TWI817872B - 神經障礙之治療 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種使用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含：(a)具有與SEQ ID NO：63、61、44或42具有至少90%序列同一性的多肽序列；及/或(b)經與SEQ ID NO：43、60或41具有至少90%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。亦提供另外的使用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之多肽，以及對應的方法及用途。

Description

神經障礙之治療
本發明係關於神經障礙之治療。
神經障礙包括神經元損傷、神經退化性疾病、感覺障礙、及自主神經系統障礙。
神經元損傷，諸如脊椎損傷(SCI)，會導致損傷的軸突變性，而防止正常的感覺、運動及自主神經功能。藉由內源性機制可發生恢復，此等機制諸如損傷的軸突之再生及未受損軸突的側枝發芽，造成失神經性標的(denervated targets)的神經再支配(reinnervation)。然而，在成年哺乳動物中，受損傷的神經元(尤其是脊髓)的再生能力受到限制，並且病患可能罹患各種失能，其極大地影響生活品質。
神經元損傷的習用療法包括介白素-6(IL-6)及幹細胞移植，然而很少有處於臨床使用的開發階段。因此，仍有需要能夠促進神經元生長或修復的神經元損傷之治療劑。
梭狀芽孢桿菌( Clostridia)屬中的細菌產生極高強效且特異性的蛋白質毒素，其可毒害被遞送至之神經元及其它細胞。此種梭狀芽孢桿菌毒素之例包括破傷風桿菌( C. tetani)(TeNT)及肉毒桿菌( C. botulinum)(BoNT)血清型A-G及X(參見WO 2018/009903 A2)所產生的神經毒素，以及由巴氏梭狀芽孢桿菌( C. baratii)及酪酸梭狀芽孢桿菌( C. butyricum)所產生者。
於梭狀芽孢桿菌神經毒素中有一些為已知最強效的毒素。舉例而言，肉毒桿菌神經毒素視其血清型而定，對於小鼠具有範圍從0.5至5 ng/kg之半致死劑量(LD 50)值。破傷風及肉毒桿菌毒素兩者係藉由抑制受影響之神經元的功能而作用，特別是神經傳導物的釋放。而肉毒桿菌毒素作用於神經肌肉會合處並在周圍神經系統中抑制膽鹼性傳導(cholinergic transmission)，破傷風毒素則作用於中樞神經系統。
自然界中，梭狀芽孢桿菌神經毒素係以單鏈多肽的方式被合成，其係藉由蛋白酶切割事件進行轉譯後修飾，而形成藉由雙硫鍵連結在一起的兩條多肽鏈。切割發生於特定切割位，通常稱為活化位(activation site)，其位於提供鏈間(inter- chain)雙硫鍵之半胱胺酸殘基之間。其為此種雙鏈型，為此毒素之最活性的型式。此兩條鏈被稱為重鏈(H-鏈)，其具有大約100kDa之分子量；及輕鏈(L-鏈)，其具有大約50kDa之分子量。此H-鏈包含N-端轉位組分(H N域)及C-端目標組分(H C域)。切割位係位於L-鏈及轉位域組分之間。於H C域結合至其目標神經元且所結合的毒素經由胞內體(endosome)內化至細胞中後，H N域將L-鏈轉位通過胞內體膜並進入細胞質液內，且L-鏈提供一種蛋白酶功能(亦已知為非細胞毒性(non-cytotoxic)蛋白酶)。
非細胞毒性蛋白酶係藉由將已知為SNARE蛋白質(例如，SNAP-25、VAMP、或突觸融合蛋白(Syntaxin))之細胞內運輸蛋白進行蛋白酶切割而作用。首字母縮略詞SNARE衍生自可溶性NSF附著受體( Soluble NSF Attachment Receptor)一詞，其中NSF意指N-乙基馬來醯亞胺-敏感性因子( N-ethylmaleimide- Sensitive Factor)。SNARE蛋白質對於細胞內囊泡融合為不可或缺的，因此對於自細胞經由囊泡運輸之分子分泌為不可或缺的。此蛋白酶功能為鋅依賴型內肽酶活性且展現對SNARE蛋白質之高受質特異性。因此，一旦被遞送至所欲標的細胞，此非細胞毒性蛋白酶能夠抑制自標的細胞的細胞分泌。梭狀芽孢桿菌神經毒素之L-鏈蛋白酶係切割SNARE蛋白質之非細胞毒性蛋白酶。
鑒於SNARE蛋白質之普遍存在的性質，梭狀芽孢桿菌神經毒素諸如肉毒桿菌毒素已被成功地運用在廣泛的療法中。
WO 2016/170501 A1描述具有催化活性的全長BoNT/A(包含L-鏈及完整H-鏈(包括H N及H C域))於治療脊髓損傷引起的麻痺中的用途。WO 2016/170501 A1教示BoNT/A的每個域(domain)對於所觀察到的治療效果為必要，包括H-鏈結合及轉位能力以及L-鏈非細胞毒性蛋白酶活性。如上述，全長梭狀芽孢桿菌神經毒素為極強效，處理該毒素時必須採用特定的安全措施。此外，毒素從目標組織中擴散出來被認為是造成不良副作用的原因，於極端情況下可能危及生命。當以高的劑量、濃度及注射量使用梭狀芽孢桿菌神經毒素治療劑(諸如BoNT治療劑)時，此可為一特別值得關注的問題。商業化的BoNT/A療法已報導與此問題相關的不良反應，包括衰弱、全身性肌肉無力、複視、上瞼下垂、吞嚥困難、發聲障礙(dysphonia)、構音障礙(dysarthria)、尿失禁、及呼吸困難。吞嚥及呼吸困難可能危及生命，且據報導死亡與毒素效應的擴展有關。因此，需要用於促進神經元生長或修復之更安全的治療劑。
鑒於它們的大小，全長梭狀芽孢桿菌神經毒素(~150 kDa)或其完整的H-鏈(~100 kDa)之使用與於用該多肽治療的受試者中引發免疫反應的風險增加相關。此外，整個H-鏈(特別是H C域)的存在造成多肽與梭狀芽孢桿菌神經毒素目標受體結合，其可能與投予該多肽的受試者的有害的脫靶作用有關。
本發明克服上述問題之一或多者。
本發明人等驚訝地發現一種包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈的片段之多肽(例如，轉位域(H N)或受體結合域(H C))促進神經元生長或修復，如此發現治療神經障礙的功用。有利地，其使得能使用梭狀芽孢桿菌神經毒素的無毒性(或實質上無毒性)片段，考慮到較小尺寸(與全長H-鏈或全長梭狀芽孢桿菌神經毒素相比)，在投予該片段的受試者中比較不可能引起免疫反應。此外，該無毒性(或實質上無毒性)片段較全長梭狀芽孢桿菌神經毒素於製造上較不昂貴及/或較不複雜。此外，較全長梭狀芽孢桿菌毒素，無毒性(或實質上無毒性)片段構成更定義明確的治療學，考慮到較短長度的多肽，有例如域間的半胱胺酸重排(shuffling)減少的可能性。
如此，於一態樣中，本發明提供一種用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含： 梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L-鏈)或其片段；及/或 梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈(H-鏈)之片段。
於一相關態樣中，提供一種用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含： 梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段；及/或 梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段。
於另一態樣中，提供一種多肽於製造用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙的藥物之用途，其中該多肽包含： 梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段；及/或 梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段。
於一態樣中，本發明提供一種用於治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含： 梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L-鏈)或其片段；及/或 梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈(H-鏈)之片段。
於一相關態樣中，提供一種治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含： 梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段；及/或 梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段。
於另一態樣中，提供一種多肽於製造用於治療受試者中的神經障礙的藥物之用途，其中該多肽包含： 梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段；及/或 梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段。
於一具體實施例，本發明之多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈。其較佳為該L-鏈為催化性不活化的。
如此，於一態樣中，本發明提供一種使用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈。
於一相關態樣中，本發明提供一種用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈。
於另一相關態樣本發明提供一種包含催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之多肽於製造用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙的藥物之用途。
於一態樣中，本發明提供一種用於治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈。
於一相關態樣中，本發明提供一種治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈。
於另一相關態樣，本發明提供一種包含催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之多肽於製造用於治療受試者中的神經障礙的藥物之用途。
本發明人等首次呈示梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之催化活性對於促進神經元生長或神經元修復並非必須的。如此，本發明允許提供更安全(毒性較小)的治療劑。
活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈具有非細胞毒性蛋白酶活性。具體而言，活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈具有內肽酶活性且能夠在目標細胞中切割胞外融合裝置的蛋白質。胞外融合裝置的蛋白質較佳為SNARE蛋白質，諸如SNAP-25、突觸小泡蛋白(synaptobrevin)/VAMP、或突觸融合蛋白。
如本文中關於梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈而使用之術語「催化性不活化」，意指該L-鏈實質上無展現非細胞毒性蛋白酶活性，較佳地，如本文中關於梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈而使用之術語「催化性不活化」，意指該L-鏈無展現非細胞毒性蛋白酶活性。於一具體實施例，催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為不切割目標細胞中胞外融合裝置之蛋白質者。術語「實質上無非細胞毒性蛋白酶活性」意指梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈具有少於5%之非細胞毒性蛋白酶活性之催化活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈，例如少於2%、1%或較佳少於0.1%之非細胞毒性蛋白酶活性之催化活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈。藉由將試驗梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈與SNARE蛋白質一起培育並比較經催化活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈切割的SNARE蛋白質的量，當與於相同條件下與經催化活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈切割的SNARE蛋白質的量比較，可於活體外確定非細胞毒性蛋白酶活性。可使用常規技術，諸如SDS-PAGE及西方印漬術(Western blotting)以定量經SNARE 蛋白質切割的量。適合的活體外試驗述於WO 2019/145577 A1，其藉由引用併入本文中。
基於細胞且為活體內的試驗亦可用於確定是否包含L-鏈及功能性細胞結合與轉位域之梭狀芽孢桿菌神經毒素具有非細胞毒性蛋白酶活性。諸如趾外展評分(Digit Abduction Score)(DAS)之試驗、背根神經節(DRG)試驗、脊髓神經元(SCN)試驗、及小鼠中膈神經偏側橫膈(PNHD)試驗在本領域中為常規試驗。用於確定非細胞毒性蛋白酶活性之適合試驗可為述於Donald et al(2018)，Pharmacol Res Perspect，e00446，1-14之一者，其藉由引用併入本文中。
催化性不活化的L-鏈可具有不活化該催化活性的一或多個突變。例如，催化性不活化的BoNT/A L-鏈可包含一活性位殘基的突變，諸如His223、Glu224、His227、Glu262、及/或Tyr366。此位置編號對應SEQ ID NO：62之胺基酸位置且可由與具SEQ ID NO：62之多肽比對而確定。由於SEQ ID NO：62之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為可任選的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具通常知識者將考量該甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：62包括甲硫胺酸時，位置編號基如上定義(例如，His223將為SEQ ID NO：62之His223)。或者，於SEQ ID NO：62不存在該甲硫胺酸時，胺基酸殘基編號應以-1修飾(例如，His223將為SEQ ID NO：62之His222)。當本文所述其它多肽序列之位置1上的甲硫胺酸存在/不存在時，適用相似考量，使用此項技術領域中的常規技術，所屬技術領域中具通常知識者將可輕易決定正確的胺基酸殘基編號。
於一特佳具體實施例中，本發明之多肽可包含經修飾的BoNT/A或其片段(較佳為BoNT/A H C域或其片段)。此經修飾的BoNT/A或其片段可為於一或多個胺基酸殘基包含修飾者，該胺基酸殘基選自：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277。與使用之已知的BoNT/A相比，此種經修飾的BoNT/A或其片段可證實副作用的減少或不存在。與已知的梭狀芽孢桿菌毒素治療劑相比，本發明之經修飾的BoNT/A之增加的組織保留性亦可以提供增加的效力及/或作用持續時間，且可允許減少劑量而被使用(或增加劑量而沒有任何其它複作用)，如此提供進一步的益處。
當與如SEQ ID NO：62所示的未經修飾的BoNT/A比較時，此修飾可為一種修飾，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：62比對而決定。由於SEQ ID NO：62(以及本文所述之對應經修飾的BoNT/A多肽或其片段的SEQ ID NO)之位置1上的甲硫胺酸殘基的存在為選擇性的，當決定胺基酸殘基編號時所屬技術領域中具通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：62包括甲硫胺酸處，位置編號將如上述定義(例如，ASN 886將為SEQ ID NO：62之ASN 886)。或者，於SEQ ID NO：2中不存在甲硫胺酸處，胺基酸殘基編號應為以-1修飾(例如，ASN 886將為SEQ ID NO：62之ASN 885)。當存在/不存在本文所述的其它多肽序列的位置1處的甲硫胺酸時，適用類似的考慮，所屬技術領域中具通常知識者將使用本領域常規技術而容易決定正確胺基酸殘基編號。
上述指出用於修飾的胺基酸殘基為表面暴露的胺基酸殘基。
經修飾的BoNT/A或其片段可包含一或多個選自下列胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274及THR 1277。
當使用於經修飾的BoNT/A或其片段之上下文，術語「一或多個胺基酸殘基」較佳意指所指胺基酸殘基之至少2、3、4、5、6或7個。如此，經修飾的BoNT/A可包含所指胺基酸殘基之至少2、3、4、5、6或7(較佳為7)個修飾。經修飾的BoNT/A或其片段可包含1-30、3-20、或5-10個胺基酸修飾。更佳地，當使用於經修飾的BoNT/A或其片段之上下文，術語「一或多個胺基酸殘基」意指所指之所有胺基酸殘基。
較佳地，當與SEQ ID NO：62相比時，除了於所指胺基酸殘基之一或多個胺基酸修飾外，經修飾的BoNT/A或其片段不含有任何另外的胺基酸修飾。
此修飾可選自： i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii.以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii.以鹼性胺基酸殘基取代未帶電表面暴露的胺基酸殘基； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
與對應的未經修飾的BoNT/A或其片段相比，上述所指修飾造成經修飾的BoNT/A或其片段具有增加的正表面電荷及增加的等電點。
等電點(pI)為所指蛋白質的特定性質。如本領域周知，蛋白質係由特定的胺基酸序列製得(於蛋白質中亦稱為胺基酸殘基)。標準的20個胺基酸組中的每個胺基酸均具有不同的側鏈(或R基團)，此意味著蛋白質中的每個胺基酸殘基均顯示不同的化學性質，例如電荷及疏水性。此等性質可能會受到周圍化學環境諸如溫度及pH的影響。蛋白質的整體化學特徵將取決於此等因素的總和。
某些胺基酸殘基(詳述於下)具有可離子化的側鏈，取決於周圍的pH值，此等側鏈可能會顯示出電荷。此種側鏈在規定的pH下是否帶電取決於相關的可離子化的基團的pKa，其中pKa是特定質子與共軛鹼的酸解離常數(Ka)的負對數。
例如，酸性殘基諸如天冬胺酸及麩胺酸具有大約4.1之pKa值之側鏈羧酸基(精確的pKa值可能取決於溫度、離子強度及可離子化的基團的微環境)。如此，此等側鏈於pH 7.4(通常稱為「生理pH」)下顯示負電荷。於低pH值下，此等側鏈成為被質子化並失去其電荷。
相反地，鹼性殘基諸如離胺酸及精胺酸具有pKa值大約為10-12的含氮側鏈基。因此，此等側鏈於pH值為7.4時顯示正電荷。此等側鏈於高pH值下會去質子化並失去其電荷。
因此，蛋白質分子的總(淨)電荷取決於蛋白質中存在的酸性及鹼性殘基的數量(及其表面暴露程度)和周圍的pH值。改變周圍的pH值會改變蛋白質的總電荷。因此，對於每種蛋白質，皆有一規定的pH，於該pH下，正電荷和負電荷的數量相等且蛋白質不顯示總體淨電荷。該點已知為等電點(pI)。該等電點為蛋白質生物化學中所屬技術領域中具通常知識者熟悉的標準概念。
因此，等電點(pI)定義為顯示蛋白質的淨電荷為零的pH值。pI的增加意指蛋白質需要更高的pH值才能顯示出零的淨電荷。如此，pI的增加表示蛋白質在規定pH值下的淨正電荷增加。相反地，pI的降低意指該蛋白質需要較低的pH值才能顯示出零的淨電荷。如此，pI的降低表示蛋白質在規定pH下的淨正電荷的降低。
決定蛋白質的pI的方法為本領域已知，且對於所屬技術領域中具通常知識者而言為熟悉的。例如，可以從蛋白質中存在的每個胺基酸的平均pKa值計算蛋白質的pI(「計算的pI」)。可使用本領域已知的計算機程式(例如來自ExPASy的Compute pI/MW Tool(https：//web.expasy.org/compute_pi/))執行此種計算，其為根據本發明計算pI的較佳方法。應使用相同的計算技術/程式對不同分子之間的pI值進行比較。
在適當的情況下，可以使用等電聚焦技術經實驗確定蛋白質的計算出的pI(「觀察到的pI」)。此技術使用電泳根據其pI將蛋白質分離。等電聚焦通常使用具有固定pH梯度的凝膠進行。當施加電場時，蛋白質會通過pH梯度遷移，直到達到其淨電荷為零的pH為止，此點為蛋白質的pI。等電聚焦提供的結果通常本質上為相對低的分辨率，因此，本發明人認為由計算出的pI(如上所述)提供的結果更適合使用。
於本說明書全文中，除非另有說明，「pI」意指「計算的pI」。
蛋白質的pI可藉由改變其表面上顯示的鹼性及/或酸性基團的數量來增加或減少。此可藉由修飾此蛋白質之一或多個胺基酸而達成。例如，可藉由減少酸性殘基的數目或藉由增加鹼性殘基的數目而提供pI的增加。
本發明之經修飾的BoNT/A或其片段可具有下述pI值，其係比未經修飾的BoNT/A(例如SEQ ID NO：62)或其片段的pI值高於至少0.2、0.4、0.5或1 pI單位。較佳，經修飾的BoNT/A或其片段可具有至少6.6，例如至少6.8之pI。
下表中列出20種標準胺基酸之性質：
胺基酸 側鏈
天冬胺酸 Asp D 帶電的(酸性)
麩胺酸 Glu E 帶電的(酸性)
精胺酸 Arg R 帶電的(鹼性)
離胺酸 Lys K 帶電的(鹼性)
組胺酸 His H 未帶電(極性)
天冬醯胺酸 Asn N 未帶電(極性)
麩醯胺酸 Gln Q 未帶電(極性)
絲胺酸 Ser S 未帶電(極性)
蘇胺酸 Thr T 未帶電(極性)
酪胺酸 Tyr Y 未帶電(極性)
甲硫胺酸 Met M 未帶電(極性)
色胺酸 Trp W 未帶電(極性)
半胱胺酸 Cys C 未帶電(極性)
丙胺酸 Ala A 未帶電(疏水性)
甘胺酸 Gly G 未帶電(疏水性)
纈胺酸 Val V 未帶電(疏水性)
白胺酸 Leu L 未帶電(疏水性)
異白胺酸 Ile I 未帶電(疏水性)
脯胺酸 Pro P 未帶電(疏水性)
苯丙胺酸 Phe F 未帶電(疏水性)
下列胺基酸被認為是帶電胺基酸：天冬胺酸(負電)、麩胺酸(負電)、精胺酸(正電)、及離胺酸(正電)。
於pH 7.4，天冬胺酸(pKa 3.1)及麩胺酸(pKa 4.1)之側鏈具有負電荷，而精胺酸(pKa 12.5)及離胺酸(pKa 10.8)之側鏈具有正電荷。天冬胺酸及麩胺酸被稱為酸性胺基酸殘基。精胺酸及離胺酸被稱為鹼性胺基酸殘基。
下列胺基酸被認為未帶電、極性(意指其參與氫鍵)胺基酸：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、及色胺酸。
下列胺基酸被認為未帶電之疏水性胺基酸：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、及甘胺酸。
於胺基酸插入，將另外的胺基酸殘基(通常不存在的一個胺基酸殘基)併入至BoNT/A多肽序列或其片段中，因而增加該序列中胺基酸殘基的總數。於胺基酸刪除，自梭狀芽孢桿菌毒素胺基酸序列移除胺基酸殘基，因而減少該序列中胺基酸殘基的總數。
較佳地，該修飾為取代，其於經修飾的BoNT/A或其片段中有利地維持相同數量的胺基酸殘基。於胺基酸取代，形成BoNT/A多肽序列或其片段的一部分的胺基酸殘基被不同的胺基酸殘基取代。如上所述，取代胺基酸殘基可為20種標準胺基酸之一。或者，胺基酸取代中的取代胺基酸可為非標準胺基酸(不屬於上述20個標準組的一部分的胺基酸)。舉例而言，取代胺基酸可為鹼性非標準胺基酸，例如，L-鳥胺酸、L-2-胺基-3-胍基丙酸、或離胺酸、精胺酸及鳥胺酸之D-異構物)。導入非標準胺基酸至蛋白質的方法為此項技術領域已知，包括重組蛋白質合成使用大腸桿菌( E. coli)營養缺陷表現宿主。
於一具體實施例，取代係選自：酸性胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代、酸性胺基酸殘基以未帶電胺基酸殘基取代、及未帶電胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代。於一具體實施例，其中取代為酸性胺基酸殘基以未帶電胺基酸殘基取代，酸性胺基酸殘基以其對應的未帶電醯胺胺基酸殘基取代(即，天冬胺酸以天冬醯胺酸替換，麩胺酸以麩醯胺酸替換)。
較佳地，鹼性胺基酸殘基為離胺酸殘基或精胺酸殘基。換言之，取代為以離胺酸或精胺酸取代。最佳地，該修飾為以離胺酸取代。
