KR102181505B1 - 가려움증 억제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프로테아제가 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 중 SNARE 단백질을 절단할 수 있는 것인, 비-세포독성 프로테아제; 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상의 결합 부위에 결합할 수 있는 표적화 모이어티 (TM)로서, 결합 부위는 세포내이입을 통해 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 내의 엔도솜 내로 혼입될 수 있고, 여기서 상기 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기는 상기 SNARE 단백질을 발현하는 것인 표적화 모이어티 (TM); 및 프로테아제를 엔도솜 내부로부터 엔도솜 막을 통과하여 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 시토졸 내로 전위시킬 수 있는 전위 도메인을 포함하는 폴리펩티드이되, 단, 폴리펩티드는 클로스트리디움(clostridial) 신경독소 (홀로톡신) 분자가 아닌 것인, 가려움증 억제 또는 치료에서 사용하기 위한 폴리펩티드를 제공한다.

Description

가려움증 억제 {SUPPRESSION OF ITCH}
본 발명은 가려움증 억제 또는 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
의학상 소양증으로 알려져 있는 가려움증은 "피부를 긁고 싶은 욕구 또는 반사 작용을 일으키는 불유쾌한 피부 감각"으로 정의되어 있다. 중증의 가려움증을 앓는 환자는 대개 관련된 불편감 및 심리적 장애, 예컨대, 우울증 또는 수면 박탈에 기인하여 정상적인 생활을 하기가 어려운 것으로 밝혀졌다. 가려움증은 또한 다수의 피부, 전신 및 신경계 장애를 동반하는 심신을 쇠약하게 만드는 병증일 수 있다.
가려움증은 통각과 관련된, 회피 반응에 의해서는 효과적으로 제거되지 못하는 곤충 또는 식물 가시 등의 작은 밀착성 위협으로부터 동물을 보호하도록 진화된 것으로 가정된다. 진화상 밀접한 관계는 가려움증과 통증 뉴런 사이의 중복에서 뚜렷이 나타나는데: 이 둘은 모두 무수초 C형 신경 섬유 (통각수용기)의 자유 신경 종말을 통해 매개된다. 상기 신경을 자극시킬 수 있는 매개체는 다수가 존재하며, 그 예로는 생체 아민, 알칼로이드, 프로테아제, 및 펩티드가 있다. 통각수용기는 그의 말초 축삭을 통해 매개체를 감지하고, 신호를 척수로 전송하여 예를 들면, 뇌에서 가려움증을 인식시킨다. 임상의에게, 가려움증과 통증의 중복이란 신경성 통증을 유발할 수 있는 동일 신경 질환이 또한 신경성 가려움증도 유발할 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 다른 점도 있다. 통증에 효과적인 대부분의 치료법이 가려움증에는 효과가 없다. 특히, 일부 진통제, 예컨대, 오피오이드 통증 완화제 (예컨대, 모르핀) 조차도 가려움증을 유발하거나, 또는 악화시킨다.
최근 연구에서는 통증과 별개인 가려움증 회로의 특징에 관해 설명하기 시작하였다. 가려움증은 진피표피 접합부에, 및 표피 내에 위치하는, '소양수용기 (pruriceptor)' 또는 가려움증-특이 신경 섬유로 지칭되는 통각수용기의 서브세트에 의해 지연되는 것을 특징으로 한다는 것으로 제안되었다. 배근 신경절 (DRG) 또는 3차 신경 중의 감각 뉴런에서 특이적으로 발현되는 특정 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)는 가려움증-독특한 감각에서 필수적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 상기 수용체 군은 최근 가려움증에 대해 독특한 것으로 확인되었고 (즉, 상기 수용체 군은 통증 회로에는 관여하지 않는다), 가려움증을 억제시키는 데 있어 잠재적인 치료학적 표적을 제시한다.
2000년 수행된 세계 질병 부담(Global Burden of Disease: GBD) 연구에 따르면, 인구의 4% (대략 2억 8천명 정도)가 가려움증과 관련된 병증을 앓고 있다. 현재, 항히스타민제 및 코르티코스테로이드 약물이 일부 유형의 급성 가려움증 및 적은 비율의 만성 가려움증 유형을 완화시킬 수 있다. 그러나, 이는 신장 질환 및 간 질환, 암 뿐만 아니라, 피부 질환, 예컨대, 아토피성 피부염으로부터 유발되는 만성 가려움증 사례의 대다수를 치료하지 못한다. 추가로, 항히스타민제는 오직 히스타민-의존성 가려움증 (일반적으로 알레르기성 자극에 의해 유발된 것)을 중화시킬 뿐이다. 그러나, 히스타민-비의존성 가려움증이 가려움증 사례의 대다수를 차지한다.
심하게 긁으면, 피부는 손상될 수 있고, 이로 인해 쉽게 감염될 수 있고, 면역약화된 환자의 경우 중증 결과가 초래될 수 있다 (가려움증이 병증 또는 약물 반응에 뒤따를 수 있는 경우에 그러하다). 가려움증에 기인하여 추가로 손상되고, 감염된 피부는 대개 "가려움증-피부 긁음-가려움증 사이클"을 심하게 만든다 (가려움증이 피부 긁음을 요구하고, 피부 긁음이 가려움증을 더 악화시키는 사이클). 의사에 의해 권장되는 다른 가려움증 완화 기법으로는 광선 요법, 느슨한 면제 의류 착용; 온수에서 단기간 동안 자주 목욕하는 것, 및 30% 내지 40% 습도 수준의 냉한 환경을 유지시키는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 예방적 조치를 유지하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 그러므로, 관련 기술분야에서는 가려움증을 억제 또는 치료하기 위한 신규한 의약이 여전히 요구되고 있다.
이러한 요구는 상기 언급된 문제점들 중 하나 이상을 해결하는 본 발명에 의해 다루어 진다.
본 발명은 융합 단백질이
(i) 프로테아제가 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 중의 SNARE (가용성 N-에틸말레이미드 감수성 인자 부착 단백질 수용체) 단백질을 절단할 수 있는 것인, 비-세포독성 프로테아제;
(ii) 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상의 결합 부위에 결합할 수 있는 표적화 모이어티 (TM)로서, 결합 부위는 세포내이입(endocytosis)을 통해 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 내의 엔도솜 내로 혼입될 수 있고, 여기서 상기 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기는 상기 SNARE 단백질을 발현하는 것인 표적화 모이어티 (TM); 및
(iii) 프로테아제를 엔도솜 내부로부터 엔도솜 막을 통과하여 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 시토졸 내로 전위시킬 수 있는 전위 도메인을 포함하되,
단, 폴리펩티드는 클로스트리디움(clostridial) 신경독소 (홀로톡신) 분자가 아닌 것인, 대상체 (예컨대, 환자)에서의 가려움증 억제 또는 치료에서 사용하기 위한 융합 단백질을 제공함으로써 상기 언급된 문제점들 중 하나 이상을 다룬다.
제1 측면은 또한 환자에게 치료학상 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 가려움증을 억제 또는 치료하기 위한 상응하는 방법을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 자연적으로 발생된 클로스트리디움 신경독소 분자 (이는 또한 클로스트리디움 홀로톡신으로도 공지)가 아니다. 클로스트리디움 홀로톡신은 인간에 공지된 가장 치명적인 신경독소들 중 하나이며, 따라서, 치료용 분자로서 상당한 한계를 가지고 있다. 또한, 가려움증을 억제시키는 것과 관련하여, 클로스트리디움 홀로톡신은 부위 밖의 표적화, 즉, 가려움증 경로의 신경 세포 이외의 세포의 표적화와 관련이 있다.
사용시, 본 발명의 폴리펩티드는 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상의 수용체에 결합한다. 전위 성분은 프로테아제 성분을 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 시토졸로 수송시키는 결과를 가져온다. 최종적으로, 일단 내부로 수송되고 나면, 프로테아제는 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 시토졸에 존재하는 SNARE 단백질을 절단함으로써 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 세포외유출 융합 프로세스를 억제시킨다. 따라서, 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 세포외유출 융합 기구를 불활성화시킴으로써, 본 발명의 폴리펩티드는 그로부터의 신경 전달 물질의 분비를 억제시킨다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기로부터 척수로 전송되는 신경 전달 물질의 수준을 감소시키고, 이로써 가려움증을 억제 또는 치료할 수 있다. 한 실시양태에서 신경 전달 물질은 아세틸콜린이다. 바람직한 실시양태에서, 신경 전달 물질은 글루타메이트이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 신경 전달 물질은 가스트린 방출 단백질 (GRP)이다.
본 발명의 폴리펩티드는 특이 표적 세포인 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기로부터의 분비를 억제시킬 수 있는 잠재능을 가지고 있다는 점에서 다른 치료제에 비해 독특한 이점을 제공한다. 대조적으로, 제안된 다른 치료제들은 효과를 매개하는 수용체에 대한 길항제를 사용하려는 시도를 통해 가려움증을 감소시키고자 한다. 그러나, 본 발명은 그의 생산 부위로부터의 신경 전달 물질 분비를 특이적으로 차단시키는 수단을 제공한다.
본 발명의 주요 표적 세포는 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기이다. DRG 세포는 척추에 의해 척주를 따라 위치하며, 이는 가려움증-특이 수용체로서 확인된, GPCR, 예컨대, MrgprX1, MrgprA3 또는 MrgprC11의 발현 부위이다.
본 발명의 융합 단백질은 일반적으로 상응하는 '유리' TM (즉, 그 자체로서 단리된 TM)과 비교하였을 때, 표적 세포에 대하여 (약 최대 10 내지 100배 범위의) 감소된 결합 친화도를 보인다. 그러나, 이러한 관찰 결과에도 불구하고, 본 발명의 융합 단백질은 놀랍게도 우수한 효능을 보인다. 이는 2가지 주요 특징에 기인하는 것일 수 있다. 첫번째로, 비-세포독성 프로테아제 성분은 촉매성이고 - 따라서, 수개의 상기 분자의 치료 효과는 표적 세포 내에서 빠르게 증폭된다. 두번째로, 표적 세포 상에 존재하는 수용체는 치료제의 유입을 위한 출입구로서의 작용만 하면 되고, 리간드-수용체 매개 약리학적 반응을 달성하기 위해 요구되는 수준으로까지 자극되어야 할 필요는 없다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은, 전형적으로는 높은 마이크로그램 내지 밀리그램의 (심지어 최대 수백 밀리그램까지의) 양으로 투여되는 다른 유형의 치료용 분자에 대해 사용되는 것보다 더 낮은 투여량으로 투여될 수 있다. 대조적으로, 본 발명의 융합 단백질은 훨씬 더 낮은 투여량으로, 전형적으로 10배 이상 더 낮은, 및 더욱 전형적으로, 100배 더 낮은 투여량으로 투여될 수 있다.
비-세포독성 프로테아제
본 발명의 TSI 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 성분은 비-세포독성 프로테아제이다. 따라서, 일단 표적 세포의 시토졸 내로 전달되고 나면, 비-세포독성 프로테아제 성분은 원하는 표적 세포 내에서 SNARE가 절단되도록 한다. SNARE 단백질은 포유동물 세포 내에서 분비 프로세스의 필수 성분이기 때문에 그의 단백질 분해 불활성화는 상기 세포로부터의 분비를 저해/억제시킨다.
비-세포독성 프로테아제는 세포를 사멸시키지 않는 별개의 분자 부류이고; 대신 이는 단백질 합성 이외의 다른 세포 프로세스를 억제시킴으로써 작용한다. 비-세포독성 프로테아제는 각종 고등 유기체 (예컨대, 식물, 및 동물)에 의해 생산되고 - 상기 고등 유기체의 예로는 브라질 전갈이 있다. 추가로, 비-세포독성 프로테아제는 다양한 미생물, 특히, 박테리아, 예컨대, 클로스트리디움 종(Clostridium sp.) 및 나이세리아 종(Neisseria sp.)에 의해 생산된다.
