CN105492074A - 瘙痒的抑制 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于抑制或治疗瘙痒的多肽,其中该多肽包含:非细胞毒性蛋白酶,该蛋白酶能够裂解瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器(pruriceptor)中的SNARE蛋白;能够结合于瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上的结合位点的靶向部分(TM),所述结合位点能够经历胞吞作用而被并入至瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器内的内体,且其中所述瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器表达所述SNARE蛋白;和能够使来自内体内的蛋白酶易位、通过内体膜并且进入瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的胞质溶胶的易位结构域;条件是该多肽不是梭菌神经毒素(全毒素)分子。
Description
本发明提供用于抑制或治疗瘙痒的方法和组合物。
瘙痒、医学上称作瘙痒症,已经被定义为“引起对搔抓的欲望或反射的令人不愉快的皮肤感觉”。具有严重瘙痒的患者通常发现因相关的不适感和心理紊乱例如抑郁或睡眠剥夺而难以过正常的生活。瘙痒还可以是虚弱性病症,其附带众多的皮肤、全身和神经系统障碍。
推定瘙痒的发生是为了防止动物受到小的粘性威胁,例如昆虫和植物尖刺,它们无法通过与感觉痛相关的回缩响应被有效地除去。密切的发展相关性因瘙痒与疼痛神经元之间的重叠而是显而易见的:两者均通过无髓鞘的C-型神经纤维(伤害性感受器)的游离神经末梢介导。存在众多能够刺激这些神经的介体,例如生物胺类、生物碱类、蛋白酶和肽类。伤害性感受器通过其周围轴突检测介体并且将信号传送至脊髓,以便在脑中产生例如瘙痒知觉。对于临床医师,瘙痒与疼痛之间的重叠意味着:可以导致神经性疼痛的相同神经性疾病也可以导致神经性瘙痒。然而,存在差异。大部分有效地针对疼痛的治疗对瘙痒无效。值得注意的是,一些止痛药如阿片样疼痛缓解剂(例如吗啡)甚至导致或恶化瘙痒。
近期的研究已经开始将瘙痒线路的特征与疼痛分开描述。已经提出:瘙痒的特征在于被伤害性感受器亚组传递,称作“痒觉感受器(pruriceptors)”或瘙痒-特异性神经纤维,其位于真皮表皮接合处和表皮内。认为一些特异性地在背根神经节(DRG)或三叉神经中的感觉神经元中表达的G-蛋白偶联受体(GPCRs)在瘙痒独特性感觉中起到必不可少的作用。这组受体近期被鉴定为瘙痒独特性的(即它们不牵涉疼痛线路),并且提供了针对抑制瘙痒的潜在治疗靶标。
根据2000年进行的全球疾病负担(GlobalBurdenofDisease)(GBD)研究,4%的人群(约2.8亿)患有与瘙痒相关的病症。目前的抗组胺药和皮质类固醇药可以缓解一些类型的急性瘙痒和小百分比的慢性瘙痒类型。然而,它们无法治疗因肾病和肝病、癌症和皮肤病例如特应性皮炎导致的大部分慢性瘙痒病例。此外,抗组胺药仅能够对抗组胺依赖性瘙痒(通常由过敏性刺激引起)。然而,非组胺依赖性瘙痒占据瘙痒病例的大部分。
严重的搔抓可以损伤皮肤,使得它倾向于感染,其中严重的牵涉免疫损伤宿主(其中瘙痒可能是病症或药物反应继发的)。此外,因瘙痒而损伤和感染的皮肤通常加剧了“瘙痒-抓挠-瘙痒循环”(这种瘙痒循环需要抓挠且抓挠进一步加剧了瘙痒)。由临床医师推荐的缓解瘙痒的其它技术包括:光疗法;穿戴松弛的棉布衣服;频繁地在温水中短暂沐浴和维持30%-40%湿度水平的清凉环境。然而,这些预防措施始终不能维持。因此,本领域中需要用于抑制或治疗瘙痒的新药剂。
本发明解决了这种需求,其解决了上述举出的问题的一种或多种。
发明概述
本发明通过提供用于抑制或治疗受试者(例如患者)的瘙痒的融合蛋白、解决了上述举出问题的一种或多种,所述融合蛋白包含:
(i)非细胞毒性蛋白酶,该蛋白酶能够裂解瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器中的SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着蛋白受体)蛋白;
(ii)能够结合至瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上的结合位点的靶向部分(TM),所述结合位点能够经历胞吞作用而被并入瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器内的内体,且其中所述瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器表达所述SNARE蛋白;和
(iii)能够使来自内体内的蛋白酶易位、通过内体膜并且进入瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的胞质溶胶的易位结构域;
条件是该多肽不是梭菌神经毒素(全毒素)分子。
第一个方面还包括用于抑制或治疗瘙痒的相应方法,该方法包括对患者施用治疗有效量的本发明的多肽。
发明详述
本发明的多肽不是天然存在的梭菌神经毒素分子(也称作梭菌全毒素)。梭菌全毒素是已知对人最致命性的神经毒素之一,且因此作为治疗分子具有明显的限制。此外,在抑制瘙痒的情况下,梭菌全毒素与不期望的靶点脱离(off-sitetargeting)相关,即靶向非瘙痒途经的神经细胞的细胞。
在应用中,本发明的多肽结合于瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上的受体。易位成分影响蛋白酶成分转运入瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的胞质溶胶。最终,一旦到达内部,则蛋白酶通过裂解瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器胞质溶胶中存在的SNARE蛋白而抑制瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的细胞外融合过程。因此,通过使瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的细胞外融合器失活,本发明的多肽抑制神经递质从其中分泌。因此,本发明的多肽降低了从瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器传送至脊髓的神经递质水平,且由此能够抑制或治疗瘙痒。在一个实施方案中,神经递质是乙酰胆碱。在一个优选的实施方案中,神经递质是谷氨酸盐。在另一个优选的实施方案中,神经递质是促胃液素释放蛋白(GRP)。
本发明的多肽类提供超过其它治疗剂的显著优势,因为它们具有抑制从特异性靶细胞即瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器中分泌的潜能。相反,其它提出的治疗剂寻求通过尝试使用介导这种效应的受体拮抗剂减轻瘙痒。然而,本发明提供特异性阻断神经递质从其产生部位分泌的手段。
本发明的主要靶细胞是瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器。DRG细胞通过脊柱沿脊椎定位,并且是GPCRs例如MrgprX1、MrgprA3或MrgprC11的表达位点,它们已被鉴定为瘙痒-特异性受体。
本发明的融合蛋白在与相应的“游离”TM(即分离的TM本身)比较时一般显示针对靶细胞减少的结合亲和力(在至多10至100-倍的范围)。然而,尽管存在这种观察结果,但是本发明的融合蛋白令人惊奇地显示出良好的效能。这可以归因于两种主要的特征。首先,非细胞毒性蛋白酶成分是催化性的–因此,少量这类分子的治疗作用在靶细胞内得以快速地扩增。其次,存在于靶细胞上的受体仅需要作为治疗剂进入的入口起作用,且不一定需要被刺激至达到配体-受体介导的药理学响应所需的水平。因此,可以以低于用于其它类型治疗分子的剂量施用本发明的融合蛋白,其它类型的治疗分子典型地以高微克至毫克(甚至达到数百毫克)用量施用。相比之下,本发明的融合蛋白可以以低得多的剂量施用,典型地至少低10-倍,且更典型地低100-倍。
非细胞毒性蛋白酶
本发明TSI多肽类的生物活性成分是非细胞毒性蛋白酶。因此,一旦被递送入靶细胞的胞质溶胶,则非细胞毒性蛋白酶成分影响期望靶细胞内的SNARE裂解。因为SNARE蛋白是哺乳动物细胞内的分泌过程的必要成分,故其蛋白水解失活抑制/阻止从所述细胞分泌。
非细胞毒性蛋白酶是不杀伤细胞的离散类分子;而它们通过抑制非蛋白质合成的细胞过程起作用。非细胞毒性蛋白酶由各种高级生物体(例如植物和动物)产生–这类高级生物体的实例是巴西全蝎(Brazilianscorpion)。此外,非细胞毒性蛋白酶由各种微生物、特别是细菌例如梭菌属(Clostridiumsp.)和奈瑟球菌属(Neisseriasp.)产生。
