ES2847241T3 - Neurotoxina botulínica genéticamente modificada - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica para uso en la atenuación de la actividad neuronal o la inhibición de la liberación de neurotransmisores, en la que la composición farmacéutica comprende o suministra una molécula que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc) de Clostridial botulinum, en la que el B-Hc modificado comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionadas del grupo que consiste en E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199F; S1199L; S1201V; V1118M; Y1183M; y combinaciones de las mismas, en la que una o más mutaciones de sustitución producen una unión mejorada del B-Hc modificado a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución.
Description
DESCRIPCIÓN
Neurotoxina botulínica genéticamente modificada
Apoyo gubernamental
Esta invención se realizó con apoyo gubernamental bajo NCRR RR000168 otorgado por el Instituto Nacional de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con el campo de la terapéutica para trastornos neuromusculares.
Antecedentes de la invención
Las neurotoxinas botulínicas son una familia de toxinas bacterianas, que incluyen siete serotipos principales (BoNT/A-G ) 1. Estas toxinas actúan mediante el bloqueo de la liberación de neurotransmisor de las neuronas, para paralizar de esta manera animales y humanos. En años recientes, las BoNT se han usado ampliamente para tratar una lista creciente de condiciones médicas: inyecciones locales de una cantidad diminuta de toxinas puede atenuar la actividad neuronal en las regiones objetivo, lo cual puede beneficiaren muchas condiciones médicas, así como para propósitos cosméticos2-4.
Las BoNT/A y BoNT/B son las únicas dos BoNT que están aprobadas actualmente por la FDA para su uso en humanos2-4. Estas son toxinas purificadas de bacterias sin ninguna modificación de secuencia (definidas como tipo silvestre, WT). A medida que crece la aplicación de las BoNT, se han reportado limitaciones y efectos adversos. La limitación principal es la generación de anticuerpos neutralizantes en pacientes, que vuelve al tratamiento futuro ineficaz5. La terminación del uso de la BoNT deja frecuentemente a los pacientes sin otras vías eficaces para tratar/aliviar sus trastornos. La posibilidad de las respuestas de anticuerpos se relaciona directamente tanto con las dosis de toxina como con la frecuencia de inyección5. Por lo tanto, esta limitación se presenta principalmente en el tratamiento de espasmos musculares, lo cual involucra dosis relativamente altas de toxinas. Consistentemente, no se han observado respuestas de anticuerpo en aplicaciones cosméticas, las cuales usan dosis de toxina extremadamente bajas5.
Los efectos adversos principales se asocian frecuentemente, además, con el tratamiento de espasmos musculares, pero no en aplicaciones cosméticas. Esto se debe a que los efectos adversos se deben en gran parte a la difusión de toxinas a otras regiones del cuerpo y la posibilidad de difusión de las toxinas se relaciona directamente con las dosis inyectadas. Los efectos adversos varían de eventos no serios transitorios tales como ptosis y diplopía a eventos amenazantes para la vida, incluso la muerte67. En una carta de petición presentada en 2008 por el Dr. Sidney Wolfe a FDA, se han documentado un total de 180 eventos adversos serios, lo que incluye 16 muertes. Como resultado, la FDA ahora requiere la "advertencia de Caja negra" en todos los productos de BoNT, lo que resalta el riesgo de la dispersión de toxinas, después de advertencias similares expedidas por la Unión Europea.
Debido a que la generación de anticuerpos neutralizantes y la difusión de toxinas se relacionan directamente con las dosis inyectadas, la disminución de la dosis de toxinas (mientras se mantienen los mismos niveles de actividad de toxina) es altamente deseada, lo cual significa que tiene que aumentarse la eficacia de las moléculas de toxina individuales. Dichas BoNT modificadas con especificidad mejorada para las neuronas reducirán, además, cualquiera de los efectos potenciales fuera del objetivo debido a la entrada no específica en otros tipos de células.
Las BoNT se dirigen y entran a las neuronas mediante la unión a sus receptores específicos a través de sus dominios de unión al receptor, los cuales se definen bien en la literatura (BoNT-Hc , Fig. 1A, B)1. La unión al receptor dicta la eficacia y especificidad de las BoNT para reconocer neuronas. El mejoramiento de la capacidad de unión al receptor de las BoNT aumentará su eficacia y especificidad por las neuronas objetivo. Se han identificado los receptores para la mayoría de las BoNT (Fig. 1C). Las BoNT/B, D-C y G comparten dos proteínas de vesícula sináptica homólogas sinaptotagmina I y II (Syt I/II) como sus receptores8-13, mientras que las BoNT/A, E, D y F usan otra proteína de vesícula sináptica SV29-14-18. Además de los receptores de proteínas, todos las BoNT requieren gangliósidos co-receptores lipídicos (Fig. 1 D), los cuales son abundantes en las superficies neuronales 19 Entre las dos isoformas de Syt en roedores y probablemente en la mayoría de los mamíferos, Syt II tiene una afinidad de unión ~10 veces más alta para BoNT/B que Syt I y, además, es la isoforma dominante expresada en las terminales nerviosas motoras, las cuales son las neuronas dirigidas para las BoNT (Fig. 2A)2021. Por lo tanto, en roedores (en los cuales se ha conducido la mayor parte de la investigación), Syt II se considera el receptor de toxina mayor, mientras que Syt I es un receptor de toxina menor en las terminales nerviosas motoras.
Se puede argumentar que las BoNT ya tienen especificidad alta por las neuronas, ¿es posible mejorar adicionalmente su unión a las neuronas?. La respuesta es un "sí" para humanos, debido a que se descubrió recientemente que la Syt II humana ha disminuido grandemente en unión y función como el receptor para la BoNT/B debido a un cambio de aminoácido único de la Syt II de roedor (rata/ratón) dentro del sitio de unión a toxina13'22. Este es un cambio de fenilalanina (F) a la leucina (L) en la posición 54 (secuencia de Syt II de ratón) (Fig. 2B). Las alineaciones de secuencias han revelado que la fenilalanina en esta posición es altamente conservada tanto en Syt I como en Syt II a través de
vertebrados, lo que incluye ornitorrinco, peces, roedores y monos23. Solamente la Syt II humana y de chimpancé contiene leucina en esta posición. Como un resultado de este cambio de residuo, la Syt II humana y de chimpancé ha disminuido grandemente la unión a la BoNT/B, D-C y G (Fig. 2C) y es significativamente menos eficiente en mediar la entrada de BoNT/B (Fig. 2D), en comparación con la Syt II de ratón. Puesto que la Syt I humana y de chimpancé todavía contiene fenilalanina en la misma posición y puede unirse a la BoNT/B, D-C, y G (Fig. 2E), el receptor de alta afinidad para las BoNT/B, D-C y G en humanos se restringe al receptor menor Syt I. Estos descubrimientos proporcionan una explicación para las observaciones clínicas de que una dosis mucho más alta de BoNT/B que BoNt /A (que enlaza un receptor diferente) es necesaria para alcanzar los mismos niveles de efectos terapéuticos en pacientes2425. Previamente estas observaciones se atribuyeron a otras razones, tal como el porcentaje de neurotoxina activa en las preparaciones usadas. Las observaciones recientes de dichas diferencias de unión de BoNT/B y Syt II humana contra Syt II de otra especie sugieren que diferentes residuos de la BoNT/B pueden involucrarse en la unión a la Syt II humana. Como tal, la modificación de la secuencia a la BoNT/B que se espera que afecte la unión a Syt II de roedor puede tener efectos impredecibles en la unión de la BoNT/B a la Syt II humana.
Resumen
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para uso en la atenuación de la actividad neuronal o inhibición de la liberación de neurotransmisores, en la que la composición farmacéutica comprende o suministra una molécula que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc ) de Clostridial botulinum, en la que el B-Hc modificado comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionados del grupo que consiste en E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199F; S1199L; S1201V; V1118M; Y1183M; y combinaciones de las mismas, en la que una o más mutaciones de sustitución producen una unión mejorada del B-Hc modificado a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso autónomo, en la que la composición farmacéutica comprende o suministra una molécula que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc ) de Clostridial botulinum, en la que el B-Hc modificado comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionados del grupo que consiste en E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199F; S1199L; S1201V; V1118M; Y1183M; y combinaciones de las mismas, en la que una o más mutaciones de sustitución producen una unión mejorada del B-Hc modificado a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un trastorno que implica un mal funcionamiento respiratorio, preferiblemente en el que el mal funcionamiento respiratorio es una enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma, en la que la composición farmacéutica comprende o suministra una molécula que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc ) de Clostridial botulinum, en la que el B-Hc modificado comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionados del grupo que consiste en E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199F; S1199L; S1201V; V1118M; Y1183M; y combinaciones de las mismas, en la que una o más mutaciones de sustitución producen una unión mejorada del B-Hc modificado a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la curvatura espinal juvenil o escoliosis, en la que la composición farmacéutica comprende o suministra una molécula que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc ) de Clostridial botulinum, en la que el B-Hc modificado comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionados del grupo que consiste en E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199F; S1199L; S1201V; V1118M; Y1183M; y combinaciones de las mismas, en la que una o más mutaciones de sustitución producen una unión mejorada del B-Hc modificado a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución.
En una realización, el dominio de unión al receptor modificado corresponde a los residuos 1028-1291 de la SEQ ID NO: 4.
En una realización, el dominio de unión al receptor modificado posee un 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo silvestre de referencia de una cepa 1 de Clostridial botulinum serotipo B, cepa 1.
En una realización, la molécula es un polipéptido, en el que opcionalmente el polipéptido comprende:
a) un dominio de proteasa;
b) un sitio de escisión de proteasa;
c) un dominio de translocación; y
d) el dominio de unión al receptor modificado.
En una realización, el dominio de proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de la proteasa son del serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C, D, E, F, G y una combinación de los mismos, preferiblemente en el que el dominio de proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de la proteasa son del serotipo B, cepa 1 o del serotipo A, cepa 1.
En una realización, la molécula es una molécula quimérica que comprende una primera porción que es el dominio de unión al receptor modificado unido a una segunda porción.
En una realización, la primera porción y la segunda porción están enlazadas covalentemente o están enlazadas de forma no covalente, y la segunda porción se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido corto y una proteína, preferiblemente en la que la segunda porción es una molécula bioactiva, un polipéptido terapéutico o un fármaco no polipeptídico.
En una realización, el B-Hc modificado comprende dos mutaciones de sustitución, preferiblemente en las que las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199Y, E1191M y S1199L, E1191M y S1199F, E1191Q y S1199L, E1191Q y S1199Y, o E1191Q y S1199F.
En una realización, la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico, preferiblemente un vector, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula que se suministra.
En una realización, la composición farmacéutica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización, el uso comprende administrar la composición farmacéutica de tal manera que la molécula se suministra en una dosis menor que la requerida para una molécula de otra manera idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución para lograr el mismo efecto.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende una composición farmacéutica para uso como se describe anteriormente y las instrucciones para la administración terapéutica de la composición farmacéutica.
Se describe en la presente un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) que comprende un dominio de proteasa, un sitio de segmentación de proteasa, un dominio de translocacíón y un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc) de Clostridial botulinum, que comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a mutaciones de sustitución en la cepa 1, de serotipo B, seleccionadas del grupo que consiste en V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; y combinaciones de estas. El (B-Hc ) modificado puede comprender dos mutaciones de sustitución. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199I, E1191M y S1199Y, E1191M y S1199F, E1191Q y S1199L, E1191Q y S1199Y, o E1191Q y S1199F. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199L. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199Y. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199F. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191Q y S1199L. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191Q y S1199Y. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191Q y S1199F.
También se describe en la presente un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) que comprende un dominio de proteasa, un sitio de segmentación de proteasa, un dominio de translocación y un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc ) de Clostridial botulinum, que comprende una mutación de sustitución en una posición correspondiente a S1199 o S1201 de serotipo B, cepa 1. La mutación de sustitución puede producir una unión aumentada de B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión reducida del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución. La mutación de sustitución puede producir una unión aumentada del B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión incrementada del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución. La mutación de sustitución puede seleccionarse del grupo que consiste en A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y y V sustituido por S. La mutación de sustitución puede ser un aminoácido que no se presenta naturalmente sustituido por S. El B-Hc modificado puede ser de la cepa 1. El dominio de proteasa, el dominio de translocación y el sitio de segmentación de proteasa pueden ser del serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C, D, E, F, G, y combinaciones de estos. El dominio de proteasa, el dominio de translocación y el sitio de segmentación de proteasa pueden ser de serotipo B, cepa 1. El dominio de proteasa, el dominio de translocación y el sitio de segmentación de proteasa pueden ser del serotipo A, cepa 1.
