显示每一个细胞类型被成功转染，并且除小细胞肺癌细胞系NCI H69和NCIH82外，来自每一个细胞系的细胞都表达GFP和GFP-轻链融合蛋白(表6)。
为了使癌细胞对内切蛋白酶解切割敏感，必须内源表达靶SNARE蛋白，使其易于被轻链切割。为了检测被切割的SNARE产物的存在，进行蛋白质印迹分析。通过向每一个孔中加入200μL 2xSDS-PAGE加样缓冲液裂解如上所述转染和洗涤的细胞系RT4、P19、NCI H69、NCI H82、DU145、T24和J82的细胞，然后将裂解物转移至试管，加热至95℃进行5分钟。在变性、还原条件下使用NuPAGE
Figure BDA0000152179730001262
Novex 4-12％Bis-Tris预铸的聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离12μL的每一个样品。使用电泳槽转移装置通过蛋白质印迹法将分离的肽从凝胶转移至硝酸纤维素膜上。通过在温和搅拌下在室温下于含有Tris-缓冲盐水(TBS)(25mM 2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇盐酸(Tris-HCl)(pH 7.4)、137mM氯化钠，2.7mM氯化钾)、0.1％聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯、2％牛血清白蛋白(BSA)和5％脱脂奶粉的封闭溶液中温育1小时来封闭膜。将封闭的膜在4℃于TBS、0.1％聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯、2％BSA和1)1∶5,000稀释度的S9684α-SNAP-25兔多克隆抗血清(作为一抗)(Sigma，St.Louis，MO)；2)1∶5,000稀释度的sc17836α-突触融合蛋白-1兔多克隆抗血清(作为一抗)(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)；或3)1∶5,000稀释度的sc69706α-VAMP-2小鼠多克隆抗血清(作为一抗)(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)中温育过夜。在TBS，聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯中洗涤一抗探测的印迹3次，每次5分钟。将洗涤的膜在室温下于TBS、0.1％聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯、2％BSA(包含：1)1∶5,000稀释度的缀合于辣根过氧化物酶(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的81-6720山羊多克隆α-小鼠免疫球蛋白G、重链和轻链(IgG、H+L)抗体(作为二抗)；或2)1∶5,000稀释度的缀合于辣根过氧化物酶(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的81-6120山羊多克隆α-兔免疫球蛋白G，重链和轻链(IgG，H+L)抗体(作为二抗))中温育1小时。在TBS，0.1％聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯中洗涤二抗探测的印迹3次，每次5分钟。使用ECL PlusTM蛋白质印迹检测系统，一种基于化学发光的检测系统(GE Healthcare-Amersham，Piscataway，NJ)使标记的SNARE产物的信号检测可见。使膜成像，利用Typhoon 9410Variable Mode Imager和Imager分析软件(GE Healthcare-Amersham，Piscataway，NJ)定量被切割的SNARE产物％。数据显示SNAP-25和VAMP-2在某些细胞类型中表达，而突触融合蛋白在每一个测试的细胞类型中表达(表7)。
此外，数据显示1)BoNT/A轻链能够切割存在于来自P19胚胎癌细胞系、DU145前列腺癌细胞系和J82膀胱癌细胞系(表8)的细胞中的SNAP-25；2)BoNT/E轻链能够切割存在于来自P19胚胎癌细胞系和J82膀胱癌细胞系(表8)的细胞中的SNAP-25；3)BoNT/B轻链不能切割存在于所有测试的细胞系中的VAMP-2(表8)；和4)BoNT/C1轻链能够切割存在于来自T24膀胱癌细胞系(表8)的细胞中的突触融合蛋白-1。这些结果表明利用适当的梭菌毒素轻链处理癌细胞将切割3种SNARE蛋白之一以抑制胞吐。该抑制将阻止癌细胞生长和存活所必需的生长因子、血管生成因子和抗细胞凋亡存活因子的释放。
为了进一步测试SNARE切割是否中断胞吐作用，进行胰岛素释放测定。当置于高浓度的葡萄糖中时，HIT-T15细胞释放胰岛素。也已显示这些细胞表达SNAP-25，并且SNAP-25是胰岛素释放所需的SNARE复合物的有机组成部分(integral component)。将如上所述转染和洗涤的HIT-T15细胞置于DMEM培养基中，所述培养基包含1)用于基础胰岛素释放的5.6mM葡萄糖(低葡萄糖)；或2)用于刺激的胰岛素释放的25.2mM葡萄糖(高葡萄糖)。将细胞在37℃培养箱中于5％二氧化碳下温育约1小时以允许胰岛素释放。收集温育的培养基，使用胰岛素ELISA试剂盒测定释放的胰岛素的量。按照制造商的说明书(APLCO Diagnostics，Salem，NH)进行测定。胞吐表示为释放的胰岛素的量/1x 106个细胞/小时。
数据显示用GFP-LC/A，GFP-LC/B和GFP-LC/E转染的HIT-T15细胞比未转染的细胞或用GFP转染的细胞释放更少的胰岛素(表9)。此外，在转染的细胞之间于含有低葡萄糖浓度(5.6mM)的培养基中释放的基础胰岛素保持不变。数据表明，BoNT/A、BoNT/B和BoNT/E轻链通过在HIT-T15细胞中切割SNAP-25或VAMP-2而抑制胰岛素的释放。
Figure BDA0000152179730001291
肉毒毒素轻链活性也可抑制蛋白来往于质膜的运输。为了测试SNARE切割是否阻止受体至质膜的递送和定位，测定细胞膜蛋白在用肉毒毒素轻链转染的细胞中的存在或不存在。用2mM NHS-LC-生物素(Thermo Scientific，Rockford，IL)在4℃下处理如上所述转染和洗涤的细胞系DU145和J82的细胞，进行2小时。随后用250mMTris-HCl(pH 7.5)在4℃处理细胞30分钟，随后在TBS中洗涤3次。按照制造商的说明书使用膜蛋白提取试剂盒(Calbiochem，San Diego，CA)分离膜蛋白。用固定的抗生物素蛋白(Thermo Scientific，Rockford，IL)沉淀生物素化的蛋白质。在用TBS洗涤3次后，将样品悬浮于50μL 2x SDS-PAGE加样缓冲液中，在变性、还原条件下使用NuPAGE
Figure BDA0000152179730001292
Novex 4-12％Bis-Tris预铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品。洗涤凝胶，将其在10％甲醇和7％乙酸中固定30分钟。除去洗涤溶液，将凝胶在室温下于SYPRO
