CN105492020B - 阳离子神经毒素 - Google Patents
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素,其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.2个pI单位。也提供了所述工程化的梭菌毒素在治疗中的相应用途。
Description
本发明涉及包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素,以及这样的工程化的梭菌毒素在医学和治疗中的用途。
梭菌属中的细菌产生高度强大的并且特异性的蛋白毒素,它们能够毒害它们被递送之处的神经元和其它细胞。这样的梭菌毒素的例子包括由破伤风梭菌(TeNT)和肉毒梭菌(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素以及由巴氏梭菌和丁酸梭菌产生的那些神经毒素。
在所述的梭菌毒素中有一些是已知最强大的毒素。例如,肉毒杆菌神经毒素对于小鼠的半数致死剂量(LD50)值范围从0.5到5ng/kg,取决于血清型。破伤风梭菌毒素和肉毒杆菌毒素两者都通过抑制受影响的神经元的功能(特别是神经递质的释放)而起作用。虽然肉毒杆菌毒素在神经肌肉连接处起作用并且抑制周围神经系统中胆碱能的传导,但是破伤风梭菌毒素却在中央神经系统中起作用。
在自然界,梭菌毒素是以单链多肽形式被合成的，通过一种蛋白酶解切割事件对该多肽进行翻译后的修饰而形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特异性的切割位点(常常被称为活化位点)处,即位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种二链形式成为了所述毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H-链)(具有大约100kDa的分子量)和轻链(L-链)(具有大约50kDa的分子量)。所述的H-链包含N-末端易位元件(HN结构域)和C-末端靶向元件(He结构域)。所述的切割位点位于所述的L-链和所述的易位结构域元件之间。在所述HC结构域与它的靶标神经元结合以及所结合的毒素经由内体内化到细胞中以后，所述的HN结构域使所述的L-链易位跨越内体膜并且进入胞质溶胶中,并且所述的L-链提供一种蛋白酶功能(也被称为一种无细胞毒性的蛋白酶)。
无细胞毒性的蛋白酶通过蛋白酶解切割被称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白(例如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白)而起作用–参见Gerald K(2002)"Cell and MolecularBiology"(第4版)John Wiley & Sons,Inc。首字母缩略词SNARE源于术语可溶性的NSF连接受体,其中NSF意指N-乙基马来酰亚胺-敏感因子。SNARE蛋白是细胞内的小泡融合体所必需的,因此是经由小泡转运的来自细胞的分子分泌所必需的。所述的蛋白酶功能是一种锌依赖性的内肽酶活性并且展示对SNARE蛋白的高度底物特异性。因此,一旦被递送到所要的靶细胞,所述的无细胞毒性的蛋白酶能够抑制来自所述靶细胞的细胞分泌。梭菌毒素的所述L-链蛋白酶是切割SNARE蛋白的无细胞毒性的蛋白酶。
鉴于SNARE蛋白的遍在本性,梭菌毒素例如肉毒杆菌毒素已经被成功地应用在广泛的治疗中。
举例来说,我们参考William J.Lipham,Cosmetic and Clinical Applicationsof Botulinum Toxin(Slack,Inc.,2004),它描述了梭菌毒素，例如肉毒杆菌神经毒素(BoNTs)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(TeNT)的用途,用于在广泛种类的治疗和化妆应用中抑制神经元传导-例如,BOTOXTM目前被批准作为下列适应症的治疗剂:弛缓不能、成年人痉挛、肛裂、背痛、眼睑痉挛、夜磨牙症、颈肌张力障碍、特发性震颤、眉间线或运动机能亢奋的面线、头疼、半面痉挛、膀胱活动过度、多汗症、青少年大脑性瘫痪、多发性硬化症、肌阵挛症、鼻唇线、痉挛性发声困难、斜视和第七神经障碍。另外,描述了梭菌毒素治疗用于治疗神经肌肉病症(参见US 6,872,397)；用于治疗子宫病症(参见US 2004/0175399)；用于治疗溃疡和胃食管反流病(参见US 2004/0086531)；用于治疗张力失常(参见US 6,319,505)；用于治疗眼病(参见US 2004/0234532)；用于治疗眼睑痉挛(参见US 2004/0151740)；用于治疗斜视(参见US 2004/0126396)；用于治疗疼痛(参见US 6,869,610,US 6,641,820、US 6,464,986和US 6,113,915)；用于治疗纤维肌痛(参见US 6,623,742、US 2004/0062776)；用于治疗下背痛(参见US2004/0037852)；用于治疗肌肉损伤(参见US 6,423,319)；用于治疗窦性头疼(参见US 6,838,434)；用于治疗紧张性头疼(参见US 6,776,992)；用于治疗头疼(参见US 6,458,365)；用于减少偏头疼性疼痛(参见US 5,714,469)；用于治疗心血管疾病(参见US 6,767,544)；用于治疗神经性病症例如帕金森氏病(参见US 6,620,415、US 6,306,403)；用于治疗神经精神病(参见US 2004/0180061、US 2003/0211121)；用于治疗内分泌紊乱(参见US 6,827,931)；用于治疗甲状腺疾病(参见US 6,740,321)；用于治疗胆碱能影响的汗腺疾病(参见US6,683,049)；用于治疗糖尿病(参见US 6,337,075、US 6,416,765)；用于治疗一种胰腺疾病(参见US 6,261,572、US 6,143,306)；用于治疗癌症例如骨瘤(参见US 6,565,870、US 6,368,605、US 6,139,845、US 2005/0031648)；用于治疗耳病(参见US 6,358,926、US 6,265,379)；用于治疗自主性疾病例如胃肠肌肉疾病和其它平滑肌机能失常(参见US 5,437,291)；用于与皮肤细胞增生性疾病相关的皮肤损伤的治疗(参见US 5,670,484)；用于控制神经原性炎性病症(参见US 6,063,768)；用于减少脱发和刺激毛发生长(参见US 6,299,893)；用于治疗嘴角朝下(参见US 6,358,917)；用于减少食欲(参见US 2004/40253274)；用于牙齿的治疗和牙科手术(参见US 2004/0115139)；用于治疗神经肌肉疾病和状况(参见US2002/0010138)；用于治疗多种疾病和状况以及相关的疼痛(参见US 2004/0013692)；用于治疗由粘液分泌过多引起的状况例如哮喘和COPD(参见WO 00/10598)；以及用于治疗非神经元状况例如炎症、内分泌状况、外分泌状况、免疫状况、心血管状况、骨状况(参见WO 01/21213)。在此通过引用将所有上述出版物整体并入。
预期无细胞毒性的蛋白酶例如梭菌毒素(例如BoNT和TeNT)在治疗性和化妆性治疗人和其它哺乳动物中的用途将要扩大到范围日益宽广的能够受益于这些毒素性质的疾病和不适。
为了避免系统性的神经效果,许多梭菌毒素治疗利用向给定的靶位点(例如一种靶组织)直接施用所述的梭菌毒素治疗剂。当以这种方式施用基于梭菌毒素的治疗剂时的一个问题是毒素远离所述的施用位点而进入周围组织或系统性循环的传播。毒素远离靶组织的扩散被认为对不受欢迎的副作用负责，这些副作用在极端情况下可能会是威胁生命的。当以高的剂量、浓度和注射体积使用梭菌毒素治疗剂(例如BoNT治疗剂)时，这可能是一个特别的关注。对于商业化的BoNT/A治疗剂，已经报道的与这个问题相关的副作用包括:无力、广泛性肌肉虚弱、复视、下垂、吞咽困难、发声困难、构音困难、尿失禁和呼吸困难。吞咽和呼吸困难可能是威胁生命的并且已经报道了与毒素效应的传播相关的死亡。
因此，在本领域中存在对这样的梭菌毒素的需要:与已知的梭菌毒素相比，它在施用位点具有增大的组织保留性质并且因此展示远离施用位点的扩散的减少。
本发明通过提供工程化的梭菌毒素解决了上述问题,正如权利要求书中具体说明的那样。
在一个方面中,本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素,其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.2个(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1个)pI单位。在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的pI增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.4个pI单位。在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的pI增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.5个pI单位。在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的pI增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.6个pI单位。在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的pI增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.8个pI单位。在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的pI增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少1个pI单位。
在一个方面中,本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素,其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少1个pI单位。
在某些实施方式中,所述工程化的梭菌毒素包含至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80氨基酸修饰。
在某些实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的pI增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少2、3、4或5个pI单位。
本发明人已经发现，通过增大梭菌毒素的pI,例如增大至少0.2个pI单位或0.5个pI单位或1个pI单位(通过向所述的梭菌毒素蛋白中引入至少一个氨基酸修饰),所得的工程化的梭菌毒素有利地显示了增大的组织保留性质和减少的远离施用位点的扩散,同时保留了靶细胞结合、易位以及靶SNARE蛋白切割的能力。因此,与缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素相比，所述的来自施用位点的梭菌毒素的传播被显著地减少了。
本发明所述的工程化的梭菌毒素适用于任何上述的治疗,并且与使用已知的梭菌毒素治疗剂相比，可以有利地显示副作用的减少或不存在。
本发明所述的工程化的梭菌毒素的增大的组织保留性质还提供增大的作用效力和/或持续时间,并且与已知的梭菌毒素治疗剂相比，能够允许使用减少的剂量(或增大的剂量而没有任何额外的副作用),从而提供了更多的优点。
正如下面更详细地论述的那样，由所述的至少一个氨基酸修饰所提供的pI的增大意思是本发明的工程化的梭菌毒素在给定的pH下具有净电荷，该净电荷比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素上的净电荷更正。不希望受任何一种理论限制,本发明人相信，这种增大的正电荷允许本发明所述的工程化的梭菌毒素在施用位点处展示更长的组织保留时间，这归因于在施用位点处，在所述工程化的梭菌毒素与阴离子细胞外组分(例如细胞膜和硫酸肝素蛋白聚糖)之间有利的静电相互作用。这些改善的静电相互作用用于减少所述工程化的梭菌毒素远离所述施用位点的扩散,从而改善组织保留。
举例来说,本发明所述的工程化的梭菌毒素的改善的组织保留性质可以允许(i)更高的剂量进入个别的肌肉,例如胸锁乳突肌,不会传播到附近的颈部肌肉中而引起吞咽困难,以及(ii)在单次治疗中更高的总剂量(对于所有的肌肉),不会传播到所述的循环中而引起系统性的效应例如呼吸困难。对于患者的益处可以包括对大肌肉(例如所述的胸锁乳突肌)的更有效的治疗,增大的在每次治疗期间注射几块不同的肌肉的机会,以及由于更高的定量给药而导致的可能更长的有效治疗持续时间(再次治疗之前更长的持续时间是必要的)。
在一个实施方式中,本发明的工程化的梭菌毒素在使用中具有正的净电荷(例如当所述工程化的梭菌毒素在使用中位于组织中的所要施用位点时)。
等电点(pI)是一种给定的蛋白质的特性。正如本领域中熟知的那样,蛋白质是由特定的氨基酸(当在一种蛋白质中时，也被称为氨基酸残基)序列制成的。20种氨基酸的标准集合中的每一种氨基酸都具有不同的侧链(或R基团),意味着在一种蛋白质中，每一种氨基酸残基显示不同的化学性质例如电荷和疏水性。这些性质可以受周围化学环境(例如温度和pH)的影响。一种蛋白质的总的化学特征将会取决于这些多种因素的总和。
某些氨基酸残基(下面详述)具有能够电离的侧链，该侧链可能显示电荷，取决于周围的pH。在给定的pH下，这样的侧链是否带电取决于相关的能够电离的部分的pKa,其中pKa是所述酸的一个指定质子从一个共轭碱分离的解离常数(Ka)的负对数。
例如酸性的残基例如天冬氨酸和谷氨酸具有pKa值大约为4.1(精确的pKa值可能取决于温度、离子强度和所述能够电离的基团的微环境)的侧链羧酸基团。因此,这些侧链在7.4的pH下(经常被称为"生理pH")展示负的电荷。在低pH值下,这些侧链将会变成质子化的并且失去它们的电荷。
相反地,碱性的残基例如赖氨酸和精氨酸具有pKa值大约为10-12的含氮的侧链基团。这些侧链因此在7.4的pH下展示正的电荷。在高pH值下，这些侧链将会变成去质子化的并且失去它们的电荷。
因此，蛋白质分子的总的(净)电荷取决于存在于所述蛋白质中的酸性残基和碱性残基的数目(以及它们的表面暴露程度)和环境的pH。改变环境的pH，就改变了所述蛋白质上的总的电荷。因此,对于每一种蛋白质，存在着一个给定的pH，在该pH下正电荷和负电荷的数目是相等的并且所述蛋白质显示总体上无净电荷。已知这个点与等电点(pI)一样。等电点是蛋白质生物化学中的一个标准的概念，技术人员将会对它很熟悉。
因此，等电点(pI)被定义为一种蛋白质显示零净电荷时的pH值。pI的增大意味着所述蛋白质展示零净电荷需要更高的pH值。因此,pI的增大表示在给定的pH下，一种蛋白质的净正电荷的增大。相反地,pI的减小意味着所述蛋白质展示零净电荷需要更低的pH值。因此,pI的减小表示在给定的pH下，一种蛋白质的净正电荷的减小。
在本领域中测定一种蛋白质的pI的方法是已知的并且对于技术人员来说将会是熟悉的。举例来说,从存在于所述蛋白质中的每一种氨基酸的平均pKa值能够把蛋白质的pI计算出来。备选地,使用等电点聚焦技术能够把一种蛋白质的pI实验测定出来。这种技术根据蛋白质的pI使用电泳来分离它们。典型地使用一种具有固定化pH梯度的凝胶来进行等电点聚焦。当应用电场时,所述蛋白质迁移穿过所述的pH梯度，直到它达到它具有零净电荷时的pH,这个点就是所述蛋白质的pI。
通过改变显示在蛋白质表面上的碱性基团和/或酸性基团的数目，可以增大或减小一种蛋白质的pI。这能够通过修饰所述蛋白质的一个或更多个氨基酸来实现。例如可以通过减少酸性残基的数目或通过增大碱性残基的数目来提供pI的增大。下面更详细地讨论这样的氨基酸修饰。
天然(未修饰的)梭菌毒素具有大约5-6的pI。因此,在7.4的pH下,天然肉毒杆菌毒素具有负净电荷。举例来说,BoNT/A的pI是6.4,并且BoNT/A分子在7.4的pH下具有-8的净电荷。如上所述计算出了这些pI值。
表1:
| 梭菌毒素 | pI |
| BoNT/A | 6.4 |
| BoNT/B | 5.3 |
| BoNT/C<sub>1</sub> | 5.5 |
| BoNT/D | 5.5 |
| BoNT/E | 6.0 |
| BoNT/F | 5.6 |
| BoNT/G | 5.2 |
| TeNT | 5.8 |
如上所述,在一个实施方式中,本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸修饰,其中所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.2个pI单位。
因此,在本发明的上下文中,pI增大0.2个单位在工程化的BoNT/A梭菌毒素的上下文中将会是pI从6.4增大到6.6。
如上所述,在一个实施方式中,本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸修饰,其中所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少1个pI单位。
