CN114502574A - 梭菌神经毒素变体用于治疗神经障碍的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含：梭菌神经毒素轻链(L‑链)或其片段；和/或梭菌神经毒素重链(H‑链)的片段。还提供了用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的其他多肽，以及相应的方法和用途。

Description

梭菌神经毒素变体用于治疗神经障碍的用途
本发明涉及神经障碍的治疗。
神经障碍包括神经元损伤、神经退行性障碍、感觉障碍和自主神经障碍。
神经元损伤，如脊髓损伤(SCI)，导致受损轴突退化，从而阻止正常的感觉、运动和自主神经功能。恢复可以通过内源性机制发生，如受损轴突的再生和未受损轴突的侧索生芽，从而导致去神经目标的神经支配恢复。然而，成年哺乳动物中受损神经元(尤其是脊髓)的再生能力有限，并且患者可能遭受各种残疾，这极大地影响了生活质量。
神经元损伤的常规疗法包括白细胞介素-6(IL-6)和干细胞移植，然而很少有处于临床使用的开发阶段。因此，仍然需要能够促进神经元生长或修复的用于神经元损伤的治疗剂。
梭菌属(Clostridia)中的细菌产生高毒力的和特定的蛋白质毒素，这种毒素毒害其被运送到的神经元和其他细胞。此类梭菌毒素的实例包括破伤风梭菌(C.Tetani)产生的神经毒素(TeNT)和肉毒杆菌(C.botulinum)产生的神经毒素(BoNT)血清型A-G和X(参见WO2018/009903 A2)，以及巴拉特梭菌(C.Baratii)和丁酸梭菌(C.Butyricum)产生的神经毒素。
在梭菌神经毒素中，已知有一些毒力最强的毒素。举例来说，取决于血清型，肉毒杆菌神经毒素对小鼠具有范围从0.5至5ng/kg的中位致死剂量(LD50)值。破伤风毒素和肉毒杆菌毒素均通过抑制受影响的神经元的功能，特别是抑制神经递质的释放而起作用。肉毒杆菌毒素作用于神经肌接头并抑制周围神经系统的胆碱能传递，而破伤风毒素作用于中枢神经系统。
在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其在翻译后通过蛋白水解切割事件进行修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，通常称为激活位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链称为重链(H-链)(其分子量约为100kDa)和轻链(L-链)(其分子量约为50kDa)。H链包含N端易位组分(HN结构域)和C端靶向组分(HC结构域)。切割位点位于L-链和易位结构域组分之间。在HC结构域与其靶神经元结合并通过内体将结合的毒素内化到细胞中后，HN结构域将L-链易位穿过内体膜并进入胞质溶胶中，而L-链提供蛋白酶功能。也称为非细胞毒性蛋白酶)。
非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白的胞内转运蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)来发挥作用。首字母缩略词SNARE源自术语可溶性NSF附着受体(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF表示N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白是胞内囊泡融合体的组成部分，并且因此是通过从细胞的囊泡转运分泌分子的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，对SNARE蛋白表现出高的底物特异性。因此，一旦递送至所需的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶就能够抑制从靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L-链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。
鉴于SNARE蛋白的普遍性，梭菌神经毒素(如肉毒杆菌毒素)已成功用于多种治疗中。
WO 2016/170501 A1描述了使用具有催化活性的全长BoNT/A(含有L-链和完整的H-链，包括HN和HC结构域)来治疗由脊髓损伤引起的瘫痪。WO 2016/170501 A1教导了BoNT/A的每个功能结构域对于观察到的治疗效果都是必不可少的，包括H-链结合和易位能力以及L-链非细胞毒性蛋白酶活性。如上所述，全长梭菌神经毒素非常有效，在处理毒素时需要采用特定的安全程序。此外，认为毒素从靶组织扩散开是造成在极端情况下可能会危及生命的不良副作用的原因。以高剂量、浓度和注射量使用梭菌神经毒素治疗剂(如BoNT治疗剂)时，这可能是一个特别值得关注的问题。已报道的商业BoNT/A疗法与此问题相关的不良作用包括虚弱、全身肌肉无力、复视、上睑下垂、吞咽困难、发音困难、构音障碍、尿失禁和呼吸困难。吞咽和呼吸困难可能危及生命，并且已经报道了死亡与毒素作用的传播有关。因此，需要一种更安全的用于促进神经元生长或修复的治疗剂。
鉴于它们的大小，使用全长梭菌神经毒素(～150kDa)或其完整的H-链(～100kDa)与用所述多肽治疗的受试者中增加的引发免疫反应的风险有关。此外，整个H-链(特别是HC结构域)的存在导致多肽与梭菌神经毒素靶受体结合，这可能与施用所述多肽的受试者中不希望的脱靶效应有关。
本发明克服了一个或多个上述问题。
本发明的发明人惊奇地发现了包含梭菌神经毒素L-链和/或梭菌神经毒素H-链片段(例如易位结构域(HN)或受体结合结构域(HC))的多肽促进神经元生长或修复，从而发现了在治疗神经障碍中的效用。有利地，这允许使用梭菌神经毒素的无毒(或基本无毒)片段，其尺寸更小(与全长H-链或全长梭菌神经毒素相比)，不太可能在施用所述片段的受试者中引发免疫反应。此外，与全长梭菌神经毒素相比，无毒(或基本上无毒)片段的制造成本更低和/或制造起来更简单。另外，无毒(或基本上无毒)片段构成比全长梭菌毒素更明确的治疗剂，并且鉴于较短的多肽长度，例如结构域之间的半胱氨酸改组的可能性降低。
因此，在一个方面中，本发明提供了用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含：
梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或
梭菌神经毒素重链(H-链)的片段。
在相关方面中，提供了用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括将多肽施用于受试者，其中多肽包含：
梭菌神经毒素L-链或其片段；和/或
梭菌神经毒素H-链的片段。
在另一个方面中，提供了多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含：
梭菌神经毒素L-链或其片段；和/或
梭菌神经毒素H-链的片段。
在一个方面中，本发明提供了用于治疗受试者的神经障碍的多肽，其中多肽包含：
梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或
梭菌神经毒素重链(H-链)的片段。
在相关方面中，提供了用于治疗受试者的神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含：
梭菌神经毒素L-链或其片段；和/或
梭菌神经毒素H-链的片段。
在另一个方面中，提供了多肽在制备用于治疗受试者的神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含：
梭菌神经毒素L-链或其片段；和/或
梭菌神经毒素H-链的片段。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含梭菌神经毒素L-链。优选L-链是无催化活性的。
因此，在一个方面中，本发明提供了用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链。
在相关方面中，本发明提供了用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链。
在另一个方面中，本发明提供了包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链的多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的药物中的用途。
在一个方面中，本发明提供了用于治疗受试者的神经障碍的多肽，其中多肽包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链。
在相关方面中，本发明提供了用于治疗受试者的神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链。
在另一个相关方面中，本发明提供了包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链的多肽在制备用于治疗受试者的神经障碍的药物中的用途。
本发明的发明人首次表明梭菌神经毒素L-链的催化活性对于促进神经元生长或神经元修复不是必需的。因此，本发明允许提供更安全(毒性更低)的治疗剂。
活性梭菌神经毒素L-链具有非细胞毒性蛋白酶活性。具体而言，活性梭菌神经毒素L-链具有内肽酶活性并且能够切割靶细胞中的胞外(exocytic)融合装置的蛋白质。胞外融合装置的蛋白质优选是SNARE蛋白，如SNAP-25、小突触泡蛋白/VAMP，或突触融合蛋白。
如本文所用的关于梭菌神经毒素L-链的术语“无催化活性”是指所述L-链基本上不表现出非细胞毒性蛋白酶活性，优选如本文所用的关于梭菌神经毒素L-链的术语“无催化活性”是指所述L-链没有表现出非细胞毒性蛋白酶活性。在一个实施方案中，无催化活性的梭菌神经毒素L-链是不切割靶细胞中的胞外融合装置的蛋白质的链。术语“基本上没有非细胞毒性蛋白酶活性”是指梭菌神经毒素L-链具有小于5％的催化活性梭菌神经毒素L-链的非细胞毒性蛋白酶活性，例如小于2％、1％或优选小于0.1％的催化活性梭菌神经毒素L-链的非细胞毒性蛋白酶活性。非细胞毒性蛋白酶活性可以通过将测试梭菌神经毒素L-链与SNARE蛋白一起孵育并比较测试梭菌神经毒素L-链切割的SNARE蛋白的量，与相同条件下被催化活性梭菌神经毒素L-链切割的SNARE蛋白的量相比。常规技术，如SDS-PAGE和蛋白质印迹，可用于量化切割的SNARE蛋白的量。合适的体外测定描述于WO 2019/145577 A1，该专利以引用的方式并入本文。
基于细胞的和体内测定也可以用于确定包含L-链以及功能性细胞结合和易位结构域的梭菌神经毒素是否具有非细胞毒性蛋白酶活性。如数字外展评分(DAS)、背根神经节(DRG)测定、脊髓神经元(SCN)测定和小鼠膈神经偏侧膈(PNHD)测定等测定是本领域常规的。用于确定非细胞毒性蛋白酶活性的合适测定可以是Donald等(2018)，Pharmacol ResPerspect，e00446，1-14中描述的测定，其通过引用并入本文。
无催化活性的L-链可以具有使所述催化活性失活的一个或多个突变。例如，无催化活性BoNT/A L-链可以包含活性位点残基的突变，如His223、Glu224、His227、Glu262和/或Tyr366。位置编号对应于SEQ ID NO:62的氨基酸位置并且可以通过将多肽与SEQ ID NO:62比对来确定。由于在SEQ ID NO:62的位置1处存在甲硫氨酸残基是可选的，因此技术人员在确定氨基酸残基编号时将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，SEQ ID NO:62包括甲硫氨酸时，位置编号将如上所定义(例如His223将是SEQ ID NO:62的His223)。或者，SEQ IDNO:62中不存在甲硫氨酸的情况下，氨基酸残基编号应通过-1来改变(例如，His223将是SEQID NO:62的His222)。当本文所述的其他多肽序列的位置1处的甲硫氨酸存在/不存在时，适用类似的考虑，并且技术人员将使用本领域常规技术容易地确定正确的氨基酸残基编号。
在特别优选的实施方案中，本发明的多肽可以包含修饰的BoNT/A或其片段(优选BoNT/A HC结构域或其片段)。修饰的BoNT/A或其片段可以是在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰的一种：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR1277。这种修饰的BoNT/A或其片段可以证明与使用已知的BoNT/A相比副作用减少或不存在。本发明的修饰的BoNT/A的增加的组织保留特性还可以提供增加的效力和/或作用持续时间，并且可以允许与已知的梭菌毒素治疗剂相比减少使用的剂量(或增加的剂量而没有任何额外的副作用)，从而提供更多优势。
与如SEQ ID NO:62所示的未修饰的BoNT/A相比时，修饰可以是修饰，其中氨基酸残基编号通过与SEQ ID NO:62的比对来确定。因为在SEQ ID NO:62的位置1处存在甲硫氨酸残基(以及对应于本文所述的修饰的BoNT/A多肽或其片段的SEQ ID NO)是可选的，因此技术人员在确定氨基酸残基编号时将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，SEQ ID NO：62包括甲硫氨酸时，位置编号将如上定义(例如，ASN 886将是SEQ ID NO：62的ASN 886)。或者，SEQ ID NO:2中不存在甲硫氨酸时，氨基酸残基编号应通过-1来改变(例如ASN 886将是SEQ ID NO:62的ASN 885)。当本文所述的其他多肽序列的位置1处的甲硫氨酸存在/不存在时，适用类似的考虑，并且技术人员将使用本领域常规技术容易地确定正确的氨基酸残基编号。
上述修饰的氨基酸残基是表面暴露的氨基酸残基。
修饰的BoNT/A或其片段可包含在一个或多个选自以下的氨基酸残基处的修饰：ASN 886,ASN 930,ASN 954,SER 955,GLN 991,ASN 1025,ASN 1026,ASN 1052,ASN 1188,ASP 1213,GLY 1215,ASN 1216,GLN 1229,ASN 1242,ASN 1243、SER 1274和THR 1277。
在修饰的BoNT/A或其片段的内容中使用时，术语“一个或多个氨基酸残基”优选意指至少2、3、4、5、6或7个指定的氨基酸残基。因此，修饰的BoNT/A可以在指定的氨基酸残基处包含至少2、3、4、5、6或7个(优选7个)修饰。修饰的BoNT/A或其片段可以包含1-30、3-20或5-10个氨基酸修饰。更优选，在修饰的BoNT/A或其片段的内容中使用时，术语“一个或多个氨基酸残基”是指所有指定的氨基酸残基。
优选，除了在指定的氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰之外，修饰的BoNT/A或其片段与SEQ ID NO:62相比时不含任何进一步的氨基酸修饰。
修饰选自：
i.用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
ii.用不带电的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；
iii.用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
iv.插入碱性氨基酸残基；和
v.删除酸性表面暴露的氨基酸残基。
如上所述的修饰导致修饰的BoNT/A或其片段与相应的未修饰的BoNT/A或其片段相比具有增加的正表面电荷和增加的等电点。
等电点(pI)是给定蛋白质的特定属性。如本领域所熟知的，蛋白质由特定的氨基酸(在蛋白质中时也称为氨基酸残基)的序列制成。二十个标准组中的每个氨基酸都有不同的侧链(或R基团)，这意味着蛋白质中的每个氨基酸残基都显示出不同的化学性质，如电荷和疏水性。这些特性可能会受到周围化学环境的影响，如温度和pH。蛋白质的整体化学特征将取决于这些不同因素的总和。
某些氨基酸残基(下文详述)具有可电离的侧链，其根据周围的pH可显示出电荷。在给定的pH下，这种侧链是否带电取决于相关可电离部分的pKa，其中pKa是来自共轭碱的特定质子的酸解离常数(Ka)的负对数。
例如，酸性残基(如天冬氨酸和谷氨酸)具有侧链羧酸基团，其pKa值约为4.1(精确的pKa值可能取决于温度、离子强度和可电离基团的微环境)。因此，这些侧链在7.4的pH(通常称为“生理pH”)下显示出负电荷。这些侧链在低pH值下将质子化并失去其电荷。
相反，赖氨酸和精氨酸等碱性残基具有含氮侧链基团，pKa值约为10-12。因此，这些侧链在7.4的pH显示出正电荷。这些侧链在高pH值下将去质子化并失去其电荷。
因此，蛋白质分子的总(净)电荷取决于蛋白质中存在的酸性和碱性残基的数量(及其表面暴露程度)和周围的pH。改变周围的pH会改变蛋白质上的总电荷。因此，对于每种蛋白质，都有一个给定的pH，在该pH下，正电荷和负电荷的数量相等，并且蛋白质显示出没有整体净电荷。该点称为等电点(pI)。等电点是技术人员熟悉的蛋白质生物化学中的标准概念。
因此，将等电点(pI)定义为蛋白质显示净电荷为零时的pH值。pI增加意味着蛋白质需要更高的pH值才能显示净电荷为零。因此，pI的增加表示在给定pH下蛋白质的净正电荷增加。相反，pI的降低意味着蛋白质需要较低的pH值才能显示净电荷为零。因此，pI的降低表示在给定pH下蛋白质的净正电荷减少。
确定蛋白质的pI的方法是本领域已知的并且是技术人员熟悉的。例如，蛋白质的pI可以从蛋白质中存在的每个氨基酸的平均pKa值计算(“计算的pI”)。这种计算可以使用本领域已知的计算机程序来执行，如来自ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)的Compute pI/MW Tool，这是根据本发明优选的用于计算pI的方法。应该使用相同的计算技术/程序来比较不同分子之间的pI值。
在适当的情况下，可以使用等电聚焦技术通过实验确认计算的蛋白质的pI(“观察到的pI”)。该技术使用电泳以根据其pI分离蛋白质。等电聚焦通常使用具有固定pH梯度的凝胶进行。施加电场时，蛋白质通过pH梯度迁移，直到达到其净电荷为零的pH，该点是蛋白质的pI。由等电聚焦提供的结果在本质上通常分辨率相对较低，因此本发明的发明人认为由计算的pI(如上所述)提供的结果更适合使用。
在本发明的整个说明书中，除非另有说明，“pI”是指“计算的pI”。
蛋白质的pI可以通过改变其表面上展示的碱性和/或酸性基团的数量来增加或减少。这可以通过修饰蛋白质的一个或多个氨基酸来实现。例如，可以通过减少酸性残基的数量或通过增加碱性残基的数量来提供pI的增加。
本发明的修饰的BoNT/A或其片段可具有比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO:62)或其片段高至少0.2、0.4、0.5或1个pI单位的pI值。优选，修饰的BoNT/A或其片段可以具有至少6.6的pI，例如至少6.8。
下表列出了20个标准氨基酸的特性：
Figure BDA0003572547830000081
Figure BDA0003572547830000091
以下氨基酸被认为是带电荷的氨基酸：天冬氨酸(负)、谷氨酸(负)、精氨酸(正)和赖氨酸(正)。
在7.4的pH时，天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的侧链带负电荷，而精氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链带正电荷。天冬氨酸和谷氨酸被称为酸性氨基酸残基。精氨酸和赖氨酸被称为碱性氨基酸残基。
以下氨基酸被认为是不带电荷的极性(意味着它们可以参与氢键合)氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
以下氨基酸被认为是不带电荷的疏水性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
在氨基酸插入中，将额外的氨基酸残基(通常不存在的)整合到BoNT/A多肽序列或其片段中，从而增加所述序列中氨基酸残基的总数。在氨基酸缺失中，从梭菌毒素氨基酸序列中除去氨基酸残基，从而减少所述序列中氨基酸残基的总数。
优选，修饰是取代，其有利地在修饰的BoNT/A或其片段中保持相同数量的氨基酸残基。在氨基酸取代中，形成BoNT/A多肽序列或其片段的一部分的氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。如上所述，取代氨基酸残基可以是20种标准氨基酸之一。或者，氨基酸取代中的取代氨基酸可以是非标准氨基酸(不是上述20种标准组的一部分的氨基酸)。例如，取代氨基酸可以是碱性非标准氨基酸，例如L-鸟氨酸、L-2-氨基-3-胍基丙酸或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的D-异构体)。将非标准氨基酸引入蛋白质的方法是本领域已知的并且包括使用大肠杆菌营养缺陷型表达宿主的重组蛋白质合成。
在一个实施方案中，取代选自：酸性氨基酸残基被碱性氨基酸残基取代、酸性氨基酸残基被不带电荷氨基酸残基取代，以及不带电的氨基酸残基被碱性氨基氨基酸残基取代。在一个实施方案中，其中取代是酸性氨基酸残基被不带电的氨基酸残基取代、酸性氨基酸残基被其相应的不带电的酰胺氨基酸残基取代(即天冬氨酸被天冬酰胺取代，谷氨酸被谷氨酰胺取代)。
优选，碱性氨基酸残基是赖氨酸残基或精氨酸残基。换言之，取代是用赖氨酸或精氨酸取代。最优选，修饰是用赖氨酸取代。
优选，用于本发明的修饰的BoNT/A或其片段包含位于梭菌毒素HCN结构域中的4至40个氨基酸修饰。所述修饰的BoNT/A或其片段优选还具有至少6.6的pI。所述修饰的BoNT/A优选包含选自以下的至少4个氨基酸的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN991、ASN 1025、ASN 1026和ASN 1052，其中所述修饰包括用赖氨酸残基或精氨酸残基的氨基酸取代。例如，所述修饰的BoNT/A或其片段可以包含选自以下的至少5个氨基酸的修饰：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229，其中所述修饰包括用赖氨酸残基或精氨酸残基的氨基酸取代。
通过氨基酸残基的取代、插入或缺失修饰蛋白质的方法是本领域已知的。例如，氨基酸修饰可以通过修饰编码多肽的DNA(例如编码未修饰的BoNT/A或其片段)序列来引入。这可以使用标准分子克隆技术来实现，例如通过定点诱变，其中使用聚合酶将编码所需氨基酸的短链DNA(寡核苷酸)用于替换原始编码序列，或通过用各种酶(例如，连接酶和限制性内切酶)插入/删除部分基因。或者，可以化学合成修饰的基因序列。
在一个方面中，本发明提供了用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者的神经障碍的多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
在相关方面中，提供了用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者的神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
在另一个相关方面中，提供了多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者的神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
在一个方面中，本发明提供了用于治疗受试者的神经障碍的多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
在相关方面中，提供了用于治疗受试者的神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
在另一个相关方面中，提供了多肽在制备用于治疗受试者的神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
在一个实施方案中，根据本发明使用的多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选，根据本发明使用的多肽包含如SEQ ID NO:42所示的多肽序列。
在一个实施方案中，根据本发明使用的多肽包含由与SEQ ID NO：41具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。优选，根据本发明的使用的多肽包括由如SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列编码的多肽序列。
在一个实施方案中，根据本发明使用的多肽(例如，包含SEQ ID NO:42或由SEQ IDNO:41编码的)可以是与SEQ ID NO:61或65具有至少70％序列同一性的多肽的一部分。因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的多肽可以包含与SEQ ID NO:61或65具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选，根据本发明使用的多肽可以包含SEQID NO:61或65(更优选地由其组成)。在一个实施方案中，该多肽包含无催化活性的L-链(例如根据SEQ ID NO:65)。
在一个实施方案中，根据本发明使用的多肽(例如，包含SEQ ID NO:42或由SEQ IDNO:41编码的)可以由与SEQ ID NO:60具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码。因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的多肽可以由与SEQ ID NO:60具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码。优选，根据本发明使用的多肽可以由包含SEQID NO:60(更优选由其组成)的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，多肽包含无催化活性的L-链。
SEQ ID NO:42是修饰的BoNT/A片段的实例，而SEQ ID NO:61和65分别是具有催化活性和无催化活性的修饰的BoNT/A多肽的实例。这种修饰的BoNT/A多肽和片段特别优选用于本发明中。与野生型BoNT/A相比时，如SEQ ID NO:42、61和62所示的多肽具有许多氨基酸修饰(例如取代)，这提高了多肽的等电点。不希望受理论束缚，认为增加的净正电荷促进了多肽和阴离子胞外组分之间的静电相互作用，从而促进了多肽和细胞表面之间的结合，因此增加了在施用部位的保留和/或作用持续时间。因此，设想与缺乏所述修饰的等效多肽相比，SEQ ID NO:42、61和65的神经元生长和/或修复特性将得到提高。
对于上述催化活性修饰的BoNT/A多肽(例如SEQ ID NO:61)，可以定义这些有利特性(其代表治疗指数的增加)的一种方式是就修饰BoNT/A的安全比而言。在这方面，梭菌神经毒素的不良影响(由毒素从施用部位扩散引起的)可以通过测量相关动物模型中的体重减轻百分比(例如小鼠，其中在施用七天内检测体重减轻)来实验性地评估。相反，可以通过数字外展评分(DAS)测定(一种肌肉麻痹的测量方法)实验性地评估所需的梭菌神经毒素的靶向作用。可以通过将20μl在明胶磷酸盐缓冲液中配制的梭菌神经毒素注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中，然后使用Aoki的方法(Aoki KR，Toxicon 39:1815-1820；2001)评估数字外展评分来进行DAS测定。在DAS测定中，拎起小鼠尾短暂悬吊，以引发一种特征性的惊吓反应，在这种反应中，小鼠伸展其后肢并外展其后指。梭菌神经毒素注射后，指外展的不同程度以五分制进行评分(0＝正常到4＝指外展和腿部伸展的最大减少)。
然后，梭菌神经毒素的安全比可以表示为体重下降10％所需的毒素量(在小鼠给药后头七天内达到峰值效应时测量)与DAS评分为2所需的毒素量之间的比率。因此需要高安全比评分，这表明毒素能够有效地麻痹目标肌肉而几乎没有不希望的脱靶效应。本发明的催化活性修饰的BoNT/A可以具有高于等效的未修饰(天然)肉毒杆菌毒素(例如SEQ IDNO:62)的安全比。
因此，在一个实施方案中，本发明的催化活性修饰的BoNT/A具有至少8(例如，至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)的安全比，其中安全比计算为：-10％体重变化所需的毒素剂量(pg/小鼠)除以DAS ED50(pg/小鼠)[ED50＝产生DAS评分为2所需的剂量]。
在一个实施方案中，本发明的催化活性修饰的BoNT/A具有至少10的安全比。在一个实施方案中，本发明的修饰的BoNT/A或其片段具有至少15的安全比。
包含与SEQ ID NO:61至少70％序列同一性的多肽描述于WO 2015/004461 A1中，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，包含与SEQ ID NO:42、61或65具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或包含由与SEQ ID NO:41或60具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列的多肽在930、955、991、1026、1052、1229和886的一个或多个(优选两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或六个或更多个，更优选全部)位置处包括取代。位置编号对应于SEQ ID NO:62的位置并且可以通过将多肽序列与SEQ ID NO:62(未修饰的/野生型BoNT/A)比对来确定。由于在SEQ ID NO:62的位置1的甲硫氨酸残基的存在是可选的，因此技术人员在确定氨基酸残基编号时将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，SEQ ID NO:62包括甲硫氨酸时，位置编号将如上所定义(例如，位置886将是SEQ ID NO:62的ASN 886)。或者，SEQ ID NO:62中不存在甲硫氨酸时，氨基酸残基编号应改变-1(例如，位置886将是SEQ ID NO:62的ASN885)。本文所述的其他多肽序列的位置1处的甲硫氨酸存在/不存在时，适用类似的考虑，并且技术人员将使用本领域常规技术容易地确定正确的氨基酸残基编号。
优选地，包含与SEQ ID NO:42、61或65具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或包含由与SEQ ID NO:41或60具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列的多肽在930、955、991、1026、1052、1229和886中的一个或多个处包含赖氨酸或精氨酸(更优选赖氨酸)。在一个实施方案中，多肽在930、955、991、1026、1052、1229和886的至少两个、三个、四个、五个、六个或所有位置处包含赖氨酸或精氨酸(更优选赖氨酸)。最优选，多肽在所有位置930、955、991、1026、1052、1229和886的所有位置处包含赖氨酸或精氨酸(更优选赖氨酸)。
本发明的多肽促进神经元生长和/或神经元修复。因此，所述多肽可用于治疗神经障碍。如本文所用，术语“神经障碍”是可以通过促进受试者的神经元生长和/或修复来治疗的障碍。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种促进神经元生长和/或神经元修复的方法，该方法包括给受试者施用多肽，该多肽包含梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或梭菌神经毒素重链(H-链)的片段。在另一个方面中，本发明提供了一种促进神经元生长和/或神经元修复的方法，该方法包括给受试者施用多肽，该多肽包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链。在另一个方面中，提供了促进神经元生长或神经元修复的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个方面中，提供了促进神经元生长或神经元修复的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:63具有至少70％序列同一性的多肽序列。
术语“促进神经元生长和/或神经元修复”可以意指本发明的多肽启动神经元生长和/或神经元修复，例如在没有发生神经元生长和/或神经元修复的情况下。在其他实施方案中，术语“促进神经元生长和/或神经元修复”可以意指本发明的多肽提高神经元生长和/或神经元修复的速率。所述提高可以是与不存在本发明多肽的情况下的神经元生长和/或神经元修复速率相比时的提高。在一个实施方案中，神经元生长和/或神经元修复允许重建受损神经元回路，从而恢复神经元网络或神经元群中的活动和/或神经元通讯。因此，本文使用的术语“神经元修复”可以涵盖特定神经元的修复以及神经元回路的修复。
术语“神经元生长和/或神经元修复”也可以包括神经元可塑性。因此，在一个实施方案中，本发明的多肽促进神经元可塑性。如本文所用，术语“神经元可塑性”包括轴突生芽、树突生芽、神经发生(例如新神经元的产生)、成熟、分化和/或突触可塑性(例如，包括突触强度、活动、解剖结构和/或连结性的变化)。在一个实施方案中，本发明的多肽促进功能性突触的建立(例如在损伤部位处或附近)。
与不存在本发明的多肽或存在替代多肽下的神经元生长和/或修复相比时，在本发明的多肽存在下，神经元生长和/或修复可增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％(优选至少80％)。在一些实施方案中，与不存在本发明的多肽或存在替代多肽下的神经元生长和/或修复相比时，在本发明的多肽存在下，神经元生长和/或修复可增加至少100％、150％或200％。
在一个实施方案中，本发明的多肽促进神经元生长。如本文所用，术语“神经元生长”涵盖神经元的任何部分的生长，包括轴突和/或树突的生长。本发明的多肽可以增加神经突长度、神经突数量(例如每个细胞的神经突数量)，和/或可以增加来自神经元的细胞体或细胞膜的突起的长度和/或数量。优选地，本发明的多肽促进神经元(例如，受试者的神经元)的轴突生长。换言之，优选本发明的多肽增加轴突生长，例如增加轴突生芽。所述轴突生长可以促进神经元之间的连接和/或化学通讯。
由本发明的多肽治疗的神经障碍可以是神经元损伤、神经退行性障碍、感觉障碍或自主神经障碍。
神经障碍可以是神经元损伤。在一个实施方案中，神经元损伤可以是神经外伤、神经病(例如周围神经病)、脊髓损伤、神经切断、脑损伤(例如外伤性脑损伤)、非外伤性损伤(例如，中风或脊髓梗塞)，或臂丛神经损伤，例如Erb麻痹或Klumpke麻痹。
在一个实施方案中，神经外伤可能由疤痕和/或骨折引起。在这种神经外伤的情况下，神经末梢受损。本发明的多肽有利地允许修复所述神经末梢或允许修复允许治疗神经损伤的远端神经末梢。
神经元损伤可以是瘫痪，如由脊髓损伤引起的瘫痪(例如由挤压、收缩和/或拉伸引起的)。在一个实施方案中，脊髓损伤是截瘫或四肢瘫痪。
神经障碍可以是感觉障碍。在一个实施方案中，感觉障碍是感觉神经病、感觉运动性多发性神经病、糖尿病性神经病、疼痛、Brown-Sequard综合征、Charcot-Marie-Tooth病或Devic综合征。优选地，本文所述的感觉障碍不是疼痛。换言之，本文所述的神经障碍优选不是疼痛。
神经障碍可以是自主神经障碍。在一个实施方案中，自主神经障碍是自律神经病变、多系统萎缩、急性特发性多发性神经病、自主神经功能障碍、家族性自主神经功能障碍、糖尿病自主神经衰竭、单纯性自主神经衰竭、温度调节障碍、多汗症、神经介导的晕厥(血管迷走神经、排尿、咳嗽、吞咽和其他情境形式)、勃起功能障碍、直立性低血压、体位性心动过速综合征(PoTS)或Guillain-Barre综合征。
神经障碍可以是神经退行性障碍。在一个实施方案中，神经退行性障碍是阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森病相关障碍、运动神经元病、周围神经病、运动神经病、朊病毒病、亨廷顿病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、单肢肌萎缩、Friedreich’s共济失调、Hallervorden-Spatz病或额颞叶变性。优选，神经退行性障碍是帕金森病或运动神经元病。有利地，由于其促进神经元生长(例如包括神经元可塑性)和/或神经元修复的能力，并且进一步由于其重建受损神经元回路的能力，认为本发明的多肽可用于治疗神经退行性障碍，从而恢复神经元网络或神经元群中的活动和/或神经元通信。
鉴于其促进神经元生长和/或神经元修复的能力，可以认为本发明的多肽是神经营养多肽。本文所述的神经元可以是选自以下的一种或多种：运动神经元(包括自主神经元)、感觉神经元、脊髓中间神经元和脑中间神经元。因此，在一个实施方案中，本发明的多肽促进运动神经元、感觉神经元和/或中间神经元的生长和/或修复。优选地，本发明的多肽促进运动神经元的生长和/或修复。
如本文所用，“受试者”可以是哺乳动物，例如人或其他哺乳动物。优选地，“受试者”是指人受试者。
如本文所用，术语“障碍”还包括“疾病”。在一个实施方案中，障碍是疾病。
如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”包括预防性治疗(例如，防止障碍的发作)以及矫正治疗(治疗已经患有障碍的受试者)。优选地，如本文所用的“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指矫正治疗。
如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指障碍和/或其症状。
因此，本发明的多肽可以以治疗有效量或预防有效量施用于受试者。优选地，本发明的多肽以治疗有效量施用于受试者。
“治疗有效量”是单独或联合施用于受试者以治疗所述障碍(或其症状)时足以实现对该障碍或其症状的此类治疗的多肽的任何量。
“预防有效量”是单独或联合施用于受试者以抑制或延迟障碍(或其症状)的发作或复发时的多肽的任何量。在一些实施方案中，预防有效量完全防止疾病的发作或复发。“抑制”发作意味着减少疾病发作(或其症状)的可能性，或完全阻止疾病发作。
本发明的多肽可以以任何合适的方式配制以施用于受试者，例如作为药物组合物的一部分。因此，在一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的多肽和药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐。在一些实施方案中，本发明的多肽可以是单链形式，而在其他实施方案中，多肽可以是双链形式，例如其中两条链通过二硫化物桥连接。优选，多肽是双链形式。
本发明的多肽可以配制成用于口服、肠胃外、连续输注、吸入或局部应用。适用于注射的组合物可以是溶液、悬浮液或乳剂的形式，或在使用前溶解或悬浮于合适的载体中的干粉形式。
在局部递送的多肽的情况下，可以将多肽配制成乳膏(例如用于局部应用)或用于皮下注射。
局部递送方式可以包括气溶胶或其他喷雾剂(例如喷雾器)。在这方面，多肽的气溶胶制剂能够递送至肺和/或其他鼻和/或支气管或气道通道。
本发明的多肽可以通过鞘内或硬膜外注射在涉及受影响器官的神经支配的脊柱节段水平的脊柱中施用于受试者。
