CN104736166B - 工程化的肉毒神经毒素 - Google Patents
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Abstract
本文公开了肉毒神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽具有修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B‑HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、或它们的组合。特定的突变组合包括E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、或E1191Q和S1199F。还公开了其它置换突变。还公开了分离的修饰的受体结合结构域、嵌合分子、药物组合物、以及使用它们的方法。
Description
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2012年5月30日提交的美国临时申请号61/653,214的优先权，以引用的方式将其整体内容并入本文。
政府支持
本发明是美国国立卫生研究院授予的NCRR RR000168的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及针对神经肌肉障碍(neuromuscular disorders)的治疗(therapeutics)的领域。
背景技术
肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin)是一个细菌毒素家族，包括七个主要血清型(BoNT/A-G)1。这些毒素通过阻断由神经元释放神经递质而发挥作用，从而使动物和人麻痹。近年来，BoNT已被广泛用于治疗越来越多的医学病症：局部注射微量毒素可以在目标区域削弱神经元活性(neuronal activity)，这在许多医学病症中、以及对于美容目的而言可能是有益的2-4。
BoNT/A和BoNT/B是仅有的两种目前经FDA批准用于人的BoNT2-4。这些是从细菌纯化而来、未经任何序列修饰(定义为野生型，WT)的毒素。随着BoNT的应用不断增加，已报道了多种限制和副作用。主要限制是在患者中产生中和抗体，这使得随后的治疗无效化5。终止使用BoNT往往使患者缺少其它有效的治疗/减轻其障碍的途径。抗体应答的可能性与毒素剂量和注射频率二者直接相关5。因此，这种限制主要发生在涉及相对高剂量毒素的肌肉痉挛治疗中。与此相一致的是，在使用非常低剂量毒素的美容应用中尚未观察到抗体应答5。
主要的副作用也往往与治疗肌肉痉挛、而非美容应用相关。这是因为副作用主要是由毒素扩散至身体其它区域所致，并且毒素扩散的可能性与注射剂量直接相关。副作用的范围从短暂的非严重事件(如眼睑下垂和复视)直至危及生命的事件甚至死亡6,7。在由Sidney Wolfe博士于2008年向FDA提交的请求书中，记载了共180例严重不良事件，其中16人死亡。因此，目前FDA要求在所有BoNT产品上标注“黑框警告”，强调毒素蔓延的风险，这一要求是在欧盟颁布了类似警告后作出的。
由于中和抗体的产生和毒素扩散均与注射剂量直接相关，降低毒素剂量(同时保持相同水平的毒素活性)是高度期望的，这意味着必须增强单个毒素分子的效力。此类对于神经元具有改进的特异性的修饰BoNT也将减少任何潜在的由于非特异性进入其它细胞类型而致的脱靶效应。
BoNT通过其受体结合结构域结合至其特异性受体，从而靶向并进入神经元，其受体结合结构域在文献中已有明确界定(BoNT-HC，图1A，图1B)1。受体结合决定BoNT识别神经元的效力和特异性。提高BoNT的受体结合能力将增强其对于目标神经元的效力和特异性。大多数BoNT的受体已经得以识别(图1C)。作为其受体，BoNT/B、D-C和G共享两个同源的突触小泡蛋白突触结合蛋白I和突触结合蛋白II(Syt I/II)8-13，而BoNT/A、E、D和F使用另一个突触小泡蛋白SV29,14-18。除了蛋白受体以外，所有BoNT还需要脂质共受体(co-receptor)神经节苷脂(图1D)，其大量位于神经元表面19。在啮齿动物(以及可能地在大多数哺乳动物)中的两个Syt异形体(isoforms)中，Syt II对BoNT/B的结合亲和力比Syt I高～10倍，并且也是在运动神经末梢(BoNT的靶向神经元)中表达的主要异形体(图2A)20,21。因此，在啮齿动物(大多数研究均对其进行)中，认为Syt II是运动神经末梢中的主要毒素受体，Syt I则是次要毒素受体。
可能存在争论的是，BoNT对神经元已具有很高特异性，是否有可能进一步改善其与神经元的结合？对人而言，答案是“是”，这是因为最近发现人Syt II对于BoNT/B而言，作为受体的结合和功能均大大削弱，这是由于毒素结合位点中由啮齿动物(大鼠/小鼠)SytII发生了独特氨基酸改变13,22。这一改变是在第54位处(小鼠Syt II序列)由苯丙氨酸(F)变为亮氨酸(L)(图2B)。序列比对已经揭示了，在整个脊椎动物(包括鸭嘴兽、鱼、啮齿动物和猴)间，该位置处的苯丙氨酸在Syt I和Syt II中均是高度保守的23。只有人和黑猩猩的SytII在这一位置含有亮氨酸。作为这一残基改变的结果，相比于小鼠Syt II，人和黑猩猩的Syt II与BoNT/B、D-C和G的结合大幅降低(图2C)，并且在介导BoNT/B进入方面效率明显较低(图2D)。由于人和黑猩猩的Syt I在相同位置处仍然含有苯丙氨酸，并能结合BoNT/B、D-C和G(图2E)，人中的BoNT/B、D-C和G的高亲和力受体被限制为次要受体Syt I。这些发现为以下临床观察提供了解释：为在患者中达到相同的疗效水平，与BoNT/A(结合不同受体)相比，需要剂量大得多的BoNT/B24,25。这些观察先前被归结于其它原因(如所使用的制剂中活性神经毒素的百分比)。BoNT/B与人Syt II相对于BoNT/B与其它物种的Syt II的此类结合差异的近期观察表明，BoNT/B的不同残基可能参与和人Syt II的结合。因此，对BoNT/B进行的预期将影响与啮齿动物Syt II的结合的序列修饰可能对于BoNT/B与人Syt II的结合具有不可预知的影响。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种肉毒神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽包含蛋白酶结构域、蛋白酶切割位点、易位结构域(translocation domain)和修饰的肉毒杆菌(Clostridial botulinum)血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域包含对应于血清型B，菌株1(strain 1)中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、以及以上置换突变的组合。在一个实施方式中，所述修饰的(B-HC)包含两个置换突变。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、或E1191Q和S1199F。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199Y。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199F。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199L。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199Y。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199F。
本发明的另一方面涉及一种肉毒神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽包含蛋白酶结构域、蛋白酶切割位点、易位结构域和修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域在对应于血清型B，菌株1的S1199或S1201的位置处包含置换突变。在一个实施方式中，与缺少该置换突变的相同分子相比，该置换突变增强修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或削弱修饰的B-HC与人Syt I的结合。在一个实施方式中，与缺少该置换突变的相同分子相比，该置换突变增强修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或提高修饰的B-HC与人Syt I的结合。在一个实施方式中，所述置换突变选自于将S置换为A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y和V的组。在一个实施方式中，所述置换突变是将S置换为非天然存在的氨基酸。在一个实施方式中，所述修饰的B-HC为菌株1的B-HC。在一个实施方式中，所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自选自于由A、B、C、D、E、F、G以及它们的组合所组成的组中的血清型。在一个实施方式中，所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型B，菌株1。在一个实施方式中，所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型A，菌株1。
本发明的另一方面涉及一种多肽，所述多肽包含修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、以及以上置换突变的组合。在一个实施方式中，所述修饰的(B-HC)包含两个置换突变。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、或E1191Q和S1199F。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199Y。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199F。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199L。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199Y。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199F。
本发明的另一方面涉及一种多肽，所述多肽包含修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域在对应于血清型B，菌株1的S1199或S1201的位置处包含置换突变。在一个实施方式中，与缺少该置换突变的相同分子相比，该置换突变增强修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或削弱修饰的B-HC与人Syt I的结合。在一个实施方式中，与缺少该置换突变的相同分子相比，该置换突变增强修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或提高修饰的B-HC与人Syt I的结合。在一个实施方式中，所述置换突变选自于将S置换为A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y和V的组。在一个实施方式中，所述置换突变是将S置换为非天然存在的氨基酸。在一个实施方式中，所述修饰的B-HC为菌株1的B-HC。
本发明的另一方面涉及一种嵌合分子，所述嵌合分子包含第一部分和第二部分，所述第一部分是修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述第一部分连接至所述第二部分，其中，所述修饰的B-HC包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、以及以上置换突变的组合。在一个实施方式中，所述修饰的B-HC包含两个置换突变。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、或E1191Q和S1199F。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199Y。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199F。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199L。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199Y。在一个实施方式中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199F。在一个实施方式中，所述修饰的B-HC包含修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域在对应于血清型B，菌株1的S1199或S1201的位置处包含置换突变。在一个实施方式中，与缺少该置换突变的相同分子相比，该置换突变增强修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或削弱修饰的B-HC与人Syt I的结合。在一个实施方式中，与缺少该置换突变的相同分子相比，该置换突变增强修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或提高修饰的B-HC与人Syt I的结合。在一个实施方式中，所述置换突变选自于将S置换为A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y和V的组。在一个实施方式中，所述置换突变是将S置换为非天然存在的氨基酸。在一个实施方式中，所述修饰的B-HC为菌株1的B-HC。在一个实施方式中，所述第一部分和所述第二部分共价连接。在一个实施方式中，所述第一部分和所述第二部分非共价连接。在一个实施方式中，所述第二部分选自于由小分子、核酸、短多肽和蛋白质所组成的组。在一个实施方式中，所述第二部分是生物活性分子。在一个实施方式中，所述第二部分是治疗性多肽药物或治疗性非多肽药物。