因此,在本发明的上下文中,pI增大1个单位在工程化的BoNT/A梭菌毒素的上下文中将会是pI从6.4增大到7.4。
在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少2个pI单位。
在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高2至5个pI单位。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素具有至少为6(例如至少6、至少7、至少8或至少9)的pI。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素具有至少为7的pI。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素具有6至10的pI(例如7至9的pI或8至9的pI)。
如上所述,本发明的所述工程化的梭菌毒素具有增大的组织保留性质，该性质也提供增大的效力和/或作用持续时间,并且与已知的梭菌毒素治疗剂相比能够允许减少使用的剂量(或者允许增大的剂量而没有任何额外的效应)。其中可以定义这些有利的性质(它们代表治疗指数的增大)的一种方式是根据所述工程化的梭菌毒素的安全比。在这个方面,通过测量一种相关的动物模型中体重减少的百分数(例如一种小鼠,其中体重减少是在7天的施用内检测的)，能够从实验上估计梭菌毒素的不受欢迎的效应(由所述毒素远离所述施用位点的扩散引起的)。相反地,通过趾外展评分(DAS)分析——一种肌肉瘫痪量度，能够从实验上估计梭菌毒素的理想的中靶效应。可以通过把20μL配制在明胶磷酸缓冲液中的梭菌毒素注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中,然后通过使用Aoki的方法估计趾外展评分(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820；2001)来进行所述的DAS分析。在所述的DAS分析中,通过尾部短暂地悬挂小鼠以便引出一种特征性的吃惊反应，其中所述的小鼠伸展它的后肢并且外展它的后趾。在注射梭菌毒素后,按照五点评分尺度(0＝正常至4＝趾外展和腿伸展减少最大)对不同程度的趾外展进行打分。
然后可以把一种梭菌毒素的安全比表示成在体重下降10％所需的毒素的量(在小鼠中定量给药后第一个7天内在峰值效应下测得的)与DAS得分为2所需的毒素的量之间的比率。因此，高安全比得分是理想的,并且指示一种能够有效地使一种靶肌肉瘫痪并且具有微小的不希望的脱靶效应的毒素。本发明的工程化的毒素具有的安全比高于对等的未修饰的(天然)肉毒杆菌毒素具有的安全比。
因此在一个实施方式中,本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为8(例如至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)的安全比,其中安全比是这样计算的:体重变化-10％所需的毒素的剂量(pg/小鼠)除以DASED50(pg/小鼠)[ED50＝产生一个为2的DAS得分所需的剂量]。
在一个实施方式中,本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为10的安全比。在一个实施方式中,本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为15的安全比。
本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸修饰。所述的至少一个氨基酸修饰增大所述梭菌毒素的pI,如上所述。在本发明的上下文中,一种氨基酸修饰是一种梭菌毒素的氨基酸序列的修饰。这样的一种修饰可以通过把所述序列中的一个氨基酸替换为另一个氨基酸(即取代)、通过把一个新的氨基酸插入所述的序列中或者通过缺失所述序列的一个氨基酸来实施。被插入蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸也被称为氨基酸残基。
在蛋白质中发现的20种标准氨基酸如下所示:
表2:
下列氨基酸被认为是带电荷的氨基酸:天冬氨酸(负的)、谷氨酸(负的)、精氨酸(正的)和赖氨酸(正的)。
在7.4的pH下,天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的侧链具有负电荷,同时精氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链具有正电荷。天冬氨酸和谷氨酸被称为酸性的氨基酸残基。精氨酸和赖氨酸被称为碱性的氨基酸残基。
下列氨基酸被认为是不带电荷的极性的(意思是它们能够参与氢键结合)氨基酸:天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸。
下列氨基酸被认为是不带电荷的疏水的氨基酸:丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
通过向梭菌毒素中引入一个或更多个增大所述梭菌毒素中正电荷与负电荷的比率的氨基酸修饰，能够实现所述的梭菌毒素的pI的增大。
在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰选自:氨基酸替换、氨基酸插入和氨基酸缺失。
在一种氨基酸替换中,形成所述梭菌毒素氨基酸序列的一部分的一个氨基酸残基被一个不同的氨基酸残基所替代。所述的替代氨基酸残基可以是如上所述的20种标准氨基酸中的一种。
备选地,在一种氨基酸替换中，所述的替代氨基酸可以是一种非标准氨基酸(不是上述20种氨基酸的标准组的一部分的一种氨基酸)。举例来说,所述的替代氨基酸可以是一种碱性的非标准氨基酸,例如L-鸟氨酸、L-2-氨基-3-胍基丙酸或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的D-异构体)。把非标准氨基酸引入蛋白质中的方法是本领域中已知的,并且包括使用大肠杆菌营养缺陷型表达宿主的重组蛋白质合成。
在一种氨基酸插入中,把另外一个氨基酸残基(正常不存在的一个氨基酸)掺入所述的梭菌毒素的氨基酸序列中,从而增大了所述的序列中氨基酸残基的总数。在一种氨基酸缺失中,从所述的梭菌毒素氨基酸序列中除去一个氨基酸残基,从而减少了所述的序列中氨基酸残基的总数。
通过替换、插入或缺失氨基酸残基来修饰蛋白质的方法是本领域中已知的。举例来说,可以通过对编码梭菌毒素的DNA序列的修饰来引入氨基酸修饰。这能够使用标准的分子克隆技术来实现,例如通过定点诱变，其中采用一种聚合酶，使用为所要的氨基酸编码的DNA的短链(寡核苷酸)来替代原编码序列,或者通过采用多种酶(例如连接酶和限制内切核酸酶)插入/缺失所述基因的部分。备选地，能够化学合成修饰的基因序列。
在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰选自:酸性的氨基酸残基被碱性的氨基酸残基替代；酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代；不带电荷的氨基酸残基被碱性的氨基酸残基替代；插入碱性的氨基酸残基；以及缺失酸性的氨基酸残基。
在一种优选的实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰是替换,该替换有利地保持所述梭菌毒素中氨基酸残基数相同。在一个实施方式中,所述的替换选自:酸性的氨基酸残基被碱性的氨基酸残基替代、酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代以及不带电荷的氨基酸残基被碱性的氨基酸残基替代。在一个实施方式中,所述的碱性氨基酸残基是赖氨酸残基或精氨酸残基。在一个实施方式中,所述的碱性氨基酸残基是赖氨酸残基。在一个实施方式中,所述的碱性的氨基酸残基是精氨酸残基。在一个实施方式中,其中所述的替换是酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代，所述的酸性的氨基酸残基被它的相应的不带电荷的酰胺氨基酸残基替代(即天冬氨酸被天冬酰胺替代,以及谷氨酸被谷氨酰胺替代)。
本发明的工程化的梭菌毒素可以包含多于一个的氨基酸修饰。因此,在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素(如上所述)包含1至80个氨基酸修饰(例如1至70个、1至60个、1至50个、4至40个、4至30个、5至40个、5至30个或10至25个氨基酸修饰)。在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素(如上所述)包含4至40个氨基酸修饰。在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个氨基酸修饰。在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素包含至少4个氨基酸修饰(例如至少4个氨基酸替换)。每一个所述的氨基酸修饰是如上所述的一个氨基酸修饰。因此,每一个所述的氨基酸修饰都有助于所述工程化的梭菌毒素的pI的增大(与缺乏所述的氨基酸修饰而其它方面相同的梭菌毒素的pI相比)。
如上所述,任何梭菌毒素的氨基酸(即氨基酸残基)都能够被修饰，只要所述的修饰的结果是增大所述梭菌毒素的pI(如上所述)。然而,本发明人已经鉴定了特别适合用于修饰的靶的梭菌毒素氨基酸的亚组。
优选的靶氨基酸可以具有某些品质。举例来说,优选的靶氨基酸可以:(i)是表面暴露的氨基酸；(ii)位于梭菌毒素蛋白二级结构的外面；(iii)位于梭菌毒素蛋白的区域中，该区域不是蛋白质功能所必需的；(iv)是其同一性在梭菌毒素的类型、亚型或血清型之间没有被保留的氨基酸；(iv)是其修饰没有产生预期的泛蛋白化位点的氨基酸；或(v)是前述的任意组合。
如上所述,梭菌毒素是由两条多肽链—具有大约100kDa的分子量的重链(H-链)和具有大约50kDa的分子量的轻链(L-链)形成的。所述的H-链包含C-末端靶向元件(受体结合结构域或He结构域)和N-末端易位元件(HN结构域)。
在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)位于所述梭菌毒素受体结合结构域(Hc结构域)中。
轻链参考序列的例子包括:
肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基1-448
肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基1-440
肉毒杆菌C1型神经毒素:氨基酸残基1-441
肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基1-445
肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基1-422
肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基1-439
肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基1-441
破伤风神经毒素:氨基酸残基1-457
应当把上面鉴定的参考序列看作是一个指南,根据亚血清型(的不同),可以存在轻微的变化。举例来说,US 2007/0166332(在此通过引用将其全文引入)引述了稍微不同的梭菌序列:
肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基M1-K448
肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基M1-K441
肉毒杆菌C1型神经毒素:氨基酸残基M1-K449
肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基M1-R445
肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基M1-R422
肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基M1-K439
肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基M1-K446
破伤风神经毒素:氨基酸残基M1-A457
梭菌毒素Hc结构域参考序列的例子包括:
BoNT/A-N872-L1296
BoNT/B-E859-E1291
BoNT/C1-N867-E1291
BoNT/D-S863-E1276
BoNT/E-R846-K1252
BoNT/F-K865-E1274
BoNT/G-N864-E1297
TeNT-I880-D1315
所述的梭菌毒素(例如BoNT)的Hc结构域包含两个不同的结构特征，它们被称为ΗCC和HCN结构域。在受体结合中所涉及的氨基酸残基被认为主要位于所述的ΗCC结构域中。
在一个实施方式中,其中所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)位于所述梭菌毒素受体结合结构域(HC结构域)中,所述的至少一个氨基酸修饰位于所述梭菌毒素HCN结构域(也被称为一种便于易位的结构域)中。在一个实施方式中,其中所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)位于所述梭菌毒素受体结合结构域(HC结构域)中,所述的至少一个氨基酸修饰位于所述梭菌毒素ΗCC结构域中。
梭菌毒素HCN结构域参考序列的例子包括:
肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基872-1110
肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基859-1097
肉毒杆菌C1型神经毒素:氨基酸残基867-1111
肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基863-1098
肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基846-1085
肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基865-1105
肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基864-1105
破伤风神经毒素:氨基酸残基880-1127
上述序列的位置可以根据血清型/亚型而稍微变化,并且合适的(参考)梭菌毒素HCN结构域的另外的例子包括:
肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基874-1110
肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基861-1097
肉毒杆菌C1型神经毒素:氨基酸残基869-1111
肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基865-1098
肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基848-1085
肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基867-1105
肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基866-1105
破伤风神经毒素:氨基酸残基882-1127
在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)是表面暴露的氨基酸残基的修饰。表面暴露的氨基酸残基是存在于折叠的蛋白质的外部上的那些氨基酸，并且因此易于接近周围溶剂,与位于所述的折叠的蛋白质内部中的那些氨基酸残基相反。一种氨基酸残基的表面暴露程度以及因此它暴露于周围溶剂的程度取决于它在所述折叠的蛋白质中的位置,也取决于所述蛋白质采用的构象。因此，与具有低表面暴露程度的氨基酸残基的修饰相比，具有高表面暴露程度的氨基酸残基的修饰可能对所述蛋白质的等电点具有更大的影响。测定氨基酸残基的表面暴露程度的方法是本领域中已知的。举例来说,能够使用计算机程序ArealMol(CCP4计算机程序套件的一部分)来计算一种给定的蛋白质中氨基酸残基的表面暴露程度。也可以通过检视蛋白质晶体结构(例如由X射线晶体学提供的)来鉴定表面暴露的氨基酸残基。在一个实施方式中,表面暴露的氨基酸残基具有至少40的总ArealMol值。
在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰包括选自下列的氨基酸残基的修饰:天冬氨酸残基、谷氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、半胱氨酸残基或酪氨酸残基。本发明人已经鉴定了来自这个组的氨基酸残基(带负电荷的残基和极性的残基)代表根据本发明用于修饰的特别合适的靶。不希望受任何一种理论限制,本发明人相信，与没有列出的疏水的残基相比，这个组中的氨基酸残基以更大的频率出现在梭菌毒素的表面上。