梭菌神经毒素代表主要的一组非细胞毒性毒素分子,并且包含通过二硫键连接的两个多肽链。两个链称作具有约100kDa分子量的重链(H-链)和具有约50kDa分子量的轻链(L-链)。轻链具有蛋白酶功能并且展示出对牵涉细胞外过程的囊泡或质膜相关SNARE蛋白(例如突触融合蛋白、SNAP和突触泡蛋白(或VAMP))的高底物特异性。这些底物是细胞分泌器的必需成分。
显然大部分来自淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)种类的奈瑟球菌属产生功能类似的非细胞毒性毒素分子。这类非细胞毒性蛋白酶的实例是IgA蛋白酶(参见WO99/58571)。类似的IgA蛋白酶由链球菌属(streptococci)例如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)产生。
因此,在一个实施方案中,本发明的非细胞毒性蛋白酶可以是梭菌神经毒素蛋白酶或IgA蛋白酶(例如参见WO99/032272)。非细胞毒性蛋白酶的另一个实例是蝎毒液蛋白酶,例如来自巴西全蝎巴西钳蝎(Tityusserrulatus)的毒液的那些或蛋白酶antarease(例如参见WO2011/022357)。
靶向部分(TM)
现在转导本发明的靶向部分(TM)成分,这种成分是使本发明的多肽结合至瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的成分。TM优选是肽。
在应用中,本发明的多肽结合至瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器。此后,该多肽的易位成分影响蛋白酶成分转运入瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的胞质溶胶。最终,一旦到达内部,则蛋白酶通过裂解瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器胞质溶胶中存在的SNARE蛋白来抑制瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的细胞外融合过程。因此,通过使瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的细胞外融合器失活,本发明的多肽抑制神经递质从其中分泌。因此,本发明的多肽减少瘙痒-感觉信号通过脊髓传送至脑,且由此能够抑制或治疗瘙痒。
TM结合瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上的结合位点,由此提供所述多肽对这一种类靶细胞超过其它细胞的选择性。在这方面,本发明优选的TM实施方案包括抗体(例如单克隆抗体、抗体片段例如Fab、F(ab)’2、Fv、ScFv等和抗体结构域肽类)和结合骨架,它们结合如下鉴定的受体。因此,本发明的多肽类可以包括商购抗体或结合骨架,它们已经被设计成实现与所述靶细胞或受体的特异性结合。或者,优选的TMs包括生物胺类、生物碱类、蛋白酶、肽配体和神经肽类。
本发明的TM结合至瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器。作为实例,本发明多肽的TM结合瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上的G-蛋白偶联受体(GPCR),其选自Mas-相关G-蛋白受体(例如MrgprX1、MrgprA3或MrgprC11)。
在一个实施方案中,TM选自牛肾上腺髓质肽(例如BAM8-22)、促黑激素肽(例如γ2-MSH)、终止于RF/Y-G或RF/Y-酰胺中的神经肽(例如NPFF或NPAF)、包含SLIGRL-NH2的肽、生物碱类(例如氯喹)、生物胺类(辣椒素、组胺、血清素、皮质抑素(cortistatin))以及其截短物或肽类似物。
在一个实施方案中,本发明多肽的TM结合至瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上的受体,其选自MrgprX1、MrgprA3或MrgprC11。所有这些受体均在瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上表达。
在一个实施方案中,TM选自:BAM8-22、γ2-MSH、NPFF、NPAF、SLIGRL-NH2、氯喹、辣椒素、组胺、血清素、皮质抑素及其截短物和肽类似物。
在一个实施方案中,本发明多肽的TM结合至Mrgpr受体,且优选MrgprX、MrgprA或MrgprC。在一个实施方案中,本发明多肽结合至MrgpX1或MrgprA3或MrgprC11。作为实例,适合的TMs包括:BAM8-22、氯喹、γ2-MSH、终止于RF/Y-G或RF/Y-酰胺中的神经肽类(例如NPFF或NPAF)、辣椒素、组胺、血清素或皮质抑素。这些TMs优选结合Mrgprs。
在一个优选的实施方案中,TM结合MrgprX受体,优选MrgprX1;还优选TM是BAM8-22或其截短物或肽类似物。
易位结构域
本发明的易位成分能够将非细胞毒性蛋白酶(或其片段)易位入靶细胞,使得蛋白酶活性的功能表达发生在靶细胞的胞质溶胶内。所述易位成分优选能够在低pH条件下在脂质膜(例如内体膜)内形成离子可渗透的孔。易位成分可以得自微生物蛋白来源,例如细菌或病毒蛋白来源。因此,在一个实施方案中,所述易位成分包含酶的易位结构域或由其组成,例如细菌毒素。在另一个实施方案中,所述易位结构域包含病毒蛋白的易位结构域或由其组成。在一个实施方案中,本发明的易位成分可以包含梭菌神经毒素H-链或其片段或由其组成,例如梭菌神经毒素的HN结构域(或其易位成分)。
多肽制备
本发明的多肽类包含3种主要成分:“生物活性”(即非细胞毒性蛋白酶);TM;和易位结构域。与制备这类融合蛋白相关的通用技术通常称作再靶向毒素技术。作为示例,我们参考:WO94/21300;WO96/33273;WO98/07864;WO00/10598;WO01/21213;WO06/059093;WO00/62814;WO00/04926;WO93/15766;WO00/61192;和WO99/58571。将所有这些公开文本并入本文参考。
更具体地,可以使本发明的TM成分与本发明的蛋白酶成分或易位成分融合。所述融合优选通过共价键例如直接共价键或通过间隔/连接分子进行。所述蛋白酶成分和易位成分优选通过共价键例如直接共价键或通过间隔/连接分子彼此连接。适合的间隔/连接分子是本领域众所周知的,且典型地包含5-40、优选10-30个氨基酸长度的基于氨基酸的序列。
在应用中,所述多肽类具有双链构象,其中所述蛋白酶成分和易位成分优选通过二硫键彼此连接。
可以通过本领域技术人员众所周知的常规化学缀合技术制备本发明的多肽类。作为实例,参照Hermanson,G.T.(1996),Bioconjugatetechniques,AcademicPress,和Wong,S.S.(1991),Chemistryofproteinconjugationandcross-linking,CRCPress,Nagy等人,PNAS95p1794-99(1998)。例如,EP0257742中提供了用于使合成的TMs连接至本发明的多肽的另外详细描述的方法。将上述举出的缀合公开文献并入本文参考。
或者,可以通过单一多肽融合蛋白的重组制备来制备所述多肽类(例如参见WO98/07864)。这项技术基于体内细菌机制,通过该机制制备天然梭菌神经毒素(即全毒素),且产生具有如下“简化”结构排列的融合蛋白:
NH2-[蛋白酶成分]–[易位成分]–[TM]-COOH
根据WO98/07864,TM定向于融合蛋白C-末端。然后通过用在蛋白酶成分与易位成分之间的位点上裂解的蛋白酶处理来活化融合蛋白。由此产生双链蛋白,其包含蛋白酶成分作为单一多肽链,其共价连接(通过二硫键)至包含易位成分+TM的另一单一多肽链。
或者,根据WO06/059093,所述融合蛋白的TM成分定位于蛋白酶切割位点与易位成分之间的直链融合蛋白序列中间。这确保了TM连接至易位结构域(即如天然梭菌全毒素所发生),不过,在这种情况中,两种成分相对天然全毒素的次序被反向。随后在蛋白酶切割位点上的裂解暴露TM的N-末端部分,并且提供双链多肽融合蛋白。
另一种选择是融合蛋白的TM成分的“分裂配体”呈现。就此,作为配体起作用的TM成分具有游离N-末端结构域和游离C-末端结构域。因此,TM能够通过靶向部分的N-末端部分与结合位点的结构域之间的相互作用与靶细胞上的结合位点(例如受体)发生相互作用。或者,TM能够在靶向部分的C-末端部分与结合位点的结构域之间发生相互作用。或者,TM能够发生双向相互作用,其中靶向部分的N-末端部分与结合位点的结构域发生相互作用,且靶向部分的C-末端部分与结合位点的结构域发生相互作用。在后面这种实施方案中,TM的N-和C-末端部分可以结合至结合位点的相同或不同结构域,和/或可以结合至不同结合位点上的结构域。有关这种排列的另外的信息可以在WO2012156743中找到,将该文献并入本文参考。
可以通过常规方式、例如通过定向诱变以DNA水平导入上述举出的蛋白酶裂解序列(和/或除去任意内在的裂解序列)。用于证实裂解序列存在的筛选法可以通过手动或借助计算机软件(例如DNASTAR,Inc.的MapDraw程序)进行。尽管可以使用任意蛋白酶切割位点(即梭菌或非梭菌),但优选以下:
另外的蛋白酶切割位点包括被非细胞毒性蛋白酶例如梭菌神经毒素裂解的识别序列。它们包括被非细胞毒性蛋白酶例如梭菌神经毒素裂解的SNARE(例如SNAP-25、突触融合蛋白、VAMP)蛋白识别序列。US2007/0166332中提供了具体的实例,将该文献完整地并入本文参考。
术语蛋白酶切割位点还包括为自体裂解序列的内蛋白(intein)。自我剪接反应是可控的,例如,通过改变存在的还原剂浓度。如果被并入本发明的多肽,上述“活化”切割位点还可以被用作“破坏性”切割位点(下述)。
在一个优选的实施方案中,本发明的融合蛋白可以包含一种或多种位于N-末端和/或C-末端上的纯化标记。尽管可以使用任意纯化标记,优选如下:
His-标记(例如6×组氨酸)(SEQIDNO:7),优选为C-末端和/或N-末端
MBP-标记(麦芽糖结合蛋白),优选为N-末端标记
GST-标记(谷胱甘肽S-转移酶),优选为N-末端标记
His-MBP-标记,优选为N-末端标记
GST-MBP-标记,优选为N-末端标记
硫氧还蛋白-标记,优选为N-末端标记
CBD-标记(壳多糖结合结构域),优选为N-末端标记。
所述融合蛋白中可以包括一种或多种肽间隔/连接分子。例如,纯化标记与融合蛋白分子其余部分之间可以使用肽间隔区。
本发明还提供编码上述举出的融合蛋白的DNA序列。在本发明的一个优选方面,将DNA序列制备成DNA载体的部分,其中该载体包含启动子和终止子。
在一个优选的实施方案中,所述载体具有选自如下的启动子:
优选通过计算机(insilico)设计本发明的DNA构建体,且然后通过常规DNA合成技术合成。
根据所要用的最终宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli))表达系统,任选对上述DNA序列信息进行修饰以用于密码子偏倚。
优选筛选用于任意内在核酸序列的DNA骨架,当其被转录和翻译时,将产生相当于由第二种肽编码序列编码的蛋白酶切割位点的氨基酸序列。这种筛选可以手动或借助计算机软件(例如DNASTAR,Inc的MapDraw程序)进行。
本文涉及的“抑制”和“治疗”是指对受试者提供治疗有益性。例如,它包括施用如本文所定义的融合蛋白以预防或减轻瘙痒的严重性。
本发明的另一个方面提供用于预防或抑制瘙痒的方法,其中该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的融合蛋白,该融合蛋白包含:
(i)非细胞毒性蛋白酶,该蛋白酶能够裂解瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器中的SNARE蛋白;
(ii)能够结合瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上的结合位点的靶向部分(TM),所述结合位点能够经历胞吞作用而被并入瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器内的内体,且其中所述瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器表达所述SNARE蛋白;和
(iii)能够使来自内体内的蛋白酶易位、通过内体膜并且进入瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的胞质溶胶的易位结构域;
条件是该多肽不是梭菌神经毒素(全毒素)分子。
本发明的融合蛋白可以包括破坏性蛋白酶切割位点,其在所述融合蛋白可以迁移至非位点位置的情况下对裂解敏感(被局部蛋白酶)。这种方法有助于将靶点脱离的风险降至最低。因此,本发明的融合蛋白可以被设计成包括一个或多个破坏性切割位点,例如,如WO2010/094905和WO2002/44199中所述–这些文件各自以其完整的形式被并入本文参考。
多肽递送
在应用中,本发明使用药物组合物,其包含多肽与至少一种选自药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐的成分。
本发明的多肽类可以配制为口服、胃肠外、连续输注、植入、吸入或局部施用。适合于注射的组合物可以为溶液、混悬液或乳剂或在使用前用适合的媒介物溶解或混悬的干粉的形式。
局部递送方式可以包括口服或胃递送。在这方面,可以使用包肠溶衣的胶囊或其它颗粒系统形式的制剂,例如微球。通过腹腔镜手术对十二指肠局部施用也是可能的。局部递送的其它实例还可以包括透皮递送(通过粘着性贴剂)。
优选的施用途径选自:全身、口服、腹腔镜和/或局部注射。
在注射用制剂的情况中,任选包括药学活性物质以辅助所述多肽保留在施用部位或减少从施用部位除去。这类药学活性物质的一个实例是血管收缩剂,例如肾上腺素。这类制剂在施用后提供多肽停留时间增加的优势且由此增加和/或增强其效果。
用于施用本发明多肽类的剂量范围是产生期望治疗效果的那些。应当理解,所需的剂量范围取决于多肽或组合物的精确性质、施用途径、制剂性质、患者年龄、患者病情的性质、程度或严重性、禁忌症(如果有的话)和主治医师的判断。这些剂量水平的改变可以使用标准最佳实验程序调整。
适合的每日剂量(每kg患者体重)是0.0001-1mg/kg,优选0.0001-0.5mg/kg,更优选0.002-0.5mg/kg,且特别优选0.004-0.5mg/kg。单位剂量可以在低于1微克至30mg之间改变,但典型地在0.01-1mg/剂量区间,可以将其每日施用或优选以较低频率施用,例如每周1次或每6个月一次。
特别优选的施用方案基于2.5ng多肽作为1X剂量。在这方面,优选的剂量在1X–100X(即2.5-250ng)。
典型地使用所述多肽和无热原无菌媒介物制备流体剂型。根据所用媒介物和浓度不同,多肽可以溶于或混悬于媒介物。在制备溶液的过程中,可以将所述多肽溶于媒介物,如果必要,通过添加氯化钠使该溶液等渗并且通过使用无菌技术、通过无菌滤膜灭菌、然后填充入适合的无菌小瓶或安瓿并且密封。或者,如果溶液的稳定性足够,则可以通过高压灭菌对其密封容器中的溶液灭菌。有利地,可以将添加剂例如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、助悬剂或乳化剂或局部麻醉剂溶于媒介物。
可以通过使用无菌技术在无菌区域将预先灭菌的成分填充入无菌容器来制备在使用前溶于或混悬于适合的媒介物的干粉。然后将产品冷冻干燥并且无菌密封容器。
按照基本上相同的方式制备适合于肌内、皮下或皮内注射的胃肠外混悬液,不同的是无菌成分混悬在无菌媒介物中,而不是被溶解,此时灭菌不能伴随着过滤。可以以无菌状态分离所述成分,或者,可以在分离后将其灭菌,例如通过γ辐照。
有利地,在组合物中包括助悬剂例如聚乙烯吡咯烷酮,以有利于成分的均匀分布。
本发明的施用可以采用各种递送技术,包括微粒包囊、病毒递送系统或高压气雾剂碰撞。
定义部分
靶向部分(TM)是指在功能上与结合位点发生相互作用以导致本发明多肽与靶细胞表面之间的物理结合的任意化学结构。在本发明的上下文中,靶细胞是瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器。术语TM包括能够结合靶细胞上的结合位点的任意分子(即天然存在的分子或其化学/物理修饰的变体),所述结合位点能够被内化(例如内体形成)–也称作受体-介导的胞吞作用。TM可以具有内体膜易位功能,在这种情况中,单独的TM和易位结构域成分无需存在于本发明的活性剂中。在上述描述的至始至终,描述了特定的TMs。所涉及的TMs仅仅是示例性的,且本发明包括其所有的变体和衍生物,它们保留示例性TMs的基本结合(即靶向)能力。
本发明的TM包括抗体(例如抗体片段)和结合骨架;尤其是为结合(例如特异性地)靶细胞目的而设计的商购抗体/片段和骨架。
蛋白质骨架代表新一代的通用结合骨架,以补充治疗单克隆抗体和衍生物的不断扩展的体系,例如scFvs、Fab分子、dAbs(单一-结构域抗体)、camelids、双体和minibodies,它们各自可以用作本发明的TM。骨架系统通过生成新的骨架或修饰已知蛋白质的结合结构域而生成或改变已知的蛋白质识别结构域。这类骨架包括但不限于:
(i)基于蛋白质A的骨架-affibodies(Nord,K.等人1997“Bindingproteinsselectedfromcombinatoriallibrariesofanalpha-helicalbacterialreceptordomain”,NatBiotechnol15,772–777);
(ii)基于脂质运载蛋白(lipocalin)的骨架–anticalins(Skerra2008“Alternativebindingproteins:anticalins-harnessingthestructuralplasticityofthelipocalinligandpockettoengineernovelbindingactivities”,FEBSJ.275:2677-83);
(iii)基于纤连蛋白的骨架–adnectin(Dineen等人2008,“TheAdnectinCT-322isanovelVEGFreceptor2inhibitorthatdecreasestumourburdeninanorthotropicmousemodelofpancreaticcancer”。BMCCancer8:352);