Figure BDA0000152179730001293
Ruby蛋白质凝胶染色液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中温育3小时至过夜。将染色的凝胶在10％甲醇和7％乙醇中脱染色30分钟。利用Typhoon 9410 Variable Mode Imager和Imager分析软件(GE Healthcare-Amersham，Piscataway，NJ)使来自脱色的凝胶的化学发光可见。数据显示利用BoNT/A轻链的处理抑制蛋白质来往于质膜的运输，这必然影响位于细胞表面上的受体的群体。该中断的运输可使癌细胞变得对细胞凋亡因子更敏感并且对生长信号和血管生成因子变得不太敏感。
通过确定轻链产生的SNARE切割效应，以及哪一个轻链切割存在于每一种细胞系中的哪一种SNARE蛋白，随后可以将TVEMP靶向在癌细胞中过表达或独特地表达的受体以递送催化轻链的方式设计TVEMP。
实施例2
受体和靶在癌细胞中的存在
本实施例举例说明如何确定可与本文中公开的TVEMP的靶向性部分结合的同源受体的存在以及本文中公开的TVEMP的酶促结构域的靶SNARE蛋白的存在。
为了使TVEMP成为用于治疗本文中公开的癌症的方法的有效试剂，癌细胞必须表达可与TVEMP的靶向性部分结合的适当受体以及可被TVEMP的酶促结构域切割的适当的SNARE蛋白。
为了培养细胞，将适当密度的细胞涂铺在含有100μL适当的培养基(表10)(但不具有血清，以及具有或不具有25μg/mL GT1b(AlexisBiochemicals，San Diego，CA))的96孔组织培养板的孔内。将细胞涂板并且在37℃培养箱中于5％二氧化碳下温育直至细胞分化，如通过标准和常规形态学标准例如生长停止(约3天)评估的。从每一个孔吸出培养基，用100μL含有不同浓度的待测试的肉毒毒素或TVEMP的新鲜培养基替换其以产生完全剂量-反应。以一式三份进行测定。在24小时处理后，洗涤细胞，在无毒素或TVEMP的情况下再温育2天以允许SNARE底物被切割。在该温育后，通过吸出培养基，用3mL1x PBS漂洗每一个孔来洗涤细胞。通过在持续搅拌的条件下于新制备的裂解缓冲液(50mM HEPES，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，1mMEGTA，1％，4-聚氧乙烯辛烷基苯酚醚)中于4℃裂解30分钟来收获细胞。使用台式离心机将裂解的细胞以4000rpm在4℃下离心20分钟以除去碎片。利用Bradford测定法测量细胞裂解物的总蛋白质浓度。
Figure BDA0000152179730001311
Figure BDA0000152179730001321
为了确定癌细胞是否表达适当的受体和靶SNARE蛋白，可进行蛋白质印迹分析。
在一个实施方案中，通过加入40μL 2x SDS-PAGE加样缓冲液(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)并且将板加热至95℃进行5分钟，收获来自如上所述转染和洗涤的细胞系RT4、P19、NCI H69、NCIH82、DU-145、T24、J82、LNCaP和PC-3的细胞。在变性、还原条件下，使用1)CRITERION
Figure BDA0000152179730001322
12％ Bis-Tris预涛聚丙烯酰胺(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)(当分离SNAP-25197切割产物时)；2)NuPAGE
Figure BDA0000152179730001323
12％ Bis-Tris预铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA)(当分离未切割的SNAP-25206底物和SNAP-25197切割产物时)；或3)NuPAGE
Figure BDA0000152179730001324
Novex 4-12％ Bis-Tris预铸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA)(当分离所有其它蛋白质时)通过MOPS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离12μL收获的样品。使用电泳槽转移装置通过蛋白质印迹法将分离的肽从凝胶转移至硝酸纤维素膜上。通过在温和搅拌的条件下在室温下于含有Tris-缓冲盐水(TBS)(25mM 2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇盐酸(Tris-HCl)(pH 7.4)、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾)、0.1％聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯、2％牛血清白蛋白(BSA)和5％脱脂奶粉的封闭溶液中温育1小时来封闭膜。将封闭的膜在4℃于TBS、0.1％聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯、2％BSA和1)1∶5,000稀释度的S9684 α-SNAP-25兔多克隆抗血清(作为一抗)(Sigma，St.Louis，MO)；2)1∶5,000稀释度的sc123α-突触融合蛋白-1兔多克隆抗血清(作为一抗)(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)；或3)1∶5,000稀释度的sc13992 α-VAMP-1/2/3兔多克隆抗血清(作为一抗)(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)；4)1∶5,000稀释度的sc50371α-SNAP-23兔多克隆抗血清(作为一抗)(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)；5)1∶5,000稀释度的sc28955α-SVC2兔多克隆抗血清(作为一抗)(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)；6)1∶5,000稀释度的sc123 α-FGFR3兔多克隆抗血清(作为一抗)(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)；7)1∶5,000稀释度的sc9112 α-KOR1兔多克隆抗血清(作为一抗)(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)；8)1∶5,000稀释度的H00004987-D01Pα-OPRL1兔多克隆抗血清(作为一抗)(Novus Biologicals，Littleton，CO)；和9)1∶5,000稀释度的sc47778 α-β-肌动蛋白小鼠单克隆抗血清(作为一抗)(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)中温育过夜。