較佳地，本發明中使用之經修飾的BoNT/A或其片段包含位於梭狀芽孢桿菌毒素H CN域的4至40個胺基酸修飾。該經修飾的BoNT/A或其片段較佳亦具有至少6.6之pI。該經修飾的BoNT/A較佳包含選自下列至少4個胺基酸之修飾：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、及ASN 1052，其中該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基之取代。例如，該經修飾的BoNT/A或其片段可包含至少5個選自下列胺基酸之修飾：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、及GLN 1229，其中該修飾包含胺基酸以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代。
藉由取代、插入或刪除胺基酸殘基而修飾蛋白質之方法為此項技術領域所知。舉例而言，可藉由編碼多肽(例如，編碼未經修飾的BoNT/A或其片段)的DNA序列之修飾而導入胺基酸修飾。此可使用標準分子選殖技術而達成，例如藉由定點誘變(site-directed mutagenesis)，使用聚合酶酵素，使用編碼所欲胺基酸之短股之DNA(寡核苷酸)替換原始編碼序列，或藉由以各種酵素(例如，連接酶及限制內核酸酶)插入/刪除基因之部份。或者，可化學合成經修飾的基因序列。
於一態樣中，本發明提供用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性的多肽序列及/或其中該多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。
於一相關態樣中，其提供一種用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性的多肽序列及/或其中該多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。
於另一相關態樣，其提供一種多肽於製造藥物之用途，該藥物係用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙，其中該多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性的多肽序列及/或其中該多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。
於一態樣中，本發明提供一種用於治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性的多肽序列及/或其中該多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。
於一相關態樣中，其提供一種治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性的多肽序列及/或其中該多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。
於另一相關態樣，其提供一種多肽於製造藥物之用途，該藥物係用於治療受試者中的神經障礙，其中該多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性的多肽序列及/或其中該多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。
於一具體實施例，依據本發明使用之多肽包含與 SEQ ID NO：42具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之多肽序列。較佳地，依據本發明使用之多肽包含如SEQ ID NO：42所示之多肽序列。
於一具體實施例，依據本發明使用之多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。較佳地，依據本發明使用之多肽包含如SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列編碼的多肽序列。
於一具體實施例，依據本發明使用之多肽(例如，包含SEQ ID NO：42、或經SEQ ID NO：41編碼)可為與SEQ ID NO：61或65具有至少70%序列同一性的多肽之一部分。如此，於一具體實施例，依據本發明使用之多肽可包含與SEQ ID NO：61或65具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列。較佳地，依據本發明使用之多肽可包含SEQ ID NO：61或65(更佳由其組成)。於一具體實施例，多肽包含催化性不活化的L-鏈(例如，如SEQ ID NO：65所示)。
於一具體實施例，依據本發明使用之多肽(例如，包含SEQ ID NO：42或經SEQ ID NO：41編碼)可經與SEQ ID NO：60具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼。如此，於一具體實施例，依據本發明使用之多肽可經與SEQ ID NO：60具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列編碼。較佳地，依據本發明使用之多肽可經包含SEQ ID NO：60(更佳由其組成)之核苷酸序列編碼。於一具體實施例，多肽包含催化性不活化的L-鏈。
SEQ ID NO：42為經修飾的BoNT/A片段之一例且SEQ ID NO：61及65為分別具有催化活性和無活性的經修飾的BoNT/A多肽之例。此種經修飾的BoNT/A多肽及片段為本發明中使用之特佳者。當與野生型BoNT/A相比時，如SEQ ID NO：42、61及62所示的多肽具有許多胺基酸修飾(例如，取代)，其增加多肽之等電點。不欲受到理論的束縛，咸信增加的淨正電荷促進多肽與陰離子細胞外組分之間的靜電相互作用，因而促進多肽與細胞表面之間的結合，如此增加在投予部位的保留及/或作用持續時間。如此，設想與缺乏該修飾的等同多肽相比，SEQ ID NO：42、61及65的神經元生長及/或修復性質將被改善。
對於上述催化活性經修飾的BoNT/A多肽(例如，SEQ ID NO：61)，可定義此等有利性質(其代表治療指數的增加)之一種方式係根據經修飾的BoNT/A之安全比(Safety Ratio)。於此方面，可藉由測量相關動物模型中體重減少的百分比(例如小鼠，其中在7日的投予內檢測體重減少)來實驗性評估梭狀芽孢桿菌神經毒素的不欲效應(由毒素自投予部位擴散所引起)。反之，可藉由趾外展評分(DAS)分析(肌肉麻痺的測量方法)，實驗性評估梭狀芽孢桿菌神經毒素的所欲命中效應。此DAS分析可藉由將20μl之梭狀芽孢桿菌神經毒素(調配於明膠磷酸鹽緩衝液(Gelatin Phosphate Buffer)中)注射到小鼠腓腸肌/比目魚肌複合體中，隨後使用Aoki之方法評估趾外展評分(Aoki KR，Toxicon 39：1815-1820；2001)而進行。於此DAS分析中，小鼠以尾巴短暫懸吊以便激起特徵性的驚嚇反應，其中小鼠伸展其後肢並外展其後趾。注射梭狀芽孢桿菌神經毒素後，以五點等級對不同程度的趾外展進行評分(0 =正常至4 =趾外展和腿伸長的最大減少)。
梭狀芽孢桿菌神經毒素的安全比可以表示為體重下降10%所需的毒素量(在小鼠投藥後的首7日中於峰值效應的測量)與DAS評分為2所需毒素量之間的比率。因此，冀望高安全比分數，且表示一種能夠有效地麻痺目標肌肉並具有很少的不冀望的脫靶效應之毒素。本發明之具有催化活性的經修飾的BoNT/A可具有比等效的未經修飾的(天然)肉毒桿菌毒素(例如SEQ ID NO：62)的安全比更高的安全比。
如此，於一具體實施例，本發明之催化活性經修飾的BoNT/A具有至少8(例如，至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)之安全比，其中安全比的計算為：體重變化-10%所需的毒素劑量(pg/小鼠)除以DAS ED 50(pg/小鼠)[ED 50=產生DAS評分2所需的劑量]。
於一具體實施例，本發明之催化活性經修飾的BoNT/A具有至少10之安全比。於一具體實施例，本發明之經修飾的BoNT/A或其片段具有至少15之安全比。
包含與SEQ ID NO：61至少70%序列同一性之多肽被揭示於WO 2015/004461 A1，其藉由引用完整併入本文中。
於一具體實施例，包含與SEQ ID NO：42、61或65具有至少70%序列同一性的多肽序列之多肽及/或包含經與SEQ ID NO：41或60具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列於下列一或多個(較佳地為二個以上、三個以上、四個以上、五個以上或六個以上，更佳為全部)位置處包含取代：930、955、991、1026、1052、1229、及886。位置編號對應SEQ ID NO：62之位置且可藉由比對多肽序列與SEQ ID NO：62(未經修飾的/野生型BoNT/A)而決定。由於SEQ ID NO：62之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非強制的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：62包括甲硫胺酸，位置編號將如上定義(例如，位置886將為SEQ ID NO：62之ASN 886)。或者，於甲硫胺酸不存在於SEQ ID NO：62，胺基酸殘基編號應以-1修飾(例如，位置886將為SEQ ID NO：62之ASN 885)。當存在/不存在本文所述的其它多肽序列的位置1處的甲硫胺酸時，適用類似的考慮，且所屬技術領域中具通常知識者將使用本領域常規技術而容易決定正確的胺基酸殘基編號。
較佳地，包含與SEQ ID NO：42、61或65具有至少70%序列同一性的多肽序列的多肽及/或包含經與SEQ ID NO：41或60具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列的多肽於位置930、955、991、1026、1052、1229及886之一或多個處包含離胺酸或精胺酸(更佳為離胺酸)。於一具體實施例，多肽於位置930、955、991、1026、1052、1229、及 886之至少二、三、四、五、六個或所有處包含離胺酸或精胺酸(更佳為離胺酸)。最佳地，多肽於位置 930、955、991、1026、1052、1229、及886之全部處包含離胺酸或精胺酸(更佳為離胺酸)。
本發明之多肽促進神經元生長及/或神經元修復。如此，該多肽發現於治療神經障礙的功用。本文所使用的術語「神經障礙」為可藉由於受試者中促進神經元生長及/或修復而被治療的障礙。
如此，於一態樣中，本發明提供一種促進神經元生長及/或神經元修復之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L-鏈)或其片段之多肽；及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈(H-鏈)之片段。於另一態樣中，本發明提供一種促進神經元生長及/或神經元修復之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其包含催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之多肽。於另一態樣中，提供一種促進神經元生長或神經元修復之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性的多肽序列及/或其中該多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。於另一態樣中，提供一種促進神經元生長或神經元修復之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含與SEQ ID NO：63具有至少70%序列同一性之多肽序列。
術語「促進神經元生長及/或神經元修復」可意指本發明之多肽促使神經元生長及/或神經元修復，例如於神經元生長及/或神經元修復未發生處。於其它具體實施例，術語「促進神經元生長及/或神經元修復」可意指本發明之多肽增加神經元生長及/或神經元修復速率。該增加可為當與不存在本發明之多肽下之神經元生長及/或神經元修復速率相比之增加。於一具體實施例，神經元生長及/或神經元修復能夠重建受損的神經元迴路，因而恢復網路或神經元群體中的活性及/或神經元連絡。如此，如本文所使用的術語「神經元修復」可涵蓋特定神經元的修復以及神經元迴路的修復。
術語「神經元生長及/或神經元修復」亦可涵蓋神經可塑性(neuronal plasticity)。如此，於一具體實施例，本發明之多肽促進神經可塑性。本文所使用的術語「神經可塑性」涵蓋軸突出芽、樹突出芽、神經新生(例如，新神經元的產生)、成熟、分化、及/或突觸可塑性(synaptic plasticity)(例如，包括突觸強度、活性、解剖結構及/或連接性的改變)。於一具體實施例，本發明之多肽促進功能性突觸的建立(例如，位於損傷位置上或其附近)。
當與不存有本發明之多肽或存有另類的多肽下之神經元生長及/或修復比較，於本發明之多肽存在下增加神經元生長及/或修復至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%(較佳地至少80%)。於一些具體實施例，當與不存有本發明之多肽或存有另類的多肽下之神經元生長及/或修復比較，於本發明之多肽存在下增加神經元生長及/或修復至少100%、150%或200%。
於一具體實施例，本發明之多肽促進神經元生長。本文所使用的術語「神經元生長」涵蓋神經元任何部分的生長，包括軸突及/或樹突之生長。本發明之多肽可增加軸索(neurite)長度、軸索數量(例如，每個細胞的軸索數量)，及/或可增加自神經元之細胞體或細胞膜突出的長度及/或數量。較佳地，本發明之多肽促進神經元之軸突生長，例如，於受試者中的神經元。換言之，較佳本發明之多肽增加軸突生長，例如，軸突出芽。該軸突生長可促進神經元間的連接及/或化學連絡。
本發明之多肽治療的神經障礙可為神經元損傷、神經退化性疾病、感覺障礙或自主神經系統障礙。
神經障礙可為神經元損傷。於一具體實施例，神經元損傷可為神經創傷、神經病變(例如，周邊神經病變)、脊髓損傷、神經截斷、腦損傷(例如，創傷性腦損傷)、非創傷性損傷(例如，中風或脊髓梗塞)、或臂神經叢損傷，例如，歐勃氏麻痺(Erb’s palsy)或克蘭氏麻痹(Klumpke’s palsy)。
於一具體實施例，神經創傷可由結疤及/或由骨折造成。於此種神經創傷的情形，神經末梢受損。本發明之多肽有利地能夠修復該神經末梢或能夠治療神經創傷遠側神經末梢。
神經元損傷可為麻痺，諸如脊髓損傷所引起的麻痺(例如，壓迫、狹窄、及/或拉伸所引起)。於一具體實施例，脊髓損傷為截癱或四肢麻痺。
神經障礙可為感覺障礙。於一具體實施例，感覺障礙為感覺神經病變、多發感覺運動神經病變(sensorimotor polyneuropathy)、糖尿病性神經病變、疼痛、布朗-斯夸症候群(Brown-Sequard syndrome)、夏馬杜三氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、或戴維克症候群(Devic’s syndrome)。較佳地，本文所述感覺障礙並非疼痛。換言之，較佳地，本文所述之神經障礙並非疼痛。
神經障礙可為自主神經系統障礙。於一具體實施例，自主神經系統障礙為自主神經病變、多系統萎縮、急性特發性多神經病變(acute idiopathic polyneuropathy)、自主神經障礙(dysautonomia)、家族性自主神經障礙、糖尿病性自主神經衰竭、純粹自主神經衰竭、溫度調節失調、多汗症、神經媒介的暈厥(血管迷走神經、排尿、咳嗽、吞嚥及其它狀態型)、勃起障礙、起立性低血壓、姿勢性心博過速症候群(postural tachycardia syndrome，PoTS)、或格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)。
神經障礙可為神經退化性疾病。於一具體實施例，神經退化性疾病為阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、與帕金森氏症有關的障礙、運動神經元疾病、周邊神經病變、運動神經病變、普里昂疾病(prion disease)、杭丁頓氏症(Huntington’s disease)、脊髓小腦性失調症(spinocerebellar ataxia)、脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy)、單肢肌萎縮症(monomelic amyotrophy)、福萊德瑞克氏運動失調症(Friedreich’s ataxia)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、或額顳葉變性(frontotemporal lobar degeneration)。較佳地，神經退化性疾病為帕金森氏症或運動神經元疾病。有利地，據信本發明的多肽發現由於其促進神經元生長(例如，包括神經可塑性)及/或神經元修復的能力，並又由於它們具有重建受損的神經元迴路的能力，因而恢復網絡或神經元群體的活性及/或神經元連絡，而可用於治療神經退化性疾病。
鑑於其促進神經元生長及/或神經元修復的能力，本發明之多肽被認為是神經營養性的多肽。本文所述的神經元可為選自下列之一或多者：運動神經元(包括自主神經元)、感覺神經元、脊髓中間神經元、及腦中間神經元。如此，於一具體實施例，本發明之多肽促進運動神經元、感覺神經元、及/或中間神經元之生長及/或修復。較佳地，本發明之多肽促進運動神經元之生長及/或修復。
本文所使用的「受試者」可為哺乳類動物，諸如人類或其它哺乳類動物。較佳地，「受試者」意指人類受試者。
本文所使用的術語「障礙」亦涵蓋「疾病」。於一具體實施例，障礙為疾病。
本文所使用的術語「治療」或「處理」涵蓋預防性處理(例如，預防障礙的發作)以及矯正治療(corrective treatment)(對已經罹患該障礙的受試者的治療)。較佳地，本文所使用的「治療」或「處理」意指矯正治療。
本文所使用的術語「治療」或「處理」係指障礙及/或其症狀。
因此本發明之多肽可以治療上有效量或預防上有效量被投予至受試者。較佳地，以治療上有效量投予本發明之多肽。
「治療上有效量」為任何量之多肽，當單獨投予或合併投予至受試者以治療該障礙(或其症狀)時足以實現對障礙或其症狀的此種治療。
「預防上有效量」為任何量之多肽，當單獨投予或合併投予至受試者以抑制或延緩障礙(或其症狀)的發作或復發。於一些具體實施例，預防上有效量完全防止疾病的發作或復發。「抑制」發作係指降低障礙發作(或其症狀)的可能性，或完全預防發作任一者。
可以任何適合的方式調配本發明之多肽以例如作為醫藥組成物的一部分投予至受試者。如此，於一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本發明之多肽及醫藥上可接受的載體、賦形劑、佐劑、推進劑及/或鹽。於一些具體實施例，本發明之多肽可為單鏈形式，而在其它具體實施例中，該多肽可為雙鏈形式，例如，兩條鏈通過雙硫鍵連接。較佳地，多肽為雙鏈形式。
本發明之多肽可調配用於口服、腸胃外、連續輸注、吸入或局部投予。適合注射的組成物可為溶液、懸浮液或乳劑、或乾粉(其在使用前溶解或懸浮在適合的媒劑中)的形式。
在多肽被局部遞送的情況下，該多肽可被調配製成霜劑(例如，用於局部投予)或用於皮下注射。
局部遞送裝置可包括氣溶膠或其它噴霧劑(例如，噴霧器(nebuliser))。就此方面而言，多肽的氣溶膠製劑能夠遞送至肺及/或其它鼻及/或支氣管或呼吸道通道。
本發明之多肽可藉由鞘內或硬膜外注射於受試者之在受影響器官的神經支配的脊段水平處的脊柱中。
投予途徑可經由腹腔鏡及/或局部注射。於一具體實施例中，在損傷部位處或附近，較佳在損傷部位處投予本發明之多肽。例如，當損傷為脊髓損傷時，可鞘內或脊髓內(較佳為鞘內)投予多肽。在一具體實施例中，本發明之多肽的投予途徑可為神經周圍的、神經內的、脊髓內的及/或鞘內的。
投予本發明之多肽的劑量範圍為產生所欲治療及/或預防效果的劑量範圍。應當理解，所需劑量範圍取決於梭狀芽孢桿菌神經毒素或組成物的精確性質、投予途徑、製劑的性質、受試者的年齡、受試者的狀況的性質、程度或嚴重性、禁忌症(如果有的話)、以及主治醫師的判斷。此等劑量水平中的變化可使用最佳化的標準經驗途徑進行調整。
於一具體實施例，多肽之劑量為平坦劑量(flat dose)。平坦劑量可為50 pg至250 ug之範圍，較佳 100 pg至100 ug。於一具體實施例，平坦劑量可為至少50 pg、100 pg、500 pg、1 ng、50 ng、100 ng、500 ng、1 ug或50 ug。該劑量可為單一平坦劑量。
通常利用多肽和無熱原的無菌媒劑製備液體劑型。梭狀芽孢桿菌神經毒素，取決於所用的媒劑和濃度，可以溶解或懸浮在媒劑中。在製備溶液中，可以將多肽溶解在媒劑中，若需要，藉由添加氯化鈉使溶液等滲，並且在填充至合適的無菌小瓶或安瓿中並密封之前，通過使用無菌技術的無菌過濾器過濾來滅菌。或者，若溶液的穩定性足夠，則可以通過高壓釜滅菌將其密封容器中的溶液滅菌。有利地，諸如緩衝劑、增溶劑、穩定劑、防腐劑或殺菌劑、助懸劑或乳化劑及/或局部麻醉劑的添加劑可被溶解於媒劑中。
藉由使用無菌技術在無菌區域中將預先滅菌的成分填充到無菌容器中，可以製備在使用前溶解或懸浮在合適媒劑中的乾燥粉末。或者，可以使用無菌技術在無菌區域將成分溶解到適合的容器中。然後，將產品冷凍乾燥，並將容器無菌密封。
以實質上相同的方式製備適用於本文所述的投予途徑的腸胃外懸浮劑，除了無菌組分懸浮在無菌媒劑中而不是被溶解並且無法藉由過濾完成滅菌之外。此組分可於無菌狀態下進行分離，或者可於分離後進行滅菌，例如，藉由γ照射。
有利地，在組成物中包括懸浮劑，例如聚乙烯吡咯啶酮，以促進組分的均勻分佈。
根據本發明之投予，可利用包括微粒包封或高壓氣溶膠撞擊的多種遞送技術。
本發明之多肽可為梭狀芽孢桿菌神經毒素或其片段，較佳為其片段。
於一具體實施例，本發明之多肽可經與SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或60之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列編碼。於一具體實施例，本發明之多肽可經與SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或60具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列編碼。較佳地，本發明之多肽可經包含SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或60之任一者之核苷酸序列編碼。
於一具體實施例，本發明之多肽可包含與SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列。於一具體實施例，本發明之多肽可包含與SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之多肽序列。較佳地，本發明之多肽可包含SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者之多肽序列。
於一具體實施例，本發明涵蓋包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈的全長之梭狀芽孢桿菌神經毒素之用途，其但書為該梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為催化性不活化的。
術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」涵蓋肉毒桿菌(肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、及X)、破傷風桿菌(破傷風神經毒素)、丁酸梭菌 (C. butyricum)(肉毒桿菌神經毒素血清型E)、及巴氏梭菌 (C. baratii)(肉毒桿菌神經毒素血清型F)所產生的毒素，以及經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素或前述任一者所衍生的衍生物。
肉毒桿菌產生的肉毒桿菌神經毒素(BoNT)為大蛋白質複合物的形式，由BoNT本身與許多輔助蛋白複合而成。目前有八種不同類型的肉毒桿菌神經毒素，即：肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、及X，所有均具有相似的結構和作用模式。可以基於藉由特異性中和抗血清的失活來區分不同的BoNT血清型，藉由血清型進行的此種分類與胺基酸水平的百分比序列同一性相關。基於胺基酸百分比序列同一性，將規定血清型的BoNT蛋白質進一步分為不同的亞型。
BoNT在胃腸道中吸收，進入全身循環後，結合至膽鹼性神經末梢的突觸前膜上並阻止其神經傳導物質乙醯膽鹼的釋放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F及BoNT/G切割突觸小泡蛋白/囊泡相關膜蛋白(vesicle-associated membrane protein，VAMP)；BoNT/C1、BoNT/A及BoNT/E切割25 kDa(SNAP-25)之突觸小體相關蛋白(synaptosomal-associated protein)；及BoNT/C1切割突觸融合蛋白。BoNT/X已被發現切割SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、Ykt6、及突觸融合蛋白1。