클로스트리디움 신경독소가 비-세포독성 독소 분자의 주요 군을 나타내며, 이는 이황화 결합에 의해 함께 연결된 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 2개의 쇄는 분자량이 대략 100 kDa인 중쇄 (H 쇄), 및 분자량이 대략 50 kDa인 경쇄 (L 쇄)로 명명된다. 프로테아제 기능을 가지며, 세포외유출 프로세스에 관여하는 소포체 또는 원형질막 결합 SNARE 단백질 (예컨대, 신탁신, SNAP 및 시냅토브레빈 (또는 VAMP))에 대하여 고도의 기질 특이성을 보이는 것은 L 쇄이다. 상기 기질은 세포 분비 기구의 필수 성분이다.
나이세리아 종, 가장 두드러지게는 N. 고노호에아에(N. gonorrhoeae) 종으로부터의 것이 기능상 유사한 비-세포독성 독소 분자를 생산한다. 상기 비-세포독성 프로테아제의 예로는 IgA 프로테아제 (WO99/58571 참조)가 있다. 유사 IgA 프로테아제는 스트렙토코커스(streptococci), 예컨대, 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)에 의해 생산된다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 비-세포독성 프로테아제는 클로스트리디움 신경독소 프로테아제 또는 IgA 프로테아제일 수 있다 (예를 들어, WO 99/032272 참조). 비-세포독성 프로테아제의 또 다른 예는 전갈 독액 프로테아제, 예컨대, 브라질 전갈인 티티우스 세룰라투스(Tityus serrulatus)의 독액으로부터의 것, 또는 프로테아제 안타레아제 (예컨대, WO 2011/022357 참조)이다.
표적화 모이어티 ( TM )
이제, 본 발명의 표적화 모이어티 (TM) 성분으로 화제를 바꾸어, 본 발명의 폴리펩티드를 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기에 결합시키는 것이 상기 성분이다. TM은 바람직하게는 펩티드이다.
사용시, 본 발명의 폴리펩티드는 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기에 결합한다. 그 후에, 폴리펩티드의 전위 성분은 프로테아제 성분을 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 시토졸로 수송시키는 결과를 가져온다. 최종적으로, 일단 내부로 수송되고 나면, 프로테아제는 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 시토졸에 존재하는 SNARE 단백질을 절단함으로써 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 세포외유출 융합 프로세스를 억제시킨다. 따라서, 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 세포외유출 융합 기구를 불활성화시킴으로써, 본 발명의 폴리펩티드는 그로부터의 신경 전달 물질의 분비를 억제시킨다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 척수를 통한 뇌로의 가려움증-감각 신호의 전달을 감소시키고, 이로써 가려움증을 억제 또는 치료할 수 있다.
TM은 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상의 결합 부위에 결합함으로써 다른 세포보다 우선하여 상기 종의 표적 세포에 대해 폴리펩티드의 선택성을 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명의 바람직한 TM 실시양태로는 항체 (예컨대, 단일클론 항체, 항체 단편, 예컨대, Fab, F(ab)'2, Fv, ScFv 등, 및 항체 도메인 펩티드) 뿐만 아니라, 하기에서 확인되는 수용체에 결합하는 결합 스캐폴드를 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 해당 표적 세포 또는 수용체에 특이적으로 결합할 수 있도록 디자인된 상업적으로 이용가능한 항체 또는 결합 스캐폴드를 포함할 수 있다. 별법으로, 바람직한 TM은 생체 아민, 알칼로이드, 프로테아제, 펩티드 리간드, 및 신경펩티드를 포함한다.
본 발명의 TM은 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기에 결합한다. 일례로, 본 발명의 폴리펩티드의 TM은 Mas-관련 G-단백질 수용체 (예컨대, MrgprX1, MrgprA3 또는 MrgprC11)를 포함하는 군으로부터 선택되는, 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상의 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)에 결합한다.
한 실시양태에서, TM은 소 부신 수질 펩티드 (예컨대, BAM8 -22), 멜라닌 세포 자극 호르몬 펩티드 (예컨대, γ2-MSH), RF/Y-G 또는 RF/Y-아미드로 종결되는 신경펩티드 (예컨대, NPFF 또는 NPAF), SLIGRL-NH2를 포함하는 펩티드, 알칼로이드 (예컨대, 클로로퀸), 생체 아민 (캡사이신, 히스타민, 세로토닌, 코르티스타틴) 뿐만 아니라, 그의 절두 생성물(truncation) 및 펩티드 유사체로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드의 TM은 MrgprX1, MrgprA3, 또는 MrgprC11을 포함하는 군으로부터 선택되는 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상의 수용체에 결합한다. 상기 수용체들은 모두 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상에서 발현된다.
한 실시양태에서, TM은 BAM8 -22, γ2-MSH, NPFF, NPAF, SLIGRL-NH2, 클로로퀸, 캡사이신, 히스타민, 세로토닌, 코르티스타틴 뿐만 아니라, 그의 절두 생성물 및 펩티드 유사체로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드의 TM은 Mrgpr 수용체에, 및 바람직하게, MrgprX, MrgprA 또는 MrgprC에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 MrgpX1 또는 MrgprA3 또는 MrgprC11에 결합한다. 일례로, 적합한 TM로는 BAM8-22, 클로로퀸, γ2-MSH, RF/Y-G 또는 RF/Y-아미드로 종결되는 신경펩티드 (예컨대, NPFF 또는 NPAF), 캡사이신, 히스타민, 세로토닌, 또는 코르티스타틴을 포함한다. 상기 TM은 Mrgpr에 결합하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, TM은 MrgprX 수용체에, 바람직하게는 MrgprX1에 결합하고; 또한 TM이 BAM8 -22, 또는 그의 절두 생성물 또는 펩티드 유사체인 것이 바람직하다.
전위 도메인
본 발명의 전위 성분은 비-세포독성 프로테아제 (또는 그의 단편)를 표적 세포 내로 전위시킬 수 있고, 이로써 프로테아제 활성의 기능적 발현은 표적 세포의 시토졸 내에서 이루어진다. 전위 성분은 바람직하게는 낮은 pH 조건하에서 지질막 (예컨대, 엔도솜 막) 중에 이온 투과성 포어를 형성할 수 있다. 전위 성분은 미생물 단백질 공급원, 예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 단백질 공급원으로부터 수득될 수 있다. 그러므로, 한 실시양태에서, 전위 성분은 효소, 예컨대, 박테리아 독소의 전위 도메인을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 전위 도메인은 바이러스 단백질의 전위 도메인을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 전위 성분은 클로스트리디움 신경독소 H 쇄 또는 그의 단편, 예컨대, 클로스트리디움 신경독소의 HN 도메인 (또는 그의 전위 단편)을 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있다.
폴리펩티드 제조
본 발명의 폴리펩티드는 3가지 주요 성분: '생체활성' 성분 (즉, 비-세포독성 프로테아제); TM; 및 전위 도메인을 포함한다. 상기 융합 단백질을 제조하는 것과 관련된 일반 기술은 흔히 재표적화 독소 기술로 지칭된다. 예시로, 본 발명자들은 WO94/21300; WO96/33273; WO98/07864; WO00/10598; WO01/21213; WO06/059093; WO00/62814; WO00/04926; WO93/15766; WO00/61192; 및 WO99/58571을 참조할 수 있다. 상기 공개 문헌들은 모두 본원에서 참조로 포함된다.
더욱 상세하게, 본 발명의 TM 성분은 본 발명의 프로테아제 성분 또는 전위 성분에 융합될 수 있다. 상기 융합은 바람직하게, 공유 결합에 의한, 예를 들어, 직접 공유 결합에 의한, 또는 스페이서/링커 분자를 통한 것이다. 프로테아제 성분 및 전위 성분은 바람직하게는 공유 결합을 통해, 예를 들어, 직접 공유 결합을 통해 또는 스페이서/링커 분자를 통해 함께 연결된다. 적합한 스페이서/연결 분자는 관련 기술분야에 주지되어 있고, 전형적으로, 그 길이는 5 내지 40개, 바람직하게는 10 내지 30개의 아미노산 잔기 길이인 아미노산 기반 서열을 포함한다.
사용시, 폴리펩티드는 프로테아제 성분 및 전위 성분이 바람직하게는 이황화 결합을 통해 함께 연결된 것인 2쇄 입체형태를 가진다.
본 발명의 폴리펩티드는 통상의 기술자에게 주지되어 있는 종래 화학적 접합 기법에 의해 제조될 수 있다. 일례로, 문헌 [Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press], 및 [Wong, S.S. (1991), Chemistry of 단백질 conjugation and cross-linking, CRC Press, Nagy et al., PNAS 95 p1794-99 (1998)]을 참조할 수 있다. 합성 TM을 본 발명의 폴리펩티드에 부착시키는 추가의 상세한 방법론은 예를 들어, EP0257742에 제공되어 있다. 상기 언급된 접합에 관한 공개 문헌이 본원에서 참조로 포함된다.
별법으로, 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드 융합 단백질의 재조합 제조법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, WO98/07864 참조). 이 기법은 천연 클로스트리디움 신경독소 (즉, 홀로톡신)를 제조하는 생체내 박테리아 기전에 기초하는 것이며, 이를 통해 하기 '간소화된' 구조 배열을 가지는 융합 단백질을 수득하게 된다:
NH2 - [프로테아제 성분] - [전위 성분] - [TM] - COOH
WO98/07864에 따르면, TM은 융합 단백질의 C 말단 단부 쪽으로 배치된다. 이어서, 융합 단백질은, 프로테아제 성분과 전위 성분 사이의 부위를 절단하는 프로테아제 처리에 의해 활성화된다. 이로써 전위 성분 + TM을 함유하는 또 다른 단일 폴리펩티드에 (이황화 브릿지를 통해) 공유적으로 부착된 단일 폴리펩티드 쇄로서 프로테아제 성분을 포함하는 2쇄 단백질이 제조된다.
별법으로, WO06/059093에 따르면, 융합 단백질의 TM 성분은 프로테아제 절단 부위와 전위 성분 사이의, 선형 융합 단백질 서열 중앙 쪽으로 위치한다. 비록 상기 경우에는 두 성분이 천연 홀로톡신과 비교하였을 때 순서가 역전되어 있기는 하지만, 상기를 통해 TM은 확실하게 전위 도메인에 부착된다 (즉, 천연 클로스트리디움 홀로톡신에서와 같이 존재하게 된다). 이어지는 프로테아제 절단 부위에서의 절단을 통해 TM의 N 말단부가 노출되고, 2쇄 폴리펩티드 융합 단백질이 제공된다.