(iv)avimers(Silverman等人2005,“Multivalentavimerproteinsevolvedbyexonshufflingofafamilyofhumanreceptordomains”,NatBiotechnol23:1556-61);
(v)基于锚蛋白的骨架–darpins(Zahnd等人2006,“SelectionandcharacterizationofHer2binding-designedankyrinrepeatproteins”,JBiolChem.281:35167-75);和
(vi)centyrin骨架–基于蛋白质折叠,其具有与带有与CDRs类似的环的Ig结构域的显著结构同源性。Ig结构域是人蛋白质中的常见模块并且广泛地用作可替代的骨架蛋白。上述“骨架”出版物各自被并入本文(以其完整的形式)参考。
结合骨架可以通过与特异性细胞表面蛋白、受体或其它细胞表面表位例如糖基的相互作用而用于靶向特定细胞类型。这类修饰的骨架可以被改造到基于重组非细胞毒性蛋白酶的本发明多肽类。
本发明的TM结合(优选特异性结合)所述瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器靶细胞。术语“特异性结合”优选是指:指定的TM结合靶细胞,其具有的结合亲和力(Ka)为106M-1或以上,优选107M-1或以上,更优选108M-1或以上,且最优选109M-1或以上。术语“特异性结合”还可以指指定的TM结合指定的受体Mas-相关G蛋白偶联受体(例如MrgprX1或MrgprA1-3或MrgprC11),其具有的结合亲和力(Ka)为106M-1或以上,优选107M-1或以上,更优选108M-1或以上,且最优选109M-1或以上。
本说明书中涉及的TM包括其片段和变体,它们保留结合所述靶细胞的能力。作为实例,变体可以具有与参比TM(例如本说明书中呈现的任意的SEQIDNO,其定义TM)至少80%、优选至少90%、更优选至少95%且最优选至少97或至少99%的氨基酸序列同一性。因此,变体可以包括氨基酸(例如非天然氨基酸)的一种或多种类似物,或取代的连接物。此外,作为实例,术语片段在涉及TM使用时是指具有参比TM的至少10个、优选至少20个、更优选至少30个且最优选至少40个氨基酸残基的肽。术语片段也指上述举出的变体。因此,作为实例,本发明的片段可以包含具有至少10、20、30或40个氨基酸的肽序列,其中该肽序列具有与参比肽的相应肽序列的(连续)氨基酸至少80%的序列同源性。
证实TM结合选择的靶细胞是常规的。例如,可以使用简单的放射性置换实验,其中使所述靶细胞的组织或细胞代表在过量未标记TM存在下暴露于标记的(例如氚标记的)TM。在这类实验中,可以评价非特异性和特异性结合的相对比例,由此能够证实TM结合靶细胞。任选地,该测定法可以包括一种或多种结合拮抗剂,且该测定法还可以包括观察TM结合的缺失,这类实验的实例可以在Hulme,E.C.(1990),Receptor-bindingstudies,abriefoutline,pp.303-311,InReceptorbiochemistry,APracticalApproach,Ed.E.C.Hulme,OxfordUniversityPress中找到。
在本发明的上下文中,所涉及的肽TM包括其肽类似物,只要该类似物结合与相应的“参比”TM相同的受体。
本发明的融合蛋白(本文也称作多肽类)可以不具有梭菌神经毒素的功能性HC或HCC结构域。在一个实施方案中,所述多肽类不具有梭菌神经毒素全毒素的最后50个C-末端氨基酸。在另一个实施方案中,所述多肽类不具有梭菌神经毒素全毒素的最后100、150、200、250或300个C-末端氨基酸残基。或者,HC结合活性可以通过诱变而消除/减少,例如简称BoNT/A,神经节苷脂结合袋中的一个或两个氨基酸残基突变(W1266至L和Y1267至F)的修饰使得HC区失去其受体结合功能。可以对非血清型A梭菌肽成分进行类似突变,例如基于肉毒毒素(botulinum)B突变(W1262-L和Y1263-F)或肉毒毒素E突变(W1224-L和Y1225-F)的构建体。针对活性位点的其它突变同样使得HC受体结合活性的消除,例如肉毒毒素型A毒素中的Y1267S和其它梭菌神经毒素中相应的高度保守的残基。这种和其它突变的详细描述记载在Rummel等人(2004)(MolecularMicrobiol.51:631-634)中,将该文献并入本文参考。
天然梭菌神经毒素的HC肽包含约400-440个氨基酸残基,并且由两个各自约25kDa的功能不同的结构域组成,即N-末端区(通常称作HCN肽或结构域)和C-末端区(通常称作HCC肽或结构域)。此外,充分记载的是,构成C-末端160-200个氨基酸残基的C-末端区(HCC)负责使梭菌神经毒素结合至其天然细胞受体,即结合神经肌肉接点上的神经末梢。因此,本说明书上下文中涉及的缺乏功能性重链HC肽(或结构域)、以使该重链不能结合天然梭菌神经毒素所结合的细胞表面受体的肽梭菌重链,是指梭菌重链单纯地不含功能性HCC肽。换句话说,HCC肽区是部分或完全缺失的,否则是修饰的(例如通过常规化学或蛋白水解处理),以便使其对神经肌肉接点上的神经末梢天然结合能力失活。
因此,在一个实施方案中,本发明的梭菌HN肽缺乏梭菌神经毒素的C-末端肽部分(HCC)的一部分,且由此缺乏天然梭菌神经毒素的HC结合功能。作为实例,在一个实施方案中,C-末端伸展的梭菌HN肽缺乏梭菌神经毒素重链的C-末端40个氨基酸残基,或C-末端60个氨基酸残基,或C-末端80个氨基酸残基,或C-末端100个氨基酸残基,或C-末端120个氨基酸残基,或C-末端140个氨基酸残基,或C-末端150个氨基酸残基,或C-末端160氨基酸残基。在另一个实施方案中,本发明的梭菌HN肽缺乏梭菌神经毒素的完整C-末端肽部分(HCC)且由此缺乏天然梭菌神经毒素的HC结合功能。作为实例,在一个实施方案中,梭菌HN肽缺乏梭菌神经毒素重链的C-末端165个氨基酸残基,或C-末端170个氨基酸残基,或C-末端175氨基酸残基,或C-末端180个氨基酸残基,或C-末端185氨基酸残基,或C-末端190个氨基酸残基,或C-末端195氨基酸残基。作为另一个实例,本发明的梭菌HN肽缺乏选自如下的梭菌HCC参比序列:
肉毒毒素A型神经毒素-氨基酸残基(Y1111-L1296)
肉毒毒素B型神经毒素-氨基酸残基(Y1098-E1291)
肉毒毒素C型神经毒素-氨基酸残基(Y1112-E1291)
肉毒毒素D型神经毒素-氨基酸残基(Y1099-E1276)
肉毒毒素E型神经毒素-氨基酸残基(Y1086-K1252)
肉毒毒素F型神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1274)
肉毒毒素G型神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1297)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(Y1128-D1315)。
上述鉴定的参比序列应当被视为指导,因为根据亚血清型可能发生稍许改变。
本发明的蛋白酶包括能够裂解真核细胞中胞外融合器的一种或多种蛋白质的所有的非细胞毒性蛋白酶。
本发明的蛋白酶优选是细菌蛋白酶(或其片段)。更优选所述细菌蛋白酶选自梭菌属或奈瑟球菌属/链球菌属(例如梭菌L-链或奈瑟球菌属IgA蛋白酶,其优选自淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)或肺炎链球菌(S.pneumoniae))。非细胞毒性蛋白酶的另一个实例包括蝎毒液蛋白酶,例如来自巴西全蝎巴西钳蝎的毒液的那些,或蛋白酶antarease。
本发明还包括变体非细胞毒性蛋白酶(即天然存在的蛋白酶分子的变体),只要该变体蛋白酶仍然显示必需的蛋白酶活性。作为实例,变体可以具有与参比蛋白酶序列至少70%、优选至少80%、更优选至少90%且最优选至少95%或至少98%的氨基酸序列同源性。因此,术语变体包括具有增强(或减少的)内肽酶活性的非细胞毒性蛋白酶–本文特别举出的是BoNT/A突变体Q161A、E54A和K165L的增加的Kcat/Km,参见Ahmed,S.A.(2008)ProteinJ.DOI10.1007/s10930-007-9118-8,将该文献并入参考。术语片段在涉及蛋白酶使用时典型地是指具有参比蛋白酶的至少150、优选至少200、更优选至少250且最优选至少300个氨基酸残基的肽。与TM“片段”成分(上述)一样,本发明的蛋白酶“片段”包括基于参比序列的变体蛋白酶片段。
本发明的蛋白酶优选显示出丝氨酸或金属蛋白酶活性(例如内肽酶活性)。蛋白酶优选对SNARE蛋白具有特异性(例如SNAP-25、突触泡蛋白(synaptobrevin)/VAMP或突触融合蛋白)。
具体举出的是神经毒素蛋白酶结构域,例如细菌神经毒素蛋白酶结构域。因此,本发明包括使用天然存在的神经毒素结构域,以及所述天然存在神经毒素的重组制备形式。
示例性神经毒素由梭菌属产生,且术语梭菌神经毒素包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素以及由巴氏梭菌(C.baratii)和肉毒梭菌(C.butyricum)产生的密切相关的BoNT-样神经毒素。在本说明书的上下文中使用上述缩写。例如,命名BoNT/A表示作为BoNT(血清型A)的神经毒素来源。相应的命名适用于其它BoNT血清型。