破傷風毒素係破傷風桿菌以單一血清型產生。丁酸梭菌產生BoNT/E，而巴氏梭菌產生BoNT/F。
術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」亦意圖涵蓋經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素及其衍生物，包括但未限於彼等下述者。與梭狀芽孢桿菌神經毒素之天然(未經修飾的)形式相比，經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素或衍生物可含有一或多個已經修飾的胺基酸，或可含有不存在於梭狀芽孢桿菌神經毒素之天然(未經修飾的)形式的一或多個插入的胺基酸。舉例而言，相對於天然(未經修飾的)梭狀芽孢桿菌神經毒素序列，經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可於一或多個域中具有經修飾的胺基酸序列。此種修飾可修飾毒素的功能面向，例如生物活性或持久性。如此，於一具體實施例，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素為經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素、或經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素衍生物、或梭狀芽孢桿菌神經毒素衍生物。
經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可於重鏈之胺基酸序列(諸如經修飾的H C域)具有一或多個修飾，其中該經修飾的重鏈以比天然(未經修飾的)梭狀芽孢桿菌神經毒素更高或更低的親和力與目標神經細胞結合。於H C域的此種修飾可包括修飾H C域的神經節苷脂結合位點的殘基或蛋白質(SV2或突觸結合蛋白(synaptotagmin))結合位點中的殘基，其改變與目標神經細胞的神經節苷脂受體及/或蛋白質受體的結合。此種經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素之例描述於WO 2006/027207及WO 2006/114308，其兩者藉由引用完整併入本文。
經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素於輕鏈之胺基酸序列中可具有一或多個修飾，例如基質結合或催化域中的修飾，其可改變或修飾經修飾的L-鏈之SNARE蛋白質特異性。此種經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素之例描述於WO 2010/120766及US 2011/0318385，其兩者藉由引用完整併入本文。
經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含一或多個修飾，其增加或減少經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素之生物活性及/或生物持久性。例如，經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含基於白胺酸或基於酪胺酸的基序，其中該基序增加或減少經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素之生物活性及/或生物持久性。適合的基於白胺酸的基序包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL、及xExxxLM(其中x為任何胺基酸)。適合的基於酪胺酸的基序包括Y-x-x-Hy(其中Hy為疏水性胺基酸)。包含基於白胺酸及基於酪胺酸的基序之經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素之例述於WO 2002/08268，其藉由引用完整併入本文。
如上述，當與缺乏該一或多個修飾的等效未經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素相比，經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素(或梭狀芽孢桿菌神經毒素片段)可為包含增加梭狀芽孢桿菌神經毒素之等電點的一或多個修飾。適合的經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素描述於上及描述於WO 2015/004461 A1及WO 2016/110662 A1，其藉由引用併入。示例性序列包括本文所述的SEQ ID NO：61及42。
術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」意圖涵蓋雜合及嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素。雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素包含至少來自一梭狀芽孢桿菌神經毒素或其亞型的輕鏈的部分，及至少來自另一梭狀芽孢桿菌神經毒素或梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型的重鏈的部分。於一具體實施例，雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素可含有來自一梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之輕鏈的完整輕鏈及來自另一梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之重鏈。於另一具體實施例，嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可含有一梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之重鏈之部分(例如，結合域)，與來自另一梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之重鏈之另一部分。相似或替代地，治療要素可包含來自不同梭狀芽孢桿菌神經毒素之輕鏈部分。此種雜合或嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素為有用的，例如，將此種梭狀芽孢桿菌神經毒素的治療益處傳遞給下列受試者之手段：對特定的梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型具有免疫學抗性的受試者、對特定的梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈結合域的受體濃度可能低於平均水平的受試者、或具有膜或囊泡毒素基質之蛋白酶抗性變異體(例如，SNAP-25，VAMP及突觸融合蛋白)的受試者。雜合及嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素被述於US 8,071,110，其公開文獻藉由引用完整併入本文。如此，於一具體實施例，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素(或其片段)為雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素、或嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素。
於一特佳具體實施例中，本發明之多肽可為包含(較佳地由其組成)BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)的嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素或其部分。適合的嵌合及/或雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素可為教示於WO 2017/191315 A1者，其藉由引用併入本文中。此種較佳序列包括SEQ ID NOs：44、63、及64。
BoNT/A LH N域可被共價連結至BoNT/B H C域。本文中該嵌合BoNT/A亦稱為「BoNT/AB」或「BoNT/AB嵌合體」。
LH N域之C-端胺基酸殘基可對應於分隔BoNT/A的LH N和H C域的3 10螺旋的第一個胺基酸殘基，H C域的N-端胺基酸殘基可對應於BoNT/B中分隔LH N和H C域的3 10螺旋的第二個胺基酸殘基。
本文所指「分隔BoNT/A的LH N和H C域的3 10螺旋的第一個胺基酸殘基」意指分隔LH N和H C域的3 10螺旋的N-端殘基。
本文所指「BoNT/B中分隔LH N和H C域的3 10螺旋的第二個胺基酸殘基」意指分隔LH N和H C域的3 10螺旋的N-端殘基後的胺基酸殘基。
「3 10螺旋」為在蛋白質和多肽中發現的一種二級結構形式，包括α-螺旋、β-褶板(β-sheet)及反向翻轉(reverse turn)。3 10螺旋中的胺基酸以右旋螺旋結構排列，其中每一個完整的轉折由三個殘基和十個原子完成，這三個殘基和十個原子將它們之間的分子內氫鍵分開。各個胺基酸對應於螺旋中的120°翻轉(即，螺旋每一翻轉具有三個殘基)，且沿著螺旋軸的平移為2.0Å(=0.2 nm)，且藉由作成輕鍵所形成的環具有10個原子。最重要地，胺基酸之N-H基團與胺基酸前3個殘基之C=O基團形成氫鍵；此重複的i+3→i氫鍵定義為3 10螺旋。3 10螺旋為所屬技術領域中具通常知識者熟悉的結構生物學的標準概念。
此3 10螺旋對應於形成實際螺旋的四個殘基和兩個帽(或過渡)殘基，在此等四個殘基的每個末端各一個。本文所用的術語「分隔LH N和H C域的3 10螺旋」由彼等6個殘基組成。
通過進行結構分析及序列比對，鑑定出分隔LH N和H C域的3 10螺旋。此3 10螺旋在其N-端(即LH N域的C-端部分)被一個α-螺旋包圍，並在其C-端(即H C域的N-端部分)被一個β-股包圍)。3 10螺旋的第一個(N-端)殘基(帽或過渡殘基)亦對應於該α-螺旋的C-端殘基。
可以例如從肉毒桿菌神經毒素的公眾可獲得的晶體結構，例如分別為肉毒桿菌神經毒素A1和B1之3BTA(http：//www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA)及1EPW(http：//www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW)確定LH N和H C域的3 10螺旋。
公開的計算機模擬和比對工具亦可用來確定將其它神經毒素中的LH N和H C域分開的3 10螺旋的位置，例如，同源模建伺服器LOOPP(Learning, Observing and Outputting Protein Patterns，http：//loopp.org)、PHYRE(Protein Homology/analogY Recognition Engine，http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)及Rosetta(https：//www.rosettacommons.org/)、蛋白質疊加伺服器(the protein superposition server)SuperPose(http：//wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)、比對程式Clustal Omega(http：//www.clustal.org/omega/)、及列於Internet Resources for Molecular and Cell Biologists (http：//molbiol-tools.ca/)的許多的其它工具/服務。特別是「H N/H CN」交界周圍的區域在結構上高度保守，此使其成為疊加不同血清型的理想區域。
例如，可使用下列方法學確定於其它神經毒素中此3 10螺旋之序列： 1.使用結構同源性建模工具LOOP(http：//loopp.org)獲得基於BoNT/A1晶體結構(3BTA.pdb)的其它BoNT血清型的預測結構； 2.對由此獲得的結構(pdb)文件進行編輯，使其僅包含H CN域的N-端及其之前的約80個殘基(屬於H N域的部分)，因而保留了「H N/H CN」區域，其在結構上高度保守； 3.使用蛋白質疊加伺服器SuperPose(http：//wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)，以疊加每種血清型到3BTA.pdb結構上； 4.檢查疊加的pdb檔，將3 10螺旋定位在BoNT/A1的H C域的開始，然後鑑定另一种血清型中的對應殘基； 5.將其它BoNT血清型序列與Clustal Omega進行比對，以檢查對應的殘基是否正確。
藉由此方法確定的LH N、H C及3 10螺旋域的示例呈示如下：
神經毒素 登錄號 ( 小數點後加上序列版本 ) LH N H C 3 10 螺旋
BoNT/A1 (SEQ ID NO：62) A5HZZ9.1 1-872 873-1296 872NIINTS 877
BoNT/A2 X73423.3 1-872 873-1296 872NIVNTS 877
BoNT/A3 DQ185900.1(aka Q3LRX9.1) 1-872 873-1292 872NIVNTS 877
BoNT/A4 EU341307.1(aka Q3LRX8.1) 1-872 873-1296 872NITNAS 877
BoNT/A5 EU679004.1(aka C1IPK2.1) 1-872 873-1296 872NIINTS 877
BoNT/A6 FJ981696.1 1-872 873-1296 872NIINTS 877
BoNT/A7 JQ954969.1(aka K4LN57.1) 1-872 873-1296 872NIINTS 877
BoNT/A8 KM233166.1 1-872 873-1297 872NITNTS 877
BoNT/B1 (a.k.a. SEQ ID NO：52) B1INP5.1 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B2 AB084152.1(aka Q8GR96.1) 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B3 EF028400.1(aka A2I2S2.1) 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B4 EF051570.1(aka A2I2W0.1) 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B5 EF033130.1(aka A2I2U6.1) 1-859 860-1291 859DILNNI 864
BoNT/B6 AB302852.1(aka A8R089.1) 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B7 JQ354985.1(aka H9CNK9.1) 1-859 860-1291 859EILNNI 864
BoNT/B8 JQ964806.1(aka I6Z8G9.1) 1-859 860-1292 859EILNNI 864
使用結構分析及序列比對，發現在3 10螺旋分離LH N和H C域的β-股在所有肉毒桿菌及破傷風神經毒素中皆為保守結構，且當從3 10的第一個殘基開始分離LH N和H C域時，在第8個殘基處開始(例如，在BoNT/A1的殘基879處)。
BoNT/AB嵌合體可包含來自BoNT/A的LH N域共價連結至來自BoNT/B的H C域， ●其中LH N域之C-端胺基酸殘基對應位於BoNT/A的H C域的起始(N-端)的β-股N-端第八位胺基酸殘基，及 ●其中H C域之N-端胺基酸殘基對應位於BoNT/B的H C域的起始(N-端)的β-股N-端第七位胺基酸殘基。
BoNT/AB嵌合體可包含來自BoNT/A的LH N域共價連結至來自BoNT/B的H C域， ●其中LH N域之C-端胺基酸殘基對應位於BoNT/A的LH N域的末端(C-端)的α-螺旋的C-端胺基酸殘基，及 ●其中H C域之N-端胺基酸殘基對應位於BoNT/B的LH N域末端(C-端)上緊靠α-螺旋之C-端胺基酸殘基的胺基酸殘基。
BoNT/AB嵌合體設計過程的基本原理係試圖確保二級結構不受到損害，因而使對三級結構和每個域功能的任何改變最小化。不欲受到理論的束縛，假設藉由不破壞BoNT/AB嵌合體中3 10螺旋的四個中心胺基酸殘基確保嵌合神經毒素的最佳構象，因而使嵌合神經毒素發揮其功能至其全部能力。
來自BoNT/A的LH N域可對應SEQ ID NO：62之胺基酸殘基1至872，或與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。來自BoNT/A的LH N域可對應SEQ ID NO：62之胺基酸殘基1至872，或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，來自BoNT/A的LH N域對應SEQ ID NO：62之胺基酸殘基1至872。
來自BoNT/B的H C域可對應SEQ ID NO：52之胺基酸殘基860至1291，或與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。來自BoNT/B的H C域可對應SEQ ID NO：52之胺基酸殘基860至1291，或與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，來自BoNT/B的H C域對應SEQ ID NO：52之胺基酸殘基860至1291。
較佳地，BoNT/AB嵌合體包含BoNT/A LH N域及BoNT/B H C域。更佳地，LH N域對應BoNT/A之胺基酸殘基1至872(SEQ ID NO：62)且H C域對應BoNT/B(SEQ ID NO：52)之胺基酸殘基860至1291。
較佳地，BoNT/B H C域進一步包含於H CC次域中至少一個胺基酸殘基取代、添加或刪除，其與天然BoNT/B相比，具有增加BoNT/B神經毒素對人Syt II的結合親和力的作用。BoNT/B H CC次域中合適的胺基酸殘基取代、添加或刪除已揭示於WO 2013/180799及WO 2016/154534(兩者藉由引用併入本文中)。
BoNT/B H CC次域中合適的胺基酸殘基取代、添加或刪除包括選自由下列組成的群組的取代突變：V1118M；Y1183M；E1191M；E1191I；E1191Q；E1191T；S1199Y；S1199F；S1199L；S1201V；E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其組合。
於BoNT/B H CC次域中合適的胺基酸殘基取代、添加或刪除進一步包括選自由下列組成的群組的兩種取代突變的組合：E1191M及S1199L、E1191M及S1199Y、E1191M及S1199F、E1191Q及S1199L、E1191Q及S1199Y、E1191Q及S1199F、E1191M及S1199W、E1191M及W1178Q、E1191C及S1199W、E1191C及S1199Y、E1191C及W1178Q、E1191Q及S1199W、E1191V及S1199W、E1191V及S1199Y、或E1191V及W1178Q。
BoNT/B H CC次域中合適的胺基酸殘基取代、添加或刪除亦包括三個取代突變的組合，該取代突變為E1191M、S1199W及W1178Q。
較佳地，BoNT/B H CC次域中合適的胺基酸殘基取代、添加或刪除包括二種取代突變的組合，該取代突變為E1191M及S1199Y。
當與如SEQ ID NO：52所示之未經修飾的BoNT/B比較時，修飾可為一修飾，其中胺基酸殘基編號藉由與SEQ ID NO：52比對而確定。由於SEQ ID NO：52之位置1的甲硫胺酸殘基存在為不強制的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具通常知識者將考量此甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：52包括甲硫胺酸處，位置編號將如上定義(例如，E1191將為SEQ ID NO：52之E1191)。或者，於SEQ ID NO：52不存有甲硫胺酸時，胺基酸殘基編號應藉由-1修飾(例如，E1191將為SEQ ID NO：52之E1190)。適用相似考量，當本文所述其它多肽序列之位置1的甲硫胺酸為存在/不存在，所屬技術領域中具通常知識者使用此技術領域的常規技術，將容易確定正確的胺基酸殘基編號。
如此，於一態樣中，本發明提供一種用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：63或64具有至少70%序列同一性之多肽序列。
於一相關態樣中，提供一種用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含與SEQ ID NO：63或64具有至少70%序列同一性之多肽序列。
於另一相關態樣，提供一種多肽於製造藥物之用途，該藥物係用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙，其中該多肽包含與SEQ ID NO：63或64具有至少70%序列同一性之多肽序列。
於一態樣中，本發明提供一種用於治療受試者中的神經障礙多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：63或64具有至少70%序列同一性之多肽序列。
於一相關態樣中，提供一治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含與SEQ ID NO：63或64具有至少70%序列同一性之多肽序列。
於另一相關態樣，提供一種多肽於製造藥物之用途，該藥物係用於治療受試者中的神經障礙，其中該多肽包含與SEQ ID NO：63或64具有至少70%序列同一性之多肽序列。
於一具體實施例，依據本發明使用之多肽包含與SEQ ID NO：63或64具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列。較佳地，依據本發明使用之多肽包含(更佳由其組成)如SEQ ID NO：63或64所示的多肽序列。
較佳地，包含與SEQ ID NO：63具有至少70%序列同一性的多肽序列之多肽包含催化性不活化的L-鏈，諸如SEQ ID NO：64。
於本發明中使用之嵌合及/或雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含BoNT/A多肽之一部分及BoNT/B多肽之一部分，其例包括本文所述如SEQ ID NO：44之多肽。
合適的嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可包括BoNT/FA。確實，於一特佳具體實施例中，本發明之多肽可包含BoNT/FA或其片段。BoNT/FA之催化性不活化的形式於本文被描述為SEQ ID NO：26及34。BoNT/FA之合適的片段於本文亦描述為SEQ ID NOs：28、30、及32。
術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」亦可涵蓋新發現的由非梭狀芽孢桿菌微生物表現的肉毒桿菌神經毒素蛋白質家族成員，諸如腸球菌(Enterococcus)編碼的毒素，其與BoNT/X序列具有最接近的序列同一性，魏氏稻草菌( Weissella oryzae)編碼的毒素稱為BoNT/Wo(NCBI Ref Seq：WP_027699549.1)，其於W89-W90切割VAMP2，糞腸球菌( Enterococcus faecium)編碼的毒素(GenBank：OTO22244.1)，其切割VAMP2及SNAP25，及 Chryseobacterium pipero編碼的毒素(NCBI Ref.Seq：WP_034687872.1)。
本發明之多肽可缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之一功能性H C域且亦可缺少任何功能上等效的外源性配體標的部位(TM)。