Se describe adicionalmente en la presente un polipéptido que comprende un dominio de unión a receptor modificado del serotipo B (B-Hc ) de Clostridial botulinum que comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a las mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionados del grupo que consiste en V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; y combinaciones de estas. El (B-Hc) modificado puede comprender dos mutaciones de sustitución. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199L, E1191M y S1199Y, E1191M y S1199F, E1191Q y S1199L, E1191Q y S1199Y, o E1191Q y S1199F. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199L. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199Y. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a
E1191M y S1199F. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191Q y S1199L. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191Q y S1199Y. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191Q y S1199F.
Se describe además en la presente un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc) de Clostridial botulinum que comprende una mutación de sustitución en una posición correspondiente a S1199 o S1201 del serotipo B, cepa 1. La mutación de sustitución puede producir una unión aumentada del B -H c modificado a la Syt II humana y/o unión reducida del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución. La mutación de sustitución puede producir una unión aumentada del B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión incrementada del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución. La mutación de sustitución puede seleccionarse del grupo que consiste en A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y y V sustituido por S. La mutación de sustitución puede ser un aminoácido que no es de origen natural sustituido por S. El B-Hc modificado puede ser de la cepa 1.
Se describe en la presente, además, una molécula quimérica que comprende una primera porción que es un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc ) de Clostridial botulinum enlazado a una segunda porción, en donde la B-Hc modificada comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a las mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionadas del grupo que consiste en V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V y combinaciones de estas. El B-Hc modificado puede comprender dos mutaciones de sustitución. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199L, E1191M y S1199Y, E1191M y S1199F, E1191Q y S1199L, E1191Q y S1199Y, o E1191Q y S1199F. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199L. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199Y. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191M y S1199F. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191Q y S1199L. Las dos mutaciones de sustitución pueden corresponder a E1191Q y S1199Y. Las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191Q y S1199F. El B-Hc modificado puede comprender un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc) de Clostridial botulinum que comprende una mutación de sustitución en una posición correspondiente a S1199 o S1201 del serotipo B, cepa 1. La mutación de sustitución puede producir una unión aumentada del B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión reducida del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución. La mutación de sustitución puede producir una unión aumentada del B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión incrementada del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución. La mutación de sustitución puede seleccionarse del grupo que consiste en A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y y V sustituido por S. La mutación de sustitución puede ser un aminoácido que no es de origen natural sustituido por S. El B-Hc modificado puede ser de la cepa 1. La primera porción y la segunda porción pueden enlazarse covalentemente. La primera porción y la segunda porción pueden enlazarse no covalentemente. La segunda porción puede seleccionarse del grupo que consiste en una molécula pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido corto y una proteína. La segunda porción puede ser una molécula bioactiva. La segunda porción puede ser un fármaco polipéptido o no polipéptido terapéutico.
Se describe además en la presente un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o molécula quimérica descrita en la presente.
También se describe en la presente un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico descrito en la presente.
Se describe además en la presente una célula que comprende el vector de ácido nucleico descrito en la presente o el ácido nucleico descrito en la presente.
También se describe en la presente una célula que expresa el polipéptido o molécula quimérica descrito en la presente.
Se describe además en la presente una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) descrito en la presente, o la molécula quimérica descrita en la presente, o el vector de ácido nucleico descrito en la presente, o el ácido nucleico descrito en la presente. En una realización, la composición farmacéutica comprende, además, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se describe en la presente un kit que comprende una composición farmacéutica descrita en la presente e instrucciones para la administración terapéutica de la composición farmacéutica.
Se describe además en la presente un método para producir un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT), el método comprende las etapas de cultivar la célula hospedera descrita en la presente en condiciones en donde se produce dicho polipéptido de la BoNT. El método puede comprender, además, recuperar el polipéptido de la BoNT a partir del cultivo.
También se describe en la presente un método para tratar una afección asociada con la actividad neuronal no deseada que comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente del polipéptido de la BoNT descrito en la presente a un sujeto para de esta manera contactar con una o más neuronas que exhiben actividad neuronal no deseada, para de esta manera tratar la afección. La afección puede seleccionarse del grupo que consiste en, disfonía espasmódica,
tortícolis espasmódica, distoma laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distoma de mano focal, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica, anismus, espasticidad de miembro, tics, estremecimientos, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos de músculos, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos secretorios, dolor de los espasmos musculares, dolor de cabeza y condiciones dermatológicas o estéticas/cosméticas.
Se describe además en la presente un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) descrito en la presente descripción, la composición farmacéutica descrita en la presente descripción, la molécula quimérica descrita en la presente descripción o el polipéptido descrito en la presente descripción, cualquiera de ellos para usar en un medicamento o medicina.
También se describe en la presente un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) descrito en la presente descripción, la composición farmacéutica descrita en la presente descripción, la molécula quimérica descrita en la presente descripción o el polipéptido descrito en la presente descripción, cualquiera de ellos para usar en el tratamiento de una afección asociada con actividad neuronal no deseada.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A-Figura 1D muestra modelos esquemáticos de cómo las BoNT se dirigen a las neuronas (A), su estructura de proteína total (B), una lista de receptores identificados (C), y el modelo estructural para la unión de la BoNT/B a sus receptores Syt y gangliósidos (D). Figura 1A) Una vista esquemática de las acciones de la BoNT: las BoNT reconocen neuronas mediante la unión a sus receptores específicos (etapa 1 ), entran a las neuronas a través de la endocitosis mediada por receptor (etapa 2), las cadenas ligeras de BoNT se translocalizan después a través de las membranas endosomales en el citosol (etapa 3), donde estas cadenas ligeras actúan como proteasas para segmentar las proteínas del hospedero objetivo (etapa 4). El panel A está adaptado a partir del de Arnon, S. y otros, JAMA, 285:1059, 2001 33 Figura 1B: las BoNT se componen de una cadena ligera y una cadena pesada, conectadas a través de un enlace disulfuro. La cadena pesada puede dividirse, además, en dos dominios: el dominio de translocación (Hn) y el dominio de unión al receptor (HC). Estos dominios funcionales son bien definidos e intercambiables entre diferentes BoNT 1. Esto sugiere que la BoNT/B-Hc modificada puede usarse para reemplazar la BoNT/A-Hc para generar toxinas quiméricas. Figura 1C) Una lista de receptores de toxinas identificados. Figura 1D) Un modelo estructural que muestra la unión de la BoNT/B a su receptor de proteína, Syt (I/II) de roedor, así como su co-receptor lipídico, gangliósidos, sobre la superficie celular. D se adapta de Chai y otros, Nature, 444:1096, 200631.
La Figura 2A-Figura 2G muestran datos previos adaptados de las literaturas publicadas que muestran (1) Syt II humana no es un receptor efectivo para las BoNT/B, D-C, y G; (2) los cambios de residuos en el dominio de unión al receptor de la BoNT/B pueden cambiar significativamente la afinidad de unión a Syt II y la potencia de las toxinas; (3) los residuos clave dentro del dominio de unión al receptor de la BoNT/B que se han planteado como hipótesis que contribuyen a la unión de Syt II. Figura 2A) La comparación entre Syt I y Syt II de roedor indica que Syt II es el receptor de toxina principal, mientras que Syt I es un receptor de toxina menor en neuronas motoras de roedor. Figura 2B) La Syt II humana difiere de Syt II de ratón/rata por un solo residuo dentro del sitio de unión de toxina (residuo 54 en Syt II de ratón, 51 en Syt II humana). Figura 2C) Syt II 1-87 (m-Syt II) de ratón recombinante marcado con Glutationa S-transferasa (GST) y una Syt II 1-87 de ratón que imita a la Syt II humana (F54L, en la presente referida como h-Syt II) se inmovilizaron cobre cuentas de glutatión-Sefarosa, y se usaron para extraer BoNT/B, BoNT/D-C o BoNT/G, con o sin la presencia de gangliósido (Gangl). Todas las tres toxinas se enlazan a m-Syt II 1-87, pero no a h-Syt II en los ensayos de extracción. Figura 2D) Las neuronas de hipocampo de rata cultivadas expresan Syt I pero no Syt II8. Por lo tanto, la inactivación (KD) de Syt I genera neuronas sin receptores de toxina endógena. Después, se expresaron m-Syt II y h-Syt II de longitud completa en neuronas del hipocampo de Syt I KD, y estas neuronas se expusieron a la BoNT/B (20 nM, exposición de 5 min, 24 h de incubación). Se ha encontrado que h-Syt II fue menos eficiente significativamente que m-Syt II en mediar la entrada de BoNT/B, BoNT/D-C y BoNT/G en las neuronas Syt I KD, como se evidenció por los grados de segmentación del substrato de toxina sinaptobrevina (Syb). Figura 2E) Syt I 1-83 de rata y Syt I 1-80 humana se usaron para extraer BoNT/B, BoNT/D-C y BoNT/G, como se describe en el panel C. La Syt I humana medió niveles similares de unión de toxina como la Syt I de rata lo hizo para todas las tres toxinas. Las Figura 2A a E se adaptan de la publicación reciente: Peng y otros, J. Cell Science, 2012, 125:323313. Figura 2F) La afinidad de unión de la BoNT/B (también definida como BoNT/B1) y uno de sus subtipos conocidos como BoNT/B2 a Syt II de rata se determinó en un ensayo de competición, mediante el uso del dominio de unión al receptor de BoNT/B1 y B2 (panel derecho) para competir la unión de la BoNT/B1 marcada con 125I sobre Syt II recombinante (panel izquierdo). La IC50 (la cual refleja la afinidad de unión) es 0,48 nM para la BoNT/B1 y 2 nM para la BoNT/B2, ~4 veces de diferencia. Esta diferencia de afinidad se debe al C-terminal del dominio de unión al receptor (residuos 1028- 1291), debido a que intercambiar esta región entre BoNT/B1 y BoNT/B2 (panel derecho) intercambia virtualmente su afinidad de unión (panel derecho). Figura 2G) Lista de residuos que son diferentes entre BoNT/B1 y BoNT/B2. Se cree que estos residuos son la razón para la diferencia de afinidad de unión entre dos toxinas a Syt II de roedor. Por lo tanto, estos pueden ser residuos claves que pueden influenciar la afinidad de unión entre BoNT/B y la Syt II humana. Los paneles F a G se adaptan de Ihara y otros, 2003, BBA, 1625:1929 (H) Las mutaciones de un solo residuo dentro del dominio de unión al receptor de BoNt /A y BoNT/B, como se indica en la tabla, pueden cambiar significativamente la potencia y toxicidad de estas toxinas. Este panel se adapta de Rummel y otros, 2004, Mol. Microbiology, 51:63130. (I)
La estructura de cocristal de la unión de BoNT/B (gris) a Syt II (rojo) revela los residuos claves (listados en la tabla derecha) que forman la cavidad de unión en la BoNT/B. Este panel se adapta de Jin y otros, 2006, Nature, 444:1092 32 y Chai y otros, 2006, Nature, 444: 109631.
La Figura 3A-Figura 3B muestra la mutagénesis dirigida de la BoNT/B-Hc y sus efectos sobre la unión a m-Syt II y h-Syt II. Figura 3A) WT BoNT/B-Hc y los mutantes de la BoNT/B-Hc indicados se expresaron como proteínas recombinantes en E. coli. Los lisados bacterianos se recolectaron e incubaron con m-Syt II inmovilizada (1-87) o h-Syt II (1-87). Los sedimentos enlazados se analizaron mediante ensayos de inmunotransferencia, se detectó BoNT/B-Hc mediante el uso del anticuerpo HA. "Entrada" representa los lisados bacterianos. Los mutantes que muestran una unión fuerte a h-Syt II se indican por las flechas. Figura 3B) Tabla que categoriza las mutaciones de la BoNT/B-Hc probadas en la Figura 3A.
La Figura 4A-Figura 4B muestra la caracterización adicional de los mutantes de BoNT/B-Hc seleccionados para su unión a Syt I y Syt II. Figura 4A) Las BoNT/B-Hc WT y mutantes indicados se expresaron en E. Coli. Los lisados bacterianos recolectados se incubaron con Syt I (1-80) humana marcada con GST inmovilizada, con o sin la presencia de gangliósidos. Los materiales enlazados se analizaron mediante ensayos de inmunotransferencia que detectaron BoNT/B-Hc . E1191M aumentó significativamente la unión de la BoNT/B-Hc a la Syt I humana, mientras que V1118M redujo la unión a Syt I humana que WT BoNT/B-Hc. Figura 4B) WT BoNT/B-Hc y el mutante E1191M se purificaron como proteínas recombinantes marcadas con His6 y se incubaron con m-Syt II (1-87) marcado con GST inmovilizado o h-Syt II (1-87), con o sin la presencia del gangliósido co-receptor lipídico (Gangl). BoNT/B-Hc no puede unirse a h-Syt II sin los gangliósidos y solamente exhibe una unión débil en presencia de gangliósidos. El mutante E1191M purificado enlaza h-Syt II sin gangliósidos, y se aumenta la unión adicionalmente, en presencia de gangliósidos.