在TBS，聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯中洗涤一抗探测的印迹3次，每次5分钟。将洗涤的膜在室温下于TBS、0.1％聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯、2％BSA(包含：1)1∶5,000稀释度的缀合于辣根过氧化物酶(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的81-6720山羊多克隆α-小鼠免疫球蛋白G、重链和轻链(IgG，H+L)抗体(作为二抗)；或2)1∶5,000稀释度的缀合于辣根过氧化物酶(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的81-6120山羊多克隆α-兔免疫球蛋白G、重链和轻链(IgG，H+L)抗体(作为二抗))中温育1小时。在TBS，0.1％聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯中洗涤二抗探测的印迹3次，每次5分钟。使用ECL PlusTM蛋白质印迹检测系统，一种基于化学发光的检测系统(GEHealthcare-Amersham，Piscataway，NJ)使标记的SNARE产物的信号检测可见。使膜成像，利用Typhoon 9410 Variable Mode Imager和Imager分析软件(GE Healthcare-Amersham，Piscataway，NJ)定量被切割的SNARE产物％。数据显示该方法可鉴定存在于细胞(包括每一个细胞系)中的受体和SNARE蛋白(表11)。
Figure BDA0000152179730001341
一旦鉴定包括包含适当的受体和SNARE蛋白的细胞的细胞系，就可通过使用蛋白质印迹分析检测被切割的SNARE产物的存在来测定肉毒毒素或TVEMP使这些细胞中毒的能力。将适当密度的来自待测试的每一个细胞系的细胞涂铺在含有100μL适当的培养基(表7)(具有或不具有25μg/mL GT 1b(Alexis Biochemicals，San Diego，CA))的96孔组织培养板的孔内。将细胞涂板并且在37℃培养箱中于5％二氧化碳下温育直至细胞分化，如通过标准和常规形态学标准例如生长停止(约3天)评估的。从每一个孔吸出培养基，用100μL含有不同的足以产生完全剂量-反应的浓度的待测试的肉毒毒素或TVEMP的新鲜培养基替换其。以一式三份进行测定。在24小时处理后，洗涤细胞，在无毒素或TVEMP的情况下再温育2天以允许SNARE底物被切割。在该温育后，通过吸出培养基，用3mL 1x PBS漂洗每一个孔来洗涤细胞。通过在持续搅拌的条件下在新制备的裂解缓冲液(50mM HEPES，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，1mM EGTA，1％，4-聚氧乙烯辛烷基苯酚醚)中于4℃裂解30分钟来收获细胞。使用台式离心机将裂解的细胞以4000rpm在4℃下离心20分钟以除去碎片。利用Bradford测定法测量细胞裂解物的蛋白质浓度。利用如上所述的蛋白质印迹分析法来分析细胞裂解物的样品。
在一个实施方案中，如上所述转染来自细胞系LNCaP、J82和MCF-7的分化细胞。从每一个孔中吸出培养基，通过用新鲜培养基替换来处理分化的细胞，所述培养基包含：1)0(未处理的样品)、0.12nM、0.36nM、1.1nM、3.3nM、10nM、30nM和90nM BoNT/A；2)0(未处理的样品)和50nM BoNT/A；3)0(未处理的样品)、0.12nM、0.36nM、1.1nM、3.3nM、10nM、30nM和90nM TVEMP(命名为Noci-LHN/A)；或4)0(未处理的样品)和166nM TVEMP(命名为Noci-LHN/A)。在1)3-15小时；2)6小时或3)24小时的处理后，洗涤细胞，将其在毒素或TVEMP不存在的情况下再温育另外16小时以允许SNAP-25底物被切割。在该温育后，如上所述洗涤和收获细胞。使用1∶5,000稀释度的S9684α-SNAP-25兔多克隆抗血清(Sigma，St.Louis，MO)作为一抗和1∶5,000稀释度的缀合于辣根过氧化物酶(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的81-6120山羊多克隆α-兔免疫球蛋白G、重链和轻链(IgG，H+L)抗体作为二抗，利用如上所述的蛋白质印迹分析来检测被切割的SNAP-25产物的存在。这些结果示于表12中。
Figure BDA0000152179730001351
综合起来，数据显示1)BoNT/A能够切割存在于来自LNCaP前列腺癌细胞系、J82膀胱癌细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系(表9)的细胞中的SNAP-25；2)Noci-LHN/A能够切割存在于来自LNCaP前列腺癌细胞系和J82膀胱癌细胞系(表9)的细胞中的SNAP-25。这些结果表明利用适当的梭菌毒素轻链处理癌细胞将切割3种SNARE蛋白之一以抑制胞吐。该抑制将阻止癌细胞生长和存活所必需的生长因子、血管生成因子和抗细胞凋亡存活因子的释放。最后，这些实验举例说明了以下一般概念的有效性，即肉毒毒素轻链至癌细胞内的细胞内递送不仅通过转染轻链构建体而且通过使用靶向性结构域的内源信号转导途径导致适当的SNARE蛋白的切割。
实施例3
轻链递送对血管生成的作用
本实施例举例说明利用肉毒毒素或TVEMP的处理可影响血管生成至足以在癌症治疗中提供治疗益处的程度。
因利用基于LHN/A-G的肉毒毒素或TVEMP的处理而引起的胞吐作用的阻断将可能阻止血管生成因子包括例如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子-1(FGF1)和FGF2的释放。阻止这些血管生成因子的释放将减少或完全抑制其中施用了毒素或TVEMP的区域的血管生成。为了测试这样的处理是否减少或抑制血管生成，进行4个不同的测定：VEGF释放测定、细胞迁移测定、体外血管形成测定和人血管生成蛋白质阵列测定。
已知VEGF为血管内皮细胞的有力的促分裂原和生理及病理血管生成的诱导物。为了验证肉毒毒素或TVEMP在抑制血管生成中的潜能，评估毒素或TVEMP抑制VEGF从细胞释放的能力。为了进行VEGF释放测定，将来自SiMa细胞系的约600,000个细胞涂铺在含有3mL不含培养基的6孔胶原IV组织培养板的孔中，所述培养基包含最低必需培养基、2mM GlutaMAXTM I(具有厄尔盐)、1x B27补充剂、1x N2补充剂、0.1mM非必需氨基酸、10mM HEPES和25μg/mL GT1b。将这些细胞在37℃培养箱中于5％二氧化碳下温育直至细胞分化，如通过标准和常规形态学标准例如生长停止和神经突延伸(约3天)评估的。从每一个孔吸出来自分化的细胞的培养基，用含有0.77mg/mL BoNT/A或1mg/mL Noci-LHN/A TVEMP的新鲜培养基替换其。作为对照，平等地用单独的培养基处理细胞。处理后，除去培养基，用新鲜分化培养基替换其。在加入新鲜分化培养基后1、2、3和4天，从每一个孔中取出60μL的培养基等分，用100μL分化培养基替换其。将取出的培养基于-20℃下贮存直至需要。在取出最后的样品后，对细胞进行胰蛋白酶处理，计数每一个孔中细胞的数目。