如此，於一特佳具體實施例中，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素並非再次靶向的梭狀芽孢桿菌神經毒素。於再次靶向的梭狀芽孢桿菌神經毒素，梭狀芽孢桿菌神經毒素為經修飾以包括已知為標的部位(TM)的外源性配體。選擇TM以提供所欲目標細胞之結合特異性，且作為再次靶向的過程的一部分，梭狀芽孢桿菌神經毒素之天然結合部分(例如，H C域、或H CC域)可被移除。再次靶向的技術被描述於，例如：EP-B-0689459；WO 1994/021300；EP-B-0939818；US 6,461,617；US 7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US 5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US 7,052,702；WO 1999/017806；EP-B-1107794；US 6,632,440；WO 2000/010598；WO 2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO 2000/61192；及WO 1999/58571；其所有藉由引述被完整併入本文中。
如上述，(全長)梭狀芽孢桿菌神經毒素係由兩多肽鏈形成：具有約100 kDa之分子量之重鏈(H-鏈)、及具有約50 kDa之分子量之輕鏈(L-鏈)。H-鏈包含C-端目標組分(受體結合域或H C域)及N-端轉位組分(H N域)。
梭狀芽孢桿菌神經毒素可選自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、及TeNT(破傷風神經毒素)。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素為肉毒桿菌神經毒素，諸如選自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、及BoNT/X之肉毒桿菌神經毒素。
於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/A。參考BoNT/A序列如SEQ ID NO：51所示。於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/B。參考BoNT/B序列如SEQ ID NO：52所示。於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/C。參考BoNT/C序列如SEQ ID NO：53所示。於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/D。參考BoNT/D序列如SEQ ID NO：54所示。於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/E。參考BoNT/E序列如SEQ ID NO：55所示。於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/F。參考BoNT/F序列如SEQ ID NO：56所示。於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/G。參考BoNT/G序列如SEQ ID NO：57所示。於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素可為TeNT。參考TeNT序列如SEQ ID NO：58所示。於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素可為BoNT/X。參考BoNT/X序列如SEQ ID NO：59所示。
於一具體實施例，本發明之多肽包含BoNT/A之片段或BoNT/F之片段。於另一具體實施例，本發明之多肽包含BoNT/A或BoNT/F之催化性不活化的L-鏈。
於具體實施例中本文所述多肽具有純化用標籤(例如，His-tag)及/或連結子(linker)時，該標籤及/或連結子為可任選的。
合適的全長梭狀芽孢桿菌神經毒素描述於此處。
於一具體實施例，本發明之多肽可包含與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列，但書為該多肽之梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為催化性不活化的。於一具體實施例，本發明之多肽可包含與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之多肽序列，但書為該多肽之梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為催化性不活化的。較佳地，本發明之多肽可包含SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者之多肽序列，但書為該多肽之梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為催化性不活化的。
於一具體實施例，本發明之多肽可為經與SEQ ID NOs：1、9、11、13、15、17、25、33、或60之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列編碼者，但書為該多肽之梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為催化性不活化的。於一具體實施例，本發明之多肽為經與SEQ ID NOs：1、9、11、13、15、17、25、33、或60之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的核苷酸序列編碼者，但書為該多肽之梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為催化性不活化的。較佳地，本發明之多肽為經包含SEQ ID NOs：1、9、11、13、15、17、25、33、或60之任一者之核苷酸序列編碼者，但書為該多肽之梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為催化性不活化的。
於一具體實施例，本發明之多肽可包含與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列，但書為該多肽之梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為催化性不活化的。於一具體實施例，本發明之多肽包含與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之多肽序列，但書為該多肽之梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為催化性不活化的。較佳地，本發明之多肽包含SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65之任一者，但書為該多肽之梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為催化性不活化的。
於一具體實施例，本發明之多肽為選自BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、及TeNT的全長梭狀芽孢桿菌神經毒素。
於一具體實施例，本發明之多肽可包含與SEQ ID NOs：52-59、61或63之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列。於一具體實施例，本發明之多肽可包含與SEQ ID NOs：52-59、61或63之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列。於一具體實施例，本發明之多肽可包含與SEQ ID NOs：52-59、61或63之任一者具有至少99%或99.9%序列同一性之多肽序列。較佳地，本發明之多肽可包含(更佳為由其組成)包含下列SEQ ID NOs：52-59、61或63之任一者之多肽序列。
於一特佳具體實施例，本發明之多肽並非全長催化活性梭狀芽孢桿菌神經毒素，例如，並非全長催化活性BoNT/A。
本發明之多肽可包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素之片段，例如，本文所述任一全長梭狀芽孢桿菌神經毒素之片段。
於一具體實施例，本發明之多肽可包含與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列之片段。於一具體實施例，本發明之多肽可包含與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列之片段。較佳地，本發明之多肽可包含包含下列SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者的多肽序列之片段。
於一具體實施例，本發明之多肽包含(或由其組成)一梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段。梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50胺基酸殘基。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之片段具有梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200個胺基酸殘基。例如，梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之20-400、50-300或100-200個胺基酸殘基。
L-鏈參考序列之例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基1-448 肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基1-440 肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基1-441 肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基1-445 肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基1-422 肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基1-439 肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基1-441 破傷風神經毒素：胺基酸殘基1-457
對於最近鑑定的BoNT/X，已報告L鏈對應於其胺基酸1-439，其中L-鏈邊界可能變化約25個胺基酸(例如1-414或1-464)。
上列鑑定的參考序列應被視為指引，由於根據亞血清型可能會發生輕微變化。舉例而言，US 2007/0166332(藉由引用整體併入本文)引用了些為不同的梭狀芽孢桿菌序列： 肉毒桿菌A型神經毒素：胺基酸殘基M1-K448 肉毒桿菌B型神經毒素：胺基酸殘基M1-K441 肉毒桿菌C1型神經毒素：胺基酸殘基M1-K449 肉毒桿菌D型神經毒素：胺基酸殘基M1-R445 肉毒桿菌E型神經毒素：胺基酸殘基M1-R422 肉毒桿菌F型神經毒素：胺基酸殘基M1-K439 肉毒桿菌G型神經毒素：胺基酸殘基M1-K446 破傷風神經毒素：胺基酸殘基M1-A457
合適的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈被描述於此處。
梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列：6、24、32或40或其片段。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之多肽序列：6、24、32或40或其片段。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈包含(更佳由其組成)包含下列SEQ ID NO之任一者之多肽序列：6、24、32或40或其片段。
梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈可為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列編碼者：5、23、31或39或其片段。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列編碼者：5、23、31或39或其片段。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈為經包含下列之SEQ ID NO任一者之核苷酸序列編碼者：5、23、31或39或其片段。
於一具體實施例，本發明之多肽包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段。梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之≤800、≤700、≤600、≤500、≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50個胺基酸殘基。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段具有梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200個胺基酸殘基。例如，梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之20-800、30-600、40-400、50-300或100-200個胺基酸殘基。
梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈包含兩種結構/功能域：轉位域(H N)及受體結合域(H C)。
於一具體實施例，本發明之多肽包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素轉位域或其片段。梭狀芽孢桿菌神經毒素轉位域之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素轉位域之≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50個胺基酸殘基。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素轉位域之片段具有梭狀芽孢桿菌神經毒素轉位域之至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200個胺基酸殘基。例如，梭狀芽孢桿菌神經毒素轉位域之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素轉位域之20-400、50-300或100-200個胺基酸殘基。
轉位域為梭狀芽孢桿菌神經毒素的H-鏈片段，大約相當於H-鏈之胺基末端的一半，或者是與完整H-鏈中該片段相對應的域。於一具體實施例，H-鏈之H C功能可藉由刪除H C胺基酸序列而被移除(在DNA合成水平、或在合成後水平藉由核酸酶或蛋白酶處理任一者)。或者，H C功能可藉由化學或生物處理而不活化。如此，於一些具體實施例，H-鏈可能無法結合天然梭狀芽孢桿菌神經毒素(即，全毒素(holotoxin))結合的目標細胞上的結合位點。
合適的(參考)轉位域之例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素-胺基酸殘基(449-871) 肉毒桿菌B型神經毒素-胺基酸殘基(441-858) 肉毒桿菌C型神經毒素-胺基酸殘基(442-866) 肉毒桿菌D型神經毒素-胺基酸殘基(446-862) 肉毒桿菌E型神經毒素-胺基酸殘基(423-845) 肉毒桿菌F型神經毒素-胺基酸殘基(440-864) 肉毒桿菌G型神經毒素-胺基酸殘基(442-863) 破傷風神經毒素- 胺基酸殘基(458-879)
上面定義的參考序列應被視為指引，因根據亞血清型可能會發生輕微變化。舉例而言，US 2007/0166332(據此以引用的方式併入本文)引用稍微不同的梭狀芽孢桿菌序列： 肉毒桿菌A型神經毒素-胺基酸殘基(A449-K871) 肉毒桿菌B型神經毒素-胺基酸殘基(A442-S858) 肉毒桿菌C型神經毒素-胺基酸殘基(T450-N866) 肉毒桿菌D型神經毒素-胺基酸殘基(D446-N862) 肉毒桿菌E型神經毒素-胺基酸殘基(K423-K845) 肉毒桿菌F型神經毒素-胺基酸殘基(A440-K864) 肉毒桿菌G型神經毒素-胺基酸殘基(S447-S863) 破傷風神經毒素-胺基酸殘基(S458-V879)
於本發明之上下文中，包含轉位域的多種梭狀芽孢桿菌神經毒素H N區域可有用於本發明的態樣。於一具體實施例，此等活性片段可促進非細胞毒性蛋白酶(例如，梭狀芽孢桿菌L-鏈)自細胞內囊泡釋放至目標細胞的細胞質，如此參與執行整個細胞機制，因而梭狀芽孢桿菌神經毒素蛋白水解切割基質。來自梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈的H N區域為長度約410-430個胺基酸且包含轉位域。研究顯示來自梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈的H N區域之整個長度對於轉位域之轉位活性並非必須。如此，此具體實施例的態樣可包括梭狀芽孢桿菌神經毒素H N區域，其包含具有下列長度的轉位域，例如，至少350個胺基酸、至少375個胺基酸、至少400個胺基酸及至少425個胺基酸。此具體實施例的其它態樣可包括梭狀芽孢桿菌神經毒素H N區域，包含具有下列長度的轉位域，例如，最多350個胺基酸、最多375個胺基酸、最多400個胺基酸且最多425個胺基酸。
梭狀芽孢肉毒桿菌及破傷風桿菌產生的毒素之遺傳基礎的進一步詳細內容參見Henderson et al(1997) in The Clostridia ： Molecular Biology and Pathogenesis ， Academic press。
術語H N涵蓋自然發生的神經毒素H N部分、及具有天然不存在的胺基酸序列及/或合成的胺基酸殘基之經修飾的H N部分。於一具體實施例，該經修飾的H N部分仍展現上述轉位功能。
於較佳具體實施例，本發明之多肽包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C)或其片段。梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C)之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C)的≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50個胺基酸殘基。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C)之片段具有梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C)之至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200個胺基酸殘基。例如，梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C)之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C)之20-350、50-300或100-200個胺基酸殘基。
梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C)參考序列之例包括： BoNT/A-N872-L1296 BoNT/B-E859-E1291 BoNT/C1-N867-E1291 BoNT/D-S863-E1276 BoNT/E-R846-K1252 BoNT/F-K865-E1274 BoNT/G-N864-E1297 TeNT-I880-D1315
對於最近鑑定的BoNT/X，已報導H C域對應於其胺基酸893-1306，域邊界可能有約25個胺基酸的變動(例如，868-1306或918-1306)。
梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈可進一步包含轉位促進域。該域促進L-鏈遞送至目標細胞的胞質液，描述於例如，於WO 08/008803及WO 08/008805，每一者藉由引述而併入本文。
舉例而言，轉位促進域可包含梭狀芽孢桿菌神經毒素H CN域或片段或其變異體。更詳細而言，梭狀芽孢桿菌神經毒素H CN轉位促進域可具有至少200個胺基酸、至少225個胺基酸、至少250個胺基酸、至少275個胺基酸之長度。於此方面，梭狀芽孢桿菌神經毒素H CN轉位促進域較佳地具有至多200個胺基酸、至多225個胺基酸、至多250個胺基酸、或至多275個胺基酸之長度。特別(參考)例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素-胺基酸殘基(872-1110) 肉毒桿菌B型神經毒素-胺基酸殘基(859-1097) 肉毒桿菌C型神經毒素-胺基酸殘基(867-1111) 肉毒桿菌D型神經毒素-胺基酸殘基(863-1098) 肉毒桿菌E型神經毒素-胺基酸殘基(846-1085) 肉毒桿菌F型神經毒素-胺基酸殘基(865-1105) 肉毒桿菌G型神經毒素-胺基酸殘基(864-1105) 破傷風神經毒素-胺基酸殘基(880-1127)
上列序列位置依據血清型/亞型可有些微變化，合適的(參考)梭狀芽孢桿菌神經毒素H CN域之另外例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素-胺基酸殘基(874-1110) 肉毒桿菌B型神經毒素-胺基酸殘基(861-1097) 肉毒桿菌C型神經毒素-胺基酸殘基(869-1111) 肉毒桿菌D型神經毒素-胺基酸殘基(865-1098) 肉毒桿菌E型神經毒素-胺基酸殘基(848-1085) 肉毒桿菌F型神經毒素-胺基酸殘基(867-1105) 肉毒桿菌G型神經毒素-胺基酸殘基(866-1105) 破傷風神經毒素-胺基酸殘基(882-1127)
合適的梭狀芽孢桿菌神經毒素H C域描述於此。
梭狀芽孢桿菌神經毒素H C域可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列：8、22、30、38、42、44、46、48或50或其片段。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素H C域包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之多肽序列：8、22、30、38、42、44、46、48或50或其片段。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素H C域包含(更佳由其組成)包含下列SEQ ID NO之任一者之多肽序列：8、22、30、38、42、44、46、48或50或其片段。
梭狀芽孢桿菌神經毒素H C域可為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列編碼者：7、21、29、37、41、43、45、47或49或其片段。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素H C域為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列編碼者：7、21、29、37、41、43、45、47或49或其片段。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素H C域為經包含下列之SEQ ID NO任一者之核苷酸序列編碼者：7、21、29、37、41、43、45、47或49或其片段。
於一具體實施例，本發明中使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素H C域為變異的BoNT/A H C域。該變異的BoNT/A H C域可包含選自Y1117、F1252、H1253、及L1278之一或多個胺基酸殘基的修飾。例如，變異的BoNT/A H C域可包含一或多個(較佳地為二個以上)之下列修飾：Y1117V、F1252Y、H1253K、及L1278F或L1278H。
於一具體實施例，變異的BoNT/A H C域包含下列修飾：Y1117V及H1253K；或Y1117V、F1252Y、H1253K、及L1278F；或Y1117V、F1252Y、H1253K、及L1278H。
較佳地，變異的BoNT/A H C域包含下列修飾：Y1117V及H1253K；或Y1117V、F1252Y、H1253K、及L1278H。