BoNTs是最有效的已知毒素,根据血清型的不同,其针对小鼠的半数致死剂量(LD50)值为0.5-5ng/kg。BoNTs在胃肠道中被吸收,且在进入全身循环后,结合胆碱能神经末梢的突触前膜并且防止其神经递质乙酰胆碱释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G裂解突触泡蛋白/囊泡-相关膜蛋白(VAMP);BoNT/C、BoNT/A和BoNT/E裂解25kDa的突触体-相关蛋白(SNAP-25);且BoNT/C裂解突触融合蛋白。
BoNTs共有常见结构,其为~150kDa的双链蛋白,由单一二硫键共价连接的~50kDa的轻链(L-链)和~100kDa重链(H-链)组成。H-链由两个各自~50kDa的结构域组成。C-末端结构域(HC)是高度亲和力神经元结合所需的,而N-末端结构域(HN)据信牵涉膜易位。L-链是负责裂解底物SNARE蛋白的锌依赖性金属蛋白酶。
术语L-链片段是指神经毒素的L-链成分,该片段显示金属蛋白酶活性且能够以蛋白水解方式裂解牵涉于细胞胞吞作用的囊泡和/或质膜相关蛋白。
适合的蛋白酶(参比)序列的实例包括:
肉毒毒素A型神经毒素-氨基酸残基(1-448)
肉毒毒素B型神经毒素-氨基酸残基(1-440)
肉毒毒素C型神经毒素-氨基酸残基(1-441)
肉毒毒素D型神经毒素-氨基酸残基(1-445)
肉毒毒素E型神经毒素-氨基酸残基(1-422)
肉毒毒素F型神经毒素-氨基酸残基(1-439)
肉毒毒素G型神经毒素-氨基酸残基(1-441)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(1-457)
IgA蛋白酶-氨基酸残基(1-959)*
*Pohlner,J.等人(1987).Nature325,pp.458-462,该文献并入本文参考。
上述鉴定的参比序列应当被视为指导,因为根据亚血清型可能发生少许改变。作为实例,US2007/0166332(并入本文参考)引述了稍不同的梭菌序列:
肉毒毒素A型神经毒素-氨基酸残基(M1-K448)
肉毒毒素B型神经毒素-氨基酸残基(M1-K441)
肉毒毒素C型神经毒素-氨基酸残基(M1-K449)
肉毒毒素D型神经毒素-氨基酸残基(M1-R445)
肉毒毒素E型神经毒素-氨基酸残基(M1-R422)
肉毒毒素F型神经毒素-氨基酸残基(M1-K439)
肉毒毒素G型神经毒素-氨基酸残基(M1-K446)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(M1-A457)
包含轻链的各种梭菌毒素片段可以用于本发明的各方面,条件是这些轻链片段可以特异性地靶向神经递质释放器的核心成分且由此参与执行全部细胞机制,由此梭菌毒素以蛋白水解方式裂解底物。梭菌毒素的轻链约为420-460个氨基酸长度且包含酶结构域。研究已经证实:完整长度的梭菌毒素轻链并非酶结构域的酶活性所必需的。作为一个非限制性实例,BoNT/A轻链的前8个氨基酸并非酶活性所需的。作为另一个非限制性实例,TeNT轻链的前8个氨基酸并非酶活性所需的。同样,轻链的羧基末端并非活性所需。作为一个非限制性实例,BoNT/A轻链的最后32个氨基酸(残基417-448)并非酶活性所需。作为另一个非限制性实例,TeNT轻链的最后31个氨基酸(残基427-457)并非酶活性所需。因此,该实施方案的各方面可以包括包含酶结构域的梭菌毒素轻链,所述酶结构域具有例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸、至少425个氨基酸和至少450个氨基酸长度。该实施方案的其它方面可以包括包含酶结构域的梭菌毒素轻链,所述酶结构域具有例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸、至多425个氨基酸和至多450个氨基酸长度。
适合的非细胞毒性蛋白酶另外的实例详细描述在WO2007/106115中,将该文献完整地并入本文参考。
在一个实施方案中,非细胞毒性蛋白酶裂解非神经元SNARE蛋白,例如SNAP-23蛋白。在一个实施方案中,非细胞毒性蛋白酶是能够裂解SNAP-23的修饰的肉毒毒素L-链。这类修饰的L-链的实例由Chen和Barbieri在PNAS,第106卷第23期,p9180-9184,2009中描述。
在一个实施方案中,非细胞毒性蛋白酶是BoNT/A、BoNT/C或BoNT/E蛋白酶,且优选的SNARE基序是SNAP(例如SNAP25)基序。
在另一个实施方案中,非细胞毒性蛋白酶是BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F或BoNT/G或破伤风神经毒素(TeNT)蛋白酶,且优选的SNARE基序是VAMP基序。
在另一个实施方案中,非细胞毒性蛋白酶是BoNT/C1蛋白酶,且优选的SNARE基序是突触融合蛋白基序。
本发明的非细胞毒性蛋白酶识别不同的切割位点序列且由此具有稍不同的裂解特异性。
非细胞毒性切割位点识别序列:
蛋白酶P4-P3-P2-P1-↓-P1’-P2’-P3’
作为另一个实例,涉及如下识别序列和切割位点:
非细胞毒性切割位点识别序列:
蛋白酶P4-P3-P2-P1-↓-P1’-P2’-P3’
本发明的多肽类、尤其是其蛋白酶成分可以被聚乙二醇化,这可以有助于增加稳定性,例如蛋白酶成分的作用期限。当蛋白酶包含BoNT/A、B或C1蛋白酶时,聚乙二醇化是特别优选的。聚乙二醇化优选包括将PEG添加到蛋白酶成分的N-末端。作为实例,蛋白酶的N-末端可以伸展出一个或多个氨基酸(例如半胱氨酸)残基,其可以相同或不同。所述氨基酸残基的一个或多个可以具有与之连接的其自身的PEG分子(例如共价连接)。这种技术的一个实例描述在WO2007/104567中,将该文献完整地并入本文参考。
易位结构域是能够使蛋白酶易位入靶细胞的分子,使得蛋白酶活性的功能性表达发生在靶细胞的胞质溶胶内。任何分子(例如蛋白质或肽)是否具有本发明的易位功能,可以通过众多常规测定法的任意一种证实。
例如,ShoneC.(1987)描述了使用脂质体的体外测定法,其使用测试分子攻击。根据易于监测的从脂质体中释放K+和/或标记的NAD来证实必需的易位功能的存在[参见ShoneC.(1987)Eur.J.Biochem;167卷(1):pp.175-180]。
另一个实例由BlausteinR.(1987)提供,其描述了使用平面磷脂双层膜的简单的体外测定法。使用测试分子攻击膜并且根据通过所述膜的电导增加证实必需的易位功能[参见Blaustein(1987)FEBSLetts;第226卷,第1期:pp.115-120]。
能够评价膜融合、由此鉴定适用于本发明的易位结构域的另外的方法由MethodsinEnzymology第220和221卷,MembraneFusionTechniques,A和B部分,学术出版社1993提供。
本发明还包括变体易位结构域,只要该变体结构域仍然显示必需的易位活性。作为实例,变体可以具有与参比易位结构域至少70%、优选至少80%、更优选至少90%且最优选至少95%或至少98%的氨基酸序列同源性。术语片段在涉及易位结构域使用时是指具有参比易位结构域的至少20个、优选至少40个、更优选至少80个且最优选至少100个氨基酸残基的肽。在梭菌易位结构域的情况中,所述片段优选具有参比易位结构域(例如HN结构域)的至少100个、优选至少150个、更优选至少200个且最优选至少250个氨基酸残基。与TM“片段”成分(上述)一样,本发明的易位“片段”包括基于参比序列的变体易位结构域片段。
所述易位结构域优选能够在低pH条件下在脂质膜中形成离子可渗透的孔。优选已发现:仅使用那些能够在内体膜内形成孔的蛋白质分子的部分。
所述易位结构域可以得自微生物蛋白质来源,特别是得自细菌或病毒蛋白来源。因此,在一个实施方案中,易位结构域是酶例如细菌毒素或病毒蛋白的易位结构域,。
充分记载了细菌毒素分子的一些结构域能够形成这类孔。还已知一些病毒表达的膜融合蛋白的易位结构域能够形成这类孔。这类结构域可以用于本发明。
所述易位结构域可以是梭菌来源,例如HN结构域(或其功能片段)。HN是指基本上相当于H-链的氨基-末端一半的梭菌神经毒素的H-链的部分或片段,或相当于完整H-链中的片段的结构域。在这方面,如果期望除去HC细胞-结合功能,这可以通过删除HC或HCC氨基酸序列进行(通过核酸酶或蛋白酶处理在DNA合成水平或合成后水平上)。或者,HC功能可以通过化学或生物学处理被失活。
适合的(参比)易位结构域的实例包括:
肉毒毒素A型神经毒素-氨基酸残基(449-871)
肉毒毒素B型神经毒素-氨基酸残基(441-858)
肉毒毒素C型神经毒素-氨基酸残基(442-866)
肉毒毒素D型神经毒素-氨基酸残基(446-862)
肉毒毒素E型神经毒素-氨基酸残基(423-845)
肉毒毒素F型神经毒素-氨基酸残基(440-864)
肉毒毒素G型神经毒素-氨基酸残基(442-863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-879)