使用K151BMB-1VEGF组织培养测定法(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)检测收集的样品中VEGF的存在。用150μL封闭缓冲液(具有0.05％聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯，2％ECL封闭试剂(GE Healthcare-Amersham，Piscataway，NJ)和1％山羊血清(RocklandImmunochemicals，Gilbertsville，PA)的PBS)封闭MULTI-ARRAY
Figure BDA0000152179730001371
96-孔Small Spot Plate VEGF板，在600rpm下振荡1小时。弃去封闭缓冲液，向VEGF板的每一个孔中加入25μL的各样品，将板在4℃温育2小时。用200μL PBS-T(PBS+0.05％Tween-20)洗涤板3次，随后加入25μl的在2％抗体缓冲液(PBS+0.05％聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯)中的5μg/mL SULFO-TAG α-hVEGF小鼠单克隆抗体，加入2％ECL封闭试剂(GE Healthcare-Amersham，Piscataway，NJ)，在室温下将其在振荡器上以600rpm温育1小时。用PBS-T洗涤板3次，随后每孔加入150μL Read Buffer(MSD，Cat#R92TC-1)。将板在SECTORTM Imager 6000 Image读数器(Meso Scale Discovery，Gaithersburg，MD)中进行读数。随后将数据输入Microsoft Office Excel2007。将检测的VEGF的量针对孔中存在的细胞数目进行标准化，使用对照作为100％值来计算VEGF释放值％。
数据显示利用BoNT/A的处理在SiMa细胞中抑制VEGF释放约50％(表13)。虽然Noci-LHN/A TVEMP的添加似乎不抑制VEGF的释放，但该结果归因于Noci-LHN/A TVEMP在SiMa细胞中与BoNT/A相比较的更低的效力。BoNT/A在分化细胞中的EC50小于约0.5nM，然而Noci-LHN/A TVEMP的EC50大于30nM。这样，Noci-LHN/ATVEMP在SiMa细胞中的效应的缺乏简单地归因于较少量的OPRL-1受体存在于这些细胞中。该效应的缺乏确证了概念：表达低水平的靶向受体的细胞将不受肉毒毒素或TVEMP处理影响(即过表达目的受体的肿瘤周围的正常细胞)。此外，IL-6(一种已知的VEGF转录调控剂)的添加对VEGF释放没有影响的发现与外源IL-6的添加不影响VEGF分泌的报导相一致。
由于VEGF是迁移的诱导物，因此影响VEGF的释放的化合物应当也影响迁移。此外，化学药物对胞吐的抑制也将抑制参与细胞迁移的其它因子的释放。为了确定肉毒毒素或TVEMP处理是否减少或抑制细胞迁移，按照制造商的说明书进行细胞迁移测定(EssenBioscience，AnnArbor，MI)。在第1天，将DU-145细胞于生长培养基中以25,000个细胞/孔涂铺在96-孔Essen ImageLock板中。第2天，用生长培养基中的10nM BoNT/A、40nM Noci-LHN/A TVEMP或90nM Gal-LHN/A TVEMP处理细胞。作为迁移的抑制的阳性对照，用0.11μM，0.33μM或1μM细胞松弛素-D处理细胞。作为阴性对照，用单独的培养基处理细胞。在第3天，在细胞达到100％的汇合后，用培养基洗涤细胞，随后将96-pin WoundMaker(Essen Bioscience，AnnArbor，MI)用于在所有孔中同时产生伤口。在细胞创伤后，除去培养基，用150μL杜尔贝科磷酸缓冲盐溶液(具有Ca2+和Mg2+)洗涤细胞2次，随后加入100μL培养基。随后将板置于INCUCYTETM扫描仪(Essen Bioscience，Ann Arbor，MI)中，每隔1小时获取图像，连续进行45小时。使用INCUCYTETM Cell Migration软件将数据分析为相对伤口密度对时间。将相对伤口密度在时间0时设定为0，当伤口内的细胞密度与最初伤口外的细胞密度相同时，设定为100％。
结果示于表14中。结果显示利用Noci-LHN/A TVEMP或Gal-LHN/A TVEMP预处理的细胞迁移比利用单独的培养基处理的细胞略微更慢。结果显示利用Noci-LHN/A TVEMP或Gal-LHN/A TVEMP的处理导致24小时后细胞迁移的显著减少，当与利用单独的培养基处理的细胞相比较时，减少约10％。利用BoNT/A处理的细胞对细胞迁移不显示任何影响。利用细胞松弛素-D处理的细胞不迁移。当利用不包含SNAP-25的PC-3细胞进行相同实验时，与减少相反，观察到迁移的增加(数据未显示)，表明最初可能地通过它们的配体受体BoNT/A、Noci-LHN/A TVEMP和Gal-LHN/A TVEMP功能的激活来增加迁移。但在切割SNAP-25后，迁移减少。这样，对肉毒毒素和/或TVEMP的更长时间暴露将最可能导致这样处理的细胞的迁移的急剧减少。
Figure BDA0000152179730001391
血管生成包括多个步骤：为了获得新血管形成，内皮细胞首先必须通过穿破基膜逃离它们的稳定位置。一旦这得以实现，内皮细胞向可能从癌细胞或损伤相关的巨噬细胞释放的血管生成刺激物迁移。此外，内皮细胞增殖以提供必需数目的细胞来产生新血管。在该增殖后，新长出的内皮细胞需要重新组织成三维管状结构。为了确定肉毒毒素或TVEMP处理是否能够减少或抑制血管形成，按照制造商的说明书进行体外内皮管形成测定(Cell Biolabs，Inc.，San Diego，CA)。将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在汇合之前于T-75培养瓶中生长至80％汇合。收获细胞，随后将其以500,000个细胞/孔(对于HUVEC)涂铺在6孔板中，进行24小时。在温育后，使细胞保持未处理或用2nM或5nM的BoNT/A或6nM或25nM的Noci-LHN/A TVEMP处理24小时。作为抑制的阳性对照，用胶原酶抑制剂处理细胞。作为抑制的阴性对照，用单独的培养基处理细胞。随后再次收获细胞，将其以35,000个细胞/孔涂铺在从鼠Engelbreth-Holm-Swan(EHS)肿瘤细胞制备的ECM凝胶上，所述凝胶包含多种血管生成刺激因子，例如，层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白(entactin)和生长因子例如FGF2和TGF-β。将细胞在ECM凝胶上温育3-4小时，随后在用钙黄绿素AM染色之前或之后，在显微镜下进行观察，照相。
也改进内皮管形成测定以使用来自肿瘤细胞系的细胞。在该改进的测定中，将来自LNCaP、PC-3、DU-145、T24和J82细胞系的细胞在T-75培养瓶中生长至80％的汇合。随后收获细胞，将其以400,000个细胞/孔涂铺在含有3mL适当的培养基(表10)(但具有1％血清)的6孔板中。将细胞在37℃培养箱中于5％二氧化碳下温育3天。在温育后，使细胞保持未处理，或用20nM BoNT/A或40nM Noci-LHN/ATVEMP处理24小时。随后收获细胞，将其涂铺在ECM凝胶板上，如上所述进行观察。