修飾可為當與如SEQ ID NO：62所示的未經修飾的BoNT/A比較之一種修飾，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：62比對而決定。由於SEQ ID NO：62之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非強制的，所屬技術領域中具通常知識者將考量甲硫胺酸殘基之存在/不存在，當決定基酸殘基編號時。例如，於SEQ ID NO：62包括甲硫胺酸處，位置編號將如上定義(例如，Y1117將與SEQ ID NO：62之Y1117比對)。或者，於甲硫胺酸不存於SEQ ID NO：62處，胺基酸殘基編號應以-1修飾(例如，Y1117將與SEQ ID NO：52之Y1116比對)。當本文所述其它多肽序列之位置1上的甲硫胺酸存在/不存在時，適用相似考量，使用此項技術領域中的常規技術，所屬技術領域中具通常知識者將可輕易決定正確的胺基酸殘基編號。
變異的BoNT/A H C域可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列：46、48或50或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。於一具體實施例，變異的BoNT/A H C域包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之多肽序列：46、48或50或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。於一具體實施例，變異的BoNT/A H C域包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少99%或99.9%序列同一性之多肽序列：46、48或50或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。較佳地，變異的BoNT/A H C域包含(更佳由其組成)包含下列SEQ ID NO之任一者之多肽序列：46、48或50或其片段。
變異的BoNT/A H C域可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列：46或50或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。於一具體實施例，變異的BoNT/A H C域包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之多肽序列：46或50或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。於一具體實施例，變異的BoNT/A H C域包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少99%或99.9%序列同一性之多肽序列：46或50或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。較佳地，變異的BoNT/A H C域包含(更佳由其組成)包含下列SEQ ID NO之任一者之多肽序列：46或50或其片段。
變異的BoNT/A H C域為可經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列編碼者：45、47或49或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。於一具體實施例，變異的BoNT/A H C域可為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列編碼：45、47或49或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。於一具體實施例，變異的BoNT/A H C域可為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少99%或99.9%序列同一性之核苷酸序列編碼：45、47或49或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。較佳地，變異的BoNT/A H C域可為經下列SEQ ID NO之任一者編碼者：45、47或49或其片段。
變異的BoNT/A H C域可為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列編碼者：45或49或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。於一具體實施例，變異的BoNT/A H C域可為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列編碼者：45或49或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。於一具體實施例，變異的BoNT/A H C域可為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少99%或99.9%序列同一性之核苷酸序列編碼者：45或49或其片段，但書為變異的BoNT/A H C域包含如上所述的修飾。較佳地，變異的BoNT/A H C域可為經下列SEQ ID NO之任一者編碼者：45或49或其片段。
上述促進域之任一者可與先前所述適合本發明使用的轉位域肽組合。如此，舉例而言，非梭狀芽孢桿菌促進域可與非梭狀芽孢桿菌轉位域肽組合或與梭狀芽孢桿菌轉位域肽組合。或者，梭狀芽孢桿菌神經毒素H CN轉位促進域可與非梭狀芽孢桿菌轉位域肽組合。或者，梭狀芽孢桿菌神經毒素H CN促進域可與梭狀芽孢桿菌轉位域肽組合，其例包括： 肉毒桿菌A型神經毒素-胺基酸殘基(449-1110) 肉毒桿菌B型神經毒素-胺基酸殘基(442-1097) 肉毒桿菌C型神經毒素-胺基酸殘基(450-1111) 肉毒桿菌D型神經毒素-胺基酸殘基(446-1098) 肉毒桿菌E型神經毒素-胺基酸殘基(423-1085) 肉毒桿菌F型神經毒素-胺基酸殘基(440-1105) 肉毒桿菌G型神經毒素-胺基酸殘基(447-1105) 破傷風神經毒素-胺基酸殘基(458-1127)
於一些具體實施例，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之功能性H C域。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素較佳缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素全毒素之最後50個C-端胺基酸。於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素較佳缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素全毒素之最後100個，較佳最後150個，更佳最後200個，特佳最後250，且最佳最後300個C-端胺基酸殘基。或者，H C結合活性可藉由誘變(mutagenesis)而消除/減少–舉例而言，為方便起見，參閱BoNT/A，神經節苷脂結合袋中一或二個胺基酸殘基突變之修飾(W1266至L及Y1267至F)導致H C區域喪失其受體結合功能。可對非血清型A的梭狀芽孢桿菌肽組分進行類似突變，例如基於肉毒桿菌B具突變(W1262至L及Y1263至F)或肉毒桿菌E(W1224至L及Y1225至F)之構築體。其它對活性位的突變達成H C受體結合活性的相同消除，例如，肉毒桿菌A型毒素中的Y1267S及於其它梭狀芽孢桿菌神經毒素中對應的高度保守殘基。此及其它突變的細節描述於Rummel et al(2004)(Molecular Microbiol. 51：631-634)，其藉由引用被併入於此。
天然梭狀芽孢桿菌神經毒素之H C肽包含約400-440個胺基酸殘基，且由各自約25kDa的兩個功能不同的域(即N-端區域(通常稱為H CN肽或域)及C-端區域(通常稱為H CC肽或域))組成。此事實藉由下列公開文獻確認，其每一者藉由引用完整併入於此：Umland TC(1997) Nat. Struct. Biol. 4：788-792；Herreros J(2000) Biochem. J. 347：199-204；Halpern J(1993) J. Biol. Chem. 268：15，pp. 11188-11192；Rummel A(2007) PNAS 104：359-364；Lacey DB(1998) Nat. Struct. Biol. 5：898-902；Knapp(1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25：90；Swaminathan and Eswaramoorthy(2000) Nat. Struct. Biol. 7：1751-1759；及Rummel A(2004) Mol. Microbiol. 51(3)，631-643。此外，已有文獻充分證明構成C-端160-200個胺基酸殘基之C-端區域(H CC)負責梭狀芽孢桿菌神經毒素與其天然細胞受體之結合，即與神經肌肉會合處的神經末梢結合-此事實亦藉由上述公開文獻證實。因此，本說明書全文中，提及缺乏功能性重鏈H C肽(或域)以使得該重鏈無法結合與天然梭狀芽孢桿菌神經毒素結合的細胞表面受體的梭狀芽孢桿菌重鏈，表示該梭狀芽孢桿菌重鏈僅缺少功能性H CC肽。換言之，H CC肽區域可被部分或完全刪除，或以其它方式修飾(例如通過常規化學或蛋白水解處理)以降低其對神經肌肉會合處神經末端的天然結合能力。
因此，於一具體實施例，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素H N肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之C-端肽部分(H CC)的部分，因此缺少天然梭狀芽孢桿菌神經毒素之H C結合功能。舉例而言，於一具體實施例，C-端延長的梭狀芽孢桿菌H N肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之C-端40個胺基酸殘基、或C-端60個胺基酸殘基、或C-端80個胺基酸殘基、或C-端100個胺基酸殘基、或C-端120個胺基酸殘基、或C-端140個胺基酸殘基、或C-端150個胺基酸殘基、或C-端160個胺基酸殘基。於另一具體實施例，本發明之梭狀芽孢桿菌H N肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之完整C-端肽部分(H CC)，因此缺少天然梭狀芽孢桿菌神經毒素之H C結合功能。舉例而言，於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌H N肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之C-端165個胺基酸殘基、或C-端170個胺基酸殘基、或C-端175個胺基酸殘基、或C-端180個胺基酸殘基、或C-端185個胺基酸殘基、或C-端190個胺基酸殘基、或C-端195個胺基酸殘基。舉另外例而言，本發明之梭狀芽孢桿菌H N肽缺少選自下列組成的群組之梭狀芽孢桿菌H CC參考序列： 肉毒桿菌A型神經毒素-胺基酸殘基(Y1111-L1296) 肉毒桿菌B型神經毒素-胺基酸殘基(Y1098-E1291) 肉毒桿菌C型神經毒素-胺基酸殘基(Y1112-E1291) 肉毒桿菌D型神經毒素-胺基酸殘基(Y1099-E1276) 肉毒桿菌E型神經毒素-胺基酸殘基(Y1086-K1252) 肉毒桿菌F型神經毒素-胺基酸殘基(Y1106-E1274) 肉毒桿菌G型神經毒素-胺基酸殘基(Y1106-E1297) 破傷風神經毒素-胺基酸殘基(Y1128-D1315)。
以上鑑定的參考序列應被視為指引，因根據亞血清型可能會發生輕微變化。
於較佳具體實施例，本發明之多肽包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段及梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段。例如，多肽可包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段及梭狀芽孢桿菌神經毒素轉位域(H N)。較佳地，此多肽不另包含梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C)或至少梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域之C-端部分(H CC)。如此，於一具體實施例，本發明之多肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域之C-端部分(H CC)。或者，此種多肽約少內源性梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合能力，如此於投予該多肽的受試者中展現較少的脫靶效應(off-target effects)。
於一具體實施例，本發明之多肽實質上由梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段組成。此上下文中使用的術語「實質上由…組成」意指多肽不進一步包含給予多肽額外功能性之一或多個胺基酸殘基，例如，當被投予至受試者時。換言之，實質上由梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段組成之多肽可進一步包含一或多個胺基酸殘基(對於梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之彼等或其片段及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段)但該一或多個另外的胺基酸殘基不給予多肽額外的功能性，例如，當被投予至受試者時。額外的功能性可包括酵素活性、結合活性及/或任何生理活性。
於一具體實施例，除了任何梭狀芽孢桿菌神經毒素序列之外，多肽可包含非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列。非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列較佳不擾亂本發明之多肽促進神經元生長或神經元修復的能力。較佳地，非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列並非具有催化活性(例如，酵素活性)者。較佳地，非梭狀芽孢桿菌序列並非結合至細胞受體者。換言之，其最佳為非梭狀芽孢桿菌序列不為針對細胞受體之配體。細胞受體可為蛋白質的細胞受體，諸如整合膜蛋白。細胞受體之例可見於IUPHAR Guide to Pharmacology Database，version 2019.4，available at https：//www.guidetopharmacology.org/download.jsp#db_reports。非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列可包括有助於純化的標籤，諸如His標籤。其較佳為任何包含於該多肽之梭狀芽孢桿菌神經毒素序列，由梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段組成。於一具體實施例，包含於該多肽的梭狀芽孢桿菌神經毒素序列可由梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈組成。於一具體實施例，包含於該多肽的梭狀芽孢桿菌神經毒素序列可由梭狀芽孢桿菌神經毒素轉位域組成。於一具體實施例，包含於該多肽的梭狀芽孢桿菌神經毒素序列可由梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域組成。於一具體實施例，包含於該多肽的梭狀芽孢桿菌神經毒素序列可由梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及梭狀芽孢桿菌神經毒素轉位域組成。
合適的包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及轉位域之多肽描述於此。
包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及轉位域之梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列：4、20、28或36或其片段。於一包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及轉位域之梭狀芽孢桿菌神經毒素包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之多肽序列：4、20、28或36或其片段。較佳地，包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及轉位域之梭狀芽孢桿菌神經毒素包含(更佳由其組成)包含下列SEQ ID NO之任一者之多肽序列：4、20、28或36或其片段。
包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及轉位域之梭狀芽孢桿菌神經毒素可為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列編碼者：3、19、27或35或其片段。於一具體實施例，包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及轉位域之梭狀芽孢桿菌神經毒素為經與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列編碼者：3、19、27或35或其片段。較佳地，包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及轉位域之梭狀芽孢桿菌神經毒素為經包含下列之SEQ ID NO任一者之核苷酸序列編碼者：3、19、27或35或其片段。
本發明之多肽可不含天然存在的梭狀芽孢桿菌神經毒素複合物中存在的複合蛋白質。
使用重組核酸技術可生產本發明之多肽。如此，於一具體實施例，多肽(如上述)為重組多肽。
於一具體實施例，提供包含編碼多肽之核酸序列之核酸(例如，DNA)。於一具體實施例，將核酸序列製備為包含啟動子及終止子的DNA載體的一部分。
於一較佳具體實施例，載體具有選自下列之啟動子：
啟動子 誘導劑 典型誘導條件
Tac(雜合體) IPTG 0.2 mM(0.05-2.0mM)
AraBAD L-阿拉伯糖 0.2%(0.002-0.4%)
T7-lac操作子 IPTG 0.2 mM(0.05-2.0mM)
於另一較佳具體實施例中，載體具有選自下列之啟動子：
啟動子 誘導劑 典型誘導條件
Tac(雜合體) IPTG 0.2 mM(0.05-2.0mM)
AraBAD L-阿拉伯糖 0.2%(0.002-0.4%)
T7-lac操作子 IPTG 0.2 mM(0.05-2.0mM)
T5-lac操作子 IPTG 0.2 mM(0.05-2.0mM)
可使用所屬技術領域中已知的任何合適方法製備核酸分子。如此，該核酸分子可使用化學合成技術製造。或者，本發明的核酸分子可使用分子生物學技術製造。
本發明之DNA構築體較佳以電腦模擬(in silico)設計，然後藉由習知DNA合成技術合成。
根據所使用的最終宿主細胞(例如，大腸桿菌)表現系統，於密碼子偏倚(codon-biasing)，可選擇性地修飾上述核酸序列訊息。
術語「核苷酸序列」及「核酸」於本文為同意義地使用。較佳地，核苷酸序列為DNA序列。
本發明之多肽(且特別是其任何梭狀芽孢桿菌神經毒素部分)可為單鏈或為雙鏈存在。
本發明提供一種生產具有輕鏈及重鏈之單鏈多肽之方法，此方法包含於表現宿主中表現本文所述核酸，切割宿主細胞以提供含有該單鏈多肽之宿主細胞均質物，及單離該單鏈多肽。於一態樣中，本發明提供一種活化本文所述多肽之方法，該方法包含將該多肽與水解多肽的活化環中的肽鍵之蛋白酶接觸，因而轉化該(單鏈)多肽成對應的二鏈多肽(例如，其中該輕鏈及重鏈藉由雙硫鍵一起連結)。
因此本發明提供藉由本發明之方法可獲得的二鏈多肽。
與本發明之各種治療用途有關的具體實施例意圖同樣地應用於本發明之治療方法、多肽，反之亦然。
序列同源性可使用多種序列比對方法中的任一種來確定一致性百分比，包括但不限於整體法(global methods)、局部法和雜合體法((hybrid methods)，諸如，例如區段逼近法(segment approach method)。確定一致性百分比的實驗規程為本領域所屬技術領域中具有通常知識者範疇內的常規程序。整體法從分子的起始到末端比對序列，並藉由累加各個殘基對的分數並藉由施加間隙(gap)罰分(gap penalties)來確定最佳比對。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，參見例如Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequenc Alignment Through Sequenc Weighting，Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice，22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；及其疊代細化(iterative refinement)，參見例如，Osamu Gotoh，Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments，264(4) J. MoI. Biol. 823-838(1996)。局部方法藉由鑑定所有輸入序列共有的一個或多個保守基序來比對序列。非限制性方法包括，例如，Match-box，參見例如，Eric Depiereux and Ernest Feytmans，Match-Box：A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences，8(5) CABIOS 501-509(1992)；Gibbs sampling，參見例如，C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals：A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment，262(5131 ) Science 208-214(1993)；Align-M，參見例如，Ivo Van WaIIe et al., Align-M- A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences，20(9) Bioinformatics：1428-1435(2004)。
如此，藉由習知方法確定序列同一性百分比。參見例如，Altschul et al.， Bull. Math. Bio. 48：603-16，1986 及 Henikoff and Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915-19，1992。簡而言之，將兩個胺基酸序列進行比對，以優化比對得分，其使用間隙開放罰分10、間隙延伸罰分1以及Henikoff及Henikoff(同上)的「blosum 62」評分矩陣，如下所示(胺基酸藉由標準的單一字母代碼表示)。
在兩個以上核酸或胺基酸序列間的「序列同一性百分比」係在序列所共有的相同位置之數目的函數。因此，同一性%可以下述方式計算：相同核苷酸/胺基酸的數目除以核苷酸/胺基酸總數乘以100。序列同一性%的計算亦可考慮到為了最佳化兩個以上序列的比對所需要導入之間隙的數量、以及各間隙的長度。兩個以上序列之間的序列比較及一致性百分比的確定可使用例如BLAST的特定數學演算法進行，其為具有技術通常知識者所熟悉的。
用於確定序列同一性的比對分數
然後，同一性百分比計算為：
實質上同源的多肽特徵在於具有一或多個胺基酸取代、刪除或添加。這些改變較佳為較小性質，即保留的胺基酸取代(詳見下文)且不會顯著影響多肽的折疊或活性的其它取代；小刪除，通常刪除1至約30個胺基酸；及小的胺基或羧基末端延伸，諸如胺基末端的甲硫胺酸殘基、最多達約20-25個殘基的小型連接肽或親和性標籤。
保留的胺基酸取代
鹼性： 精胺酸
   離胺酸
   組胺酸
酸性： 麩胺酸
   天冬胺酸
極性： 麩醯胺酸
   天冬醯胺酸
疏水性： 白胺酸
   異白胺酸
   纈胺酸
芳香族： 苯丙胺酸
   色胺酸
   酪胺酸
小型： 甘胺酸
   丙胺酸
   絲胺酸
   蘇胺酸
   甲硫胺酸
除了20個標準胺基酸之外，非標準胺基酸(諸如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸及α-甲基絲胺酸)亦可取代本發明的多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保留胺基酸、非由遺傳密碼編碼的胺基酸及非天然胺基酸可取代多肽胺基酸殘基。本發明之多肽亦可包含非天然存在的胺基酸殘基。