上述鉴定的参比序列应当被视为指导,因为根据亚血清型可能存在少许改变。作为实例,US2007/0166332(并入本文参考)引述了稍不同的梭菌序列:
肉毒毒素A型神经毒素-氨基酸残基(A449-K871)
肉毒毒素B型神经毒素-氨基酸残基(A442-S858)
肉毒毒素C型神经毒素-氨基酸残基(T450-N866)
肉毒毒素D型神经毒素-氨基酸残基(D446-N862)
肉毒毒素E型神经毒素-氨基酸残基(K423-K845)
肉毒毒素F型神经毒素-氨基酸残基(A440-K864)
肉毒毒素G型神经毒素-氨基酸残基(S447-S863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(S458-V879)
适合的易位结构域另外的实例详细描述在WO2007/106115中,将该文献完整地并入本文参考。
在本发明的上下文中,包含易位结构域的各种梭菌毒素HN区可以用于本发明的各方面,条件是这些活性片段可以促进非细胞毒性蛋白酶(例如梭菌L-链)从胞内囊泡释放入靶细胞的细胞质,且由此参与执行全部细胞机制,由此梭菌毒素以蛋白水解方式裂解底物。来自梭菌毒素的重链的HN区约为410-430个氨基酸长度且包含易位结构域。研究已经证实来自梭菌毒素重链的全长HN区并非易位结构域的易位活性所必需。因此,该实施方案的各方面可以包括包含易位结构域的梭菌毒素HN区,所述易位结构域具有例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸和至少425个氨基酸长度。该实施方案的其它方面可以包括包含易位结构域的梭菌毒素HN区,所述易位结构域具有例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸和至多425个氨基酸长度。
对于有关肉毒梭菌和破伤风梭菌中毒素产生的遗传基础的进一步详细描述,我们参照Henderson等人(1997)TheClostridia:MolecularBiologyandPathogenesis,学术出版社。
术语HN包括天然存在的神经毒素HN部分,和具有在天然和/或合成氨基酸残基中不出现的氨基酸序列的修饰的HN部分,只要修饰的HN部分仍然显示上述举出的易位功能。
或者,易位结构域可以是非梭菌来源。非梭菌(参比)易位结构域来源的实例包括但不限于白喉毒素易位结构域[O=Keefe等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89,6202-6206;Silverman等人,J.Biol.Chem.(1993)269,22524-22532;和London,E.(1992)Biochem.Biophys.Acta.,1112,pp.25-51]、假单胞菌(Pseudomonus)外毒素A型易位结构域[Prior等人Biochemistry(1992)31,3555-3559]、炭疽毒素易位结构域[Blanke等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93,8437-8442]、具有易位功能的各种融合或疏水性肽类[Plank等人J.Biol.Chem.(1994)269,12918-12924;和Wagner等人(1992)PNAS,89,pp.7934-7938]和两亲性肽类[Murata等人(1992)Biochem.,31,pp.1986-1992]。易位结构域可以反映出天然存在的蛋白质中存在的易位结构域,或可以包括氨基酸改变,只要这些改变不会破坏易位结构域的易位能力。
适用于本发明的病毒(参比)易位结构域的具体实例包括一些病毒表达的膜融合蛋白的易位结构域。例如,Wagner等人(1992)和Murata等人(1992)描述了衍生自流感病毒血细胞凝集素的N-末端区的众多融合和两亲性肽类的易位(即膜融合和囊泡化)功能。已知具有期望易位活性的其它病毒表达的膜融合蛋白是西门利克森林病毒(SemlikiForestVirus/SFV)的融合肽的易位结构域、水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的易位结构域、SER病毒F蛋白的易位结构域和泡沫病毒包膜糖蛋白的易位结构域。病毒编码的Aspike蛋白在本发明的上下文中具有特定的应用,例如,SFV的E1蛋白和VSV的G蛋白的G蛋白。
(下)表中列出的(参比)易位结构域的应用包括其序列变体的应用。变体可以包含一个或多个保守核酸取代和/或核酸缺失或插入,条件是该变体具有必需的易位功能。变体还可以包含一个或多个氨基酸取代和/或氨基酸缺失或插入,只要该变体具有必需的易位功能。
本发明的多肽类还可以包含易位促进结构域。所述结构域促进将非细胞毒性蛋白酶递送入靶细胞的胞质溶胶且描述在例如WO08/008803和WO08/008805中,将这些文献各自并入本文参考。
作为实例,适合的易位促进结构域包括有包膜的病毒融合肽结构域,例如,适合的融合肽结构域包括流感病毒融合肽结构域(例如23个氨基酸的流感病毒A型融合肽结构域)、甲病毒属融合肽结构域(例如26个氨基酸的西门利克森林病毒融合肽结构域)、水泡性病毒融合肽结构域(例如21个氨基酸的水泡性口炎病毒融合肽结构域)、呼吸系病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的仙台病毒融合肽结构域)、麻疹病毒属(morbiliivirus)融合肽结构域(例如25个氨基酸的犬瘟热病毒融合肽结构域)、avulavirus融合肽结构域(例如25个氨基酸的新城疫(Newcastledisease)病毒融合肽结构域)、亨尼波病毒(henipavirus)融合肽结构域(例如25个氨基酸的亨德拉病毒(Hendravirus)融合肽结构域)、变型肺病毒(metapneumovirus)融合肽结构域(例如25个氨基酸的人变型肺病毒融合肽结构域)或泡沫病毒属(spumavirus)融合肽结构域,例如猴泡沫病毒(simianfoamyvirus)融合肽结构域或其片段或变体。
作为另一个实例,易位促进结构域可以包含梭菌毒素HCN结构域或其片段或变体。更具体地,促进梭菌毒素HCN易位的结构域可以具有至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸长度。在这方面,促进梭菌毒素HCN易位的结构域优选至多200个氨基酸、至多225个氨基酸、至多250个氨基酸或至多275个氨基酸长度。具体(参比)实例包括:
肉毒毒素A型神经毒素-氨基酸残基(872-1110)
肉毒毒素B型神经毒素-氨基酸残基(859-1097)
肉毒毒素C型神经毒素-氨基酸残基(867-1111)
肉毒毒素D型神经毒素-氨基酸残基(863-1098)
肉毒毒素E型神经毒素-氨基酸残基(846-1085)
肉毒毒素F型神经毒素-氨基酸残基(865-1105)
肉毒毒素G型神经毒素-氨基酸残基(864-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(880-1127)
上述序列位置可以根据血清型/亚型的不同稍有改变,且适合的(参比)梭菌毒素HCN结构域的另外的实例包括:
肉毒毒素A型神经毒素-氨基酸残基(874-1110)
肉毒毒素B型神经毒素-氨基酸残基(861-1097)
肉毒毒素C型神经毒素-氨基酸残基(869-1111)
肉毒毒素D型神经毒素-氨基酸残基(865-1098)
肉毒毒素E型神经毒素-氨基酸残基(848-1085)
肉毒毒素F型神经毒素-氨基酸残基(867-1105)
肉毒毒素G型神经毒素-氨基酸残基(866-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(882-1127)
任意上述促进结构域可以与任意上述适用于本发明的易位结构域肽类合并。因此,作为实例,可以将非梭菌促进结构域与非梭菌易位结构域肽或梭菌易位结构域肽合并。或者,梭菌毒素HCN易位促进结构域可以与非梭菌易位结构域肽合并。或者,梭菌毒素HCN促进结构域可以组合或与梭菌易位结构域肽合并,其实例包括:
肉毒毒素A型神经毒素-氨基酸残基(449-1110)
肉毒毒素B型神经毒素-氨基酸残基(442-1097)
肉毒毒素C型神经毒素-氨基酸残基(450-1111)
肉毒毒素D型神经毒素-氨基酸残基(446-1098)
肉毒毒素E型神经毒素-氨基酸残基(423-1085)
肉毒毒素F型神经毒素-氨基酸残基(440-1105)
肉毒毒素G型神经毒素-氨基酸残基(447-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-1127)
序列同源性