La Figura 5A-Figura 5B muestra que la unión a Syt I/II humana puede aumentarse, además, mediante la combinación de las sustituciones de un solo residuo seleccionadas. Figura 5A) mutantes dobles seleccionados que combinan dos sitios de mutación como se indica, se probaron para su habilidad para unir m-Syt II y h-Syt II en ensayos de extracción como se describe en la Fig. 3A. Las combinaciones de dos sitios, E1191M o E1191Q con S1199L o S1199Y o S1199F (marcados por flechas) exhibieron fuerte unión a h-Syt II. Figura 5B) La unión de mutantes dobles seleccionados a la Syt I humana se analizó en ensayos de extracción. Todos los mutantes dobles exhibieron una unión aumentada significativamente a la Syt I humana en comparación a WT BoNT/B-Hc .
La Figura 6A-Figura 6D muestra la caracterización adicional de un mutante doble representativo, E1191M/S1199Y. Figura 6A) los mutantes BoNT/B-Hc WT, E1191M y E1191M/S1199Y se expresaron en E. Coli y se purificaron como proteínas recombinantes marcadas con His6. Cantidades iguales de estas proteínas (100 nM) se incubaron con m-Syt II marcada con GST inmovilizada (1-87) o h-Syt II (1-87) como se indica, con o sin la presencia de gangliósidos (Gangl). Los materiales unidos se sometieron al análisis de inmunotransferencia. "Entrada" representa las proteínas recombinantes purificadas en los siguientes órdenes: WT, E1191M, E1191M/S1199Y. WT BoNT/B-Hc no puede unirse a h-Syt II sin gangliósidos y solamente exhibe una unión débil en la presencia de gangliósidos (franja 4, 5). El mutante E1191M se enlaza a h-Syt II sin gangliósidos, y la unión se aumenta, además, en la presencia de gangliósidos (franjas 6, 7). E1191M/S1199Y aumentó significativamente la unión a h-Syt II en comparación a E1191M (franja 8, 9). La unión de E1191M/S1199Y tanto a h-Syt II (franja 8, 9) y m-Syt II (franja 10, 11) están en niveles similares como la unión de WT BoNT/B-HC a m-Syt II (franja 13, 14). Figura 6B) cantidades iguales de la BoNT/B-Hc WT, mutantes E1191M, y E1191M/S1199Y se incubaron con h-Syt I marcada con GST. Los materiales enlazados se sometieron al análisis de inmunotransferencia. Tanto E1191M como E1191M/S1199Y aumentaron significativamente la unión a h-Syt I en comparación con la WT BoNT/B-Hc. Figura 6C) Las titulaciones (nM) de WT BoNT/B-HC purificado se incubaron con m-Syt II, mientras que las titulaciones de E1191M/S1199Y purificado se incubaron con h-Syt II, como se indica. Los materiales enlazados se sometieron al análisis de inmunotransferencia. La unión de E1191M/S1199Y a h-Syt II está en niveles similares a la unión de WT BoNT/B-Hc a m-Syt II. Figura 6D) La afinidad de unión entre E1191M/S1199Y y h-Syt II se estimó en base a la cuantificación de los resultados de inmunotransferencia obtenidos en el panel C. Se estima que la Kd es 19 /- 3 nM para E1191M/S1199Y que se une a h-Syt II, mientras que la Kd para WT BoNT/B que se une a m-Syt II es 68 /-12 nM. Por lo tanto, la unión de E1191M/S1199Y a h-Syt II es ~ 3,5 veces más alta que la unión de la Wt BoNT/B a m-Syt II.
La Figura 7 muestra que el mutante BoNT/B-Hc E1191M/S1199Y puede unirse a la h-Syt II expresada sobre la superficie de neuronas. Las neuronas de hipocampo de rata cultivadas expresan solamente Syt I, pero no Syt II. Por lo tanto, la inactivación (KD) de la expresión de Syt I a través de la infección lentiviral creó neuronas sin ninguna Syt endógena y esto anuló la unión de WT y E1191M/S1199Y BoNT/B-Hc (la segunda estructura desde la izquierda). Después se expresaron M-Syt II, m-Syt II (F54L) y h-Syt II en estas neuronas a través de la infección lentiviral. WT BoNT/B-Hc puede unirse a m-Syt II, pero no a m-Syt II (F54L) o h-Syt II. El mutante E1191M/S1199Y puede unirse a m-Syt II y a h-Syt II en la superficie de la neurona. La sinapsina también se marcó como un marcador para sinapsis.
La Figura 8 es la secuencia de aminoácidos de la BoNT/B-Hc (cepa 1; cepa BoNT/B1 Okra). Residuos 857-1291 de BoNT/B, cepa 1, GenBank: AB232927.1, (SEQ ID NO: 1).
La Figura 9 es la secuencia de ácido nucleico que codifica BoNT/B-Hc (cepa B1, cepa Okra) residuos 857-1291 de la BoNT/B, cepa 1, en base en GenBank: AB232927.1) que se ha optimizado para la expresión en E. coli. La secuencia de ácido nucleico se muestra en la SEQ ID NO: 2.
La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos del serotipo A de C. botulinum (1296 a.a.) (SEQ ID NO: 3).
La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos del serotipo B de C. botulinum (1291 a.a.) (SEQ ID NO: 4).
La Figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos del serotipo C1 de C. botulinum (1291 a.a.) (SEQ ID NO: 5).
La Figura 13 muestra la secuencia de aminoácidos del serotipo D de C. botulinum (1276 a.a.) (SEQ ID NO: 6).
La Figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos del serotipo E de C. botulinum (1252 a.a.) (SEQ ID NO: 7).
La Figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos del serotipo F de C. botulinum (1274 a.a.) (SEQ ID NO: 8).
La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos del serotipo G de C. botulinum (1297 a.a.) (SEQ ID NO: 9).
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación se relaciona con la generación del polipéptido de neurotoxina de C. botulinum (BoNT) que tiene una unión mejorada a sus receptores humanos a través de la incorporación de un dominio de unión al receptor modificado. A partir de estos descubrimientos, puede crearse una nueva generación de BoNT terapéuticas con el uso del dominio de unión al receptor modificado identificado en la presente descripción, con eficacia y especificidad mejoradas a las neuronas humanas objetivo que las WT BoNT usadas actualmente.
Definiciones
Como se usa en la presente descripción, el término "afinidad de unión" significa cuan fuerte es la actividad de unión de la molécula para un sistema de receptor particular. En general, la afinidad de unión alta resulta de una fuerza intermolecular más grande entre un dominio de unión y su sistema receptor mientras que afinidad de unión baja involucra menos fuerza intermolecular entre el ligando y su receptor. La afinidad de unión alta involucra un tiempo de residencia más largo para el dominio de unión en su sitio de unión al receptor que en el caso para la afinidad de unión baja. Como tal, una molécula con una afinidad de unión alta significa que se requiere una concentración menor de esa molécula para ocupar máximamente los sitios de unión de un sistema receptor y activar una respuesta fisiológica. A la inversa, la afinidad de unión baja significa que se requiere una concentración relativamente alta de una molécula antes de que los sitios de unión del receptor de un sistema de receptor se ocupen máximamente y se alcance la respuesta fisiológica máxima. De esta manera, una neurotoxina botulínica como se describe en la presente con la actividad de unión incrementada debido a la afinidad de unión alta permitirá la administración de dosis reducidas de la toxina, para de esta manera reducir o prevenir los efectos secundarios indeseados asociados con la dispersión de la toxina en áreas no dirigidas.
Como se usa el término en la presente, "unión significativamente aumentada" cuando se usa para describir la afinidad de unión de una molécula de neurotoxina de C. botulinum como se describe en la presente a un receptor específico, se refiere a un aumento en la afinidad de unión para un receptor específico que aumenta sustancialmente (por ejemplo, en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la afinidad de unión de la molécula de tipo silvestre) en comparación a la versión no sustituida de la molécula. La unión aumentada puede ser de un orden de magnitud o más alto que la Kd de la neurotoxina no sustituida (por ejemplo, la neurotoxina con una molécula BoNT Hc de origen natural). El término "unión significativamente aumentada" cuando se usa para describir la afinidad de unión de un fragmento de unión de la BoNT/B-Hc producido por las mutaciones puntuales descritas en la presente se refiere a un incremento en la afinidad de unión del dominio de unión modificado (expresado como un fragmento aislado de la proteína BoNT completa) a un receptor específico que es incrementada sustancialmente (por ejemplo, en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la afinidad de unión) en comparación con la unión de la versión no sustituida de la molécula. La unión aumentada puede ser significativamente más alto (por ejemplo, 1.5X, 2.0X, 2.5X, 3.0X, etcétera) que la Kd del fragmento no sustituido.
Como se usa en la presente, el término "neurotoxina botulínica" significa cualquier polipéptido que puede realizar el mecanismo celular total mediante el cual una toxina de C. botulinum entra a una neurona e inhibe la liberación del neurotransmisor y abarca la unión de una toxina de C. botulinum a un complejo de receptor de afinidad baja o alta, la internalización de la toxina, la translocación de la cadena ligera de toxina en el citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de toxina de C. botulinum.
Un "dominio de unión al receptor modificado" o "Hc modificado", como se usa el término en la presente, facilita la unión de la molécula de neurotoxina de C. botulinum en la que está comprendida, a un receptor para la neurotoxina de C. botulinum ubicada en la superficie de una célula objetivo. Dicha molécula se genera típicamente a través de la tecnología de recombinación genética. El Hc modificado tiene una afinidad de unión para el receptor para la neurotoxina de C. botulinum ubicada sobre la superficie de una célula objetivo. Como se usa en la presente, el término "actividad de unión" significa que una molécula está directa o indirectamente en contacto con otra molécula a través de al menos una fuerza intermolecular o intramolecular, que incluye, sin limitación, un enlace covalente, un enlace iónico, un enlace metálico, un enlace de hidrógeno, una interacción hidrofóbica, una interacción de van der Waals, y similares, o cualquier combinación de estos. "Unidos" y "unir" se consideran términos para la unión.
Como se usa en la presente, el término "dominio de proteasa de toxina de C. botulinum" significa un dominio de toxina de C. botulinum que puede llevar a cabo la etapa de modificación enzimática del objetivo del proceso de intoxicación. De esta manera, un dominio de proteasa de toxina de C. botulinum se dirige específicamente a un sustrato de toxina de C. botulinum y abarca la segmentación proteolítica de un substrato de toxina de C. botulinum, tal como, por ejemplo, proteínas SNARE similares a un sustrato SNAP-25, un sustrato VAMP y un substrato de sintaxina.
Ejemplos no limitantes de dominios de proteasa de toxina de C. botulinum se proporcionan en la Tabla 1 y 2.
Como se usa en la presente, el término "dominio de translocación de toxina de C. botulinum" o "Hn" significa un dominio de toxina de C. botulinum que puede ejecutar la etapa de translocación del proceso de intoxicación que media la translocación de cadena ligera de toxina de C. botulinum. De esta manera, un Hn facilita el movimiento de una cadena ligera de toxina de C. botulinum a través de una membrana y abarca el movimiento de una cadena ligera de toxina C. botulinum a través de la membrana de una vesícula intracelular en el citoplasma de una célula. Ejemplos no limitantes de Hn incluyen un BoNT/A Hn, un BoNT/B Hn, un BoNT/C1 Hn, un BoNT/D Hn, un BoNT/E Hn, un BoNT/F Hn, y un BoNT/G Hn, cuyas secuencias de aminoácidos se proporcionan en la Tabla 1 y en las Figuras 10-16.
Como se usa en la presente, el término "dominio de unión al receptor de C. botulinum" es sinónimo con "dominio Hc" y significa cualquier dominio de unión al receptor de C. botulinum de origen natural que puede ejecutar la etapa de enlace de célula del proceso de intoxicación, lo que incluye, por ejemplo, la unión de la toxina de C. botulinum a un sistema receptor específico de toxina de C. botulinum ubicado sobre la superficie de la membrana plasmática de una célula objetivo. Se contempla que el reemplazo de la actividad de unión puede alcanzarse, por ejemplo, mediante el reemplazo del dominio Hc de C. botulinum completo por un dominio Hc modificado (por ejemplo, aumentado).
Como se usa en la presente, el término "célula objetivo de toxina de C. botulinum" se refiere a una célula que es una célula de origen natural a la que una toxina de C. botulinum de origen natural es capaz de intoxicar, que incluye, sin limitación, neuronas motoras; neuronas sensoriales; neuronas autonómicas; tales como, por ejemplo, neuronas del sistema simpático y neuronas parasimpáticas; neuronas no-petidérgicas, tales como, por ejemplo, neuronas colinérgicas, neuronas adrenérgicas, neuronas noradrenérgicas, neuronas serotonérgicas, neuronas GABAérgicas y neuronas peptidérgicas, tales como, por ejemplo, neuronas de Sustancia P, neuronas de Péptido Relacionado con el Gen de Calcitonina, neuronas de péptido intestinales vasoactivas, neuronas de Neuropéptido Y, neuronas de colecistoquinina.