非天然存在的胺基酸包括但不限於反式-3-甲基脯胺酸、2,4-甲橋-脯胺酸(2,4-methano-proline)、順式-4-羥基脯胺酸、反式-4-羥基-脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別-蘇胺酸、甲基-蘇胺酸、羥基-乙基半胱胺酸、羥基乙基升半胱胺酸(hydroxyethylhomo-cysteine)、硝基-麩醯胺酸、升麩醯胺酸(homoglutamine)、2-哌啶甲酸、三級白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯基-丙胺酸、4-氮雜苯基-丙胺酸、及4-氟苯丙胺酸。此項技術領域已知將非天然存在的胺基酸殘基併入蛋白質中的數種方法。例如，可使用活體外系統，其中使用經化學胺基醯化的壓制型tRNA(suppressor tRNA)而抑制無意義突變(nonsense mutation)。用於合成胺基酸和胺基醯化tRNA的方法為此項技術領域所知。包含無意義突變的質體的轉錄和轉譯係於無細胞系統中進行，該無細胞系統包含大腸桿菌S30萃取物及可商業上購得的酶和其它試劑。蛋白質可藉由層析純化。參見例如，Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113：2722，1991；Ellman et al., Methods Enzymol. 202：301，1991；Chung et al., Science 259：806-9，1993；及 Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：10145-9，1993)。於第二種方法中，藉由顯微注射突變的mRNA及經化學胺基醯化的壓制型tRNA，而在爪蟾卵母細胞(Xenopus oocyte)中進行轉譯(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271：19991-8，1996)。於第三種方法中，在欲替換的天然胺基酸(例如苯丙胺酸)不存在且所欲的非天然存在的胺基酸(例如2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸或4-氟苯丙胺酸)存在下培養大腸桿菌細胞。非天然存在的胺基酸被併入多肽中代替其天然的對應物。參見Koide et al., Biochem. 33：7470-6，1994。天然存在的胺基酸殘基可藉由活體外化學修飾而轉化為非天然存在的種類。化學修飾可與定點誘變結合以進一步擴大取代範圍(Wynn and Richards，Protein Sci. 2：395-403，1993)。
有限數量的非保留的胺基酸、非由遺傳密碼編碼的胺基酸、非天然存在的胺基酸及非天然的胺基酸可取代本發明之多肽的胺基酸殘基。
本發明之多肽中的必須胺基酸可根據所屬技術領域中已知的程序鑑定，諸如定點誘變或丙胺酸-掃描誘變(scanning mutagenesis)(Cunningham and Wells，Science 244：1081-5，1989)。生物相互作用的位置亦可藉由結構物理分析來確定，如藉由如核磁共振、結晶學、電子繞射或光親和性標幟(photoaffinity labeling)之技術，結合推定的接觸位胺基酸的突變。參見例如，de Vos et al., Science 255：306-12，1992；Smith et al., J. Mol. Biol. 224：899-904，1992；Wlodaver et al., FEBS Lett. 309：59-64，1992。必須胺基酸的同一性亦可由與本發明之多肽的相關組分(例如轉位或蛋白酶組分)的同源性分析來推斷。
可使用已知的誘變與篩選方法而進行及測試多個胺基酸取代，例如Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241：53-7，1988)或Bowie and Sauer(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：2152-6，1989)所揭示的彼等方法。簡而言之，此等作者揭示用於在多肽中同時隨機化二或多個位置，選擇功能性多肽，然後定序誘變的多肽以確定每個位置允許取代的幅度之方法。可使用的其它方法包括噬菌體展示(phage display)(例如，Lowman et al., Biochem. 30：10832-7，1991；Ladner et al., U.S.專利號No. 5，223，409；Huse，WIPO公開案WO 92/06204)及區域定向誘變(region-directed mutagenesis)(Derbyshire et al., Gene 46：145，1986；Ner et al., DNA 7：127，1988)。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有如被本揭示所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解的相同含義。Singleton, et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，20 ED., John Wiley and Sons，New York(1994)，及Hale & Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)為所屬技術領域中具通常知識者提供本揭示中使用的許多術語的一般詞典。
此揭示並不受限於本文所揭示的例示方法及材料，且與本文描述的彼等方法或材料相似或等同的任何方法和材料皆可用於本揭示之具體實施例的實施或試驗中。數字範圍包括定義範圍的數字。除非另有說明，否則任何核酸序列均以5'至3'方向從左至右書寫；胺基酸序列以胺基至羧基的方向從左至右書寫。
本文所提供的標題並非此揭示之各種態樣或具體實施例的限制。
胺基酸在本文中使用胺基酸的名稱、三字母縮寫或單字母縮寫來指稱。本文所使用之術語「蛋白質」包括蛋白質、多肽及肽。本文所使用之術語「胺基酸序列」與術語「多肽」及/或術語「蛋白質」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「肽」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「酶」同義。術語「蛋白質」和「多肽」在本文可互換使用。在本揭示及申請專利範圍中，可使用用於胺基酸殘基的習知一字母及三字母代碼。胺基酸的三字母代碼，係與IUPACIUB 聯合生化命名委員會(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)一致地定義。亦應理解的是，由於遺傳密碼的簡併性，一種多肽可藉由一種以上的核苷酸序列所編碼。
術語的其它定義可能在整個說明書中出現。在更詳細地描述例示性具體實施例之前，應理解本揭示不限於所描述的特定具體實施例，且因此可加以變化。亦應理解，本文中所使用的術語僅出於描述特定實施方式的目的，而並未意圖限制，因為本揭示的範疇僅由後附的申請專利範圍定義。
在提供一數值範圍時，應當理解，除非上下文另有明確指明，否則在該範圍的上限及下限之間的每個居中值(intervening value)至下限單位的十分之一亦被具體揭示。在本揭示中涵蓋在所述範圍內的任何所述值或居中值與所述範圍內的任何其它所述或居中值之間的每個較小範圍。此等較小範圍的上限及下限可獨立地在該範圍內被包括或排除，且於較小範圍內包含此限值中的任一個、兩個皆不包含或兩個皆包含之每個範圍亦被包括於本揭示內容中，受到於所述範圍內任何明確排除的限制。當於所述範圍包括此限值的一或兩個時，排除彼等所包含的限值之一或兩個的範圍亦包括於本揭示內容。
必須注意於本文及所附申請專利範圍中使用時，單數形式「一」、「一種」、及「該」包括複數的指涉對象，除非上下文另有明確規定。如此，例如，提及「一種梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括多種的此種候選藥劑，而提及「該梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括提及所屬技術領域中具有通常知識者已知的一或多種梭狀芽孢桿菌神經毒素及其等效物等。
本文中討論的出版物僅提供用於彼等在本申請案之申請日之前的揭示。本文中的任何內容均不應解釋為承認此類出版物構成所附之申請專利範圍的先前技術。
現僅藉由例示的方式，參考下列圖式及實施例描述本發明之具體實施例。
序列表於下列SEQ ID NO之任一者中指示初始Met胺基酸殘基或對應的初始密碼子時，該殘基/密碼子為任意的。 SEQ ID NO ： 1-重組催化性不活化的BoNT/A(rBoNT/A(0))之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 2-rBoNT/A(0)之多肽序列 SEQ ID NO ： 3-rLH N/A(僅輕鏈加上轉位域)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 4-rLH N/A之多肽序列 SEQ ID NO ： 5-rL/A(僅輕鏈)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 6-rL/A之多肽序列 SEQ ID NO ： 7-rH C/A之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 8-rH C/A之多肽序列 SEQ ID NO ： 9-rBoNT/B(0)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 10-rBoNT/B(0)之多肽序列 SEQ ID NO ： 11-rBoNT/C(0)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 12-rBoNT/C(0)之多肽序列 SEQ ID NO ： 13-rBoNT/E(0)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 14-rBoNT/E(0)之多肽序列 SEQ ID NO ： 15-rBoNT/F(0)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 16-rBoNT/F(0)之多肽序列 SEQ ID NO ： 17-rBoNT/A(0)(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 18-rBoNT/A(0)(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 19-rLH N/A(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 20-rLH N/A(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 21-rH C/A(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 22-rH C/A(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 23-rLC/A(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 24-rLC/A(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 25-rBoNT/FA(0)(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 26-rBoNT/FA(0)(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 27-rLH N/FA(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 28-rLH N/FA(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 29-rH C/FA(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 30-rH C/FA(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 31-rLC/FA(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 32-rLC/FA(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 33-rBoNT/F(0)(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 34-rBoNT/F(0)(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 35-rL HN/F(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 36-rL HN/F(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 37-rH C/F(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 38-rH C/F(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 39-rLC/F(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 40-rLC/F(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 41-陽離子性rH C/A(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 42-陽離子性rH C/A(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 43-rH C/AB(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 44-rH C/AB(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 45-rH C/A變異體Y1117V H1253K(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 46-rH C/A變異體Y1117V H1253K(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 47-rH C/A變異體Y1117V F1252Y H1253K L1278F(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 48-rH C/A變異體Y1117V F1252Y H1253K L1278F(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 49-rH C/A變異體Y1117V F1252Y H1253K L1278H(His-標籤的)之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 50-rH C/A變異體Y1117V F1252Y H1253K L1278H(His-標籤的)之多肽序列 SEQ ID NO ： 51-BoNT/A-UniProt P10845之多肽序列 SEQ ID NO ： 52-BoNT/B-UniProt P10844之多肽序列 SEQ ID NO ： 53-BoNT/C-UniProt P18640之多肽序列 SEQ ID NO ： 54-BoNT/D-UniProt P19321之多肽序列 SEQ ID NO ： 55-BoNT/E-UniProt Q00496之多肽序列 SEQ ID NO ： 56-BoNT/F-UniProt A7GBG3之多肽序列 SEQ ID NO ： 57-BoNT/G-UniProt Q60393之多肽序列 SEQ ID NO ： 58-TeNT – UniProt P04958之多肽序列 SEQ ID NO ： 59-BoNT/X之多肽序列 SEQ ID NO ： 60–mrBoNT/A之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 61–mrBoNT/A之多肽序列 SEQ ID NO ： 62–未經修飾的BoNT/A1之多肽序列 SEQ ID NO ： 63–mrBoNT/AB之多肽序列 SEQ ID NO ： 64–mrBoNT/AB(0)之多肽序列 SEQ ID NO ： 65–mrBoNT/A(0)之多肽序列 SEQ ID NO ： 1-rBoNT/A(0) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 2-rBoNT/A(0) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 3-rLH N /A 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 4-rLH N /A 之多肽序列 SEQ ID NO ： 5-rL/A 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 6-rL/A 之多肽序列 SEQ ID NO ： 7-rH C /A 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 8-rH C /A 之多肽序列 SEQ ID NO ： 9-rBoNT/B(0) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 10-rBoNT/B(0) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 11-rBoNT/C(0) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 12-rBoNT/C(0) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 13-rBoNT/E(0) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 14-rBoNT/E(0) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 15-rBoNT/F(0) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 16-rBoNT/F(0) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 17-rBoNT/A(0)(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 18-rBoNT/A(0)(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 19-rLH N /A(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 20-rLH N /A(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 21-rH C /A(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 22-rH C /A(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 23-rLC/A(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 24-rLC/A(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 25-rBoNT/FA(0)(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 26-rBoNT/FA(0)(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 27-rLH N /FA(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 28-rLH N /FA(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 29-rH C /FA(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 30-rH C /FA(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 31-rLC/FA(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 32-rLC/FA(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 33-rBoNT/F(0)(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 34-rBoNT/F(0)(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 35-rL H N/F(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 36-rL H N/F(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 37-rH C /F(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 38-rH C /F(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 39-rLC/F(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 40-rLC/F(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 41- 陽離子性 rH C /A(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 42- 陽離子性 rH C /A(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 43-rH C /AB(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 44-rH C /AB(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 45-rH C /A 變異體 Y1117V H1253K(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 46-rH C /A 變異體 Y1117V H1253K(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 47-rH C /A 變異體 Y1117V F1252Y H1253K L1278F(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 48-rH C /A 變異體 Y1117V F1252Y H1253K L1278F(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 49-rH C /A 變異體 Y1117V F1252Y H1253K L1278H(His- 標籤的 ) 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 50-rH C /A 變異體 Y1117V F1252Y H1253K L1278H(His- 標籤的 ) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 51-BoNT/A-UniProt P10845 之多肽序列 SEQ ID NO ： 52-BoNT/B-UniProt P10844 之多肽序列 SEQ ID NO ： 53-BoNT/C-UniProt P18640 之多肽序列 SEQ ID NO ： 54-BoNT/D-UniProt P19321 之多肽序列 SEQ ID NO ： 55-BoNT/E-UniProt Q00496 之多肽序列 SEQ ID NO ： 56-BoNT/F-UniProt A7GBG3 之多肽序列 SEQ ID NO ： 57-BoNT/G-UniProt Q60393 之多肽序列 SEQ ID NO ： 58-TeNT – UniProt P04958 之多肽序列 SEQ ID NO ： 59-BoNT/X 之多肽序列 SEQ ID NO ： 60–mrBoNT/A 之核苷酸序列 SEQ ID NO ： 61–mrBoNT/A 之多肽序列 SEQ ID NO ： 62– 未經修飾的 BoNT/A1 之多肽序列 SEQ ID NO ： 63–mrBoNT/AB 之多肽序列 SEQ ID NO ： 64–mrBoNT/AB(0) 之多肽序列 SEQ ID NO ： 65–mrBoNT/A(0) 之多肽序列 實施例