在一个实施方式中,其中所述的氨基酸修饰包括选自下列的氨基酸残基的修饰:天冬氨酸残基、谷氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、半胱氨酸残基或酪氨酸残基(如上所述),所述的氨基酸残基被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。因此,在一个实施方式中,带负电荷的残基或极性的残基被带正电荷的残基替代,从而增大了正电荷与负电荷的比率，并且增大了所述梭菌毒素的pI。
在一个实施方式中,所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)包含天冬酰胺氨基酸残基或谷氨酰胺氨基酸残基(两者都是不带电荷的极性的残基)的修饰。在一个实施方式中,所述的天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸残基被赖氨酸残基或精氨酸残基(两者都是带正电荷的残基)替代。在一个实施方式中,所述的天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸残基被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸残基被精氨酸残基替代。
天冬酰胺和谷氨酰胺残基有利地适用于修饰，因为它们是极性的,只与其它残基形成弱的偶极相互作用,并且构成典型的梭菌毒素分子(例如BoNT/A)的14％。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A。一种参考BoNT/A序列具有UniProtKB检索号P10845。
本发明人已经鉴定了代表BoNT/A梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的靶的某些氨基酸。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086和GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086和GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述的工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086和GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083和ASP 1086；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个)氨基酸的修饰:ASN886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个)氨基酸的修饰:ASN886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个)氨基酸的修饰:ASN886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少1个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、或6个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、或6个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一种(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比一个缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、或6)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6或7个)氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6或7个)氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6或7个)氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列8个氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN1243、SER 1274、THR 1277；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列8个氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN1243、SER 1274、THR 1277；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含下列8个氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN1243、SER 1274、THR 1277；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6或所有7个)氨基酸的修饰:ASN 930、SER955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052、HIS 1064和GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或所有11个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052、HIS 1064、ASN 1080、ASN 1147和GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A,所述工程化的BoNT/A包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或所有13个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN1052、HIS 1064、ASN 1080、ASN 1147和GLN 1229；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B。一种参考BoNT/B序列具有UniProtKB检索号P10844。
本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/B梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的靶。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B,所述工程化的BoNT/B包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 873、ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、GLU 1189、GLU 1252和ASN 1273；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/B的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/B的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B,所述工程化的BoNT/B包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 873、ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、GLU 1189、GLU 1252和ASN 1273；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/B的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/B的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B,所述工程化的BoNT/B包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 873、ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、GLU 1189、GLU 1252和ASN 1273；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/B的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/B的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素是BoNT/C1。一种参考BoNT/C1序列具有UniProtKB检索号P18640。
本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/C1梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的靶。
因此,在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/C1,所述工程化的BoNT/C1包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN881、ASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、ASP 996、ASN 1000、GLU 1036、ASN 1041、ASP 1062、ASP 1064、GLU 1079和ASP 1081；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/C1的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/C1的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
因此,在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/C1,所述工程化的BoNT/C1包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN881、ASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、ASP 996、ASN 1000、GLU 1036、ASN 1041、ASP 1062、ASP 1064、GLU 1079和ASP 1081；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/C1的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/C1的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/C1,所述工程化的BoNT/C1包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN 881、ASP898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、ASP 996、ASN 1000、GLU 1036、ASN 1041、ASP 1062、ASP 1064、GLU 1079和ASP 1081；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/C1的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/C1的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D。一种参考BoNT/D序列具有UniProtKB检索号P19321。
本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/D梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的靶。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D,所述工程化的BoNT/D包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 877、ASP893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、ASN 979、GLU 1030、ASP 1031、ASP 1033、GLU 1047、GLU 1051、ASN 1052、GLU 1066和GLN1122；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/D的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/D的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D,所述工程化的BoNT/D包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 877、ASP893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、ASN 979、GLU 1030、ASP 1031、ASP 1033、GLU 1047、GLU 1051、ASN 1052、GLU 1066和GLN1122；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/D的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/D的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D,所述工程化的BoNT/D包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 877、ASP893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、ASN 979、GLU 1030、ASP 1031、ASP 1033、GLU 1047、GLU 1051、ASN 1052、GLU 1066和GLN1122；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/D的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/D的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E。一种参考BoNT/E序列具有UniProtKB检索号Q00496。
本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/E梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的靶。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E,所述工程化的BoNT/E包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 859、ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 981、ASP 985、GLN 1014、ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035和ASN 1140；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/E的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/E的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E,所述工程化的BoNT/E包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 859、ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 981、ASP 985、GLN 1014、ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035和ASN 1140；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/E的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/E的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E,所述工程化的BoNT/E包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 859、ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 981、ASP 985、GLN 1014、ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035和ASN 1140；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/E的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/E的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F。一种参考BoNT/F序列具有UniProtKB检索号YP_001390123。