本发明的另一方面涉及包含编码本文所述多肽或嵌合分子的核苷酸序列的核酸。
本发明的另一方面涉及包含本文所述核酸的核酸载体。
本发明的另一方面涉及包含本文所述核酸载体或本文所述核酸的细胞。
本发明的另一方面涉及表达本文所述多肽或嵌合分子的细胞。
本发明的另一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的肉毒神经毒素(BoNT)多肽、或本文所述的嵌合分子、或本文所述的核酸载体、或本文所述的核酸。在一个实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂(excipient)。
本发明的另一方面涉及试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的药物组合物；以及用于治疗性给予所述药物组合物的说明书(directions)。
本发明的另一方面涉及生产肉毒神经毒素(BoNT)多肽的方法，所述方法包括在生产所述BoNT多肽的条件下培养本文所述宿主细胞的步骤。在一个实施方式中，所述方法还包括从培养物中回收BoNT多肽。
本发明的另一方面涉及对与不希望的神经元活性相关的病症进行治疗的方法，所述方法包括向受试者给予治疗有效量的本文所述BoNT多肽，从而与一个或多个表现出不希望的神经元活性的神经元相接触，从而治疗所述病症。在一个实施方式中，所述病症选自于以下病症所组成的组：痉挛性发音障碍(dysphonia)、痉挛性斜颈、喉部肌张力障碍(dystonia)、口下颌(oromandibular)发音障碍、舌部肌张力障碍、颈部肌张力障碍、局限性手部肌张力障碍(focal hand dystonia)、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛(hemifacial spasm)、眼睑障碍(eyelid disorder)、脑性麻痹、局限性痉挛(focal spasticity)和其它语音障碍、痉挛性结肠炎、神经原性膀胱、盆底失弛缓(anismus)、四肢痉挛、抽搐(tics)、震颤(tremors)、磨牙症、肛裂、弛缓不能(achalasia)、吞咽困难和其它肌张力障碍、以及特征为肌肉群不自主运动的其它障碍、流泪、多汗症(hyperhydrosis)、过度流涎(excessivesalivation)、过度胃肠分泌(excessive gastrointestinal secretions)、分泌紊乱、肌肉痉挛痛、头痛、以及皮肤病病症或美学/美容病症(aesthetic/cosmetic conditions)。
本发明的另一方面涉及本文所述的肉毒神经毒素(BoNT)多肽、本文所述的药物组合物、本文所述的嵌合分子或本文所述的多肽中的任一种在医药(medicament)或药物(medicine)中的用途。
本发明的另一方面涉及本文所述的肉毒神经毒素(BoNT)多肽、本文所述的药物组合物、本文所述的嵌合分子或本文所述的多肽中的任一种在对与不希望的神经元活性相关的病症进行治疗中的用途。
附图说明
图1A-图1D示出了BoNT如何靶向神经元的示意性模型(A)、它们的整体蛋白结构(B)、识别的受体列表(C)、以及BoNT/B与其受体Syt和神经节苷脂结合的结构模型(D)。图1A)BoNT作用示意图：BoNT通过结合至其特异性受体来识别神经元(步骤1)；通过受体介导的胞吞作用进入神经元(步骤2)；随后BoNT轻链穿过内体(endosomal)膜易位到细胞质中(步骤3)；这些轻链在细胞质中充当裂解靶宿主蛋白质的蛋白酶(步骤4)。组图(panel)A修改自Arnon，S.等，JAMA，285:1059，200133。图1B)BoNT由通过二硫键相连的轻链和重链组成。重链可进一步分为两个结构域：易位结构域(HN)和受体结合结构域(HC)。这些功能结构域是定义明确的，且在不同BoNT间是可交换的(switchable)1。这表明修饰的BoNT/B-HC可用于替换BoNT/A-HC，以生成嵌合毒素。图1C)识别的毒素受体的列表。图1D)示出BoNT/B与其蛋白受体啮齿动物Syt(I/II)及其脂质共受体神经节苷脂在细胞表面上结合的结构模型。图1D修改自Chai等，Nature，444:1096，200631。
图2A-图2G示出了修改自已公开文献的在先数据，显示(1)人Syt II对于BoNT/B、D-C和G而言并非有效受体；(2)BoNT/B的受体结合结构域中的残基改变能显著改变与SytII的结合亲和力和毒素效力；(3)假设有助于结合Syt II的BoNT/B的受体结合结构域中的关键残基。图2A)啮齿动物Syt I和Syt II之间的比较表明，在啮齿动物的运动神经元中，Syt II是主要毒素受体，而Syt I是次要毒素受体。图2B)人Syt II相比小鼠/大鼠Syt II在毒素结合位点中有一个残基存在不同(小鼠Syt II中的残基54，人Syt II中的残基51)。图2C)将谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记的重组小鼠Syt II 1-87(m-Syt II)和模拟人Syt II(F54L，本文中称为h-Syt II)的小鼠Syt II 1-87突变体固定在谷胱甘肽-琼脂糖珠上，并用于在存在或不存在神经节苷脂(Gangl)的情况下对BoNT/B、BoNT/D-C或BoNT/G进行下拉(pull down)。在该下拉分析中，全部三种毒素均与m-Syt II 1-87结合，但不与h-Syt II结合。图2D)培养的大鼠海马神经元只表达Syt I，而不表达Syt II8。因此，敲减(knockingdown，KD)Syt I产生不含内源性毒素受体的神经元。随后在Syt I KD海马神经元中表达全长m-Syt II和h-Syt II，并使这些神经元暴露至BoNT/B(20nM，暴露5min，孵育24hr)。业已发现，如毒素底物小突触泡蛋白(synaptobrevin，Syb)的裂解程度所证实的，在介导BoNT/B、BoNT/D-C和BoNT/G进入Syt I KD神经元方面，h-Syt II与m-Syt II相比效率显著较低。图2E)如组图C所述，用大鼠Syt I 1-83和人Syt I 1-80对BoNT/B、BoNT/D-C和BoNT/G进行下拉。对于全部三种毒素而言，人Syt I介导了与大鼠Syt I类似的毒素结合水平。图2A至图2E修改自最近的公开文献：Peng等，J.Cell Science，2012，125:323313。图2F)通过使用BoNT/B1和B2的受体结合结构域(右侧组图)对重组Syt II上的125I标记的BoNT/B1的结合(左侧组图)进行竞争，在竞争分析中对BoNT/B(也定义为BoNT/B1)及其称为BoNT/B2的一个亚型(subtype)与大鼠Syt II的结合亲和力进行测定。IC50(其反映了结合亲和力)对于BoNT/B1为0.48nM，而对于BoNT/B2为2nM，差异为～4倍。这一亲和力差异是由受体结合结构域的C末端(残基1028-1291)所致，这是因为在BoNT/B1和BoNT/B2之间交换该区域(右侧组图)实际上也交换了它们的结合亲和力(右侧组图)。图2G)BoNT/B1和BoNT/B2之间不同残基的列表。认为这些残基是这两种毒素与啮齿动物Syt II之间的结合亲和力存在差异的原因。因此，这些残基可能是可影响BoNT/B与人Syt II之间的结合亲和力的关键残基。组图F-G改编自Ihara等，2003，BBA，1625:1929。图2H)如表中所指出的，BoNT/A和BoNT/B的受体结合结构域内的单个残基突变可以显著改变这些毒素的效力及毒性。这一组图改编自Rummel等，2004，Mol.Microbiology，51:63130。图2I)与Syt II(红色)结合的BoNT/B(灰色)的共晶结构揭示了形成BoNT/B中的结合袋的关键残基(在右表中列出)。这一组图改编自Jin等，2006，Nature，444:109232和Chai等，2006，Nature，444:109631。
图3A-图3B示出了BoNT/B-HC的靶向突变及其对与m-Syt II和h-Syt II结合的影响。图3A)WT BoNT/B-HC和标明的BoNT/B-HC突变体在大肠杆菌中表达为重组蛋白。收集细菌裂解物并与固定的m-Syt II(1-87)或h-Syt II(1-87)孵育。通过免疫印迹分析对结合的颗粒(pellets)进行分析，使用HA抗体对BoNT/B-HC进行检测。“输入”表示细菌裂解物。用箭头指示出显示出与h-Syt II强烈结合的突变体。图3B)图3A中测试的BoNT/B-HC突变体的分类表。
图4A-图4B示出了对所选定的BoNT/B-HC突变体与Syt I和Syt II的结合的进一步表征。图4A)在大肠杆菌中表达WT BoNT/B-HC和标明的突变体。在存在或不存在神经节苷脂的情况下，将收集的细菌裂解物与固定的GST标记的人Syt I(1-80)孵育。通过检测BoNT/B-HC的免疫印迹分析对结合的物质进行分析。与WT BoNT/B-HC相比，E1191M显著增强了BoNT/B-HC与人Syt I的结合，而V1118M削弱了与人Syt I的结合。图4B)将WT BoNT/B-HC和E1191M突变体纯化为His6标记的重组蛋白，并在存在或不存在脂质共受体神经节苷脂(Gangl)的情况下与固定的GST标记的m-Syt II(1-87)或h-Syt II(1-87)孵育。在无神经节苷脂时，BoNT/B-HC不能与h-Syt II结合；在存在神经节苷脂的情况下，仅显示出弱结合。纯化的E1191M突变体在无神经节苷脂时结合h-Syt II，并且该结合在存在神经节苷脂的情况下进一步增强。
图5A-图5B表明，与人Syt I/II的结合可通过组合所选定的单个残基置换而得以进一步增强。图5A)如图3A所述，在下拉分析中对组合了两个突变位点(如所标明的)的选定的双突变体结合m-Syt II和h-Syt II的能力进行了测试。E1191M或E1191Q与S1199L或S1199Y或S1199F的两个位点的组合(由箭头标记)显示出与h-Syt II的稳健(robust)结合。图5B)在下拉分析中对选定的双突变体与人Syt I的结合进行了分析。与WT BoNT/B-HC相比，全部双突变体均显示出与人Syt I显著增强的结合。
图6A-图6D示出对代表性双突变体E1191M/S1199Y的进一步表征。图6A)在大肠杆菌中表达WT BoNT/B-HC、E1191M和E1191M/S1199Y突变体，并纯化为His6标记的重组蛋白。在存在或不存在神经节苷脂(Gangl)的情况下，如所标明的，将等量的这些蛋白(100nM)与固定的GST标记的m-Syt II(1-87)或h-Syt II(1-87)孵育。对结合的物质进行免疫印迹分析。“输入”表示依照以下顺序的纯化重组蛋白：WT、E1191M、E1191M/S1199Y。在无神经节苷脂时，WT BoNT/B-HC不能与h-Syt II结合；在存在神经节苷脂的情况下，仅显示出弱结合(第4道、第5道)。E1191M突变体在无神经节苷脂时结合h-Syt II，并且该结合在存在神经节苷脂的情况下进一步增强(第6道、第7道)。与E1191M相比，E1191M/S1199Y显著增强了与h-Syt II的结合(第8道、第9道)。和WT BoNT/B-HC与m-Syt II的结合(第12道、第13道)相比，E1191M/S1199Y与h-Syt II的结合(第8道、第9道)和与m-Syt II的结合(第10道、第11道)处于类似水平。图6B)使等量的WT BoNT/B-HC、E1191M和E1191M/S1199Y突变体与GST标记的h-Syt I孵育。对结合的物质进行免疫印迹分析。与WT BoNT/B-HC相比，E1191M和E1191M/S1199Y二者均显著增强了与h-Syt I的结合。图6C)如所标明的，使滴定浓度(nM)的纯化WTBoNT/B-HC与m-Syt II孵育，而使滴定浓度的纯化E1191M/S1199Y与h-Syt II孵育。对结合的物质进行免疫印迹分析。和WT BoNT/B-HC与m-Syt II的结合相比，E1191M/S1199Y与h-Syt II的结合处于类似水平。图6D)基于对组图C中获得的免疫印迹结果进行的定量，对E1191M/S1199Y与h-Syt II之间的结合亲和力进行了估算。估计E1191M/S1199Y结合h-SytII的Kd为19±3nM，而WT BoNT/B结合m-Syt II的Kd为68±12nM。因此，E1191M/S1199Y与h-Syt II之间的结合是WT BoNT/B与m-Syt II之间的结合的～3.5倍。
图7示出BoNT/B-HC E1191M/S1199Y突变体可以与神经元表面表达的h-Syt II结合。培养的大鼠海马神经元仅表达Syt I，而不表达Syt II。因此，通过慢病毒感染敲减(KD)Syt I表达产生了不具有任何内源性Syt、并且消除了WT BoNT/B-HC和E1191M/S1199YBoNT/B-HC的结合的神经元(左侧第二张框图)。随后经由慢病毒感染使得m-Syt II、m-SytII(F54L)和h-Syt II在这些神经元中表达。WT BoNT/B-HC可以与m-Syt II结合，但不能与m-Syt II(F54L)或h-Syt II结合。E1191M/S1199Y突变体可以与神经元表面上的m-Syt II和h-Syt II均结合。也将突触蛋白标记为突触的标记物。
图8是BoNT/B-HC的氨基酸序列(菌株1；BoNT/B1Okra株)。BoNT/B的857-1291位残基，菌株1，GenBank：AB232927.1(SEQ ID NO：1)。
图9是编码BoNT/B-HC(菌株B1，Okra株)的核酸序列(BoNT/B的857-1291位残基，菌株1，基于GenBank：AB232927.1)，其已经为在大肠杆菌中表达而进行了优化。所述核酸序列示于SEQ ID NO：2中。
图10示出了肉毒杆菌血清型A的氨基酸序列(1296a.a.)(SEQ ID NO：3)。
图11示出了肉毒杆菌血清型B的氨基酸序列(1291a.a.)(SEQ ID NO：4)。
图12示出了肉毒杆菌血清型C1的氨基酸序列(1291a.a.)(SEQ ID NO：5)。
图13示出了肉毒杆菌血清型D的氨基酸序列(1276a.a.)(SEQ ID NO：6)。
图14示出了肉毒杆菌血清型E的氨基酸序列(1252a.a.)(SEQ ID NO：7)。