추가의 대안은 융합 단백질의 TM 성분의 '스플릿 리간드' 제시이다. 여기서, 리간드로서 작용하는 TM 성분은 유리 N 말단 도메인 및 유리 C 말단 도메인, 둘 모두를 포함한다. 따라서, TM은 표적화 모이어티의 N 말단부와 결합 부위의 도메인 사이의 상호작용을 통해 표적 세포 상의 결합 부위 (예컨대, 수용체 또는 억셉터)와 상호작용할 수 있다. 별법으로, TM은 표적화 모이어티의 C 말단부와 결합 부위의 도메인 사이의 상호작용을 수행할 수 있다. 또는, TM은 이중 상호작용을 수행할 수 있으며, 여기서 표적화 모이어티의 N 말단부는 결합 부위의 도메인과 상호작용하고, 표적화 모이어티의 C 말단부는 결합 부위의 도메인과 상호작용한다. 상기 후자의 실시양태에서, TM의 N 및 C 말단부는 결합 부위의 동일한 또는 상이한 도메인에 결합할 수 있고/거나, 상이한 결합 부위 상의 도메인에 결합할 수 있다. 이러한 배열에 관한 추가 정보는 WO2012156743 (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
상기 언급된 프로테아제 절단 서열(들)은 종래 수단에 의해, 예컨대, 부위 지정 돌연변이유발법에 의해 DNA 수준에서 도입될 수 있다(그리고/또는 임의의 고유 절단 서열은 제거될 수 있다). 절단 서열의 존재를 확인하기 위한 스크리닝은 수동으로, 또는 컴퓨터 소프트웨어 (예컨대, DNASTAR, 인크.(DNASTAR, Inc.)에 의한 맵드로우(MapDraw) 프로그램)의 지원으로 수행될 수 있다. 임의의 프로테아제 절단 부위가 사용될 수 있지만 (즉, 클로스트리디움, 또는 비-클로스트리디움), 하기의 것이 바람직하다:
엔테로키나제 (DDDDK↓) (서열 1)
인자 Xa (IEGR↓/IDGR↓) (서열 2 및 3)
TEV(담배 식각 바이러스) (ENLYFQ↓G) (서열 4)
트롬빈 (LVPR↓GS) (서열 5)
프리시전(PreScission) (LEVLFQ↓GP) (서열 6)
추가의 프로테아제 절단 부위로는 비-세포독성 프로테아제에 의해, 예를 들어, 클로스트리디움 신경독소에 의해 절단되는 인식 서열을 포함한다. 상기 서열로는 비-세포독성 프로테아제, 예컨대, 클로스트리디움 신경독소에 의해 절단되는 SNARE (예컨대, SNAP-25, 신탁신, VAMP) 단백질 인식 서열을 포함한다. 특정 예는 US2007/0166332에 제공되어 있다 (상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다).
자가 절단 서열인 인테인 또한 프로테아제 절단 부위라는 용어에 포함된다. 자가 스플라이싱 반응은 예를 들어, 존재하는 환원제의 농도를 달리함으로써 제어가능하다. 상기 언급된 '활성화' 절단 부위는 또한 본 발명의 폴리펩티드 내로 도입되어야 하는 (하기 논의되는) '파괴적' 절단 부위로서 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치하는 정제 태그를 포함할 수 있다. 임의의 정제 태그가 사용될 수 있지만, 하기의 것이 바람직하다:
His-태그 (예컨대, 6 x 히스티딘) (서열 7), 바람직하게 C 말단 및/또는 N 말단 태그로서의 것
MBP-태그 (말토스 결합 단백질), 바람직하게 N 말단 태그로서의 것
GST-태그 (글루타티온-S-트랜스퍼라제), 바람직하게 N 말단 태그로서의 것
His-MBP-태그, 바람직하게 N 말단 태그로서의 것
GST-MBP-태그, 바람직하게 N 말단 태그로서의 것
티오레독신-태그, 바람직하게 N 말단 태그로서의 것
CBD-태그 (키틴 결합 도메인), 바람직하게 N 말단 태그로서의 것.
하나 이상의 펩티드 스페이서/링커 분자가 융합 단백질에 포함될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 스페이서는 정제 태그와 융합 단백질 분자의 나머지 부분 사이에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 언급된 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 측면에서, DNA 서열은 프로모터 및 종결인자를 포함하는 DNA 벡터의 일부로서 제조된다.
바람직한 실시양태에서, 벡터는 하기로부터 선택되는 프로모터를 가진다:
프로모터 유도제 전형적인 유도 조건
Tac (하이브리드) IPTG 0.2 mM (0.05-2.0 mM)
AraBAD L-아라비노스 0.2% (0.002-0.4%)
T7-lac 오퍼레이터 IPTG 0.2 mM (0.05-2.0 mM)
본 발명의 DNA 구축물은 바람직하게 인실리코에서 디자인된 후, 종래 DNA 합성 기법에 의해 합성된다.
상기 언급된 DNA 서열 정보는 사용되는 최종 숙주 세포 (예컨대, E. 콜라이(E. coli)) 발현 시스템에 따른 코돈-편향화에 따라 임의로는 변형된다.
DNA 골격은 바람직하게는, 전사되고 번역되었을 때, 제2 펩티드 코딩 서열에 의해 코딩되는 프로테아제 절단 부위에 상응하는 아미노산 서열을 생성하게 되는 임의의 고유한 핵산 서열에 대해 스크리닝된다. 이러한 스크리닝은 수동으로, 또는 컴퓨터 소프트웨어 (예컨대, DNASTAR, 인크.)에 의한 맵드로우 프로그램)의 지원으로 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "억제하는" 및 "치료하는"이라고 언급하는 것은 대상체에게 치료학적 이점을 제공한다는 것을 의미한다. 이는 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 융합 단백질을 투여함으로써 가려움증을 예방하거나, 또는 그의 중증도를 경감시키는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 측면은 상기 대상체에게 치료학상 유효량의,
(i) 프로테아제가 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 중의 SNARE 단백질을 절단할 수 있는 것인, 비-세포독성 프로테아제;
(ii) 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상의 결합 부위에 결합할 수 있는 표적화 모이어티 (TM)로서, 결합 부위는 세포내이입을 통해 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 내의 엔도솜 내로 혼입될 수 있고, 여기서 상기 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기는 상기 SNARE 단백질을 발현하는 것인 표적화 모이어티 (TM); 및
(iii) 프로테아제를 엔도솜 내부로부터 엔도솜 막을 통과하여 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 시토졸 내로 전위시킬 수 있는 전위 도메인을 포함하는 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하되,
단, 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 (홀로톡신) 분자가 아닌 것인, 가려움증을 예방하거나, 또는 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질이 부위 밖의 위치로 이동할 수 있는 경우에 (국소 프로테아제에 의한) 절단에 의해 쉽게 절단될 수 있는 파괴적 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 이러한 접근법은 부위 밖의 표적화의 위험을 최소화시키는 데 도움이 된다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 예를 들어, WO 2010/094905 및 WO 2002/44199 (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 바와 같이, 하나 이상의 파괴적 절단 부위를 포함하도록 디자인될 수 있다.
폴리펩티드 전달
사용시, 본 발명은 제약상 허용되는 담체, 부형제, 애주번트, 추진제 및/또는 염으로부터 선택되는 1종 이상의 성분과 함께 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물을 사용한다.
본 발명의 폴리펩티드는 경구적, 비경구적, 연속 주입, 삽입, 흡입 또는 국소 적용용으로 제제화될 수 있다. 주사에 적합한 조성물은 액제, 현탁제, 또는 에멀젼, 또는 사용 전 적합한 비히클 중에 용해되거나, 또는 현탁되는 건식 분제의 형태일 수 있다.
국부 전달 수단으로는 경구적 또는 위 전달을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 장용 피복된 캡슐제 또는 다른 입자 시스템, 예컨대, 마이크로스피어 형태의 제제가 사용될 수 있다. 복강경 수술을 통한 십이지장으로의 국부 투여 또한 가능하다. 국부 전달의 다른 예로는 또한 (접착 패치를 통한) 경피 전달을 포함할 수 있다.
바람직한 투여 경로는 전신, 경구적, 복강경 및/또는 국소 주사로부터 선택된다.
주사용 제제의 경우, 임의적으로 투여 부위에의 체류를 지원하거나, 또는 상기 부위로부터의 폴리펩티드 제거를 감소시키기 위해 제약상 활성인 물질을 포함할 수 있다. 상기 제약상 활성인 물질의 일례로 혈관 수축제, 예컨대, 아드레날린이 있다. 상기 제제는 투여 후 폴리펩티드의 체류 기간을 연장시켜 그의 효과를 증가시키고/거나, 증진시킨다는 이점을 부여한다.
본 발명의 폴리펩티드의 투여를 위한 투여량 범위는 원하는 치료학적 효과를 일으키는 것이다. 필요한 투여량 범위는 폴리펩티드 또는 조성물의 정확한 성질, 투여 경로, 제제의 성질, 환자 연령, 환자 병증의 성질, 정도 또는 중증도, 사용 금지 사유, 및 존재할 경우, 주치의의 판단에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 투여량 수준에 있어서의 변동은 최적화를 위한 표준 실험적 관례를 사용하여 조정될 수 있다.
(환자 체중 1 kg당) 적합한 1일 투여량은 0.0001-1 mg/kg, 바람직하게 0.0001-0.5　mg/kg, 더욱 바람직하게 0.002-0.5 mg/kg, 및 특히 바람직하게 0.004-0.5　mg/kg 범위이다. 단위 투여량은 1 ㎍ 미만 내지 30 mg으로 달라질 수 있지만, 전형적으로는 1회 투약당 약 0.01 내지 1 mg일 것이며, 이는 1일 또는 바람직하게는 그보다 덜 빈번하게, 예컨대, 매주 또는 6개월마다 한번씩 투여될 수 있다.
특히 바람직한 투약 요법은 1X 용량으로서 2.5 ng의 폴리펩티드인 것에 기초한다. 이와 관련하여, 바람직한 투여량은 1X-100X (즉, 2.5-250 ng) 범위이다.
유체 투여 형태는 전형적으로 폴리펩티드 및 발열성 물질 무함유 멸균 비히클을 사용하여 제조된다. 비히클 및 사용 농도에 따라 폴리펩티드는 비히클 중에 용해되거나, 또는 현탁될 수 있다. 액제 제조시, 폴리펩티드는 비히클에 용해될 수 있고, 액제는 필요할 경우, 염화나트륨 첨가에 의해 등장성인 것으로 제조될 수 있고, 적합한 멸균 바이알 또는 앰플 내로 충전되고, 밀봉되기 이전에 무균 기법을 이용하여 멸균 필터를 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 별법으로, 액제 안정성이 적절할 경우, 그의 밀봉 용기 내의 액제는 오토클레이빙에 의해 멸균 처리될 수 있다. 유리하게는, 첨가제, 예컨대, 완충화제, 가용화제, 안정화제, 보존제 또는 살박테리아제, 현탁화제 또는 유화제 및 국부 마취제가 비히클 중에 용해될 수 있다.
사용 전 적합한 비히클 중에 용해되고, 현탁되는 건식 분제는 멸균 분야의 무균 기법을 사용하여 멸균 용기 내로 미리 멸균 처리된 성분을 충전시킴으로써 제조될 수 있다. 별법으로, 성분은 멸균 분야의 무균 기법을 사용하여 적합한 멸균 용기 내로 용해될 수 있다. 이어서, 생성물을 냉동 건조시키고, 용기를 무균 방식으로 밀봉한다.
근육내, 피하, 또는 피내 주사에 적합한 비경구용 현탁제는 실질적으로 같은 방식으로 제조되되, 단, 예외적으로, 멸균 처리는 여과에 의해서는 달성될 수 없기 때문에, 멸균 성분은 멸균 비히클 중에 용해되는 대신 현탁된다. 성분은 멸균 상태로 단리될 수 있거나, 또는 별법으로, 단리 후, 예컨대, 감마선 조사에 의해 멸균 처리될 수 있다.
성분의 균일한 분포를 촉진시키기 위해서 현탁화제, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈을 조성물(들)에 포함시키는 것이 이롭다.
본 발명에 따른 투여는 미립자 캡슐화, 바이러스 전달 시스템, 또는 고압 에어로졸 충돌을 비롯한 다양한 전달 기술을 이용할 수 있다.
정의 섹션
표적화 모이어티 (TM)란 본 발명의 폴리펩티드와 표적 세포의 표면 사이의 물리적 회합이 이루어지도록 결합 부위와 기능적으로 상호작용하는 임의의 화학적 구조를 의미한다. 본 발명과 관련하여, 표적 세포는 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기이다. TM이라는 용어는 표적 세포 상의 결합 부위에 결합할 수 있는 임의의 분자 (즉, 자연적으로 발생된 분자, 또는 화학적으로/물리적으로 변형된 그의 변이체)를 포함하며, 상기 결합 부위는 수용체-매개 세포내이입로도 지칭되는 내재화 (예컨대, 엔도솜 형성)가 가능한 것이다. TM은 엔도솜 막 전위 기능을 가질 수 있으며, 이러한 경우, 별개의 TM 및 전위 도메인 성분이 본 발명의 작용제에 존재할 필요는 없다. 상기 설명 전역에 걸쳐, 특이 TM이 기술되었다. 상기 TM에 관한 언급은 단지 예시적인 것이며, 본 발명은 예시된 TM의 기본 결합 (즉, 표적화) 능력을 보유하는, 그의 모든 변이체 및 유도체를 포함한다.