各种序列对比方法的任意一种都可以用于测定同一性百分比,包括但不限于通用方法、局部方法和杂交方法,例如片段接近法(segmentapproachmethod)。用于测定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规方法。通用方法从分子开始到结束比较序列,并且通过合计各个残基对的评分和利用空位罚分确定最佳序列排列。非限制性方法包括例如CLUSTALW,参见例如JulieD.Thompson等人,CLUSTALW:ImprovingtheSensitivityofProgressiveMultipleSequenceAlignmentThroughSequenceWeighting,Position-SpecificGapPenaltiesandWeightMatrixChoice,22(22)NucleicAcidsResearch4673-4680(1994);和迭代精制,参见例如OsamuGotoh,SignificantImprovementinAccuracyofMultipleProtein.SequenceAlignmentsbyIterativeRefinementasAssessedbyReferencetoStructuralAlignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定由所有输入序列共有的一个或多个保守基序对比序列。非限制性方法包括例如Match-盒,参见例如EricDepiereuxandErnestFeytmans,Match-Box:AFundamentallyNewAlgorithmfortheSimultaneousAlignmentofSeveralProteinSequences,8(5)CABIOS501-509(1992);Gibbs采样,参见例如C.E.Lawrence等人,DetectingSubtleSequenceSignals:AGibbsSamplingStrategyforMultipleAlignment,262(5131)Science208-214(1993);Align-M,参见例如voVanWaIIe等人,Align-M-ANewAlgorithmforMultipleAlignmentofHighlyDivergentSequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。
因此,通过常规方法测定序列同一性百分比。参见例如Altschul等人,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986和Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-19,1992。简言之,将两个氨基酸序列进行序列对比,以便使用如下所示的Henikoff和Henikoff(同前)的空位开放罚分10、空位伸展罚分1和“blosum62”评分矩阵来优化序列对比评分(氨基酸用标准单字母码表示)。
用于测定序列同一性的序列对比评分
然后将同一性百分比计算为:
同一性匹配总数
__________________________________________x100
[较长序列长度+导入较长序列、以对两种序列进行序列对比的缺口数量]
将基本上同源的多肽类表征为具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些改变优选具有较少的属性,即保守氨基酸取代(参见下文)和不会显著影响多肽折叠或活性的其它取代;小的缺失,典型地1-约30个氨基酸;和小的氨基-或羧基-末端伸展例如氨基-末端甲硫氨酸残基、至多约20-25个残基的小的连接肽或亲和标记。
保守氨基酸取代
碱性:精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性:谷氨酸
天冬氨酸
极性:谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性:亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香性:苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小:甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除20个标准氨基酸外,非标准氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α–甲基丝氨酸)可以取代本发明多肽类的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸即不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代梭菌多肽氨基酸残基。本发明的多肽类还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌可酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域已知用于将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质的几种方法。例如,可以使用体外系统,其中使用化学氨基酰化抑制剂tRNAs抑制无义突变。用于合成氨基酸和使tRNA氨基酰化的方法是本领域公知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译在包含大肠杆菌S30提取物和商购酶和其它试剂的无细胞系统中进行。通过色谱法纯化蛋白质。参见例如Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991;Ellman等人,MethodsEnzymol.202:301,1991;Chung等人,Science259:806-9,1993;和Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10145-9,1993)。在第二种方法中,翻译在爪蟾卵(Xenopusoocytes)中通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化抑制剂tRNAs来进行(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中,在没有被替代的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)的存在下和有期望非天然存在的氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的存在下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸掺入多肽替代其天然副本。参见Koide等人,Biochem.33:7470-6,1994。可以通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化为非天然存在的种类。可以将化学修饰与定点诱变合并,以进一步扩展取代范围(Wynn和Richards,ProteinSci.2:395-403,1993)。
有限数量的非保守氨基酸、未被遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以替代本发明多肽类的氨基酸残基。
可以根据本领域公知的方法鉴定本发明多肽类中的必需氨基酸,例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,Science244:1081-5,1989)。还可以通过对结构进行物理分析确定生物相互作用位点,正如通过例如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记这类技术与推定接触位点氨基酸突变组合所测定的。参见例如deVos等人,Science255:306-12,1992;Smith等人,J.Mol.Biol.224:899-904,1992;Wlodaver等人,FEBSLett.309:59-64,1992。还可以从与本发明多肽相关成分的同一性分析中推定必需氨基酸的身份(例如易位或蛋白酶成分)。
可以使用已知的诱变和筛选方法、例如Reidhaar-Olson和Sauer(Science241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-6,1989)所公开的那些进行和测试多个氨基酸取代。简言之,这些作者公开了用于同时随机选择多肽中的两个或多个位置、选择功能性多肽且然后对诱变多肽类测序的方法,以便测定每个位置上允许的取代谱。可以使用的其它方法包括噬菌体展示(例如Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991;Ladner等人,美国专利US5,223,409;Huse,WIPO公开号WO92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,Gene46:145,1986;Ner等人,DNA7:127,1988)。