本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/F梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的靶。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F,所述工程化的BoNT/F包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 879、ASP896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055和ASP1056；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/F的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/F的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F,所述工程化的BoNT/F包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 879、ASP896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055和ASP1056；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/F的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/F的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F,所述工程化的BoNT/F包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 879、ASP896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055和ASP1056；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/F的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/F的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G。一种参考BoNT/G序列具有UniProtKB检索号Q60393。
本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/G梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的靶。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G,所述工程化的BoNT/G包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASP 900、ASN909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、ASN 1001、ASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075和ASN 1090；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/G的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/G的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G,所述工程化的BoNT/G包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASP 900、ASN909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、ASN 1001、ASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075和ASN 1090；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/G的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/G的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G,所述工程化的BoNT/G包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASP 900、ASN909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、ASN 1001、ASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075和ASN 1090；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/G的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/G的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,所述工程化的梭菌毒素是TeNT。一种参考TeNT序列具有UniProtKB检索号P04958。
本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表TeNT梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的靶。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是TeNT,所述工程化的TeNT包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN 893、ASP 894、ASP 911、ASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081和ASN 1097；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的TeNT的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的TeNT的pI高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是TeNT,所述工程化的TeNT包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN 893、ASP 894、ASP 911、ASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081和ASN 1097；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的TeNT的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的TeNT的pI高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
在一个实施方式中,其中所述工程化的梭菌毒素是TeNT,所述工程化的TeNT包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN 893、ASP 894、ASP 911、ASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081和ASN 1097；并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的TeNT的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的TeNT的pI高至少一个pI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中,所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
本发明适用于许多不同的种类的梭菌毒素。因此,在本发明的上下文中,术语"梭菌毒素"包括由肉毒梭菌(肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G)、破伤风梭菌(破伤风神经毒素)、丁酸梭菌(肉毒杆菌神经毒素血清型E)和巴氏梭菌(肉毒杆菌神经毒素血清型F)以及修饰的梭菌毒素或源于任何前述的衍生物生产的毒素。术语"梭菌毒素"也包括肉毒杆菌神经毒素血清型H。
肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是由肉毒梭菌以一种大的蛋白质复合物的形式生产的,该复合物由自身与多个辅助蛋白复合的BoNT组成成。目前有8种不同的类别的肉毒杆菌神经毒素,即:肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G和H,所有这些共有相似的结构和作用模式。基于被特异性的中和抗血清失活能够区分不同的BoNT血清型,这种通过血清型的分类与在所述的氨基酸水平上序列同一性百分比相关。基于氨基酸的序列同一性百分比，进一步把给定的血清型BoNT蛋白质划分成不同的亚型。
BoNTs被吸收到胃肠道中,并且在进入大循环以后,与胆碱能神经末端的突出前膜结合并且阻止它们的神经递质乙酰胆碱的释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G切割突触小泡蛋白/与小泡缔合的膜蛋白(VAMP)；BoNT/C1、BoNT/A和BoNT/E切割与突触小体缔合的25kDa的蛋白(SNAP-25)；而BoNT/C1切割突触融合蛋白。
破伤风毒素是由破伤风梭菌以单一的血清型生产。丁酸梭菌生产BoNT/E,同时巴氏梭菌生产BoNT/F。
术语"梭菌毒素"也意图包括修饰的梭菌毒素及其衍生物,包括但不限于下面描述的那些。一种修饰的梭菌毒素或衍生物可以包含与梭菌毒素的天然(未修饰的)形式相比已经被修饰的一个或更多个氨基酸,或可以包含不存在于所述梭菌毒素的天然(未修饰的)形式中的插入的一个或更多个氨基酸。举例来说,与天然(未修饰的)梭菌毒素序列相比，一种修饰的梭菌毒素可以在一个或更多个结构域中含有修饰的氨基酸序列。这样的修饰可以改变所述毒素的功能方面,例如生物学活性或持久性。因此,在一个实施方式中,本发明所述的工程化的梭菌毒素是工程化的修饰的梭菌毒素，或工程化的修饰的梭菌毒素衍生物,或工程化的梭菌毒素衍生物。
修饰的梭菌毒素可以在所述重链的氨基酸序列(例如一种修饰的HC结构域)中具有一个或更多个修饰,其中所述修饰的重链以比所述的天然(未修饰的)梭菌毒素更高或更低的亲和性与靶神经细胞结合。在所述HC结构域中这样的修饰能够包括修饰所述HC结构域的神经节苷脂结合位点中或所述蛋白质(SV2或突触结合蛋白)结合位点中的残基，该修饰改变了与所述的靶神经细胞的神经节苷脂受体和/或所述蛋白质受体的结合。这样的修饰的梭菌毒素的例子被描述在WO 2006/027207和WO 2006/114308中,在此通过引文全文引入它们两者。
修饰的梭菌毒素可以在所述的轻链的氨基酸序列中具有一个或更多个修饰,例如在底物结合或催化结构域中的修饰，该修饰可以改变或修饰所述修饰的LC的SNARE蛋白特异性。这样的修饰的梭菌毒素的例子被描述在WO 2010/120766和US 2011/0318385,在此通过引文全文引入它们两者。
修饰的梭菌毒素可以包含增大或减小所述的修饰的梭菌毒素的生物学活性和/或生物学持久性的一个或更多个修饰。例如一种修饰的梭菌毒素可以包含一个基于亮氨酸或酪氨酸的基序,其中所述的基序增大或减小所述的修饰的梭菌毒素的生物学活性和/或生物学持久性。合适的基于亮氨酸的基序包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL和xExxxLM(其中x是任何氨基酸)。合适的基于酪氨酸的基序包括Y-x-x-Hy(其中Hy是一种疏水的氨基酸)。包含基于亮氨酸和酪氨酸的基序的修饰的梭菌毒素的例子被描述在WO 2002/08268,在此通过引文将其全文引入。
术语"梭菌毒素"意图包括杂合体和嵌合体梭菌毒素。一种杂合体梭菌毒素包含来自一种梭菌毒素或其亚型的一条轻链的至少一部分和来自另一种梭菌毒素或梭菌毒素亚型的一条重链的至少一部分。在一个实施方式中，所述的杂合体梭菌毒素可以包含来自一种梭菌毒素亚型的一条轻链的整条轻链和来自另一种梭菌毒素亚型的重链。在另一个实施方式中,一种嵌合体梭菌毒素可以包含一种梭菌毒素亚型的重链的一部分(例如所述的结合结构域),所述重链的另一部分来自另一种梭菌毒素亚型。类似地或备选地,所述的治疗性元素可以包含来自不同的梭菌毒素的轻链部分。这样的杂合体或嵌合体梭菌毒素是有用的，例如作为一种递送手段，把这样的梭菌毒素的治疗益处递送到对一种给定的梭菌毒素亚型有免疫抗性的患者,递送到可以具有低于平均的一种给定的梭菌毒素重链结合结构域的受体浓度的患者,或递送到可以具有所述膜或小泡毒素底物的抗蛋白酶的变体(例如SNAP-25、VAMP和突触融合蛋白)的患者。杂合体和嵌合体梭菌毒素被描述在US 8,071,110中,在此通过引文将该文献全文引入。因此，在一个实施方式中,本发明所述的工程化的梭菌毒素是工程化的杂合体梭菌毒素或工程化的嵌合体梭菌毒素。
术语"梭菌毒素"意图包括再靶向的梭菌毒素。在一种再靶向的梭菌毒素中,所述的梭菌毒素被修饰而包含已知作为靶向部分(TM)的外源配体。选择所述的TM以提供对一种所要的靶细胞的结合特异性,并且作为所述的再靶向过程的一部分，所述的梭菌毒素的天然结合部分(例如所述的HC结构域或所述的HCC结构域)可以被除去。再靶向技术例如被描述在:EP-B-0689459；WO1994/021300；EP-B-0939818；US6,461,617；US7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US7,052,702；WO1999/017806；EP-B-1107794；US6,632,440；WO2000/010598；WO2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO 2000/61192；和WO 1999/58571中，在此通过引文把所有这些文献全文引入。因此,在一个实施方式中,本发明所述的工程化的梭菌毒素是工程化的再靶向的梭菌毒素。
本发明也包括具有非天然蛋白酶切割位点的梭菌毒素。在这样的梭菌毒素中,天然的蛋白酶切割位点(也被称为活化位点,如上所述)被修饰或被一个蛋白酶切割位点替代，该切割位点不是该梭菌毒素天然有的(即一个外源性切割位点)。这样的位点将会需要外源性蛋白酶进行切割,这允许改善的对切割事件的时机和位置的控制。可以被用在梭菌毒素中的非天然蛋白酶切割位点包括:
肠激酶 (DDDDK↓)
因子Xa (IEGR↓/IDGR↓)
TEV(烟草蚀刻病毒) (ENLYFQ↓G)
凝血酶 (LVPR↓GS)
PreScission (LEVLFQ↓GP)。
另外的蛋白酶切割位点包括被无细胞毒性的蛋白酶(例如被所述的梭菌神经毒素的轻链)切割的识别序列。这些包括被无细胞毒性的蛋白酶(例如所述的梭菌神经毒素的轻链)切割的所述SNARE(例如SNAP-25、突触融合蛋白、VAMP)蛋白质识别序列。包含非天然蛋白酶切割位点的梭菌毒素被描述在US 7,132,259、EP 1206554-B2和US 2007/0166332中,在此通过引文把所有这些文献全文引入。术语蛋白酶切割位点也包括一种内含肽,它是一种自切割序列。自剪接反应是能够控制的,例如通过改变存在的还原剂的浓度。