图15示出了肉毒杆菌血清型F的氨基酸序列(1274a.a.)(SEQ ID NO：8)。
图16示出了肉毒杆菌血清型G的氨基酸序列(1297a.a.)(SEQ ID NO：9)。
具体实施方式
本发明的各方面涉及通过引入修饰的受体结合结构域来产生肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽与其人受体的结合得到改善。从这些发现出发，可通过利用本文鉴定的修饰的受体结合结构域来制造新一代治疗性BoNT，与目前利用的WT BoNT相比，所述新一代治疗性BoNT具有改善的靶向人神经元的效力和特异性。
定义
本文所使用的术语“结合亲和力”是指分子对于特定受体体系的结合活性强弱。一般而言，高结合亲和力来自结合结构域与其受体体系之间较大的分子间作用力，而低结合亲和力涉及配体与其受体之间较小的分子间作用力。相比低结合亲和力的情况而言，高结合亲和力涉及在其受体结合位点处对于结合结构域较长的滞留时间(residence time)。从而，具有高结合亲和力的分子意味着需要较低浓度的该分子来最大限度地占据受体体系的结合位点并触发生理应答。相反，低结合亲和力是指需要相对高的分子浓度才能最大限度地占据受体体系的受体结合位点并获得最大程度的生理应答。因此，本发明的由于高结合亲和力而具有提高的结合活性的肉毒神经毒素将允许给予降低剂量的毒素，从而减少或防止与毒素扩散入非目标区域相关的不希望的副作用。
当用于描述本发明肉毒杆菌神经毒素分子对特定受体的结合亲和力时，本文所使用的术语“显著增强的结合”是指与未置换版本的分子相比，对特定受体的结合亲和力实质上提高(例如，提高野生型分子结合亲和力的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在一个实施方式中，所述增强的结合比未置换的神经毒素(例如，具有天然存在的BoNT HC分子的神经毒素)的Kd高一个数量级或更高。当用于描述本文所述的由点突变产生的BoNT/B-HC结合片段的结合亲和力时，术语“显著增强的结合”是指与未置换版本的分子的结合相比，修饰的结合结构域(表达为整个BoNT蛋白的分离片段)与特定受体的结合亲和力实质上提高(例如，提高结合亲和力的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在一个实施方式中，所述增强的结合比未置换的片段的Kd显著更高(例如，1.5×、2.0×、2.5×、3.0×等)。
本文所使用的术语“肉毒神经毒素”是指可以执行“肉毒杆菌毒素进入神经元并抑制神经递质释放”这一总的细胞机制的任何多肽，并涉及肉毒杆菌毒素结合至低亲和力的受体复合物或高亲和力的受体复合物、毒素内化(internalization)、毒素轻链易位进入细胞质和对肉毒杆菌毒素底物的酶修饰。
本文所使用的术语“修饰的受体结合结构域”或“修饰的HC”有利于肉毒杆菌神经毒素分子(包含该“修饰的受体结合结构域”或“修饰的HC”)结合至位于靶细胞表面上的肉毒杆菌神经毒素受体。该分子通常通过基因重组技术产生。修饰的HC对位于靶细胞表面上的肉毒杆菌神经毒素受体具有结合活性。本文所使用的术语“结合活性”是指一个分子经由至少一种分子间或分子内作用力直接或间接地与另一分子相接触，所述分子间或分子内作用力包括但不限于：共价键、离子键、金属键、氢键、疏水相互作用、范德华相互作用等，或上述作用力的任意组合。“结合(bound/bind)”被认为是关于结合(binding)的术语。
本文所使用的术语“肉毒杆菌毒素的蛋白酶结构域”是指可执行中毒过程(intoxication process)的酶促靶修饰步骤的肉毒杆菌毒素结构域。因此，肉毒杆菌毒素的蛋白酶结构域特异性靶向肉毒杆菌毒素底物，并涉及对肉毒杆菌毒素底物(如，例如SNARE蛋白如SNAP-25底物、VAMP底物和突触融合蛋白底物)的蛋白水解切割。
表1和表2中提供了肉毒杆菌毒素的蛋白酶结构域的非限制性实例。
本文所使用的术语“肉毒杆菌毒素的易位结构域”或“HN”是指可执行中毒过程的易位步骤(介导肉毒杆菌毒素的轻链易位)的肉毒杆菌毒素结构域。因此，HN促进肉毒杆菌毒素轻链移动跨膜，并涉及肉毒杆菌毒素轻链经由细胞内囊泡的膜移动进入细胞的细胞质中。HN的非限制性实例包括BoNT/A HN、BoNT/B HN、BoNT/C1HN、BoNT/D HN、BoNT/E HN、BoNT/FHN和BoNT/G HN，表1和图10-图16中提供了上述HN的氨基酸序列。
本文所使用的术语“肉毒杆菌毒素的受体结合结构域”与“HC结构域”含义相同，是指可以执行中毒过程的细胞结合步骤的任何天然存在的肉毒杆菌毒素的受体结合结构域，所述结合步骤包括例如肉毒杆菌毒素结合至位于靶细胞质膜表面上的肉毒杆菌毒素特异性受体体系。设想可通过例如以修饰的(例如，增强的)HC结构域替换整个肉毒杆菌HC结构域，来实现对结合活性的替换。
本文所使用的术语“肉毒杆菌毒素的靶细胞”是指天然存在的肉毒杆菌毒素可使其中毒的天然存在的细胞，所述细胞包括但不限于：运动神经元；感觉神经元；自主神经元；如，例如交感神经的神经元和副交感神经的神经元；非肽能神经元，如，例如胆碱能神经元、肾上腺素能神经元、去甲肾上腺素能神经元、血清素能神经元、GABA能神经元；以及肽能神经元，如，例如P物质神经元、降钙素基因相关肽神经元、血管活性肠肽神经元、神经肽Y神经元、胆囊收缩素神经元。
“分离的(isolated)”是指对于在天然状态下通常与其相伴的组分具有不同游离度的物质。“分离(isolate)”表示与原始来源或环境的分隔(separation)度，例如与侧翼DNA或与该DNA的天然来源的分隔度。
术语“纯化的”用于指物质(如多肽)相对于制剂的其它组分(例如，其它多肽)而言是“基本上纯的”。它可以指多肽相对于其它组分而言是至少约50％、60％、70％、或75％，优选至少约85％，更优选至少约90％，并且最优选至少约95％纯的。再者，术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”对于多肽而言是指制剂含有低于约20％，更优选低于约15％、10％、8％、7％，最优选低于约5％、4％、3％、2％、1％，或低于1％的一种或多种其它组分(例如，其它多肽或细胞组分)。
本文所使用的术语“保守的”或“保守置换突变”是指一个氨基酸被置换为另一具有相似性质的氨基酸的突变，从而肽化学领域的技术人员将预期到所述多肽的二级结构、化学性质和/或亲水性基本不变。以下氨基酸组已在历史上作为保守改变而相互进行置换：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、try、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。其它普遍认可的保守置换列于下方：
| 残基 | 保守置换 | 残基 | 保守置换 |
| Ala | Ser | Leu | Ile；Val |
| Arg | Lys | Lys | Arg；Gln |
| Asn | Gln；His | Met | Leu；Ile |
| Asp | Glu | Phe | Met；Leu；Tyr |
| Gln | Asn | Ser | Thr；Gly |
| Cys | Ser | Thr | Ser；Val |
| Glu | Asp | Trp | Tyr |
| Gly | Pro | Tyr | Trp；Phe |
| His | Asn；Gln | Val | Ile；Leu |
| Ile | Leu，Val |
不涉及特定氨基酸，术语“置换突变”可包括并非通常位于该位置处的野生型残基的任何氨基酸。此类置换可以是以非极性(疏水性)氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸)进行替换。置换可以是以极性(亲水性)氨基酸(如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)进行替换。置换可以是以带电氨基酸(如带负电荷的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；以及带正电荷的氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)进行替换。
本文所述的置换突变通常是以不同的天然存在的氨基酸残基进行替换，但在某些情况下，也可使用非天然存在的氨基酸残基进行替换。本文所使用的术语非天然氨基酸是指天然存在的或化学合成的非蛋白原(non-proteinogenic)(即非蛋白编码)的氨基酸。实例包括但不限于：β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸(homo-amino acid)、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线性核氨基酸(linear core amino acid)、二氨基酸、D-氨基酸和N-甲基氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸可以是取代的或未取代的。取代的氨基酸或取代基可以是卤代芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸；疏水性侧链上的卤代脂肪族修饰或芳香族修饰；或脂肪族修饰或芳香族修饰。
术语“治疗有效量”是指当给予患有病症的典型受试者时，足以使所述病症的一种或多种症状产生治疗上显著降低的量。症状的治疗上显著降低是指相比对照或未治疗受试者而言为例如约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％或更多。
术语“治疗”(treat/treatment)是指治疗性处理，其目的是消除或减轻症状。有益的或期望的临床结果包括但不限于：消除症状、缓解症状、减轻病症程度、稳定(即，不恶化)病症状态、延迟或减缓病症进展。
本文所使用的“受试者”是指人或动物。通常，所述动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物(game animal)。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭(woodchucks)、雪貂(ferrets)、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括牛(cows)、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(如家猫)、犬科动物(如狗、狐狸、狼)、鸟类(如鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟)以及鱼(例如鳟鱼(trout)、鲶鱼和鲑鱼)。患者或受试者包括前述受试者的任何子集，例如除了一个或多个组或物种(例如人、灵长类动物或啮齿动物)以外的全部前述受试者。在本文所述各方面的某些实施方式中，受试者是哺乳动物(例如灵长类动物，例如人)。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可以是雄性或雌性。受试者可以是完全发育的受试者(例如成人)或正经历发育过程的受试者(例如儿童、婴儿或胎儿)。
优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或者牛，但是并不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表与不希望的神经元活性有关的病症的动物模型的受试者。此外，本文描述的方法和组合物可用于对家养动物和/或宠物进行治疗。
实施方式
“BoNT/B因不能结合人Syt II而在人中具有较低的特异性和效力”的这一观测结果可以解释为何需要比BoNT/A相对更高的剂量。更高的BoNT/B剂量对应于触发抗体应答和发生严重副作用的几率升高。因此，改善BoNT/B与人受体Syt II的结合，以提高其靶向人神经元的效力和特异性应当允许在治疗性应用中降低所使用的毒素剂量的量。
本发明的各个方面源自以下发现：对BoNT/B-HC的蛋白序列进行修饰改变了含有该受体结合结构域的片段与人Syt II受体的结合。已经鉴定了增强结合、从而产生以高亲和力结合人Syt II的结构域的特定修饰。当在全长BoNT蛋白的情况下时，修饰的BoNT/B-HC保留了这些结合性质。将具有增强的结合的修饰的受体结合结构域并入包含其它BoNT结构域的分子，从而产生具有类似的增强的受体结合的全长BoNT分子。从而，产生了以高亲和力结合至人Syt II的新版本BoNT。具有显著增强的结合的BoNT可用于类似治疗中，但比目前可用的BoNT分子剂量更低，因此提供了更安全的治疗方法。
包括本文所述全长BoNT多肽和BoNT多肽片段或结构域在内的BoNT多肽、以及对其进行编码的核酸分子均明确地包括在本发明中。这些多肽和核酸分子可通过本领域中已知的重组DNA方法产生。此类多肽或核酸分子通常被称为“重组多肽”或“重组核酸”。
BoNT具有图1B中所示的整体结构。BoNT由三个结构域组成，每一结构域具有特定和独立的功能：蛋白酶结构域(也被称为轻链)、易位结构域(HN)和受体结合结构域(HC)。肉毒杆菌神经毒素的各种菌株的结构域已显示出可在很大程度上互换(如美国专利8,052,979中的天然存在的嵌合毒素(如BoNT/CD)所证实的，其由BoNT/C的轻链和HN、以及BoNT/D的HC组成34)。该蛋白可以是单链形式或双链形式。双链形式是由天然存在的蛋白酶对位于蛋白酶结构域和易位结构域之间的蛋白酶切割位点进行加工所致。在蛋白酶加工后，该蛋白通过二硫键的存在而维持为双链形式。
本发明的一个方面涉及一种肉毒神经毒素(BoNT)，所述肉毒神经毒素包含蛋白酶结构域、易位结构域、和本文所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域、以及蛋白酶切割位点。通常，这些区域以如下的氨基至羧基的单个多肽的线性顺序排列：蛋白酶结构域、蛋白酶切割位点、易位结构域和修饰的受体结合结构域。然而，可预期各个结构域以不同排列来适当运作。在一个实施方式中，修饰的受体结合结构域包含一个或多个置换突变，导致与人Syt I受体和/或人Syt II受体的结合显著增强。