實施例 1 與未經處理的對照細胞相比，多種催化性不活化的 BoNT 血清型增加總軸索長度
[材料&方法] 五種催化性不活化(即，內肽酶不活化)肉毒桿菌神經毒素(BoNT)血清型被重組地表現於大腸桿菌，即對應於血清型A、B、C、E及F，並表示為rBoNT/A(0)、rBoNT/B(0)、rBoNT/C(0)、rBoNT/E(0)、及rBoNT/F(0)。由於催化性不活化的結果，此等分子無法切割其各自的(SNARE)蛋白質基質。 運動神經元樣雜合細胞系(NSC34細胞)(Tebu-Bio，Cedarlane laboratories，法國)以5000個細胞/孔被培養於聚-D-離胺酸塗附的黑多孔盤且培養於具有添加10% FCS及青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)的DMEM。平盤培養後，藉由暴露於1 uM 視網酸(retinoic acid)及低量血清中4日，細胞分化成運動神經元，然後將細胞以rBoNT/A(0)、rBoNT/B(0)、rBoNT/C(0)、rBoNT/E(0)及rBoNT/F(0)於0.1、1及10 nM之3種不同濃度下處理4日，並以三聚甲醛(paraformaldehyde)4%-蔗糖4%固定。使用腦衍生的神經營養性因子(BDNF)(自ReproTech EC Ltd, London, UK商購) 1ng/mL作為神經元外生(neuronal outgrowth)之陽性對照。細胞以三聚甲醛4%-蔗糖4%固定，然後以適當抗體染色。尤其，將抗βIII 微管蛋白mAb(Anti-βIII Tubulin mAb)(Promega G7121)稀釋(1：1000)於1xPBS+ 2% BSA+0.3% TritonX-100中，將平盤於37°C溫育3小時。然後投予Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)二級抗體(Life Tech cat. A-11001)(1：2000 in 1x PBS+2% BSA+0.3% TritonX-100)並於37°C 1h。以DAPI將核染色。影像分析：使用ArrayScan XTI HCA Reader(Thermo Fisher Scientific)以10倍物鏡拍攝，每孔取6個影像。使用Image J軟體(來自NIH的開放原始碼軟體，馬里蘭，USA)進行所有分析。進行三個獨立實驗。每一獨立實驗包含6個重複。
[結果] 將細胞暴露於不同催化性不活化的BoNT血清型4日(圖1)。圖1顯示NSC34細胞暴露於三種不同濃度之平均軸索外生。該圖呈現三個獨立實驗回合的平均值。當與未處理對照比較時，於平均軸索外生的數據確認rBoNT/A(0)增加每個NSC34細胞的軸索長度，相似於陽性對照BDNF。亦發現rBoNT/B(0)、rBoNT/C(0)、rBoNT/E(0)、及rBoNT/F(0)增加每個NSC34細胞的軸索長度。 如此，此等數據確認BoNT/A之神經營養性的特性亦可被外推至其它BoNT血清型。
實施例 2 BoNT L- 鏈及 LH N 增加總軸索長度，相對於對照組
[材料&方法] 催化性不活化的肉毒桿菌毒素rBoNT/A(0)被重組表現於大腸桿菌。BoNT/A之片段亦被表現於大腸桿菌，且被表示為輕鏈(L/A)、輕鏈及轉位域(LH N/A)、及重鏈之細胞結合域片段(H C/A)。NSC34細胞暴露於BoNT/A片段以及全長rBoNT/A(0)，如實施例1。
[結果] 圖2顯示NSC34細胞暴露於rBoNT/A(0)、rL/A、rLH N/A及rHc/A之三種不同濃度之平均軸索外生。該圖呈現三個獨立實驗回合的平均值。 相似於rH C/A，發現rL/A及rLH N/A兩者於每一濃度皆增加每個NSC34細胞的軸索長度，當與未處理對照比較時，相似於陽性對照BDNF。特別令人意外的是，rL/A及rLH N/A片段為神經營養性的，由於兩者缺少梭狀芽孢桿菌毒素受體結合域(呈現於rH C/A)。
實施例 3 於相似於 BoNT/A(0) 或其片段之濃度下被投予的其它蛋白質不會增加軸索外生
[材料&方法] 分化NSC34細胞，然後於下列實驗條件下培養4日：(1)未處理的細胞對照：細胞經歷與化合物處理的細胞相同次數的操作，即洗滌/餵養，然而未處理的對照細胞僅暴露於生長培養基，(2) BDNF–陽性試驗對照，1ng/ml，(3) 三劑量(0.1、1及10 nM)之BoNT/A(0)，(4)陰性試驗對照(蛋白質對照)：1. A7030，Sigma，牛血清白蛋白(BSA)，2. NBP1-37082，Bio-techne，重組人類膜聯蛋白(Annexin)A4蛋白質，3. U-100AT，Bio-techne，重組植物泛素蛋白質，4. 大腸桿菌表現溶胞產物，其不含有肉毒桿菌神經毒素或其片段。於1.5 ug/ml最終濃度下測試所有陰性對照蛋白質。此濃度對應10 nM之BoNT/A(0)。蛋白質溶液為於PBS，除了含有20%甘油、0.2M NaCl的膜聯蛋白4-20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)。所有蛋白質溶液均為1 mg/ml。細胞在1xPBS-4% BSA-0.3% TritonX100及二級抗體抗小鼠Alexa Fluor 488中以抗Beta III微管蛋白稀釋劑1：1000染色；使用DAPI作為核染色劑。使用NeurphologyJ(an Image J macro, NIH, 馬里蘭, USA)處例β3-微管蛋白訊息的所有原始影像。
[ 結果 ]將細胞暴露於三種不同實驗條件。圖3顯示於NSC34中平均軸索長度。該圖呈現三個獨立實驗回合的平均值。當與未處理對照比較時，於平均軸索外生的數據確認rBoNT/A(0) 增加每個NSC34細胞的軸索長度，相似於陽性對照BDNF。相比之下，其它「陰性對照」條件皆不會增加軸索長度。此確證在暴露於rL/A和rLH N/A(以及各種BoNT血清型和rH C/A)時觀察到的神經營養性作用，並證明此作用並非簡單地源於NSC34細胞暴露於蛋白質或於肉毒桿菌毒素製劑中存在假定的殘留大腸桿菌組分。
實施例 4 活體內神經元損傷的治療設計一項研究以調查使用活體內小鼠背柱病變模型的催化性不活化的肉毒桿菌毒素rBoNT/A(0)在增強功能恢復和神經再生中的功效。該模型有用於分析引起局部出芽及/或長道軸突再生的分子的功效。如眾所周知者，擠壓傷為脊髓損傷中的常見情況，因而該模型模擬了創傷後脊髓中發生的大多數病理變化(參見Lagord et al, 2002；Molecular and Cellular Neuroscience 20：69；Esmaelli et al., 2014；Neural Regeneration Research 9：1653；Surey et al., 2014；Neuroscience 275C：62；Almutiri et al., 2018；Scientific Reports 8：10707 關於此模型及損傷反應的詳細內容)。
[材料&方法]
[脊髓損傷之小鼠模型] 手術前，對C57/BL小鼠皮下注射丁丙諾啡(Buprenorphine)，並在1.8 ml/l的O 2中使用5%的異氟烷(Isoflurane)麻醉，並在整個手術過程中監測體溫和心率。在胸部第8層(T8)進行部分椎板切除術後，使用經校準的鐘錶匠的1mm深x1mm寬的鑷子雙向擠壓脊髓背柱(spinal dorsal column，SDC)之上升感覺、下降運動和節段本體感受軸突(segmental proprioceptive axons，SPA)。
[藥物投予] rBoNT/A(0) 投予係在手術時藉由3種劑量(100pg、100ng及50µg/小鼠)之一的鞘內單次10µl注射(進入椎管的CSF)。每3種劑量的治療組如下： 1.媒劑(磷酸鹽緩衝食鹽水[PBS])，即SDC病變加10μl鞘內立即單次注入媒劑；n＝6隻小鼠。 2.BoNT治療，即SDC病變加上10μl鞘內立即單次注射3種劑量的BoNT(100pg、100ng及50μg/小鼠)之一；3×n=6/組；18隻小鼠。 鞘內注射BoNT如下列進行。將小鼠置於俯臥位置，並在L5和S1脊椎之間注射。切開棘突並向後反映以顯示黃韌帶，並以水平60°的角度將鈍的25G針插入黃韌帶，並通過腦脊液(CSF)回流及「輕打尾(tail flick)」的存在確認存在鞘內腔。然後在1分鐘內緩慢注入10 µl注射液，並藉由輕柔的尾巴抬高促進CSF表現。
[測量的終點] 1.在基線使用水平梯行走試驗(horizontal ladder walking test)測量運動功能(損傷前)，然後再次於SDC損傷後2d、1w、2w、3w及4w測量。 2.運動和感覺神經元/軸突發芽和再生的4w時間點的定性組織學評估，即，短距離(＜1mm)和長距離(~5mm)的軸突生長。Neurofilament 200(NF200)染色的組織切片可檢測到成熟的軸突。磷酸化的MAP1b存在於生長的軸突和生長錐中，在其中它可以維持細胞骨架組分之間的動態平衡，並調節微管和肌動蛋白的穩定性和相互作用，從而促進中樞神經系統中的軸突生長、神經連接性及再生。MAP1b染色顯示活躍的軸突出芽區域。
[水平梯試驗] 此測試運動功能並於0.6公尺長的水平梯上進行，寬度為8cm，橫木隨機調整，可變動的間隙為1-2 cm。損傷前、然後於SDC損傷後2d、1w、2w、3w及4w，再次評估小鼠在梯子上的移動，並記錄左、右後爪滑倒的情況，並由不知道治療組的個人記錄步數。為了計算平均錯誤率，將滑倒數除以總步數。
[組織製備和冷凍切片] 在SDC損傷後第4w，對小鼠進行心內灌注4%甲醛(Raymond A Lamb，Peterborough，UK)，並解剖含有DC損傷部位的T8脊髓的各節(損傷部位+兩側5mm)以及脛腓骨肌在室溫下固定2小時，在一系列蔗糖中冷凍保護，在最佳切割溫度媒質(OCT；Raymond A Lamb)中封閉，並使用Bright低溫恆溫器切成15μm的厚度。
[免疫組織化學] 在0.1M磷酸鹽緩衝液pH7.4(PBS; Raymond A Lamb)中洗滌兩次之前，將切片在室溫下解凍30分鐘。然後將切片在PBS(Sigma)中的0.1%Triton X-100中通透化10分鐘，並在室溫下在含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)和0.1%Triton-X100(均來自Sigma)的PBS中封閉30min。然後將切片與用抗體稀釋緩衝液(ADB；含有0.5%BSA和0.05%Tween-20(均來自Sigma)的PBS)稀釋的適合的一級抗體培育，並在4°C的潮濕箱中培育隔夜。然後將切片在PBS中洗滌，並與在ADB中稀釋的適當的螢光標記的二級抗體一起培育。然後將切片在PBS中洗滌，並用含有DAPI的Vectashield(Vector Laboratories，Peterborough，UK)固定蓋玻片。在每次運行中均包括陰性對照，其中包括一級抗體的省略，且此等被用於設置圖像捕獲的背景閾值水平。使用配備有運行Axiovision軟體的Axiocam HRc的Axioplan 2落射螢光顯微鏡(epifluorescent microscope)觀察切片並捕獲圖像。
使用的一級抗體如下： ●兔抗NF200 Sigma, Poole, UK(1：300稀釋) ●兔MAP1b Abcam, Cambridge, UK(1：400稀釋)
使用的二級抗體如下： ●Alexa 488抗兔IgG Invitrogen, Paisley, UK(1：400稀釋) ●Alexa 594抗兔IgG Invitrogen, Paisley, UK(1：400稀釋)
[統計] 使用SPSS 20(IBM，美國)對功能數據進行統計分析。進行正態分布檢驗(Normal distribution test)以確定最適合的統計分析以比較治療。統計顯著性確定為p ＜0.05。
[結果]
圖4顯示與100 pg和100 ng劑量的媒劑對照相比，在第2日投予rBoNT/A(0)減少了背柱損傷引起的運動功能障礙的程度。在所有測試劑量下，與媒劑對照相比，投予rBoNT/A(0)4週時可顯著減少背柱損傷引起的運動功能障礙及恢復率。此外，鞘內注射rBoNT/A(0)的效果比脊髓內投予的效果更為明顯(數據未顯示)。
免疫組織化學評估採用對神經絲 200(NF200)和MAP1b的抗體。神經絲200(NF200)在成熟的軸突中表現，pMAP1b抗體在活躍出芽的軸突末端顯現神經絲，說明軸突仍在病變部位周圍和內部活躍出芽。
圖5A結果顯示於媒劑治療的動物之病變部位周圍可見許多NF200染色的軸突，於未經治療的動物之病變部位核心內幾乎沒有NF200+軸突存在。相較於此，於rBoNT/A(0)處理的動物之病變部位周圍可見許多NF200染色的軸突，在病變部位核心內亦可見許多NF200+軸突。
圖5B顯示於媒劑治療的動物之病變部位周圍可見適量的MAP1b染色的出芽軸突，於病變部位核心內幾乎沒有MAP1b軸突存在。相較於此，MAP1b染色顯示，在rBoNT/A(0)處理的動物中，病變部位周圍出現了明顯的軸突出芽，並且在整個病變部位的核心處亦有分支。
功能測試中性能改善開始的迅速性顯示了rBoNT/A(0)引起軸突出芽，並在病變下方建立了有用的功能性突觸。定性免疫組織化學提供BoNT誘導的通過SDC病變部位局部明顯的軸突出芽的證據。
此等活體內數據為清楚的證據，證實rBoNT/A(0)於神經障礙之治療中的角色。
實施例 5 全長催化性不活化的重組 BoNTs 、 BoNT 片段、及變異體對於每個細胞的軸索數目的效果
於活體外測試許多全長催化性不活化的重組BoNT血清型、以及BoNT片段、及變異體對於軸索外生的調節作用。
[材料&方法]
將暴露於多肽的細胞與暴露於陽性對照(1ng/ml BDNF)的細胞進行比較。分化小鼠運動神經元樣雜合(NSC34)細胞，並於4日的活體外(DIV)中暴露於3種不同劑量(0.1 nM、1 nM及10 nM)的不同多肽。
藉由融合富含運動神經元的胚胎小鼠脊髓細胞與小鼠神經母細胞瘤而產生NSC34細胞(Cashman et al. Dev Dyn. 1992 Jul；194(3)：209-21，其藉由引用併入本文中)。該細胞模擬運動神經元的許多性質，包括膽鹼乙醯基轉移酶、乙醯膽鹼合成、儲存及釋放以及神經絲三聯體蛋白(neurofilament triplet protein)。此外，NSC34脊髓運動神經元表現麩胺酸受體蛋白並產生動作電位。NSC34神經元已被廣泛用於研究神經元訊息傳導和神經元變性的機制。
採用下列實驗方案：於神經元細胞系(NSC34)之篩選：
將NSC34細胞培養在於加10%FCS的DMEM中的經聚D-離胺酸塗覆的玻璃蓋玻片上。
接種後，藉由暴露於視網酸及低血清水平達4日，將細胞分化為運動神經元。在特定時間點(即，4 DIV)，於存在/不存在多肽的情況下培養細胞。將測試數據與於陽性(BDNF)所見及陰性(BSA)對照數據的效果進行比較。
活體外(DIV)4日後，將細胞固定於4%三聚甲醛中，以特定的神經元標記(β微管蛋白)染色，並定量檢測軸索外生(軸索延伸、軸突伸長、樹枝狀)。使用Operetta CLS HCS顯微鏡(PerkinElmer)，藉由20倍物鏡進行影像採集。每孔獲得六(6)個視野。進行軸索外生分析並評估每個細胞的平均軸索。
[結果]
圖6至圖10表示在三個獨立的實驗期中評估的每個細胞上計數的軸索數量的平均值。在未處理的對照細胞上將數據標準化。與BSA相比，多肽在統計學上顯著增加每個細胞的軸索數量。
對於BoNT/A，與細胞結合域(H C域)片段相比，LH N/A片段(輕鏈加上轉位域)具有增加的活性(參見圖6)。
對於BoNT/FA和BoNT/F，與H C片段相比，LH N和LC(僅輕鏈)片段均顯示增進的活性(參見圖7及圖8)。
最後，所有變異的H C域片段均顯示出高效率(圖9及圖10)，陽離子H C/A域(SEQ ID NO：42–圖9)展現優異的活性，相對於BDNF，於3個濃度的2個濃度下，其活性得到改善。預期陽離子H C/A域的高活性於包含該域的全長多肽中亦為明顯的(無論是催化性不活化或是活化的)。
於上述說明書中提及的所有出版物均藉由引用併入本文。在不脫離本發明的範疇及精神下，本發明所描述的方法及系統的各種修飾和變化對所屬技術領域中具有通常知識者而言將為顯而易見的。儘管已結合特定較佳具體實施例對本發明進行描述，但應當理解，所請發明不應過度限於此類特定具體實施例。實際上，對於生物化學和生物技術或相關技術領域中具有通常知識者而言顯而易見的是，所述用於實施本發明之模式的各種修飾皆在以下申請專利範圍的範疇內。
[項目] 1.一種使用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含： 梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L-鏈)或其片段；及/或 梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈(H-鏈)之片段。 2.一種用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含： 梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段；及/或 梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段。 3.一種多肽於製造藥物之用途，該藥物係用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙，其中該多肽包含： 梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段；及/或 梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段。 4.如項1之使用的多肽、項2之方法、或項3之用途，其中該L-鏈為催化性不活化的。 5.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽基本上由梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L-鏈)或其片段；及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈(H-鏈)之片段組成。 6.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽由梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L-鏈)或其片段；及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈(H-鏈)之片段組成。 7.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段包含：轉位域(H N)或其片段；或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C)或其片段。 8.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段包含H N域或其片段。 9.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段係由H N域或其片段組成。 10.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段包含H C域或其片段。 11.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈之片段係由H C域或其片段組成。 12.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H CC)之C-端部分。 13.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽不包含梭狀芽孢桿菌神經毒素H N域及H C域兩者。 14.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽不另包含非梭狀芽孢桿菌催化域。 15.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含：一梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段、及H N域或其片段。 16.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽由下列組成：梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈或其片段、及H N域或其片段。 17.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽由下列組成：梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈及H N域。 18.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49之任一者具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50之任一者具有至少70%序列同一性的多肽序列。 19.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49之任一者具有至少80%序列同一性的核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50之任一者具有至少80%序列同一性的多肽序列。 20.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49之任一者具有至少90%序列同一性的核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50之任一者具有至少90%序列同一性的多肽序列。 21.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49之任一者具有至少95%序列同一性的核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50之任一者具有至少95%序列同一性的多肽序列。 22.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49之任一者具有至少99%序列同一性的核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50之任一者具有至少99%序列同一性的多肽序列。 23.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49之任一者具有至少99.9%序列同一性的核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50之任一者具有至少99.9%序列同一性的多肽序列。 24.一種使用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈。 25.一種用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈。 26.一種包含催化性不活化的梭狀芽孢桿菌神經毒素L-鏈之多肽於製造藥物之用途，該藥物係用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙。 27.一種使用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性的多肽序列及/或其中該多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。 28.一種用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性的多肽序列及/或其中該多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。 29.