본 발명에 따른 TM으로는 항체 (예컨대, 항체 단편) 및 결합 스캐폴드; 특히, 표적 세포에의 (예컨대, 특이적인) 결합 목적으로 디자인된 상업적으로 이용가능한 항체/단편 및 스캐폴드를 포함한다.
단백질 스캐폴드는, 각각이 본 발명의 TM으로서 사용될 수 있는 것인 치료학적 단일클론 항체 및 유도체, 예컨대, scFv, Fab 분자, dAb (단일-도메인 항체), 카멜리드, 디아바디 및 미니바디로 이루어진 확장 레퍼토리를 보완하는 차세대 범용 결합 골격을 나타낸다. 스캐폴드 시스템은 신규한 스캐폴드를 생성하거나, 또는 공지된 단백질 결합 도메인을 변형시킴으로써 기지의 단백질 인식 도메인을 생성하거나, 또는 변형시킨다. 상기 스캐폴드로는 하기의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
(i) 단백질 A 기반 스캐폴드 - 어피바디 (Nord, K. et al 1997 "Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain". Nat Biotechnol 15, 772-777);
(ii) 리포칼린 기반 스캐폴드 - 안티칼린 (Skerra 2008 "Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities". FEBS J. 275:2677-83);
(iii) 피브로넥틴 기반 스캐폴드 - 에드넥틴 (Dineen et al 2008 "The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumour burden in an orthotropic mouse model of pancreatic cancer". BMC Cancer 8:352);
(iv) 아비머 (Silverman et al 2005 "Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains". Nat Biotechnol 23:1556-61);
(v) 안키린 기반 스캐폴드 - 달핀 (Zahnd et al 2006 "Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins". J Biol Chem. 281:35167-75); 및
(vi) 센티린 스캐폴드 - CDR과 유사한 루프를 포함하는 Ig 도메인과 유의적인 구조적 상동성을 가지는 단백질 폴드에 기반하는 것. Ig 도메인은 인간 단백질에서 일반적인 모듈이고, 대안적 스캐폴드 단백질로서 널리 적용되어 왔다. 상기 '스캐폴드'에 관한 공개 문헌들은 각각 (그의 전문이) 본원에서 참조로 포함된다.
결합 스캐폴드는 특이 세포 표면 단백질, 수용체 또는 다른 세포 표면 에피토프, 예컨대 당 기와의 상호작용을 통해 특정 세포 유형을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 상기 변형된 스캐폴드는 본 발명의 재조합 비-세포독성 프로테아제 기반 폴리펩티드 상에로 조작될 수 있다.
본 발명의 TM은 해당 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 표적 세포에 결합한다 (바람직하게 특이적으로 결합한다). "특이적으로 결합한다"라는 용어는 바람직하게 주어진 TM이 106 M-1 이상, 바람직하게 107 M-1 이상, 더욱 바람직하게 108 M-1 이상, 및 가장 바람직하게, 109 M-1 이상의 결합 친화도 (Ka)로 표적 세포에 결합한다는 것을 의미한다. "특이적으로 결합한다"라는 용어는 또한 주어진 TM이 106 M-1 이상, 바람직하게 107 M-1 이상, 더욱 바람직하게 108 M-1 이상, 및 가장 바람직하게, 109 M-1 이상의 결합 친화도 (Ka)로 주어진 수용체, Mas-관련 G 단백질 커플링된 수용체 (예컨대, MrgprX1 또는 MrgprA1 -3 또는 MrgprC11)에 결합한다는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 TM에 대한 언급은 해당 표적 세포에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 그의 단편 및 변이체를 포함한다. 일례로, 변이체는 참조 TM (예컨대, TM을 정의하는, 본 명세서에서 제공되는 임의의 서열 번호의 것)와 80% 이상, 바람직하게, 90% 이상, 더욱 바람직하게, 95% 이상, 및 가장 바람직하게, 97% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다. 따라서, 변이체는 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예컨대, 비천연 아미노산), 또는 치환된 연결부를 포함할 수 있다. 또한, 일례로, TM과 관련하여 사용될 때, 단편이라는 용어는 참조 TM의 아미노산 잔기를 10개 이상, 바람직하게, 20개 이상, 더욱 바람직하게, 30개 이상, 및 가장 바람직하게, 40개 이상 가지는 펩티드를 의미한다. 단편이라는 용어는 또한 상기 언급된 변이체에 관한 것이다. 따라서, 일례로, 본 발명의 단편은 참조 펩티드의 (인접한) 아미노산의 상응하는 펩티드 서열에 걸쳐 80% 이상의 서열 상동성을 가지며, 10, 20, 30 또는 40개 이상의 아미노산을 가지는 펩티드 서열을 포함할 수 있다.
TM이 선택된 표적 세포에 결합하는지 여부를 확인하는 것이 일반적이다. 예를 들어, 해당 표적 세포를 나타내는 조직 또는 세포를 표지화되지 않은 과량의 TM 존재하에 표지화된 (예컨대, 삼중 수소화된) TM에 노출시키는 간단한 방사성 치환 실험이 사용될 수 있다. 상기 실험에서, 비-특이 결합과 특이 결합의 상대적인 비율을 검출할 수 있고, 이로써, TM이 표적 세포에 결합하였는지 여부를 확인할 수 있다. 임의적으로, 검정법은 하나 이상의 결합 길항제를 포함할 수 있고, 검정법은 TM 결합 손실을 관찰하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 유형의 실험에 관한 예는 문헌 [Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311, In Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press]에서 살펴볼 수 있다.
본 발명과 관련하여, 펩티드 TM에 대한 언급은 그의 펩티드 유사체를 포함하는 것으로, 상기 유사체가 상응하는 '참조' TM와 동일한 수용체에 결합하는 한, 그러하다.
본 발명의 융합 단백질 (이는 본원에서는 또한 폴리펩티드로도 지칭된다)은 클로스트리디움 신경독소의 기능적 HC 또는 HCC 도메인을 포함하지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 홀로톡신의 마지막 50개의 C 말단 아미노산을 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 클로스트리디움 신경독소 홀로톡신의 마지막 100, 150, 200, 250, 또는 300개의 C 말단 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 별법으로, HC 결합 활성은 돌연변이 유발법에 의해 무효화/감소될 수 있고 - 일례로, 편의상 BoNT/A를 참조하면, 일례로, BoNT/A로 지칭되는 편의상, 강글리오시드 결합 포켓 중 하나 또는 2개의 아미노산 잔기 돌연변이 (W1266 → L 및 Y1267 → F)의 변형으로 HC 영역은 그의 수용체 결합 기능을 상실하게 된다. 비-혈청형 A 클로스트리디움 펩티드 성분에 대해 유사한 돌연변이화가 이루어질 수 있으며, 예컨대, 돌연변이 (W1262 → L 및 Y1263 → F)를 포함하는 보툴리눔(botulinum) B 또는 보툴리눔 E (W1224 → L 및 Y1225 → F)에 기반한 구축물이 있다. 예컨대, 보툴리눔 A형 독소에서 Y1267S, 및 다른 클로스트리디움 신경독소에서 상응하는 고도로 보존되는 잔기와 같이, 활성 부위에 대한 다른 돌연변이화를 통해 HC 수용체 결합 활성은 동일하게 제거될 수 있다. 상기 돌연변이 및 다른 것에 대한 상세한 설명은 문헌 [Rummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634)] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
천연 클로스트리디움 신경독소의 HC 펩티드는 대략 400-440개의 아미노산 잔기를 포함하고, 각각 대략 25 kDa씩인 2개의 기능상 상이한 도메인, 즉, N 말단 영역 (일반적으로 HCN 펩티드 또는 도메인으로 지칭) 및 C 말단 영역 (일반적으로 HCC 펩티드 또는 도메인으로 지칭)으로 이루어진다. 또한, C 말단의 160-200개의 아미노산 잔기를 구성하는 C 말단 영역 (HCC)이 클로스트리디움 신경독소의 그의 천연 세포 수용체에의, 즉, 신경근 접합부의 신경 말단에의 결합을 담당한다는 것은 문서상으로 충분히 입증되어 있다. 따라서, 중쇄가 천연 클로스트리디움 신경독소가 결합하는 세포 표면 수용체에 결합하지 못하도록 기능성 중쇄 HC 펩티드 (또는 도메인)를 포함하지 않는 클로스트리디움 중쇄에 대한 본 명세서 전역에서의 언급은 간단하게 클로스트리디움 중쇄가 기능성 HCC 펩티드를 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 다시 말해, HCC 펩티드 영역은 부분적으로 또는 전체적으로 결실되어 있거나, 또는 다르게는 신경근 접합부의 신경 말단에 대한 그의 천연 결합능을 불활성화시키도록 (예컨대, 종래 화학적 처리 또는 단백질 분해 처리를 통해) 변형되어 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 클로스트리디움 HN 펩티드는 클로스트리디움 신경독소의 C 말단 펩티드 부분 (HCC)의 일부를 포함하지 않으며, 따라서 천연 클로스트리디움 신경독소의 HC 결합 기능은 없다. 일례로, 한 실시양태에서, C 말단이 연장된 클로스트리디움 HN 펩티드는 클로스트리디움 신경독소 중쇄의 C 말단의 40개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 60개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 80개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 100개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 120개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 140개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 150개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 160개의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 클로스트리디움 HN 펩티드는 클로스트리디움 신경독소의 전체 C 말단 펩티드 부분 (HCC)을 포함하지 않으며, 따라서 천연 클로스트리디움 신경독소의 HC 결합 기능은 없다. 일례로, 한 실시양태에서, 클로스트리디움 HN 펩티드는 클로스트리디움 신경독소 중쇄의 C 말단의 165개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 170개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 175개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 180개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 185개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 190개의 아미노산 잔기, 또는 C 말단의 195개의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 추가 일례로, 본 발명의 클로스트리디움 HN 펩티드는 하기의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 클로스트리디움 HCC 참조 서열을 포함하지 않는다:
보툴리눔 A형 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1111-L1296)
보툴리눔 B형 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1098-E1291)
보툴리눔 C형 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1112-E1291)
보툴리눔 D형 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1099-E1276)
보툴리눔 E형 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1086-K1252)
보툴리눔 F형 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1106-E1274)
보툴리눔 G형 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1106-E1297)
테타누스(Tetanus) 신경독소 - 아미노산 잔기 (Y1128-D1315).
혈청형 서브타입(sub-serotype)에 따라 약간의 변이가 존재할 수 있는 바, 상기 확인된 참조 서열은 가이드로서 간주되어야 한다.
본 발명의 프로테아제는 진핵 세포에서 세포외유출 융합 기구의 하나 이상의 단백질을 절단할 수 있는 모든 비-세포독성 프로테아제를 포함한다.
본 발명의 프로테아제는 바람직하게 박테리아 프로테아제 (또는 그의 단편)이다. 더욱 바람직하게, 박테리아 프로테아제는 클로스트리디움 속 또는 나이세리아 속/스트렙토코커스 속으로부터 선택된다 (예컨대, 클로스트리디움 L 쇄, 또는 나이세리아 IgA 프로테아제, 바람직하게, N. 고노호에아에 또는 S. 뉴모니아에로부터의 것). 비-세포독성 프로테아제의 또 다른 예로는 전갈 독액 프로테아제, 예컨대, 브라질 전갈 티티우스 세룰라투스의 독액으로부터의 것, 또는 프로테아제 안타레아제를 포함한다.