Por "aislado" se entiende un material que está libre de grados variables de componentes que normalmente lo acompañan como se encuentra en su estado nativo. "Aislado" denota un grado de separación de la fuente original o alrededores, por ejemplo, del ADN flanqueante o de la fuente natural del ADN.
El término "purificado" se usa para referirse a una sustancia tal como un polipéptido que es "sustancialmente pura", con respecto a otros componentes de una preparación (por ejemplo, otros polipéptidos). Puede referirse a un polipéptido que es al menos aproximadamente 50%, 60%, 70% o 75%, preferentemente, al menos aproximadamente 85%, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 90%, y, con la máxima preferencia, al menos aproximadamente 95% puro, con respecto a otros componentes. Del mismo modo, los términos "sustancialmente puro" o "esencialmente purificado", con respecto a un polipéptido, se refiere a una preparación que contiene menos de aproximadamente 20%, con mayor preferencia menos de aproximadamente 15%, 10%, 8%, 7%, con la máxima preferencia menos de aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos de 1%, de uno o más otros componentes (por ejemplo, otros polipéptidos o componentes celulares).
El término "conservativa" o "mutación de sustitución conservativa" como se usa en la presente se refiere a una mutación donde un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría la estructura secundaria, propiedades químicas y/o naturaleza hidropática del polipéptido se mantengan sustancialmente sin cambios. Los siguientes grupos de aminoácidos se han sustituido históricamente entre sí como cambios conservativos: (1 ) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, try, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Otras sustituciones conservativas aceptadas comúnmente se enumeran más abajo:
El término "mutación de sustitución" sin referencia a un aminoácido específico, puede incluir cualquier aminoácido diferente del residuo de tipo silvestre encontrado normalmente en esa posición. Dichas sustituciones pueden ser el reemplazo con aminoácidos no polares (hidrofóbicos), tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano y prolina. Las sustituciones pueden ser el reemplazo con aminoácidos polares (hidrofílicos) tales como serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Las sustituciones pueden ser el reemplazo con aminoácidos cargados eléctricamente, por ejemplo, aminoácidos eléctricamente cargados negativamente tales como ácido aspártico y ácido glutámico y aminoácidos eléctricamente cargados positivamente tales como lisina, arginina e histidina.
Las mutaciones de sustitución descritas en la presente se reemplazarán típicamente con un residuo de aminoácido de origen natural diferente, pero en algunos casos pueden sustituirse, además, residuos de aminoácido que no es de origen natural. Los aminoácidos no naturales, como se usa el término en la presente, son aminoácidos no proteinogénicos (es decir, no codifican proteína) de o bien de origen natural o se sintetizan químicamente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a p-aminoácidos (p3 y p2 ), homo-aminoácidos, prolina y derivados del ácido pirúvico, derivados de alanina 3-sustituido, derivados de glicina, derivados de fenilalanina y tirosina sustituido en el anillo, aminoácidos de núcleo lineal, diaminoácidos, D-aminoácidos y N-metil aminoácidos. El aminoácido puede ser sustituido o no sustituido. El aminoácido sustituido o sustituyente puede ser un aminoácido aromático alifático halogenado, una modificación alifática o aromática halogenada sobre la cadena lateral hidrofóbica, o una modificación alifática o aromática.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es suficiente para efectuar una reducción terapéuticamente significativa en uno o más síntomas de la afección cuando se administran a un sujeto típico que tiene la afección. Una reducción terapéuticamente significativa en un síntoma es, por ejemplo, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 100%, o más en comparación con un sujeto control o no tratado.
El término "tratar" o "tratamiento" se refiere a un tratamiento terapéutico en donde el objetivo es eliminar o disminuir los síntomas. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, eliminación de síntomas, alivio de síntomas, disminución del grado de la afección, estado estabilizado (es decir, no empeoramiento) de la afección, retardo o enlentecimiento de la progresión de la afección.
Como se usa en la presente, un "sujeto" se refiere a un ser humano o un animal. Usualmente el animal es un vertebrado tal como un primate, roedor, animal doméstico o animal deportivo. Los primates incluyen chimpancés, monos cynomolgus, monos araña y macacos, por ejemplo, Rhesus. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámster. Los animales domésticos y deportivos incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervos, bisontes, búfalos, especies felinas, por ejemplo, gato doméstico, especies caninas, por ejemplo, perro, zorro, lobo, especies de aves, por ejemplo, pollo, emú, avestruz y peces, por ejemplo, trucha, bagre y salmón. El paciente o sujeto incluye cualquier subconjunto de los anteriores, por ejemplo, todos los anteriores, pero que excluye uno o más grupos o especies tales como humanos, primates o roedores. En ciertas realizaciones de los aspectos descritos en la presente, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un humano. Los términos, "paciente" y "sujeto" se usan intercambiablemente en la presente. Un sujeto puede ser macho o hembra. Un sujeto puede ser un sujeto completamente desarrollado (por ejemplo, un adulto) o un sujeto que experimenta el proceso de desarrollo (por ejemplo, un niño, infante o feto).
Preferentemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca, pero se limitan a estos ejemplos. Los mamíferos diferentes de los humanos pueden usarse ventajosamente como sujetos que representan modelos animales de los trastornos asociados con la actividad neuronal no deseada. Además, los métodos y composiciones descritos en la presente pueden usarse para tratar animales domesticados y/o mascotas.
Realizaciones
La observación de que la BoNT/B es menos específica y potente en humanos debido a su incapacidad para unirse a la Syt II humana, puede explicar por qué se requieren dosis comparativamente más altas que la BoNT/A. Las dosis de BoNT/B más altas corresponden a oportunidades incrementadas de que se activen respuestas de anticuerpos y de que ocurran efectos secundarios serios. Por lo tanto, la unión mejorada de la BoNT/B al receptor humano Syt II, para incrementar su eficacia y especificidad a las neuronas humanas objetivo debe permitir una cantidad reducida de las dosis de toxina usadas en aplicaciones terapéuticas.
Los aspectos de la invención surgen del descubrimiento de que la modificación de la secuencia de proteína de la BoNT/B-Hc modifica la unión del fragmento que contiene el dominio de unión a receptor, al receptor de Syt II humana. Se han identificado modificaciones específicas que aumentan la unión, lo cual genera de esta manera un dominio que
enlaza la Syt II humana con afinidad alta. La BoNT/B-Hc modificada, en el contexto de una proteína de BoNT de longitud completa, retiene estas propiedades de unión. La incorporación de un dominio de unión al receptor modificado con unión aumentada, en una molécula que comprende los otros dominios de la BoNT, genera de esta manera una molécula de BoNT de longitud completa con unión al receptor aumentada similarmente. Como tal, se generan nuevas versiones de BoNT con unión de afinidad alta a la Syt II humana. La BoNT con unión significativamente aumentada puede usarse en terapias similares, aunque en dosis menores que las moléculas de BoNT disponibles actualmente, lo que proporciona de esta manera métodos más seguros de tratamiento.
Los polipéptidos de BoNT, que incluyen polipéptidos de BoNT de longitud completa y fragmentos o dominios de polipéptido de BoNT descritos en la presente, y las moléculas de ácidos nucleicos que los codifican pueden generarse mediante procedimientos de ADN recombinante conocidos en la técnica. Dichos polipéptidos se mencionan típicamente como "polipéptidos recombinantes" o "ácidos nucleicos recombinantes".
La BoNT tiene la estructura total mostrada en la Figura 1B. La BoNT se compone de tres dominios, cada dominio tiene una función específica e independiente: un dominio de proteasa (referido también como la cadena ligera), un dominio de translocación (Hn) y un dominio de unión al receptor (Hc). Los dominios de las diversas cepas de neurotoxina de C. botulinum han mostrado ser grandemente intercambiables (como se demostró por las toxinas quiméricas de origen natural tal como BoNT/CD, la cual se compone de la cadena ligera y Hn de BoNT/C, con e1Hc de BoNT/D 34, en la Patente de los Estados Unidos 8,052,979). La proteína puede estar en forma de una sola cadena o forma de di-cadena. La forma de di-cadena resulta del procesamiento de proteasa de origen natural de un sitio de segmentación de proteasa ubicado entre el dominio de proteasa y el dominio de translocación. La proteína se mantiene en la forma de di-cadena después del procesamiento de proteasa mediante la presencia de un enlace disulfuro.
Se describe en la presente una neurotoxina botulínica (BoNT) que comprende un dominio de proteasa, un dominio de translocación y un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de Clostridial botulinum, como se describe en la presente, y un sitio de segmentación de proteasa. Típicamente, estos se disponen en un orden de polipéptido único de amino a carboxilo lineal de dominio de la proteasa, el sitio de segmentación de proteasa, el dominio de translocación y el dominio de unión al receptor modificado. Sin embargo, se espera que diferentes disposiciones de los diversos dominios funcionen adecuadamente. El dominio de unión al receptor modificado puede comprender una o más mutaciones de sustitución las cuales conducen a la unión significativamente aumentada al receptor Syt I humano y/o al receptor Syt II humano.
Las cepas de Clostridial botulinum producen siete tipos distintos antigénicamente de toxinas botulínicas (BoNT), los cuales se han identificado al investigar brotes de botulismo en el hombre (BoNT/A, /B, /E y /F), animales (BoNT/C1 y /D) o aislado del suelo (BoNT/G). Aunque los siete serotipos de la BoNT tienen estructura y propiedades farmacológicas similares, cada uno exhibe, además, características bacteriológicas heterogéneas. La diversidad genética de las cepas de C. botulinum se describe en detalle en Hill y otros, (Journal of Bacteriology, Vol. 189, No. 3, p. 818-832 (2007)) 35
Las toxinas de las diversas cepas de C. botulinum comparten la misma organización de dominio funcional y la arquitectura estructural total. Las toxinas de C. botulinum se traducen cada una como un polipéptido de una sola cadena de aproximadamente 150 kDa que se segmenta subsecuentemente mediante escisión proteolítica dentro de un bucle de disulfuro por una proteasa de origen natural, tal como, por ejemplo, una proteasa de toxina de C. botulinum endógena o proteasas de origen natural producidas en el ambiente. Este procesamiento post-traduccional produce una molécula di-cadena que comprende una cadena ligera (LC) de 50 kDa aproximadamente y una cadena pesada (HC) de 100 kDa aproximadamente mantenidas unidas por un único enlace disulfuro e interacciones no covalentes. Cada molécula di-cadena madura comprende tres dominios distintos funcionalmente: 1) un dominio proteolítico localizado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad de endopeptidasa dependiente de zinc que se dirige específicamente a los componentes de núcleo del aparato de liberación de neurotransmisores; 2) un dominio de translocación contenido dentro de la mitad amino-terminal de la HC (Hn) que facilita la liberación de la LC de las vesículas intracelulares en el citoplasma de la célula objetivo; y 3) un dominio de unión encontrado dentro de la mitad carboxilo-terminal de la HC que determina la actividad de unión y especificidad de unión de la toxina al complejo receptor ubicado en la superficie de la célula objetivo. Las ubicaciones de los dominios específicos dentro de la toxina se proporcionan en la Tabla 1:
Tabla 1
Dominios de toxina de C. botulinum de varias cepas
Las secuencias de aminoácidos completas de las toxinas se proporcionan en las Figuras 10-16.