结果显示在HUVEC、DU145和J82细胞中，在更低的程度上在T24和LNCaP细胞中，管在用单独的培养基处理的ECM板上形成，然而利用胶原酶抑制剂的处理阻止管的形成(表15)。在PC-3细胞中没有管形成。来自LNCaP前列腺癌细胞系和J82膀胱癌细胞系的细胞的BoNT/A和Noci-LHN/ATVEMP处理抑制管的形成。BoNT/A和Noci-LHN/A TVEMP处理对来自HUVEC培养的管形成没有影响。管形成的抑制可能因受体和其它蛋白(运动性因子(motility factor)和它们的受体)至膜、与基质或其它细胞相互作用的粘附分子的迁移、递送和/或蛋白酶的分泌的抑制而引起。
Figure BDA0000152179730001401
Figure BDA0000152179730001411
为了进行人血管生成蛋白质阵列筛选，将来自DU-145前列腺癌细胞系的细胞涂铺在100mm2的含有伊格尔最低必需培养基(具有1％经活性炭处理的FBS，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的板中。通过在37℃培养箱中于5％二氧化碳下温育过夜，将细胞生长至5x106个细胞的密度。在该温育后，通过吸出培养基，用10mL 1x PBS漂洗来洗涤细胞。通过用含有50nM BoNT/A的新鲜培养基替换来处理洗涤的细胞。为了进行比较，平均地进行用单独的培养基处理的细胞。在24小时的处理后，洗涤细胞，通过在连续搅拌的条件下，于冰上在新制备的裂解缓冲液(50mM HEPES，150mM NaCl，1.5mMMgCl2，1mM EGTA，1％4-聚氧乙烯辛烷基苯酚醚)中裂解30分钟来收获细胞。将裂解的细胞以14,000g在4℃下离心5分钟以除去碎片。利用Bradford测定法测量细胞裂解物的蛋白质浓度。为了进行测定，将阵列与250μL的每一种细胞裂解物(含有500μg蛋白质)一起温育。通过用Typhoon 9410 Imager扫描斑点获取阵列图像，使用ImageQuant TL V2005对阵列进行定量。通过将来自未处理的信号除以测试的样品的信号来测定增加的倍数。
结果显示35种被检测的血管生成相关蛋白中的大部分在用BoNT/A处理的细胞中相对于未处理的对照被上调(表16)。表达上增加的蛋白质参与促进血管生成，除为抗血管生成的两种蛋白质(内皮抑素(endostatin)和血管抑素(angiostatin))外。存在增加的促进细胞增殖、分化、细胞生长和发育的GDNF、PDGF-AA和FGF1。促进或起始血管生成的蛋白质为：凝血因子III、EG-VEGF、血管生成素-1、血管生成素-2和PD-ECGF。参与葡萄糖代谢的蛋白质的表达为：DPPIV、IGFBP-1、IGFBP-2和IGFBP-3。增强细胞-细胞粘附的蛋白质也被上调：MIP-1、MMP-9、内皮缩血管肽-1、血小板因子4和TGF-β1。对于内分泌腺衍生血管内皮生长因子(EG-VEGF)观察到最显著的增加，其增加至几乎100倍。这些蛋白质在细胞裂解物中的增加可反映它们在细胞质中的积累，因为胞吐已被抑制并且细胞不能将它们释放入培养基。
Figure BDA0000152179730001421
Figure BDA0000152179730001431
综合起来，本实施例中描述的实验显示了在肉毒毒素或TVEMP处理后血管生成潜能的总体降低，同时观察到细胞内血管生成蛋白的增加。这可归因于肉毒毒素或TVEMP的受体的激活，所述受体的激活可因SNARE蛋白被切割后胞吐作用的阻断而促进血管生成和/或囊泡蛋白质的积累。
实施例4
轻链递送对细胞凋亡的作用
本实施例举例说明利用肉毒毒素或TVEMP的处理将影响细胞凋亡至足以在癌症治疗中提供治疗益处的程度。
因利用基于LHN/A-G的肉毒毒素或TVEMP的处理而引起的胞吐的阻断将可能导致降低的代谢活性和降低的细胞存活率。这样，因毒素或TVEMP作用而被抑制胞吐能力的癌细胞具有减弱的存活的能力。为了测试这样的处理是否引起降低的癌细胞存活率，进行3个不同的测定：细胞存活率和代谢测定、胱天蛋白酶-3/8活性测定和人细胞凋亡蛋白质阵列测定。
为了确定肉毒毒素或TVEMP处理是否可降低癌细胞存活率，按照制造商的说明书进行CELLTITER 96
Figure BDA0000152179730001441
AQueous One Solution CellProliferationAssay细胞代谢活性测定(Promega Corp.，Madison，WI)。该测定是包含四唑化合物[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐；MTS]的比色测定，所述四唑化合物在代谢活性细胞中被NADPH或NADH还原。还原的MTS可以是在490nm的吸光度上被测量的有色甲臜(formazan)产物。将适当密度的来自细胞系MCF-7、SiMa、PC-12、266.6、RWPE-1和N2a的细胞涂铺在含有100μL适当的培养基(表7)(但无血清，具有或不具有25μg/mL GT1b(Alexis Biochemicals，San Diego，CA))的96孔组织培养板的孔中。将细胞涂板，在37℃培养箱中于5％二氧化碳下温育直至细胞分化，如通过标准和常规形态学标准例如生长停止(约3天)评估的。从每一个孔吸出培养基，通过用含有0(未处理的样品)、0.3125nM、1.25nM和20nM BoNT/A的新鲜培养基替换来处理分化的细胞。在24小时处理后，通过吸出培养基，用100μL 1x PBS漂洗每一个孔来洗涤细胞。洗涤后，向每一个孔中加入100μL MTS溶液，温育2小时，随后利用96孔板读数器记录490nm处的吸光度。通过490nm吸光度的量测量的甲臜产物的量与培养中的活细胞的数目成正比。可将类似的设计用于检查TVEMP对细胞存活率的作用。
结果显示BoNT/A处理降低测试的癌细胞系的代谢活性(表17)。
Figure BDA0000152179730001451
为了进一步证明肉毒毒素或TVEMP处理可降低癌细胞存活率，按照制造商的说明书进行CELLTITER GLO
Figure BDA0000152179730001452
Luminescent细胞存活率测定(Promega Corp.，Madison，WI)。在该测定中，基于表明代谢活性细胞的存在的ATP的存在定量细胞存活率。ATP含量的减少相应于代谢活性不太强的细胞。如上所述分化来自细胞系LNCaP、J82、T24和DU-145的细胞。从每一个孔中吸出培养基，通过用含有1)0(未处理的样品)、25nM和50nM BoNT/A；或2)0(未处理的样品)、250nM和500nM Noci-LHN/A TVEMP的新鲜培养基替换来处理分化的细胞。在24小时的处理后，通过吸出培养基，然后用100μL 1x PBS漂洗每一个孔来洗涤细胞。洗涤后，向每一个孔中加入100μLCELLTITER GLO
Figure BDA0000152179730001453
试剂。在于室温下温育10分钟后，使用SpectraMAX L发光读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测量样品发光。以一式三份进行测定，每天记录细胞存活率，进行4或5天。