본 발명은 또한 변이체 프로테아제가 여전히 필수 프로테아제 활성을 보이는 한, 변이체 비-세포독성 프로테아제 (즉, 자연적으로 발생된 프로테아제 분자의 변이체)를 포함한다. 일례로, 변이체는 참조 프로테아제 서열과 70% 이상, 바람직하게, 80% 이상, 더욱 바람직하게, 90% 이상, 및 가장 바람직하게, 95% 이상 또는 98% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다. 따라서, 변이체라는 용어는 엔도펩티다제 활성이 증진된 (또는 감소된) 비-세포독성 프로테아제를 포함하며 - 본원에서는 BoNT/A 돌연변이체 Q161A, E54A, 및 K165L의 Kcat/Km 증가를 특별히 언급할 수 있다. 문헌 [Ahmed, S.A. (2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다. 프로테아제와 관련하여 사용될 때, 단편이라는 용어는 전형적으로 참조 프로테아제의 150개 이상, 바람직하게, 200개 이상, 더욱 바람직하게, 250개 이상, 및 가장 바람직하게, 300개 이상의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드를 의미한다. (상기 논의된) TM '단편' 성분과 같이, 본 발명의 프로테아제 '단편'은 참조 서열에 기반한 변이체 프로테아제의 단편을 포함한다.
본 발명의 프로테아제는 바람직하게 세린 또는 메탈로프로테아제 활성 (예컨대, 엔도펩티다제 활성)을 보인다. 프로테아제는 바람직하게 SNARE 단백질 (예컨대, SNAP-25, 시냅토브레빈/VAMP, 또는 신탁신)에 대해 특이적이다.
신경독소의 프로테아제 도메인, 예를 들어, 박테리아 신경독소의 프로테아제 도메인을 특별히 언급할 수 있다. 따라서, 본 발명은 자연상에 존재하는 신경독소 도메인 뿐만 아니라, 상기 자연적으로 발생된 신경독소의 재조합적으로 제조된 버전의 용도를 포함한다.
예시적인 신경독소는 클로스트리디움에 의해 생산되고, 클로스트리디움 신경독소라는 용어는 C. 테타니(C. tetani) (TeNT)에 의해, 및 C. 보툴리눔 (BoNT) 혈청형 A-G에 의해 생산된 신경독소 뿐만 아니라, C. 바라티이(C. baratii) 및 C. 부티리쿰(C. butyricum)에 의해 생산된, 밀접한 관련이 있는 BoNT-유사 신경독소를 포함한다. 상기 언급된 약어가 본 명세서 전역에 걸쳐 사용된다. 예를 들어, BoNT/A라는 명칭은 BoNT (혈청형 A)로서 신경독소의 공급원을 의미한다. 상응하는 명명법이 다른 BoNT 혈청형에도 적용된다.
BoNT는 공지된 것 중 가장 강력한 독소이며, 마우스에 대한 반치사량 (LD50) 값은 혈청형에 따라 0.5 내지 5 ng/kg 범위이다. BoNT는 위장관에서 흡수되고, 전신 순환으로의 진입 후, 콜린성 신경 말단의 시냅스전 막에 결합하고, 그의 신경 전달 물질 아세틸콜린의 방출을 막는다. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G는 시냅토브레빈/소포체 결합 막 단백질 (VAMP)을 절단하고; BoNT/C, BoNT/A 및 BoNT/E는 25 kDa의 시냅토솜 결합 단백질 (SNAP-25)을 절단하고; BoNT/C는 신탁신을 절단한다.
BoNT는 단일 이황화 결합에 의해 ~50 kDa의 경쇄 (L 쇄)에 공유적으로 연결된 ~100 kDa의 중쇄 (H 쇄)로 이루어진 ~150 kDa의 2쇄 단백질인 공통 구조를 공유한다. H 쇄는 각각 ~50 kDa인 두 도메인으로 이루어져 있다. C 말단 도메인 (HC)은 고친화성 뉴런 결합을 위해 요구되는 반면, N 말단 도메인 (HN)은 막 전위에 관여하는 것으로 제안되고 있다. L 쇄는 기질 SNARE 단백질의 절단을 담당하는 아연 의존성 메탈로프로테아제이다.
L 쇄 단편이라는 용어는, 메탈로프로테아제 활성을 보이고, 세포 세포외유출 (exocytosis)에 관여하는 소포체 및/또는 원형질 막 결합 단백질을 단백질 분해 방식으로 절단할 수 있는 것인, 신경독소의 L 쇄의 성분을 의미한다.
적합한 프로테아제 (참조) 서열의 예로는 하기를 포함한다:
보툴리눔 A형 신경독소 - 아미노산 잔기 (1-448)
보툴리눔 B형 신경독소 - 아미노산 잔기 (1-440)
보툴리눔 C형 신경독소 - 아미노산 잔기 (1-441)
보툴리눔 D형 신경독소 - 아미노산 잔기 (1-445)
보툴리눔 E형 신경독소 - 아미노산 잔기 (1-422)
보툴리눔 F형 신경독소 - 아미노산 잔기 (1-439)
보툴리눔 G형 신경독소 - 아미노산 잔기 (1-441)
테타누스 신경독소 - 아미노산 잔기 (1-457)
IgA 프로테아제 - 아미노산 잔기 (1-959)*
* 문헌 [Pohlner, J. et al. (1987). Nature 325, pp. 458-462] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다).
혈청형 서브타입에 따라 약간의 변이가 존재할 수 있는 바, 상기 확인된 참조 서열은 가이드로서 간주되어야 한다. 일례로, US 2007/0166332 (본원에서 참조로 포함된다)에는 약간 다른 클로스트리디움 서열이 예시되어 있다:
보툴리눔 A형 신경독소 - 아미노산 잔기 (M1-K448)
보툴리눔 B형 신경독소 - 아미노산 잔기 (M1-K441)
보툴리눔 C형 신경독소 - 아미노산 잔기 (M1-K449)
보툴리눔 D형 신경독소 - 아미노산 잔기 (M1-R445)
보툴리눔 E형 신경독소 - 아미노산 잔기 (M1-R422)
보툴리눔 F형 신경독소 - 아미노산 잔기 (M1-K439)
보툴리눔 G형 신경독소 - 아미노산 잔기 (M1-K446)
테타누스 신경독소 - 아미노산 잔기 (M1-A457)
경쇄를 포함하는 다양한 클로스트리디움 독소 단편이 본 발명의 측면에서 유용할 수 있되, 단, 상기 경쇄 단편은 신경 전달 물질 방출 기구의 코어 성분을 특이적으로 표적화할 수 있고, 이로써, 클로스트리디움 독소가 단백질 분해 방식으로 기질을 절단시키는 전반적인 세포 기전을 실행하는 데 참여할 수 있다. 클로스트리디움 독소의 경쇄의 길이는 대략 420-460개의 아미노산 길이이고, 효소 도메인을 포함한다. 효소 도메인의 효소적 활성을 위해 전장의 클로스트리디움 독소 경쇄가 필요한 것은 아니라는 것이 연구를 통해 밝혀졌다. 비제한적인 일례로서, BoNT/A 경쇄의 처음 8개의 아미노산은 효소적 활성에 필요한 것은 아니다. 또 다른 비제한적인 일례로서, TeNT 경쇄의 처음 8개의 아미노산은 효소적 활성에 필요한 것은 아니다. 유사하게, 경쇄의 카르복실 말단은 상기 활성에 필요한 것은 아니다. 비제한적인 일례로, BoNT/A 경쇄의 마지막 32개의 아미노산 (잔기 417-448)은 효소적 활성에 필요한 것은 아니다. 또 다른 비제한적인 일례로서, TeNT 경쇄의 마지막 31개의 아미노산 (잔기 427-457)은 효소적 활성에 필요한 것은 아니다. 따라서, 본 실시양태의 측면은 길이가 예를 들어, 350개 이상의 아미노산, 375개 이상의 아미노산, 400개 이상의 아미노산, 425개 이상의 아미노산 및 450개 이상의 아미노산 길이인 것인 효소 도메인을 포함하는 클로스트리디움 독소 경쇄를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 다른 측면은 길이가 예를 들어, 350개 이하의 아미노산, 375개 이하의 아미노산, 400개 이하의 아미노산, 425개 이하의 아미노산 및 450개 이하의 아미노산 길이인 것인 효소 도메인을 포함하는 클로스트리디움 독소 경쇄를 포함할 수 있다.
적합한 비-세포독성 프로테아제의 추가 예는 WO 2007/106115 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 상세하게 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 비-세포독성 프로테아제는 비-뉴런 SNARE 단백질, 예컨대, SNAP-23 단백질을 절단한다. 한 실시양태에서, 비-세포독성 프로테아제는 SNAP-23을 절단할 수 있는 변형된 보툴리눔 독소 L 쇄이다. 상기 변형된 L 쇄의 예는 문헌 [Chen and Barbieri, PNAS, vol. 106, no. 23, p9180-9184, 2009]에 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 비-세포독성 프로테아제는 BoNT/A, BoNT/C 또는 BoNT/E 프로테아제이고, 바람직한 SNARE 모티프는 SNAP (예컨대, SNAP 25) 모티프이다.
또 다른 실시양태에서, 비-세포독성 프로테아제는 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 또는 BoNT/G 또는 테타누스 신경독소 (TeNT) 프로테아제이고, 바람직한 SNARE 모티프는 VAMP 모티프이다.
또 다른 실시양태에서, 비-세포독성 프로테아제는 BoNT/C1 프로테아제이고, 바람직한 SNARE 모티프는 신탁신 모티프이다.
본 발명의 비-세포독성 프로테아제는 상이한 절단 부위 서열을 인식하고, 따라서, 약간 다른 절단 특이성을 가진다.
Figure 112016011481871-pct00001
추가의 일례로, 하기 인식 서열 및 절단 부위를 언급할 수 있다:
Figure 112016011481871-pct00002
Figure 112016011481871-pct00003
Figure 112016011481871-pct00004
본 발명의 폴리펩티드, 특히, 그의 프로테아제 성분은 PEG화될 수 있으며 - 이는 안정성을 증가시키는 데, 예를 들어, 프로테아제 성분의 작용 지속 기간을 연장시키는 데 도움을 줄 수 있다. PEG화는 프로테아제가 BoNT/A, B 또는 C1 프로테아제를 포함하는 경우에 특히 바람직하다. PEG화는 바람직하게 PEG를 프로테아제 성분의 N-말단에 부가하는 것을 포함한다. 일례로, 프로테아제의 N-말단은, 동일하거나 또는 상이할 수 있는 하나 이상의 아미노산 (예컨대, 시스테인) 잔기로 연장될 수 있다. 상기 아미노산 잔기 중 하나 이상의 것은 그에 부착된 (예컨대, 공유적으로 부착된) 그 자체의 PEG 분자를 가질 수 있다. 이러한 기술의 예는 WO2007/104567 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
전위 도메인은 프로테아제 활성의 기능적 발현이 표적 세포의 시토졸 내에서 발생할 수 있도록 프로테아제를 표적 세포 내로 전위시킬 수 있는 분자이다. 임의의 분자 (예컨대, 단백질 또는 펩티드)가 본 발명의 필수 전위 기능을 가지는지 여부는 다수의 종래 검정법 중 어느 하나에 의해 확인될 수 있다.
예를 들어, 문헌 [Shone C. (1987)]에는 시험 분자와 함께 시험된 리포솜을 이용하는 시험관내 검정법이 기술되어 있다. 필수 전위 기능의 존재 여부는 쉽게 모니터링될 수 있는 K+ 및/또는 표지화된 NAD의 리포솜으로부터의 방출에 의해 확인될 수 있다 ([Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180] 참조).
추가의 예는 평면 인지질 이중막을 이용하는 간단한 시험관내 검정법이 기술되어 있는 문헌 [Blaustein R. (1987)]에 제공되어 있다. 막은 시험 분자와 함께 시험되고, 필수 전위 기능은 상기 막 간의 전도도 증가에 의해 확인된다 ([see Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120] 참조).
본 발명에서 사용하는 데 적합한, 막 융합 평가와 이로써 전위 도메인의 확인을 가능하게 하는 추가의 방법은 문헌 [Methods in Enzymology Vol 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993]에 제공되어 있다.