给药途径可以是通过腹腔镜和/或局部注射。在一个实施方案中，本发明的多肽在损伤部位处或其附近施用，优选在损伤部位处施用。例如，在损伤是脊髓损伤的情况中，多肽可以通过鞘内或脊柱内(优选鞘内)施用。在一个实施方案中，本发明多肽的施用途径可以是神经周围、神经内、脊柱内和/或鞘内。
本发明多肽的给药剂量范围是产生所需治疗和/或预防效果的剂量范围。应当理解，所需的剂量范围取决于梭菌神经毒素或组合物的确切性质、给药途径、制剂的性质、受试者的年龄、受试者病症的性质、程度或严重性、禁忌症，如果有的话，以及主治医师的判断。这些剂量水平的变化可以使用标准经验程序进行调整以进行优化。
在一个实施方案中，多肽的剂量是固定剂量。固定剂量可以在50pg到250ug的范围内，优选100pg到100ug。在一个实施方案中，固定剂量可以是至少50pg、100pg、500pg、1ng、50ng、100ng、500ng、1ug或50ug。所述剂量可以是单一的固定剂量。
流体剂型通常使用多肽和无热原无菌载剂制备。根据使用的载剂和浓度，梭菌神经毒素可以溶解或悬浮在载剂中。在制备溶液时，多肽可以溶解在载剂中，必要时通过添加氯化钠使溶液等渗，并在装入合适的无菌小瓶或安瓿并密封之前使用无菌技术通过无菌过滤器过滤进行灭菌。或者，如果溶液稳定性足够，则密封容器中的溶液可以通过高压灭菌来进行灭菌。有利地，添加剂，如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化剂和/或局部麻醉剂可以溶解在载剂中。
在使用前溶解或悬浮于合适载剂中的干粉可以通过在无菌区域中使用无菌技术将预先灭菌的成分填充到无菌容器中来制备。或者，可以在无菌区域中使用无菌技术将成分溶解到合适的容器中。然后将产品冷冻干燥并将容器无菌密封。
适用于本文所述的施用途径的肠胃外混悬剂以基本相同的方式制备，除了将无菌组分悬浮在无菌载剂中，而不是溶解并且不能通过过滤实现灭菌。组分可以在无菌状态下被分离，或替换地可以在分离后灭菌，例如通过伽马辐照。
有利地，在组合物中包括悬浮剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)以促进组分的均匀分布。
根据本发明的给药可以利用多种递送技术，包括微粒封装或高压气溶胶冲击。
本发明的多肽可以是梭菌神经毒素或其片段，优选其片段。
在一个实施方案中，本发明的多肽可以由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，本发明的多肽可以由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码。优选，本发明的多肽可以由包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，本发明的多肽可以包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，本发明的多肽可以包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选，本发明的多肽可以包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明包括使用包含梭菌神经毒素L-链和梭菌神经毒素H-链的全长梭菌神经毒素，条件是所述梭菌神经毒素L-链是无催化活性的。
术语“梭菌神经毒素”包括由肉毒梭菌(肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G和X)、破伤风梭菌(破伤风神经毒素)、丁酸梭菌(肉毒杆菌神经毒素血清型E)和巴拉特梭菌(C.baratii)肉毒杆菌神经毒素血清型F)产生的毒素，以及源自上述任一种的修饰的梭菌神经毒素或衍生物。
肉毒杆菌神经毒素(BoNT)由肉毒梭菌以大蛋白复合物的形式产生，其由与许多辅助蛋白复合的BoNT本身组成。目前有八种不同类别的肉毒杆菌神经毒素，即：肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G和X，它们都具有相似的结构和作用方式。不同的BoNT血清型可以通过特异性中和抗血清的失活来区分，这种通过血清型的分类与氨基酸水平的序列同一性百分比相关。基于氨基酸百分比序列同一性，将给定血清型的BoNT蛋白进一步分为不同的亚型。
BoNT在胃肠道中被吸收，并且在进入全身循环后，与胆碱能神经末梢的突触前膜结合，阻止其神经递质乙酰胆碱的释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G切割小突触泡蛋白/囊泡相关膜蛋白(VAMP)；BoNT/C1、BoNT/A和BoNT/E切割25kDa(SNAP-25)的突触体相关蛋白；BoNT/C1切割突触蛋白。已发现BoNT/X切割SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、Ykt6和syntaxin1。
破伤风毒素由破伤风梭菌以单一血清型由破伤风梭菌产生。丁酸梭菌产生BoNT/E，而巴拉特梭菌产生BoNT/F。
术语“梭菌神经毒素”还旨在包括修饰的梭菌神经毒素及其衍生物，包括但不限于下文所述的那些。修饰的梭菌神经毒素或衍生物可以含有一个或多个与梭菌神经毒素的天然(未修饰)形式相比已被修饰的氨基酸，或者可以含有一个或多个插入的在天然(未修饰)形式的梭菌神经毒素中不存在的氨基酸。举例来说，修饰的梭菌神经毒素可以相对于天然(未修饰的)梭菌神经毒素序列在一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。这种修饰可以改变毒素的功能方面，例如生物活性或持久性。因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素是修饰的梭菌神经毒素，或修饰的梭菌神经毒素衍生物，或梭菌神经毒素衍生物。
修饰的梭菌神经毒素可以在重链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰(如修饰的HC结构域)，其中所述修饰的重链以比天然(未修饰的)梭菌神经毒素更高或更低的亲和力结合靶神经细胞。HC结构域中的此类修饰可以包括修饰HC结构域的神经节苷脂结合位点或蛋白质(SV2或突触结合蛋白)结合位点中的残基，其改变与靶神经细胞的神经节苷脂受体和/或蛋白质受体的结合。此类修饰的梭菌神经毒素的实例描述于WO 2006/027207和WO2006/114308中，两者均通过引用整体并入本文。
修饰的梭菌神经毒素可以在轻链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如底物结合或催化结构域中的修饰，其可以改变或修饰修饰的L-链的SNARE蛋白特异性。此类修饰的梭菌神经毒素的实例描述于WO 2010/120766和US 2011/0318385中，两者均通过引用整体并入本文。
修饰的梭菌神经毒素可以包含一种或多种修饰，其增加或降低修饰的梭菌神经毒素的生物活性和/或生物持久性。例如，修饰的梭菌神经毒素可以包含基于亮氨酸或酪氨酸的基序，其中所述基序增加或降低修饰的梭菌神经毒素的生物活性和/或生物持久性。合适的基于亮氨酸的基序包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL和xExxxLM(其中x是任何氨基酸)。合适的基于酪氨酸的基序包括Y-x-x-Hy(其中Hy是疏水性氨基酸)。包含基于亮氨酸和酪氨酸的基序的修饰的梭菌神经毒素的实例在WO 2002/08268中进行了描述，其通过引用整体并入本文。
如上所述，修饰的梭菌神经毒素(或梭菌神经毒素片段)可以是包含一个或多个修饰的毒素，与缺乏所述一个或多个修饰的等效未修饰梭菌神经毒素相比时，所述修饰提高梭菌神经毒素的等电点。合适的修饰的梭菌神经毒素在上文和WO 2015/004461 A1和WO2016/110662 A1中进行了描述，其通过引用并入本文。示例性序列包括本文所述的SEQ IDNO:61和42。
术语“梭菌神经毒素”旨在包括杂合和嵌合的梭菌神经毒素。杂合梭菌神经毒素包含来自一种梭菌神经毒素或其亚型的轻链的至少一部分，以及来自另一种梭菌神经毒素或梭菌神经毒素亚型的重链的至少一部分。在一个实施方案中，杂合梭菌神经毒素可以含有来自一种梭菌神经毒素亚型的轻链的完整轻链和来自另一种梭菌神经毒素亚型的重链。在另一个实施方案中，嵌合梭菌神经毒素可以含有一种梭菌神经毒素亚型的重链的一部分(例如结合结构域)，而重链的另一部分来自另一种梭菌神经毒素亚型。类似地或替代地，治疗元件可以包含来自不同梭菌神经毒素的轻链部分。这种杂合或嵌合的梭菌神经毒素是有用的，例如，作为一种将这些梭菌神经毒素的治疗益处传递给对给定的梭菌神经毒素亚型具有免疫抗性的受试者、可能对给定的梭菌神经毒素重链结合结构域具有低于平均受体浓度的受试者的方法，或可能具有膜或囊泡毒素底物(例如，SNAP-25、VAMP和突触蛋白)的蛋白酶抗性变体的受试者。杂合和嵌合的梭菌神经毒素描述于US 8,071,110，将该公开通过引用整体并入本文。因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素(或其片段)是杂合梭菌神经毒素或嵌合梭菌神经毒素。
在特别优选的实施方案中，本发明的多肽可以是嵌合梭菌神经毒素，其包含(优选由以下组成)BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)或其一部分。合适的嵌合和/或杂合梭菌神经毒素可以是WO 2017/191315 A1中教导的一种，其通过引用并入本文。此类优选序列包括SEQ ID NO:44、63和64。
BoNT/A LHN结构域可以共价连接BoNT/B HC结构域。所述嵌合BoNT/A在本文中也称为“BoNT/AB”或“BoNT/AB嵌合体”。
LHN结构域的C-末端氨基酸残基可以对应于分隔BoNT/A的LHN和HC结构域的310螺旋的第一个氨基酸残基，而HC结构域的N-末端氨基酸残基可以对应于分隔BoNT/B的LHN和HC结构域的310螺旋的第二个氨基酸残基。
本文提及的“分隔BoNT/A的LHN和HC结构域的310螺旋的第一个氨基酸残基”是指分隔LHN和HC结构域的310螺旋的N-末端残基。
本文提及的“分隔BoNT/B的LHN和HC结构域的310螺旋的第二个氨基酸残基”是指分隔LHN和HC结构域的310螺旋的N-末端残基之后的氨基酸残基。
“310螺旋”是连同α-螺旋、β-折叠和反转在蛋白质和多肽中发现的二级结构。310螺旋中的氨基酸排列成右手螺旋结构，其中每个完整的转由三个残基和十个原子完成，其将它们之间的分子内氢键分开。每个氨基酸对应于螺旋中的120°转角(即螺旋每转有三个残基)，沿螺旋轴平移
Figure BDA0003572547830000221
(＝0.2nm)，并在通过形成氢键的环中具有10个原子。最重要的是，氨基酸的N-H基团与三个残基前的氨基酸的C＝O基团形成氢键；这种重复的i+3→i氢键定义了310螺旋。310螺旋是技术人员熟悉的结构生物学中的标准概念。
这种310螺旋对应于形成实际螺旋的四个残基和两个帽(或过渡)残基，两个帽在这四个残基的每一端各有一个。如本文所用，术语“分隔LHN和HC结构域的310螺旋”由这6个残基组成。
通过进行结构分析和序列比对，鉴定了分隔LHN和HC结构域的310螺旋。这种310螺旋在其N-末端(即在LHN结构域的C-末端部分)被α-螺旋包围，在其C-末端(即在HC的N-末端部分)被β-链包围。310螺旋的第一个(N-末端)残基(帽或过渡残基)也对应于这个α-螺旋的C-末端残基。
分隔LHN和HC结构域的310螺旋可以例如从公开可获得的肉毒杆菌神经毒素的晶体结构确定，例如3BTA(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝3BTA)和1EPW(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝1EPW)分别用于肉毒杆菌神经毒素A1和B1。
可公开获得的计算机建模和比对工具也可用于确定在其他神经毒素中分隔LHN和HC结构域的310螺旋的位置，例如同源建模服务器LOOPP(学习、观察和输出蛋白质模式，http://loopp.org)，PHYRE(蛋白质同源性/模拟Y识别引擎，http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)和Rosetta(https://www.rosettacommons.org/)，蛋白质叠加服务器SuperPose(http://wisart.biology.ualberta.ca/superpose/)、比对程序Clustal Omega(http://www.clustal.org/omega/)以及在分子和细胞生物学家互联网资源(http://molbiol-tools.ca/)列出的许多其他工具/服务。特别是“HN/HCN”连接点周围的区域在结构上高度保守，这使其成为叠加不同血清型的理想区域。
例如，以下方法可用于确定其他神经毒素中的这种310螺旋的序列：
1.基于BoNT/A1晶体结构(3BTA.pdb)，使用结构同源性建模工具LOOP(http://loopp.org)来获得其他BoNT血清型的预测结构；
2.将由此获得的结构(pdb)文件编辑为仅包括HCN结构域的N-末端及其之前的约80个残基(它们是HN结构域的一部分)，从而保留了结构上高度保守的“HN/HCN”区域；
3.使用蛋白质叠加服务器SuperPose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)将每个血清型叠加到3BTA.pdb结构上；
4.检查叠加的pdb文件，将BoNT/A1 HC结构域开头的310螺旋定位，然后鉴定其他血清型中的相应残基；
5.将其他BoNT血清型序列与Clustal Omega进行比对，以检查相应残基是否正确。
通过这种方法确定的LHN、HC和310螺旋结构域的实例呈现于以下：
Figure BDA0003572547830000241
使用结构分析和序列比对，发现了分隔LHN和HC结构域的310螺旋后的β-链是所有肉毒杆菌和破伤风神经毒素中的保守结构，并且从分隔LHN和HC结构域的310螺旋的第一个残基开始时，从第8个残基开始(例如，对于BoNT/A1，在残基879处)。
BoNT/AB嵌合体可以包含与来自BoNT/B的HC结构域共价连接的来自BoNT/A的LHN结构域，
·其中LHN结构域的C-末端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的HC结构域开始(N-末端)的β-链N-末端的第八个氨基酸残基，和
·其中HC结构域的N-末端氨基酸残基对应于位于BoNT/B的HC结构域开始(N-末端)的β-链N-末端的第七个氨基酸残基。
BoNT/AB嵌合体可以包含与BoNT/B的HC结构域共价连接的BoNT/A的LHN结构域，
·其中LHN结构域的C-末端氨基酸残基对应于位于BoNT/A的LHN结构域末端(C-末端)的α-螺旋的C-末端氨基酸残基，和
·其中HC结构域的N-末端氨基酸残基对应于紧邻至位于BoNT/B的LHN结构域末端(C-末端)的α-螺旋的C-末端氨基酸残基的C-末端氨基酸残基。
BoNT/AB嵌合体的设计过程的基本原理是试图确保二级结构不受影响，从而最大限度地减少对三级结构和每个结构域功能的任何变化。不希望受理论束缚，假设了通过不破坏BoNT/AB嵌合体中310螺旋的四个中心氨基酸残基确保嵌合神经毒素的最佳构象，从而允许嵌合神经毒素完全发挥其功能。
来自BoNT/A的LHN结构域可对应于SEQ ID NO:62的氨基酸残基1至872，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自BoNT/A的LHN结构域可对应于SEQ ID NO:62的氨基酸残基1至872，或与其具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选，来自BoNT/A的LHN结构域对应于SEQ ID NO:62的氨基酸残基1至872。
来自BoNT/B的HC结构域可对应于SEQ ID NO:52的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列。来自BoNT/B的HC结构域可对应于SEQ ID NO:52的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少80％、90％或95％序列同一性的多肽序列。优选，来自BoNT/B的HC结构域对应于SEQ ID NO:52的氨基酸残基860至1291。
优选，BoNT/AB嵌合体包含BoNT/A LHN结构域和BoNT/B HC结构域。更优选，LHN结构域对应于BoNT/A(SEQ ID NO:62)的氨基酸残基1至872，而HC结构域对应于BoNT/B(SEQ IDNO:52)的氨基酸残基860至1291。
优选，BoNT/B HC结构域在HCC亚结构域中还包含至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失，与天然BoNT/B序列相比，这具有增加BoNT/B神经毒素对人Syt II的结合亲和力的作用。BoNT/B HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失已在WO 2013/180799和WO2016/154534(均通过引用并入本文)中公开。
BoNT/B HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失包括选自以下的取代突变：V1118M；Y1183M；E1191M；E1191I；E1191Q；E1191T；S1199Y；S1199F；S1199L；S1201V；E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合。
BoNT/B HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失进一步包括选自以下的两种取代突变的组合：E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y，E1191Q和S1199F、E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、E1191C和S1199W、E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1191Y，或E1191V和W1178Q。
BoNT/B HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失还包括三种取代突变的组合物，其是E1191M、S1199W和W1178Q。
优选，BoNT/B HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失包括两种取代突变的组合，其是E1191M和S1199Y。
所述修饰可以是与如SEQ ID NO:52所示的未修饰的BoNT/B相比时的修饰，其中氨基酸残基编号通过与SEQ ID NO:52的比对来确定。由于SEQ ID NO:52的位置1存在的甲硫氨酸残基是可选的，因此技术人员在确定氨基酸残基编号时将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，在SEQ ID NO:52包括甲硫氨酸的情况中，位置编号将如上定义(例如，E1191将是SEQ ID NO:52的E1191)。或者，在SEQ ID NO:52中不存在甲硫氨酸的情况中，氨基酸残基编号应通过-1来改变(例如E1191将是SEQ ID NO:52的E1190)。本文所述的其他多肽序列的位置1的甲硫氨酸存在/不存在时，适用类似的考虑，并且技术人员将容易地使用本领域常规技术来确定正确的氨基酸残基编号。
因此，在一个方面中，本发明提供用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者的神经障碍的多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
在相关方面中，提供了一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者的神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
在进一步相关的方面中，提供了多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者的神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
在一个方面中，本发明提供了用于治疗受试者的神经障碍的多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
在相关方面中，提供了用于治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
在再一个相关方面中，提供了多肽在制备用于治疗受试者神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，根据本发明使用的多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选，根据本发明使用的多肽包含SEQ IDNO:63或64所示的多肽序列(更优选由其组成)。
优选，包含与SEQ ID NO:63具有至少70％序列同一性的多肽序列的多肽包含无催化活性的L链，如SEQ ID NO:64。
用于本发明中的嵌合和/或杂合梭菌神经毒素可包含BoNT/A多肽的一部分和BoNT/B多肽的一部分，其实例包括本文中描述为SEQ ID NO:44的多肽。
合适的嵌合梭菌神经毒素可包括BoNT/FA。实际上，在特别优选的实施方案中，本发明的多肽可包含BoNT/FA或其片段。BoNT/FA的无催化活性形式在本文中描述为SEQ IDNO:26和34。BoNT/FA的合适片段在本文中也描述为SEQ ID NO:28、30和32。
术语“梭菌神经毒素”还可以包括由非梭菌微生物表达的新发现的肉毒杆菌神经毒素蛋白家族成员，如肠球菌编码的与BoNT/X具有最接近的序列同一性的毒素，魏斯氏菌(Weissella oryzae)编码的称为BoNT/WO的毒素(NCBI Ref Seq:WP_027699549.1)，其在W89-W90处切割VAMP2，屎肠球菌(Enterococcus faecium)编码的毒素(GenBank:0T022244.1)，其切割VAMP2和SNAP25，以及胡椒黄杆菌(Chryseobacterium pipero)编码的毒素(NCBI Ref.Seq:WP_034687872.1)。
本发明的多肽可以缺乏梭菌神经毒素的功能性HC结构域，并且还缺乏任何功能等同的外源配体靶向部分(TM)。
因此，在特别优选的实施方案中，本发明的梭菌神经毒素不是重靶向的梭菌神经毒素。在重靶向的梭菌神经毒素中，梭菌神经毒素修饰成包括称为靶向部分(TM)的外源配体。选择TM以提供对所需靶细胞的结合特异性，并且作为重靶向过程的一部分，可以除去梭菌神经毒素的天然结合部分(例如HC结构域或HCC结构域)。重靶向技术描述于例如：EP-B-0689459；WO 1994/021300；EP-B-0939818；US 6,461,617；US 7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US 5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US 7,052,702；WO 1999/017806；EP-B-1107794；US 6,632,440；WO 2000/010598；WO 2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO2000/61192；和WO 1999/58571；所有这些专利的全部内容通过引用并入本文。
如上所述，(全长)梭菌神经毒素由两条多肽链形成，即分子量为约100kDa的重链(H链)和分子量为约50kDa的轻链(L链)。H链包含C-末端靶向组分(受体结合结构域或HC结构域)和N-末端易位组分(HN结构域)。
梭菌神经毒素可以选自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X和TeNT(破伤风神经毒素)。优选，梭菌神经毒素是肉毒杆菌神经毒素，如选自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和BoNT/X的肉毒杆菌神经毒素。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/A。参考BoNT/A序列显示为SEQ IDNO:51。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/B。参考BoNT/B序列显示为SEQ IDNO:52。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/C。参考BoNT/C序列显示为SEQ IDNO:53。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/D。参考BoNT/D序列显示为SEQ IDNO:54。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/E。参考BoNT/E序列显示为SEQ IDNO:55。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/F。参考BoNT/F序列显示为SEQ IDNO:56。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/G。参考BoNT/G序列显示为SEQ IDNO:57。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是TeNT。参考TeNT序列显示为SEQ ID NO:58。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/X。参考BoNT/X序列显示为SEQ ID NO:59。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含BoNT/A的片段或BoNT/F的片段。在另一个实施方案中，本发明的多肽包含BoNT/A或BoNT/F的无催化活性的L链。
在本文所述的多肽具有用于纯化的标签(例如His-标签)和/或接头的实施方案中，所述标签和/或接头是任选的。
本文描述了合适的全长梭菌神经毒素。
在一个实施方案中，本发明的多肽可包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列，条件是所述多肽的梭菌神经毒素L链是无催化活性的。在一个实施方案中，本发明的多肽可包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列，条件是所述多肽的梭菌神经毒素L链是无催化活性的。优选，本发明的多肽可以包含含有SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中任一个的多肽序列，条件是所述多肽的梭菌神经毒素L链是无催化活性的。
在一个实施方案中，本发明的多肽可以是由与SEQ ID NO:1、9、11、13、15、17、25、33或60中的任一个具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽，条件是所述多肽的梭菌神经毒素L链是无催化活性的。在一个实施方案中，本发明的多肽是由与SEQ ID NO:1、9、11、13、15、17、25、33或60中的任一个具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽，条件是所述多肽的梭菌神经毒素L链是无催化活性的。优选，本发明的多肽是由包含SEQ ID NO:1、9、11、13、15、17、25、33或60中任一个的核苷酸序列编码的多肽，条件是所述多肽的梭菌神经毒素L链是无催化活性的。
在一个实施方案中，本发明的多肽可包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列，条件是所述多肽的梭菌神经毒素L链是无催化活性的。在一个实施方案中，本发明的多肽包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列，条件是所述多肽的梭菌神经毒素L链是无催化活性的。优选，本发明的多肽包含SEQ IDNO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个，条件是所述多肽的梭菌神经毒素L链是无催化活性的。
在一个实施方案中，本发明的多肽是选自BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X和TeNT的全长梭菌神经毒素。
在一个实施方案中，本发明的多肽可包含与SEQ ID NO:52-59、61或63中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，本发明的多肽可包含与SEQ IDNO:52-59、61或63中的任一个具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，本发明的多肽可包含与SEQ ID NO:52-59、61或63中的任一个具有至少99％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选，本发明的多肽可以包含包含SEQ ID NO:52-59、61或63中的任一个的多肽序列(更优选由其组成)。
在特别优选的实施方案中，本发明的多肽不是全长催化活性梭菌神经毒素，例如不是全长催化活性BoNT/A。
本发明的多肽可包含梭菌神经毒素的片段(或由其组成)，例如本文所述的任何全长梭菌神经毒素的片段。
在一个实施方案中，本发明的多肽可包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列的片段。在一个实施方案中，本发明的多肽可包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列的片段。优选，本发明的多肽可以包含含有SEQ IDNO:2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个的多肽序列的片段。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含梭菌神经毒素L链或其片段(或由其组成)。梭菌神经毒素L-链的片段可以具有梭菌神经毒素L-链的≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50个氨基酸残基。在一个实施方案中，梭菌神经毒素L链的片段具有梭菌神经毒素L链的至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200个氨基酸残基。例如，梭菌神经毒素L链的片段可具有梭菌神经毒素L链的20-400、50-300或100-200个氨基酸残基。
L-链参考序列的实例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-448
B型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-440
C1型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-441
D型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-445
E型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-422
F型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-439
G型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-441
破伤风神经毒素：氨基酸残基1-457
对于最近鉴定的BoNT/X，报道了L-链对应于其氨基酸1-439，其中L-链边界可能变化约25个氨基酸(例如1-414或1-464)。
以上鉴定的参考序列应当被认为是指导，因为根据亚血清型可能发生轻微变化。举例来说，US 2007/0166332(通过引用整体并入本文)引用了略微不同的梭菌序列：
A型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K448
B型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K441
C1型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K449
D型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-R445
E型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-R422
F型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K439
G型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K446
破伤风神经毒素：氨基酸残基M1-A457
本文描述了合适的梭菌神经毒素L链。
梭菌神经毒素L-链可以包含与SEQ ID NO:6、24、32或40中的任一个或其片段具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，梭菌神经毒素L-链包含与SEQ IDNO:6、24、32或40中的任一个或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选，梭菌神经毒素L链包含含有SEQ ID NO:6、24、32或40中的任一个或其片段的多肽序列(更优选地由其组成)。
梭菌神经毒素L-链可以是由与SEQ ID NO:5、23、31或39中的任一个或其片段具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的链。在一个实施方案中，梭菌神经毒素L-链是由与SEQ ID NO:5、23、31或39中的任一个或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码的链。优选地，梭菌神经毒素L-链是由包含SEQ ID NO:5、23、31或39中任一个或其片段的核苷酸序列编码的链。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含梭菌神经毒素H-链的片段(或由其组成)。梭菌神经毒素H链的片段可以具有梭菌神经毒素H-链的≤800、≤700、≤600、≤500、≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50个氨基酸残基。在一个实施方案中，梭菌神经毒素H-链的片段具有梭菌神经毒素H-链的至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200个氨基酸残基。例如，梭菌神经毒素H-链的片段可以具有梭菌神经毒素H-链的20-800、30-600、40-400、50-300或100-200个氨基酸残基。
梭菌神经毒素H-链包含两个结构/功能结构域：易位结构域(HN)和受体结合结构域(HC)。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含梭菌神经毒素易位结构域或其片段(或由其组成)。梭菌神经毒素易位结构域的片段可具有梭菌神经毒素易位结构域的≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50个氨基酸残基。在一个实施方案中，梭菌神经毒素易位结构域的片段具有梭菌神经毒素易位结构域的至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200个氨基酸残基。例如，梭菌神经毒素易位结构域的片段可具有梭菌神经毒素易位结构域的20-400、50-300或100-200个氨基酸残基。
易位结构域是梭菌神经毒素的H-链的片段，其大致等同于H-链的氨基末端一半，或对应于完整H-链中的该片段的结构域。在一个实施方案中，H-链的HC功能可以通过缺失HC氨基酸序列(在DNA合成水平上，或在合成后水平上通过核酸酶或蛋白酶处理)来去除。或者，可以通过化学或生物处理使HC功能失活。因此，在一些实施方案中，H-链可能不能结合天然梭菌神经毒素(即全毒素)结合的靶细胞上的结合位点。
合适的(参考)易位结构域的实例包括：
肉毒杆菌A型神经毒素-氨基酸残基(449-871)
肉毒杆菌B型神经毒素-氨基酸残基(441-858)
肉毒杆菌C型神经毒素-氨基酸残基(442-866)
肉毒杆菌D型神经毒素-氨基酸残基(446-862)
肉毒杆菌E型神经毒素-氨基酸残基(423-845)
肉毒杆菌F型神经毒素-氨基酸残基(440-864)
肉毒杆菌G型神经毒素-氨基酸残基(442-863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-879)
以上鉴定的参考序列应当被认为是指导，因为根据亚血清型可能发生轻微变化。举例来说，US 2007/0166332(通过引用并入本文)引用了略微不同的梭菌序列：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A449-K871)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A442-S858)
C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(T450-N866)
D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(D446-N862)
E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(K423-K845)
F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A440-K864)
G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(S447-S863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(S458-V879)
在本发明的上下文中，包含易位结构域的多种梭菌神经毒素HN区可用于本发明的各个方面中。在一个实施方案中，这些活性片段可促进非细胞毒性蛋白酶(例如梭菌L-链)从胞内囊泡释放到靶细胞的细胞质中，并因此参与执行梭菌神经毒素蛋白水解切割底物的整个细胞机制。来自梭菌神经毒素的重链的HN区的长度为约410-430个氨基酸，并且包含易位结构域。研究表明，来自梭菌神经毒素重链的HN区的整个长度对于易位结构域的易位活性不是必需的。因此，本发明的各方面实施方案可以包括梭菌神经毒素HN区，其包含具有例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸和至少425个氨基酸长度的易位结构域。该实施方案的其他方面可以包括梭菌神经毒素HN区，其包含具有例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸和至多425个氨基酸长度的易位结构域。