数据显示在BoNT/A处理(表18)或Noci-LHN/A TVEMP处理(表19)后，在来自DU-145前列腺癌细胞系和J82膀胱癌细胞系的细胞中都观察到降低的存活率。
Figure BDA0000152179730001454
Figure BDA0000152179730001461
为了确定肉毒毒素或TVEMP治疗是否通过细胞凋亡过程降低癌细胞存活率，测量用BoNT/A处理的细胞的胱天蛋白酶-3/8的活性。如上所述分化来自细胞系LNCaP、J82和T24的细胞。从每一个孔中吸出培养基，通过用包含1)0(未处理的样品)、0.5nM、5nM和50nM的BoNT/A；或2)0(未处理的样品)、1.6nM、16nM和166nM的Noci-LHN/A TVEMP的新鲜培养基进行替换来处理分化细胞。在24小时的处理后，通过吸出培养基，然后用100μL 1x PBS漂洗每一个孔来洗涤细胞。为了测量细胞胱天蛋白酶9活性，向每一个孔的培养基中加入50μL CASPASE-GLO
Figure BDA0000152179730001462
9(Promega，Corp.，Madison，WI)试剂。在于37℃下温育30分钟后，使用Spectramax L照度计(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测量每一个样品的发光。T24剂量不表达SNAP-25并且不应当对利用BoNT/A或Noci-LHN/A TVEMP的处理敏感。
数据显示在暴露于BoNT/A后，对胱天蛋白酶3/8活性的影响在LNCaP细胞中是普遍的，这表明LNCaP细胞系存活率因BoNT/A处理而降低(表20)。这些数据得到测量用BoNT/A处理的群体中的活细胞和死细胞的数目的细胞存活率测定的支持(表18)。虽然来自J82细胞系的细胞未显示显著的胱天蛋白酶3/8活性的差异，但该细胞系在BoNT/A或Noci-LHN/A TVEMP处理后确实包含更大量的死亡细胞(表19)。J82细胞的无胱天蛋白酶活性的观察的原因可能归因于至少两种可能性：1)检测胱天蛋白酶3/8活性的BoNT/A处理的时间安排对于J82和LNCaP是不同的(例如，胱天蛋白酶3/8激活可能已在J82细胞中更早发生)；或2)J82的细胞死亡途径不依赖于胱天蛋白酶3/8。
为了测试利用肉毒毒素或TVEMP处理的细胞的细胞死亡是否通过不依赖于胱天蛋白酶3/8途径的过程指导，测定细胞的切割的细胞核聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的存在。PARP为116kDa的细胞核聚(ADP-核糖)聚合酶并且似乎参与响应环境应激的DNA修复。该蛋白质可在体外被许多ICE-样胱天蛋白酶切割并且在体内是胱天蛋白酶-3的主要切割靶之一。在人PARP中，切割在Asp214与Gly215之间发生，这将PARP氨基末端DNA结合结构域(24kDa)与羧基末端催化结构域(89kDa)分离。PARP帮助细胞维持它们的存活力；PARP的切割促进细胞分解，用作细胞经历细胞凋亡的标志。为了确定细胞存活率的变化是否归因于细胞经历细胞凋亡，如上所述分化来自细胞系DU-145和J82的细胞。从每一个孔中吸出培养基，通过用新鲜培养基替换来处理分化的细胞，所述培养基包含1)0(未处理的样品)和50nM BoNT/A；或2)0(未处理的样品)和500nM Noci-LHN/A TVEMP。在48小时处理后，洗涤细胞，收获细胞，除将α-PARP抗体用作一抗外，如实施例1中所述进行蛋白质印迹分析。来自两个细胞系的细胞都显示在2天的Noci-LHN/A TVEMP处理后被切割的PARP增加。然而，被切割的PARP的存在在来自用BoNT/A处理的两个细胞系的细胞中都是最低的。
为了进行人细胞凋亡蛋白质阵列筛选，用BoNT/A处理来自DU-145前列腺癌细胞系的细胞，收获细胞，如实施例3中所述测定细胞。结果显示在用50nM BonT/A处理来自DU-145细胞系的细胞24小时后，当与对照相比较时大多数细胞凋亡相关蛋白保持不变。只有10种表达减少至2/3至5/12的细胞凋亡相关蛋白(表21)。在三种抗细胞凋亡蛋白(Livin、存活素和BCL-x)、两种细胞周期相关蛋白(Claspin和P27)、抗氧化剂相关蛋白(PON2)、伴侣蛋白(凝集素)和两种促细胞凋亡相关蛋白(Bax和细胞色素C)中观察到表达的减少。
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综合起来，本实施例中描述的实验显示利用BoNT/A或TVEMP的处理导致降低的代谢活性和降低的细胞存活率。在轻链递送入癌细胞后，鉴定了与细胞凋亡相关的事件，在用BoNT/A处理后，在LNCaP细胞中观察到胱天蛋白酶3/8活性以及在用Noci-LHN/A TVEMP处理后在DU-145和J82细胞中观察到增加的PARP(胱天蛋白酶3的主要底物)的切割，这显示在用BoNT/A或TVEMP处理后，细胞被推向细胞凋亡。总体上，细胞裂解物中参与细胞凋亡的蛋白质的量在用BoNT/A处理后未改变。大多数促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白通过从细胞质转移至线粒体(而不改变总的蛋白质量)来发挥它们功能。检测到的小的变化可能是肿瘤细胞对胞吐的抑制和对癌细胞存活所需的自分泌或旁分泌回路的输入的干扰的短期响应。最终这些细胞因缺乏存活信号而被推进细胞凋亡。
实施例5
癌症的治疗
通过描述具体的实施方案(而无意以任何方式限定本发明的范围)来提供下列实施例。
医生检查了主诉她的左乳腺中的肿块的62岁妇女，并且诊断她患有乳腺癌。通过在患病区域的附近局部施用包含本文中公开的TVEMP的组合物来治疗该妇女。监控患者的病况，在治疗后约1-7天后，医生注意到恶性肿瘤的生长已减慢。在1和3个月检查时，医生确定肿瘤的大小已变小。肿瘤大小的减小表明利用包含TVEMP的组合物的治疗是成功的。此外，包含本文中公开的TVEMP的组合物的全身性施用也可用于施用公开的TVEMP来治疗乳腺癌。
医生检查了主诉排尿困难的58岁男子，将诊断他患有前列腺癌。通过静脉内施用包含本文中公开的TVEMP的组合物来对该男子进行全身性治疗。监控患者的病况，在治疗后约1-7天后，医生确定前列腺的大小开始变小。在1和3个月检查时，医生确定前列腺的大小已回复至其正常大小，血清PSA水平在正常范围内。肿瘤大小的该减小和/或血清PSA水平的降低表明利用包含TVEMP的组合物的治疗是成功的。此外，包含本文中公开的TVEMP的组合物的局部施用也可用于施用公开的TVEMP来治疗前列腺癌。
医生检查了主诉当他呼吸时哮鸣的67岁男子，并且诊断他患有肺癌。通过静脉内施用包含本文中公开的TVEMP的组合物全身性治疗该男子。监控患者的病况，在治疗后约1-7天后，医生注意到恶性肿瘤的生长已减慢。在1和3个月检查时，该男子表示他的呼吸已回复至正常，医生确定肿瘤的大小已开始变小。正常呼吸和/或肿瘤大小的减小表明利用包含TVEMP的组合物的治疗是成功的。此外，还可将全身性施用用于施用公开的TVEMP来治疗癌症。此外，通过吸入的施用还可用于施用公开的TVEMP来治疗肺癌。