본 발명은 또한 변이체 도메인이 여전히 필수 전위 활성을 보이는 한, 변이체 전위 도메인를 포함한다. 일례로, 변이체는 참조 전위 도메인과 70% 이상, 바람직하게, 80% 이상, 더욱 바람직하게, 90% 이상, 및 가장 바람직하게, 95% 이상 또는 98% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다. 전위 도메인와 관련하여 사용될 때, 단편이라는 용어는 참조 전위 도메인의 20개 이상, 바람직하게, 40개 이상, 더욱 바람직하게, 80개 이상, 및 가장 바람직하게, 100개 이상의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드를 의미한다. 클로스트리디움 전위 도메인의 경우, 단편은 바람직하게 참조 전위 도메인 (예컨대, HN 도메인)의 100개 이상, 바람직하게, 150개 이상, 더욱 바람직하게, 200개 이상, 및 가장 바람직하게, 250개 이상의 아미노산 잔기를 가진다. (상기 논의된) TM '단편' 성분과 같이, 본 발명의 전위 '단편'은 참조 서열에 기반한 변이체 전위 도메인의 단편을 포함한다.
전위 도메인은 바람직하게 낮은 pH 조건하에서 지질막에 이온 투과성 포어를 형성할 수 있다. 바람직하게, 엔도솜 막 내에 포어를 형성할 수 있는 단백질 분자 중 일부분만을 사용하는 것으로 밝혀졌다.
전위 도메인은 미생물 단백질 공급원으로부터, 특히, 박테리아 또는 바이러스 단백질 공급원으로부터 수득될 수 있다. 그러므로, 한 실시양태에서, 전위 도메인은 효소, 예컨대, 박테리아 독소 또는 바이러스 단백질의 전위 도메인이다.
박테리아 독소 분자의 특정 도메인이 상기 포어를 형성할 수 있다는 것은 문서상으로 충분히 입증되어 있다. 바이러스에 의해 발현된 막 융합 단백질의 특정 전위 도메인이 상기 포어를 형성할 수 있다는 것 또한 공지되어 있다. 상기 도메인은 본 발명에서 사용될 수 있다.
전위 도메인은 클로스트리디움 기원의 것, 예컨대, HN 도메인 (또는 그의 기능성 성분)일 수 있다. HN이란 대략적으로 H 쇄의 아미노 말단 절반부에 등가인 클로스트리디움 신경독소의 H 쇄의 일부분 또는 단편, 또는 무손상 H 쇄에서 상기 단편에 상응하는 도메인을 의미한다. 이와 관련하여, HC 세포 결합 기능을 제거하는 것이 바람직할 경우, (뉴클레아제에 의해, 또는 프로테아제 처리에 의해 DNA 합성 수준에서, 또는 합성 후 수준에서) HC 또는 HCC 아미노산 서열을 결실시킴으로써 수행될 수 있다. 별법으로, HC 기능은 화학적 또는 생물학적 처리에 의해 불활성화될 수 있다.
적합한 (참조) 전위 도메인의 예로는 하기를 포함한다:
보툴리눔 A형 신경독소 - 아미노산 잔기 (449-871)
보툴리눔 B형 신경독소 - 아미노산 잔기 (441-858)
보툴리눔 C형 신경독소 - 아미노산 잔기 (442-866)
보툴리눔 D형 신경독소 - 아미노산 잔기 (446-862)
보툴리눔 E형 신경독소 - 아미노산 잔기 (423-845)
보툴리눔 F형 신경독소 - 아미노산 잔기 (440-864)
보툴리눔 G형 신경독소 - 아미노산 잔기 (442-863)
테타누스 신경독소 - 아미노산 잔기 (458-879)
혈청형 서브타입에 따라 약간의 변이가 존재할 수 있는 바, 상기 확인된 참조 서열은 가이드로서 간주되어야 한다. 일례로, US 2007/0166332 (본원에서 참조로 포함된다)에는 약간 다른 클로스트리디움 서열이 예시되어 있다:
보툴리눔 A형 신경독소 - 아미노산 잔기 (A449-K871)
보툴리눔 B형 신경독소 - 아미노산 잔기 (A442-S858)
보툴리눔 C형 신경독소 - 아미노산 잔기 (T450-N866)
보툴리눔 D형 신경독소 - 아미노산 잔기 (D446-N862)
보툴리눔 E형 신경독소 - 아미노산 잔기 (K423-K845)
보툴리눔 F형 신경독소 - 아미노산 잔기 (A440-K864)
보툴리눔 G형 신경독소 - 아미노산 잔기 (S447-S863)
테타누스 신경독소 - 아미노산 잔기 (S458-V879)
적합한 전위 도메인의 추가의 일례는 WO 2007/106115 (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 상세하게 기술되어 있다.
본 발명과 관련하여, 전위 도메인을 포함하는 다양한 클로스트리디움 독소 HN 영역이 본 발명의 측면에서 유용할 수 있되, 단, 상기 활성 단편은 세포내 소포체로부터 표적 세포의 세포질 내로의 비-세포독성 프로테아제 (예컨대, 클로스트리디움 L 쇄)의 방출을 촉진시킬 수 있으며, 이로써, 클로스트리디움 독소가 단백질 분해 방식으로 기질을 절단시키는 전반적인 세포 기전을 실행하는 데 참여할 수 있다. 클로스트리디움 독소의 중쇄로부터의 HN 영역의 길이는 대략 410-430개의 아미노산 길이이고, 전위 도메인을 포함한다. 전위 도메인의 전위 활성을 위해 클로스트리디움 독소 중쇄로부터의 전장의 HN 영역이 필요한 것은 아니라는 것이 연구를 통해 밝혀졌다. 따라서, 본 실시양태의 측면은 길이가, 예를 들어, 350개 이상의 아미노산, 375개 이상의 아미노산, 400개 이상의 아미노산 및 425개 이상의 아미노산 길이인 것인 전위 도메인을 포함하는 클로스트리디움 독소 HN 영역을 포함할 수 있다. 본 실시양태의 다른 측면은 길이가 예를 들어, 350개 이하의 아미노산, 375개 이하의 아미노산, 400개 이하의 아미노산 및 425개 이하의 아미노산 길이인 것인 전위 도메인을 포함하는 클로스트리디움 독소 HN 영역을 포함할 수 있다.
클로스트리디움 보툴리눔 및 C. 테타니에서의 독소 생산의 유전적 기초에 관한 추가의 상세한 설명을 위해, 본 발명자들은 문헌 [Henderson et al (1997) in The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press]을 참조한다.
HN이라는 용어는 자연적으로 발생된 신경독소 HN 일부분, 및 변형된 HN 일부분이 여전히 상기 언급된 전위 기능을 보이는 한, 자연상에 존재하지 않는 아미노산 서열 및/또는 합성 아미노산 잔기를 가지는 변형된 HN 일부분을 포함한다.
별법으로, 전위 도메인은 비-클로스트리디움 기원의 것일 수 있다. 비-클로스트리디움 (참조) 전위 도메인 기원의 예로는 디프테리아 독소의 전위 도메인 ([O=Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206]; [Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532]; 및 [London, E. (1992) Biochem . Biophys . Acta ., 1112, pp.25-51]), 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A형의 전위 도메인 [Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], 탄저균 독소의 전위 도메인 [Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442], 전위 기능이 있는 다양한 융합성 또는 소수성 펩티드 ([Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924]; 및 [Wagner et al (1992) PNAS , 89, pp.7934-7938]), 및 양친매성 펩티드 [Murata et al (1992) Biochem ., 31, pp.1986- 1992]를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전위 도메인은 자연적으로 발생된 단백질 중에 존재하는 전위 도메인을 반영할 수 있거나, 또는 변이가 전위 도메인의 전위 능력을 파괴시키지 않는 한, 아미노산 변이를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 데 적합한 바이러스 (참조) 전위 도메인의 특정 예로는 바이러스에 의해 발현된 막 융합 단백질의 특정 전위 도메인을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wagner et al. (1992)] 및 [Murata et al. (1992)]에는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 N 말단 영역으로부터 유래된 다수의 융합성 및 양친매성 펩티드의 전위 (즉, 막 융합 및 소포 형성) 기능이 기술되어 있다. 원하는 전위 활성이 있는 것으로 알려져 있는, 바이러스에 의해 발현된 다른 막 융합 단백질은 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest Virus: SFV)의 융합성 펩티드의 전위 도메인, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 당단백질 G의 전위 도메인, SER 바이러스 F 단백질의 전위 도메인, 및 포말 바이러스 외피 당단백질의 전위 도메인이다. 바이러스에 의해 코딩된 아스파이크(Aspike) 단백질, 예를 들어, SFV의 E1 단백질, 및 VSV의 G 단백질의 G 단백질은 본 발명과 관련하여 특별히 적용된다.
(하기) 표에 열거된 (참조) 전위 도메인의 용도는 그의 서열 변이체의 용도를 포함한다. 변이체는 하나 이상의 보존적 핵산 치환 및/또는 핵산 결실 또는 삽입을 포함할 수 있되, 단, 변이체는 필수 전위 기능을 가진다. 변이체가 필수 전위 기능을 가지는 한, 변이체는 또한 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 아미노산 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다.
Figure 112016011481871-pct00005
본 발명의 폴리펩티드는 전위 촉진 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 상기 도메인은 표적 세포의 시토졸 내로의 비-세포독성 프로테아제의 전달을 촉진시키고, 이는 예를 들어, WO 08/008803 및 WO 08/008805 (상기 문헌은 각각 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
일례로, 적합한 전위 촉진 도메인은 외피 바이러스 융합성 펩티드 도메인을 포함하고, 예를 들어, 적합한 융합성 펩티드 도메인은 인플루엔자 바이러스 융합성 펩티드 도메인 (예컨대, 23개의 아미노산으로 이루어진 인플루엔자 A 바이러스 융합성 펩티드 도메인), 알파바이러스 융합성 펩티드 도메인 (예컨대, 26개의 아미노산으로 이루어진 셈리키 삼림열 바이러스 융합성 펩티드 도메인), 베시클로바이러스 융합성 펩티드 도메인 (예컨대, 21개의 아미노산으로 이루어진 수포성 구내염 바이러스 융합성 펩티드 도메인), 레스피로바이러스 융합성 펩티드 도메인 (예컨대, 25개의 아미노산으로 이루어진 센다이 바이러스 융합성 펩티드 도메인), 모르빌리바이러스 융합성 펩티드 도메인 (예컨대, 25개의 아미노산으로 이루어진 개 홍역 바이러스 융합성 펩티드 도메인), 아불라바이러스 융합성 펩티드 도메인 (예컨대, 25개의 아미노산으로 이루어진 뉴캐슬병 바이러스 융합성 펩티드 도메인), 헤니파바이러스 융합성 펩티드 도메인 (예컨대, 25개의 아미노산으로 이루어진 헨드라 바이러스 융합성 펩티드 도메인), 메타뉴모바이러스 융합성 펩티드 도메인 (예컨대, 25개의 아미노산으로 이루어진 인간 메타뉴모바이러스 융합성 펩티드 도메인) 또는 스푸마바이러스 융합성 펩티드 도메인 예컨대, 원숭이 포말 바이러스 융합성 펩티드 도메인; 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다.