本发明也包括包含"毁灭性切割位点"的梭菌毒素。在所述的梭菌毒素中,在一个选定的位置，非天然的蛋白酶切割位点被掺入所述的梭菌毒素中,使得在所述位点的切割将会减小所述梭菌毒素的活性或失活它如果在施用后,所述的梭菌毒素迁移到非靶向的位置，那么所述破坏性的蛋白酶切割位点可能易受局部蛋白酶切割。合适的非天然蛋白酶切割位点包括上述的那些。包含破坏性切割位点的梭菌毒素被描述在WO 2010/094905和WO2002/044199中,在此通过引文全文引入它们两者。
本发明所述的工程化的梭菌毒素,尤其是其轻链组分,可以是聚乙二醇化的——这可以帮助增大稳定性,例如所述的轻链组分的作用持续时间。当所述的轻链包含BoNT/A、B或C1蛋白酶时，聚乙二醇化是特别优选的。聚乙二醇化优选地包括把PEG添加到所述的轻链组分的N-末端。举例来说,一条轻链的N-末端可以是被一个或更多个氨基酸(例如半胱氨酸)残基延长,该残基可以是相同的或不同的。一个或更多个所述的氨基酸残基可以具有它自己的与其相连的(例如共价连接的)PEG分子。这种技术的一个例子被描述在WO2007/104567中,在此通过引文将其全文引入。
本发明所述的工程化的梭菌毒素可以没有所述的复合蛋白，该复合蛋白存在于天然存在的梭菌毒素复合物中。
本发明的工程化的梭菌毒素也可以包含数量有限的非标准氨基酸。因此,除了所述的20种标准氨基酸以外,也可以用非标准氨基酸(例如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和a-甲基丝氨酸)来替代本发明所述的工程化的梭菌毒素的氨基酸残基。数量有限的非保守性的氨基酸、没有被遗传密码编码的氨基酸和非天然的氨基酸可以被用来替代梭菌多肽的氨基酸残基。本发明所述的工程化的梭菌毒素也能够包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟基乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、派可酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯基-丙氨酸、4-氮杂苯基-丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域中已知有几种方法用于把非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质中。例如可以采用一种体外系统，其中使用以化学方法氨酰化的抑制子tRNAs抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域中已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译是在包含大肠杆菌S30提取液和可商业得到的酶和其它试剂的不含有细胞的体系中进行的。通过层析法纯化蛋白质。参见,例如Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722.1991；Ellman等人,MethodsEnzymol.202:301,1991；Chung等人,Science 259:806-9,1993；和Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中,翻译是通过显微注射突变的mRNA和以化学方法氨酰化的抑制子tRNAs在非洲爪蟾卵母细胞中进行的(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中,在不存在将要被替换的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)并且存在所要的非天然存在的氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将所述的非天然存在的氨基酸掺入所述的多肽中，替代它的天然对应物。参见,Koide等人,Biochem.33:7470-6,1994。
使用重组核酸技术能够生产本发明所述的工程化的梭菌毒素。因此,在一个实施方式中,工程化的梭菌毒素(如上所述)是重组的工程化的梭菌毒素。
在另一个方面中,本发明提供一种核酸(例如DNA)，其包含编码如上所述的工程化的梭菌毒素的核酸序列。在一个实施方式中,所述的核酸序列是作为包含启动子和终止子的DNA载体的一部分而被制备的。
一种优选的实施方式,所述的载体具有选自下列的启动子:
启动子 诱导剂 典型的诱导条件
Tac(杂合体) IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)
AraBAD L-阿拉伯糖 0.2％(0.002-0.4％)
T7-lac操纵基因 IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)
在另一种优选的实施方式中,所述的载体具有选自下列的启动子:
启动子 诱导剂 典型的诱导条件
Tac(杂合体) IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)
AraBAD L-阿拉伯糖 0.2％(0.002-0.4％)
T7-lac操纵基因 IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)
T5-lac操纵基因 IPTG 0.2mM(0.05-2.0mM)
可以使用本领域中已知的任何合适的方法来制备本发明所述的核酸分子。因此,可以使用化学合成技术来制备所述的核酸分子。备选地,可以使用分子生物学技术来制备本发明所述的核酸分子。
本发明所述的DNA构建物优选地是在电脑中被设计,然后通过常规的DNA合成技术被合成的。
根据将要被采用的最终的宿主细胞(例如大肠杆菌)表达系统，任选地针对密码子偏倚修饰上述的核酸序列信息。
在一个实施方式中,编码如上所述的工程化的梭菌毒素的所述核酸序列是一种核酸序列，它与选自SEQ ID NOs:3、5、7和9的一种核酸序列具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98或99％)的序列同一性。
在一个方面中,本发明提供一种核酸序列，它与选自SEQ ID NOs:3、5、7和9的一种核酸序列具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98或99％)的序列同一性。在一个实施方式中,所述的核酸序列与选自SEQ ID NOs:3、5、7和9的核酸序列具有至少90％的序列同一性。
本发明也提供由如上所述的核酸序列编码的多肽。因此，在一个方面中,本发明提供包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与选自SEQ ID NOs:4、6、8和10的氨基酸序列具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98或99％)的序列同一性。在一个实施方式中,所述的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs:4、6、8和10的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
在一个实施方式中,本发明所述的工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的BoNT/A,并且所述的工程化的BoNT/A包含氨基酸序列(或由其组成)，该氨基酸序列与选自SEQ ID NOs:4、6、8和10的一种氨基酸序列具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9％)的序列同一性。
在一个实施方式中,本发明所述的工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的BoNT/A,并且所述的工程化的BoNT/A包含SEQ ID NO:4、6、8或10的氨基酸序列(或由其组成)。
在一个方面中,本发明提供一种多肽，它包含SEQ ID NO:4、6、8或10的氨基酸序列(或由组成)。
在一个方面中,本发明提供一种编码如上所述的工程化的梭菌毒素的核酸,其中所述的核酸包含一种核酸序列，该核酸序列与选自SEQ ID NOs:3、5、7和9的核酸序列具有至少70％(例如至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9％)的序列同一性。在一个实施方式中,所述的核酸包含SEQ ID NO:3、5、7或9的核酸序列(或由其组成)。
在一个方面中,本发明提供一种核酸，它包含SEQ ID NO:3、5、7或9的核酸序列(或由其组成)。
在两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的"序列同一性百分数"是所述序列共有的相同位置的数量的函数。因此可以这样计算同一性％:相同的核苷酸/氨基酸的数量除以核苷酸/氨基酸的总数,乘以100。计算序列同一性％也可以考虑需要引入以优化两个或更多个序列的比对的空位的数量以及每个空位的长度。在两个或更多个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可以使用特定的数学算法(例如BLAST)来进行,该算法对于技术人员来说是熟悉的。
在一个方面中,本发明提供一种生产单链工程化的梭菌毒素蛋白的方法，该蛋白具有一条轻链和一条重链,所述的方法包括在一种合适的宿主细胞中表达一种核酸(所述的核酸如上所述),裂解所述的宿主细胞以提供包含所述的单链工程化的梭菌毒素蛋白的宿主细胞匀浆液,并且分离所述的单链工程化的梭菌毒素蛋白。
在另一个方面中,本发明提供一种活化工程化的梭菌毒素的方法,所述的方法包括提供一种能够通过如上所述的生产单链工程化的梭菌毒素蛋白的方法得到的单链工程化的梭菌毒素蛋白,使所述的多肽与切割所述多肽的蛋白酶在位于所述的轻链和重链之间的识别位点(切割位点)处接触,从而把所述的多肽转化为一种双链多肽，其中通过二硫键把所述的轻链和重链连接在一起。
本发明所述的工程化的梭菌毒素可以被用来预防或治疗某些医学或美容性疾病和状况。因此，在另一个方面中,本发明提供如上所述的工程化的梭菌毒素，其用于医药中。
在一个相关的方面中,本发明提供如上所述的工程化的梭菌毒素,其用于预防或治疗选自下列的一种疾病或状况:斜视、眼睑痉挛、斜眼、张力失常(例如痉挛性张力失常、口颚肌张力失常、病灶性张力失常、迟发性张力失常、喉部张力失常、四肢张力失常、颈肌张力失常)、斜颈(例如痉挛性斜颈)、受益于细胞/肌肉无能的美容治疗(美容性)应用(经由SNARE下调或失活)、神经肌肉病症或眼能动性状况(例如共同性斜视、垂直斜视、外直肌瘫痪、眼球震颤、甲状腺机能障碍性肌病)、指痉挛、眼睑痉挛、夜磨牙症、肝豆状核变性、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、痉挛、由慢性多发性硬化症引起的痉挛状态、导致异常的膀胱控制的痉挛状态、男性意像、背部痉挛、四头肌僵痛、紧张性头疼、提肌骨盆综合征、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森氏病、口吃、半面痉挛、眼睑病、脑性瘫痪、病灶性痉挛状态、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、肛门痉挛、四肢痉挛状态、抽搐、震颤、夜磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难、流泪、多汗症、过度流涎、过度胃肠分泌、肌肉疼痛(例如来自肌肉痉挛的疼痛)、头疼疼痛(例如紧张性头疼)、额沟、皮肤皱纹、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器-神经疾病、慢性神经原性炎症和平滑肌病症。
在使用中,本发明使用一种药物组合物,其包含工程化的梭菌毒素与至少一种选自下列的组分:药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐。
可以配制本发明所述的工程化的梭菌毒素使其用于口、胃肠外、连续的输注、吸入或局部应用。适用于注射的组合物可以呈溶液、混悬液或乳液的形式或呈干粉形式，在使用前把所述干粉溶解或混悬在合适的赋形剂中。
在将要被局部递送的所述工程化的梭菌毒素的情形中,所述工程化的梭菌毒素可以被配制成乳膏(例如用于局部应用),或用于皮下注射。
局部递送手段可以包括气溶胶或其它喷雾剂(例如喷雾器)。在这个方面,工程化的梭菌毒素的气溶胶制剂确保递送到肺和/或其它鼻的和/或支气管的或气道的通道。
可以在参与受影响的器官的神经支配的脊髓节段的水平，通过鞘内或硬膜外注射到脊柱中，来给患者施用本发明的工程化的梭菌毒素。
优选的施用途径是经由腹腔镜检查和/或局部化的,特别肌肉内注射。
施用本发明所述的工程化的梭菌毒素的剂量范围是将要产生所要的治疗效果的那些剂量范围。应当理解所需的剂量范围取决于所述工程化的梭菌毒素或组合物的精确本性、施用途径、所述制剂的本性、患者的年龄、患者状况的本性、程度或严重程度、禁忌症(如果有的话)和主治医师的判断。能够使用用于最优化的标准经验途径来调节这些剂量水平的变化。
合适的每日剂量(每kg患者的体重)在0.0001-1ng/kg,优选地在0.0001-0.5ng/kg,更优选地在0.002-0.5ng/kg,特别优选地在0.004-0.5ng/kg范围内。所述的单位剂量能够在少于1皮克(pg)至30ng剂量内变化,但是典型地将会在0.01至1ng/剂量的范围内,可以每日一次地施用该剂量或优选地不那么频繁地,例如每星期一次地或6个月一次地施用。
一种特别优选的定量给药方案基于0.05ng工程化的梭菌毒素作为所述的IX剂量。在这个方面,优选的剂量在1X-100X(即0.05-5ng)范围内。
流体剂型典型地是利用所述工程化的梭菌毒素和不含热原的无菌载体制备的。取决于所用的载体和浓度,能够把所述工程化的梭菌毒素溶解或混悬在载体中。在制备溶液时，载体,如果必要的话，通过添加氯化钠把所述溶液制成等渗的，并且通过使用无菌技术通过无菌过滤器过滤来灭菌，然后填充到合适的无菌小瓶或安瓿中并且密封。备选地,如果溶液稳定性是足够的,则可以通过高压灭菌法把所述的处于密封容器中的溶液灭菌。有利地，可以把添加剂例如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、混悬剂或乳化剂和或局部麻醉剂溶解在载体中。
干粉(在使用前将其溶解或混悬在一种合适的载体中)可以通过在无菌区使用无菌技术把预先灭菌的组分填充在无菌容器中来制备。备选地，可以在无菌区使用无菌技术把所述的组分溶解在合适的容器中。然后把产品冷冻干燥，并且把容器无菌密封。
除了把无菌组分混悬而不是溶解在无菌载体中并且灭菌不能够通过过滤完成外，以实质上相同的方式制备适用于肌肉内、皮下或皮内注射的胃肠外混悬剂。可以以无菌状态分离所述的组分或备选地，可以在分离后把组分灭菌,例如通过伽马照射。
有利地,把混悬剂例如聚乙烯吡咯烷酮包含在所述组合物中以促进所述组分的均匀分布。
根据本发明的施用可以利用多种递送技术，包括微粒包裹、病毒递送体系或高压气溶胶冲击。
附图描述
图1
阳离子构建体的等电点聚焦(IEF)凝胶。
图2
在大鼠胚胎脊髓神经元(eSCN)中，Cat5v2(K1064H/N954K)(A)、Cat5v2(K1064H/N886K)(B)和Cat5v2(K1064H/N1025K)(C)的SNAP-25切割百分数以及相对于nBoNT/Al的pEC50的汇总表。把(A、B、C)大鼠胚胎脊髓神经元培养三个星期并且用Cat5v4处理24h,然后用SNAP-25特异性的抗体进行蛋白质印迹分析。数据是来自三个独立实验的一式三份的平均值±SEM。(D)在大鼠eSCN SNAP-25切割效力分析中，Cat5v2(K1064H/N886K),Cat5v2(K1064H/N954K)和Cat5v2(K1064H/N1025K)相对于nBoNT/Al(List BiologicalLaboratories)的效力。基于一个8-点浓度响应曲线(CRC)，每一个点对应于单一批次并且是3次独立的pEC50测定的平均值。一式三份评估所述CRC中的每一个浓度。把效力比较制成目录批、合并的数据n＝24的平均值。数据是每种Cat5v4的n＝3批的平均值±SEM。
图3
在小鼠膈神经偏侧膈分析(mPNHD)中，nBoNT/Al和Cat5v4的效力(t50)。按照所指示的那样，把小鼠膈神经偏侧膈组织与Cat5v4或天然BoNT/Al一起温育。记录隔膜的收缩力，直到不再能检测到收缩或140分钟以后为止。每一个点对应于独立的测定。t50值是把小鼠偏侧膈的收缩力抑制50％所需要的时间。
序列
SEQ ID NO:1.BoNT/Al核酸序列。
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAG
ATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCG
GAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCT
GTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACC
AAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATC
CCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATT
CAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATC
CAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAG
TACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTG
CTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCAC
CGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATG
AGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGC
TTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAG
GCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTG
CTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTG
ACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAAT
TTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAAC
CTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACG
AAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGC
AAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGG
GATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGC
GATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTT
AACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAA
CTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCAT
TACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCC
CTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACT
GAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTG
AGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGC
AACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTC
ATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTG
ACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATT
GTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTG
GAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAG
AATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATC
AATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTC
AAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGT
ACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTT
CAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATC
AATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAG
ATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAA
TCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACC
AGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAAC
TGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGAC
ACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAAT
CGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTG
ATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGAC
GGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAG
AAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTAT
CTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAAT
GTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTG
AACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATT
GTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAAC
GCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAA
GTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAAC
AATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAAT
TGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGAT
GATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO：2.BoNT/Al氨基酸序列。
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVP
VSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVI
QPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPL
LGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDS
LQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKML
TEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFT
KLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITS
DTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFH
YLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEV
STTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVL
TVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEK
NNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRG
TLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASK
INIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIIN
CMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRL
IDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDY
LQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNI
VRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDN
NGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO：3.工程化的BoNT/A1＂Cat-A＂核酸序列。
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAG
ATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCG
GAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCT
GTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACC
AAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATC
CCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATT
CAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATC
CAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAG
TACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTG
CTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCAC
CGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATG
AGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGC
TTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAG
GCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTG
CTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTG
ACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAAT
TTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAAC
CTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACG
AAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGC
AAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGG
GATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGC
GATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTT
AACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAA
CTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCAT
TACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCC
CTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACT
GAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTG
AGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGC
AACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTC
ATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTG
ACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATT
GTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTG
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AATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATC
AATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTC
AAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGT
ACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTT
CAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATC
AATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAG
ATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAA
TCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACC
AGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAAC
TGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGAC
ACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAAT
CGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTG
ATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGAC
GGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAG
AAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTAT
CTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAAT
GTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTG
AACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATT
GTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAAC
GCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAA
GTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAAC
AATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAAT
TGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGAT
GATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
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CAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAG
TACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTG
CTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCAC
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CTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACaAGATGCTG
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NGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO：7.工程化的BoNT/A1＂Cat-C＂核酸序列。
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAG
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CTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCAT
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AATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATC
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KLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITS
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IDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDY
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SEQ ID NO：9.工程化的BoNT/A1＂Cat-D＂核酸序列。
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAG
ATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCG
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AGCGGCCTgGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGC
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CTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTG
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AATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATC
AATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTC
AAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGT
ACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTT
CAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATC
AATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATtGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAG
ATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAA
TCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACC
AGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAAC
TGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGAC
ACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAAT
CGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTG
ATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGAC
GGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAG
AAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTAT
CTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAAT
GTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTG
AACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATT
GTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGCGTAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAAC
GCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTCGTGTCCGTCGTCTGAGCCAA
GTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACCGT
CGTGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAAT
TGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCCGTAGCCGTCGTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGAT
GATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO：10.工程化的BoNT/A1＂Cat-D＂氨基酸序列。
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVP
VSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVI
QPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPL
LGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDS
LQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKML
TEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFT
KLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITS
DTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFH
YLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEV
STTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVL
TVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEK
NNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRG
TLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASK
INIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIIN
CMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRL
IDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDY
LQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNI
VRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDR
RGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
实施例
下列实施例用于举例说明本发明的具体实施方式，并且不以任何方式限定权利要求书中所定义的本发明的保护范围。
实施例1
生产了根据本发明的工程化的BoNT/A1分子的3个不同实例。
使用多个不同的标准筛选了被选择用于修饰的氨基酸(突变位点)。
残基替换的标准如下:
1.残基的类型；
2.表面暴露程度；
3.关于二级/三级结构的位置；
4.关于BoNT的已知功能性结构域的位置；
5.遍及所述BoNT/A或BoNT/E亚型的序列保守度；
6.引入另外一个遍在蛋白化位点的概率。
在这个实施例中,选择天冬酰胺(Asn,N)和谷氨酰胺(Gln,Q)用于突变因为它们是极性的,尺寸与Lys相似,仅仅与其它残基形成较弱的偶极相互作用,并且所述分子的14％是由这两种残基构成的。
从BoNT/A1(PDB ID:3BTA)的晶体结构中鉴定了在所述分子的表面上可见的Asn和Gln残基。这确保所有被替换的残基将能够在外面上展示它们的电荷。通过应用上述筛选标准(迭代法)的3-5点,可能从这个目录中排除掉不太适用于替换的那些残基.
从与BoNT/A和功能上相似的BoNT/E血清型的其它亚型的比对中鉴定了BoNT/A1内的非保守残基。把在其它序列中表现为碱性残基的那些残基选择作为用于替换的头等候选者。
在通过上述章节提到的筛选标准的连续反复多轮后，鉴定了最终的候选残基目录。筛选这些用于潜在产生另外的遍在蛋白化共有序列(利用CKSAAP_UbSite服务器)。通过把所述的替代赖氨酸改变为精氨酸，把被鉴定出来的很少几个残基除去了。
合成的用于BoNT/A1序列的最终实例的阳离子构建体被列于下面,命名为Cat-A、Cat-B和Cat-C。每种构建体具有149,637道尔顿的分子量。
Cat-A:N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,N886K。
Cat-B:N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,N954K。
Cat-C:N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,N1025K。
实施例2
针对能够被Lys或Arg替代的潜在的残基，评估了所述的BoNT/B、F和E的氨基酸序列。这种初始的评估鉴定了能够被替换而产生具有增大的pI的BoNT/B、E或F蛋白质的残基。
分析了BoNT/B(Ac:P10844)、BoNT/E(Ac:Q00496)和BoNT/F(Ac:P30996)的一级序列,并且将氨基酸组成汇总在下表中:
表3:
从该表中,根据对BoNT/A1的观察，类似地有大量极性的Asn/Gln残基存在于所述的氨基酸序列中。也有相对大量的酸性的(Asp/Glu)残基，这些残基潜在地能够被改变成它们相应的中性残基(Asn/Gln)或碱性残基(Lys或Arg)。
实施例3
用于修饰的优选的梭菌毒素氨基酸的鉴定。
BoNT/A、BoNT/B和BoNT/E的全长结构数据是可以得到的；然而对于其余的四种血清型,基于序列和相关的结构同源性，使用LOOPP计算机程序产生了理论模型。
通过ArealMol(CCP4套件)分析了每一种结构，并且把暴露的残基鉴定为具有大于40的总值。具有极性侧链的残基选自这个目录,并且从这个目录中优选酸性的残基(Asp和Glu)或具有H-键受体侧链的残基(Asn和Gln)。最后的计算步骤涉及基于来自所述的Stride服务器的分析数据，选择在α-螺旋和β-链的之间的残基。检视每一个分子的结构以鉴定位于界面区域内的残基-避开这些残基。
对于BoNT/Al,给优选的残基目录补充了在至少90％的所有比对的序列中功能上非保守的残基[大的非极性的侧链(Met、Pro、Phe、Trp)被认为是等同的,小的非极性的侧链(Gly、Ala、Val、Leu、He)被认为是等同的,酸性的侧链(Asp、Glu)被认为是等同的,并且碱性的侧链(Arg、Lys)被认为是等同的]。更具体地,在至少10％的所述序列中表现为碱性的残基的那些非保守残基以及所述参考序列中的非保守的Asn、Gln、Asp或Glu被选择作为候选者。
对于其余的血清型,在亚型之间进行多重的序列比对以鉴定在至少10％的所述序列中表现为碱性残基的功能上非保守的残基。
优选的用于修饰的梭菌毒素氨基酸:
BoNT/A:
ASN 886,ASN 905,GLN 915,ASN 918,GLU 920,ASN 930,ASN 954,SER 955,GLN991,GLU 992,GLN 995,ASN 1006,ASN 1025,ASN 1026,ASN 1032,ASN 1043,ASN 1046,ASN1052,ASP 1058,HIS 1064,ASN 1080,GLU 1081,GLU 1083,ASP 1086.
BoNT/B:
ASN 873,ASN 874,GLU 892,ASP 895,ASN 906,ASP 940,ASN 948,GLU 949,ASN958,ASN 959,ASN 979,ASN 990,GLU 993,ASP 994,GLU 997,ASN 1012,ASN 1019,ASP1030,ASP 1047,ASP 1049,GLU 1065,GLU 1072,GLN 1176,GLU 1189,GLU 1252,ASN 1273.
ASN 881,ASP 898,GLU 916,GLU 927,ASN 952,ASN 964,ASN 965,ASN 984,GLU985,ASP 986,ASP 996,ASN 1000,GLU 1036,ASN 1041,ASP 1062,ASP 1064,GLU 1079,ASP1081.
BoNT/D:
ASN 877,ASP 893,ASN 894,ASN 898,ASN 920,ASN 945,ASN 948,GLU 957,GLN958,ASN 959,ASN 968,ASN 979,GLU 1030,ASP 1031,ASP 1033,GLU 1047,GLU 1051,ASN1052,GLU 1066,GLN 1122.
BoNT/E:
ASN 859,ASP 860,ASN 892,ASP 893,ASP 904,ASP 909,ASN 928,ASN 932,ASN934,ASN 935,GLU 936,ASP 945,ASN 946,ASN 947,ASN 966,ASN 976,ASN 979,ASN 981,ASP 985,GLN 1014,ASN 1019,ASN 1022,ASP 1027,ASN 1035,and ASN 1140.
BoNT/F:
ASN 879,ASP 896,ASN 922,ASN 923,ASN 928,ASN 947,ASN 950,ASN 952,ASN953,GLU 954,ASN 963,ASN 964,ASN 965,ASN 987,GLN 997,ASN 1037,ASP 1040,ASP1045,ASN 1055,ASP 1056.
BoNT/G:
ASP 900,ASN 909,ASN 910,GLU 912,ASN 913,ASN 945,ASN 947,GLU 956,ASN965,ASP 966,ASN 986,ASN 1001,ASN 1038,ASP 1040,ASN 1046,ASP 1057,GLU 1073,ASN1075,ASN 1090.
TeNT:
ASN 893,ASP 894,ASP 911,ASN 919,ASN 927,ASN 928,GLU 929,GLN 968,ASN972,GLU 973,GLU 1010,ASP 1018,ASN 1079,ASN 1080,ASN 1081,ASN 1097.