医生检查了主诉骨盆痛的33岁的妇女，并且诊断她患有膀胱癌。通过在患病区域的附近局部施用包含本文中公开的TVEMP的组合物来治疗该妇女。监控患者的病况，在治疗后约1-7天后，医生注意到恶性肿瘤的生长已减慢。在1和3个月检查时，该妇女表示骨盆痛已减退，医生确定肿瘤的大小已开始变小。减轻的疼痛和/或肿瘤大小的减小表明利用包含TVEMP的组合物的治疗是成功的。此外，还可将包含本文中公开的TVEMP的组合物的全身性施用用于施用公开的TVEMP来治疗膀胱癌。
医生检查了主诉腹痛的73岁的妇女，并且诊断她患有结肠癌。通过静脉内施用包含本文中公开的TVEMP的组合物来全身性治疗该妇女。监控患者的病况，在治疗后约1-7天后，医生注意到恶性肿瘤的生长已减慢。在1和3个月检查时，该妇女表示腹痛已减退，医生确定肿瘤的大小已开始变小。减轻的疼痛和/或肿瘤大小的减小表明利用包含TVEMP的组合物的治疗是成功的。此外，还可将包含本文中公开的TVEMP的组合物的局部施用用于施用公开的TVEMP来治疗结肠癌。
医生检查了主诉头痛和眩晕的37岁的男子，并且诊断他患有神经母细胞瘤。通过在患病区域的附近颅内施用包含本文中公开的TVEMP的组合物来治疗该男子。监控患者的病况，在治疗后约1-7天后，医生确定恶性肿瘤的大小已开始变小。在1和3个月检查时，该男子表示他不再受头痛和眩晕的折磨，医生确定神经母细胞瘤消失。头痛、眩晕和/或神经母细胞瘤的消失表明利用包含TVEMP的治疗是成功的。
医生检查了主诉疼痛的皮肤痣和褪色的46岁的男子，并且诊断他患有黑素瘤。通过局部施用包含本文中公开的TVEMP的组合物治疗该男子。监控患者的病况，在治疗后约1-7天后，医生确定皮肤痣的大小已略微减小，并且皮肤不如之前一样褪色。在1和3个月检查时，男子表示他不再遭受任何疼痛折磨，医生确定皮肤痣和褪色已消失。减轻的疼痛和/或皮肤痣的消失表明利用包含TVEMP的组合物的治疗是成功的。此外，还可将包含本文中公开的TVEMP的组合物的全身性施用用于施用公开的TVEMP来治疗膀胱癌。
最后，应理解，虽然已参考多个实施方案描述了本说明书的方面，但本领域技术人员可容易地理解，公开的具体实施例仅举例说明本文中公开的主题的原理。因此，应理解，公开的主题绝不限定于本文中公开的特定的方法、方案和/或试剂等。这样，可按照本文中的教导产生公开的主题的不同改进或变化或备用构型而不背离本说明书的精神。最后，本文中使用的技术仅仅是为了描述特定的实施方案，并且无意限定本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求来界定。因此，本发明不限定于明确显示和描述的实施方案。
在本文中描述了本说明书的某些实施方案，包括已知对于进行本发明的发明人来说是最好的模式。当然，在阅读上述说明后，这些描述的实施方案的变化对于本领域技术人员将变得显然。本发明人预期本领域技术人员适当时应用此类变型，并且本发明人希望用除了本文中明确描述的方式外的方式实施本发明。因此，本发明包括其所附的权利要求中引述的主题的所有变动和等同物，如适用法律所允许的。此外，除非在本文中另有所指或通过上下文表明明确矛盾，否则所有其可能的变型中上述元素的任何组合包括在本发明中。
本文中公开的本发明的备用元素或实施方案的分组不被解释为限制。可个别地或以与所述组的其它成员或本文中发现的其它元素的任何组合提及和声称每一组成员。预期组的一个或多个成员可因方便性和/或专利性包括在组中或从组中删除。当任何这样的包括或删除发生时，说明书被认为包括经改动从而满足所附权利要求中使用的所有马库什群组(Markush Group)的书面描述的组。
除非另外指出，否则表示本说明书和权利要求中所使用的成分、性质例如分子量、反应条件等的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。如本文中所使用的，术语“约”意指所描述的条目、参数或项包括高于或低于所述条目、参数或项的值的正或负10％的范围内。因此，除非表明矛盾，否则说明书和所附权利要求中所示的数值参数为可视通过本发明寻求获得的期望的性质而变化的近似值。绝不试图限制与权利要求的范围等同的教导的应用。每一个数值参数应当至少根据报导的有效数字的数目和通过应用普通舍入技术来解释。虽然本发明的宽范围所示的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报导具体的实施例中所示的数值。然而，任何数值，固有地包括某些必然因在它们各种的测试测量中发现的标准差而引起的误差。
除非在本文中另有所指或通过上下文表明明确相矛盾，否则术语“一种/个(a)”、“一种/个(an)”、“该/所述(the)”和描述本发明的上下文中(特别是下列权利要求的上下文中)使用的类似指示物解释为包括单数和复数。本文中的值的范围的引用仅意欲用作个别地提及落在该范围内的每一个离散值的速记法。除非在本文中另有所指，否则将每一个个别值整合入本说明书就如同其在本文中个别地引用一样。除非在本文中另外指出或通过上下文表明明确相矛盾，否则可以以任何适当的顺序进行本文中描述的所有方法。本文中提供的任何和所有实施例或示例性词汇(例如，“比如”)的使用仅意欲更好地举例说明本发明并且不对所述的本发明的范围施加限制。说明书中没有词汇被解释为表示实施本发明所必需的任何非要求的元素。
可使用词汇“由......组成”或“基本上由......组成”来在权利要求中进一步限制本文中公开的具体实施方案。当用于权利要求时，无论作为每个实施方案提交的或添加的，过渡术语“由......组成”不包括未在权利要求中指出的任何元素、步骤或成分。过渡术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限定于指定的材料或步骤以及在不显著影响基本和新特征的材料或步骤。在本文中固有地或明确地描述所要求保护的本发明的实施方案并且为其授权。
将本说明书中参考和鉴定的所有专利、专利公布和其它公布个别且明确地通过引用整体并入本文以描述和公开例如在这些公布中描述的可与本发明结合使用的组合物和方法。仅在本申请的提交日期之前提供这些公布的公开内容。在这一点上任何信息，都不能被解释对为本发明人无权按照现有发明的性质或因其它原因而享有的先于这些公开纰漏的权利的认可。关于这些文献的内容的日期或表述的所有申明基于对于申请人是可获得的信息并且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
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Claims (24)

1.一种治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的组合物的步骤，所述组合物包括包含靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域以及梭菌毒素酶促结构域和外源蛋白酶切割位点的TVEMP，其中所述组合物的施用减轻与癌症相关的症状。