肉毒杆菌菌株产生七种不同抗原类型(antigenically-distinct types)的肉毒杆菌毒素(BoNT)，这些毒素已在对人(BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E和BoNT/F)、动物(BoNT/C1和BoNT/D)的肉毒杆菌中毒(botulism)爆发进行研究时得以鉴定，或已从土壤中分离(BoNT/G)。虽然全部七种BoNT血清型具有相似的结构和药理学特性，然而其中每一种还显示出多样化的细菌学特征。肉毒杆菌菌株的遗传多样性在Hill等(Journal of Bacteriology，第189卷，第3期，第818-832页(2007))中详述35，以引用的方式将其内容并入本文。
来自各种肉毒杆菌菌株的毒素享有相同的功能结构域组织和整体结构构造。肉毒杆菌毒素各自被翻译为约150kDa的单链多肽，随后在二硫环(disulfide loop)中由天然存在的蛋白酶(如，例如内源性肉毒杆菌毒素蛋白酶或环境中产生的天然存在的蛋白酶)通过蛋白水解裂解而被切割。这一翻译后加工产生由单个二硫键和非共价相互作用保持在一起的双链分子，其包含约50kDa的轻链(LC)和约100kDa的重链(HC)。每个成熟的双链分子包含三个功能上不同的结构域：1)位于LC中的蛋白水解结构域，其包含含有锌依赖性内肽酶(endopeptidase)活性的金属蛋白酶区域，所述区域特异性地靶向神经递质释放器的核心组件；2)包含于HC氨基末端半区(HN)的易位结构域，其促进LC由细胞内囊泡释放入靶细胞的细胞质中；以及3)在HC羧基末端半区发现的结合结构域，其决定毒素与位于靶细胞表面的受体复合物的结合活性和结合特异性。表1中提供了毒素中特定结构域的位置：
表1
来自不同菌株的肉毒杆菌毒素的结构域
图10-图16中提供了所述毒素的完整氨基酸序列。
这三个功能结构域的结合活性、易位活性和蛋白酶活性对于毒性而言均是必需的。无论是何种血清型或亚型，整个细胞中毒机制(其中，肉毒杆菌毒素进入神经元并抑制神经递质释放)是相似的。不希望受理论束缚，该中毒机制包括至少四个步骤：1)受体结合；2)复合物内化；3)轻链易位；以及4)蛋白酶靶向修饰。当肉毒杆菌毒素的HC结构域结合至位于靶细胞质膜表面上的毒素特异性受体时，该过程起始。认为受体复合物的结合特异性部分地通过神经节苷脂和蛋白受体的特定组合而实现。一旦结合，毒素/受体复合物通过胞吞作用内化，并且内化的囊泡被分选(sorted)至特定细胞内途径。易位步骤由囊泡区室的酸化触发。一旦易位，毒素的轻链内肽酶由细胞内囊泡释放到细胞质中，其在细胞质中特异性靶向已知为神经递质释放器的核心组件的三种蛋白(囊泡相关膜蛋白(VAMP)/小突触泡蛋白、25kDa的突触体相关蛋白(SNAP-25)和突触融合蛋白)中的一种。这些核心组件对于突触小泡在神经末梢处对接(docking)并融合是必需的，并构成可溶性N-乙基马来酰亚胺-敏感因子-附着蛋白-受体(SNARE)家族的成员。BoNT/A和BoNT/E在羧基末端区中切割SNAP-25，分别释放出9或26个氨基酸的区段，BoNT/C1也在羧基末端附近切割SNAP-25。肉毒血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风毒素作用于VAMP的保守中央部分，并将VAMP的氨基末端部分释放入细胞质。BoNT/C1在胞质质膜表面附近的单个位点处切割突触融合蛋白。突触SNARE的选择性蛋白水解正是肉毒杆菌毒素在体内阻断神经递质释放的原因。肉毒杆菌毒素的SNARE靶蛋白在各种非神经元类型中对于胞吐作用很普遍；在这些细胞中，如在神经元中，轻链肽酶活性抑制胞吐作用，参见例如，Yann Humeau等，How Botulinum andTetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release，82(5)Biochimie.427-446(2000)；Kathryn Turton等，Botulinum and Tetanus Neurotoxins:Structure，Functionand Therapeutic Utility，27(11)Trends Biochem.Sci.552-558.(2002)；GiovannaLalli等，The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons，11(9)Trends Microbiol.431-437(2003)。
本发明的肉毒神经毒素包含修饰的受体结合结构域。所述修饰的受体结合结构域表现出与通常由一种或多种肉毒杆菌毒素菌株结合并利用的一种或多种人受体的显著增强的结合。本文提供了特定的修饰的受体结合结构域的实例。本文所述的分离的修饰的受体结合结构域多肽与对其进行编码的分离的核酸分子一样，也包括在本发明中。
本发明的肉毒神经毒素还包含蛋白酶结构域，本领域也称为轻链变体(variant)。轻链变体可以是天然存在的轻链变体，如，例如肉毒杆菌毒素的轻链异形体和肉毒杆菌毒素的轻链亚型；或者非天然存在的肉毒杆菌毒素的轻链变体，如，例如保守置换的肉毒杆菌毒素的轻链变体。
本发明的肉毒神经毒素还包含毒素易位结构域(HN)。
本文所述的各种结构域(例如HN、HC或蛋白酶结构域)包括但不限于：天然存在的变体，如，例如异形体和亚型；非天然存在的变体，如，例如保守置换突变体。非天然存在的变体是指与参比序列的相应区域(例如，表1或图10-图16)相比具有至少一个氨基酸变化、并可以使用相对于该参比序列的相应区域的一致性(identity)百分比来描述的结构域。
本领域技术人员公认的是，在肉毒杆菌毒素的各血清型中，可具有氨基酸序列(以及编码这些蛋白质的核酸)有所不同的天然存在的肉毒杆菌结构域变体。设想用于产生本发明的BoNT的天然存在的肉毒杆菌毒素的结构域(例如轻链、HN或HC)变体可以是以与参比肉毒杆菌毒素结构域(天然存在的肉毒杆菌结构域变体以此为基础)基本相同的方式起作用，并且可在本发明的任何方面替代所述参比肉毒杆菌毒素结构域。
天然存在的肉毒杆菌毒素结构域变体的非限制性实例是肉毒杆菌毒素结构域异形体，如，例如BoNT/A结构域异形体、BoNT/B结构域异形体、BoNT/C1结构域异形体、BoNT/D结构域异形体、BoNT/E结构域异形体、BoNT/F结构域异形体和BoNT/G结构域异形体。肉毒杆菌毒素结构域异形体可以是以与参比肉毒杆菌毒素结构域(肉毒杆菌毒素结构域异形体以此为基础)基本相同的方式起作用，并且可在本发明的任何方面替代所述参比肉毒杆菌毒素结构域。
天然存在的肉毒杆菌毒素结构域变体的另一非限制性实例是肉毒杆菌毒素结构域亚型，如，例如来自以下亚型的结构域：BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4、BoNT/A5；来自以下亚型的结构域：BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7；来自以下亚型的结构域：BoNT/C1-1、BoNT/C1-2、BoNT/D-C；来自以下亚型的结构域：BoNT/E1、BoNT/E2、BoNT/E3、BoNT/E4、BoNT/E5、BoNT/E6、BoNT/E7、BoNT/E8；以及来自以下亚型的结构域：BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4、BoNT/F5、BoNT/F6、BoNT/F7。肉毒杆菌毒素结构域亚型可以是以与参比肉毒杆菌毒素结构域(肉毒杆菌毒素结构域亚型以此为基础)基本相同的方式起作用，并且可在本发明的任何方面替代所述参比肉毒杆菌毒素结构域。
本文所使用的术语“非天然存在的变体”(例如，肉毒杆菌毒素的轻链变体、HC和HN)指借助人为操作产生的肉毒杆菌结构域，包括但不限于用随机诱变或合理设计进行基因工程而产生的结构域和通过化学合成产生的肉毒杆菌结构域。非天然存在的肉毒杆菌结构域变体的非限制性实例包括例如保守的肉毒杆菌结构域变体。本文所使用的术语“保守的肉毒杆菌结构域变体”是指至少一个氨基酸被另一氨基酸或氨基酸类似物置换的肉毒杆菌结构域，所述另一氨基酸或氨基酸类似物的至少一种性质类似于来自参比肉毒杆菌结构域序列的原始氨基酸(例如，表1和图10-图16)。与参比结构域序列相比，该变体可以具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个保守氨基酸置换。所述性质的实例包括但不限于：类似的大小、形态(topography)、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键合能力、氢键键合能力、理化性质等，或者以上性质的任意组合。保守的肉毒杆菌结构域变体可以是以与参比肉毒杆菌毒素结构域(保守的肉毒杆菌毒素结构域变体以此为基础)基本相同的方式起作用，并且可在本发明的任何方面替代所述参比肉毒杆菌结构域。
非天然存在的肉毒杆菌毒素结构域变体可由参比肉毒杆菌毒素结构域(天然存在的肉毒杆菌毒素结构域以此为基础)置换一个或多个氨基酸(例如一个、两个、三个、四个、五个或更多个)。非天然存在的肉毒杆菌毒素结构域变体还可相对于参比肉毒杆菌毒素结构域(天然存在的肉毒杆菌结构域变体以此为基础)而言具有95％以上(例如，96％、97％、98％或99％)的氨基酸一致性。
各种非天然存在的肉毒杆菌神经毒素或其特定结构域在国际专利公开WO95/32738、WO96/33273、WO98/07864和WO99/17806中有描述，以引用的方式将以上每一文献并入本文。
本文所述的肉毒杆菌神经毒素或其特定结构域一般含有天然存在的氨基酸残基，但在某些情况下也可具有非天然存在的氨基酸残基。因此，所谓的“肽模拟物”和“肽类似物”也可用于本发明的上下文中，所述肽模拟物和肽类似物可包含模拟特定氨基酸或肽的结构的非氨基酸化学结构。此类模拟物或类似物的特征通常为表现出相似的物理特性(例如大小、电荷或疏水性)以及在其天然肽对应物(counterparts)中发现的合适空间取向。如本领域所熟知的，肽模拟物化合物的一个具体实例是其中的一个或多个氨基酸之间的酰胺键被替换为例如碳-碳键或其它非酰胺键的化合物(参见例如Sawyer，Peptide Based DrugDesign，378-422页，ACS，Washington D.C.1995)。
在本发明的一个方面中，本发明的肉毒神经毒素(BoNT)包含修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(BoNT/B-HC)。该修饰的BoNT/B-HC包含一个或多个置换突变，所述置换突变使得对人Syt I受体和/或人Syt II受体的结合显著增强。在一个实施方式中，所述BoNT/B-HC来自BoNT/B1(GenBank登录号：AB232927.1)。本发明中用作参比模板的BoNT/B1-HC Okra菌株的氨基酸序列示于图8。还设想了通过置换对应于如本文所述B1中特定位置的氨基酸而由其它菌株产生B-HC。本发明还包括本文所述分离的、纯化的修饰的受体结合结构域多肽。本发明还包括包含本文所述修饰的受体结合结构域的多肽。本发明还包括编码该多肽的核酸分子。在一个实施方式中，所述修饰的受体结合结构域是BoNT/B-HC(例如，来自BoNT/B1)。
BoNT/B-HC蛋白序列的修饰可以通过靶向诱变(定点突变)或随机诱变已知用于结合Syt I/II的区域内的各氨基酸残基来进行。这些Syt结合区域已由涉及小鼠或大鼠Syt受体的在先研究得以充分界定1,29,3631,32，但尚未明确确定BoNT/B-HC与人Syt受体之间的相互作用。可将BoNT/B的不同亚型用作模板，以通过生成对应于本文所述B1-HC的突变体来产生相同或类似的突变体。通过与B1亚型进行序列比对，可容易地确定所选定的待进行突变的残基的相应位置。本发明包括所得的多肽产物，也包括包含所述产物的多肽以及编码所述多肽和所述产物的核酸分子。
产生修饰的受体结合结构域的氨基酸序列修饰可以是单个残基突变为不同的氨基酸(单位点置换)、多个残基同时突变(多位点置换)、一个或多个残基的删除(删除)、以及一个或多个残基的插入(插入)，以及上述修饰的组合。使蛋白发生突变的方法是本领域公知的(例如，在编码BoNT/B-HC序列的DNA上进行靶向单位点和多位点置换)。
在一个实施方式中，对BoNT/B-HC中接触啮齿动物Syt II或周围区域(基于BoNT/B受体结合结构域的相关在先文献29以及所报道的BoNT/B-Syt II结构(PDB ID：2NM1)31,32)的一个或多个残基进行修饰。这些残基包括但不限于对应于以下位置的位置处的残基：BoNT/B-B1的Y1181、P1197、A1196、F1204、F1194、P1117、W1178、Y1183、V1118、S1116、K1113、K1192、S1199、S1201、E1191、E1245、Y1256。在一个实施方式中，将这些残基中的一个或多个修饰为疏水性氨基酸(例如，V、I、L、M、F、W、C)。在一个实施方式中，将这些残基中的一个或多个修饰为疏水性较弱的氨基酸(例如，A、Y、H、T、S、P、Q、N和G)。还设想了各种修饰的组合，包括但不限于：两个以上的上述位置突变为任何种类的本文所述各种氨基酸。
在一个实施方式中，所述BoNT/B-HC具有一个或多个置换突变(例如，在对应于下列位置的位置处：B1的E1191、S1199、S1201、V1118、P1117、Y1183、A1196和Y1181)，与WTBoNT/B-HC相比，所述置换突变增强了与人Syt II的结合。在一个实施方式中，所述突变包含对应于以下突变的一种或多种突变：B1的E1191M/I/T/L/Q(E1191M、E1191I、E1191T、E1191L或E1191Q)、V1118M、S1199Y/L/F(S1199Y、S1199L或S1199F)、S1201V、P1117S/M/Y(P1117S、P1117M或P1117Y)、Y1183M、Y1181M、A1196Y，或以上突变的组合(图3A，图3B)。所述突变合适地选自于位置1118、1191和1199或它们的组合处的上述突变。特别地，选自于V1118M、E1191M/Q/I和S1199Y中的一个或多个突变可能是有益的。更特别地，设想了对应于B1的位置E1191M或E1191Q的突变，这是因为它们显示出与h-Syt II的结合增强最强。与WTBoNT/B-HC相比，对应于B1的E1191M或E1191Q的突变也显著增强了BoNT/B-HC与人Syt I的结合(图4A)。在一个实施方式中，所述BoNT/B-HC具有两个置换突变。
也可通过组合这些确定的关键残基中的突变而产生多位点置换。此类多位点置换突变已经进一步增强了与人Syt I和h-Syt II的结合(图5)。作为非限制性实例，组合两个单位点置换的突变(如对应于B1的E1191M或E1191Q与S1199L、S1199Y或S1199F的突变)显示出与人Syt I和h-Syt II二者的结合均显著增强(图5)。由于仅在1199位置处进行突变所达到的结合活性仅相对适度增强，这一结合强度的增强是出人意料的。