所用的序列检索号:
BoNT/A:P10845
BoNT/B:PI0844
BoNT/C1:P18640
BoNT/D:P19321
BoNT/E:Q00496
BoNT/F:YP_001390123
BoNT/G:Q60393
TeNT:P04958
结构数据源
BoNT/A(3BTA.pdb)、BoNT/B(1EPW)和BoNT/E(3FFZ.pdb)的晶体结构是从RCSB获得的。
分别使用LOOPP和下列序列来进行BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G和TeNT的同源性建模:P18640、P19321、YP_001390123、Q60393,和P04958。
结构分析
使用AreaIMol从所述的CCP4套件确定暴露的残基。
使用Stride确定了二级结构的分配。
通过采用RasMol检视确定了界面残基。
序列分析
全长BoNT序列是从NCBI获得的。
用ClustalX进行比对。
实施例4
克隆、表达和纯化
合成了实施例1中描述的编码所述工程化的BoNT/A分子的DNA构建体,把它们克隆到所述的pJ401表达载体中并且然后转化到BL21(DE3)大肠杆菌中。这允许所述重组的Cat-A、Cat-B和Cat-C蛋白质在BL21(DE3)大肠杆菌中可溶的过度表达。
使用经典的层析法技术从所述的大肠杆菌裂解液中纯化所述重组的工程化的BoNT。采用一个使用阳离子交换树脂的初始纯化步骤，然后通过使用疏水相互作用树脂进行中间纯化步骤。然后通过蛋白酶水解切割所述重组的工程化的BoNT单链,产生活化的双链工程化的BoNT。然后采用最后的纯化步骤来除去剩余的污染物。
实施例5
纯化的工程化的BoNT的表征
按照下述以实验方式对上述实施例1中描述的工程化的BoNT进行了表征。
对所述pI的测定显示:所述工程化的BoNT的等电点大于未修饰的(天然)BoNT/A1的等电点-参见图1和下表。
表4:
使用大鼠胚胎脊髓神经元(eSCN)评估了所述工程化的BoNT进入神经元并且切割SNAP-25(BoNT/A1的靶)的能力。图2显示所述工程化的BoNT保留了与天然BoNT/A1相同的进入所述的神经元并且切割SNAP-25的能力。
使用小鼠膈神经偏侧膈分析(mPNHD)进一步评估了所述工程化的BoNT的效力。图3显示所述工程化的BoNT保留了与天然BoNT/A1相同的抑制所述小鼠偏侧膈的收缩能力的能力。
使用体内小鼠趾外展评分(DAS)分析来评估相对于天然BoNT/A1的效力或安全性。相对于天然BoNT/A1，两种分子都展示了更高的安全比并且效力稍微更强一些。这些数据被呈现在下面(表4)。
表4:
-DAS ED50:计算的引发DAS 2的剂量
-剂量DAS 4:引发DAS 4的实验剂量
-BW:体重
--10％ΔBW的剂量:计算的引发BW与在D0下BW相比减小10％的剂量
-安全比:-10％ΔBW的剂量/DAS ED50
所述的安全比是BoNT处理的不利效应(体重减少)相对于效力(半最大趾外展评分(DAS))的量度。它被计算成-10％体重(BW)与所述DAS ED50的比率,其中-10％BW是指10％的体重减小所需的BoNT的量(pg/动物),而ED50是指将会产生一个为2的DAS的BoNT的量(pg/动物)。
所述的DAS分析是通过把20μL配制在明胶磷酸缓冲液中的工程化的梭菌毒素注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中,然后通过像Aoki先前报道的那样(Aoki KR,Toxicon39:1815-1820；2001)评估趾外展来进行的。
实施例6
使用上述实施例1中提出的标准设计了根据本发明的进一步工程化的梭菌毒素。
这种阳离子构建体也源于BoNT/A1并且具有7.4的计算的pI以及149,859的分子量。所述的构建体被命名为Cat-D。虽然构建体Cat-A、Cat-B和Cat-C包含突变为赖氨酸的残基,但是Cat-D包含突变为精氨酸的残基。
Cat-D:N1188R,D1213R,G1215R,N1216R,N1242R,N1243R,S1274R,T1277R。
实施例7
治疗患有颈肌张力失常的患者
一位患有痉挛性斜颈的50岁的妇女在诊室中陈述先前曾经接受过治疗有效量的一种标准BoNT/A制剂进入颈部肌肉中的治疗；然而,该患者经受了由于所述毒素传播到口咽中而引起的吞咽困难。采用大约1.5ng(或更多)本发明的工程化的BoNT/A在颈部肌肉中注射来治疗该患者。在3-7天以后，在没有发生吞咽困难的情况下,该患者的斜颈得到了显著的改善，并且该患者能够将她的头和肩膀保持在正常的状态持续至少5个月。由于所述工程化的BoNT/A分子的增强的组织保留和减少的传播,医生能够注射更多的药物而不用担心副作用；所述的增大的剂量导致延长的持续作用时间。
实施例8
治疗患有眼睑痉挛的患者
一位47岁的男人在诊室中陈述患有眼睑痉挛。通过把5pg至25pg本发明的工程化的BoNT/A注射到上眼睑的外侧睑板前眼轮匝肌肌肉和下眼睑的外侧睑板前眼轮匝肌肌肉中来治疗该患者。在大约一个星期内，该患者的症状发生了减轻并且持续了至少5个月，没有眼下垂。本发明所述的多肽的增大的安全性允许医生增大剂量，并且因此延长了临床效果的持续时间。
实施例9
一位患有脑性瘫痪的27岁男人在诊室中陈述患有衰弱的马蹄足并且患有行走困难。该患者先前曾经接受过治疗有效量的BoNT/A的治疗,其中他的步态缓解改善伴随着他四肢的肌肉虚弱和疼痛。通过把大约20pg/kg本发明的工程化的BoNT/A注射到所述受影响的下肢的腓肠肌肌肉的内侧头和外侧头的两个位点中的每一个中来治疗该患者。在一个星期内,该患者的步态改善了，没有先前见到的副作用并且所述的症状减轻持续了至少4个月。给药更高量的药物的能力导致产生延长的作用时间的治疗。
Claims (15)
1.工程化的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)，其中所述工程化的BoNT/A由包含选自SEQID NOs:3、5和7的核酸序列的核酸编码；或其中所述工程化的BoNT/A包含选自SEQ ID NOs:4、6和8的氨基酸序列；
其中所述工程化的BoNT/A具有至少8的安全比，其中安全比是这样计算的:测量为pg/小鼠的、体重变化-10％所需的毒素的剂量除以测量为pg/小鼠的DAS ED50，其中ED50＝产生一个为2的DAS得分所需的剂量，和
其中所述工程化的BoNT/A具有至少6.6的pI。
2.根据权利要求1所述的工程化的BoNT/A，其中所述工程化的BoNT/A由选自SEQ IDNOs:3、5和7的核酸序列组成的核酸编码。
3.根据权利要求1所述的工程化的BoNT/A，其中所述工程化的BoNT/A由选自SEQ IDNOs:4、6和8的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的工程化的BoNT/A，其中所述工程化的BoNT/A具有在7和9之间的pI。
5.一种核酸，它包含编码根据权利要求1-4中任意一项所述的工程化的BoNT/A的核酸序列。
6.一种生产单链工程化的BoNT/A蛋白质的方法，该蛋白质具有一条轻链和一条重链,所述的方法包括在合适的宿主细胞中表达根据权利要求5的核酸，裂解所述的宿主细胞以提供包含所述的单链工程化的BoNT/A蛋白质的宿主细胞匀浆，并且分离所述的单链工程化的BoNT/A蛋白质。
7.一种活化工程化的BoNT/A的方法,所述方法包括提供能够通过权利要求6所述的方法得到的单链工程化的BoNT/A蛋白质,使所述的多肽与在位于所述的轻链和重链之间的识别位点(切割位点)处切割所述多肽的蛋白酶接触,并且把所述的多肽转化为双链多肽，其中所述的轻链和重链通过二硫键连接在一起。
8.双链工程化的BoNT/A，其通过权利要求7的方法获得。
9.根据权利要求1-4中任意一项所述的工程化的BoNT/A或根据权利要求8所述的双链工程化的BoNT/A在制备药物中的用途。
10.根据权利要求1-4中任意一项所述的工程化的BoNT/A或根据权利要求8所述的双链工程化的BoNT/A在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗选自下列的疾病或状况:斜视、斜眼、张力失常、斜颈、受益于细胞/肌肉无能的美容治疗应用、神经肌肉病症或眼能动性状况、夜磨牙症、肝豆状核变性、震颤、抽搐、痉挛、男性意像、四头肌僵痛、紧张性头疼、提肌骨盆综合征、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森氏病、口吃、眼睑病、脑性瘫痪、神经源性膀胱、肛裂、弛缓不能、吞咽困难、流泪、多汗症、过度流涎、过度胃肠分泌、肌肉疼痛、头疼疼痛、额沟、皮肤皱纹、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器-神经疾病、慢性神经原性炎症和平滑肌病症。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述张力失常是痉挛性张力失常、口颚肌张力失常、病灶性张力失常、迟发性张力失常、喉部张力失常、四肢张力失常或颈肌张力失常，或其中所述斜颈是痉挛性斜颈，或其中所述神经肌肉病症或眼能动性状况是共同性斜视、垂直斜视、外直肌瘫痪、眼球震颤或甲状腺机能障碍性肌病，或其中所述肌肉疼痛是来自肌肉痉挛的疼痛，或其中所述美容治疗应用包括美容性处理，或其中所述头疼疼痛是紧张性头疼。
12.根据权利要求10所述的用途，所述痉挛是由慢性多发性硬化症引起的痉挛状态。
13.根据权利要求10所述的用途，所述痉挛是病灶性痉挛状态。
14.根据权利要求10所述的用途，所述痉挛是导致异常的膀胱控制的痉挛状态、痉挛性结肠炎、背部痉挛、半面痉挛、肛门痉挛或四肢痉挛状态。
15.根据权利要求10所述的用途，所述痉挛是眼睑痉挛、指痉挛或节段性肌阵挛。
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Legal Events
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