关于肉毒梭菌和破伤风梭菌中毒素产生的遗传基础的进一步细节，参见Henderson等人(1997)，The Clostridia:Molecular Biology and Pathogenesis，Academic Press。
术语HN包括天然存在的神经毒素HN部分，以及具有在自然界不存在的和/或合成氨基酸残基的氨基酸序列的修饰的HN部分。在一个实施方案中，所述修饰的HN部分仍然表现出上述易位功能。
在优选实施方案中，本发明的多肽包含梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)或其片段(或由其组成)。梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)的片段可具有梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)的≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50个氨基酸残基。在一个实施方案中，梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)的片段具有梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)的至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200个氨基酸残基。例如，梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)的片段可具有梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)的20-350、50-300或100-200个氨基酸残基。
梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)参考序列的实例包括：
BoNT/A-N872-L1296
BoNT/B-E859-E1291
BoNT/C1-N867-E1291
BoNT/D-S863-E1276
BoNT/E-R846-K1252
BoNT/F-K865-E1274
BoNT/G-N864-E1297
TeNT-I880-D1315
对于最近鉴定的BoNT/X，报道了HC结构域对应于其氨基酸893-1306，其中结构域边界可能变化约25个氨基酸(例如868-1306或918-1306)。
梭菌神经毒素H-链可以进一步包含易位促进结构域。所述结构域有助于将L-链递送到靶细胞的胞质中，并且描述于例如WO 08/008803和WO 08/008805中，其各自通过引用并入本文。
举例来说，易位促进结构域可包含梭菌神经毒素HCN结构域或其片段或变体。更详细地，梭菌神经毒素HCN易位促进结构域可以具有至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸的长度。在这方面，梭菌神经毒素HCN易位促进结构域优选具有至多200个氨基酸、至多225个氨基酸、至多250个氨基酸或至多275个氨基酸的长度。具体(参考)实例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(872-1110)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(859-1097)
C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(867-1111)
D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(863-1098)
E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(846-1085)
F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(865-1105)
G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(864-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(880-1127)
根据血清型/亚型，上述序列位置可以略有变化，并且合适的(参考)梭菌神经毒素HCN结构域的更多实例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(874-1110)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(861-1097)
C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(869-1111)
D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(865-1098)
E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(848-1085)
F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(867-1105)
G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(866-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(882-1127)
本文描述了合适的梭菌神经毒素HC结构域。
梭菌神经毒素HC结构域可以包含与SEQ ID NO:8、22、30、38、42、44、46、48或50中的任一个或其片段具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，梭菌神经毒素HC结构域包含与SEQ ID NO:8、22、30、38、42、44、46、48或50中的任一个或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选，梭菌神经毒素HC结构域包含含有SEQ ID NO:8、22、30、38、42、44、46、48或50中的任一个或其片段的多肽序列(更优选由其组成)。
梭菌神经毒素HC结构域可以是由与SEQ ID NO:7、21、29、37、41、43、45、47或49中的任一个或其片段具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的结构域。在一个实施方案中，梭菌神经毒素HC结构域是由与SEQ ID NO:7、21、29、37、41、43、45、47或49中的任一个或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码的结构域。优选，梭菌神经毒素HC结构域是由包含SEQ ID NO:7、21、29、37、41、43、45、47或49中任一个或其片段的核苷酸序列编码的结构域。
在一个实施方案中，用于本发明的梭菌神经毒素HC结构域是变体BoNT/A HC结构域。所述变体BoNT/A HC结构域可包含选自Y1117、F1252、H1253和L1278的一个或多个氨基酸残基的修饰。例如，变体BoNT/A HC结构域可以包含以下修饰Y1117V、F1252Y、H1253K和L1278F或L1278H中的一个或多个(优选两个或更多个)。
在一个实施方案中，变体BoNT/A HC结构域包含以下修饰：Y1117V和H1253K；或Y1117V、F1252Y、H1253K和L1278F；或Y1117V、F1252Y、H1253K和L1278H。
优选，变体BoNT/A HC结构域包含以下修饰：Y1117V和H1253K；或Y1117V、F1252Y、H1253K和L1278H。
修饰可以是与如SEQ ID NO:62所示的未修饰的BoNT/A相比时的修饰，其中氨基酸残基编号通过与SEQ ID NO:62比对来确定。由于SEQ ID NO:62的位置1的甲硫氨酸残基的存在是任选的，因此技术人员在确定氨基酸残基编号时将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，在SEQ ID NO:62包含甲硫氨酸的情况下，位置编号将如上所定义(例如Y1117将与SEQ ID NO:62的Y1117对准)。或者，在SEQ ID NO:62中不存在甲硫氨酸的情况下，氨基酸残基编号应通过-1来改变(例如Y1117将与SEQ ID NO:52的Y1116对准)。本文所述的其他多肽序列的位置1的甲硫氨酸存在/不存在时，适用类似的考虑，并且技术人员将使用本领域常规技术容易地确定正确的氨基酸残基编号。
变体BoNT/A HC结构域可包含与SEQ ID NO:46、48或50中任一个或其片段具有至少70％序列同一性的多肽序列，条件是变体BoNT/A HC结构域包含如上所述的修饰。在一个实施方案中，变体BoNT/A HC结构域包含与SEQ ID NO:46、48或50中的任一个或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列，条件是变体BoNT/A HC结构域包含如上所述的修饰。在一个实施方案中，变体BoNT/A HC结构域包含与SEQ ID NO:46、48或50中任一个或其片段具有至少99％或99.9％序列同一性的多肽序列，条件是变体BoNT/A HC结构域包含如上所述的修饰。优选，变体BoNT/HC结构域包含含有SEQ ID NO:46、48或50中的任一个或其片段的多肽序列(更优选由其组成)。
变体BoNT/A HC结构域可包含与SEQ ID NO:46或50中的任一个或其片段具有至少70％序列同一性的多肽序列，条件是变体BoNT/A HC结构域包含如上所述的修饰。在一个实施方案中，变体BoNT/A HC结构域包含与SEQ ID NO:46或50中的任一个或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列，条件是变体BoNT/A HC结构域包含如上所述的修饰。在一个实施方案中，变体BoNT/A HC结构域包含与SEQ ID NO:46或50中的任一个或其片段具有至少99％或99.9％序列同一性的多肽序列，条件是变体BoNT/AHC结构域包含如上所述的修饰。优选，变体BoNT/HC结构域包含含有SEQ ID NO:46或50中的任一个或其片段的多肽序列(更优选由其组成)。
变体BoNT/A HC结构域可以是由与SEQ ID NO:45、47或49中的任一个或其片段具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的结构域，条件是变体BoNT/A HC结构域包含如上所述的修饰。在一个实施方案中，变体BoNT/A HC结构域是由与SEQ ID NO:45、47或49中的任一个或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码的结构域，条件是变体BoNT/AHC结构域包含如上所述的修饰。在一个实施方案中，变体BoNT/A HC结构域是由与SEQ ID NO:45、47或49中的任一个或其片段具有至少99％或99.9％序列同一性的核苷酸序列编码的结构域，条件是变体BoNT/A HC结构域包含如上所述的修饰。优选，变体BoNT/HC结构域是由SEQ ID NO:45、47或49中的任一个或其片段编码的结构域。
变体BoNT/A HC结构域可以是由与SEQ ID NO:45或49中的任一个或其片段具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的结构域，条件是变体BoNT/A HC结构域包含如上所述的修饰。在一个实施方案中，变体BoNT/A HC结构域是由与SEQ ID NO:45或49中的任一个或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码的结构域，条件是变体BoNT/A HC结构域包含如上所述的修饰。在一个实施方案中，变体BoNT/A HC结构域是由与SEQ ID NO:45或49中的任一个或其片段具有至少99％或99.9％序列同一性的核苷酸序列编码的结构域，条件是变体BoNT/A HC结构域包含如上所述的修饰。优选，变体BoNT/HC结构域是由SEQ ID NO:45或49中的任一个或其片段编码的结构域。
任何上述的促进结构域可以与任何前述适用于本发明的易位结构域肽组合。因此，举例来说，非梭菌促进结构域可与非梭菌易位结构域肽或与梭菌易位结构域肽组合。或者，梭菌神经毒素HCN易位促进结构域可以与非梭菌易位结构域肽组合。或者，梭菌神经毒素HCN促进结构域可以与梭菌易位结构域肽组合，其实例包括：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(449-1110)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(442-1097)
C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(450-1111)
D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(446-1098)
E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(423-1085)
F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(440-1105)
G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(447-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-1127)
在一些实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以缺乏梭菌神经毒素的功能性HC结构域。在一个实施方案中，梭菌神经毒素优选缺乏梭菌神经毒素全毒素的最后50个C-末端氨基酸。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素优选缺少梭菌神经毒素全毒素的最后100个，优选最后150个，更优选最后200个，特别优选最后250个，最优选最后300个C-末端氨基酸残基。或者，HC结合活性可以通过诱变消除/降低-举例来说，为方便起见参考BoNT/A，神经节苷脂结合袋中的一个或两个氨基酸残基突变(W1266至L和Y1267至F)的修饰导致HC区域丧失其受体结合功能。可以对非血清型A梭菌肽组分进行类似的突变，例如基于具有突变的肉毒杆菌B(W1262至L和Y1263至F)或肉毒杆菌E(W1224至L和Y1225至F)的构建体。活性位点的其它突变实现HC受体结合活性的相同消除，例如A型肉毒杆菌毒素中的Y1267S和其它梭菌神经毒素中的相应高度保守残基。这种突变和其他突变的详细内容描述于Rummel等(2004)(Molecular Microbiol.51:631-634)，其通过引用并入本文。
天然梭菌神经毒素的HC肽包含大约400-440个氨基酸残基，并且由各自大约25kDa的两个功能不同的结构域组成，即N-末端区域(通常称为HCN肽或结构域)和C-末端区域(通常称为HCC肽或结构域)。这一事实由以下出版物证实，其各自通过引用整体并入本文：Umland TC(1997)Nat.Struct.Biol.4:788-792；Herreros J(2000)Biochem.J.347:199-204；Halpern J(1993)J.Biol.Chem.268:15，pp.11188-11192；Rummel A(2007)PNAS 104:359-364；Lacey DB(1998)Nat.Struct.Biol.5:898-902；Knapp(1998)Am.Cryst.Assoc.Abstract Papers 25:90；Swaminathan和Eswaramoorthy(2000)Nat.Struct.Biol.7:1751-1759；和Rummel A(2004)Mol.Microbiol.51(3)，631-643。此外，已经充分证明了C-末端区域(HCC)(其构成C-末端160-200个氨基酸残基)负责梭菌神经毒素与其天然细胞受体(即神经肌肉接头处的神经末梢)的结合-这一事实也得到了上述出版物的证实。因此，在整个本说明书中提及缺乏功能性重链HC肽(或结构域)使得重链不能结合天然梭菌神经毒素结合的细胞表面受体的梭菌重链意味着梭菌重链简单地缺乏功能性HCC肽。换句话说，HCC肽区域可以部分或全部缺失，或以其他方式修饰(例如通过常规化学或蛋白水解处理)以降低其对神经肌肉接头处的神经末梢的天然结合能力。
因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素HN肽缺乏梭菌神经毒素的C-末端肽部分(HCC)的一部分，并因此缺乏天然梭菌神经毒素的HC结合功能。举例来说，在一个实施方案中，C-末端延伸的梭菌HN肽缺少梭菌神经毒素重链的C-末端40个氨基酸残基、或C-末端60个氨基酸残基、或C-末端80个氨基酸残基、或C-末端100个氨基酸残基、或C-末端120个氨基酸残基、或C-末端140个氨基酸残基、或C-末端150个氨基酸残基、或C-末端160个氨基酸残基。在另一个实施方案中，本发明的梭菌HN肽缺乏梭菌神经毒素的整个C-末端肽部分(HCC)，并因此缺乏天然梭菌神经毒素的HC结合功能。举例来说，在一个实施方案中，梭菌HN肽缺少梭菌神经毒素重链的C-末端165个氨基酸残基、或C-末端170个氨基酸残基、或C-末端175个氨基酸残基、或C-末端180个氨基酸残基、或C-末端185个氨基酸残基、或C-末端190个氨基酸残基、或C-末端195个氨基酸残基。作为另一个实例，本发明的梭菌HN肽缺乏选自以下的梭菌HCC参考序列：
A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1111-L1296)
B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1098-E1291)
C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1112-E1291)
D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1099-E1276)
E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1086-K1252)
F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1274)
G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1297)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(Y1128-D1315)。
以上鉴定的参考序列应当被认为是指导，因为根据亚血清型可能发生轻微变化。
在优选实施方案中，本发明的多肽包含梭菌神经毒素L-链或其片段和梭菌神经毒素H-链的片段(或由其组成)。例如，多肽可包含梭菌神经毒素L-链或其片段和梭菌神经毒素易位结构域(HN)(或由其组成)。优选，多肽不进一步包含梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)或梭菌神经毒素受体结合结构域(HCC)的至少C-末端部分。因此，在一个实施方案中，本发明的多肽缺少梭菌神经毒素受体结合结构域(HCC)的C-末端部分。有利地，此类多肽缺乏内源性梭菌神经毒素受体结合能力，因此在施用所述多肽的受试者中表现出较少的脱靶效应。
在一个实施方案中，本发明的多肽基本上由梭菌神经毒素L-链或其片段和/或梭菌神经毒素H-链的片段组成。如在此上下文中使用的术语“基本上由......组成”意指多肽不进一步包含一个或多个赋予多肽另外的功能性的氨基酸残基，例如施用于受试者时。换句话说，“基本上由梭菌神经毒素L-链或其片段和/或梭菌神经毒素H-链的片段组成”的多肽可以进一步包含一个或多个氨基酸残基(针对梭菌神经毒素L-链或其片段和/或梭菌神经毒素H-链的片段的氨基酸残基)，但所述一个或多个另外的氨基酸残基不赋予多肽另外的功能性，例如施用于受试者时。另外的功能性可包括酶活性、结合活性和/或任何生理活性。
在一个实施方案中，除了任何梭菌神经毒素序列之外，多肽还可包含非梭菌神经毒素序列。非梭菌神经毒素序列优选不破坏本发明的多肽促进神经元生长或神经元修复的能力。优选，非梭菌神经毒素序列不是具有催化活性(例如酶活性)的序列。优选，非梭菌序列不是与细胞受体结合的序列。换句话说，最优选非梭菌序列不是细胞受体的配体。细胞受体可以是蛋白质细胞受体，如膜内在蛋白。细胞受体的实例可以在IUPHAR Guide toPharmacology Database，Version 2019.4中找到，可在https://www.guidetopharmacology.org/download.jsp#db_reports获得。非梭菌神经毒素序列可以包括有助于纯化的标签，如His标签。优选包含在所述多肽中的任何梭菌神经毒素序列由梭菌神经毒素L-链或其片段和/或梭菌神经毒素H-链的片段组成。在一个实施方案中，包含在所述多肽中的梭菌神经毒素序列可以由梭菌神经毒素L-链组成。在一个实施方案中，包含在所述多肽中的梭菌神经毒素序列可由梭菌神经毒素易位结构域组成。在一个实施方案中，包含在所述多肽中的梭菌神经毒素序列可由梭菌神经毒素受体结合结构域组成。在一个实施方案中，包含在所述多肽中的梭菌神经毒素序列可由梭菌神经毒素L-链和梭菌神经毒素易位结构域组成。
本文描述了包含梭菌神经毒素L-链和易位结构域(或由其组成)的合适的多肽。
包含梭菌神经毒素L-链和易位结构域(或由其组成)的梭菌神经毒素可以包含与SEQ ID NO:4、20、28或36中的任一个或其片段具有至少70％序列同一性的多肽序列。在一个实施方案中，包含梭菌神经毒素L-链和易位结构域(或由其组成)的梭菌神经毒素包含与SEQ ID NO:4、20、28或36中的任一个或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的多肽序列。优选，包含梭菌神经毒素L-链和易位结构域(或由其组成)的梭菌神经毒素包含含有SEQ ID NO:4、20、28或36中的任一个的多肽序列或其片段(更优选由其组成)。
包含梭菌神经毒素L-链和易位结构域(或由其组成)的梭菌神经毒素可以是由与SEQ ID NO:3、19、27或35中的任一个或其片段具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的梭菌神经毒素。在一个实施方案中，包含梭菌神经毒素L-链和易位结构域(或由其组成)的梭菌神经毒素是由与SEQ ID NO:3、19、27或35中的任一个或其片段具有至少80％、90％、95％或98％序列同一性的核苷酸序列编码的梭菌神经毒素。优选，包含梭菌神经毒素L-链和易位结构域(或由其组成)的梭菌神经毒素是由包含SEQ ID NO:3、19、27或35中的任一个的核苷酸序列或其片段编码的梭菌神经毒素。
本发明的多肽可以不含天然存在的梭菌神经毒素复合物中存在的复合蛋白。
本发明的多肽可以使用重组核酸技术产生。因此，在一个实施方案中，多肽(如上所述)是重组多肽。
在一个实施方案中，提供了包含编码多肽的核酸序列的核酸(例如，DNA)。在一个实施方案中，将核酸序列制备为包含启动子和终止子的DNA载体的一部分。
在优选的实施方案中，载体具有选自以下的启动子：
Figure BDA0003572547830000421
在另一个优选实施方案中，载体具有选自以下的启动子：
Figure BDA0003572547830000422
可以使用本领域已知的任何合适的方法制备核酸分子。因此，可以使用化学合成技术制备核酸分子。或者，可以使用分子生物学技术制备本发明的核酸分子。
本发明的DNA构建体优选在计算机中设计，然后通过常规DNA合成技术合成。
根据待采用的最终宿主细胞(例如大肠杆菌)表达系统，任选地针对密码子偏好修饰上述核酸序列信息。
术语“核苷酸序列”和“核酸”在本文中同义使用。优选，核苷酸序列是DNA序列。
本发明的多肽(尤其是其任何梭菌神经毒素部分)可以作为单链或作为双链存在。
本发明提供了一种产生具有轻链和重链的单链多肽的方法，该方法包括在表达宿主中表达本文所述的核酸，裂解宿主细胞以提供含有单链多肽的宿主细胞匀浆，并分离单链多肽。在一个方面中，本发明提供了一种激活本文所述的多肽的方法，该方法包括使多肽与水解多肽的激活环中的肽键的蛋白酶接触，从而将(单链)多肽转化为相应的双链多肽(例如其中轻链和重链通过二硫键连接在一起)。
因此，本发明提供了可通过本发明的方法获得的双链多肽。
涉及本发明的各种治疗用途的实施方案旨在等同地应用于本发明的治疗方法、多肽，反之亦然。
序列同源性
多种序列比对方法中的任何都可以用于确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如区段方法。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开始到结束比对序列，并通过累加各个残基对的分数和通过施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括，例如CLUSTAL W，参见例如JulieD.Thompson等，CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive MultipleSequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penaltiesand Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代改进，参见例如，Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy of MultipleProtein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Referenceto Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括，例如火柴盒(Match-box)，参见例如Eric Depiereux and Ernest Feytmans,Match-Box:A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501-509(1992)；Gibbs采样，参见例如C.E.Lawrence等，Detecting SubtleSequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见，例如，Ivo Van WaIIe等，Align-M-A NewAlgorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。
因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。参见，例如，Altschul等，Bull.Math.Bio.48:603-16，1986以及Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-19，1992。简而言之，如下所示，使用空位开放罚分10，空位延伸罚分1，以及Henikoff和Henikoff的“blosum 62”评分矩阵(同上)对两个氨基酸序列进行比对，以优化比对得分(氨基酸由标准的单字母代码表示)。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是该序列共有的相同位置数目的函数。因此，同一性％可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100。％序列同一性的计算也可以考虑需要引入以优化两个或更多个序列比对的空位的数目，以及每个空位的长度。可以使用本领域技术人员熟悉的特定数学算法(例如BLAST)进行序列比较和确定两个或多个序列之间的同一性百分比。
确定序列同一性的比对得分
Figure BDA0003572547830000451
然后，百分比同一性计算为：
Figure BDA0003572547830000452
基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、删除或添加。这些变化优选是不重要的，即，保守的氨基酸取代(见下文)和不显著影响多肽折叠或活性的其他取代；小的删除，通常1至约30个氨基酸；和小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基，最多约20-25个残基的小接头肽或亲和标签。
保守氨基酸取代
碱性：精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性：谷氨酸
天冬氨酸
极性：谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性：亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香族：苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小的：甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除20个标准氨基酸外，非标准氨基酸(例如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不是由遗传密码子编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然存在的氨基酸残基并入蛋白质中的几种方法是本领域已知的。例如，可以使用体外系统，其中使用化学氨酰化的抑制子tRNA抑制无义突变。合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译是在无细胞系统中进行的，该系统包含大肠杆菌S30提取物以及可商购的酶和其他试剂。蛋白质通过色谱法纯化。参见，例如，Robertson等，J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等，Methods Enzymol.202:301,1991；Chung等人,Science 259:806-9,1993；和Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制子tRNA在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等，J.Biol.Chem.271:19991-8，1996)。在第三种方法中，在不存在待替代的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)和存在期望的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸并入多肽，代替其天然对应物。参见，Koide等，Biochem.33:7470-6，1994。可通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化为非天然存在的物质。化学修饰可以与定点诱变组合使用，以进一步扩大取代范围(Wynn和Richards，Protein Sci.2:395-403，1993)。
有限数量的非保守氨基酸、不是由遗传密码子编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明多肽的氨基酸残基。
可以根据本领域已知的程序来鉴定本发明多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,Science 244:1081-5，1989)。也可以通过结构的物理分析来确定生物相互作用的位点，如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术，结合假定的接触位点氨基酸突变来确定。参见，例如，de Vos等，Science 255:306-12，1992；Smith等，J.Mol.Biol.224:899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.309:59-64，1992。还可以从与本发明多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性分析中推断出必需氨基酸的鉴定。
可以使用诱变和筛选的已知方法进行多种氨基酸取代，并进行测试，例如Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7，1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6，1989)中公开的那些方法。简而言之，这些作者公开了同时使多肽中的两个或更多个位置随机化，选择功能性多肽，然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置上允许取代的范围的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等，Biochem.30:10832-7，1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公开WO92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等，Gene 46:145，1986；Ner等，DNA 7:127，1988)。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY，第20版，John Wiley and Sons,New York(1994)，和Hale&Marham，THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)，为熟练的技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
本公开内容不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法或材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开内容的实施方案的实践或测试。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列都以5'至3'的方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右书写。
本文提供的标题不是对本公开的各个方面或实施方案的限制。
在本文中，使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换使用。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母密码子。根据IUPACIUB生化命名联合委员会(JCBN)定义氨基酸的3字母密码子。还应理解，由于遗传密码子的简并性，多肽可以被一个以上的核苷酸序列编码。
术语的其他定义可能在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，并因此可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本公开的范围仅由所附权利要求书限定。
在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限和下限之间、每个居中值，至下限单位的十分之一，具体包括在本公开内。在指定范围内的任何指定值或居中值与该指定范围内的任何其他指定值或居中值之间的每个较小范围都包括在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且其中包括在较小范围内的上下限之一、均不包括、或包括二者的每个范围也包括在本公开内，以所述范围内的任何明确排除的限为准。在所述范围包括一个或两个限的情况下，排除那些包括的限中任一个或两个的范围也包括在本公开中。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个(a)”、“一个(an)”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“梭菌神经毒素”包括多种这样的候选试剂，并且提及“梭菌神经毒素”包括提及一种或多种梭菌神经毒素及本领域技术人员已知的其等同物，等等。
本文所讨论的出版物仅因在本申请的提交日期之前公开其内容而提供。本文中的任何内容均不应解释为承认此类出版物构成了所附权利要求的现有技术。
附图说明
现在将参考以下附图和实施例仅以举例的方式描述本发明的实施方案。
图1显示了在运动神经元样细胞系NSC34中，与阳性对照脑源性神经营养因子(BDNF)相比，不同重组表达的无催化活性的BoNT血清型的神经营养作用。相对于未处理的对照，*p<0.05，单因素ANOVA，然后进行Dunnett’s多重比较检验。数据是三个独立实验的平均值±标准误差，每个实验在六个重复孔中进行。
图2显示了肉毒杆菌神经毒素血清型A片段在运动神经元样细胞系NSC34中的神经营养作用和重组表达的无催化活性的BoNT/A的作用。BDNF用作阳性对照。相对于未处理的对照，*p<0.05，单因素ANOVA，然后进行Dunnett’s多重比较检验。数据是三个独立实验的平均值±标准误差，每个实验在六个重复孔中进行。
图3显示了阴性对照与重组表达的无催化活性的BoNT/A(BoNT/A(0))在运动神经元样细胞系NSC34中的神经营养作用。BDNF用作阳性对照。相对于未处理的对照，*p<0.05，单因素ANOVA，然后进行Dunnett’s多重比较检验。数据是三个独立实验的平均值±标准误差，每个实验在六个重复孔中进行。
图4显示了施用了载剂对照(PBS)或100pg、100ng或50ug的rBoNT/A(0)的小鼠的水平梯测试的结果。
图5显示了：(A)在施用载剂(PBS)(左图)或100ng rBoNT/A(0)(右图)后4周，使用与神经丝200(NF200)结合的抗体的免疫组织化学；和(B)在施用载剂(PBS)(左图)或100ngrBoNT/A(0)(右图)后4周，使用与MAP1B结合的抗体的免疫组织化学。病变部位用*表示(并且对于图5B，用白色箭头表示)。
图6显示了(A)无催化活性BoNT/A(0)、(B)BoNT/A轻链加易位结构域片段(LHN/A)、(C)BoNT/A轻链(LC/A，即L/A)和(D)BoNT/A受体结合结构域(HC/A)对每个细胞的神经突数量的影响。将BoNT或BoNT片段与BSA(阴性对照)、BDNF(阳性对照)进行比较，并在0.1nM、1nM和10nM的浓度下进行测试。相对于BSA对照，*p<0.05，单因素ANOVA，然后进行Dunnett’spost hoc检验。数据为平均±s.e.平均。
图7显示了(A)无催化活性BoNT/FA(0)、(B)BoNT/FA轻链加易位结构域片段(LHN/FA)、(C)BoNT/FA轻链(LC/FA，即L/FA)和(D)BoNT/FA受体结合结构域(HC/FA)对每个细胞的神经突数量的影响。将BoNT或BoNT片段与BSA(阴性对照)、BDNF(阳性对照)进行比较，并在0.1nM、1nM和10nM的浓度下进行测试。相对于BSA对照，*p<0.05，单因素ANOVA，然后进行Dunnett’s post hoc检验。数据为平均±s.e.平均。