在一个实施方式中，设想了对应于BoNT/B-B1的位置E1191、S1199、S1201、V1118、P1117、A1196、Y1181和Y1183的残基的置换，这是由于它将产生与人Syt II的结合增强的BoNT/B-HC突变体。在包括但不限于对应于B1的E1191、S1199、S1201、V1118、P1117、Y1181、Y1183和A1196的位置处的其它组合置换产生与人Syt II的结合增强的BoNT/B-HC突变体。
因此，本发明包括包含BoNT/B-HC的多肽，所述BoNT/B-HC相对于WT BoNT/B-HC的序列具有修饰的氨基酸序列，其中，与WT BoNT/B-HC相比，所述修饰的BoNT/B-HC与人Syt I和II的结合显著增强。本发明还包括编码此类多肽的核酸分子。在优选的实施方式中，所述修饰的BoNT/B-HC突变体在对应于B1的V1118、E1191、S1199、S1201、P1117、Y1181、Y1183和A1196的氨基酸残基中的一者或它们的组合处含有氨基酸置换。在一个实施方式中，这些修饰包括对应于B1的E1191M或E1191Q与S1199L、S1199Y或S1199F的组合的突变。
本发明还包括突变的全长BoNT/B，所述突变的全长BoNT/B包含与上述B-HC中相同的氨基酸置换，用于人中的治疗应用。在优选的实施方式中，该全长BoNT/B突变体在对应于B1的位置E1191、V1118、S1199、S1201、P1117、Y1181、Y1183和A1196的氨基酸残基中的一者或它们的组合处含有氨基酸置换。在一个实施方式中，所述修饰包括E1191M或E1191Q与S1199L、S1199Y或S1199F的组合。可将BoNT/B的任一亚型用作模板，以与上文所公开的用于BoNT/B-HC的相同方式制备突变体。这些突变的BoNT/B毒素具有与人Syt II和人Syt I二者显著增强的结合，因此将获得比WT BoNT/B更高的靶向人神经元的效力和特异性。
毒素扩散和中和抗体的产生并不限于BoNT/B，也在BoNT/A中观测到，这表明BoNT/A与其受体SV2的结合亲和力也需要改进。由于BoNT/B与Syt I/II的结合相比BoNT/A与SV2的结合而言具有高得多的亲和力14,20,26,27，因此还可用具有结合人Syt II能力的修饰的BoNT/B受体结合结构域(BoNT/B-HC)来替换BoNT/A-HC，以产生修饰的嵌合BoNT/A，其对于人神经元的效力和特异性比WT BoNT/A更高28,29,30。
进一步设想了，上述修饰的BoNT/B-HC可用于替换全部其它BoNT的HC。每一BoNT的HC区域均已充分确定，并且它们的替换可经由编码BoNT/B-HC的DNA与其它BoNT的HN-LC的标准PCR融合来进行，这一技术是本领域已充分建立的。此外，这些替换也可使用BoNT/B-HC的C末端部分(指定为HCC)进行，所述HCC是各BoNT中含有针对蛋白受体和神经节苷脂的结合位点的区域。所得到的嵌合毒素将具有通过结合至人Syt I/II来靶向人神经元的能力。作为非限制性实例，修饰的BoNT/B-HC可用于替换BoNT/A的HC。所得到的多肽包括在本发明内。这些嵌合毒素将比WT BoNT/A具有更高的靶向人神经元的效力和特异性。该嵌合BoNT/A毒素可用于人中的治疗应用，并提供相对于WT BoNT/A而言的显著改善。
本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码本文所述多肽(例如，本文所述的修饰的受体结合结构域或包含所述修饰的受体结合结构域的肉毒神经毒素)的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述核酸分子包含图9中所示的核酸序列。此类核酸分子可通过重组DNA技术产生。
本发明的另一方面涉及包含本文所述核酸分子的核酸载体。在一个实施方式中，所述载体是表达载体。该表达载体在本文中被称为表达构建体，并包含本文所公开的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至该表达载体，所述表达载体用于在细胞或无细胞提取物中表达所述核酸分子。可将各种表达载体用于表达本发明的编码肉毒杆菌神经毒素的核酸分子，所述表达载体包括但不限于：病毒表达载体；原核表达载体；真核表达载体，如，例如酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体；以及无细胞提取物表达载体。进一步理解的是，可用于实施这些方法的各个方面的表达载体可包括在组成型、组织特异性、细胞特异性或可诱导的启动子元件、增强子元件的控制下或两者的控制下表达肉毒杆菌神经毒素的表达载体。表达载体以及充分开发的用于制造和使用源自此类表达载体的表达构建体的试剂和条件的非限制性实例可容易地由供应商处获得，所述供应商包括但不限于：BDBiosciences-Clontech，Palo Alto，Calif.；BD Biosciences Pharmingen，San Diego，Calif.；Invitrogen，Inc，Carlsbad，Calif.；EMD Biosciences-Novagen，Madison，Wis.；QIAGEN，Inc.，Valencia，Calif.；以及Stratagene，La Jolla，Calif.。对合适表达载体进行选择、制造和使用是本领域技术人员能力范围内的常规程序，并且本文对此也有所教导。
本发明的另一方面涉及包含本文所述核酸分子或表达构建体的细胞。所述细胞可用于所述核酸的扩增(propagation)或所述核酸的表达，或两者皆有。这些细胞包括但不限于：原核细胞，包括但不限于需氧、微量需氧、嗜二氧化碳(capnophilic)、兼性、厌氧、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞的菌株，如来源于以下的菌株：例如大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridia perfringens)、艰难梭菌(Clostridia difficile)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、Neisseriameningirulls、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、荧光假单胞菌(PseudomonasfIuorescens)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；以及真核细胞，包括但不限于酵母菌株，如，例如来源于以下的菌株：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；昆虫细胞和来源于昆虫的细胞系，如，例如来源于：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)；以及哺乳动物细胞和来源于哺乳动物细胞的细胞系，如，例如来源于：小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类动物和人。细胞系可由American Type Culture Collection、European Collection of Cell Cultures和GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures获得。用于选择、制备和使用适当细胞系的特定方案的非限制性实例在以下文献中描述：例如INSECT CELL CULTUREENGINEERING(Mattheus F.A.Goosen等编著，Marcel Dekker，1993)；INSECT CELLCULTURES:FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J.M.Vlak等编著，Kluwer AcademicPublishers，1996)；Maureen A.Harrison&Ian F.Rae，GENERAL TECHNIQUES OF CELLCULTURE(Cambridge University Press，1997)；CELL AND TISSUE CULTURE:LABORATORYPROCEDURES(Alan Doyle等编著，John Wiley and Sons，1998)；R.Ian Freshney，CULTUREOF ANIMAL CELLS:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss，第4次增补版，2000)；ANIMAL CELL CULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John R.W.Masters编著，OxfordUniversity Press，第3次增补版，2000)；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，同上，(2001)；BASIC CELL CULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis，Oxford Press，第2次增补版，2002)；以及CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，同上，(2004)。这些方案为本领域技术人员能力范围内的常规程序，并且本文对此也有所教导。
还设想了，可将此处描述的修饰的BoNT/B-HC用作递送工具，来靶向人中的神经元。例如，修饰的BoNT/B-HC可与其它治疗剂共价或非共价地相连接，并通过结合至人SytI/II而在人中作为将治疗剂递送至神经元的靶向载体。从而，本发明的另一方面涉及一种嵌合多肽分子，所述嵌合多肽分子包含第一部分和第二部分，所述第一部分是修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域包含一个或多个置换突变，使得与人Syt I受体和/或人Syt II受体的结合显著增强，所述第一部分连接至所述第二部分。所述分子的第二部分可以是生物活性分子，如治疗剂(例如，多肽或药物)。该分子的第一部分和第二部分的连接可以是共价的(例如，融合蛋白的形式)或非共价的。这种连接方法是本领域已知的，并且可以容易地被本领域技术人员应用。
本发明的另一方面涉及包含本文所述肉毒杆菌神经毒素或嵌合分子的药物组合物。在一个实施方式中，本文所述的多肽是包含药学上可接受的载体的组合物(在本文中称为药物组合物)中的活性成分。“药学上可接受的载体”是指将靶向递送组合物混合和/或递送至受试者的任何药学上可接受的工具(means)。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或辅料(vehicle)，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，涉及将目标试剂(subject agents)从一个器官或身体部分携带或运输至另一器官或身体部分。每种载体必须在与组合物的其它成分相容的意义上是“可接受的”，并且与向受试者(如人)的给药相容。可专门配制此类组合物，以通过多种途径中的一种或多种(如本文所述的给药途径)进行给药。组合物中也可掺入补充的活性成分。当将本文所述的试剂、制剂或药物组合物给予受试者时，优选地，给予治疗有效量。本文所使用的术语“治疗有效量”是指使得病症得以改善或修复(remediation)的量。在一个实施方式中，所述药物组合物被配制用于通过注射给药。在一个实施方式中，所述药物组合物包含包封在微球中的肉毒神经毒素。在一个实施方式中，所述药物组合物包含配制用于缓释的肉毒神经毒素。
在一个实施方式中，本发明的肉毒神经毒素、多肽或嵌合分子处于控释制剂的形式。此类用于给药的组合物和方法在美国专利公开号2007/0020295中提供，以引用的方式将其内容并入本文。
肉毒神经毒素可通过根据已知程序在发酵罐中建立并培育肉毒杆菌培养物、然后收集和纯化发酵混合物来获得。所有肉毒神经毒素血清型首先被合成为非活性的单链蛋白，必须由蛋白酶对其进行切割或造成切口(nick)才能具有神经活性。细菌菌株使肉毒神经毒素血清型A和G具有内源性蛋白酶，血清型A和G因此可以从细菌培养物中以主要处于其活性形式的状态回收。与此相反，肉毒神经毒素血清型C1、D和E是由非蛋白水解性菌株合成的，因此从培养物中回收时通常是未活化的。血清型B和F是由蛋白水解性和非蛋白水解性菌株产生的，因此可以以活性形式或非活性形式回收。产生例如肉毒神经毒素血清型B的蛋白水解菌株可能只切割部分所产生的毒素。带切口分子与不带切口分子的确切比例取决于孵育时间长度和培养温度。因此，例如，B型肉毒神经毒素制剂中的一定百分比可能是非活性的。在一个实施方式中，本发明的神经毒素处于活性状态。在一个实施方式中，所述神经毒素处于非活性状态。在一个实施方式中，设想了活性和非活性神经毒素的组合。
本发明还包括包含本文所述药物组合物的试剂盒。所述试剂盒可进一步包含用于该组合物的治疗性给药的递送工具或装置；和/或用于治疗性给药的说明书。
本发明的另一方面涉及用于给予本文所述药物组合物的递送工具或装置，所述工具或装置预装有所述药物组合物(例如，用于单次使用)。此类装置可以是用于递送所述组合物的注射器或微针装置。所述注射器可以是预装有有效量的所述组合物的单次使用注射器。所述微针装置可包含涂覆有本文所述组合物的一个或多个微针，如在美国专利公开2010/0196445中所描述的，将其整体内容并入本文。
治疗方法
本发明还包括用于对通常使用神经毒素治疗的病症(例如，骨骼肌病症、平滑肌病症、腺体病症(glandular condition)、神经肌肉障碍、自主神经紊乱、疼痛、或美学/美容病症)进行治疗的方法。如本领域技术人员所确定的，此类病症与不希望的神经元活性相关。所述方法包括向哺乳动物中的合适位置给予治疗有效量的本文所述药物组合物(例如，含有肉毒神经毒素(BoNT)或嵌合分子的药物组合物)的步骤，以减少不希望的神经元活性，从而对所述病症进行治疗。给予通过使有效量的组合物接触表现出不希望的活性的神经元的途径进行。