La unión, translocación y actividad de proteasa de estos tres dominios funcionales son necesarios para la toxicidad. El mecanismo de intoxicación celular total mediante el cual las toxinas de C. botulinum entran en una neurona e inhiben la liberación del neurotransmisor es similar, sin considerar el serotipo o subtipo. Sin desear estar limitados por la teoría, el mecanismo de intoxicación involucra por lo menos cuatro etapas: 1 ) unión al receptor, 2 ) internalización del complejo, 3) translocación de la cadena ligera y 4) modificación por proteasa del objetivo. El proceso se inicia cuando el dominio Hc de una toxina de C. botulinum se une a un receptor específico de toxina ubicado en la superficie de la membrana plasmática de una célula objetivo. Se cree que la especificidad de unión de un complejo receptor se alcanza, en parte, por combinaciones específicas de los gangliósidos y receptores de proteína. Una vez unidos, los complejos toxina/receptor se internalizan mediante endocitosis y las vesículas internalizadas se distribuyen en rutas intracelulares específicas. La etapa de translocación se activa por la acidificación del compartimiento de vesícula. Una vez translocada, la endopeptidasa de cadena ligera de la toxina se libera de la vesícula intracelular en el citosol, donde se dirige específicamente a una de las tres proteínas conocidas como los componentes de núcleo del aparato de liberación de neurotransmisores (proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP)/sinaptobrevina, proteína asociada a sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25) y Sintaxina). Estos componentes del núcleo son necesarios para la disposición de vesícula sináptica y la fusión en el terminal nervioso y constituyen los miembros de la familia del receptor de proteína de unión al factor sensible a la N-etilmaleimida (SNARE). Las BoNT/A y BoNT/E segmentan SNAP-25 en la región carboxilo-terminal, lo que libera un segmento de nueve o veintiséis aminoácidos, respectivamente, y BoNT/C1 también segmenta SNAP-25 cerca del carboxilo-terminal. Los serotipos botulínicos BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G y la toxina del tétano, actúan en la porción central conservada de VAMP, y liberan la porción amino-terminal de VAMP en el citosol. BoNT/C1 segmenta la sintaxina en un solo sitio cerca de la superficie de membrana de plasma citosólica. La proteólisis selectiva de SNARE sinápticas tiene impacto para el bloqueo de la liberación de neurotransmisores causado por las toxinas de C. botulinum in vivo. Las proteínas SNARE objetivo de las toxinas de C. botulinum son comunes a la exocitosis en una variedad de tipos no neuronales; en estas células, como en las neuronas, la actividad de peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis, ver, por ejemplo, Yann Humeau y otros, How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton y otros, Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci.
552-558. (2002); Giovanna Lalli y otros, The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).
La neurotoxina botulínica comprende un dominio de unión al receptor modificado. El dominio de unión al receptor modificado exhibe una unión significativamente aumentada a uno o más receptores humanos unidos y usados típicamente por una o más cepas de toxina de C. botulinum. Ejemplos de dominios de unión al receptor modificados específicos se proporcionan en la presente. El polipéptido de dominio de unión al receptor modificado aislado descrito en la presente se abarca también por la presente divulgación, así como la molécula de ácido nucleico aislada mediante la cual se codifica.
La neurotoxina botulínica comprende, además, un dominio de proteasa, también referido en la técnica como una variante de la cadena ligera. La variante de la cadena ligera puede ser una variante de cadena ligera de origen natural, tal como, por ejemplo, isoformas de cadena ligera de toxina de C. botulinum y subtipos de cadena ligera de toxina de C. botulinum; o una variante de cadena ligera de toxina de C. botulinum que no es de origen natural, tal como, por ejemplo, las variantes de cadena ligera de toxina de C. botulinum de sustitución conservativa.
La neurotoxina botulínica comprende, además, un dominio de translocación de toxina (Hn).
Los diversos dominios descritos en la presente (por ejemplo, Hn, Hc, o dominio de proteasa) incluyen, sin limitación, variantes de origen natural, tales como, por ejemplo, isoformas y subtipos; variantes que no son de origen natural, tales como, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservativa. Las variantes que no son de origen natural, se refieren a un dominio que tiene al menos un cambio de aminoácido de la región correspondiente de las secuencias de referencia (por ejemplo, de la Tabla 1 o Figuras 10-16) y puede describirse en porciento de identidad con la región correspondiente de esa secuencia de referencia.
Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada serotipo de toxina de C. botulinum puede haber variantes de dominio de C. botulinum de origen natural que difieren de alguna forma en su secuencia de aminoácidos, y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Una variante de dominio de toxina de C. botulinum de origen natural (por ejemplo, cadena ligera, Hn o Hc) contemplada para el uso en la generación de la BoNT puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de toxina de C. botulinum de referencia sobre el cual se basa la
variante de dominio de C. botulinum de origen natural, y puede sustituirse por el dominio de toxina de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.
Un ejemplo no limitante de una variante de dominio de toxina de C. botulinum de origen natural es una isoterma de dominio de toxina de C. botulinum tal como, por ejemplo, una isoterma de dominio BoNT/A, una isoterma de dominio BoNT/B, una isoforma de dominio BoNT/Cl, una isoforma de dominio BoNT/D, una isoforma de dominio BoNT/E, una isoforma de dominio BoNT/F, y una isoforma de dominio BoNT/G. Una isoforma de dominio de toxina de C. botulinum puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de toxina de C. botulinum de referencia sobre el cual se basa la isoforma de dominio de toxina de C. botulinum, y puede sustituirse por el dominio de toxina de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.
Otro ejemplo no limitante de una variante de dominio de toxina de C. botulinum de origen natural es un subtipo de dominio de toxina de C. botulinum tal como, por ejemplo, un dominio del subtipo BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, BoNT/A5; un dominio de subtipo de BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/B5, B0NT/B6, BoNT/B7; un dominio de subtipo de BoNT/C1-1, BoNT/C1-2, BoNT/D-C; un dominio de subtipo de BoNT/E1, BoNT/E2, BoNT/E3, BoNT/E4, BoNT/E5, B0NT/E6, BoNT/E7, B0NT/E8; y un dominio de subtipo de BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3, BoNT/F4, BoNT/F5, B0NT/F6, BoNT/F7. Un subtipo de dominio de toxina de C. botulinum puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de toxina de C. botulinum de referencia sobre el cual se basa el subtipo de dominio de toxina de C. botulinum, y puede sustituirse por el dominio de toxina de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.
Como se usa en la presente, el término "variante que no es de origen natural " (por ejemplo, variante de cadena ligera de toxina de C. botulinum Hc y Hn) significa un dominio de C. botulinum producido con la ayuda de la manipulación humana, que incluye, sin limitación, dominios producidos por ingeniería genética mediante el uso de mutagénesis aleatoria o diseño racional y los dominios de C. botulinum producidos mediante síntesis química. Ejemplos no limitantes de variantes de dominio de C. botulinum que no son de origen natural incluyen, por ejemplo, variantes de dominio de C. botulinum conservativas. Como se usa en la presente, el término "variante de dominio de C. botulinum conservativa" significa un dominio de C. botulinum que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a aquella del amino ácido original de la secuencia del dominio de C. botulinum de referencia (por ejemplo, Tabla 1 y Figuras 10-16). La variante puede tener una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácido conservativas en comparación con la secuencia de dominio de referencia. Ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, capacidad de enlace covalente, capacidad de enlace de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, o similares, o cualquier combinación de estos. Una variante de dominio de C. botulinum conservativa puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de toxina de C. botulinum de referencia sobre la cual se basa la variante de dominio de toxina de C. botulinum conservativa, y puede sustituirse por el dominio de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.
Una variante de dominio de toxina de C. botulinum que no es de origen natural puede sustituir uno o más aminoácidos (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o más) del dominio de toxina de C. botulinum de referencia sobre el cual se basa el dominio de toxina de C. botulinum de origen natural. Una variante de dominio de toxina de C. botulinum que no es de origen natural puede poseer, además, 95% o más (por ejemplo, 96%, 97%, 98% o 99%) de identidad de aminoácidos con respecto al dominio de toxina de C. botulinum de referencia sobre el cual se basa la variante de dominio de C. botulinum de origen natural.
Varias neurotoxinas de C. botulinum que no son de origen natural o dominios específicos de estas, se describen en las Publicaciones de Patente Internacional WO95/32738, WO96/33273, WO98/07864 y WO99/17806.
La neurotoxina de C. botulinum o dominio específico de esta descrita en la presente contendrá, típicamente, residuos de aminoácido de origen natural, pero en algunos casos pueden presentarse, además, residuos de aminoácidos que no son de origen natural. Por lo tanto, los llamados "imitadores de péptido" y "análogos de péptido", los cuales pueden incluir estructuras químicas diferentes de aminoácidos que imitan la estructura de un aminoácido o péptido particular, pueden también usarse dentro del contexto de la invención. Dichos imitadores o análogos se caracterizan generalmente como que exhiben características físicas similares tales como tamaño, carga o hidrofobicidad, y la orientación espacial apropiada que se encuentra en sus contrapartes de péptidos naturales. Un ejemplo específico de un compuesto imitador de péptido es un compuesto en el cual la unión de amida entre uno o más de los aminoácidos se reemplaza, por ejemplo, mediante un enlace de carbono-carbono u otro enlace no amida, como es bien conocido en la técnica (ver, por ejemplo, Sawyer, en Peptide Based Drug Design, págs 378-422, ACS, Washington D.C. 1995).
La neurotoxina botulínica (BoNT) descrita en la presente puede comprender un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de C. botulinum (BoNT/B-Hc). La BoNT/B-Hc modificada comprende una o más mutaciones de sustitución que conducen a una unión significativamente aumentada al receptor Syt I humano y/o al receptor Syt II humano. La BoNT/B-Hc puede ser de BoNT/B1 (GenBank acceso No: AB232927.1). La secuencia de aminoácidos de la cepa Okra de BoNT/B1-Hc, usada como la plantilla de referencia en la presente invención se muestra en la Figura 8. Se contempla, además, la generación de B-Hc de otras cepas mediante la sustitución de los aminoácidos que corresponden a la(s) posición(es) especificada(s) en B1 descritas en la presente. Se describe además un polipéptido de dominio de unión al receptor modificado, purificado y aislado, descrito en la presente. La presente divulgación
abarca, además, un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado descrito en la presente. La divulgación abarca, además, una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido. El dominio de unión al receptor modificado puede ser BoNT/B-Hc (por ejemplo, de BoNT/B1).
La modificación de la secuencia de proteína de la BoNT/B-Hc puede realizarse mediante mutagénesis dirigida (mutagénesis dirigida al sitio) o mutagénesis aleatoria de cada residuo de aminoácido dentro de la región conocida por su unión a Syt I/II. Estas regiones de unión de Syt son bien definidas por estudios previos relacionados con receptores Syt de ratón o de rata1,29 36 31 32 pero no se ha determinado claramente para interacciones entre la BoNT/B-Hc y receptores Syt humanos. Diferentes subtipos de la BoNT/B pueden usarse como plantilla para crear las mismas o mutaciones similares mediante la generación de mutaciones correspondientes descritas en la presente para B1-Hc. La posición correspondiente para residuos seleccionados a ser mutados puede identificarse fácilmente mediante la alineación de secuencia con el subtipo B1. Los productos de polipéptidos resultantes son abarcados por la presente divulgación, como son los polipéptidos que comprenden dichos productos y las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos y productos.
Las modificaciones de la secuencia de aminoácidos para producir el dominio de unión al receptor modificado puede ser la mutación de un solo residuo a un aminoácido diferente (sustitución de un solo sitio), mutación de residuos múltiples al mismo tiempo (sustitución de múltiples sitios), deleción de uno o más residuos (deleción) e inserción de uno o más residuos (inserción), así como combinaciones de estas. Los métodos para mutar proteínas son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, sustituciones dirigidas a un solo sitio y múltiples sitios en el ADN que codifica la secuencia de BoNT/B-Hc).
Como se describe en la presente, pueden modificarse uno o más residuos en la BoNT/B-Hc que hacen contacto con la Syt II de roedor o las regiones circundantes, en base a la literatura previa sobre el dominio de unión al receptor de BoNT/B29 y la estructura de BoNT/B-Syt II reportada (PDB ID: 2NM1) 3132. Estos incluyen, sin limitación, aquellas posiciones que corresponden a la posición Y1181, P1197, A1196, F1204, F1194, P1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, K1113, K1192, S1199, S1201, E1191, E1245, Y1256 de la BoNT/B-B1. Uno o más de estos residuos puede modificarse a un aminoácido hidrofóbico (por ejemplo, V, I, L, M, F, W, C). Uno o más de estos residuos puede modificarse a un aminoácido menos hidrofóbico (por ejemplo, A, Y, H, T, S, P, Q, N y G). Se contemplan, además, combinaciones de varias modificaciones, que incluyen, sin limitación, mutaciones de dos o más posiciones citadas, a cualquier variedad de los diversos aminoácidos citados en la presente.
La BoNT/B-Hc puede tener una o más mutaciones de sustitución (por ejemplo, en las posiciones que corresponden a las posiciones E1191, S1199, S1201, V1118, P1117, Y1183, A1196 y Y1181 de B1) que aumenta la unión a la Syt II humana en comparación con WT BoNT/B-Hc . La mutación puede comprender una o más mutaciones que corresponden a E1191M/I/T/L/Q o combinaciones de estas (E1191M, E11911, E1191T, E1191L o E1191Q), V1118M, S1199Y/L/F (S1199Y, S1199L o S1199F), S1201V, P1117S/M/Y (P1117S, P1117M o P1117Y), Y1183M, Y1181M, A1196Y de B1 o combinaciones de estas (Fig. 3A, B). De manera adecuada las mutaciones se seleccionan de las mutaciones anteriores en las posiciones 1118, 1191 y 1199 o combinaciones de estas. En particular, las mutaciones seleccionadas de uno o más de V1118M, E1191M/Q/I y S1199Y pueden ser beneficiosas. Con mayor particularidad, se contempla la mutación que corresponde a la posición E1191M o E1191Q de B1, puesto que exhiben el aumento más fuerte para la unión a h-Syt II. Las mutaciones correspondientes a E1191M o E1191Q de B1 también aumentaron significativamente la unión de BoNT/B-Hc a la Syt I humana en comparación con la WT BoNT/B-Hc (Fig. 4A). La BoNT/B-Hc puede tener dos mutaciones de sustitución.