图8显示了(A)BoNT/F轻链加易位结构域片段(LHN/F)、(B)BoNT/F轻链(LC/F，即L/F)和(C)BoNT/F受体结合结构域(HC/F)对每个细胞的神经突数量的影响。将BoNT或BoNT片段与BSA(阴性对照)、BDNF(阳性对照)进行比较，并在0.1nM、1nM和10nM的浓度下进行测试。相对于BSA对照，*p<0.05，单因素ANOVA，然后进行Dunnett’s post hoc检验。数据为平均±s.e.平均。
图9显示了阳离子的rHC/A(即mrHC/A)对每个细胞的神经突数量的影响。将阳离子的BoNT片段与BSA(阴性对照)、BDNF(阳性对照)进行比较，并在0.1nM、1nM和10nM的浓度下进行测试。相对于BSA对照，*p<0.05，单因素ANOVA，然后进行Dunnett’s post hoc检验。数据为平均±s.e.平均。
图10显示了(A)toxHC/A YH(即rHC/A变体Y1117V H1253K)和(B)toxHC/A YFHL(L至H)(即rHC/A变体Y1117V F1252Y H1253K L1278H)对每个细胞的神经突数量的影响。将变体BoNT片段与BSA(阴性对照)、BDNF(阳性对照)进行比较，并在0.1nM、1nM和10nM的浓度下进行测试。相对于BSA对照，*p<0.05，单因素ANOVA，然后进行Dunnett’s post hoc检验。数据为平均±s.e.平均。
序列表
在任何以下SEQ ID NO中指示初始Met氨基酸残基或相应的初始密码子时，所述残基/密码子是任选的。
SEQ ID NO:1-重组的无催化活性BoNT/A(rBoNT/A(0))的核苷酸序列
SEQ ID NO:2-rBoNT/A(0)的多肽序列
SEQ ID NO:3-rLHN/A的核苷酸序列(仅轻链加易位结构域)。
SEQ ID NO:4-rLHN/A的多肽序列
SEQ ID NO:5-rL/A的核苷酸序列(仅轻链)
SEQ ID NO:6-rL/A的多肽序列
SEQ ID NO:7-rHC/A的核苷酸序列
SEQ ID NO:8-rHC/A的多肽序列
SEQ ID NO:9-rBoNT/B(0)的核苷酸序列
SEQ ID NO:10-rBoNT/B(0)的多肽序列
SEQ ID NO:11-rBoNT/C(0)的核苷酸序列
SEQ ID NO:12-rBoNT/C(0)的多肽序列
SEQ ID NO:13-rBoNT/E(0)的核苷酸序列
SEQ ID NO:14-rBoNT/E(0)的多肽序列
SEQ ID NO:15-rBoNT/F(0)的核苷酸序列
SEQ ID NO:16-rBoNT/F(0)的多肽序列
SEQ ID NO:17-rBoNT/A(0)的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:18-rBoNT/A(0)的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:19-rLHN/A的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:20-rLHN/A的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:21-rHC/A的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:22-rHC/A的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:23-rLc/A的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:24-rLc/A的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:25-rBoNT/FA(0)的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:26-rBoNT/FA(0)的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:27-rLHN/FA的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:28-rLHN/FA的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:29-rHC/FA的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:30-rHC/FA的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:31-rLC/FA的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:32-rLC/FA的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:33-rBoNT/F(0)的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:34-rBoNT/F(0)的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:35-rLHN/F的核苷酸序列(His标记)
SEQ ID NO:36-rLHN/F的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:37-rHC/F的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:38-rHC/F的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:39-rLC/F的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:40-rLC/F的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:41-阳离子的rHC/A的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:42-阳离子的rHC/A的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:43-rHC/AB的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:44-rHC/AB的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:45-rHC/A变体Y1117V H1253K的核苷酸序列(His-标记的)
SEQ ID NO:46-rHC/A变体Y1117V H1253K的多肽序列(His-标记的)
SEQ ID NO:47-rHC/A变体Y1117V F1252Y H1253K L1278F的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:48-rHC/A变体Y1117V F1252Y H1253K L1278F的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:49-rHC/A变体Y1117V F1252Y H1253K L1278H的核苷酸序列(His标记的)
SEQ ID NO:50-rHC/A变体Y1117V F1252Y H1253K L1278H的多肽序列(His标记的)
SEQ ID NO:51-BoNT/A的多肽序列-Uniprot P10845
SEQ ID NO:52-BoNT/B的多肽序列-Uniprot P10844
SEQ ID NO:53-BoNT/C的多肽序列-Uniprot P18640
SEQ ID NO:54-BoNT/D的多肽序列-Uniprot P19321
SEQ ID NO:55-BoNT/E的多肽序列-Uniprot Q00496
SEQ ID NO:56-BoNT/F的多肽序列-Uniprot A7GBG3
SEQ ID NO:57-BoNT/G的多肽序列-Uniprot Q60393
SEQ ID NO:58-TeNT的多肽序列-Uniprot P04958
SEQ ID NO:59-BoNT/X的多肽序列
SEQ ID NO:60-mrBoNT/A的核苷酸序列
SEQ ID NO:61-mrBoNT/A的多肽序列
SEQ ID NO:62-未修饰的BoNT/A1的多肽序列
SEQ ID NO:63-mrBoNT/AB的多肽序列
SEQ ID NO:64-mrBoNT/AB(0)的多肽序列
SEQ ID NO:65-MrBoNT/A(0)的多肽序列
SEQ ID NO:1-rBoNT/A(0)的核苷酸序列
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATcAACTGATCtACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO:2-rBoNT/A(0)的多肽序列
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO:3-rLHN/A的核苷酸序列
atggagttcgttaacaaacagttcaactataaagacccagttaacggtgttgacattgcttacatcaaaatcccgaacgctggccagatgcagccggtaaaggcattcaaaatccacaacaaaatctgggttatcccggaacgtgatacctttactaacccggaagaaggtgacctgaacccgccaccggaagcgaaacaggtgccggtatcttactatgactccacctacctgtctaccgataacgaaaaggacaactacctgaaaggtgttactaaactgttcgagcgtatttactccaccgacctgggccgtatgctgctgactagcatcgttcgcggtatcccgttctggggcggttctaccatcgataccgaactgaaagtaatcgacactaactgcatcaacgttattcagccggacggttcctatcgttccgaagaactgaacctggtgatcatcggcccgtctgctgatatcatccagttcgagtgtaagagctttggtcacgaagttctgaacctcacccgtaacggctacggttccactcagtacatccgtttctctccggacttcaccttcggttttgaagaatccctggaagtagacacgaacccactgctgggcgctggtaaattcgcaactgatcctgcggttaccctggctcacgaactgattcatgcaggccaccgcctgtacggtatcgccatcaatccgaaccgtgtcttcaaagttaacaccaacgcgtattacgagatgtccggtctggaagttagcttcgaagaactgcgtacttttggcggtcacgacgctaaattcatcgactctctgcaagaaaacgagttccgtctgtactactataacaagttcaaagatatcgcatccaccctgaacaaagcgaaatccatcgtgggtaccactgcttctctccagtacatgaagaacgtttttaaagaaaaatacctgctcagcgaagacacctccggcaaattctctgtagacaagttgaaattcgataaactttacaaaatgctgactgaaatttacaccgaagacaacttcgttaagttctttaaagttctgaaccgcaaaacctatctgaacttcgacaaggcagtattcaaaatcaacatcgtgccgaaagttaactacactatctacgatggtttcaacctgcgtaacaccaacctggctgctaattttaacggccagaacacggaaatcaacaacatgaacttcacaaaactgaaaaacttcactggtctgttcgagttttacaagctgctgtgcGTCGACGGCATCATTACCTCCAAAACTAAATCTGACGATGACGATAAAAACAAAGCGCTGAACCTGCAGtgtatcaaggttaacaactgggatttattcttcagcccgagtgaagacaacttcaccaacgacctgaacaaaggtgaagaaatcacctcagatactaacatcgaagcagccgaagaaaacatctcgctggacctgatccagcagtactacctgacctttaatttcgacaacgagccggaaaacatttctatcgaaaacctgagctctgatatcatcggccagctggaactgatgccgaacatcgaacgtttcccaaacggtaaaaagtacgagctggacaaatataccatgttccactacctgcgcgcgcaggaatttgaacacggcaaatcccgtatcgcactgactaactccgttaacgaagctctgctcaacccgtcccgtgtatacaccttcttctctagcgactacgtgaaaaaggtcaacaaagcgactgaagctgcaatgttcttgggttgggttgaacagcttgtttatgattttaccgacgagacgtccgaagtatctactaccgacaaaattgcggatatcactatcatcatcccgtacatcggtccggctctgaacattggcaacatgctgtacaaagacgacttcgttggcgcactgatcttctccggtgcggtgatcctgctggagttcatcccggaaatcgccatcccggtactgggcacctttgctctggtttcttacattgcaaacaaggttctgactgtacaaaccatcgacaacgcgctgagcaaacgtaacgaaaaatgggatgaagtttacaaatatatcgtgaccaactggctggctaaggttaatactcagatcgacctcatccgcaaaaaaatgaaagaagcactggaaaaccaggcggaagctaccaaggcaatcattaactaccagtacaaccagtacaccgaggaagaaaaaaacaacatcaacttcaacatcgacgatctgtcctctaaactgaacgaatccatcaacaaagctatgatcaacatcaacaagttcctgaaccagtgctctgtaagctatctgatgaactccatgatcccgtacggtgttaaacgtctggaggacttcgatgcgtctctgaaagacgccctgctgaaatacatttacgacaaccgtggcactctgatcggtcaggttgatcgtctgaaggacaaagtgaacaataccttatcgaccgacatcccttttcagctcagtaaatatgtcgataaccaacgccttttgtccactctagaagcaCACCATCATCACcaccatcaccatcaccat
SEQ ID NO:4-rLHN/A的多肽序列
MEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEAHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:5-rL/A的核苷酸序列
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGggtctagaagcaCACCATCATCACcaccatcaccatcaccat
SEQ ID NO:6-rL/A的多肽序列
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLGLEAHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:7-rHC/A的核苷酸序列
ATGCATCATCACCATCACCACAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO:8-rHC/A的多肽序列
MHHHHHHKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO:9-rBoNT/B(0)的核苷酸序列
ATGCCGGTGACGATTAACAACTTCAACTACAACGACCCGATTGACAACAACAACATTATCATGATGGAACCGCCGTTTGCACGCGGCACGGGCCGTTATTACAAAGCGTTTAAAATCACCGATCGTATTTGGATTATCCCGGAACGCTACACGTTTGGTTATAAACCGGAAGACTTCAACAAAAGCTCTGGCATCTTCAACCGTGATGTTTGCGAATACTACGATCCGGACTACCTGAACACCAACGATAAGAAAAACATTTTTCTGCAAACGATGATCAAACTGTTCAATCGCATTAAAAGCAAACCGCTGGGTGAAAAACTGCTGGAAATGATTATCAATGGCATTCCGTATCTGGGTGATCGTCGCGTGCCGCTGGAAGAATTTAACACCAATATCGCGAGTGTTACGGTCAACAAACTGATTTCCAATCCGGGTGAAGTCGAACGTAAAAAAGGCATCTTCGCCAACCTGATCATCTTCGGCCCGGGTCCGGTGCTGAACGAAAATGAAACCATTGATATCGGTATTCAGAACCATTTTGCCTCACGCGAAGGCTTCGGCGGTATTATGCAAATGAAATTTTGCCCGGAATATGTGTCGGTTTTCAACAATGTTCAGGAAAACAAAGGTGCAAGCATCTTTAATCGTCGCGGCTATTTCTCTGATCCGGCTCTGATCCTGATGCACcAACTGATTtATGTGCTGCACGGCCTGTATGGTATCAAAGTGGATGACCTGCCGATCGTTCCGAACGAGAAAAAATTTTTCATGCAGAGCACCGACGCAATTCAAGCTGAAGAACTGTATACGTTTGGCGGTCAGGACCCGTCTATTATCACCCCGAGCACCGACAAAAGCATCTACGATAAAGTGCTGCAAAACTTTCGTGGCATTGTTGACCGCCTGAATAAAGTCCTGGTGTGTATCTCTGATCCGAACATCAACATCAACATCTACAAAAACAAATTCAAAGACAAATACAAATTCGTTGAAGATTCTGAAGGCAAATATAGTATTGACGTCGAATCCTTTGATAAACTGTACAAAAGTCTGATGTTCGGTTTCACCGAAACGAACATCGCGGAAAACTACAAAATCAAAACCCGCGCCTCCTATTTCAGCGACTCTCTGCCGCCGGTTAAAATCAAAAATCTGCTGGATAACGAAATTTATACGATCGAAGAAGGTTTCAACATCAGCGATAAAGACATGGAAAAAGAATACCGTGGCCAGAATAAAGCAATCAACAAACAGGCGTATGAAGAAATTAGTAAAGAACATCTGGCGGTCTACAAAATTCAGATGTGCAAATCCGTGAAAGCCCCGGGTATTTGTATCGATGTTGACAATGAAGACCTGTTTTTCATCGCCGATAAAAACAGTTTTTCCGATGACCTGTCAAAAAATGAACGCATCGAATACAACACCCAATCGAACTACATCGAAAACGATTTCCCGATCAACGAACTGATTCTGGATACGGACCTGATTAGTAAAATCGAACTGCCGTCAGAAAACACCGAATCGCTGACGGACTTTAATGTTGATGTCCCGGTGTATGAAAAACAGCCGGCAATTAAGAAAATTTTTACCGATGAAAACACGATCTTCCAGTACCTGTACAGCCAAACCTTTCCGCTGGACATTCGCGATATCTCTCTGACGAGTTCCTTTGATGACGCACTGCTGTTCAGCAACAAAGTGTACTCCTTTTTCTCAATGGATTACATCAAAACCGCTAACAAAGTGGTTGAAGCGGGCCTGTTTGCCGGTTGGGTGAAACAGATCGTTAACGATTTCGTCATCGAAGCCAACAAAAGTAACACGATGGATAAAATTGCTGATATCTCCCTGATTGTCCCGTATATTGGCCTGGCACTGAATGTGGGTAACGAAACGGCGAAAGGCAATTTTGAAAACGCCTTCGAAATTGCAGGCGCTTCAATCCTGCTGGAATTTATTCCGGAACTGCTGATCCCGGTCGTGGGTGCGTTCCTGCTGGAATCTTACATCGACAACAAAAACAAAATCATCAAAACCATTGATAACGCGCTGACGAAACGTAACGAAAAATGGTCAGATATGTACGGCCTGATTGTTGCCCAGTGGCTGAGCACCGTCAACACGCAATTTTACACCATCAAAGAAGGTATGTACAAAGCGCTGAATTATCAGGCGCAAGCCCTGGAAGAAATCATCAAATACCGCTACAACATCTACAGCGAAAAAGAAAAATCTAACATCAACATCGACTTTAATGATATCAACAGCAAACTGAACGAAGGTATCAACCAGGCAATCGATAACATCAACAACTTCATCAACGGCTGCTCAGTGTCGTATCTGATGAAGAAAATGATCCCGCTGGCTGTTGAAAAACTGCTGGATTTTGACAACACCCTGAAGAAAAACCTGCTGAACTACATCGATGAAAACAAACTGTACCTGATCGGCTCAGCCGAATACGAAAAATCGAAAGTGAACAAATACCTGAAAACCATCATGCCGTTTGACCTGAGTATTTACACCAACGATACGATCCTGATCGAAATGTTCAACAAATACAACTCCGAAATTCTGAACAATATTATCCTGAACCTGCGTTACAAAGACAACAATCTGATCGATCTGAGCGGCTATGGTGCAAAAGTTGAAGTCTACGACGGTGTCGAACTGAACGATAAAAACCAGTTCAAACTGACCTCATCGGCTAACTCAAAAATTCGTGTGACGCAGAACCAAAACATCATCTTCAACTCGGTCTTTCTGGACTTCAGCGTGTCTTTCTGGATTCGCATCCCGAAATATAAAAATGATGGCATCCAGAACTACATCCATAACGAATACACCATCATCAACTGTATGAAAAACAACAGTGGTTGGAAAATTTCCATCCGTGGCAACCGCATTATCTGGACCCTGATTGATATCAATGGTAAAACGAAAAGCGTGTTTTTCGAATACAACATCCGTGAAGATATCTCTGAATACATCAATCGCTGGTTTTTCGTGACCATTACGAACAATCTGAACAATGCGAAAATCTATATCAACGGCAAACTGGAAAGTAATACCGACATCAAAGATATTCGTGAAGTTATCGCCAACGGTGAAATCATCTTCAAACTGGATGGCGACATCGATCGCACCCAGTTCATTTGGATGAAATACTTCTCCATCTTCAACACGGAACTGAGTCAGTCCAATATCGAAGAACGCTACAAAATCCAATCATACTCGGAATACCTGAAAGATTTCTGGGGTAACCCGCTGATGTACAACAAAGAATACTACATGTTCAACGCGGGCAACAAAAACTCATACATCAAACTGAAAAAAGATTCGCCGGTGGGTGAAATCCTGACCCGTAGCAAATACAACCAGAACTCTAAATACATCAACTATCGCGATCTGTACATTGGCGAAAAATTTATTATCCGTCGCAAAAGCAACTCTCAGAGTATTAATGATGACATCGTGCGTAAAGAAGACTACATCTATCTGGATTTCTTTAATCTGAACCAAGAATGGCGCGTTTATACCTACAAATACTTCAAAAAAGAAGAAGAGAAACTGTTCCTGGCCCCGATTAGCGACAGCGATGAATTTTACAACACCATCCAGATCAAAGAATACGATGAACAGCCGACGTATAGTTGCCAACTGCTGTTCAAAAAAGACGAAGAATCCACCGATGAAATTGGCCTGATTGGTATCCACCGTTTCTATGAAAGCGGTATCGTTTTCGAAGAATACAAAGATTACTTCTGTATCTCTAAATGGTATCTGAAAGAAGTCAAACGCAAACCGTACAACCTGAAACTGGGCTGCAACTGGCAATTTATCCCGAAAGACGAAGGCTGGACCGAA
SEQ ID NO:10-rBoNT/B(0)的多肽序列
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SEQ ID NO:11-rBoNT/C(0)的核苷酸序列
ATGCCGATCACGATTAATAATTTCAACTATAGCGATCCGGTGGACAATAAGAATATTCTGTATCTGGATACTCATCTGAATACGCTGGCTAACGAACCGGAGAAAGCGTTCCGCATCACAGGCAACATCTGGGTTATTCCCGATCGCTTTTCACGCAACAGCAACCCTAATCTGAACAAACCTCCTCGTGTCACCAGTCCTAAATCCGGTTATTACGACCCAAACTATCTGAGTACGGATAGCGATAAAGATCCCTTTCTGAAAGAGATCATTAAGCTGTTCAAACGCATTAACTCTCGCGAAATTGGGGAAGAGCTGATCTATCGGCTTTCGACAGATATCCCGTTCCCAGGTAACAATAATACCCCGATTAATACTTTCGACTTTGATGTTGATTTCAATTCTGTGGATGTGAAAACGCGTCAAGGCAATAATTGGGTGAAAACTGGTAGCATTAACCCGAGTGTAATTATCACAGGTCCCCGTGAGAACATCATCGACCCGGAAACCTCTACCTTCAAGCTGACGAACAACACGTTTGCTGCACAGGAAGGGTTTGGTGCCCTGTCAATCATTTCCATCTCACCGCGTTTCATGTTAACCTACTCCAATGCCACAAATGATGTTGGCGAAGGACGTTTTAGCAAATCAGAATTTTGCATGGACCCAATTCTCATTCTGATGggCacGCTGAACaATGCGATGCACAACTTGTATGGCATTGCTATTCCAAACGATCAAACCATTAGCTCCGTTACCAGTAATATCTTCTATAGCCAGTATAATGTCAAATTGGAGTATGCCGAAATTTACGCCTTTGGAGGCCCGACCATTGACCTGATTCCGAAATCTGCACGCAAATACTTCGAAGAAAAGGCGTTAGATTACTATCGCAGCATCGCGAAACGCCTGAACTCGATTACCACGGCCAATCCGTCGTCGTTCAACAAATACATTGGTGAATATAAACAGAAACTGATTCGCAAATATCGGTTTGTCGTAGAAAGCTCTGGTGAAGTGACTGTAAACCGCAACAAATTTGTCGAACTCTACAACGAGTTGACCCAAATCTTTACCGAGTTTAACTACGCAAAGATCTATAACGTACAGAACCGCAAGATTTATCTTAGCAATGTATACACACCGGTTACTGCGAACATCTTAGACGACAATGTGTATGATATTCAGAATGGCTTTAACATCCCGAAATCAAATCTGAACGTTCTGTTTATGGGCCAGAACCTGAGTCGTAATCCAGCACTGCGTAAAGTGAACCCGGAAAATATGCTCTACTTGTTTACCAAATTTTGCCACAAAGCGATTGATGGCCGCTCTCTCTATAACAAAACGCTGGATTGTCGTGAGTTACTTGTGAAGAACACTGATTTACCGTTCATTGGGGATATCTCCGACGTGAAAACCGATATCTTCCTGCGCAAAGACATTAATGAAGAAACGGAAGTCATCTATTACCCCGACAATGTGAGCGTTGATCAGGTCATTTTATCGAAGAACACCTCCGAACATGGTCAGTTGGATTTGCTGTACCCTAGCATTGACTCGGAGAGTGAAATCCTTCCGGGCGAAAATCAAGTGTTTTACGACAACCGTACCCAAAATGTTGATTATTTGAATTCTTATTACTACCTGGAATCTCAGAAATTGAGCGACAATGTGGAAGATTTCACGTTCACACGCTCCATTGAGGAAGCGCTGGATAATAGCGCGAAAGTGTATACGTATTTCCCTACCTTGGCGAATAAAGTAAATGCTGGTGTCCAGGGAGGCTTATTTCTGATGTGGGCGAATGATGTGGTAGAAGATTTTACGACCAATATTTTGCGTAAGGACACCTTAGATAAAATTAGCGATGTTAGCGCCATCATCCCCTATATTGGCCCAGCACTGAATATCTCGAACTCTGTGCGTCGCGGAAACTTCACCGAAGCATTTGCGGTGACCGGGGTTACTATTCTGTTGGAAGCCTTTCCGGAGTTTACTATTCCGGCGCTGGGTGCGTTTGTGATTTATTCGAAAGTACAAGAACGCAATGAAATTATCAAAACCATCGATAATTGCCTGGAACAACGCATTAAACGCTGGAAGGATTCTTATGAATGGATGATGGGCACCTGGTTATCCCGTATTATCACACAGTTTAACAACATCTCGTATCAGATGTACGATTCACTGAACTACCAAGCAGGGGCGATCAAAGCCAAGATCGACTTAGAATACAAGAAATATTCAGGTAGCGATAAAGAGAATATTAAAAGCCAGGTTGAAAACCTGAAGAACTCTCTGGATGTCAAAATTTCAGAGGCTATGAACAACATTAACAAATTTATCCGCGAATGTAGCGTCACGTATCTGTTTAAAAACATGCTCCCGAAAGTGATTGATGAGCTCAACGAGTTTGATCGCAACACAAAGGCCAAACTGATTAACCTGATTGATAGTCACAATATTATTTTAGTCGGTGAAGTTGACAAGCTGAAGGCTAAGGTCAATAACAGCTTTCAGAACACTATTCCGTTTAATATTTTCTCCTATACGAACAATAGTCTGCTGAAAGACATTATCAACGAATACTTCAACAATATTAATGACAGCAAAATTCTGAGCCTGCAGAATCGTAAGAATACGCTGGTAGATACCAGTGGATATAATGCGGAAGTCTCAGAAGAGGGTGATGTACAGCTGAACCCGATCTTTCCGTTCGACTTTAAACTGGGGTCTAGTGGTGAAGATCGCGGTAAAGTGATCGTTACCCAAAACGAGAACATTGTGTATAACAGCATGTACGAGAGTTTCTCAATTTCTTTCTGGATTCGCATCAATAAATGGGTTTCTAATTTGCCTGGCTATACCATCATTGATAGCGTCAAAAACAACTCGGGCTGGTCGATTGGCATTATTAGCAACTTTCTGGTGTTTACCCTGAAACAGAATGAGGATTCGGAACAGAGCATTAACTTCTCCTACGACATCAGCAACAATGCACCAGGGTATAACAAATGGTTCTTCGTAACGGTGACGAACAATATGATGGGCAATATGAAAATCTACATTAACGGGAAACTTATCGACACCATTAAAGTGAAAGAGCTTACTGGGATCAATTTTAGTAAAACCATTACCTTTGAGATCAACAAAATTCCGGACACGGGTCTGATTACCTCCGATTCGGATAATATCAATATGTGGATTCGCGACTTTTATATCTTCGCCAAAGAACTTGATGGCAAAGATATCAACATTTTGTTTAATTCCCTGCAGTATACCAATGTCGTTAAGGACTATTGGGGCAATGATCTCCGCTACAATAAAGAATACTACATGGTTAACATCGACTATCTCAATCGCTACATGTATGCTAACTCGCGTCAAATTGTGTTTAACACACGTCGTAACAACAACGATTTTAACGAAGGTTATAAAATCATTATCAAACGGATCCGCGGCAATACGAACGATACTCGTGTTCGTGGCGGTGACATTCTGTATTTCGACATGACGATTAATAATAAAGCGTACAATCTGTTCATGAAGAACGAAACCATGTACGCCGATAACCATTCCACTGAAGATATCTACGCAATCGGACTTCGCGAACAGACCAAAGACATTAACGACAACATCATCTTTCAGATTCAACCGATGAATAATACCTACTACTATGCCTCCCAGATCTTCAAAAGTAATTTCAACGGCGAAAACATTTCAGGCATTTGCTCAATCGGCACTTATCGGTTCCGGTTAGGTGGTGATTGGTATCGTCACAACTACCTTGTTCCCACAGTGAAACAAGGCAACTATGCATCGCTCTTAGAAAGCACATCTACGCATTGGGGTTTTGTGCCAGTCAGTGAA
SEQ ID NO:12-rBoNT/C(0)的多肽序列
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SEQ ID NO:13-rBoNT/E(0)的核苷酸序列
atgccgaaaatcaactctttcaactacaacgacccggttaacgaccgtaccatcctgtatatcaaaccgggtggttgccaggagttctacaaatctttcaacatcatgaaaaacatctggatcatcccggaacgtaacgttatcggtaccaccccgcaggacttccacccgccgacctctctgaaaaacggtgactcttcttactacgacccgaactacctccagtctgacgaagaaaaagaccgtttcctgaaaatcgttaccaaaatcttcaaccgtatcaacaacaacctgtctggtggtatcctgctggaagaactgtctaaagctaacccgtacctgggtaacgacaacaccccggacaaccagttccacatcggtgacgcttctgctgttgaaatcaaattctctaacggttctcaggacatcctgctgccgaacgttatcatcatgggtgctgaaccggacctgttcgaaaccaactcttctaacatctctctgcgtaacaactacatgccgtctaaccacggtttcggttctatcgctatcgttaccttctctccggaatactctttccgtttcaacgacaacagcatgaacgagttcatccaggacccggctctgaccctgatgcaccaactgatctactctctgcacggtctgtacggtgctaaaggtatcaccaccaaatacaccatcacccagaaacagaacccgctgatcaccaacatccgtggtaccaacatcgaagagttcctgaccttcggtggtaccgacctgaacatcatcacctctgctcagtctaacgacatctacaccaacctgctggctgactacaaaaaaatcgcttctaaactgtctaaagttcaggtttctaacccgctgctgaacccgtacaaagacgttttcgaagctaaatacggtctggacaaagacgcttctggtatctactctgttaacatcaacaaattcaacgacatcttcaaaaaactgtactctttcaccgagttcgacctggcgaccaaattccaggttaaatgccgtcagacctacatcggtcagtacaaatacttcaaactgtctaacctgctgaacgactctatctacaacatctctgaaggttacaacatcaacaacctgaaagttaacttccgtggtcagaacgctaacctgaacccgcgtatcatcaccccgatcaccggtcgtggtctggttaaaaaaatcatccgtttctgcAAGAATATTGTAAGCGTTAAAGGAATAAGAAAAAGTATCtgcatcgaaatcaacaacggtgaactgttcttcgttgcttctgaaaactcttacaacgacgacaacatcaacaccccgaaagaaatcgacgacaccgttacctctaacaacaactacgaaaacgacctggaccaggttatcctgaacttcaactctgaatctgctccgggtctgtctgacgaaaaactgaacctgaccatccagaacgacgcttacatcccgaaatacgactctaacggtacctctgacatcgaacagcacgacgttaacgaactgaacgttttcttctacctggacgctcagaaagttccggaaggtgaaaacaacgttaacctgacctcttctatcgacaccgctctgctggaacagccgaaaatctacaccttcttctcttctgagttcatcaacaacgttaacaaaccggttcaggctgctctgttcgtttcttggattcagcaggttctggttgacttcaccaccgaagctaaccagaaatctaccgttgacaaaatcgctgacatctctatcgttgttccgtacatcggtctggctctgaacatcggtaacgaagctcagaaaggtaacttcaaagacgctctggaactgctgggtgctggtatcctgctggagttcgaaccggaactgctgatcccgaccatcctggttttcaccatcaaatctttcctgggttcttctgacaacaaaaacaaagttatcaaagctatcaacaacgctctgaaagaacgtgacgaaaaatggaaagaagtttactctttcatcgtttctaactggatgaccaaaatcaacacccagttcaacaaacgtaaagaacagatgtaccaggctctccagaaccaggttaacgctatcaaaaccatcatcgaatctaaatacaactcttacaccctggaagaaaaaaacgaactgaccaacaaatacgacatcaaacagatcgaaaacgaactgaaccagaaagtttctatcgctatgaacaacatcgaccgtttcctgaccgaatcttctatctcttacctgatgaaactcatcaacgaagttaaaatcaacaaactgcgtgaatacgacgaaaacgttaaaacctacctgctgaactacatcatccagcacggttctatcctgggtgaatctcagcaggaactgaactctatggttaccgacaccctgaacaactctatcccgttcaaactgtcttcttacaccgacgacaaaatcctGATCTCTTACTTCAACAAATTCTTTAAAcgcATTAAGAGTTCATCGGTTctgaatATGCGGTACAAAAATGATAAAtatGTCGATACTTCTGGATATgatAGCAATATCAACATTAACGGCGACGTGTATAAATATccgACAAATAAAAACCAGTTTGGGATATATAACGACAAGctgTCGGAGGTCAATattTCTCAAAACGACtatATCattTACGATAATaaaTATAAAAACTTTAGCATTAGTtttTGGGTTcgtATACCTAATtatGACAATaaaattGTAAATGTGAATAACGAGTATACCATTATAAACTGTATGcgcGACAATAACAGTGGTTGGAAGGTATCGctgAACCATAATGAGATTATCTGGACCctgcagGATAATgcaGGTATAAACCAGAAACTGGCTTTTAACTATGGAAACGCAAATGGGATCTCAGATTACATTaataaaTGGatttttGTTaccATTACGAACGATcgcTTAGGCGACTCAAAACTTTATATTAATggcAATctgATAGATCAGAAATCAATCTTAAATTTGGGCAATATTCATGTCTCTgatAACATCTTGTTCAAGATCGTTAATTGCAGTTACACTcgtTATATTGGCATTCGTTACTTTAATATCTTCgataaaGAActgGACGAGACGGAAATCcagACTCTGTATTCAAACGAGCCCAATACTAATATATTGAAAGATTTTTGGGGTAACTATCTTTTATATGATAAAGAATACTATCTCCTGaatGTATTGAAGCCAAACAATTTCATAGATAGACGCAAGGATAGCACATTAAGTATCAACAATATCAGATCTACTATActgttaGCAAATCGCCTcTACTCCggtATTAAAGTGAAGATTcagCGGGTTAATAACTCCAGTACCAATGATAATCTGGTCCGTAAGAACGATCAGGTATACATCaatTTCGTCGCGAGCAAAACTcatCTCTTCCCGCTTTACGCCgatACAGCTACGACAAACAAGGAAAAAACCATAAAAATTTCCAGCTCCGGAAACAGATTCAATCAAGTAGTTGTAATGAACTCTGTGGGTaatAATTGTACGATGAACTTTaagAATAACAATGGGAACAATattGGACTTTTGGGCTTcAAAGCCGACACAGTGGTGGCGTCCACCTGGTATTACACGcacATGcggGACCATACGAATTCGAACGGTTGCTTCTGGAACTTTATCTCGGAAgaaCACGGGTGGCAAGAAAAA