设想通过本文所讨论的方法进行治疗的具体病症包括但不限于：痉挛性发音障碍、痉挛性斜颈、喉部肌张力障碍、口下颌发音障碍、舌部肌张力障碍、颈部肌张力障碍、局限性手部肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑障碍、脑性麻痹、局限性痉挛和其它语音障碍、痉挛性结肠炎、神经原性膀胱、盆底失弛缓、四肢痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难和其它肌张力障碍、以及特征为肌肉群不自主运动的其它障碍、流泪、多汗症、过度流涎、过度胃肠分泌以及其它分泌紊乱、肌肉痉挛痛、头痛。另外，本发明可用于治疗皮肤病病症或美学/美容病症，例如减少眉头纹、减少皮肤皱纹。本发明也可用于治疗运动损伤。
Borodic的美国专利号5,053,005公开了使用A型肉毒杆菌治疗青少年脊椎弯曲(即脊柱侧弯)的方法。以引用的方式将Borodic的公开内容整体并入本文。在一个实施方式中，采用与Borodic的公开基本类似的方法，可将修饰的神经毒素给予哺乳动物(优选人)以治疗脊椎弯曲。在合适的实施方式中，给予修饰的神经毒素，所述修饰的神经毒素包含融合有基于亮氨酸的基序的E型肉毒杆菌。甚至更优选地，将包含在其轻链的羧基末端融合了基于亮氨酸的基序的A-E型肉毒杆菌的修饰的神经毒素给予哺乳动物(优选人)以治疗脊椎弯曲。
此外，可利用通常使用A型肉毒杆菌进行的公知技术给予所述修饰的神经毒素，以治疗其它神经肌肉障碍。例如，本发明可用于治疗疼痛，例如头痛、肌肉痉挛痛和各种形式的炎性疼痛。例如，Aoki的美国专利号5,721,215和Aoki的美国专利号6,113,915公开了使用A型肉毒毒素治疗疼痛的方法。以引用的方式将这两项专利的公开内容整体并入本文。
自主神经系统紊乱也可使用修饰的神经毒素来治疗。例如，腺体机能障碍是一种自主神经系统紊乱。腺体机能障碍包括过度出汗和过度流涎。呼吸机能障碍是自主神经系统紊乱的另一实例。呼吸机能障碍包括慢性阻塞性肺病和哮喘。Sanders等公开了用于治疗自主神经系统的方法；例如，利用天然存在的肉毒毒素治疗自主神经系统紊乱，如过度出汗、过度流涎、哮喘等。以引用的方式将Sander等人的公开内容整体并入本文。在一个实施方式中，可使用与Sanders等人基本上类似的方法，但改为使用修饰的神经毒素，对自主神经系统紊乱(如上文所讨论的自主神经系统紊乱)进行治疗。例如，可以以足以使控制鼻腔粘液分泌的自主神经系统的胆碱能神经元退化的量将修饰的神经毒素局部施用到哺乳动物的鼻腔。
可由修饰的神经毒素进行治疗的疼痛包括由肌张力或痉挛引发的疼痛、或不与肌肉痉挛相关的疼痛。例如，Binder在美国专利号5,714,468中公开了可使用天然存在的肉毒毒素(如A型肉毒杆菌)对由血管障碍(disturbances)、肌张力、神经痛和神经病变引发的头痛进行治疗。以引用的方式将Binder的公开内容整体并入本文。在一个实施方式中，可使用与Binder基本上类似的方法，但改为使用修饰的神经毒素，对头痛，特别是由血管障碍、肌张力、神经痛和神经病变引发的头痛进行治疗。由肌肉痉挛引发的疼痛也可以通过给予修饰的神经毒素进行治疗。例如，可在疼痛/痉挛位置肌内给予融合有基于亮氨酸的基序的E型肉毒杆菌、优选在E型肉毒杆菌轻链的羧基末端融合有基于亮氨酸的基序的E型肉毒杆菌，以缓解疼痛。
此外，可将修饰的神经毒素给予哺乳动物，以对不与肌肉障碍(如痉挛)相关的疼痛进行治疗。在一个广泛的实施方式中，本发明治疗非痉挛相关疼痛的方法包括中枢给予或外周给予所述修饰的神经毒素。
例如，Foster等人在美国专利号5,989,545中公开了可中枢(鞘内)给予缀合有靶向部分的肉毒毒素以缓解疼痛。以引用的方式将Foster等人的公开内容整体并入本文。在一个实施方式中，可使用与Foster等人基本上类似的方法，但改为使用本文所述的组合物来治疗疼痛。所要治疗的疼痛可以是急性疼痛或慢性疼痛。
不与肌肉痉挛相关的急性或慢性疼痛也可以通过将所述修饰的神经毒素局部、外周给予至哺乳动物的实际疼痛部位或感知疼痛部位处而得以缓解。在一个实施方式中，在疼痛部位处或疼痛部位附近(例如，切口处或切口附近)皮下给予所述修饰的神经毒素。在一些实施方式中，在疼痛部位处或疼痛部位附近(例如，在哺乳动物的瘀伤(bruise)部位处或瘀伤部位附近)肌内给予所述修饰的神经毒素。在一些实施方式中，将所述修饰的神经毒素直接注射入哺乳动物的关节，用于治疗或缓解因关节炎病症而致的疼痛。此外，将所述修饰的神经毒素频繁重复注射或输注至外周疼痛部位也在本发明的范围之内。
此类方法的给药途径是本领域已知的，并且可由本领域技术人员容易地使其适用于本文所述的方法(例如，参见例如Harrison's Principles of Internal Medicine(1998)，Anthony Fauci等人编著，第14次增补版，由McGraw Hill出版)。通过非限制性实例的方式，对神经肌肉障碍的治疗可包括将有效量的分子局部给予至肌肉或肌肉群的步骤、对自主神经紊乱的治疗可包括将有效量的分子局部给予至腺体或腺体群的步骤、以及对疼痛的治疗可包括将有效量的分子给予至疼痛部位的步骤。此外，对疼痛的治疗可包括将有效量的修饰的神经毒素给予至脊髓的步骤。
此处和以下实施例中描述的实施方式仅出于说明目的，对于本领域技术人员而言显而易见的各种改变或变化均包括在本发明的范围之内。
除非本文另有定义，与本申请相关使用的科学术语和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
应当理解的是，本发明不限定于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且诸如此类可以发生变化。本文所使用的术语仅出于对具体实施方式进行描述的目的，并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
除了在操作实施例中或另有说明的情况下，表示本文所使用的成分的量或反应条件的所有数字应当理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当用于描述本发明时，与百分比相连使用的术语“约”是指±1％。
在一个方面，本发明涉及对本发明必要的本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放(“包含(comprising)”)。在一些实施方式中，对所述组合物、方法或其各自的组成部分的说明中所要包括的其它要素仅限于不实质上影响本发明的基本特征和新颖性特征的要素(“基本上由…组成(consistingessentially of)”)。这对于所描述的方法中的步骤以及组合物和组合物的组分而言同等适用。在其它实施方式中，本文所述的发明、组合物、方法及其各自的组成部分旨在排除对于所述组成部分、组合物或方法而言不被视为必要要素的任何要素(“由…组成(consisting of)”)。
为了描述和公开的目的，以引用的方式将所有专利、专利申请和其它已确定的出版物明确地并入本文，例如在此类出版物中描述的可用于本发明的方法学。这些出版物仅因为它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这方面的任何内容不应视为承认发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。
本发明可以如以下编号段落中的任一项所定义。
1.一种肉毒神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽包含：
a)蛋白酶结构域；
b)蛋白酶切割位点；
c)易位结构域；以及
d)修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：
V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、以及以上置换突变的组合。
2.如段1所述的BoNT多肽，其中，所述修饰的(B-HC)包含两个置换突变。
3.如段2所述的BoNT多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、或E1191Q和S1199F。
4.如段2或3所述的BoNT多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L。
5.如段2或3所述的BoNT多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199Y。
6.如段2或3所述的BoNT多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199F。
7.如段2或3所述的BoNT多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199L。
8.如段2或3所述的BoNT多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199Y。
9.如段2或3所述的BoNT多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199F。
10.一种肉毒神经毒素(BoNT)多肽，所述多肽包含：
a)蛋白酶结构域；
b)蛋白酶切割位点；
c)易位结构域；以及
d)修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域在对应于血清型B，菌株1的S1199或S1201的位置处包含置换突变。
11.如段10所述的BoNT多肽，其中，与缺少所述置换突变的相同分子相比，所述置换突变增强所述修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或削弱所述修饰的B-HC与人Syt I的结合。
12.如段10所述的BoNT多肽，其中，与缺少所述置换突变的相同分子相比，所述置换突变增强所述修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或提高所述修饰的B-HC与人Syt I的结合。
13.如段11或12所述的BoNT多肽，其中，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：将S置换为A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y和V。
14.如段11-13中任一项所述的BoNT多肽，其中，所述置换突变为将S置换为非天然存在的氨基酸。
15.如段1-14中任一项所述的BoNT多肽，其中，所述修饰的B-HC为菌株1的B-HC。
16.如段1-15中任一项所述的BoNT多肽，其中，所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自选自于以下血清型所组成的组中的血清型：A、B、C、D、E、F、G、以及以上血清型的组合。
17.如段16所述的BoNT多肽，其中，所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型B，菌株1。
18.如段16所述的BoNT多肽，其中，所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型A，菌株1。
19.一种多肽，所述多肽包含修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：
V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、以及以上置换突变的组合。
20.如段19所述的多肽，其中，所述修饰的(B-HC)包含两个置换突变。
21.如段20所述的多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、或E1191Q和S1199F。
22.如段20或21所述的多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L。
23.如段20或21所述的多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199Y。
24.如段20或21所述的多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199F。
25.如段20或21所述的多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199L。
26.如段20或21所述的多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199Y。
27.如段20或21所述的多肽，其中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199F。
28.一种多肽，所述多肽包含修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域在对应于血清型B，菌株1的S1199或S1201的位置处包含置换突变。
29.如段28所述的多肽，其中，与缺少所述置换突变的相同分子相比，所述置换突变增强所述修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或削弱所述修饰的B-HC与人Syt I的结合。
30.如段28所述的多肽，其中，与缺少所述置换突变的相同分子相比，所述置换突变增强所述修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或提高所述修饰的B-HC与人Syt I的结合。
31.如段29或30所述的多肽，其中，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：将S置换为A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y和V。
32.如段29-31中任一项所述的多肽，其中，所述置换突变为将S置换为非天然存在的氨基酸。
33.如段19-32中任一项所述的多肽，其中，所述修饰的B-HC为菌株1的B-HC。
34.一种嵌合分子，所述嵌合分子包含第一部分和第二部分，所述第一部分是修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述第一部分连接至所述第二部分，其中，所述修饰的B-HC包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：