Las sustituciones de múltiples sitios pueden generarse, además, mediante la combinación de mutaciones en estos residuos clave identificados. Tales mutantes de sustituciones de múltiples sitios han aumentado, además, la unión a la Syt I humana y h-Syt II (Fig. 5). Como un ejemplo no limitante, las mutaciones que combinan dos sustituciones de un solo sitio tales como aquellas correspondientes a E1191M o E1191Q con S1199L, S1199Y o S1199F de B1 exhibieron unión significativamente aumentada tanto a Syt I humana como a h-Syt II (Fig. 5). El aumento en la resistencia de unión fue sorprendente dado el aumento relativamente modesto en la actividad de unión alcanzada por las mutaciones en la posición 1199 solamente.
Como se describe en la presente, se contempla la sustitución de un residuo correspondiente a la posición E1191, S1199, S1201, V1118, P1117, A1196, Y1181, y Y1183 de la BoNT/B-B1, puesto que producirá un mutante BoNT/B-Hc con unión aumentada a la Syt II humana. Las sustituciones de combinación adicionales en las posiciones incluyen, pero no se limitan a, aquellas que corresponden a E1191, S1199, S1201, V1118, P1117, Y1181, Y1183 y A1196 de B1 que producen mutantes de BoNT/B-Hc con unión aumentada a la Syt II humana.
Por consiguiente, la divulgación abarca polipéptidos que comprenden BoNT/B-Hc con la secuencia de aminoácidos modificada con relación a la secuencia de WT BoNT/B-Hc , en donde la BoNT/B-Hc modificada tiene unión significativamente aumentada a Syt I y II humanas en comparación con WT BoNT/B-Hc . La divulgación abarca, además, moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos. Los mutantes de BoNT/B-Hc modificados pueden contener sustituciones de aminoácidos en una o combinaciones de los residuos de aminoácido correspondientes a V1118, E1191, S1199, S1201, P1117, Y1181, Y1183, y A1196 de B1. Estas modificaciones pueden incluir mutaciones correspondientes a E1191M o E1191Q en combinación con S1199L, S1199Y o S1199F de B1.
Se describen además BoNT/B de longitud completa mutante que contienen las mismas sustituciones de aminoácidos en B-Hc como se describió anteriormente para aplicaciones terapéuticas en humanos. Los mutantes de BoNT/B de longitud completa pueden contener sustituciones de aminoácidos en una o combinaciones de los residuos de aminoácido correspondientes a la posición E1191, V1118, S1199, S1201, P1117, Y1181, Y1183, y A1196 de B1. Las modificaciones pueden incluir combinaciones de E1191M o E1191Q con S1199L, S1199Y o S1199F. Las mutaciones pueden realizarse de la misma manera como se describió anteriormente para la BoNT/B-Hc, mediante el uso de cualquiera de los subtipos de BoNT/B como plantillas. Estas toxinas de BoNT/B mutantes tienen unión significativamente aumentada a Syt II humana y a Syt I humana, por lo tanto, alcanzarán una eficacia y especificidad más alta a las neuronas humanas objetivo que la WT BoNT/B.
La difusión de toxinas y generación de anticuerpos de neutralización no se limitan a la BoNT/B, sino que también se observan para la BoNT/A, lo que indica que la afinidad de unión de BoNT/A a su receptor SV2 también necesita ser mejorada. Debido a que la unión de BoNT/B a Syt I/II tiene una afinidad mucho más alta que la unión de BoNT/A a SV2 1420.26.27, puede usarse, además, un dominio de unión al receptor de BoNT/B modificado (BoNT/B-Hc) con la habilidad para unir Syt II humana para reemplazar BoNT/A-Hc para generar una BoNT/A quimérica modificada con mayor eficacia y especificidad para las neuronas humanas que la WT BoNT/A282930
Se contempla, además, que la BoNT/B-Hc modificada descrita anteriormente puede usarse para reemplazar la Hc de todas las otras BoNT. Las regiones Hc de cada BoNT están bien definidas y sus reemplazos pueden realizarse a través de la fusión de PCR estándar del ADN que codifica BoNT/B-Hc con el Hn-LC de otras BoNT, lo cual ha sido bien establecido en la técnica. Adicionalmente, estos remplazos pueden realizarse, además, mediante el uso de la parte C-terminal de BoNT/B-Hc (designada como Hcc), la cual es la región que contiene el sitio de unión para los receptores de proteínas y gangliósidos en cada BoNT. Las toxinas quiméricas resultantes tendrán la habilidad para dirigirse a las neuronas humanas por la vía de la unión a Syt I/II humana. Como un ejemplo no limitante, la BoNT/B-Hc modificada puede usarse para reemplazar la Hc de BoNT/A. Los polipéptidos resultantes se abarcan por la presente divulgación. Estas toxinas quiméricas tendrán una eficacia y especificidad más alta que se dirige a las neuronas humanas que el WT BoNT/A. Dicha toxina BoNT/A quimérica puede usarse para aplicaciones terapéuticas en humanos y ofrece mejoramiento significativo sobre la WT BoNT/A.
Se describe además en la presente una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos descritos en la presente (por ejemplo, el dominio de unión al receptor modificado o la neurotoxina botulínica que comprende el dominio de unión al receptor modificado, descrito en la presente). La molécula de ácido nucleico puede comprender la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 9. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante.
Se describe además en la presente un vector de ácido nucleico que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en la presente. El vector puede ser un vector de expresión. Dicho vector de expresión se refiere en la presente descripción como un constructo de expresión, y comprende una molécula de ácido nucleico descrita en la presente operablemente unida al vector de expresión útil para expresar la molécula de ácido nucleico en un extracto de células o libre de células. Una amplia variedad de vectores de expresión puede emplearse para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una neurotoxina de C. botulinum de la presente divulgación lo que incluye, sin limitación, un vector de expresión viral; un vector de expresión procariótico; vectores de expresión eucarióticos, tales como, por ejemplo, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto y un vector de expresión de mamífero; y un vector de expresión de extracto libre de células. Además, se entiende que los vectores de expresión útiles para practicar los aspectos de estos métodos pueden incluir aquellos que expresan la neurotoxina de C. botulinum bajo el control de un elemento promotor constitutivo, específico de tejido, específico de célula o inducible, elemento potenciador o ambos. Ejemplos no limitantes de vectores de expresión, junto con los reactivos bien establecidos y las condiciones para hacer y usar un constructo de expresión a partir de tales vectores de expresión están fácilmente disponibles de vendedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, Calif.; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.; Invitrogen, Inc, Carlsbad, Calif.; EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wis.; QIAGEN, Inc., Valencia, Calif.; y Stratagene, La Jolla, Calif. La selección, elaboración y uso de un vector de expresión apropiado son procedimientos rutinarios que están bien dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas en la presente.
Se describe además en la presente una célula que comprende la molécula de ácido nucleico o constructo de expresión descrito en la presente. La célula puede ser para la propagación del ácido nucleico o para la expresión del ácido nucleico, o ambas. Dichas células incluyen, sin limitación, células procariotas que incluyen, sin limitación, cepas de células bacterianas aeróbicas, microaerofílicas, capnofílicas, facultativas, anaeróbicas, gram-negativas y grampositivas tales como aquellas derivadas de, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens y Salmonella typhimurium; y células eucarióticas que incluyen, sin limitación, cepas de levadura, tales como, por ejemplo, aquellas derivadas de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica; células de insecto y líneas de células derivadas de insectos, tales como, por ejemplo, aquellas derivadas de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster y Manduca sexta; y células de mamífero y líneas de células derivadas de células de mamífero, tales como, por ejemplo, aquellas derivadas de ratón, rata, hámster, porcino, bovino, equino, primate y humano. Las líneas de células pueden obtenerse de la Colección
Americana de Cultivos Tipo, la Colección Europea de Cultivos de Células y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células. Ejemplos no limitantes de protocolos específicos para seleccionar, hacer y usar una línea celular apropiada se describen en, por ejemplo, INSECT CELL CULTURE e Ng INEERING (Mattheus F. A. Goosen y otros, eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak y otros, eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison e Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES o F CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle y otros eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4.sup.th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3.sup.rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2.sup.nd ed. 20 2002); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, (2004). Estos protocolos son procedimientos rutinarios dentro del alcance de un experto en la técnica y a partir de la enseñanza en la presente.
Se contempla, además, que la BoNT/B-Hc modificada descrita en la aquí puede usarse como una herramienta de suministro para las neuronas objetivo en humanos. Por ejemplo, la BoNT/B-Hc modificada puede unirse a otros agentes terapéuticos, covalentemente o no covalentemente, y actúa como el vehículo de dirección para suministrar los agentes terapéuticos a las neuronas en humanos mediante la unión a la Syt I/II humana. Como tal, también se describe en la presente, una molécula de polipéptido quimérica que comprende una primera porción que es un dominio de unión al receptor modificado del serotipo de B de C. botulinum, que comprende una o más mutaciones de sustitución que conduce a la unión significativamente aumentada al receptor Syt I humano y/o al receptor Syt II humano, unido a una segunda porción. La segunda porción de la molécula puede ser una molécula bioactiva tal como un agente terapéutico (por ejemplo, un polipéptido o fármaco). La unión de la primera y segunda porciones de la molécula puede ser covalente (por ejemplo, en la forma de una proteína de fusión) o no covalente. Los métodos de dicha unión son conocidos en la técnica y pueden aplicarse fácilmente por el profesional experto.
Se describe además en la presente una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina de C. botulinum, o la molécula quimérica descrita en la presente. El polipéptido descrito en la presente puede ser un ingrediente activo en una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable (referido en la presente como una composición farmacéutica). Un "portador farmacéuticamente aceptable" significa cualquier medio farmacéuticamente aceptable para mezclar y suministrar la composición de suministro dirigida a un sujeto. El término "portador farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un líquido o relleno sólido, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante, involucrado en llevar o transportar los agentes objetivo desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición y es compatible con la administración a un sujeto, por ejemplo, un humano. Dichas composiciones pueden formularse específicamente para la administración por la vía de una o más de un número de rutas, tal como las rutas de administración descritas en la presente. Pueden incorporarse en las composiciones, además, Ingredientes activos suplementarios. Cuando un agente, formulación o composición farmacéutica descrita en la presente, se administra a un sujeto, preferentemente, se administra una cantidad efectiva terapéuticamente. Como se usa en la presente, el término "cantidad efectiva terapéuticamente" se refiere a una cantidad que resulta en una mejora o recuperación de la afección. La composición farmacéutica puede formularse para la administración por inyección. La composición farmacéutica puede involucrar la neurotoxina botulínica encapsulada en microesferas. La composición farmacéutica puede involucrar la neurotoxina botulínica formulada para liberación lenta.
La neurotoxina botulínica, polipéptido o molécula quimérica puede estar en la forma de una fórmula de liberación controlada. Dichas composiciones y métodos para la administración se proporcionan en la Publicación de la Patente de los Estados Unidos No. 2007/0020295.
La neurotoxina botulínica puede obtenerse mediante el establecimiento y crecimiento de cultivos de Clostridial botulinum en un fermentador y después mediante la recolección y purificación de la mezcla fermentada de acuerdo con procedimientos conocidos. Todos los serotipos de toxina botulínica se sintetizan inicialmente como proteínas de una sola cadena inactivas las cuales deben ser segmentadas o separadas por proteasas para llegar a ser neuroactivas. Las cepas bacterianas que hacen los serotipos A y G de la toxina botulínica poseen proteasas endógenas y los serotipos A y G por lo tanto pueden recuperarse de los cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. En contraste, los serotipos C1, D y E de la toxina botulínica se sintetizan mediante cepas no proteolíticas y por lo tanto se inactivan típicamente cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F se producen de ambas cepas proteolíticas y no proteolíticas y por lo tanto pueden recuperarse ya sea en la forma activa o la inactiva. Las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo tipo B de toxina botulínica solamente pueden segmentar una porción de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas separadas o no separadas depende de la duración de incubación y la temperatura del cultivo. Por lo tanto, un cierto porcentaje de una preparación de, por ejemplo, la toxina tipo B de toxina botulínica puede estar inactiva. La neurotoxina de la presente invención pude estar en un estado activo. La neurotoxina puede estar en un estado inactivo. Se contempla, además, una combinación de neurotoxina activa e inactiva.
Se describe además en la presente un kit que comprende la composición farmacéutica descrita en la presente. El kit puede comprender, además, una herramienta de suministro o dispositivo para la administración terapéutica de la composición, y/o instrucciones para la administración terapéutica.