SEQ ID NO:14-rBoNT/E(0)的多肽序列
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SEQ ID NO:15-rBoNT/F(0)的核苷酸序列
ATGCCGGTGGTCATCAACAGCTTCAACTACAACGACCCAGTAAACGACGACACGATCCTGTATATGCAAATCCCGTATGAAGAGAAGAGCAAGAAGTACTATAAGGCCTTTGAAATCATGCGCAATGTGTGGATTATTCCGGAGCGTAATACGATTGGTACTGACCCAAGCGACTTCGATCCACCTGCGTCTTTGGAAAACGGCTCGTCCGCATATTACGACCCGAATTACCTGACCACCGATGCGGAGAAAGATCGTTATTTGAAAACCACCATCAAGCTGTTCAAACGCATTAACAGCAATCCGGCAGGTGAGGTCCTGCTGCAAGAGATTAGCTACGCAAAGCCTTATCTGGGTAATGAGCATACGCCTATTAACGAGTTTCACCCGGTTACCCGCACTACCAGCGTTAACATCAAGTCCTCGACCAACGTGAAGTCTAGCATTATCCTGAACCTGCTGGTTCTGGGTGCCGGTCCGGACATCTTCGAAAACTCTAGCTACCCGGTGCGTAAACTGATGGATAGCGGCGGTGTTTATGACCCGAGCAATGACGGTTTTGGCAGCATCAATATCGTGACGTTTAGCCCGGAGTACGAGTACACCTTCAATGATATCAGCGGTGGTTACAATTCTTCTACCGAGAGCTTCATCGCCGACCCGGCGATCAGCCTGGCACACCAACTGATCTATGCATTGCATGGCTTGTACGGTGCCCGTGGTGTGACGTATAAAGAGACTATCAAGGTTAAGCAGGCACCTCTGATGATTGCGGAAAAGCCGATTCGCCTGGAAGAGTTCCTGACCTTCGGCGGTCAAGATTTGAACATCATTACCTCGGCCATGAAAGAGAAAATCTATAACAATTTGCTGGCCAACTATGAAAAGATTGCAACGCGCTTGTCTCGTGTTAACTCCGCTCCGCCGGAATACGACATTAATGAGTACAAAGACTACTTTCAATGGAAATATGGCCTGGACAAAAATGCGGATGGTTCTTATACCGTGAATGAAAACAAATTCAATGAAATCTACAAGAAACTGTACAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCGAACAAGTTCAAAGTCAAATGTCGTAATACCTACTTCATCAAATATGGCTTCCTGAAAGTCCCGAACCTGCTGGACGATGACATCTATACCGTCAGCGAAGGCTTCAACATCGGCAATCTGGCCGTGAATAATCGTGGTCAGAACATCAAACTGAATCCGAAAATCATTGACTCCATCCCAGACAAGGGCCTGGTTGAGAAAATCGTGAAGTTCTGCAAAAGCGTTATTCCGCGTAAAGGTACGAAAGCACCGCCTCGCCTGTGCATTCGCGTTAACAACCGTGAGTTGTTCTTTGTGGCATCTGAAAGCAGCTACAACGAGAACGACATCAACACCCCTAAAGAAATTGATGATACCACGAACCTGAATAACAATTATCGCAACAATCTGGACGAGGTGATCCTGGATTACAATTCGGAAACCATTCCGCAAATTAGCAATCAGACGCTGAACACCCTGGTTCAGGACGATAGCTACGTTCCGCGTTACGACTCCAATGGTACTAGCGAGATTGAAGAACACAACGTAGTGGACTTGAACGTTTTCTTTTATCTGCACGCCCAGAAGGTTCCGGAGGGCGAAACCAATATTAGCCTGACCAGCTCGATCGACACCGCGCTGTCTGAGGAGAGCCAAGTCTACACCTTTTTCAGCAGCGAGTTTATCAACACTATTAACAAGCCAGTTCATGCTGCATTGTTTATCTCTTGGATTAACCAGGTGATTCGCGACTTTACGACGGAGGCGACCCAGAAGTCTACCTTCGACAAAATTGCAGACATCTCCCTGGTCGTCCCATACGTCGGCCTGGCGTTGAATATTGGCAATGAAGTTCAAAAAGAGAACTTCAAAGAAGCGTTCGAGCTGCTGGGTGCAGGCATCCTGCTGGAGTTCGTGCCGGAACTGTTGATCCCGACCATCCTGGTGTTCACCATTAAGAGCTTCATTGGATCCTCCGAGAATAAGAACAAGATCATCAAGGCGATCAATAACAGCCTGATGGAGCGTGAAACGAAGTGGAAAGAAATCTATAGCTGGATTGTTAGCAATTGGCTGACTCGTATTAACACGCAATTCAACAAGCGTAAAGAGCAAATGTACCAAGCCCTGCAAAACCAAGTTGACGCCATCAAAACGGTAATTGAATACAAGTACAACAATTACACGAGCGATGAGCGCAACCGCCTGGAAAGCGAATACAACATCAACAACATTCGCGAAGAATTGAACAAGAAAGTGAGCCTGGCGATGGAGAACATTGAGCGTTTTATCACCGAAAGCAGCATCTTTTACCTGATGAAATTGATTAATGAGGCGAAAGTCTCGAAACTGCGTGAGTACGACGAAGGTGTGAAAGAGTATCTGCTGGATTACATTAGCGAGCACCGTAGCATCTTGGGTAACTCGGTTCAGGAGCTGAACGATCTGGTGACCTCTACCCTGAACAATAGCATCCCGTTCGAACTGAGCAGCTATACCAATGACAAGATTCTGATTCTGTATTTCAATAAACTGTATAAGAAGATCAAGGATAACAGCATTCTGGATATGCGTTACGAAAACAATAAGTTTATCGACATTTCTGGTTACGGCAGCAACATTTCCATCAATGGCGATGTCTACATCTACAGCACCAATCGCAACCAGTTCGGCATCTACTCTAGCAAACCGAGCGAAGTTAACATCGCACAGAACAATGATATTATTTATAACGGTCGTTATCAAAACTTCTCTATCAGCTTTTGGGTCCGTATCCCGAAGTACTTCAATAAAGTCAATCTGAATAATGAATACACGATCATCGACTGCATTCGCAATAACAACAGCGGTTGGAAAATCAGCCTGAATTACAACAAAATTATTTGGACCCTGCAAGATACGGCGGGTAACAATCAGAAACTGGTGTTTAACTACACGCAAATGATCAGCATTTCTGACTATATCAACAAGTGGATCTTTGTTACCATCACCAATAATCGTCTGGGCAATAGCCGTATTTACATCAACGGTAACCTGATTGATGAGAAAAGCATCAGCAACCTGGGCGATATTCACGTCAGCGACAACATTCTGTTCAAAATTGTTGGTTGTAACGATACCCGTTACGTCGGCATCCGTTATTTCAAGGTTTTCGATACGGAGCTGGGTAAAACGGAAATCGAAACGTTGTACTCCGATGAACCAGATCCGAGCATTCTGAAGGACTTTTGGGGTAACTACTTGCTGTACAATAAACGTTACTATCTGCTGAATCTGTTGCGCACCGACAAGAGCATTACCCAAAACAGCAATTTCCTGAACATTAATCAGCAACGCGGCGTATACCAAAAACCGAACATCTTCAGCAATACGCGCCTGTATACTGGTGTTGAAGTGATCATTCGTAAGAACGGTAGCACCGACATTAGCAACACGGACAATTTCGTCCGTAAGAATGACCTGGCGTACATTAACGTCGTGGACCGTGATGTCGAGTATCGTCTGTACGCAGACATCAGCATTGCGAAACCGGAAAAGATTATCAAGCTGATCCGTACCAGCAACAGCAACAACAGCCTGGGTCAGATCATTGTGATGGACAGCATTGGTAATAACTGCACGATGAACTTCCAGAACAACAATGGTGGTAATATCGGTCTGCTGGGTTTTCACAGCAATAATCTGGTTGCTTCCAGCTGGTACTACAATAACATTCGTAAAAACACGTCTAGCAATGGTTGTTTTTGGAGCTTTATCAGCAAAGAGCACGGCTGGCAAGAAAAT
SEQ ID NO:16-rBoNT/F(0)的多肽序列
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SEQ ID NO:17-rBoNT/A(0)的核苷酸序列(His-标签)
ATGCCGTTTGTGAACAAGCAGTTCAACTATAAAGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAAAGCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACACCAGCTGATTTATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCCATTAATCCGAATCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCCTATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGAGTTTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCAGCAAAACCAAAAGTCTGGATAAAGGCTACAATAAAGCCCTGAATGATCTGTGCATTAAGGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAGGATAATTTCACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTCGATAATGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCACTGACCAATAGCGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTTAACAAAGCAACCGAAGCAGCCATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTTTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATTACCATCATCATCCCGTATATCGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTGAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATCGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTGTACAAGTATATCGTGACCAATTGGCTGGCAAAAGTTAACACCCAGATTGACCTGATTCGCAAGAAGATGAAAGAAGCACTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAATAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCAGCAAACTGAACGAAAGCATCAACAAAGCCATGATTAACATTAACAAATTTCTGAACCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGTCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCCCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGTCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTGAACAACACCCTGAGTACCGATATTCCTTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGTCTGCTGTCAACCTTTACCGAATACATTAAGAACATCATCAACACCAGCATTCTGAACCTGCGTTATGAAAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCCAGCAAAATCAATATAGGCAGCAAGGTTAACTTCGACCCGATTGACAAAAATCAGATACAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATTGAGGTGATCCTGAAAAACGCCATTGTGTATAATAGCATGTACGAGAATTTCTCGACCAGCTTTTGGATTCGTATCCCGAAATACTTTAATAGCATCAGCCTGAACAACGAGTACACCATTATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGCTGGAAAGTTAGCCTGAATTATGGCGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCCAAGAAATCAAACAGCGTGTGGTTTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAATAATCGCCTGAATAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGTCTGATTGACCAGAAACCGATTAGTAATCTGGGTAATATTCATGCGAGCAACAACATCATGTTTAAACTGGATGGTTGTCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAGTACTTCAACCTGTTCGATAAAGAGTTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTATGATAACCAGAGCAACAGCGGTATTCTGAAGGATTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAATCTGTACGACCCGAATAAATACGTGGATGTGAATAATGTTGGCATCCGTGGTTATATGTACCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTATGACCACAAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGAACCAAATTCATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGTGCCCTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTGATGAAAAGCAAAAATGATCAGGGCATCACCAACAAGTGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAATATTGCGAAACTGGTTGCAAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGGAAAACCTGTATTTTCAAGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA
SEQ ID NO:18-rBoNT/A(0)的多肽序列(His-标签)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLENLYFQGASHHHHHHHH
SEQ ID NO:19-rLHN/A的核苷酸序列(His-标签)
ATGCCGTTTGTGAACAAGCAGTTCAACTATAAAGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCAGCAAAACCAAAAGTCTGGATAAAGGCTACAATAAAGCCCTGAATGATCTGTGCATTAAGGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAGGATAATTTCACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTCGATAATGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCACTGACCAATAGCGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTTAACAAAGCAACCGAAGCAGCCATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTTTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATTACCATCATCATCCCGTATATCGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTGAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATCGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTGTACAAGTATATCGTGACCAATTGGCTGGCAAAAGTTAACACCCAGATTGACCTGATTCGCAAGAAGATGAAAGAAGCACTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAATAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCAGCAAACTGAACGAAAGCATCAACAAAGCCATGATTAACATTAACAAATTTCTGAACCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGTCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCCCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGTCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTGAACAACACCCTGAGTACCGATATTCCTTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGTCTGCTGTCAACCGAAAATCTGTATTTCCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA
SEQ ID NO:20-rLHN/A的多肽序列(His-标签)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTENLYFQGASHHHHHHHH
SEQ ID NO:21-rHC/A的核苷酸序列(His-标签)ATGCATCATCACCATCACCACGAAAATCTATACTTCCAAGGAAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTGTAA
SEQ ID NO:22-rHC/A的多肽序列(His-标签)
MHHHHHHENLYFQGKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO:23-rLC/A的核苷酸序列(His-标签)
ATGCCGTTTGTGAACAAGCAGTTCAACTATAAAGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTTGAAGAGAATCTGTATTTCCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA
SEQ ID NO:24-rLC/A的多肽序列(His-标签)
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SEQ ID NO:25-rBoNT/FA(0)的核苷酸序列(His-标签)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATGATGATCCGGTGAACGATAACACCATCATTTATATCCGTCCGCCTTATTATGAAACCAGCAACACCTATTTCAAAGCCTTCCAGATTATGGATAACGTGTGGATTATTCCGGAACGTTATCGTCTGGGTATTGATCCGAGCCTGTTTAATCCGCCTGTTAGCCTGAAAGCAGGTAGTGATGGTTATTTTGATCCGAATTATCTGAGCACCAACACCGAGAAAAACAAATACCTGCAGATTATGATCAAGCTGTTCAAACGCATTAATAGCAAACCGGCAGGTCAGATTCTGCTGGAAGAAATCAAAAATGCAATTCCGTATCTGGGCAACAGCTATACCCAAGAAGAACAGTTTACCACCAATAATCGTACCGTGAGCTTTAATGTTAAACTGGCCAATGGTAATATCGTTCAGCAGATGGCAAATCTGATTATTTGGGGTCCGGGTCCTGATCTGACCACAAATAAAACCGGTGGTATCATCTATAGCCCGTATCAGAGCATGGAAGCAACCCCGTATAAAGATGGTTTTGGTAGCATTATGACCGTGGAATTTAGTCCGGAATATGCAACCGCCTTTAACGATATTTCAATTGCAAGCCATAGTCCGTCGCTGTTTATCAAAGATCCGGCACTGATTCTGATGCACCAGCTGATTTATGTTCTGCATGGTCTGTATGGCACCTATATCACCGAATACAAAATTACCCCGAATGTGGTTCAGAGCTATATGAAAGTTACCAAACCGATTACCAGCGCAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCGTGATCGCAATATTGTTCCGCAGAGCATTCAGAGCCAGCTGTATAACAAAGTTCTGAGCGATTATAAACGTATTGCCAGCCGTCTGAATAAAGTTAATACCGCAACCGCACTGATCAACATCGATGAATTCAAAAACCTGTACGAGTGGAAATACCAGTTTGCCAAAGATAGCAATGGTGTGTATAGCGTGGATCTGAACAAATTTGAGCAGCTGTACAAAAAAATCTATAGCTTCACCGAATTCAACCTGGCCTATGAGTTTAAAATCAAAACCCGTCTGGGTTATCTGGCCGAAAATTTTGGTCCGTTTTATCTGCCGAATCTGCTGGATGATAGCATTTATACCGAAGTGGATGGTTTTAACATTGGTGCACTGAGCATTAACTATCAGGGTCAGAATATTGGCAGCGATATCAACAGCATCAAAAAACTGCAAGGTCAGGGTGTTGTTAGCCGTGTTGTTCGTCTGTGTAGCAATAGCAATACCAAAAACAGCCTGTGCATTACCGTTAATAATCGCGACCTGTTTTTTATCGCAAGCCAAGAAAGCTATGGCGAGAATACCATTAACACCTATAAAGAGATTGACGATACCACCACACTGGATCCGAGCTTTGAAGATATTCTGGATAAAGTGATCCTGAACTTCAACGAACAGGTTATTCCGCAGATGCCGAATCGTAATGTTAGCACCGATATTCAGAAAGACAACTACATCCCGAAATACGATTATAACCGCACCGACATTATCGATAGCTATGAAGTTGGTCGCAACTACAACACCTTTTTCTATCTGAATGCCCAGAAATTTAGCCCGAACGAAAGCAATATTACCCTGACCAGCAGCTTTGATACAGGTCTGTTAGAAGGTAGCAAAGTGTATACCTTTTTCAGCAGCGATTTCATTAACAACATCAACAAACCGGTTCAGGCCCTGCTGTTTATTGAATGGGTTAAACAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCAAAACCTCAACCGTTGATAAACTGAAAGATATTAGCCTGGTGGTGCCGTATATTGGTCTGGCACTGAATATTGGTGATGAGATCTACAAACAGCATTTTGCAGAAGCAGTTGAACTGGTTGGTGCAGGTCTGCTGCTGGAATTTTCACCGGAATTTCTTATTCCGACGCTGCTGATTTTTACCATCAAAGGTTATCTGACCGGTAGCATTCGCGATAAAGACAAAATCATTAAAACCCTGGATAACGCCCTGAATGTTCGTGATCAGAAATGGAAAGAACTGTATCGTTGGGTTGTTAGCAAATGGCTGACCACCATTAATACGCAGTTCAACAAACGCAAAGAACAAATGTACAAAGCCCTGAAAAATCAGGCCACCGCCATTAAAAAGATCATCGAGAACAAATATAACAACTATACCACCGATGAAAAAAGCAAGATCGATAGCAGCTATAACATCAACGAAATTGAACGCACCCTGAACGAAAAAATCAATCTGGCCATGAAAAACATCGAGCAGTTTATTACCGAAAGCAGCATTGCCTATCTGATCAATATCATCAACAACGAAACGATCCAGAAACTGAAAAGCTATGATGACCTGGTTCGTCGTTATCTGCTGGGTTATATTCGTAATCATAGCAGCATTCTGGGCAATAGCGTTGAAGAACTGAATTCCAAAGTGAACAACCATCTGGATAATGGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGTTATACCAATGATAGCCTGCTGATCCGCTACTTCAATAAAAACTATGGCGAACTGAAGTACAACTGCATTCTGAACATCAAATATGAGATGGATCGTGACAAACTGGTTGATAGCAGCGGTTATCGTAGCCGTATCAATATTGGTACAGGCGTCAAATTTAGCGAGATCGATAAAAATCAAGTGCAGCTGAGCAATCTGGAATCCAGCAAAATTGAAGTCATTCTGAATAACGGCGTCATCTATAACAGCATGTATGAAAACTTTTCGACCAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTCGCAACATCAATAACGAGTACAAGATCATCAGCTGTATGCAGAATAATAGCGGTTGGGAAGTGAGCCTGAATTTTAGCAATATGAACTCGAAAATCATCTGGACCCTGCAGGATACCGAAGGTATCAAAAAAACCGTTGTGTTTCAGTACACCCAGAACATTAACATTAGCGACTATATCAACCGCTGGATCTTTGTGACCATTACAAATAATCGTCTGAGCAACAGCAAAATCTACATTAATGGTCGCCTGATCAACGAAGAAAGCATTAGCGATCTGGGTAATATCCATGCCAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGTTGCCGTGATCCGCATCGTTATATCTGGATTAAATACTTTAACCTGTTTGACAAAGAGCTGAACAAGAAAGAAATTAAAGATCTGTACGACAACCAGAGCAATAGCGGTATTCTGAAAGATTTCTGGGGTGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAATCTGTATGACCCGAATAAGTATCTGGATGTGAATAATGTTGGCATCCGTGGCTATATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGTCGTATTGTGACCACCAACATTTATCTGAATAGCACCCTGTATATGGGCACCAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTATATTAACGTGGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGCGCAGTTGAAATCCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTGATGAAAAGCGAAAATGATCAGGGCATTCGCAACAAGTGTAAAATGAATCTGCAAGACAATAACGGCAACGATATTGGCTTTATCGGCTTTCACCAGTTTAATAACATTGCAAAACTGGTGGCCAGCAACTGGTATAACCGTCAGATTGGTAAAGCAAGCCGTACCTTTGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCGGTTGATGATGGTTGGGGTGAAAGCAGCCTGGAAAATCTGTATTTCCAGGGTGCCAGTCATCATCACCACCATCACCATCACTGA
SEQ ID NO:26-rBoNT/FA(0)的多肽序列(His-标签)
MPVVINSFNYDDPVNDNTIIYIRPPYYETSNTYFKAFQIMDNVWIIPERYRLGIDPSLFNPPVSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNKYLQIMIKLFKRINSKPAGQILLEEIKNAIPYLGNSYTQEEQFTTNNRTVSFNVKLANGNIVQQMANLIIWGPGPDLTTNKTGGIIYSPYQSMEATPYKDGFGSIMTVEFSPEYATAFNDISIASHSPSLFIKDPALILMHQLIYVLHGLYGTYITEYKITPNVVQSYMKVTKPITSAEFLTFGGRDRNIVPQSIQSQLYNKVLSDYKRIASRLNKVNTATALINIDEFKNLYEWKYQFAKDSNGVYSVDLNKFEQLYKKIYSFTEFNLAYEFKIKTRLGYLAENFGPFYLPNLLDDSIYTEVDGFNIGALSINYQGQNIGSDINSIKKLQGQGVVSRVVRLCSNSNTKNSLCITVNNRDLFFIASQESYGENTINTYKEIDDTTTLDPSFEDILDKVILNFNEQVIPQMPNRNVSTDIQKDNYIPKYDYNRTDIIDSYEVGRNYNTFFYLNAQKFSPNESNITLTSSFDTGLLEGSKVYTFFSSDFINNINKPVQALLFIEWVKQVIRDFTTEATKTSTVDKLKDISLVVPYIGLALNIGDEIYKQHFAEAVELVGAGLLLEFSPEFLIPTLLIFTIKGYLTGSIRDKDKIIKTLDNALNVRDQKWKELYRWVVSKWLTTINTQFNKRKEQMYKALKNQATAIKKIIENKYNNYTTDEKSKIDSSYNINEIERTLNEKINLAMKNIEQFITESSIAYLINIINNETIQKLKSYDDLVRRYLLGYIRNHSSILGNSVEELNSKVNNHLDNGIPFELSSYTNDSLLIRYFNKNYGELKYNCILNIKYEMDRDKLVDSSGYRSRINIGTGVKFSEIDKNQVQLSNLESSKIEVILNNGVIYNSMYENFSTSFWIRIPKYFRNINNEYKIISCMQNNSGWEVSLNFSNMNSKIIWTLQDTEGIKKTVVFQYTQNINISDYINRWIFVTITNNRLSNSKIYINGRLINEESISDLGNIHASNNIMFKLDGCRDPHRYIWIKYFNLFDKELNKKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYLDVNNVGIRGYMYLKGPRGRIVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSAVEIPDVGNLSQVVVMKSENDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSLENLYFQGASHHHHHHHH
SEQ ID NO:27-rLHN/FA的核苷酸序列(His-标签)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATGATGATCCGGTGAACGATAACACCATCATTTATATCCGTCCGCCTTATTATGAAACCAGCAACACCTATTTCAAAGCCTTCCAGATTATGGATAACGTGTGGATTATTCCGGAACGTTATCGTCTGGGTATTGATCCGAGCCTGTTTAATCCGCCTGTTAGCCTGAAAGCAGGTAGTGATGGTTATTTTGATCCGAATTATCTGAGCACCAACACCGAGAAAAACAAATACCTGCAGATTATGATCAAGCTGTTCAAACGCATTAATAGCAAACCGGCAGGTCAGATTCTGCTGGAAGAAATCAAAAATGCAATTCCGTATCTGGGCAACAGCTATACCCAAGAAGAACAGTTTACCACCAATAATCGTACCGTGAGCTTTAATGTTAAACTGGCCAATGGTAATATCGTTCAGCAGATGGCAAATCTGATTATTTGGGGTCCGGGTCCTGATCTGACCACAAATAAAACCGGTGGTATCATCTATAGCCCGTATCAGAGCATGGAAGCAACCCCGTATAAAGATGGTTTTGGTAGCATTATGACCGTGGAATTTAGTCCGGAATATGCAACCGCCTTTAACGATATTTCAATTGCAAGCCATAGTCCGTCGCTGTTTATCAAAGATCCGGCACTGATTCTGATGCATGAACTGATTCATGTTCTGCATGGTCTGTATGGCACCTATATTACCGAATACAAAATTACCCCGAATGTGGTGCAGAGCTATATGAAAGTTACCAAACCGATTACCAGCGCAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCGTGATCGCAATATTGTTCCGCAGAGCATTCAGAGCCAGCTGTATAACAAAGTTCTGAGCGATTATAAACGTATTGCCAGCCGTCTGAATAAAGTTAATACCGCAACCGCACTGATCAACATCGATGAATTCAAAAACCTGTACGAGTGGAAATACCAGTTTGCCAAAGATAGCAATGGTGTGTATAGCGTGGATCTGAACAAATTTGAGCAGCTGTACAAAAAAATCTATAGCTTCACCGAATTCAACCTGGCCTATGAGTTTAAAATCAAAACCCGTCTGGGTTATCTGGCCGAAAATTTTGGTCCGTTTTATCTGCCGAATCTGCTGGATGATAGCATTTATACCGAAGTGGATGGTTTTAACATTGGTGCACTGAGCATTAACTATCAGGGTCAGAATATTGGCAGCGATATCAACAGCATCAAAAAACTGCAAGGTCAGGGTGTTGTTAGCCGTGTTGTTCGTCTGTGTAGCAATAGCAATACCAAAAACAGCCTGTGCATTACCGTTAATAATCGCGACCTGTTTTTTATCGCAAGCCAAGAAAGCTATGGCGAGAATACCATTAACACCTATAAAGAGATTGACGATACCACCACACTGGATCCGAGCTTTGAAGATATTCTGGATAAAGTGATCCTGAACTTCAACGAACAGGTTATTCCGCAGATGCCGAATCGTAATGTTAGCACCGATATTCAGAAAGACAACTACATCCCGAAATACGATTATAACCGCACCGACATTATCGATAGCTATGAAGTTGGTCGCAACTACAACACCTTTTTCTATCTGAATGCCCAGAAATTTAGCCCGAACGAAAGCAATATTACCCTGACCAGCAGCTTTGATACAGGTCTGTTAGAAGGTAGCAAAGTGTATACCTTTTTCAGCAGCGATTTCATTAACAACATCAACAAACCGGTTCAGGCCCTGCTGTTTATTGAATGGGTTAAACAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCAAAACCTCAACCGTTGATAAACTGAAAGATATTAGCCTGGTGGTGCCGTATATTGGTCTGGCACTGAATATTGGTGATGAGATCTACAAACAGCATTTTGCAGAAGCAGTTGAACTGGTTGGTGCAGGTCTGCTGCTGGAATTTTCACCGGAATTTCTTATTCCGACGCTGCTGATTTTTACCATCAAAGGTTATCTGACCGGTAGCATTCGCGATAAAGACAAAATCATTAAAACCCTGGATAACGCCCTGAATGTTCGTGATCAGAAATGGAAAGAACTGTATCGTTGGGTTGTTAGCAAATGGCTGACCACCATTAATACGCAGTTCAACAAACGCAAAGAACAAATGTACAAAGCCCTGAAAAATCAGGCCACCGCCATTAAAAAGATCATCGAGAACAAATATAACAACTATACCACCGATGAAAAAAGCAAGATCGATAGCAGCTATAACATCAACGAAATTGAACGCACCCTGAACGAAAAAATCAATCTGGCCATGAAAAACATCGAGCAGTTTATTACAGAAAGCAGCATTGCCTACCTGATCAATATCATCAACAACGAAACCATTCAGAAACTGAAAAGCTATGATGACCTGGTTCGTCGTTATCTGCTGGGTTATATTCGTAATCATAGCAGCATTCTGGGCAATAGCGTTGAAGAACTGAATTCCAAAGTGAACAACCATCTGGATAATGGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGTTATACCAATGATAGCCTGCTGATCCGCTACTTCAATAAAAACTATGGCGAAGAGAACCTGTATTTCCAGGGTGCCAGTCATCATCACCACCATCACCATCACTGA
SEQ ID NO:28-rLHN/FA的多肽序列(His-标签)
MPVVINSFNYDDPVNDNTIIYIRPPYYETSNTYFKAFQIMDNVWIIPERYRLGIDPSLFNPPVSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNKYLQIMIKLFKRINSKPAGQILLEEIKNAIPYLGNSYTQEEQFTTNNRTVSFNVKLANGNIVQQMANLIIWGPGPDLTTNKTGGIIYSPYQSMEATPYKDGFGSIMTVEFSPEYATAFNDISIASHSPSLFIKDPALILMHELIHVLHGLYGTYITEYKITPNVVQSYMKVTKPITSAEFLTFGGRDRNIVPQSIQSQLYNKVLSDYKRIASRLNKVNTATALINIDEFKNLYEWKYQFAKDSNGVYSVDLNKFEQLYKKIYSFTEFNLAYEFKIKTRLGYLAENFGPFYLPNLLDDSIYTEVDGFNIGALSINYQGQNIGSDINSIKKLQGQGVVSRVVRLCSNSNTKNSLCITVNNRDLFFIASQESYGENTINTYKEIDDTTTLDPSFEDILDKVILNFNEQVIPQMPNRNVSTDIQKDNYIPKYDYNRTDIIDSYEVGRNYNTFFYLNAQKFSPNESNITLTSSFDTGLLEGSKVYTFFSSDFINNINKPVQALLFIEWVKQVIRDFTTEATKTSTVDKLKDISLVVPYIGLALNIGDEIYKQHFAEAVELVGAGLLLEFSPEFLIPTLLIFTIKGYLTGSIRDKDKIIKTLDNALNVRDQKWKELYRWVVSKWLTTINTQFNKRKEQMYKALKNQATAIKKIIENKYNNYTTDEKSKIDSSYNINEIERTLNEKINLAMKNIEQFITESSIAYLINIINNETIQKLKSYDDLVRRYLLGYIRNHSSILGNSVEELNSKVNNHLDNGIPFELSSYTNDSLLIRYFNKNYGEENLYFQGASHHHHHHHH
SEQ ID NO:29-rHC/FA的核苷酸序列(His-标签)
ATGCTGAAGTATAACTGCATCCTGAACATCAAATATGAGATGGATCGTGATAAACTGGTTGATAGCAGCGGTTATCGTAGCCGTATCAATATTGGCACCGGTGTGAAATTTAGCGAGATCGATAAAAATCAGGTGCAGCTGAGCAATCTGGAAAGCAGCAAAATTGAAGTGATTCTGAATAACGGCGTGATCTACAATAGCATGTATGAAAACTTTTCGACCAGCTTCTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTCGCAACATCAACAACGAGTACAAGATTATCAGCTGTATGCAGAATAATAGCGGTTGGGAAGTTAGCCTGAATTTCAGCAATATGAACAGCAAAATCATTTGGACCCTGCAGGATACCGAAGGTATCAAAAAAACCGTTGTGTTTCAGTACACCCAGAACATTAACATCAGCGATTACATTAACCGCTGGATCTTTGTGACCATTACCAATAATCGTCTGAGCAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGCCTGATTAACGAAGAGAGCATTAGCGATCTGGGTAATATTCATGCCAGCAACAACATCATGTTTAAACTGGATGGTTGTCGTGATCCGCATCGTTATATTTGGATCAAATACTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAACAAAAAAGAAATCAAAGACCTGTATGATAACCAGAGCAATAGCGGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGTGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTACATGCTGAATCTGTACGATCCGAACAAATATCTGGATGTGAATAATGTGGGTATCCGTGGCTATATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGTCGTATTGTTACCACCAACATTTATCTGAATAGCACCCTGTATATGGGCACCAAATTCATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTATATCAATGTGGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGTCTGGCCACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGCGCAGTTGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTTATGAAAAGCGAAAATGATCAGGGCATTCGCAACAAATGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAACATTGCAAAACTGGTGGCGAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGGTAAAGCAAGCCGTACCTTTGGTTGTAGCTGGGAATTTATTCCGGTTGATGATGGTTGGGGTGAAAGCAGCCTGGAAAATCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCACCATCACCATCATTAA
SEQ ID NO:30-rHC/FA的多肽序列(His-标签)
MLKYNCILNIKYEMDRDKLVDSSGYRSRINIGTGVKFSEIDKNQVQLSNLESSKIEVILNNGVIYNSMYENFSTSFWIRIPKYFRNINNEYKIISCMQNNSGWEVSLNFSNMNSKIIWTLQDTEGIKKTVVFQYTQNINISDYINRWIFVTITNNRLSNSKIYINGRLINEESISDLGNIHASNNIMFKLDGCRDPHRYIWIKYFNLFDKELNKKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYLDVNNVGIRGYMYLKGPRGRIVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSAVEIPDVGNLSQVVVMKSENDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSLENLYFQGASHHHHHHHH
SEQ ID NO:31-rLC/FA的核苷酸序列(His-标签)ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATGATGATCCGGTGAACGATAACACCATCATTTATATCCGTCCGCCTTATTATGAAACCAGCAACACCTATTTCAAAGCCTTCCAGATTATGGATAACGTGTGGATTATTCCGGAACGTTATCGTCTGGGTATTGATCCGAGCCTGTTTAATCCGCCTGTTAGCCTGAAAGCAGGTAGTGATGGTTATTTTGATCCGAATTATCTGAGCACCAACACCGAGAAAAACAAATACCTGCAGATTATGATCAAGCTGTTCAAACGCATTAATAGCAAACCGGCAGGTCAGATTCTGCTGGAAGAAATCAAAAATGCAATTCCGTATCTGGGCAACAGCTATACCCAAGAAGAACAGTTTACCACCAATAATCGTACCGTGAGCTTTAATGTTAAACTGGCCAATGGTAATATCGTTCAGCAGATGGCAAATCTGATTATTTGGGGTCCGGGTCCTGATCTGACCACAAATAAAACCGGTGGTATCATCTATAGCCCGTATCAGAGCATGGAAGCAACCCCGTATAAAGATGGTTTTGGTAGCATTATGACCGTGGAATTTAGTCCGGAATATGCAACCGCCTTTAACGATATTTCAATTGCAAGCCATAGTCCGTCGCTGTTTATCAAAGATCCGGCACTGATTCTGATGCATGAACTGATTCATGTTCTGCATGGTCTGTATGGCACCTATATTACCGAATACAAAATTACCCCGAATGTGGTGCAGAGCTATATGAAAGTTACCAAACCGATTACCAGCGCAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCGTGATCGCAATATTGTTCCGCAGAGCATTCAGAGCCAGCTGTATAACAAAGTTCTGAGCGATTATAAACGTATTGCCAGCCGTCTGAATAAAGTTAATACCGCAACCGCACTGATCAACATCGATGAATTCAAAAACCTGTACGAGTGGAAATACCAGTTTGCCAAAGATAGCAATGGTGTGTATAGCGTGGATCTGAACAAATTTGAGCAGCTGTACAAAAAAATCTATAGCTTCACCGAATTCAACCTGGCCTATGAGTTTAAAATCAAAACCCGTCTGGGTTATCTGGCCGAAAATTTTGGTCCGTTTTATCTGCCGAATCTGCTGGATGATAGCATTTATACCGAAGTGGATGGTTTTAACATTGGTGCACTGAGCATTAACTATCAGGGTCAGAATATTGGCAGCGATATCAACAGCATCAAAAAACTGCAAGGTCAGGGTGTTGTTAGCCGTGTTGTTCGTCTGTGTAGCAATAGCGAAAATCTGTATTTTCAGGGTGCCAGTCATCATCACCACCATCACCATCACTGA
SEQ ID NO:32-rLC/FA的多肽序列(His-标签)
MPVVINSFNYDDPVNDNTIIYIRPPYYETSNTYFKAFQIMDNVWIIPERYRLGIDPSLFNPPVSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNKYLQIMIKLFKRINSKPAGQILLEEIKNAIPYLGNSYTQEEQFTTNNRTVSFNVKLANGNIVQQMANLIIWGPGPDLTTNKTGGIIYSPYQSMEATPYKDGFGSIMTVEFSPEYATAFNDISIASHSPSLFIKDPALILMHELIHVLHGLYGTYITEYKITPNVVQSYMKVTKPITSAEFLTFGGRDRNIVPQSIQSQLYNKVLSDYKRIASRLNKVNTATALINIDEFKNLYEWKYQFAKDSNGVYSVDLNKFEQLYKKIYSFTEFNLAYEFKIKTRLGYLAENFGPFYLPNLLDDSIYTEVDGFNIGALSINYQGQNIGSDINSIKKLQGQGVVSRVVRLCSNSENLYFQGASHHHHHHHH
SEQ ID NO:33-rBoNT/F(0)的核苷酸序列(His-标签)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATAACGATCCGGTGAACGATGATACCATCCTGTATATGCAGATTCCGTATGAAGAGAAAAGCAAAAAGTACTACAAAGCCTTTGAGATCATGCGCAACGTTTGGATTATTCCGGAACGTAATACCATTGGCACCGATCCGAGCGATTTTGATCCGCCTGCAAGCCTGGAAAATGGTAGCAGCGCATATTATGATCCGAATTATCTGACCACCGATGCCGAAAAAGATCGTTATCTGAAAACCACCATCAAACTGTTCAAACGCATTAATAGCAATCCGGCAGGCGAAGTTCTGCTGCAAGAAATTAGCTATGCAAAACCGTATCTGGGCAATGAACATACCCCGATTAATGAATTTCATCCGGTTACACGTACCACGAGCGTTAACATTAAAAGCAGCACCAATGTGAAGTCCAGCATTATTCTGAATCTGCTGGTTTTAGGTGCAGGTCCGGATATTTTTGAAAATTCAAGCTATCCGGTGCGCAAACTGATGGATAGCGGTGGTGTGTATGATCCGTCAAATGATGGTTTTGGCAGCATTAACATTGTGACCTTTAGTCCGGAATATGAATACACCTTCAACGATATTAGCGGTGGCTATAATAGCAGCACCGAAAGTTTTATTGCAGATCCGGCAATTAGCCTGGCACACCAGCTGATTTATGCACTGCATGGTCTGTATGGTGCACGTGGTGTTACCTATAAAGAAACCATTAAAGTTAAACAGGCACCGCTGATGATTGCGGAAAAACCGATTCGTCTGGAAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCAGGATCTGAACATTATTACCAGCGCAATGAAAGAGAAAATCTATAATAACCTGCTGGCCAACTATGAGAAAATTGCAACCCGTCTGAGCCGTGTTAATAGCGCACCTCCTGAATATGATATCAACGAGTATAAAGACTATTTTCAGTGGAAATACGGCCTGGATAAAAATGCAGATGGTAGCTATACCGTGAACGAGAACAAATTTAACGAGATCTACAAAAAACTGTATAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCCAACAAATTCAAAGTGAAATGCCGCAACACCTACTTCATCAAATATGGCTTTCTGAAAGTTCCGAACCTGCTTGATGATGATATCTATACCGTTAGCGAAGGCTTTAACATTGGTAATCTGGCCGTTAATAATCGCGGTCAGAACATTAAACTGAACCCGAAAATTATCGATAGCATCCCGGATAAAGGCCTGGTTGAAAAAATTGTGAAATTCTGCAAAAGCGTGATTCCGCGTAAAGGCACCAAAGCACCGCCTCGTCTGTGTATTCGTGTGAATAATCGTGAACTGTTTTTTGTTGCAAGCGAGAGCAGCTATAACGAGAATGATATTAACACCCCGAAAGAGATTGACGATACCACCAATCTGAATAACAACTATCGCAACAATCTGGATGAAGTGATCCTGGATTATAACAGCGAAACCATTCCGCAGATTAGCAATCAGACCCTGAATACCCTGGTTCAGGATGATAGCTATGTTCCGCGTTATGATAGCAATGGCACCAGCGAAATTGAAGAACATAATGTGGTTGATCTGAACGTGTTCTTTTATCTGCATGCACAGAAAGTGCCGGAAGGTGAAACCAATATTAGCCTGACCAGCAGCATTGATACCGCACTGAGCGAAGAAAGCCAGGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGAATTCATCAACACCATTAACAAACCGGTTCATGCAGCACTGTTTATTAGCTGGATTAATCAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCCAGAAAAGCACCTTTGATAAAATTGCCGATATTAGTCTGGTGGTGCCGTATGTTGGTCTGGCACTGAATATTGGTAATGAAGTGCAGAAAGAGAACTTTAAAGAAGCCTTCGAACTGTTAGGTGCCGGTATTCTGCTGGAATTTGTGCCGGAACTGCTGATTCCGACCATTCTGGTTTTTACCATTAAGAGCTTTATTGGCAGCAGCGAGAACAAGAACAAAATCATTAAAGCCATCAACAACAGCCTGATGGAACGCGAAACCAAATGGAAAGAAATTTACAGCTGGATTGTGAGCAATTGGCTGACCCGTATCAATACCCAGTTTAACAAACGCAAAGAACAAATGTATCAGGCCCTGCAGAATCAGGTTGATGCAATTAAAACCGTGATCGAATACAAATACAACAACTATACCAGCGACGAACGTAATCGCCTGGAAAGCGAATACAACATTAATAACATTCGCGAAGAACTGAACAAAAAAGTGAGCCTGGCAATGGAAAACATCGAACGTTTTATTACCGAAAGCAGCATCTTCTACCTGATGAAACTGATTAACGAAGCCAAAGTTAGCAAACTGCGCGAATATGATGAAGGCGTTAAAGAATATCTGCTGGACTATATTAGCGAACATCGTAGCATTCTGGGTAATAGCGTTCAAGAGCTGAATGATCTGGTTACCAGCACACTGAATAATAGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGCTACACCAACGATAAAATCCTGATCCTGTACTTCAACAAACTGTACAAGAAGATCAAGGACAACAGCATACTGGATATGCGCTATGAAAACAACAAGTTCATTGATATCAGCGGCTATGGTAGCAACATTAGCATTAATGGTGATGTGTATATCTACAGCACCAACCGCAATCAGTTTGGTATTTATAGCAGCAAACCGAGCGAAGTTAATATTGCGCAGAATAACGATATCATCTACAACGGTCGCTATCAGAACTTTAGCATTAGCTTTTGGGTTCGCATTCCGAAATACTTTAACAAGGTGAACCTGAACAACGAGTACACCATTATTGATTGCATTCGCAATAATAACAGCGGCTGGAAAATCAGCCTGAACTATAACAAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCGCAGGTAATAATCAGAAACTGGTGTTTAACTACACCCAGATGATTAGCATCAGCGACTATATCAACAAATGGATCTTTGTGACCATTACCAACAATCGTCTGGGTAACAGCCGCATTTATATCAATGGCAATCTGATCGACGAAAAAAGCATTTCAAATCTGGGCGATATTCACGTGAGCGATAACATTCTGTTCAAAATTGTTGGCTGCAACGATACCCGTTATGTTGGTATTCGTTACTTCAAAGTGTTTGATACGGAACTGGGCAAAACGGAAATTGAAACCCTGTATAGTGATGAACCGGATCCGAGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGTAATTATCTGCTGTACAACAAACGCTACTATCTGCTGAACCTGCTGCGTACCGATAAAAGCATTACACAGAATAGCAACTTTCTGAACATCAATCAGCAGCGTGGTGTTTATCAGAAACCGAACATTTTTAGCAACACCCGTCTGTATACCGGTGTGGAAGTTATTATTCGTAAAAACGGTAGCACCGATATCAGCAACACCGATAACTTTGTGCGTAAAAATGACCTGGCCTATATTAACGTTGTTGATCGTGATGTTGAGTATCGTCTGTATGCGGATATTAGCATTGCCAAACCGGAAAAGATTATCAAACTGATCCGTACCAGCAACAGCAATAATTCACTGGGTCAGATTATCGTGATGGACAGCATTGGTAACAATTGCACCATGAATTTCCAGAACAATAACGGTGGTAATATTGGCCTGCTGGGCTTTCATAGCAATAATCTGGTTGCAAGCAGCTGGTATTACAACAACATCCGTAAAAATACCAGCAGTAATGGTTGCTTTTGGAGCTTTATCAGTAAAGAACATGGCTGGCAAGAAAACGAGAACCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA
SEQ ID NO:34-rBoNT/F(0)的多肽序列(His-标签)
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SEQ ID NO:35-rLHN/F的核苷酸序列(His-标签)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATAACGATCCGGTGAACGATGATACCATCCTGTATATGCAGATTCCGTATGAAGAGAAAAGCAAAAAGTACTACAAAGCCTTTGAGATCATGCGCAACGTTTGGATTATTCCGGAACGTAATACCATTGGCACCGATCCGAGCGATTTTGATCCGCCTGCAAGCCTGGAAAATGGTAGCAGCGCATATTATGATCCGAATTATCTGACCACCGATGCCGAAAAAGATCGTTATCTGAAAACCACCATCAAACTGTTCAAACGCATTAATAGCAATCCGGCAGGCGAAGTTCTGCTGCAAGAAATTAGCTATGCAAAACCGTATCTGGGCAATGAACATACCCCGATTAATGAATTTCATCCGGTTACACGTACCACGAGCGTTAACATTAAAAGCAGCACCAATGTGAAGTCCAGCATTATTCTGAATCTGCTGGTTTTAGGTGCAGGTCCGGATATTTTTGAAAATTCAAGCTATCCGGTGCGCAAACTGATGGATAGCGGTGGTGTGTATGATCCGTCAAATGATGGTTTTGGCAGCATTAACATTGTGACCTTTAGTCCGGAATATGAATACACCTTCAACGATATTAGCGGTGGCTATAATAGCAGCACCGAAAGTTTTATTGCAGATCCGGCAATTAGCCTGGCACATGAACTGATTCATGCACTGCATGGTCTGTATGGTGCACGTGGTGTTACCTATAAAGAAACCATTAAAGTTAAACAGGCACCGCTGATGATTGCGGAAAAACCGATTCGTCTGGAAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCAGGATCTGAACATTATTACCAGCGCAATGAAAGAGAAAATCTATAATAACCTGCTGGCCAACTATGAGAAAATTGCAACCCGTCTGAGCCGTGTTAATAGCGCACCTCCTGAATATGATATCAACGAGTATAAAGACTATTTTCAGTGGAAATACGGCCTGGATAAAAATGCAGATGGTAGCTATACCGTGAACGAGAACAAATTTAACGAGATCTACAAAAAACTGTATAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCCAACAAATTCAAAGTGAAATGCCGCAACACCTACTTCATCAAATATGGCTTTCTGAAAGTTCCGAACCTGCTTGATGATGATATCTATACCGTTAGCGAAGGCTTTAACATTGGTAATCTGGCCGTTAATAATCGCGGTCAGAACATTAAACTGAACCCGAAAATTATCGATAGCATCCCGGATAAAGGCCTGGTTGAAAAAATTGTGAAATTCTGCAAAAGCGTGATTCCGCGTAAAGGCACCAAAGCACCGCCTCGTCTGTGTATTCGTGTGAATAATCGTGAACTGTTTTTTGTTGCAAGCGAGAGCAGCTATAACGAGAATGATATTAACACCCCGAAAGAGATTGACGATACCACCAATCTGAATAACAACTATCGCAACAATCTGGATGAAGTGATCCTGGATTATAACAGCGAAACCATTCCGCAGATTAGCAATCAGACCCTGAATACCCTGGTTCAGGATGATAGCTATGTTCCGCGTTATGATAGCAATGGCACCAGCGAAATTGAAGAACATAATGTGGTTGATCTGAACGTGTTCTTTTATCTGCATGCACAGAAAGTGCCGGAAGGTGAAACCAATATTAGCCTGACCAGCAGCATTGATACCGCACTGAGCGAAGAAAGCCAGGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGAATTCATCAACACCATTAACAAACCGGTTCATGCAGCACTGTTTATTAGCTGGATTAATCAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCCAGAAAAGCACCTTTGATAAAATTGCCGATATTAGTCTGGTGGTGCCGTATGTTGGTCTGGCACTGAATATTGGTAATGAAGTGCAGAAAGAGAACTTTAAAGAAGCCTTCGAACTGTTAGGTGCCGGTATTCTGCTGGAATTTGTGCCGGAACTGCTGATTCCGACCATTCTGGTTTTTACCATTAAGAGCTTTATTGGCAGCAGCGAGAACAAGAACAAAATCATTAAAGCCATCAACAACAGCCTGATGGAACGCGAAACCAAATGGAAAGAAATTTACAGCTGGATTGTGAGCAATTGGCTGACCCGTATCAATACCCAGTTTAACAAACGCAAAGAACAAATGTATCAGGCCCTGCAGAATCAGGTTGATGCAATTAAAACCGTGATCGAATACAAATACAACAACTATACCAGCGACGAACGTAATCGCCTGGAAAGCGAATACAACATTAATAACATTCGCGAAGAACTGAACAAAAAAGTGAGCCTGGCAATGGAAAACATCGAACGTTTTATTACCGAAAGCAGCATCTTCTACCTGATGAAACTGATTAACGAAGCCAAAGTTAGCAAACTGCGCGAATATGATGAAGGCGTTAAAGAATATCTGCTGGACTATATTAGCGAACATCGTAGCATTCTGGGTAATAGCGTTCAAGAGCTGAATGATCTGGTTACCAGCACACTGAATAATAGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGCTACACCAACGATAAAATCCTGATCCTGTACTTCAACAAACTGTACAAGAAAGAAAACCTGTATTTTCAGGGTGCAAGCCATCATCACCACCATCACCATCATTAA
SEQ ID NO:36-rLHN/F的多肽序列(His-标签)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKENLYFQGASHHHHHHHH
SEQ ID NO:37-rHC/F的核苷酸序列(His-标签)
ATGATCAAGGATAACAGCATTCTGGATATGCGCTATGAGAACAACAAATTCATTGATATTAGCGGCTATGGCAGCAACATTAGCATTAATGGTGATGTGTATATCTACAGCACCAACCGTAATCAGTTTGGCATTTATAGCAGCAAACCGAGCGAAGTTAATATTGCCCAGAACAACGATATCATCTATAACGGTCGCTATCAGAACTTCAGCATTAGCTTTTGGGTTCGCATTCCGAAATACTTCAATAAGGTGAACCTGAACAACGAGTATACCATCATTGATTGCATTCGCAATAATAACAGCGGCTGGAAAATTAGCCTGAACTACAACAAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCGCAGGTAATAATCAGAAACTGGTGTTTAACTACACCCAGATGATTAGCATCAGCGACTATATCAACAAATGGATCTTTGTGACCATTACCAATAATCGCCTGGGTAATAGCCGCATTTATATCAATGGTAACCTGATCGATGAGAAAAGCATTAGCAATCTGGGTGATATTCATGTGAGCGATAACATCCTGTTTAAAATCGTGGGTTGTAACGATACCCGTTATGTTGGTATTCGCTACTTCAAAGTGTTTGATACCGAACTGGGTAAAACCGAAATTGAAACCCTGTATAGTGATGAACCGGATCCGAGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGTAATTATCTGCTGTACAACAAACGCTACTATCTGCTGAATCTGCTGCGTACCGATAAATCAATTACCCAGAATAGCAACTTCCTGAACATTAATCAGCAGCGTGGTGTTTATCAGAAACCGAACATTTTTAGCAACACCCGTCTGTATACCGGTGTGGAAGTTATTATTCGTAAAAATGGCAGCACCGATATCAGCAACACCGATAACTTTGTTCGCAAAAATGATCTGGCGTATATCAACGTTGTTGATCGTGATGTTGAATATCGTCTGTATGCCGATATTAGCATTGCCAAACCGGAAAAAATCATCAAACTGATCCGTACCAGCAACAGCAATAATTCACTGGGTCAGATTATTGTGATGGATAGCATTGGTAATAACTGCACCATGAACTTTCAGAACAATAACGGTGGTAATATTGGTCTGCTGGGCTTTCATAGTAATAATCTGGTTGCAAGCAGCTGGTATTATAACAACATCCGTAAAAATACCAGCAGCAATGGTTGCTTTTGGAGCTTTATTAGCAAAGAACATGGCTGGCAAGAAAACGAGAATCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCACCATCACCATCATTAA
SEQ ID NO:38-rHC/F的多肽序列(His-标签)
MIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQENENLYFQGASHHHHHHHH
SEQ ID NO:39-rLC/F的核苷酸序列(His-标签)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATAACGATCCGGTGAACGATGATACCATCCTGTATATGCAGATTCCGTATGAAGAGAAAAGCAAAAAGTACTACAAAGCCTTTGAGATCATGCGCAACGTTTGGATTATTCCGGAACGTAATACCATTGGCACCGATCCGAGCGATTTTGATCCGCCTGCAAGCCTGGAAAATGGTAGCAGCGCATATTATGATCCGAATTATCTGACCACCGATGCCGAAAAAGATCGTTATCTGAAAACCACCATCAAACTGTTCAAACGCATTAATAGCAATCCGGCAGGCGAAGTTCTGCTGCAAGAAATTAGCTATGCAAAACCGTATCTGGGCAATGAACATACCCCGATTAATGAATTTCATCCGGTTACACGTACCACGAGCGTTAACATTAAAAGCAGCACCAATGTGAAGTCCAGCATTATTCTGAATCTGCTGGTTTTAGGTGCAGGTCCGGATATTTTTGAAAATTCAAGCTATCCGGTGCGCAAACTGATGGATAGCGGTGGTGTGTATGATCCGTCAAATGATGGTTTTGGCAGCATTAACATTGTGACCTTTAGTCCGGAATATGAATACACCTTCAACGATATTAGCGGTGGCTATAATAGCAGCACCGAAAGTTTTATTGCAGATCCGGCAATTAGCCTGGCACATGAACTGATTCATGCACTGCATGGTCTGTATGGTGCACGTGGTGTTACCTATAAAGAAACCATTAAAGTTAAACAGGCACCGCTGATGATTGCGGAAAAACCGATTCGTCTGGAAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCAGGATCTGAACATTATTACCAGCGCAATGAAAGAGAAAATCTATAATAACCTGCTGGCCAACTATGAGAAAATTGCAACCCGTCTGAGCCGTGTTAATAGCGCACCTCCTGAATATGATATCAACGAGTATAAAGACTATTTTCAGTGGAAATACGGCCTGGATAAAAATGCAGATGGTAGCTATACCGTGAACGAGAACAAATTTAACGAGATCTACAAAAAACTGTATAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCCAACAAATTCAAAGTGAAATGCCGCAACACCTACTTCATCAAATATGGCTTTCTGAAAGTTCCGAACCTGCTTGATGATGATATCTATACCGTTAGCGAAGGCTTTAACATTGGTAATCTGGCCGTTAATAATCGCGGTCAGAACATTAAACTGAACCCGAAAATTATCGATAGCATCCCGGATAAAGGCCTGGTTGAAAAAATTGTGAAATTCTGCAAAAGCGAGAACCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA
SEQ ID NO:40-rLC/F的多肽序列(His-标签)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSENLYFQGASHHHHHHHH
SEQ ID NO:41–阳离子的rHC/A的核苷酸序列(His-标签)ATGATCATCAACACCAGCATTCTGAACCTGCGTTATGAAAGCAAACATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCCAGCAAAATCAATATAGGCAGCAAGGTTAACTTCGACCCGATTGACAAAAATCAGATACAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATTGAGGTGATCCTGAAAAAAGCGATCGTGTATAATAGCATGTACGAGAATTTTTCGACCAGCTTTTGGATTCGCATCCCGAAATACTTTAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACCATCATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGTTGGAAAGTCAGCCTGAATTATGGCGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCAAAGAAATCAAACAGCGTGTGGTGTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAATAATCGGCTGAACAAGAGCAAGATCTATATTAACGGTCGTCTGATTGACCAGAAACCGATTAGTAATCTGGGTAATATTCATGCGAGCAACAAAATCATGTTTAAACTGGATGGTTGCCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAATACTTCAACCTGTTCGATAAAGAGTTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTACGATAACCAGAGCAATAGCGGCATACTGAAAGATTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAATCTGTACGACCCGAATAAATACGTGGATGTTAATAATGTGGGCATCCGTGGTTATATGTACCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTATGACCACAAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGAACCAAATTCATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGTGCCCTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTGATGAAAAGCAAAAACGATAAAGGCATCACCAACAAATGCAAGATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAATGATATTGGCTTCATTGGCTTTCACCAGTTTAACAACATTGCAAAACTGGTTGCGAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
SEQ ID NO:42-阳离子的rHC/A的多肽序列(His-标签)
MIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLKLAAALEHHHHHH
SEQ ID NO:43-rHC/AB的核苷酸序列(His-标签)
ATGATTCTGAACAATATTATCCTGAACCTGCGTTACAAAGACAACAATCTGATCGATCTGAGCGGCTATGGTGCAAAAGTTGAAGTCTACGACGGTGTCGAACTGAACGATAAAAACCAGTTCAAACTGACCTCATCGGCTAACTCAAAAATTCGTGTGACGCAGAACCAAAACATCATCTTCAACTCGGTCTTTCTGGACTTCAGCGTGTCTTTCTGGATTCGCATCCCGAAATATAAAAATGATGGCATCCAGAACTACATCCATAACGAATACACCATCATCAACTGTATGAAAAACAACAGTGGTTGGAAAATTTCCATCCGTGGCAACCGCATTATCTGGACCCTGATTGATATCAATGGTAAAACGAAAAGCGTGTTTTTCGAATACAACATCCGTGAAGATATCTCTGAATACATCAATCGCTGGTTTTTCGTGACCATTACGAACAATCTGAACAATGCGAAAATCTATATCAACGGCAAACTGGAAAGTAATACCGACATCAAAGATATTCGTGAAGTTATCGCCAACGGTGAAATCATCTTCAAACTGGATGGCGACATCGATCGCACCCAGTTCATTTGGATGAAATACTTCTCCATCTTCAACACGGAACTGAGTCAGTCCAATATCGAAGAACGCTACAAAATCCAATCATACTCGGAATACCTGAAAGATTTCTGGGGTAACCCGCTGATGTACAACAAAGAATACTACATGTTCAACGCGGGCAACAAAAACTCATACATCAAACTGAAAAAAGATTCGCCGGTGGGTGAAATCCTGACCCGTAGCAAATACAACCAGAACTCTAAATACATCAACTATCGCGATCTGTACATTGGCGAAAAATTTATTATCCGTCGCAAAAGCAACTCTCAGAGTATTAATGATGACATCGTGCGTAAAGAAGACTACATCTATCTGGATTTCTTTAATCTGAACCAAGAATGGCGCGTTTATACCTACAAATACTTCAAAAAAGAAGAAATGAAACTGTTCCTGGCCCCGATTTACGACAGCGATGAATTTTACAACACCATCCAGATCAAAGAATACGATGAACAGCCGACGTATAGTTGCCAACTGCTGTTCAAAAAAGACGAAGAATCCACCGATGAAATTGGCCTGATTGGTATCCACCGTTTCTATGAAAGCGGTATCGTTTTCGAAGAATACAAAGATTACTTCTGTATCTCTAAATGGTATCTGAAAGAAGTCAAACGCAAACCGTACAACCTGAAACTGGGCTGCAACTGGCAATTTATCCCGAAAGACGAAGGCTGGACCGAAAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
SEQ ID NO:44-rHC/AB的多肽序列(His-标签)
MILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEKLAAALEHHHHHH
SEQ ID NO:45-rHC/A变体Y1117VH1253K的核苷酸序列(His-标签)
ATGATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGgtTGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCaAaCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTGCACCATCACCATCACCATCACCATCACCATT
SEQ ID NO:46-rHC/A变体Y1117VH1253K的多肽序列(His-标签)
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SEQ ID NO:47-rHC/A变体Y1117VF1252YH1253KL1278F的核苷酸序列(His-标签)
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SEQ ID NO:48-rHC/A变体Y1117VF1252YH1253KL1278F的多肽序列(His-标签)
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SEQ ID NO:49-rHC/A变体Y1117VF1252YH1253KL1278H的核苷酸序列(His-标签)
ATGATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGgtTGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTaCaAaCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTcatGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTGCACCATCACCATCACCAT
SEQ ID NO:50-rHC/A变体Y1117VF1252YH1253KL1278H的多肽序列(His-标签)
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SEQ ID NO:51-BoNT/A-UniProt P10845的多肽序列
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNVGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO:52-BoNT/B-UniProt P10844的多肽序列
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
SEQ ID NO:53-BoNT/C-UniProt P18640的多肽序列MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
SEQ ID NO:54-BoNT/D-UniProt P19321的多肽序列
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE
SEQ ID NO:55-BoNT/E-UniProt Q00496的多肽序列MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHRFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNCMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLRTKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTFEDNRGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
SEQ ID NO:56-BoNT/F-UniProt A7GBG3的多肽序列
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN
SEQ ID NO:57-BoNT/G-UniProt Q60393的多肽序列
MPVNIKXFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE
SEQ ID NO:58-TeNT–UniProt P04958的多肽序列
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND
SEQ ID NO:59-BoNT/X的多肽序列
MKLEINKFNYNDPIDGINVITMRPPRHSDKINKGKGPFKAFQVIKNIWIVPERYNFTNNTNDLNIPSEPIMEADAIYNPNYLNTPSEKDEFLQGVIKVLERIKSKPEGEKLLELISSSIPLPLVSNGALTLSDNETIAYQENNNIVSNLQANLVIYGPGPDIANNATYGLYSTPISNGEGTLSEVSFSPFYLKPFDESYGNYRSLVNIVNKFVKREFAPDPASTLMHELVHVTHNLYGISNRNFYYNFDTGKIETSRQQNSLIFEELLTFGGIDSKAISSLIIKKIIETAKNNYTTLISERLNTVTVENDLLKYIKNKIPVQGRLGNFKLDTAEFEKKLNTILFVLNESNLAQRFSILVRKHYLKERPIDPIYVNILDDNSYSTLEGFNISSQGSNDFQGQLLESSYFEKIESNALRAFIKICPRNGLLYNAIYRNSKNYLNNIDLEDKKTTSKTNVSYPCSLLNGCIEVENKDLFLISNKDSLNDINLSEEKIKPETTVFFKDKLPPQDITLSNYDFTEANSIPSISQQNILERNEELYEPIRNSLFEIKTIYVDKLTTFHFLEAQNIDESIDSSKIRVELTDSVDEALSNPNKVYSPFKNMSNTINSIETGITSTYIFYQWLRSIVKDFSDETGKIDVIDKSSDTLAIVPYIGPLLNIGNDIRHGDFVGAIELAGITALLEYVPEFTIPILVGLEVIGGELAREQVEAIVNNALDKRDQKWAEVYNITKAQWWGTIHLQINTRLAHTYKALSRQANAIKMNMEFQLANYKGNIDDKAKIKNAISETEILLNKSVEQAMKNTEKFMIKLSNSYLTKEMIPKVQDNLKNFDLETKKTLDKFIKEKEDILGTNLSSSLRRKVSIRLNKNIAFDINDIPFSEFDDLINQYKNEIEDYEVLNLGAEDGKIKDLSGTTSDINIGSDIELADGRENKAIKIKGSENSTIKIAMNKYLRFSATDNFSISFWIKHPKPTNLLNNGIEYTLVENFNQRGWKISIQDSKLIWYLRDHNNSIKIVTPDYIAFNGWNLITITNNRSKGSIVYVNGSKIEEKDISSIWNTEVDDPIIFRLKNNRDTQAFTLLDQFSIYRKELNQNEVVKLYNYYFNSNYIRDIWGNPLQYNKKYYLQTQDKPGKGLIREYWSSFGYDYVILSDSKTITFPNNIRYGALYNGSKVLIKNSKKLDGLVRNKDFIQLEIDGYNMGISADRFNEDTNYIGTTYGTTHDLTTDFEIIQRQEKYRNYCQLKTPYNIFHKSGLMSTETSKPTFHDYRDWVYSSAWYFQNYENLNLRKHTKTNWYFIPKDEGWDED
SEQ ID NO:60–mrBoNT/A的核苷酸序列
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO:61–mrBoNT/A的多肽序列
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO:62–未修饰的BoNT/A1的多肽序列
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO:63–mrBoNT/AB的多肽序列
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
SEQ ID NO:64–mrBoNT/AB(0)的多肽序列
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
SEQ ID NO:65–mrBoNT/A(0)的多肽序列
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
实施例
实施例1
与未处理的对照细胞相比，多种无催化活性的BoNT血清型增加总神经突长度
材料和方法
在大肠杆菌中重组表达五种无催化活性(即无内肽酶活性)的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)血清型，即对应于血清型A、B、C、E和F，并表示为rBoNT/A(0)、rBoNT/B(0)、rBoNT/C(0)、rBoNT/E(0)和rBoNT/F(0)。作为无催化活性的结果，这些分子不能切割它们各自的(SNARE)蛋白质底物。
运动神经元样杂交细胞系(NSC34细胞)(Tebu-Bio，Cedarlane Laboratories，法国)在聚-D-赖氨酸包被的黑色多孔上以5000个细胞/孔培养，并在添加有10％FCS和青霉素/链霉素的DM EM中培养。铺板后，通过暴露于1μM视黄酸和低血清4天将细胞分化成运动神经元，然后用3种不同浓度：0.1、1和10nM的rBoNT/A(0)、rBoNT/B(0)、rBoNT/C(0)、rBoNT/E(0)和rBoNT/F(0)处理细胞4天，并用多聚甲醛4％-蔗糖4％固定。脑源性神经营养因子(BDNF)(可从ReproTech EC Ltd，伦敦，UK商购获得)1ng/ml用作神经元生长的阳性对照。用多聚甲醛4％-蔗糖4％固定细胞，然后用适当的抗体染色。特别地，将抗βIII微管蛋白mAb(Promega G7121)在1×PBS+2％BSA+0.3％TritonX-100中稀释(1:1000)，并将板在37℃下孵育3小时。然后在37℃下施用Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(Life Tech目录号A-11001)(在1×PBS+2％BSA+0.3％TritonX-100中1:2000)1h。细胞核用DAPI染色。图像分析：用具有10×物镜的ArrayScan XTI HCA读数器(Thermo Fisher Scientific)拍摄每孔6个图像。使用Image J软件(来自NIH，Maryland，USA的开源软件)进行所有分析。进行三次独立实验。每个独立实验包含6个重复。
结果
将细胞暴露于不同的无催化活性的BoNT血清型4天(图1)。图1显示了暴露于三种不同浓度的NSC34细胞的平均神经突生长。该图呈现了三轮独立实验的平均。平均神经突生长的数据证实，与未处理的对照相比时，rBoNT/A(0)增加了每个NSC34细胞的神经突长度，类似于阳性对照BDNF。发现rBoNT/B(0)、rBoNT/C(0)、rBoNT/E(0)和rBoNT/F(0)也增加了每个NSC34细胞的神经突长度。
因此，这些数据证实了BoNT/A的神经营养特性也可以外推至其他BoNT血清型。
实施例2
BoNT L-链和LHN相对于对照增加了总神经突长度
材料和方法
在大肠杆菌中重组表达无催化活性的肉毒杆菌毒素rBoNT/A(0)。BoNT/A的片段也在大肠杆菌中表达，并表示为轻链(L/A)、轻链和易位结构域(LHN/A)和重链的细胞结合结构域片段(HC/A)。与实施例1一样，将NSC34细胞暴露于BoNT/A片段以及全长rBoNT/A(0)。
结果
图2显示了暴露于三种不同浓度的rBoNT/A(0)、rL/A、rLHN/A和rHC/A的NSC34细胞的平均神经突生长。该图呈现了三轮独立实验的平均。
与rHC/A类似，与未处理的对照相比时，发现rL/A和rLHN/A在每个浓度下都增加每个NSC34细胞的神经突长度，类似于阳性对照BDNF。特别出乎意料的是，rL/A和rLHN/A片段是神经营养性的，因为两者都缺乏梭菌毒素受体结合结构域(存在于rHC/A中)。
实施例3
以与BoNT/A(0)或其片段相似的浓度施用的其他蛋白质不增加神经突生长材料和 方法
使NSC34细胞分化，然后在以下实验条件下培养4天：(1)未处理的细胞对照：细胞经历与化合物处理的细胞相同数量的操作，即洗涤/给料，然而未处理的对照细胞仅暴露于生长培养基，(2)BDNF-阳性测定对照，1ng/ml，(3)3个剂量(0.1、1和10nM)的BoNT/A(0)，(4)阴性测定对照(蛋白质对照)：1.A7030，Sigma，牛血清白蛋白(BSA)，2.NBP1-37082，Bio-techne，重组人膜联蛋白A4蛋白，3.U-100AT，Bio-techne，重组植物泛素蛋白，4.大肠杆菌表达裂解物，其不含肉毒杆菌神经毒素或其片段。所有阴性对照蛋白以1.5μg/ml终浓度测试。这个浓度对应于10nM的BoNT/A(0)。蛋白质溶液在PBS中，除了含有20％甘油、0.2M NaCl的膜联蛋白4-20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。所有蛋白质溶液均为1mg/l。将细胞用1×PBS-4％BSA-0.3％TritonXI00中的1:1000抗βIII微管蛋白稀释液和二抗抗小鼠AlexaFluor 488染色；DAPI用作核染色剂。使用NeurphologyJ(an Image J Macro，NIH，Maryland，USA)处理β3-微管蛋白信号的所有原始图像。
结果
将细胞暴露于不同的实验条件。图3显示了NSC34细胞中的平均神经突长度。该图呈现了三轮独立实验的平均。平均神经突生长的数据证实了与未处理的对照相比时，rBoNT/A(0)增加每个NSC34细胞的神经突长度，类似于阳性对照BDNF。相反，其他“阴性对照”条件都没有增加神经突长度。这证实了在暴露于rL/A和rLHN/A(以及各种BoNT血清型和rHC/A)时观察到的神经营养作用，并且证明该作用不是由NSC34细胞暴露于蛋白质或肉毒杆菌毒素制剂中存在的推定残留大肠杆菌组分引起的。
实施例4
体内神经元损伤的治疗
设计一项研究以使用体内小鼠背柱损伤模型研究无催化活性的肉毒杆菌毒素rBoNT/A(0)在增强功能恢复和神经再生中的功效。该模型可用于分析引起局部发芽和/或长束轴突再生的分子的功效。众所周知，挤压损伤是脊髓损伤中的常见情况，并且因此该模型模拟创伤后脊髓中发生的大多数病理变化(关于模型和损伤反应的详细内容，参见Lagord等，2002；Molecular and Cellular Neuroscience 20:69；Esmaelli等，2014；Neural Regeneration Research9:1653；Surey等，2014；Neuroscience 275C:62；Almutiri等，2018；Scientific Reports 8:10707)。
材料和方法
脊髓损伤小鼠模型
在手术前，给C57/BL小鼠皮下注射丁丙诺啡，并使用1.8ml/l O2中的5％异氟烷麻醉，在整个手术过程中监测体温和心率。经胸8(T8)椎板部分切除术后使用1mm深×1mm宽的有刻度钟表钳双侧挤压脊髓背柱(SDC)的上行感觉、下行运动和节段本体感受轴突(SPA)。
药物施用
rBoNT/A(0)施用是通过在手术时单次鞘内10μl注射(进入椎管的CSF)3个剂量(100pg、100ng和50μg/小鼠)中的一个。3个剂量中的每一个的治疗组如下：
1.载剂(磷酸盐缓冲盐水[PBS])，即SDC损伤加上载剂的立即单次10μl鞘内注射；n＝6只小鼠。
2.BoNT处理的，即SDC损伤加上立即单次10μl鞘内注射3个剂量的BoNT(100pg、100ng和50μg/小鼠)之一；3×n＝6/组；18只小鼠。
如下进行BoNT的鞘内注射。将小鼠置于俯卧位，并在L5和S1脊椎之间进行注射。将棘突切开并向嘴侧反射以显示黄韧带，并将25G钝针以60°水平角度插入黄韧带，并通过脑脊液(CSF)的回流和“甩尾”的存在确认进入鞘内空间。然后在1min内缓慢注射10μl注射物，并通过温和的尾部抬高促进CSF表达。
测量的终点
1.在基线(损伤前)，然后在SDC损伤后2d、1w、2w、3w和4w再次使用水平梯步行测试测量运动功能。
2.在从运动和感觉神经元/轴突发芽和再生的4W时间点进行定性组织学评估，即短(<1mm)和长(～5mm)距离的轴突生长。对神经丝200(NF200)染色的组织切片检测成熟轴突。磷酸化的MAP1b存在于生长轴突和生长锥中，在那维持细胞骨架组分之间的动态平衡并调节微管和肌动蛋白的稳定性和相互作用，以促进中枢神经系统中的轴突生长、神经连接和再生。MAP1b染色揭示了活跃轴突发芽的区域。
水平梯试验
这测试了运动功能，并且在0.6米长的水平梯上进行，所述水平梯具有8cm的宽度和具有1-2cm的可变间隙的随机调节的横档。在损伤前，然后在SDC损伤后2d、1w、2w、3w和4w再次评估小鼠穿过梯子，并且由不知道处理组的个体记录左后爪滑动和右后爪滑动以及总步数。为了计算平均错误率，将滑动数除以总步数。
组织制备和冷冻切片
在SDC损伤后4w，用4％甲醛(Raymond A Lamb，Peterborough，UK)心内灌注小鼠，并将含有DC损伤部位(损伤部位+任一侧5mm)的T8索的解剖片段与胫骨颅肌一起在室温下后固定2hr，在分级系列的蔗糖中冷冻保护，在最佳切割温度培养基(OCT；Raymond A Lamb)中封闭，并使用Bright低温恒温器以15μm厚切片。
免疫组织化学
将切片在室温下解冻30min，然后在0.1M磷酸盐缓冲盐水，pH7.4(PBS，Raymond ALamb)中洗涤两次。然后将切片在PBS(Sigma)中的0.1％Triton X-100中透化10min，并在室温下在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％Triton-X100(均来自Sigma)的PBS中封闭30min钟。然后将切片与用抗体稀释缓冲液(ADB，含有0.5％BSA和0.05％Tween-20(均来自Sigma)的PBS)稀释的适当的一抗一起孵育，并在4℃下在加湿室中孵育过夜。然后将切片在PBS中洗涤，并与在ADB中稀释的适当荧光标记的二抗一起孵育。然后将切片在PBS中洗涤，并使用含有DAPI的Vectashield(Vector Laboratories，Peterborough，UK)固定盖玻片。在每轮处理中包括阴性对照，其省略了一抗，并且这些用于设置图像捕获的背景阈值水平。使用配备有运行Axiovision软件的Axiocam HRc的Axioplan 2落射荧光显微镜观察切片并捕获图像。
使用的一抗如下：
·兔抗NF200 Sigma，Poole，UK(1:300稀释)
·兔MAP1b Abcam，Cambridge，UK(1:400稀释)
使用的二抗如下：
·Alexa 488抗兔IgG Invitrogen，Paisley，UK(1:400稀释)
·Alexa 594抗兔IgG Invitrogen，Paisley，UK(1:400稀释)
统计
使用SPSS 20(IBM，USA)对功能数据进行统计分析。进行正态分布检验以确定最合适的统计分析来比较处理。在p<0.05下确定统计学显著性。
结果
图4显示了对于100pg和100ng剂量，与载剂对照相比时，施用rBoNT/A(0)在第2天降低了背柱损伤诱导的运动缺陷的程度。在所有测试剂量下，与载剂对照相比时，施用rBoNT/A(0)显著降低了4周时背柱损伤诱导的运动缺陷并恢复速率。此外，鞘内施用rBoNT/A(0)时的效果比脊髓内施用时更显著(数据未显示)。
免疫组织化学评估使用了针对神经丝200(NF200)和MAP1b的抗体。神经丝200(NF200)在成熟轴突中表达，并且pMAP1b抗体揭示了活跃发芽轴突的末端中的神经丝，说明了在病变部位周围和内部仍然活跃发芽的轴突。
图5A显示了在载剂治疗的动物的病变部位周围可见许多NF200染色的轴突，在未治疗动物的病变部位核心内存在很少(如果有的话)NF200+轴突。相比之下，在rBoNT/A(0)治疗的动物的病变部位周围可见许多NF200染色的轴突，在病变部位的核心内也可见许多NF200+轴突。
图5B显示了在载剂治疗的动物的病变部位周围可见适度数量的MAP1b染色的发芽轴突，其中在病变部位的核心内存在极少(如果有的话)MAP1b轴突。相比之下，MAP1b染色揭示了在rBoNT/A(0)治疗的动物中病变部位周围的花状轴突发芽，并且还在整个病变部位的核心分支。
功能测试中性能改善开始的快速性表明了rBoNT/A(0)引起轴突发芽，在病变下方建立有用的功能性突触。定性免疫组织化学提供了BoNT诱导的花状轴突通过SDC病变部位局部发芽的证据。
这些体内数据是证实rBoNT/A(0)在治疗神经障碍中的作用的明确证据。
实施例5
全长无催化活性重组BoNT、BoNT片段&变体对每个细胞的神经突数量的作用
测试了许多全长无催化活性的重组BoNT血清型以及BoNT片段和变体对体外神经突生长的调节作用。
材料和方法
将暴露于多肽的细胞与暴露于阳性对照(1ng/ml BDNF)的那些进行比较。将小鼠运动神经元样杂合(NSC34)细胞分化并在体外(DIV)暴露于3种不同剂量(0.1nM、1nM和10nM)的不同多肽4天。
通过融合富含运动神经元的胚胎小鼠脊髓细胞和小鼠神经母细胞瘤产生NSC34细胞(Cashman等，Dev Dyn.1992年7月；194(3):209-21，其通过引用并入本文)。所述细胞模拟运动神经元的许多性质，包括胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱合成、储存和释放以及神经丝三联体蛋白。此外，NSC34脊髓运动神经元表达谷氨酸受体蛋白并产生动作电位。NSC34神经元已广泛用于研究神经元信号传导和神经元变性的机制。
采用以下实验方案：在神经元细胞系(NSC34)上筛选：
Figure BDA0003572547830001011
将NSC34细胞在聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上在DMEM加10％FCS中培养。
涂布后，通过暴露于视黄酸和低血清水平4天，将细胞分化成运动神经元。在特定时间点存在/不存在多肽的情况下，培养细胞(即，4DIV)。将测试数据与在阳性(BDNF)以及阴性(BSA)对照数据上观察到的效果进行比较。
体外4天(DIV)后，将细胞固定在4％多聚甲醛中，用特异性神经元标志物(β微管蛋白)染色，并定量测定神经突生长(神经突延伸、轴突伸长、分支)。使用Operetta CLS HCS显微镜(PerkinElmer)通过20×物镜进行图像采集。每个孔，采集六(6)个视场。进行神经突生长分析并评估每个细胞的平均神经突。
结果
图6-10表示在三个独立的实验阶段中评估的每个细胞上计数的神经突数量的平均值。将数据在未处理的对照细胞上归一化。与BSA相比时，多肽在统计学上显著地增加了每个细胞的神经突数量。
对于BoNT/A，LHN/A片段(轻链加易位结构域)与细胞结合结构域(HC结构域)片段相比具有改善的活性(参见图6)。
对于BoNT/FA和BoNT/F，与HC结构域片段相比，LHN和LC(仅轻链)片段显示出改善的活性(参见图7和8)。
最后，变体HC结构域片段均显示出高度有效(图9和10)，其中阳离子的HC/A结构域(SEQ ID NO:42-图9)表现出优异的活性，其在3种浓度中的2种下相对于BDNF有所改善。预期阳离子的HC/A结构域的高活性在包含所述结构域的全长多肽中也是明显的(无论是无催化活性的还是有催化活性的)。
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应当理解所要求保护的本发明不应不适当地限于这些具体实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。
条款
1.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含：
梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或
梭菌神经毒素重链(H-链)的片段。
2.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含：
梭菌神经毒素L-链或其片段；和/或
梭菌神经毒素H-链的片段。
3.多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含：
梭菌神经毒素L-链或其片段；和/或
梭菌神经毒素H-链的片段。
4.根据条款1使用的多肽、根据条款2的方法或根据条款3的用途，其中L-链是无催化活性的。
5.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽基本上由梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或梭菌神经毒素重链(H-链)的片段组成。
6.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽由梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或梭菌神经毒素重链(H-链)的片段组成。
7.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中梭菌神经毒素H-链的片段包含：易位结构域(HN)或其片段；或梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)或其片段。
8.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中梭菌神经毒素H-链的片段包含HN结构域或其片段。
9.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中梭菌神经毒素H-链的片段由HN结构域或其片段组成。
10.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中梭菌神经毒素H-链的片段包含HC结构域或其片段。
11.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中梭菌神经毒素H-链的片段由HC结构域或其片段组成。
12.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽缺乏梭菌神经毒素受体结合结构域(HCC)的C-末端部分。
13.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽不包含梭菌神经毒素HN结构域和HC结构域两者。
14.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽不进一步包含非梭菌催化结构域。
15.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含：梭菌神经毒素L-链或其片段，和HN结构域或其片段。
16.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽由以下组成：梭菌神经毒素L-链或其片段，和HN结构域或其片段。
17.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽由以下组成：梭菌神经毒素L-链和HN结构域。
18.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
19.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
20.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
21.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含(优选由其组成)与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少95％序列同一性的多肽序列。
22.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含(优选由其组成)与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少99％序列同一性的多肽序列。
23.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少99.9％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
24.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链。
25.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链。
26.包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链的多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的药物中的用途。
27.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
28.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
29.多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
30.根据条款27-29任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ ID NO:41具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。
31.根据条款27-30任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ ID NO:41具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码。
32.根据条款27-31任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少95％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ ID NO:41具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码。
33.根据条款27-32任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少99％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ ID NO:41具有至少99％序列同一性的核苷酸序列编码。
34.根据条款27-33任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ ID NO:41具有至少99.9％序列同一性的核苷酸序列编码。
35.根据条款27-34任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码。
36.根据条款27-35任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。
37.根据条款27-36任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码。
38.根据条款27-37任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少95％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码。
39.根据条款27-38任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少99％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少99％序列同一性的核苷酸序列编码。
40.根据条款27-39任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少99.9％序列同一性的核苷酸序列编码。
41.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
42.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
43.多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
44.根据条款41-43任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