V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、以及以上置换突变的组合。
35.如段33所述的嵌合分子，其中，所述修饰的(B-HC)包含两个置换突变。
36.如段35所述的嵌合分子，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、或E1191Q和S1199F。
37.如段35或36所述的嵌合分子，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199L。
38.如段35或36所述的嵌合分子，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199Y。
39.如段35或36所述的嵌合分子，其中，所述两个置换突变对应于E1191M和S1199F。
40.如段35或36所述的嵌合分子，其中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199L。
41.如段35或36所述的嵌合分子，其中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199Y。
42.如段35或36所述的嵌合分子，其中，所述两个置换突变对应于E1191Q和S1199F。
43.如段34所述的嵌合分子，其中，所述修饰的B-HC包含修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域(B-HC)，所述修饰的肉毒杆菌血清型B的受体结合结构域在对应于血清型B，菌株1的S1199或S1201的位置处包含置换突变。
44.如段43所述的嵌合分子，其中，与缺少所述置换突变的相同分子相比，所述置换突变增强所述修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或削弱所述修饰的B-HC与人Syt I的结合。
45.如段43所述的嵌合分子，其中，与缺少所述置换突变的相同分子相比，所述置换突变增强所述修饰的B-HC与人Syt II的结合和/或提高所述修饰的B-HC与人Syt I的结合。
46.如段44或45所述的嵌合分子，其中，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：将S置换为A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y和V。
47.如段44-46中任一项所述的嵌合分子，其中，所述置换突变为将S置换为非天然存在的氨基酸。
48.如段43-47中任一项所述的嵌合分子，其中，所述修饰的B-HC为菌株1的B-HC。
49.如段32-48中任一项所述的嵌合分子，其中，所述第一部分和所述第二部分共价连接。
50.如段32-48中任一项所述的嵌合分子，其中，所述第一部分和所述第二部分非共价连接。
51.如段32-50中任一项所述的嵌合分子，其中，所述第二部分选自于以下物质所组成的组：小分子、核酸、短多肽和蛋白质。
52.如段51所述的嵌合分子，其中，所述第二部分是生物活性分子。
53.如段51或52所述的嵌合分子，其中，所述第二部分是治疗性多肽药物或治疗性非多肽药物。
54.包含编码如段1-53中任一项所述的多肽或嵌合分子的核苷酸序列的核酸。
55.包含如段54所述的核酸的核酸载体。
56.包含如段55所述的核酸载体或如段54所述的核酸的细胞。
57.表达如段1-53中任一项所述的多肽或嵌合分子的细胞。
58.一种药物组合物，所述药物组合物包含如段1-18中任一项所述的肉毒神经毒素(BoNT)多肽、或如段34-53中任一项所述的嵌合分子、或如段55所述的核酸载体、或如段54所述的核酸。
59.如段58所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
60.一种试剂盒，所述试剂盒包含如段58或59所述的药物组合物；以及用于治疗性给予所述药物组合物的说明书。
61.一种生产肉毒神经毒素(BoNT)多肽的方法，所述方法包括在生产所述BoNT多肽的条件下培养如段57所述的宿主细胞的步骤。
62.如段61所述的方法，所述方法进一步包括从培养物中回收所述BoNT多肽。
63.一种用于对与不希望的神经元活性相关的病症进行治疗的方法，所述方法包括向受试者给予治疗有效量的如段1-18中任一项所述的BoNT多肽，从而与一个或多个表现出不希望的神经元活性的神经元相接触，从而治疗所述病症。
64.如段63所述的方法，其中，所述病症选自于以下病症所组成的组：痉挛性发音障碍、痉挛性斜颈、喉部肌张力障碍、口下颌发音障碍、舌部肌张力障碍、颈部肌张力障碍、局限性手部肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑障碍、脑性麻痹、局限性痉挛和其它语音障碍、痉挛性结肠炎、神经原性膀胱、盆底失弛缓、四肢痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难和其它肌张力障碍、以及特征为肌肉群不自主运动的其它障碍、流泪、多汗症、过度流涎、过度胃肠分泌、分泌紊乱、肌肉痉挛痛、头痛、以及皮肤病病症或美学/美容病症。
65.如段1-18中任一项所述的肉毒神经毒素(BoNT)多肽、如段58或59所述的药物组合物、或如段34-53中任一项所述的嵌合分子、或如段19-33中任一项所述的多肽在药物中的用途。
66.如段1-18中任一项所述的肉毒神经毒素(BoNT)多肽、如段58或59所述的药物组合物、或如段34-53中任一项所述的嵌合分子、或如段19-33中任一项所述的多肽在对与不希望的神经元活性相关的病症进行治疗中的用途。
实施例
通过下列实施例进一步说明本发明，其不应被解释为进一步限制本发明。
为了确定是否能够通过修饰BoNT/B受体结合结构域来改变BoNT/B与人Syt II的结合亲和力，进行了以下实验。该假说基于一系列在先研究：(1)在1998年已经示出，天然存在的BoNT/B亚型毒素BoNT/B2显示出比BoNT/B(也被定义为BoNT/B1)低～4倍的与Syt II的结合亲和力28(图2F)。在2003年，证明了这一亲和力差异是由其受体结合结构域内的若干氨基酸差异所导致29(图2F，图2G)，这首次表明了改变BoNT/B的受体结合结构域中的残基可改变与Syt II的结合亲和力。这些研究还确定了影响与Syt II的结合亲和力的关键残基(图2G)。(2)在2004年已经报道了，BoNT/A和BoNT/B的受体结合结构域内的单个残基突变可以极大改变这些毒素的毒性和效力(图2H)，表明受体结合亲和力的改变可以转化为毒素毒性和效力的变化30。(3)与大鼠Syt II结合的BoNT/B的共晶结构已经解明31,32，形成Syt II结合位点的关键残基也已解明31,32。这些在先研究均使用了啮齿动物Syt II，而非人Syt II。
由全部这些使用啮齿动物Syt II结合的在先研究，确定了对BoNT/B受体结合结构域进行工程化以改变其与人Syt II的结合亲和力的靶残基。
BoNT/B的受体结合结构域已被充分确定1。在先研究证实，改变BoNT/B的受体结合结构域中的残基可以对BoNT/B与大鼠或小鼠Syt II的结合亲和力进行调节29,30。与大鼠SytII结合的BoNT/B的共晶结构也已经在2006年由两项研究解明31,32。人Syt II中的残基改变是由F改变为L的相对保守的改变，二者均是疏水性残基。但是，BoNT/B对啮齿动物Syt II的结合亲和力的差异比人Syt II显著更高。此外，“BoNT/B与人Syt II之间的结合相互作用可能如何被修饰，以补偿结合位点中部的这一苯丙氨酸残基的缺失”这一点并不是显而易见的。而可设想(并可见于已公开的晶体结构中)WT BoNT/B-HC与大鼠或小鼠Syt II之间的积极的(positive)结合相互作用，例如包括疏水环的堆叠(stacking)或堆积(packing)；或WTBoNT/B-HC和修饰的人Syt II(苯丙氨酸被置换入序列中)之间的积极的结合相互作用；此类相互作用可能无法在修饰的BoNT/B-HC和WT人Syt II蛋白之间再现。这表明，在BoNT/B-Syt II复合物的整体结构没有显著改变的情况下，改变BoNT/B中的数个或甚至一个残基可能无法恢复/改善与人Syt II的结合。
54位的保守苯丙氨酸与BoNT/B形成多个疏水性接触(hydrophobic contacts)。由于亮氨酸(在人中)也是疏水性的，因此对BoNT/B结合的破坏可能是由于苯丙氨酸和亮氨酸之间的尺寸/形状差异。因此，本发明的关键在于识别BoNT/B-HC区域中可能的变化，其可顺应(accommodate)并补偿由苯丙氨酸至亮氨酸的改变。该方法是双重的：关注直接接触啮齿动物Syt II中的苯丙氨酸54的残基；或关注BoNT/B-HC周围区域中的残基，该残基可补偿与54位的苯丙氨酸间的积极结合相互作用的缺失。这些潜在位于BoNT/B与人Syt II间的相应结合区域内的残基是参照BoNT/B-大鼠Syt II共晶结构(图2I)判定的，可能包括Y1181、P1197、A1196、F1204、F1194、P1117、W1178、Y1183、V1118、S1116、K1113、K1192、S1199、S1201、E1191、E1245和Y1256。在先研究中也已经示出残基1117、1191和1199属于对BoNT/B2与啮齿动物Syt II的结合产生影响的残基(图2G)29。因为不可能预测由残基置换带来的精确效果，因此采用了“试错(trial-and-error)”法。首先进行单个残基置换，接着进行选定组合的置换。具体来说，将每一列出的关键残基系统化地用不同尺寸的疏水性残基置换：将这一筛选限于疏水性残基，以确保维持重要的疏水性接触。这些疏水性置换残基包括V、I、L、M、F、W、C；以及其它疏水性较弱的氨基酸，包括A、Y、H、T、S、P、Q、N、和G。
本发明成功的关键之一在于开发可行且经济的方式来对突变体进行筛选。基本方法是，在如图2C所示的下拉分析中，对可溶性重组BoNT/B-HC与固定的小鼠Syt II(F54L)的结合进行检测。然而，为下拉分析纯化所有突变体并不可行。因此，对是否有可能直接使用Syt II从少量细菌裂解物中下拉BoNT/B-HC而无需纯化进行了测试。基本原理是，BoNT/B-Syt II的结合亲和力对这一方法而言可能足够高(Kd～0.23nM)20。事实上，发现固定的大鼠Syt II可以直接从仅6ml细菌裂解液中“亲和纯化”足够的WT BoNT/B-HC(图3A)。这一新开发的方法大大简化了筛选相当大量BoNT/B-HC突变体所需要付出的努力。使用这种方法进行了如下测试：就BoNT/B-HC突变体与小鼠Syt II 1-87(m-Syt II)和模拟人Syt II序列(F54L，h-Syt II)的突变小鼠Syt II的结合进行了筛选。对结合的物质进行免疫印迹分析，使用抗HA抗体检测BoNT/B-HC(图3A)。
发现大多数突变体分为两类：(1)不能与m-Syt II和h-Syt II结合，如F1204L和V1118W(图3B)；(2)仍与m-Syt II结合，但不能与h-Syt II结合，如F1204W和E1191W(图3B)。除了图3A中示出的若干实例以外，此处在很大程度上省略了这些结合结果。
在筛选的突变体中，确定了若干与m-Syt II和h-Syt II均结合的突变体，包括V1118M、S1199Y/L/F、Y1183M、S1201V、E1191M/I/Q/T(图3B)。因此，这些残基被确定为处于顺应人Syt II中的L残基的关键位置处或处于补偿人Syt II中该位置处苯丙氨酸残基的缺失的关键位置处。尽管人Syt I在运动神经元中的表达水平比人Syt II显著较低，但它仍是重要且可用的毒素受体，这也通过患者中的BoNT/B效力得以证实。为了达到与人神经元最大可能的结合，在一些方面中，修饰的BoNT/B突变体应当合意地不会负面影响与人Syt I的结合。理想地，它们甚至可提高与Syt I的结合。因此，使用相同的小规模下拉分析(图4A)对选定的BoNT/B突变体与固定的人Syt I的结合进行了进一步检查。因为Syt I与BoNT/B的结合相比Syt II具有较低的亲和力，因此其需要存在脂质共受体神经节苷脂10,20。这一需要通过在下拉分析中将纯化的脑神经节苷脂加入细菌裂解物而得以满足。如图4A所示，将含有毒素结合位点的人Syt I片段(1-80)纯化为GST标记的蛋白并固定在珠上，以在存在或不存在神经节苷脂(Gangl)的情况下下拉WT BoNT/B-HC和突变BoNT/B-HC。如预期地，WT BoNT/B-HC只在存在神经节苷脂的情况下与Syt I结合。发现突变体E1191M和E1191Q显著提高与SytI的结合：这些突变体甚至可以在无神经节苷脂时结合人Syt I(图4A)。与WT BoNT/B-HC相比，其它突变体要么削弱与Syt I的结合(例如V1118M)，要么保持类似水平(例如S1201V)。这表明E1191M和E1191Q是既能与人Syt II结合、又能增强与人Syt I的结合的突变体。
突变V1118M也是令人感兴趣的，这是因为它与人Syt II结合，而不与人Syt I结合。因此，它具有如下潜能：用于产生在人中相比WT BoNT/B而言对表达Syt II的神经元更具特异性的治疗性毒素，从而减少在人中非特异性进入表达Syt I的细胞。
举E1191M为例，使用纯化重组蛋白进一步验证了其与人Syt II的相互作用，这允许我们将等量的WT BoNT/B-HC和E1191M突变体与m-Syt II和h-Syt II的结合进行比较(图4B)。发现E1191M在无神经节苷脂时与m-Syt II和h-Syt II均发生结合，并且加入神经节苷脂进一步提升了所述结合(图4B)。这些结果证实，E1191M获得了在不存在神经节苷脂的情况下与人Syt II结合的能力，并且能够在存在脂质共受体神经节苷脂的情况下与人Syt II形成高亲和力的复合物。
使用E1191M/Q作为骨架(backbone)，进行实验以分析将其与其它残基置换相组合是否可以进一步增强与人Syt I/II的结合。将S1199L/Y/或/F与E1191M/或/Q组合产生了显示出与人Syt II的结合显著更高的双突变体(图5A)。例如，E1191M/S1199Y与m-Syt II和h-Syt II二者的结合达到了相似的水平(图5A，第5-6道)。这与单独的E1191M相比是显著增强，相比与m-Syt II的结合，单独的E1191M介导了较低的与h-Syt II的结合(图4B)。此外，所有选定的双突变体均显示出比WT BoNT/B-HC显著更高的与人Syt I的结合(图5B)。