一種多肽於製造藥物之用途，該藥物係用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙，其中該多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性的多肽序列及/或其中該多肽包含經與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列。 30.如項27至項29中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：42具有至少80%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：41具有至少80%序列同一性之核苷酸序列編碼。 31.如項27至項30中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：42具有至少90%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：41具有至少90%序列同一性之核苷酸序列編碼。 32.如項27至項31中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：42具有至少95%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：41具有至少95%序列同一性之核苷酸序列編碼。 33.如項27至項32中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：42具有至少99%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：41具有至少99%序列同一性之核苷酸序列編碼。 34.如項27至項33中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：42具有至少99.9%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：41具有至少99.9%序列同一性之核苷酸序列編碼。 35.如項27至項34中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：61或65具有至少70%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：60具有至少70%序列同一性之核苷酸序列編碼。 36.如項27至項35中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：61或65具有至少80%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：60具有至少80%序列同一性之核苷酸序列編碼。 37.如項27至項36中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：61或65具有至少90%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：60具有至少90%序列同一性之核苷酸序列編碼。 38.如項27至項37中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：61或65具有至少95%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：60具有至少95%序列同一性之核苷酸序列編碼。 39.如項27至項38中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：61或65具有至少99%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：60具有至少99%序列同一性之核苷酸序列編碼。 40.如項27至項39中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：61或65具有至少99.9%序列同一性之多肽序列及/或其中該多肽係經與SEQ ID NO：60具有至少99.9%序列同一性之核苷酸序列編碼。 41.一種使用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：63或64具有至少70%序列同一性之多肽序列。 42.一種用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙之方法，該方法包含投予多肽至受試者，其中該多肽包含與SEQ ID NO：63或64具有至少70%序列同一性之多肽序列。 43.一種多肽於製造藥物之用途，該藥物係用於促進神經元生長或神經元修復以治療受試者中的神經障礙，其中該多肽包含與SEQ ID NO：63或64具有至少70%序列同一性之多肽序列。 44.如項41至項43中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：63或64具有至少80%序列同一性之多肽序列。 45.如項41至項44中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：63或64具有至少90%序列同一性之多肽序列。 46.如項41至項45中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：63或64具有至少95%序列同一性之多肽序列。 47.如項41至項46中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：63或64具有至少99%序列同一性之多肽序列。 48.如項41至項47中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含(較佳由其組成)與SEQ ID NO：63或64具有至少99.9%序列同一性之多肽序列。 49.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽不包含天然的梭狀芽孢桿菌神經毒素H-鏈。 50.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為神經營養性的。 51.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽促進神經元生長及/或神經元修復。 52.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該神經障礙為可藉由促進神經元生長及/或修復而治療的障礙。 53.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該神經障礙為神經元損傷、神經退化性疾病、感覺障礙或自主神經系統障礙。 54.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該神經障礙為神經元損傷，選自：神經創傷(例如，由結疤及/或由骨折造成)、神經病變(例如，周邊神經病變)、脊髓損傷(例如，包括麻痺)、神經截斷、腦損傷(例如，創傷性腦損傷)、非創傷性損傷(例如，中風或脊髓梗塞)、及臂神經叢的損傷，例如，歐勃氏麻痺(Erb’s palsy)或克蘭氏麻痹(Klumpke’s palsy)。 55.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該神經障礙為神經退化性疾病，選自：阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、與帕金森氏症有關的障礙、運動神經元疾病、周邊神經病變、運動神經病變、普里昂疾病(prion disease)、杭丁頓氏症(Huntington’s disease)、脊髓小腦性失調症(spinocerebellar ataxia)、脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy)、單肢肌萎縮症(monomelic amyotrophy)、福萊德瑞克氏運動失調症(Friedreich’s ataxia)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、及額顳葉變性(frontotemporal lobar degeneration)。 56.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽促進運動神經元的生長或修復。 57.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素，諸如嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素或雜合(hybrid)梭狀芽孢桿菌神經毒素。 58.如項24至項34或項49至項57中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為催化性不活化的且： a.係經與SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或60之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列。 59.如項24至項34或項49至項58中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為催化性不活化的且： a.係經與SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或60之任一者具有至少80%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少80%序列同一性之多肽序列。 60.如項24至項34或項49至項59中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為催化性不活化的且： a.係經與SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或60之任一者具有至少90%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少90%序列同一性之多肽序列。 61.如項24至項34或項49至項60中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為催化性不活化的且： a.係經與SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或60之任一者具有至少95%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少95%序列同一性之多肽序列。 62.如項24至項34或項49至項61中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為催化性不活化的且： a.係經與SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或60之任一者具有至少99%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少99%序列同一性之多肽序列。 63.如項24至項34或項49至項62中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為催化性不活化的且： a.係經與SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、或60之任一者具有至少99.9%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65之任一者具有至少99.9%序列同一性之多肽序列。 64.如項24至項26或項49至項63中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：1、9、11、13、15、17、25或33之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列。 65.如項24至項26或項49至項64中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：1、9、11、13、15、17、25或33之任一者具有至少80%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65之任一者具有至少80%序列同一性之多肽序列。 66.如項24至項26或項49至項65中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：1、9、11、13、15、17、25或33之任一者具有至少90%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65之任一者具有至少90%序列同一性之多肽序列。 67.如項24至項26或項49至項66中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：1、9、11、13、15、17、25或33之任一者具有至少95%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65之任一者具有至少95%序列同一性之多肽序列。 68.如項24至項26或項49至項67中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：1、9、11、13、15、17、25或33之任一者具有至少99%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65之任一者具有至少99%序列同一性之多肽序列。 69.如項24至26或49至68中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽： a.係經與SEQ ID NOs：1、9、11、13、15、17、25或33之任一者具有至少99.9%序列同一性之核苷酸序列編碼；或 b.包含(較佳由其組成)與SEQ ID NOs：2、10、12、14、16、18、26、34、64或65之任一者具有至少99.9%序列同一性之多肽序列。 70.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽係被投予至損傷位置上、或被投予至損傷位置附近，較佳地其中該多肽經鞘內腔投予。 71.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽不另包含與細胞受體結合的域。 72.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之功能性H C域且亦缺少任一功能性相等的外源性配體標的部位(Targeting Moiety，TM)。 73.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽未於受試者之細胞中表現。 74.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽之梭狀芽孢桿菌序列係由梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L-鏈)或其片段；及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈(H-鏈)之片段組成。 75.如前述項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽進一步包含一或多個非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列。 76.如項75之使用的多肽、方法或用途，其中該一或多個非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列不與細胞受體結合。 77.如項75或項76之使用的多肽、方法或用途，其中該一或多個非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列不包含針對細胞受體之配體。 78.如項1至項40或項49至項77中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為經修飾的BoNT/A或其片段，其包含於選自下列之一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，其中該修飾係選自： i.酸性表面暴露的胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代； ii.酸性表面暴露的胺基酸殘基以未帶電胺基酸殘基取代； iii.未帶電表面暴露的胺基酸殘基以鹼性胺基酸殘基取代； iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及 v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。 79.如項1至項26或項41至項77中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為嵌合BoNT，該嵌合BoNT包含BoNT/A輕鏈及轉位域、及BoNT/B受體結合域(H C域)。
無
圖 1顯示在運動神經元樣細胞系NSC34中，相較於陽性對照腦衍生的神經營養性因子(BDNF)，不同重組表現的催化性不活化的BoNT血清型之神經營養性的效果。*相對於未處理對照組，p＜0.05，單向ANOVA，然後鄧奈特多重比較檢定(Dunnett’s multiple comparison test)。數據為三個獨立實驗的平均值±標準誤差，每一者在六個重複孔中進行。 圖 2顯示在運動神經元樣細胞系NSC34中肉毒桿菌神經毒素血清型A片段之神經營養性的效果及重組表現的催化性不活化的BoNT/A的效果。使用BDNF作為陽性對照。*相對於未處理對照組，p＜0.05，單向ANOVA，然後鄧奈特多重比較檢定。數據為三個獨立實驗的平均值±標準誤差，每一者在六個重複孔中進行。 圖 3顯示在運動神經元樣細胞系NSC34中陰性對照相對於重組表現的催化性不活化的BoNT/A(BoNT/A(0))之神經營養性的效果。使用BDNF作為陽性對照。*相對於未處理對照組，p＜0.05，單向ANOVA，然後鄧奈特多重比較檢定。數據為三個獨立實驗的平均值±標準誤差，每一者在六個重複孔中進行。 圖 4顯示於100 pg、100 ng或50 ug對小鼠投予的媒劑對照(PBS)或rBoNT/A(0)之水平梯試驗(horizontal ladder test)的結果。 圖 5顯示：( A)在投予媒劑(PBS)(左圖)或100 ng rBoNT/A(0)(右圖)後第4週時使用結合神經絲(neurofilament)200(NF200)的抗體進行免疫組織化學；及( B)在投予媒劑(PBS)(左圖)或100 ng rBoNT/A(0)(右圖)後第4週時使用結合MAP1b的抗體進行免疫組織化學。病變部位以*表示(且於圖5B，以白色箭頭表示)。 圖 6顯示( A)催化性不活化的BoNT/A(0)、( B)BoNT/A輕鏈加上轉位域片段(LH N/A)、( C)BoNT/A輕鏈(LC/A，即L/A)、及( D)BoNT/A受體結合域(H C/A)對每個細胞之軸索數目的效果。將BoNT或BoNT片段與BSA(陰性對照)、BDNF(陽性對照)比較，於0.1 nM、1 nM、及10 nM之濃度下進行測試。*相對於BSA對照，p＜0.05，單向ANOVA然後鄧奈特事後比較檢定(Dunnett’s post hoc test)。數據為平均值± s.e.平均值。 圖 7顯示( A)催化性不活化的BoNT/FA(0)、( B)BoNT/FA輕鏈加上轉位域片段(LH N/FA)、( C)BoNT/FA輕鏈(LC/FA，即L/FA)、及( D)BoNT/FA受體結合域(H C/FA)對每個細胞之軸索數目的效果。將BoNT或BoNT片段與BSA(陰性對照)、BDNF(陽性對照)比較，於0.1 nM、1 nM、及10 nM之濃度下進行測試。*相對於BSA對照，p＜0.05，單向ANOVA然後鄧奈特事後比較檢定。數據為平均值± s.e.平均值。 圖 8顯示( A)BoNT/F輕鏈加上轉位域片段(LH N/F)、( B)BoNT/F輕鏈(LC/F，即L/F)、及( C)BoNT/F受體結合域(H C/F)對每個細胞之軸索數目的效果。將BoNT或BoNT片段與BSA(陰性對照)、BDNF(陽性對照)比較，於0.1 nM、1 nM、及10 nM之濃度下進行測試。*相對於BSA對照，p＜0.05，單向ANOVA然後事後比較檢定鄧奈特事後比較檢定。數據為平均值± s.e.平均值。 圖 9顯示陽離子性rH C/A(即mrHC/A)對每個細胞之軸索數目的效果。將陽離子性BoNT片段與BSA(陰性對照)、BDNF(陽性對照)比較，於0.1 nM、1 nM、及10 nM之濃度下進行測試。*相對於BSA對照，p＜0.05，單向ANOVA然後事後比較檢定鄧奈特事後比較檢定。數據為平均值± s.e.平均值。 圖 10顯示( A)toxHC/A YH(即rH C/A 變異體Y1117V H1253K) 及( B) toxHC/A YFHL(L至H)(即rH C/A 變異體Y1117V F1252Y H1253K L1278H)對每個細胞之軸索數目的效果。將變異的BoNT片段與BSA(陰性對照)、BDNF(陽性對照)比較，於0.1 nM、1 nM、及10 nM之濃度下進行測試。*相對於BSA對照，p＜0.05，單向ANOVA然後事後比較檢定鄧奈特事後比較檢定。數據為平均值± s.e.平均值。
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無。

Claims (10)

  1. 一種梭狀芽孢桿菌毒素多肽於製造藥物之用途，該藥物係用於治療受試者中的神經障礙，其中該多肽包含：(a)具有與SEQ ID NO：63、61、44或42具有至少90%序列同一性的多肽序列；及/或(b)經與SEQ ID NO：43、60或41具有至少90%序列同一性的核苷酸序列編碼的多肽序列；其中該多肽被投予至受試者的劑量為至少50ng。
  2. 如請求項1之用途，其中該多肽為二鏈多肽，其中該多肽的輕鏈(L-鏈)與該多肽的重鏈(H-鏈)經由雙硫鍵連結，且其中該二鏈多肽係藉由一種方法可獲得，該方法包含將包含具有與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：61具有至少90%序列同一性的多肽序列的單鏈多肽，與水解活化環中的肽鍵之蛋白酶接觸，因而轉化該單鏈多肽成對應的二鏈多肽。
  3. 如請求項1之用途，其中該神經障礙為感覺障礙、神經元損傷或神經退化性疾病。
  4. 如請求項3之用途，其中該感覺障礙係選自疼痛、感覺神經病變、多發感覺運動神經病變(sensorimotor polyneuropathy)、糖尿病性神經病變、布朗-斯夸症候群(Brown-Sequard syndrome)、夏馬杜三氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、及戴維克症候群(Devic’s syndrome)。
  5. 如請求項3之用途，其中該神經元損傷係選自神經創傷、神經病變、脊髓損傷、神經截斷、腦損傷、非創傷性損傷、及臂神經叢的損傷。
  6. 如請求項5之用途，其中該神經創傷係由結疤及/或由骨折造成；該神經病變為周邊神經病變；該脊髓損傷包括麻痺；該腦損傷為創傷性腦損傷；該非創傷性損傷為中風或脊髓梗塞；或該臂神經叢的損傷為歐勃氏麻痺(Erb’s palsy)或克蘭氏麻痹(Klumpke’s palsy)。
  7. 如請求項3之用途，其中該神經退化性疾病係選自：阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、與帕金森氏症有關的障礙、運動神經元疾病、周邊神經病變、運動神經病變、普里昂疾病(prion disease)、杭丁頓氏症(Huntington’s disease)、脊髓小腦性失調症(spinocerebellar ataxia)、脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy)、單肢肌萎縮症(monomelic amyotrophy)、福萊德瑞克氏運動失調症(Friedreich’s ataxia)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、及額顳葉變性(frontotemporal lobar degeneration)。
  8. 如請求項1之用途，其中投予該多肽至受試者的劑量至多500ng。
  9. 如請求項1之用途，其中該多肽為神經營養性。
  10. 如請求項1之用途，其中該多肽促進神經元生長及/或神經元修復以治療神經障礙。
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