추가 일례로, 전위 촉진 도메인은 클로스트리디움 독소 HCN 도메인, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 더욱 상세하게, 클로스트리디움 독소 HCN 전위 촉진 도메인의 길이는 200개 이상의 아미노산, 225개 이상의 아미노산, 250개 이상의 아미노산, 275개 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 이와 관련하여, 클로스트리디움 독소 HCN 전위 촉진 도메인의 길이는 바람직하게 200개 이하의 아미노산, 225개 이하의 아미노산, 250개 이하의 아미노산, 또는 275개 이하의 아미노산 길이다. 구체적인 (참조) 예로는 하기를 포함한다:
보툴리눔 A형 신경독소 - 아미노산 잔기 (872-1110)
보툴리눔 B형 신경독소 - 아미노산 잔기 (859-1097)
보툴리눔 C형 신경독소 - 아미노산 잔기 (867-1111)
보툴리눔 D형 신경독소 - 아미노산 잔기 (863-1098)
보툴리눔 E형 신경독소 - 아미노산 잔기 (846-1085)
보툴리눔 F형 신경독소 - 아미노산 잔기 (865-1105)
보툴리눔 G형 신경독소 - 아미노산 잔기 (864-1105)
테타누스 신경독소 - 아미노산 잔기 (880-1127)
상기 서열 위치는 혈청형/서브타입에 따라 약간 달라질 수 있고, 적합한 (참조) 클로스트리디움 독소 HCN 도메인의 추가 예로는 하기를 포함한다:
보툴리눔 A형 신경독소 - 아미노산 잔기 (874-1110)
보툴리눔 B형 신경독소 - 아미노산 잔기 (861-1097)
보툴리눔 C형 신경독소 - 아미노산 잔기 (869-1111)
보툴리눔 D형 신경독소 - 아미노산 잔기 (865-1098)
보툴리눔 E형 신경독소 - 아미노산 잔기 (848-1085)
보툴리눔 F형 신경독소 - 아미노산 잔기 (867-1105)
보툴리눔 G형 신경독소 - 아미노산 잔기 (866-1105)
테타누스 신경독소 - 아미노산 잔기 (882-1127)
상기 기술된 촉진 도메인 중 임의의 것은 본 발명에서 사용하는 데 적합한, 앞서 기술된 전위 도메인 펩티드 중 임의의 것과 조합될 수 있다. 따라서, 일례로, 비-클로스트리디움 촉진 도메인은 비-클로스트리디움 전위 도메인 펩티드과, 또는 클로스트리디움 전위 도메인 펩티드와 조합될 수 있다. 별법으로, 클로스트리디움 독소 HCN 전위 촉진 도메인은 비-클로스트리디움 전위 도메인 펩티드와 조합될 수 있다. 별법으로, 클로스트리디움 독소 HCN 촉진 도메인은 클로스트리디움 전위 도메인 펩티드와 조합될 수 있으며, 그의 예로는 하기를 포함한다:
보툴리눔 A형 신경독소 - 아미노산 잔기 (449-1110)
보툴리눔 B형 신경독소 - 아미노산 잔기 (442-1097)
보툴리눔 C형 신경독소 - 아미노산 잔기 (450-1111)
보툴리눔 D형 신경독소 - 아미노산 잔기 (446-1098)
보툴리눔 E형 신경독소 - 아미노산 잔기 (423-1085)
보툴리눔 F형 신경독소 - 아미노산 잔기 (440-1105)
보툴리눔 G형 신경독소 - 아미노산 잔기 (447-1105)
테타누스 신경독소 - 아미노산 잔기 (458-1127)
서열 상동성
동일성(%)을 측정하는 데 다양한 서열 정렬 방법 중 임의의 것이 사용될 수 있으며, 이는 제한 없이, 전역 방법, 국부 방법 및 하이브리드 방법, 예컨대, 세그먼트 접근 방법을 포함한다. 동일성(%)을 측정하는 프로토콜은 통상의 기술자의 범주 내에 포함되어 있는 통상적인 방법이다. 전역 방법은 분자 시작점에서부터 종점까지 서열을 정렬하고, 개별 잔기 쌍의 점수를 합산함으로써, 및 갭 패널티를 부과함으로써 최고 정렬을 측정한다. 비제한적인 방법으로 예컨대, CLUSTAL W (예컨대, 문헌 [Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)] 참조); 및 반복적 개량법 (예컨대, 문헌 [Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)] 참조)을 포함한다. 국부 방법은 입력 서열 모두가 공유하는 하나 이상의 보존 모티프를 확인함으로써 서열을 정렬한다. 비제한적인 방법으로 예컨대, 맥치-박스(Match-box) (예컨대, 문헌 [Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)] 참조); 깁스 샘플링(Gibbs sampling) (예컨대, 문헌 [C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)] 참조); 얼라인-M(Align-M) (예컨대, 문헌 [Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)] 참조)를 포함한다.
따라서, 서열 동일성(%)은 종래 방법에 의해 측정된다. 예를 들어, 문헌 [Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986] 및 [Henikoff and Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915-19, 1992]를 참조할 수 있다. 간략하면, 하기 제시된 문헌 [Henikoff and Henikoff (상기와 같은 문헌)]의 갭 개방 패널티 = 10, 갭 연장 패널티 = 1, 및 "블로섬 62(blosum 62)" 점수화 매트릭스를 사용하여 (아미노산은 표준 1 문자 코드로 표시되어 있다) 정렬 점수가 최적화되도록 두 아미노산 서열을 정렬한다.
서열 동일성을 측정하기 위한 정렬 점수
Figure 112016011481871-pct00006
이어서, 동일성(%)은 하기와 같이 계산된다:
Figure 112016011481871-pct00007
실질적으로 상동성인 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 변이는 바람직하게 부차적 성질의 것이며, 즉, 보존적 아미노산 치환 (하기 참조), 및 폴리펩티드의 폴딩 또는 활성에는 유의적인 영향을 미치지 않는 다른 치환; 작은 결실, 전형적으로 1 내지 약 30개의 아미노산의 것; 및 작은 아미노 또는 카르복실 말단 연장, 예컨대, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 최대 약 20-25개의 잔기로 이루어진 소형 링커 펩티드, 또는 친화성 태그이다.
보존적 아미노산 치환
염기성: 아르기닌
리신
히스티딘
산성: 글루탐산
아스파르트산
극성: 글루타민
아스파라긴
소수성: 류신
이소류신
발린
방향족: 페닐알라닌
트립토판
티로신
소형: 글리신
알라닌
세린
트레오닌
메티오닌
20종의 표준 아미노산 이외에도, 비-표준 아미노산 (예컨대, 4-히드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린 및 α-메틸 세린)이 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 대신으로 치환될 수 있다. 제한된 개수의 비-보존적 아미노산, 유전자 코드에 의해 코딩되지 않는 아미노산, 및 비천연 아미노산이 클로스트리디움 폴리펩티드 아미노산 잔기 대신으로 치환될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 비-자연적으로 발생된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
비-자연적으로 발생된 아미노산으로는 제한 없이, 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노-프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시-프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸-트레오닌, 히드록시-에틸시스테인, 히드록시에틸호모-시스테인, 니트로-글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, tert-류신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐-알라닌, 4-아자페닐-알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다. 비-자연적으로 발생된 아미노산 잔기를 단백질로 도입시키는 수개의 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를 이용하여 넌센스 돌연변이를 억제시키는 시험관내 시스템이 사용될 수 있다. 아미노산을 합성하고, tRNA를 아미노아실화시키는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 넌센스 돌연변이를 함유하는 플라스미드의 전사 및 번역은 E. 콜라이 S30 추출물 및 상업적으로 이용가능한 효소 및 다른 시약을 포함하는 무세포 시스템 중에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예를 들어, 문헌 [Robertson et al., J. Am. Chem . Soc. 113:2722, 1991]; [Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991]; [Chung et al., Science 259:806-9, 1993]; 및 [Chung et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 90:10145-9, 1993]을 참조할 수 있다. 제2 방법에서 번역은 돌연변이화된 mRNA 및 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA의 미세주입에 의해 제노푸스 난모 세포에서 수행된다 (Turcatti et al., J. Biol . Chem. 271:19991-8, 1996). 제3 방법 내에서, E. 콜라이 세포는 치환되는 천연 아미노산 (예컨대, 페닐알라닌)의 부재하에, 및 원하는 비-자연적으로 발생된 아미노산(들) (예컨대, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재하에서 배양된다. 비-자연적으로 발생된 아미노산은 그의 천연 대응물 대신으로 폴리펩티드 내로 도입된다. 문헌 [Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994]를 참조할 수 있다. 자연적으로 발생된 아미노산 잔기는 시험관내 화학적 변형에 의해 비-자연적으로 발생된 종으로 전환될 수 있다. 화학적 변형은 치환 범위를 추가로 확장시키기 위해 부위 지정 돌연변이유발법과 조합될 수 있다 (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).
제한된 개수의 비-보존적 아미노산, 유전자 코드에 의해 코딩되지 않는 아미노산, 비-자연적으로 발생된 아미노산, 및 비천연 아미노산이 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 대신으로 치환될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 중의 필수 아미노산은 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법, 예컨대, 부위 지정 돌연변이유발법 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발법에 따라 확인될 수 있다 (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). 추정의 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께, 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화와 같은 기법에 의해 측정되는, 구조의 물리적 분석에 의해 생물학적 상호작용 부위 또한 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [de Vos et al., Science 255:306-12, 1992]; [Smith et al., J. Mol . Biol . 224:899-904, 1992]; [Wlodaver et al., FEBS Lett . 309:59-64, 1992]를 참조할 수 있다. 필수 아미노산의 정체는 또한 본 발명의 폴리펩티드의 관련 성분 (예컨대, 전위 또는 프로테아제 성분)과의 상동성 분석으로부터 추정될 수 있다.
다중의 아미노산 치환이 이루어질 수 있으며, 이는 공지된 돌연변이유발법 및 스크리닝 방법, 예컨대, 문헌 [Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)] 또는 [Bowie and Sauer (Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:2152-6, 1989)]에 의해 개신된 방법을 사용하여 시험될 수 있다. 간략하면, 상기 저자는 폴리펩티드 중 2개 이상의 위치를 동시에 무작위 배정하고, 기능적 폴리펩티드에 대해 선별한 후, 돌연변이화된 폴리펩티드의 서열을 분석하여 각 위치에서의 허용가능한 치환의 스펙트럼을 측정하는 방법을 개시하였다. 사용될 수 있는 다른 방법으로는 파지 디스플레이 (예컨대, [Lowman et al., Biochem . 30:10832-7, 1991]; 래드너(Ladner) 등의 미국 특허 번호 5,223,409; 휴즈(Huse)의 WIPO 공보 WO 92/06204) 및 영역 지정 돌연변이유발법 ([Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986]; [Ner et al., DNA 7:127, 1988])을 포함한다.
다중의 아미노산 치환이 이루어질 수 있으며, 이는 공지된 돌연변이유발법 및 스크리닝 방법, 예컨대, 문헌 [Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)] 또는 [Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)]에 의해 개시된 방법을 사용하여 시험될 수 있다. 간략하면, 상기 저자는 폴리펩티드 중 2개 이상의 위치를 동시에 무작위 배정하고, 기능적 폴리펩티드에 대해 선별한 후, 돌연변이화된 폴리펩티드의 서열을 분석하여 각 위치에서의 허용가능한 치환의 스펙트럼을 측정하는 방법을 개시하였다. 사용될 수 있는 다른 방법으로는 파지 디스플레이 (예컨대, [Lowman et al., Biochem . 30:10832-7, 1991]; 래드너 등의 미국 특허 번호 5,223,409; 휴즈의 WIPO 공보 WO 92/06204) 및 영역 지정 돌연변이유발법 ([Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986]; [Ner et al., DNA 7:127, 1988])을 포함한다.
실시예
가려움증을 앓는 환자에게 투여하여 가려움증을 억제 또는 치료하는 방법을 제공하기 위한 폴리펩티드를 제조하였다. 본 발명에서 정의된 바와 같이, 제조된 폴리펩티드의 표적화 모이어티 (TM) 성분은 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상에 존재하는 G-단백질 커플링된 수용체에 결합한다. 그 후에, 전위 성분은 폴리펩티드의 비-세포독성 프로테아제 성분을 수송시키는 결과를 가져오며, 일단 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 내부로 수송되고 나면, 그로부터의 신경 전달 물질 분비를 억제시킨다. 따라서, 폴리펩티드는 신경 전달 물질 수준을 감소시키고, 가려움증을 억제 또는 치료할 수 있다.