举E1191M/S1199Y为例，使用等量的纯化重组蛋白对WT、E1191M和E1191M/S1199Y与h-Syt II的结合进行进一步比较。如图6A所示，在当前分析条件下，WT BoNT/B-HC无法在无神经节苷脂时与h-Syt II结合。E1191M在无神经节苷脂时显示出与h-Syt II中等(modest)结合；而与单独的E1191M相比，E1191M/S1199Y与h-Syt II的结合显著增强，尤其是在没有神经节苷脂时(比较第6道与第8道)。此外，与WT BoNT/B-HC相比，E1191M和E1191M/S1199Y二者与人-Syt I的结合均显著增强(图6B)。
已知WT BoNT/B-HC与m-Syt II的结合具有高亲和力20,21。因此，对E1191M/S1199Y与h-Syt II之间的结合和“金标准”WT BoNT/B-HC与m-Syt II的结合进行比较。如图6C所示，BoNT/B-HC浓度的滴定表明，E1191M/S1199Y在所有浓度下均具有和WT与m-Syt II的结合相似的结合水平。该分析条件下，估计E1191M/S1199Y和h-Syt II间的Kd为～19nM，而WTBoNT/B-HC结合m-Syt II的Kd为～68nM(图6D)。与WT BoNT/B-HC相比，这在结合h-Syt II方面是巨大的进步，WT BoNT/B-HC在这些分析条件下不能与h-Syt II结合(图6A)。总之，将E1191M与S1199Y组合在结合亲和力方面提供了协同改善，相比E1191M突变体还提供了额外改善，并产生了与人Syt I和Syt II二者均具有高亲和力结合的新型BoNT/B-HC突变体。与此相反，一些其它有益的单个突变的组合并未产生进一步改善的双突变BoNT/B-HC结构域。
最后，对E1191M/S1199Y突变体是否能在神经元表面恢复与h-Syt II的结合进行了检查。培养的大鼠海马神经元只表达Syt I，而不表达Syt II。在这些神经元中敲减(KD)Syt I，然后通过慢病毒转导使用外源性m-Syt II、m-Syt II(F54L)和h-Syt II进行替换。随后对WT BoNT/B-HC和E1191M/S1199Y与这些神经元的结合进行了测试(图7)。WT BoNT/B-HC只结合至m-Syt II，而E1191M/S1199Y则结合至神经元表面上的m-Syt II(F54L)和h-SytII这二者，表明E1191M/S1199Y突变体可在神经元中将h-Syt II用作功能性受体。
材料和方法
抗体和材料：小鼠单克隆抗HA抗体购自Covance(16B12)。牛混合脑神经节苷脂购自Matreya LLC(Pleasant Gap，PA)，并如在先所描述的，在Tris缓冲盐水(TBS：20mM Tris，150mM NaCl)中复溶9。BoNT/B(Okra)在E.Johnson的实验室(Madison，WI)中由指定菌株纯化。
cDNA和构建体：编码BoNT/B-HC(残基856-1291，基于GenBank登录号：AB232927.1)的DNA由Geneart Inc.合成，其密码子已为在大肠杆菌中表达进行了优化。将编码BoNT/B-HC的DNA亚克隆至pET28a载体中，在其N-末端融合有His6标签和HA标签(YPYDVPDYA)。使用QuickChange定点突变试剂盒(Agilent Technologies，CA)，按照制造商的说明书通过PCR产生BoNT/B-HC中的突变。以下DNA由所标明的研究组慷慨提供：大鼠Syt I(T.C.Sudhof，Palo Alto，CA)、小鼠Syt II(M.Fukuda，Ibaraki，Japan)、人Syt I(R.B.Sutton，Lubbock，TX)。GST标记的Syt I/II片段和Syt II突变体在先已有所描述10,13,14。所有构建体均通过测序进行了验证。
蛋白表达和纯化：WT BoNT/B-HC和突变体BoNT/B-HC在大肠杆菌中表达为His6标记的重组蛋白。Syt I/II片段和突变体在大肠杆菌中表达为GST标记的重组蛋白。如在先所描述的对GST-融合蛋白和His6-融合蛋白二者进行纯化9，使用0.25mM IPTG在20℃的诱导温度下过夜。
GST下拉分析：进行了两种类型的下拉分析。第一系列用于对突变BoNT/B-HC与GST标记的小鼠Syt II(m-Syt II)和模拟人Syt II序列(在实施例1-6中指定为h-Syt II)的突变小鼠Syt II(F54L)的结合进行筛选。简言之，将6ml表达BoNT/B-HC的大肠杆菌旋降(spindown)，重悬于800μl TBS中，超声处理，然后在4℃与2％Triton X-100孵育1小时。随后在4℃将样品在微量离心机中以最大速度旋降15min。收集上清液，并通过在4℃与10μg固定在谷胱甘肽-琼脂糖珠(GE bioscience，Piscataway，NJ)上的Syt蛋白孵育1小时用于下拉分析。在洗涤缓冲液(TBS+0.5％Triton)中洗涤样品三次，并使用抗HA抗体检测BoNT/B-HC，通过免疫印迹分析对样品进行分析。对于与h-Syt II的结合增强的突变体，通过如在先所描述的9将这些突变BoNT/B-HC纯化为His6标记的蛋白来进行进一步的下拉分析。随后在存在或不存在神经节苷脂(60μg/ml)的情况下，使用处于100μl TBS缓冲液加0.5％Triton X-100中的固定的Syt片段，在4℃进行1h的下拉分析。使用TBS缓冲液加0.5％Triton X-100对珠进行3次洗涤。对10％的结合物质进行SDS-PAGE，随后进行免疫印迹分析。
免疫染色：用4％多聚甲醛固定培养的神经元，用0.25％Triton X-100通透化(permeabilized)，并进行免疫染色分析，检测BoNT/B-HC(利用HA抗体)和突触蛋白这二者。利用共聚焦显微镜(Leica TCS SP5；40×油性物镜)采集图像。
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Claims (32)
1.一种肉毒神经毒素多肽，所述多肽包含修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域，其中，所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域的修饰为两个置换突变，所述置换突变对应于血清型B，菌株1中的置换突变E1191M和S1199Y，
其中，与缺少所述置换突变的相同分子相比，所述置换突变增强所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域与人Syt II的结合。
2.一种肉毒神经毒素多肽，所述多肽包含：
a）蛋白酶结构域；
b）蛋白酶切割位点；
c）易位结构域；以及
d）修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域，所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域的修饰为对应于血清型B，菌株1中的置换突变E1191M和S1199Y的两个置换突变。
3.如权利要求2所述的肉毒神经毒素多肽，其中，所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域进一步包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：
V1118M、Y1183M、S1201V、以及以上置换突变的组合。
4.如权利要求2或3所述的肉毒神经毒素多肽，其中，所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域为菌株1的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域。
5.如权利要求2或3所述的肉毒神经毒素多肽，其中，所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自选自于以下血清型所组成的组中的血清型：B、A、C、D、E、F、G、以及以上血清型的组合。
6.如权利要求5所述的肉毒神经毒素多肽，其中，所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型B，菌株1。
7.如权利要求5所述的肉毒神经毒素多肽，其中，所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶切割位点来自血清型A，菌株1。
8.一种肉毒神经毒素多肽，所述多肽包含修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域，其中，所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域的修饰为对应于血清型B，菌株1中的置换突变E1191M和S1199Y的两个置换突变。
9.如权利要求8所述的多肽，其中，所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域进一步包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：
V1118M、Y1183M、S1201V、以及以上置换突变的组合。
10.如权利要求8或9所述的多肽，其中，所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域为菌株1的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域。
11.一种嵌合分子，所述嵌合分子包含第一部分和第二部分，所述第一部分是修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域，所述第一部分连接至所述第二部分，其中，所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域的修饰为对应于血清型B，菌株1中的置换突变E1191M和S1199Y的两个置换突变。
12.如权利要求11所述的嵌合分子，其中，所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域进一步包含对应于血清型B，菌株1中的置换突变的一个或多个置换突变，所述置换突变选自于以下置换突变所组成的组：
V1118M、Y1183M、S1201V、以及以上置换突变的组合。
13.如权利要求11或12所述的嵌合分子，其中，与缺少所述置换突变的相同分子相比，所述置换突变增强所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域与人Syt II的结合。
14.如权利要求11或12所述的嵌合分子，其中，与缺少所述置换突变的相同分子相比，所述置换突变增强所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域与人Syt II的结合和/或提高所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域与人Syt I的结合。
15.如权利要求11或12所述的嵌合分子，其中，所述修饰的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域为菌株1的来自肉毒杆菌血清型B的神经毒素的受体结合结构域。
16.如权利要求11或12所述的嵌合分子，其中，所述第一部分和所述第二部分共价连接。
17.如权利要求11或12所述的嵌合分子，其中，所述第一部分和所述第二部分非共价连接。
18.如权利要求11或12所述的嵌合分子，其中，所述第二部分选自于以下物质所组成的组：小分子、核酸和蛋白质。
19.如权利要求11或12所述的嵌合分子，其中，所述第二部分为短多肽。
20.如权利要求11或12所述的嵌合分子，其中，所述第二部分是生物活性分子。
21.如权利要求11或12所述的嵌合分子，其中，所述第二部分是治疗性多肽药物或治疗性非多肽药物。
22.包含编码如权利要求1-10中任一项所述的多肽或如权利要求11-21中任一项所述的嵌合分子的核苷酸序列的核酸。
23.包含如权利要求22所述的核酸的核酸载体。
24.包含如权利要求23所述的核酸载体或如权利要求22所述的核酸的细胞。
25.表达如权利要求1-10中任一项所述的多肽或如权利要求11-21中任一项所述的嵌合分子的细胞。
26.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-10中任一项所述的多肽、或如权利要求11-21中任一项所述的嵌合分子、或如权利要求23所述的核酸载体、或如权利要求22所述的核酸。
27.如权利要求26所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
28.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求26或27所述的药物组合物；以及用于治疗性给予所述药物组合物的说明书。
29.一种生产肉毒神经毒素多肽的方法，所述方法包括在生产所述肉毒神经毒素多肽的条件下培养如权利要求25所述的细胞的步骤。
30.如权利要求29所述的方法，所述方法进一步包括从培养物中回收所述肉毒神经毒素多肽。
31.如权利要求1-10中任一项所述的多肽、如权利要求26或27所述的药物组合物、或如权利要求11-21中任一项所述的嵌合分子在制备用于对与不希望的神经元活性相关的病症进行治疗的药物中的用途。
32.如权利要求31所述的用途，其中，所述病症选自于以下病症所组成的组：痉挛性发音障碍、痉挛性斜颈、喉部肌张力障碍、口下颌发音障碍、舌部肌张力障碍、颈部肌张力障碍、局限性手部肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑障碍、脑性麻痹、局限性痉挛和其它语音障碍、痉挛性结肠炎、神经原性膀胱、盆底失弛缓、四肢痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难和其它肌张力障碍、以及特征为肌肉群不自主运动的其它障碍、流泪、多汗症、过度流涎、过度胃肠分泌、分泌紊乱、肌肉痉挛痛、头痛、以及皮肤病病症或美学/美容病症。
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