45.根据条款41-44任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
46.根据条款41-45任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少95％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
47.根据条款41-46任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少99％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
48.根据条款41-47任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
49.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽不包含天然梭菌神经毒素H-链。
50.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽是神经营养性的。
51.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽促进神经元生长和/或神经元修复。
52.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中神经障碍是可通过促进神经元生长和/或修复来治疗的障碍。
53.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中神经障碍是神经元损伤、神经退行性障碍、感觉障碍或自主神经障碍。
54.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中神经障碍是选自以下的神经元损伤：神经创伤(例如由瘢痕形成和/或由骨折引起)、神经病变(例如周围神经病变)、脊髓损伤(例如包括麻痹)、神经切断、脑损伤(例如创伤性脑损伤)、非创伤性损伤(例如中风或脊髓梗塞)和臂丛损伤，例如Erb’s麻痹或Klumpke’s麻痹。
55.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中神经障碍是选自以下的神经退行性障碍：阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森病相关病症、运动神经元疾病、周围神经病变、运动神经病变、朊病毒病、亨廷顿病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、单肢肌萎缩、Friedreich’s共济失调、Hallervorden-Spatz病或额颞叶变性。
56.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽促进运动神经元的生长或修复。
57.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽是经修饰的梭菌神经毒素，如嵌合梭菌神经毒素或杂合梭菌神经毒素。
58.根据条款24-34或49-57任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
59.根据条款24-34或49-58中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
60.根据条款24-34或49-59中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
61.根据条款24-34或49-60中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含(优选由其组成)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少95％序列同一性的多肽序列。
62.根据条款24-34或49-61中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少99％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
63.根据条款24-34或49-58中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少99.9％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
64.根据条款24-26或49-63任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
65.根据条款24-26或49-64任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
66.根据条款24-26或49-65任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
67.根据条款24-26或49-66任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少95％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
68.根据条款24-26或49-67任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少99％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
69.根据条款24-26或49-68任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少99.9％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
70.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽在损伤部位处或附近施用，优选其中多肽在鞘内施用。
71.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽不进一步包含与细胞受体结合的结构域。
72.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽缺乏梭菌神经毒素的功能性HC结构域，并且还缺乏任何功能等同的外源配体靶向部分(TM)。
73.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽不在受试者的细胞中表达。
74.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽的梭菌序列由梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或梭菌神经毒素重链(H-链)的片段组成。
75.根据前述任一项条款使用的多肽、方法或用途，其中多肽还包含一个或多个非梭菌神经毒素序列。
76.根据条款75使用的多肽、方法或用途，其中一个或多个非梭菌神经毒素序列不结合细胞受体。
77.根据条款75或76使用的多肽、方法或用途，其中一个或多个非梭菌神经毒素序列不包含细胞受体的配体。
78.根据条款1-40或49-77任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是修饰的BoNT/A或其片段，其在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY1215，ASN 1216，GLN1229，ASN 1242，ASN 1243，SER 1274，和THR 1277，其中修饰选自：
i.用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
ii.用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
iii.用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
iv.插入碱性氨基酸残基；和
v.缺失表面暴露的酸性氨基酸残基。
79.根据条款1-26或41-77中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)的嵌合BoNT。
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Claims (79)

1.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含：
梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或
梭菌神经毒素重链(H-链)的片段。
2.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含：
梭菌神经毒素L-链或其片段；和/或
梭菌神经毒素H-链的片段。
3.多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含：
梭菌神经毒素L-链或其片段；和/或
梭菌神经毒素H-链的片段。
4.根据权利要求1使用的多肽、根据权利要求2的方法或根据权利要求3的用途，其中L-链是无催化活性的。
5.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽基本上由梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或梭菌神经毒素重链(H-链)的片段组成。
6.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽由梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或梭菌神经毒素重链(H-链)的片段组成。
7.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中梭菌神经毒素H-链的片段包含：易位结构域(HN)或其片段；或梭菌神经毒素受体结合结构域(HC)或其片段。
8.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中梭菌神经毒素H-链的片段包含HN结构域或其片段。
9.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中梭菌神经毒素H-链的片段由HN结构域或其片段组成。
10.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中梭菌神经毒素H-链的片段包含HC结构域或其片段。
11.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中梭菌神经毒素H-链的片段由HC结构域或其片段组成。
12.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽缺乏梭菌神经毒素受体结合结构域(HCC)的C-末端部分。
13.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽不包含梭菌神经毒素HN结构域和HC结构域两者。
14.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽不进一步包含非梭菌催化结构域。
15.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含：梭菌神经毒素L-链或其片段，和HN结构域或其片段。
16.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽由以下组成：梭菌神经毒素L-链或其片段，和HN结构域或其片段。
17.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽由以下组成：梭菌神经毒素L-链和HN结构域。
18.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
19.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
20.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
21.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少95％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
22.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少99％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
23.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO:3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47或49中的任一个具有至少99.9％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含(与SEQ ID NO:4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48或50中的任一个具有至少99.9％序列同一性的多肽序列优选由其组成)。
24.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链。
25.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含无催化活性的梭菌神经毒素L- 链。
26.包含无催化活性的梭菌神经毒素L-链的多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的药物中的用途。
27.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ IDNO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
28.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
29.多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的多肽序列和/或其中多肽包含由与SEQ ID NO:41具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽序列。
30.根据权利要求27-29任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ ID NO:41具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。
31.根据权利要求27-30任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ ID NO:41具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码。
32.根据权利要求27-31任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少95％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ ID NO:41具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码。
33.根据权利要求27-32任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少99％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ ID NO:41具有至少99％序列同一性的核苷酸序列编码。
34.根据权利要求27-33任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:42具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ ID NO:41具有至少99.9％序列同一性的核苷酸序列编码。
35.根据权利要求27-34任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码。
36.根据权利要求27-35任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。
37.根据权利要求27-36任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码。
38.根据权利要求27-37任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少95％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码。
39.根据权利要求27-38任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少99％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少99％序列同一性的核苷酸序列编码。
40.根据权利要求27-39任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:61或65具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)和/或其中多肽由与SEQ IDNO:60具有至少99.9％序列同一性的核苷酸序列编码。
41.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
42.一种用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的方法，该方法包括给受试者施用多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
43.多肽在制备用于促进神经元生长或神经元修复以治疗受试者神经障碍的药物中的用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少70％序列同一性的多肽序列。
44.根据权利要求41-43任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
45.根据权利要求41-44任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
46.根据权利要求41-45任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少95％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
47.根据权利要求41-46任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少99％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
48.根据权利要求41-47任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽包含与SEQ ID NO:63或64具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
49.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽不包含天然梭菌神经毒素H-链。
50.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽是神经营养性的。
51.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽促进神经元生长和/或神经元修复。
52.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中神经障碍是可通过促进神经元生长和/或修复来治疗的障碍。
53.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中神经障碍是神经元损伤、神经退行性障碍、感觉障碍或自主神经障碍。
54.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中神经障碍是选自以下的神经元损伤：神经创伤(例如由瘢痕形成和/或骨折引起)、神经病变(例如周围神经病变)、脊髓损伤(例如包括麻痹)、神经切断、脑损伤(例如创伤性脑损伤)、非创伤性损伤(例如中风或脊髓梗塞)和臂丛损伤，例如Erb’s麻痹或Klumpke’s麻痹。
55.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中神经障碍是选自以下的神经退行性障碍：阿尔茨海默病、帕金森病、帕金森病相关病症、运动神经元疾病、周围神经病变、运动神经病变、朊病毒病、亨廷顿病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、单肢肌萎缩、Friedreich’s共济失调、Hallervorden-Spatz病或额颞叶变性。
56.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽促进运动神经元的生长或修复。
57.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽是修饰的梭菌神经毒素，如嵌合梭菌神经毒素或杂合梭菌神经毒素。
58.根据权利要求24-34或49-57任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
59.根据权利要求24-34或49-58中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
60.根据权利要求24-34或49-59中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
61.根据权利要求24-34或49-60中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含(优选由其组成)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少95％序列同一性的多肽序列。
62.根据权利要求24-34或49-61中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含(优选由其组成)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少99％序列同一性的多肽序列。
63.根据权利要求24-34或49-62中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是无催化活性的，并且：
a.由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或60中的任一个具有至少99.9％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64或65中的任一个具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
64.根据权利要求24-26或49-63任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少70％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少70％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
65.根据权利要求24-26或49-64任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少80％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
66.根据权利要求24-26或49-65任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少90％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
67.根据权利要求24-26或49-66任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少95％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
68.根据权利要求24-26或49-67任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少99％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
69.根据权利要求24-26或49-68任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽：
a.由与SEQ ID NO：1、9、11、13、15、17、25或33中的任一个具有至少99.9％序列同一性的核苷酸序列编码；或
b.包含与SEQ ID NO:2、10、12、14、16、18、26、34、64或65中的任一个具有至少99.9％序列同一性的多肽序列(优选由其组成)。
70.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽在损伤部位处或附近施用，优选其中多肽在鞘内施用。
71.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽不进一步包含与细胞受体结合的结构域。
72.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽缺乏梭菌神经毒素的功能性HC结构域，并且还缺乏任何功能等同的外源配体靶向部分(TM)。
73.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽不在受试者的细胞中表达。
74.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽的梭菌序列由梭菌神经毒素轻链(L-链)或其片段；和/或梭菌神经毒素重链(H-链)的片段组成。
75.根据前述任一项权利要求使用的多肽、方法或用途，其中多肽还包含一个或多个非梭菌神经毒素序列。
76.根据权利要求75使用的多肽、方法或用途，其中一个或多个非梭菌神经毒素序列不结合细胞受体。
77.根据权利要求75或76使用的多肽、方法或用途，其中一个或多个非梭菌神经毒素序列不包含细胞受体的配体。
78.根据权利要求1-40或49-77任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是修饰的BoNT/A或其片段，其在选自以下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN1006、ASN 1025、ASN1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY1215，ASN 1216，GLN1229，ASN 1242，ASN 1243，SER 1274，和THR 1277，其中修饰选自：
vi.用碱性氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
vii.用不带电荷的氨基酸残基取代表面暴露的酸性氨基酸残基；
viii.用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；
ix.插入碱性氨基酸残基；和
x.缺失表面暴露的酸性氨基酸残基。
79.根据权利要求1-26或41-77中任一项使用的多肽、方法或用途，其中多肽是包含BoNT/A轻链和易位结构域以及BoNT/B受体结合结构域(HC结构域)的嵌合BoNT。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4297773A1 (en) * 2021-03-30 2024-01-03 Ipsen Biopharm Limited Catalytically inactive clostridial neurotoxins for the treatment of pain & inflammatory disorders
CA3234608A1 (en) * 2021-11-22 2023-05-25 Ipsen Biopharm Limited Treatment of pain
WO2024069191A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-04 Ipsen Biopharm Limited Clostridial neurotoxin for use in a treatment of bladder pain syndrome

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107438670A (zh) * 2015-03-27 2017-12-05 益普生生物制药有限公司 嵌合多肽

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
AU3658093A (en) 1992-02-10 1993-09-03 Seragen, Inc. Desensitization to specific allergens
GB9305735D0 (en) 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity
GB9508204D0 (en) 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
GB9617671D0 (en) 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
US7192596B2 (en) 1996-08-23 2007-03-20 The Health Protection Agency Ipsen Limited Recombinant toxin fragments
GB9721189D0 (en) 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
ATE227739T1 (de) 1998-05-13 2002-11-15 Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh Hybridprotein zur hemmung der mastzelldegranulation und dessen verwendung
EP1346731B1 (en) 1998-07-22 2006-12-06 Osprey Pharmaceuticals Limited Conjugates for treating inflammatory disorders and associated tissue damage
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
US6776990B2 (en) 1999-04-08 2004-08-17 Allergan, Inc. Methods and compositions for the treatment of pancreatitis
US6358697B2 (en) 1999-04-21 2002-03-19 Children's Hospital Medical Center Intracellular pharmaceutical targeting
DE60032367T3 (de) 1999-08-25 2011-03-10 Allergan, Inc., Irvine Aktivierbare rekombinante neurotoxine
GB9922554D0 (en) 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US6903187B1 (en) 2000-07-21 2005-06-07 Allergan, Inc. Leucine-based motif and clostridial neurotoxins
DE102004043009A1 (de) 2004-09-06 2006-03-23 Toxogen Gmbh Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen
EP1830872B1 (en) 2004-12-01 2010-11-17 Health Protection Agency Fusion proteins
DE102005019302A1 (de) 2005-04-26 2006-11-16 Toxogen Gmbh Carrier zum Targeting von Nervenzellen
ATE463506T1 (de) 2005-09-19 2010-04-15 Allergan Inc Mit clostriedientoxin aktivierbare clostridientoxine
AU2007272517B2 (en) 2006-07-11 2013-09-26 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for non-clostridial toxin target cells
EP2038298A2 (en) 2006-07-11 2009-03-25 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for clostridial toxin target cells
GB0725321D0 (en) * 2007-12-31 2008-02-06 Syntaxin Ltd Delivery vehicles
JP5764550B2 (ja) 2009-04-14 2015-08-19 エムシーダブリユー リサーチ フオンデーシヨン インコーポレーテツド 遺伝子工学的ボツリヌス神経毒
US8853360B2 (en) 2010-06-23 2014-10-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Engineered botulinum neurotoxin C1 with selective substrate specificity
PT2854840T (pt) 2012-05-30 2018-03-02 Harvard College Neurotoxina botulínica geneticamente modificada
US20160051644A1 (en) * 2013-01-16 2016-02-25 Bal Ram Singh Botulinum Chimera Compositions for Axonal Regenerative Therapy During Spinal Cord Injury
GB201312317D0 (en) 2013-07-09 2013-08-21 Syntaxin Ltd Cationic neurotoxins
US10647750B2 (en) 2015-01-09 2020-05-12 Ipsen Bioinnovation Limited Cationic neurotoxins
HUE057258T2 (hu) 2015-03-26 2022-05-28 Harvard College Szerkesztett Botulinum neurotoxin
EP3285800B1 (en) 2015-04-24 2019-09-18 Consiglio Nazionale Delle Ricerche A new therapeutic use of the botulinum neurotoxin serotype a
GB201517450D0 (en) * 2015-10-02 2015-11-18 Ipsen Biopharm Ltd Method
GB201607901D0 (en) * 2016-05-05 2016-06-22 Ipsen Biopharm Ltd Chimeric neurotoxins
MX2019000151A (es) 2016-07-08 2019-08-29 Childrens Medical Center Una neurotoxina botulinica novedosa y sus derivados.
CA3220194A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Ipsen Biopharm Limited Non-neuronal snare-cleaving botulinum neurotoxins
CN110141661A (zh) * 2019-05-09 2019-08-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 肉毒毒素AHc疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107438670A (zh) * 2015-03-27 2017-12-05 益普生生物制药有限公司 嵌合多肽

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JULIE A. COFFIELD等: "Neuritogenic Actions of Botulinum Neurotoxin A on Cultured Motor Neurons", J. PHARMACOL. EXP. THER., vol. 330, no. 1, pages 352 - 358, XP055759768, DOI: 10.1124/jpet.108.147744 *
YA-FANG WANG等: "The Effect of Botulinum Neurotoxin Serotype a Heavy Chain on the Growth Related Proteins and Neurite Outgrowth after Spinal Cord Injury in Rats", TOXINS (BASEL), vol. 10, no. 2, pages 66, XP055758907, DOI: 10.3390/toxins10020066 *

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