2.权利要求1所述的方法，其中所述TVEMP包含如下的线性氨基至羧基单链多肽顺序：1)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域、靶向性结构域，2)梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域，3)靶向性结构域、梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点和梭菌毒素酶促结构域，4)靶向性结构域、梭菌毒素酶促结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素转位结构域，5)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、梭菌毒素酶促结构域和靶向性结构域，或6)梭菌毒素转位结构域、外源蛋白酶切割位点、靶向性结构域和梭菌毒素酶促结构域。
3.权利要求1所述的方法，其中所述靶向性结构域为神经营养蛋白肽、头激活物肽、配体(GFL)肽的胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)家族、RF-酰胺相关肽、神经激素肽或神经调节细胞因子肽。
4.权利要求3所述的方法，其中所述神经营养蛋白肽靶向性结构域为神经生长因子(NGF)肽、脑源性神经营养因子(BDNF)肽、神经营养因子-3(NT-3)肽或神经营养因子4/5(NT-4/5)肽。
5.权利要求4所述的方法，其中所述神经营养蛋白肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：82的氨基酸139-257、SEQ ID NO：83的氨基酸133-240或氨基酸129-247、SEQ ID NO：84的氨基酸144-249或氨基酸19-257或SEQ ID NO：85的氨基酸89-202或氨基酸81-210。
6.权利要求4所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、神经母细胞瘤、黑素瘤、许旺细胞瘤、胰岛素瘤、肝细胞瘤、髓母细胞瘤、泌乳素瘤、结肠癌、白血病、慢性髓性白血病、肥大细胞白血病、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞肺癌、肺癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、纤维肉瘤或嗜铬细胞瘤。
7.权利要求3所述的方法，其中所述头激活物肽靶向性结构域为头激活物肽。
8.权利要求7所述的方法，其中所述头激活物肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：86。
9.权利要求7所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
10.权利要求3所述的方法，其中所述配体肽靶向性结构域的胶质细胞源性神经营养因子家族为胶质细胞源性神经营养蛋白肽、Neurturin肽、Persephrin肽或Artemin肽。
11.权利要求10所述的方法，其中所述配体肽靶向性结构域的胶质细胞源性神经营养因子家族包括SEQ ID NO：87的氨基酸118-211、SEQ ID NO：88的氨基酸107-196或氨基酸96-197、SEQ IDNO：89的氨基酸66-155或SEQ ID NO：90的氨基酸123-218。
12.权利要求10所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、腺癌、黑素瘤或膀胱癌。
13.权利要求3所述的方法，其中所述RF酰胺相关肽靶向性结构域为RF酰胺相关肽-1、RF酰胺相关肽-2、RF酰胺相关肽-3、神经肽AF或神经肽FF。
14.权利要求13所述的方法，其中所述RF酰胺相关肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：91的氨基酸81-92、氨基酸101-112或氨基酸124-131、SEQ ID NO：92的氨基酸58-92或氨基酸104-131、SEQ IDNO：93的氨基酸83-94或氨基酸109-125或SEQ ID NO：94的氨基酸65-77或氨基酸92-111。
15.权利要求13所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
16.权利要求3所述的方法，其中所述神经激素肽靶向性结构域为促肾上腺皮质素释放激素(CCRH)、甲状旁腺素(PTH)、甲状旁腺素样激素(PTHLH)、PHYH、促甲状腺素释放激素(TRH)、尿皮质素-1(UCN1)、尿皮质素-2(UCN2)、尿皮质素-3(UCN3)或urotensin2(UTS2)。
17.权利要求16所述的方法，其中所述神经激素肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：95的氨基酸159-193或氨基酸154-194、SEQ IDNO：96的氨基酸35-70或氨基酸145-177或SEQ ID NO：97的氨基酸39-206。
18.权利要求16所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌、子宫癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、垂体癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌、子宫内膜癌、嗜铬细胞瘤、鳞状细胞癌、结肠癌、肺泡基底上皮癌、睾丸癌或骨肉瘤。
19.权利要求3所述的方法，其中所述神经调节细胞因子肽靶向性结构域为睫状神经营养因子肽、血型糖蛋白-A肽、白血病抑制因子肽、心肌营养蛋白-1肽、心肌营养蛋白-样细胞因子肽、神经白细胞素肽和制癌蛋白M肽。
20.权利要求19所述的方法，其中所述神经调节细胞因子肽靶向性结构域包括SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103。
21.权利要求19所述的方法，其中所述癌症为肝癌、胃癌、淋巴瘤、结肠癌、胃癌。
22.权利要求1所述的方法，其中所述梭菌毒素转位结构域为BoNT/A转位结构域、BoNT/B转位结构域、BoNT/C1转位结构域、BoNT/D转位结构域、BoNT/E转位结构域、BoNT/F转位结构域、BoNT/G转位结构域、TeNT转位结构域、BaNT转位结构域或BuNT转位结构域。
23.权利要求1所述的方法，其中所述梭菌毒素酶促结构域为BoNT/A酶促结构域、BoNT/B酶促结构域、BoNT/C1酶促结构域、BoNT/D酶促结构域、BoNT/E酶促结构域、BoNT/F酶促结构域、BoNT/G酶促结构域、TeNT酶促结构域、BaNT酶促结构域或BuNT酶促结构域。
24.权利要求1所述的方法，其中所述外源蛋白酶切割位点为植物木瓜蛋白酶切割位点、昆虫木瓜蛋白酶切割位点、甲壳动物木瓜蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点、人鼻病毒3C蛋白酶切割位点、人肠道病毒3C蛋白酶切割位点、烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点、烟草叶脉斑点病毒切割位点、枯草杆菌蛋白酶切割位点、羟胺切割位点或胱天蛋白酶3切割位点。
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