Se describe además en la presente una herramienta de suministro o dispositivo para la administración de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente, precargadas con la composición farmacéutica (por ejemplo, para un uso único). Dichos dispositivos pueden ser una jeringa o un dispositivo de microaguja para el suministro de las composiciones. La jeringa puede ser una jeringa de un solo uso precargada con una cantidad eficaz de la composición. El dispositivo de microaguja puede comprender uno o más microagujas recubiertas con la composición descrita en la presente, tal como se describe en la Publicación de Patente de los Estados Unidos 2010/0196445.
Métodos de Tratamiento
Se describen métodos para tratar una afección que se trata típicamente con una neurotoxina (por ejemplo, condiciones del músculo esquelético, condiciones del músculo liso, condiciones glandulares, un trastorno neuromuscular, un trastorno autonómico, dolor o una afección estética/cosmética). Dichas condiciones se asocian con actividad neuronal no deseada, como se determina por el profesional experto. El método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica descrita en la presente (por ejemplo, que contiene una neurotoxina botulínica (BoNT) o una molécula quimérica) a la ubicación apropiada en el mamífero para reducir la actividad neuronal no deseada, para de esta manera tratar la afección. La administración es mediante una ruta que pone en contacto una cantidad eficaz de la composición con las neuronas que exhiben la actividad no deseada.
Las condiciones específicas contempladas para el tratamiento mediante los métodos discutidos en la presente incluyen, sin limitación, disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía de mano focal, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica, anismus, espasticidad del miembro, estremecimiento, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas así como otros trastornos secretorios, dolor de los espasmos musculares, dolor de cabeza. Además, los métodos presentes pueden usarse para tratar condiciones dermatológicas o estéticas/cosméticas, por ejemplo, reducción de arrugas de la frente, reducción de arrugas de la piel. Los métodos presentes pueden usarse, además, en el tratamiento de lesiones en el deporte.
La Patente de los Estados Unidos No. 5,053,005 de Borodic describe métodos para tratar la curvatura espinal juvenil, es decir, escoliosis, mediante el uso de botulinum tipo A. Mediante el uso de métodos sustancialmente similares como el descrito por Borodic, puede administrarse una neurotoxina modificada a un mamífero, preferentemente un humano, para tratar la curvatura espinal. En un ejemplo adecuado, se administra una neurotoxina modificada que comprende botulinum tipo E fusionada con una porción a base de leucina. Aún con mayor preferencia, una neurotoxina modificada que comprende botulinum tipo A-E con una porción basada en leucina fusionada al carboxilo terminal de su cadena ligera se administra al mamífero, de preferencia un humano, para tratar la curvatura espinal.
Adicionalmente, la neurotoxina modificada puede administrarse para tratar otros trastornos neuromusculares mediante el uso de técnicas bien conocidas que se realizan comúnmente con el botulinum tipo A. Por ejemplo, la neurotoxina modificada puede usarse para tratar dolor, por ejemplo, dolor de cabeza, dolor de espasmos musculares y varias formas de dolor inflamatorio. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,721,215 de Aoki y la Patente de los Estados Unidos No. 6,113,915 de Aoki describen métodos para usar la toxina botulinum tipo A para tratar el dolor.
Los trastornos del sistema nervioso autonómico pueden tratarse, además, con una neurotoxina modificada. Por ejemplo, el mal funcionamiento glandular es un trastorno del sistema nervioso autonómico. El mal funcionamiento glandular incluye sudoración excesiva y salivación excesiva. El mal funcionamiento respiratorio es otro ejemplo de un trastorno del sistema nervioso autonómico. El mal funcionamiento respiratorio incluye la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma. Sanders y otros describen métodos para tratar el sistema nervioso autonómico; por ejemplo, tratar los trastornos del sistema nervioso autonómico tal como la sudoración excesiva, salivación excesiva, asma, etcétera, mediante el uso de toxinas botulínicas que existen naturalmente. Pueden emplearse métodos sustancialmente similares a aquellos de Sanders y otros, pero mediante el uso de una neurotoxina modificada, para tratar trastornos del sistema nervioso autonómico tal como los discutidos anteriormente. Por ejemplo, una neurotoxina modificada puede aplicarse localmente a la cavidad nasal del mamífero en una cantidad suficiente para degenerar las neuronas colinérgicas del sistema nervioso autonómico que controlan la secreción de moco en la cavidad nasal.
El dolor que puede tratarse mediante una neurotoxina modificada incluye el dolor causado por la tensión muscular, o espasmo, o dolor que no se asocia con el espasmo muscular. Por ejemplo, Binder en la Patente de los Estados Unidos No. 5,714,468 describe que el dolor causado por las alteraciones vasculares, tensión muscular, neuralgia y neuropatía puede tratarse con una toxina botulínica de origen natural, por ejemplo botulinum tipo A. Pueden emplearse métodos sustancialmente similares a aquellos de Binder, pero mediante el uso de una neurotoxina modificada, para tratar el dolor de cabeza, especialmente los causados por alteraciones vasculares, tensión muscular, neuralgia y neuropatía. El dolor causado por el espasmo muscular puede tratarse, además, mediante la administración de una neurotoxina modificada. Por ejemplo, un botulinum tipo E fusionado con una porción basada en leucina, preferentemente en el carboxilo terminal de la cadena ligera del botulinum tipo E, puede administrarse intramuscularmente en la ubicación del dolor/espasmo para aliviar el dolor.
Además, puede administrarse una neurotoxina modificada a un mamífero para tratar el dolor que no se asocia con un trastorno muscular, tal como espasmo. Los métodos para tratar el dolor no relacionado con el espasmo incluyen la administración central o la administración periférica de la neurotoxina modificada.
Por ejemplo, Foster y otros, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,989,545 describe que una toxina botulínica conjugada con una porción de dirección puede administrarse centralmente (intratecalmente) para aliviar el dolor. Métodos sustancialmente similares a aquel de Foster y otros pueden emplearse, pero mediante el uso de las composiciones descritas en la presente para tratar el dolor. El dolor a ser tratado puede ser un dolor agudo o un dolor crónico.
Un dolor agudo o crónico que no se asocia con un espasmo muscular puede aliviarse, además, con una administración periférica, local de la neurotoxina modificada a una ubicación real o percibida de dolor sobre el mamífero. La neurotoxina modificada puede administrarse subcutáneamente en o cerca de la ubicación del dolor, por ejemplo, en o cerca de una cortada. La neurotoxina modificada puede administrarse intramuscularmente en o cerca de la ubicación del dolor, por ejemplo, en o cerca de una ubicación de contusión sobre el mamífero. La neurotoxina modificada puede inyectarse directamente en la articulación de un mamífero, para tratar o aliviar el dolor causado por condiciones artríticas. Además, se contempla la inyección o infusión repetida frecuente de la neurotoxina modificada a una ubicación de dolor periférica.
Las rutas de administración por dichos métodos son conocidas en la técnica y se adaptan fácilmente a los métodos descritos en la presente por el profesional experto (ver, por ejemplo, Harrison's Principies of Internal Medicine (1998), editado por Anthony Fauci y otros, 14.sup.th edition, publicado por McGraw Hill). A manera de ejemplo no limitante, el tratamiento de un trastorno neuromuscular puede comprender una etapa de administrar localmente una cantidad eficaz de la molécula a un músculo o grupo muscular, el tratamiento de un trastorno autonómico puede comprender una etapa de administrar localmente una cantidad eficaz de la molécula a una glándula o glándulas, y el tratamiento del dolor puede comprender una etapa de administrar una cantidad eficaz de la molécula al sitio del dolor. Además, el tratamiento de dolor puede comprender una etapa de administrar una cantidad eficaz de una neurotoxina modificada a la médula espinal.
Las realizaciones descritas aquí y en los siguientes ejemplos son para propósitos ilustrativos únicamente, y varias modificaciones o cambios evidentes para aquellos expertos en la técnica se incluyen dentro del alcance de la invención.
A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente solicitud tendrán los significados que son comúnmente entendidos por aquellos expertos en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán lo singular.
Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares, etcétera, descritos en la presente y como tales pueden variar. La terminología usada en la presente es para el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no se propone para limitar el alcance de la presente invención, que se define solamente mediante las reivindicaciones.
Diferente a los ejemplos de operación, o donde es indicado de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usados en la presente deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" cuando se usa para describir la presente invención, en relación con porcentajes significa 1 %.
En un aspecto, la presente invención se relaciona con las composiciones descritas en la presente, métodos y componente(s) respectivo(s) de estos, como esencial para la invención, pero aún abiertos a la inclusión de elementos no especificados, esenciales o no esenciales ("que comprende"). En algunas realizaciones, otros elementos a ser incluidos en la descripción de la composición, método o componente respectivo de estos se limitan a aquellos que no afectan materialmente la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de la invención ("que consiste esencialmente de"). Esto se aplica igualmente a las etapas dentro de un método descrito, así como las composiciones y componentes en los mismos. En otras realizaciones, las invenciones, composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos, descritos en la presente se proponen para ser exclusivos de cualquier elemento no considerado un elemento esencial al componente, composición o método ("que consiste en").
La descripción de la presente solicitud se da en los siguientes párrafos numerados.
1. Un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) que comprende:
a) un dominio de proteasa;
b) un sitio de segmentación de proteasa;
c) un dominio de translocación; y
d) un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de Clostridial botulinum (B-Hc), que comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a las mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionado del grupo que consiste en:
V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V y combinaciones de estos.
2. El polipéptido de BoNT del párrafo 1, en donde el (B-Hc) modificado comprende dos mutaciones de sustitución. 3. El polipéptido de BoNT del párrafo 2, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199L, E1191M y S1199Y, E1191M y S1199F, E1191Q y S1199L, E1191Q y S1199Y, o E1191Q y S1199F.
4. El polipéptido de BoNT de uno de los párrafos 2-3, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199L.
5. El polipéptido de BoNT de uno de los párrafos 2-3, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199Y.
6. El polipéptido BoNT de uno de los párrafos 2-3, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199F.
7. El polipéptido de BoNT de uno de los párrafos 2-3, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191Q y S1199L.
8. El polipéptido de BoNT de uno de los párrafos 2-3, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191Q y S1199Y.
9. El polipéptido de BoNT de uno de los párrafos 2-3, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191Q y S1199F.
10. Un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) que comprende:
a) un dominio de proteasa;
b) un sitio de segmentación de proteasa;
c) un dominio de translocación; y
d) un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de Clostridial botulinum (B-Hc), que comprende una mutación de sustitución en una posición correspondiente a S1199 o S1201 del serotipo B, cepa 1.
11. El polipéptido de BoNT del párrafo 10, en donde la mutación de sustitución produce una unión aumentada del B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión reducida de B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución.
12. El polipéptido de BoNT del párrafo 10, en donde la mutación de sustitución produce una unión aumentada del B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión incrementada del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución.
13. El polipéptido de BoNT de cualquiera de los párrafos 11-12, en donde la mutación de sustitución se selecciona del grupo que consiste en A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y y V sustituido por S.
14. El polipéptido de BoNT de cualquiera de los párrafos 11-13, en donde la mutación de sustitución es un aminoácido que no es de origen natural sustituido por S.
15. El polipéptido de BoNT de cualquiera de los párrafos 1-14, en donde el B-Hc modificado es de la cepa 1.
16. El polipéptido de BoNT de cualquiera de los párrafos 1-15 en donde el dominio de proteasa, el dominio de translocación y el sitio de segmentación de proteasa son del serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C, D, E, F, G, y combinaciones de estos.
17. El polipéptido de BoNT del párrafo 16, en donde el dominio de proteasa, el dominio de translocación y el sitio de segmentación de proteasa son del serotipo B, cepa 1.
18. El polipéptido de BoNT del párrafo 16, en donde el dominio de proteasa, el dominio de translocación y el sitio de segmentación de proteasa son del serotipo A, cepa 1.
19. Un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de Clostridial botulinum (B-Hc) que comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a las mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionado del grupo que consiste en V1118M; Y1183M; E1191M; E11911; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; y combinaciones de estas.
20. El polipéptido del párrafo 19, en donde el (B-Hc) modificado comprende dos mutaciones de sustitución.
21. El polipéptido del párrafo 20, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199L, E1191M y S1199Y, E1191M y S1199F, E1191Q y S1199L, E1191Q y S1199Y, o E1191Q y S1199F.
22. El polipéptido de uno de los párrafos 20-21, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199L.
23. El polipéptido de uno de los párrafos 20-21, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M yS1199Y.
24. El polipéptido de uno de los párrafos 20-21, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M yS1199F.
25. El polipéptido de uno de los párrafos 20-21, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191Q y S1199L.
26. El polipéptido de uno de los párrafos 20-21, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191Q yS1199Y.
27. El polipéptido de uno de los párrafos 20-21, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191Q yS1199F.
28. Un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de Clostridial botulinum (B-Hc) que comprende una mutación de sustitución en una posición correspondiente a S1199 o S1201 del serotipo B, cepa 1.