可以使用已知的诱变和筛选方法、例如Reidhaar-Olson和Sauer(Science241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-6,1989)所公开的那些进行和测试多个氨基酸取代。简言之,这些作者公开了用于同时随机选择多肽中的两个或多个位置、选择功能性多肽且然后对诱变的多肽类测序的方法,以便测定每个位置上允许的取代谱。可以使用的其它方法包括噬菌体展示(例如Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991;Ladner等人,美国专利US5,223,409;Huse,WIPO公开号WO92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,Gene46:145,1986;Ner等人,DNA7:127,1988)。
实施例
制备用于对患有瘙痒的患者施用的多肽,提供用于抑制或治疗瘙痒的方法。正如本发明中定义的,所制备的多肽的靶向部分(TM)成分结合于存在于瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上的G-蛋白偶联受体。此后,易位成分影响多肽的非细胞毒性蛋白酶成分的转运,一旦进入瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器内部,则抑制神经递质从其中分泌。因此,所述多肽降低神经递质水平并且能够抑制或治疗瘙痒。
实施例1
一位35岁的女性乳腺癌患者因治疗其恶性肿瘤的药物反应而患有虚弱型慢性瘙痒。治疗通过皮下注射0.025mg/kg包含BAM8-22配体的本发明多肽来进行(每周注射1次,历时6个月),导致瘙痒感减轻且健康明显改善。该患者报告瘙痒有效地得到缓解。
实施例2
一位60岁的男性患者报告慢性瘙痒且呈现可归因于肾病的严重情况。通过腹腔镜十二指肠注射施用0.07mg/kg包含SLIGRL-NH2肽的本发明的多肽的胃肠外混悬液(每6个月注射1次的方案)。在治疗的第一个月内报告积极的效果,包括瘙痒减轻。
实施例3
一位具有银屑病家族史的37岁男性患者患有对其身体健康和生活质量产生显著影响的慢性瘙痒。通过静脉内施用0.09mg/kg包含γ2-促黑激素(γ2-MSH)肽的本发明多肽的每周剂量。该患者在治疗期间报告银屑病的严重性减轻且无进一步的瘙痒感觉。
实施例4
一位患有严重慢性瘙痒的45岁HIV患者近期被诊断为带状疱疹(shingles),即一种具有通常包括极端发痒感觉的症状的疾病。在多次痛苦的搔抓过夜不眠后,她被开据每个月静脉内注射0.05mg/kg包含氯喹(CQ)的本发明多肽的处方。该患者报告恢复率改善,且在3个月治疗后无进一步的瘙痒感觉。
实施例5
一位6岁特应性湿疹女性患者被开据每个月口服剂量0.1mg/kg包含组胺HT1的本发明多肽包囊制剂的处方。该患者在治疗后报告其病情改善,并且在膝盖后皮肤的发红区域消失。
实施例6
一位具有Jorgen综合征的17岁男性报告其眼睛中瘙痒和四肢皮疹症状。临床医师开据0.001mg/kg(每8周局部腹腔镜注射1次)的包含血清素的本发明多肽的处方。2个月后,该患者报告不适感明显减轻。
实施例7
一位18岁女性患者在去非洲休假后被诊断为丘疹性荨麻疹(papularurticaria)。她给临床医师呈现众多暴露区域的损害,特别是下肢,还有臂、面颊和腰围。丘疹和炎症后疤痕明显。自诊断起,该患者经历较差的整体生活质量。给予该患者每个月注射1次0.07mg/kg本发明的多肽以治疗其瘙痒,本发明的多肽包含终止于NPFF/Y-G或RF/Y-酰胺中的神经肽类。在6个月治疗方案期间,该患者报告无进一步的瘙痒感觉。
实施例8
一位具有皮肤B细胞淋巴瘤的59岁男性患者随后发生红疹和干性皮肤,具有的严重性瘙痒覆盖约80%的身体。患者的临床医师开据0.1mg/kg包含辣椒素的本发明多肽,每3个月通过腹腔镜十二指肠注射施用。在一个治疗剂量后,患者报告无进一步瘙痒。
实施例9
一位具有妊娠性多形疹(PEP)的34岁女性患者呈现严重性瘙痒,形式为具有风疹块的疹子和其下腹部和肢体皮肤的大片发炎区域。通过在其皮肤表面上施用粘着性贴剂治疗该患者,在2周期限内通过从贴剂中缓慢扩散递送包含皮质抑素的本发明多肽。直至12周结束时报告瘙痒感觉消失时,取下透皮贴剂。
动物模型实施例
将本发明的多肽类作为瘙痒治疗剂测试,通过使用如本文所述的瘙痒诱发的特应性皮炎(AD)小鼠模型来进行。如下所示例,BALB/c和C57BL/6小鼠品系同样适合。
实施例10
通过用卵白蛋白反复表皮(EC)致敏胶带剥皮(tape-stripped)皮肤来诱发瘙痒的BALB/c小鼠模型。刮净小鼠背部皮肤并且用3M胶带粘贴剥离6次,模拟具有特应性皮炎(AD)患者中由搔抓导致的皮肤损伤。将在100μl生理盐水中的100μgOVA置于1×1cm无菌纱布贴剂上,将其用透明生物封闭性绷带固定在皮肤上。这确保抗原不会被舔食。每只小鼠总计具有3个1周暴露期于同一部位的贴剂,其彼此之间有2周的间隔。EC致敏的小鼠发生搔抓行为增加且其皮肤发生特征在于表皮和真皮增厚的损害。
在1h间隔以1mg/ml的浓度通过皮内(i.d)将本发明的多肽施用入颈后部。使用注射PBS作为对照。
通过比较计数用本发明多肽治疗前与治疗后相比的搔抓“发作”次数,来擦亮“瘙痒”。将搔抓发作定义为使用后爪在注射部位周围区域上(即颈后部)3次或以上个体快速搔抓运动。结果显示使用本发明的多肽治疗后搔爪明显减少。
实施例11
使BABL/c小鼠进行重组螨过敏原Derp8的EC施用,并且显示具有表皮增生和棘细胞层水肿(spongiosis)的皮炎特征。如上所述施用本发明的多肽。观察结果与使用OVAEC致敏的模型中观察到的那些结果类似,即在使用本发明的多肽治疗后注意到搔抓明显减少。
实施例12
使BABL/c小鼠暴露于金黄色葡萄球菌感染,已知其恶化AD症状并且导致皮肤损害。施用本发明多肽的结果显示:使用本发明多肽治疗的受试者与对照小鼠相比搔抓水平明显降低。这些结果证明了本发明多肽类在治疗瘙痒中的应用。
Claims (12)
1.用于抑制或治疗瘙痒的多肽,其中该多肽包含:
(i)非细胞毒性蛋白酶,该蛋白酶能够裂解瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器中的SNARE蛋白;
(ii)能够结合于瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上的结合位点的靶向部分(TM),所述结合位点能够经历胞吞作用而被并入至瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器内的内体,且其中所述瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器表达所述SNARE蛋白;和
(iii)能够使来自内体内的蛋白酶易位、通过内体膜并且进入瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的胞质溶胶的易位结构域;
条件是该多肽不是梭菌神经毒素(全毒素)分子。
2.根据权利要求1所用的多肽,其中TM结合至Mas-相关G蛋白-偶联受体(Mrgpr)。
3.根据权利要求1或2所用的多肽,其中TM结合至选自MrgprX、MrgprA或MrgprC的受体或其受体类似物。
4.根据上述权利要求任一项所用的多肽,其中TM选自:牛肾上腺髓质(BAM)肽、促黑激素肽(MSH)、终止于Y-G/Y-酰胺中的神经肽类、氯喹(CQ)、包含SLIGRL-NH2的肽、组胺、血清素、辣椒素、皮质抑素或其截短物或肽类似物。
5.根据上述权利要求任一项所用的多肽,其中TM选自:BAM8-22、γ2-MSH、SLIGRL、NPAF、NPFF、氯喹(CQ)、组胺或血清素、辣椒素、皮质抑素或其截短物或肽类似物。
6.根据上述权利要求任一项所用的多肽,其中TM结合至MrgprX1受体。
7.根据上述权利要求任一项所用的多肽,其中TM是BAM8-22肽或其截短物或肽类似物。
8.根据上述权利要求任一项所用的多肽,其中所述非细胞毒性蛋白酶包含梭菌神经毒素L-链或IgA蛋白酶。
9.根据上述权利要求任一项所用的多肽,其中所述易位结构域包含梭菌神经毒素易位结构域。
10.编码上述权利要求任一项的多肽的核酸。
11.抑制或治疗患者的瘙痒的方法,包括对该患者施用有效量的上述权利要求任一项的多肽或核酸。
12.多肽,包含:
(i)非细胞毒性蛋白酶,该蛋白酶能够裂解瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器中的SNARE蛋白;
(ii)能够结合于瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器上的结合位点的靶向部分(TM),所述结合位点能够经历胞吞作用而被并入至瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器内的内体,且其中所述瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器表达所述SNARE蛋白;和
(iii)能够使来自内体内的蛋白酶易位、通过内体膜并且进入瘙痒-特异性DRG神经元或痒觉感受器的胞质溶胶的易位结构域;
条件是该多肽不是梭菌神经毒素(全毒素)分子,且其中TM选自:牛肾上腺髓质(BAM)肽、促黑激素肽(MSH)、终止于Y-G/Y-酰胺中的神经肽类、氯喹(CQ)、包含SLIGRL-NH2的肽、组胺、血清素、辣椒素、皮质抑素或其截短物或肽类似物。
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