실시예 1
35세의 여성 유방암 환자는 그녀의 악성 종양 치료를 위한 약물 반응에 기인한 심신을 쇠약하게 만드는 만성 가려움증을 앓았다. 치료는 0.025 mg/kg의, BAM8 -22 리간드를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 피하로 주사 (6개월의 기간 동안에 걸쳐 매주 주사)함으로써 이루어졌고, 이를 통해 가려움감은 감소되고, 건강은 현저히 호전되었다. 환자는 가려움증이 효과적으로 경감되었다고 보고하였다.
실시예 2
60세의 남성 환자는 만성 가려움증을 보고하였고, 신장 질환에 기인하는 중증 사례를 보였다. 0.07 mg/kg의, SLIGRL-NH2 펩티드를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드로 이루어진 비경구용 현탁제를 복강경을 통한 십이지장 주사 (6개월마다 주사하는 요법)에 의해 투여하였다. 치료 후 처음 1개월 이내에 가려움증 감소를 비롯한 긍정적인 결과가 보고되었다.
실시예 3
건선의 가족력이 있는 37세의 남성 환자는 그의 신체적 안녕과 삶의 질에 유의적인 영향을 미치는 만성 가려움증을 앓았다. γ2-멜라닌 세포 자극 호르몬 (γ2-MSH) 펩티드를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 0.09 mg/kg의 1주 투여량으로 정맥내로 투여하였다. 건성의 중증도는 감소되었고, 전 치료 기간 동안 환자에 의해 보고된 추가의 가려움감은 없었다.
실시예 4
중증 만성 가려움증을 앓는 45세의 HIV 환자는 최근, 흔히 극심한 가려움증을 포함하는 증상이 있는 질환인 대상 포진 진단을 받았다. 가차없는 피부 긁음으로 여러날 동안 잠을 이루지 못한 후, 그녀는 클로로퀸 (CQ)을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드 0.05 mg/kg을 매달 정맥내로 주사맞는 처방을 받았다. 치료 3개월 후 환자는 회복률은 개선되고, 추가의 가려움감은 없다고 보고하였다.
실시예 5
아토피성 습진을 앓는 6세의 여성 환자는 0.1 mg/kg의, 히스타민 HT1을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 캡슐화된 제제를 매달 경구적으로 투약받는 처방을 받았다. 환자는 치료 후 그녀의 상태가 호전되었으며, 그녀 무릎 뒤쪽 피부의 빨간 부분은 사라졌다고 보고하였다.
실시예 6
쇼그렌 증후군(Jorgen's syndrome)을 앓는 17세의 남성은 그의 귀에 소양증, 및 손발에 피부 발진이 있다고 보고하였다. 임상의는 0.001 mg/kg의, 세로토닌을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 처방하였다 (매 8주마다 국부 복강경 주사). 두달 후, 환자는 불쾌감이 유의적으로 감소되었다고 보고하였다.
실시예 7
18세의 여성 환자는 아프리카에서 휴가를 보낸 이후에 구진 두드러기 진단을 받았다. 그녀는 노출 부위, 특히, 하퇴 뿐만 아니라, 팔, 볼 및 허리라인 상의 많은 병변으로 임상의에게 진찰을 받았다. 구진 및 염증 후 흉터가 눈에 띄었다. 진단 이후, 환자는 더욱 열악한 전반적인 삶의 질을 경험하였다. 환자는 그녀의 가려움증을 위해 0.07 mg/kg의, NPFF/Y-G 또는 RF/Y-아미드로 종결되는 신경펩티드를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 매달 주사맞는 치료를 받았다. 6개월 간의 치료 프로그램 동안, 환자는 어떤 추가의 가려움감도 보고하지 않았다.
실시예 8
피부 B-세포 림프종을 앓는 59세의 남성 환자에서는 이어서 신체의 대략 80%에 걸쳐 일어난 중증 가려움증과 함께 빨간 반점 및 피부 건조증이 발생하였다. 환자의 의사는 매 3개월마다 0.1 mg/kg의, 캡사이신을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 복강경을 통한 십이지장 주사에 의해 투여받도록 처방하였다. 1회 투약 치료 후, 환자는 어떤 추가의 가려움증도 보고하지 않았다.
실시예 9
임신성 다형 발진 (PEP)을 앓는 34세의 여성 환자는 그녀의 하복부, 및 사지 상에 피부의 큰 염증 부위 및 부스럼을 동반한 발진 형태의 중증 가려움증을 보였다. 코르티스타틴을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 2주 동안에 걸쳐 느린 확산을 통해 패치로부터 전달하는 접착 패치를 환자 피부 표면상에 투여함으로써 그녀를 치료하였다. 최대 12주째까지 경피용 패치를 교체해 주었고, 그 종료시 가려움감은 사라진 것으로 보고되었다.
동물 모델 실시예
본원에 기술된 가려움증 유발 아토피성 피부염(AD)을 앓는 마우스 모델을 사용함으로써 가려움증 치료법으로서 본 발명의 폴리펩티드를 시험하였다. 하기 예시되는 바와 같이 BALB/c 및 C57BL/6 마우스 계통은 동등하게 적합하였다.
실시예 10
BALB/c 마우스 모델에서 오브알부민을 이용하여 테이프-박리 피부의 반복된 피부 (epicutaneous, EC) 감작화에 의해 가려움증을 유도하였다. 마우스의 등쪽 피부를 면도시키고, 3M 테이프를 6회에 걸쳐 테이프 박리를 함으로써 아토피성 피부염 (AD)을 앓는 환자에서 피부 긁음에 의해 가해되는 피부 손상을 모방하였다. 100 ㎕ 생리 식염수 중 100 ㎍의 OVA를 1 x 1 cm 멸균 거즈 패치 위에 놓고, 이를 투명한 생체 밀봉 드레싱을 이용하여 피부에 고정시켰다. 이로써 핥음으로 인한 항원 접근은 쉽게 일어나지 못했다. 각 마우스는 서로 2주간의 간격을 두고 총 3회에 걸쳐 1주 동안 같은 부위에서 패치에 노출되었다. EC 감작화된 마우스에서는 긁는 행동 증가가 발생하였고, 그의 피부에서는 표피 및 진피의 비후화를 특징으로 하는 병변이 발생하였다.
본 발명의 폴리펩티드를 1 mg/ml의 농도로 1 h의 간격을 두고 목 뒤쪽으로 진피내로 (i.d) 투여하였다. PBS 주사를 대조군으로서 사용하였다.
'가려움증'은 치료 이후와의 비교로서, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 치료하기 전 '한차례'의 긁음이 일어난 횟수를 계수함으로써 측정하였다. 한차례의 긁음이란, 뒷발을 이용하여 주사 부위 (즉, 목 뒤쪽) 주변부로 3회 이상 개별적으로 빠르게 긁는 움직임으로서 정의된다. 결과는 본 발명의 폴리펩티드를 이용한 치료 이후에 긁는 현상은 현저히 감소된 것으로 나타났다.
실시예 11
BABL/c 마우스에 재조합 진드기 알레르겐 Der p8을 EC 적용하였고, 마우스는 표피 증식 및 해면화를 동반한 피부염 특징을 보였다. 본 발명의 폴리펩티드를 상기와 같이 투여하였다. 본 발명의 폴리펩티드를 이용한 치료 이후에 긁는 현상이 유의적으로 감소된 것이 관찰되었다는 점에서 본 결과는 OVA로 EC 감작화된 모델에서 관찰된 것과 유사하였다.
실시예 12
AD 증상을 악화시키고, 피부에서 병변을 유발하는 것으로 알려져 있는 S. 아우레우스(S. aureus) 감염에 BABL/c 마우스를 노출시켰다. 본 발명의 폴리펩티드를 투여한 결과, 대조군 마우스와 비교하였을 때, 본 발명의 폴리펩티드로 처리된 대상체의 긁음 수준은 현저히 감소된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 가려움증 치료에서의 본 발명의 폴리펩티드의 유용성을 입증한다.
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terminator <400> 87 Asn Pro Phe Tyr Gly 1 5

Claims (12)

  1. (i) 프로테아제가 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 중의 SNARE 단백질을 절단할 수 있는 것인, 비-세포독성 프로테아제;
    (ii) 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상의 Mas-관련 G 단백질-커플링된 수용체 (Mrgpr)에 결합할 수 있는 표적화 모이어티 (TM)로서, Mrgpr은 세포내이입을 통해 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 내의 엔도솜 내로 혼입될 수 있고, 여기서 상기 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기는 상기 SNARE 단백질을 발현하는 것인 표적화 모이어티 (TM); 및
    (iii) 프로테아제를 엔도솜 내부로부터 엔도솜 막을 통과하여 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 시토졸 내로 전위시킬 수 있는 전위 도메인을 포함하는 폴리펩티드이되,
    단, 폴리펩티드는 자연적으로 발생된 클로스트리디움(clostridial) 신경독소 (홀로톡신) 분자가 아니고,
    여기서 TM이 소 부신 수질 (BAM) 펩티드, 멜라닌 세포 자극 호르몬 펩티드 (MSH), Y-G 또는 Y-아미드로 종결되는 신경펩티드, 클로로퀸 (CQ), SLIGRL-NH2를 포함하는 펩티드, 히스타민, 세로토닌, 캡사이신, 코르티스타틴, 또는 그의 절두 생성물(truncation) 또는 펩티드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    가려움증 억제 또는 치료에서의 사용을 위한 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, TM이 BAM8-22, γ2-MSH, SLIGRL, NPAF, NPFF, 클로로퀸 (CQ), 히스타민, 또는 세로토닌, 캡사이신, 코르티스타틴, 또는 그의 절두 생성물 또는 펩티드 유사체를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 가려움증 억제 또는 치료에서의 사용을 위한 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, TM이 MrgprX1 수용체에 결합하는 것인, 가려움증 억제 또는 치료에서의 사용을 위한 폴리펩티드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, TM이 BAM8-22 펩티드, 또는 그의 절두 생성물 또는 펩티드 유사체인 것인, 가려움증 억제 또는 치료에서의 사용을 위한 폴리펩티드.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비-세포독성 프로테아제가 클로스트리디움 신경독소 L 쇄 또는 IgA 프로테아제를 포함하는 것인, 가려움증 억제 또는 치료에서의 사용을 위한 폴리펩티드.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전위 도메인이 클로스트리디움 신경독소 전위 도메인을 포함하는 것인, 가려움증 억제 또는 치료에서의 사용을 위한 폴리펩티드.
  7. 가려움증 억제 또는 치료에서 사용하기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
  8. 유효량의 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는, 환자에서 가려움증을 억제 또는 치료하기 위한 조성물.
  9. (i) 프로테아제가 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 중의 SNARE 단백질을 절단할 수 있는 것인, 비-세포독성 프로테아제;
    (ii) 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 상의 Mas-관련 G 단백질-커플링된 수용체 (Mrgpr)에 결합할 수 있는 표적화 모이어티 (TM)로서, Mrgpr은 세포내이입을 통해 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기 내의 엔도솜 내로 혼입될 수 있고, 여기서 상기 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기는 상기 SNARE 단백질을 발현하는 것인 표적화 모이어티 (TM); 및
    (iii) 프로테아제를 엔도솜 내부로부터 엔도솜 막을 통과하여 가려움증-특이 DRG 뉴런 또는 소양수용기의 시토졸 내로 전위시킬 수 있는 전위 도메인을 포함하는 폴리펩티드이되,
    단, 폴리펩티드는 자연적으로 발생된 클로스트리디움 신경독소 (홀로톡신) 분자가 아니고, 여기서 TM은 멜라닌 세포 자극 호르몬 펩티드 (MSH), Y-G 또는 Y-아미드로 종결되는 신경펩티드, 클로로퀸 (CQ), SLIGRL-NH2를 포함하는 펩티드, 히스타민, 세로토닌, 또는 그의 절두 생성물 또는 펩티드 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  10. 제9항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
  11. 삭제
  12. 삭제
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