29. El polipéptido del párrafo 28, en donde la mutación de sustitución produce una unión aumentada del B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión reducida del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución.
30. El polipéptido del párrafo 28, en donde la mutación de sustitución produce una unión aumentada del B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión incrementada del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución.
31. El polipéptido de cualquiera de los párrafos 29-30, en donde la mutación de sustitución se selecciona del grupo que consiste en A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y y V sustituidos por S.
32. El polipéptido de cualquiera de los párrafos 29-31, en donde la mutación de sustitución es un aminoácido que no es de origen natural sustituido por S.
33. El polipéptido de cualquiera de los párrafos 19-32, en donde el B-Hc modificado es de la cepa 1.
34. Una molécula quimérica que comprende una primera porción que es un dominio de unión al receptor modificado de serotipo B de Clostridial botulinum (B-Hc ) enlazado a una segunda porción, en donde el B-Hc modificado comprende una o más mutaciones de sustitución correspondiente a las mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionado del grupo que consiste en:
V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V y combinaciones de estas.
35. La molécula quimérica del párrafo 33, en donde el B-Hc modificado comprende dos mutaciones de sustitución.
36. La molécula quimérica del párrafo 35, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199L, E1191M y S1199Y, E1191M y S1199F, E1191Q y S1199L, E1191Q y S1199Y, o E1191Q y S1199F.
37. La molécula quimérica de uno de los párrafos 35-36, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199L.
38. La molécula quimérica de uno de los párrafos 35-36, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199Y.
39. La molécula quimérica de uno de los párrafos 35-36, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199F.
40. La molécula quimérica de uno de los párrafos 35-36, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191Q y S1199L.
41. La molécula quimérica de uno de los párrafos 35-36, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191Q y S1199Y.
42. La molécula quimérica de uno de los párrafos 35-36, en donde las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191Q y S1199F.
43. La molécula quimérica del párrafo 34, en donde el B-Hc modificado comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de Clostridial botulinum (B-Hc) que comprende una mutación de sustitución en una posición correspondiente a S1199 o S1201 del serotipo B, cepa 1.
44. La molécula quimérica del párrafo 43, en donde la mutación de sustitución produce una unión aumentada del B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión reducida del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución.
45. La molécula quimérica del párrafo 43, en donde la mutación de sustitución produce una unión aumentada del B-Hc modificado a la Syt II humana y/o unión incrementada del B-Hc modificado a la Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación de sustitución.
46. La molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 44-45, en donde la mutación de sustitución se selecciona del grupo que consiste en A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y y V sustituidos por S.
47. La molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 44-46, en donde la mutación de sustitución es un aminoácido que no es de origen natural sustituido por S.
48. La molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 43-47, en donde el B-Hc modificado es de la cepa 1.
49. La molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 32-48, en donde la primera porción y la segunda porción se enlazan covalentemente.
50. La molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 32-48, en donde la primera porción y la segunda porción se enlazan no covalentemente.
51. La molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 32-50, en donde la segunda porción se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido corto y una proteína.
52. La molécula quimérica del párrafo 51, en donde la segunda porción es una molécula bioactiva.
53. La molécula quimérica del párrafo 51 o 52, en donde la segunda porción es un fármaco polipéptido o no polipéptido terapéutico.
54. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 1-53.
55. Un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico del párrafo 54.
56. Una célula que comprende el vector de ácido nucleico del párrafo 55 o el ácido nucleico del párrafo 54.
57. Una célula que expresa el polipéptido o molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 1-53.
58. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) de cualquiera de los párrafos 1-18, o la molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 34-53, o el vector de ácido nucleico del párrafo 55 o el ácido nucleico del párrafo 54.
59. La composición farmacéutica del párrafo 58 que comprende, además, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
60. Un kit que comprende una composición farmacéutica del párrafo 58 o 59 e instrucciones para la administración terapéutica de la composición farmacéutica.
61. Un método para producir un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT), el método comprende las etapas de cultivar la célula hospedera del párrafo 57 en condiciones en donde se produce dicho polipéptido de BoNT.
62. El método del párrafo 61 que comprende, además, recuperar el polipéptido de BoNT del cultivo.
63. Un método para tratar una afección asociada con actividad neuronal no deseada que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de BoNT de cualquiera de los párrafos 1-18 a un sujeto para de esta manera hacer contacto con una o más neuronas que exhiben actividad neuronal no deseada, para de esta manera tratar la afección.
64. El método del párrafo 63, en donde la afección se selecciona del grupo que consiste en, disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía de mano focal, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica, anismus, espasticidad del miembro, tics, estremecimientos, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos
caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos secretorios, dolor de los espasmos musculares, dolor de cabeza y condiciones dermatológicas o estéticas/cosméticas.
65. El polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) de cualquiera de los párrafos 1-18, la composición farmacéutica del párrafo 58 o 59, o la molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 34-53, o el polipéptido de cualquiera de los párrafos 19-33, para su uso en medicina.
66. El polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) de cualquiera de los párrafos 1-18, la composición farmacéutica del párrafo 58 o 59, o la molécula quimérica de cualquiera de los párrafos 34-53, o el polipéptido de cualquiera de los párrafos 19-33, para su uso en el tratamiento de una afección asociada con actividad neuronal no deseada.
La invención se ilustra, además, por los siguientes ejemplos, los cuales no deben considerarse como limitantes adicionalmente.
Ejemplos
Los siguientes experimentos se realizaron para determinar si es posible cambiar la afinidad de unión de la BoNT/B a la Syt II humana mediante la modificación del dominio de unión al receptor de la BoNT/B. La hipótesis se basa en una serie de estudios previos: (1) Se ha mostrado en 1998 que una toxina de subtipo BoNT/B de origen natural, BoNT/B2, exhibe ~ 4 veces menor afinidad de unión a Syt II que la BoNT/B 28 (también definida como BoNT/B1, Fig. 2F). Esta diferencia de afinidad se mostró que se debe a unas pocas diferencias de aminoácidos dentro de sus dominios de unión al receptor en 2003 29 (Fig. 2F, G), lo que demostró por primera vez que los residuos cambiantes dentro del dominio de unión al receptor de la BoNT/B puede cambiar la afinidad de unión a Syt II. Estos estudios identificaron, además, residuos claves que influencian la afinidad de unión a Syt II (Fig. 2G). (2) Se ha reportado en 2004 que mutaciones de residuos únicas dentro del dominio de unión al receptor de BoNT/A y BoNT/B pueden cambiar notablemente la toxicidad y potencia de estas toxinas (Fig. 2H), lo que demuestra que los cambios en la afinidad de unión al receptor pueden traducirse en cambios de toxicidad y potencia de las toxinas30 (3) Se ha resuelto la estructura cocristalina de la BoNT/B enlazada a Syt II de rata 3132 , y se han resuelto los residuos claves que forman el sitio de unión para Syt II 3132. Todos estos estudios previos usaron la Syt II de roedor, pero no la Syt II humana.
Los residuos objetivos para diseñar el dominio de unión al receptor de la BoNT/B para cambiar su afinidad de unión a la Syt II humana se identificaron de todos estos estudios previos con la unión a Syt II de roedor.
El dominio de unión al receptor de la BoNT/B está bien definido 1. Los estudios previos establecieron que el cambio de los residuos dentro del dominio de unión al receptor de la BoNT/B puede modular la afinidad de unión de la BoNT/B a Syt II de rata o ratón2930. La estructura cocristalina de la BoNT/B enlazado a Syt II de rata también se ha resuelto por dos estudios en 200631 32. El cambio de residuo en la Syt II humana es un cambio relativamente conservativo de F a L, ambos son residuos hidrofóbicos. Sin embargo, la diferencia en la afinidad de unión de la BoNT/B para la Syt II de roedor es significativamente más alta que para la Syt II humana. Además, no es obvio cómo la interacción de unión entre la BoNT/B y la Syt II humana podría ser modificada para compensar la carencia de este residuo de fenilalanina en la parte media del sitio de unión. Mientras se pueden contemplar interacciones de unión positivas (y visualizada en las estructuras de cristal publicadas) entre WT BoNT/B-Hc y la Syt II de rata o de ratón, por ejemplo, que involucra el apilamiento o empacado de anillos hidrofóbicos, o entre una WT BoNT/B-Hc y una Syt II humana modificada en la cual la fenilalanina es sustituida en la secuencia; dichas interacciones pueden no ser reproducibles entre una BoNT/B-Hc modificada y una proteína Syt II humana WT. Esto sugiere que el cambio de unos pocos o inclusive un residuo en la BoNT/B no podría ser capaz de restaurar/mejorar la unión a la Syt II humana sin cambios mayores en la estructura global de los complejos BoNT/B-Syt II.
La fenilalanina conservada en la posición 54 forma múltiples contactos hidrofóbicos con la BoNT/B. Debido a que la leucina (en humanos) también es hidrofóbica, la interrupción de la unión de BoNT/B es probablemente debido a las diferencias en tamaño/forma entre la fenilalanina y leucina. La clave para la invención fue por lo tanto identificar los posibles cambios en la región de BoNT/B-Hc que pudieran ajustar y compensar el cambio de fenilalanina a la leucina. El enfoque fue doble: enfocarse en residuos directamente en contacto con la fenilalanina 54 en la Syt II en roedor: o enfocarse en los residuos dentro de la región circundante de BoNT/B-Hc , lo cual podría compensar la carencia de una interacción de unión positiva con fenilalanina en la posición 54. Estos residuos que están potencialmente dentro de la región de unión correspondiente entre la BoNT/B y la Syt II humana se estimaron por referencia a la estructura de cocristal de BoNT/B-Syt II de rata (Fig. 2I) para incluir posiblemente Y1181, P1197, A1196, F1204, F1194, P1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, K1113, K1192, S1199, S1201, E1191, E1245 y Y1256. Los residuos 1117, 1191 y 1199 también se han mostrado que están entre la lista de residuos que influencian la unión de la BoNT/B2 a la Syt II de roedor en un estudio anterior (Fig. 2G) 29. Debido a que es imposible predecir al efecto preciso de las sustituciones de residuos, se empleó un acercamiento de "ensayo y error". En primer lugar, se llevaron a cabo sustituciones de un solo residuo, seguido por combinaciones seleccionadas. Específicamente, cada uno de los residuos claves listados se sustituyó sistemáticamente con residuos hidrofóbicos con diferentes tamaños - con la búsqueda limitada a residuos hidrofóbicos para asegurar que se mantuvieran los contactos hidrofóbicos importantes. Estos residuos de sustitución hidrofóbicos incluyen: V, I, L, M, F, W, C y otros aminoácidos menos hidrofóbicos que incluyen A, Y, H, T, S, P, Q, N y G.
Una clave para el éxito de la invención fue desarrollar una manera factible y económica para la exploración de mutantes. El enfoque básico fue detectar la unión de BoNT/B-Hc recombinante soluble a la Syt II de ratón inmovilizada (F54L) en ensayos de extracción como se describe en la Fig. 2C. Sin embargo, no fue factible purificar todos los mutantes para los ensayos de extracción. Por lo tanto, se probó si fue posible extraer BoNT/B-Hc de una cantidad pequeña de lisados bacterianos directamente con Syt II, sin la necesidad de purificación. El razonamiento fue que la afinidad de unión de BoNT/B-Syt II podría ser suficientemente alta para este procedimiento (Kd ~ 0.23 nM) 20 En realidad, se encontró que la Syt II de rata inmovilizada podría "purificar por afinidad" suficiente WT BoNT/B-Hc directamente de sólo 6 ml de lisados bacterianos (Fig. 3A). Este método recientemente desarrollado simplificó grandemente el esfuerzo para explorar un número muy grande de mutantes de BoNT/B-Hc. Mediante el uso de este método, se probó la exploración de mutantes de BoNT/B-Hc para su unión a una Syt II de ratón 1-87 (m-Syt II) y a una Syt II de ratón mutada que imita la secuencia de la Syt II humana (F54L, h-Syt II). Los materiales unidos se sometieron al análisis de inmunotransferencia lo que detecta BoNT/B-Hc mediante el uso del anticuerpo anti-HA (Fig. 3A).
Se encontró que la mayoría de los mutantes caen en dos categorías: (1) no logran enlazar m-Syt II y h-Syt II, tales como F1204L y V1118W (Fig. 3B); (2) todavía enlazan m-Syt II, pero no logran enlazar h-Syt II, tal como F1204W y E1191W (Fig. 3B). Estos resultados de unión se omiten ampliamente aquí excepto por unos cuantos ejemplos ilustrados en la Fig. 3A.
Entre los mutantes clasificados, se identificaron unos cuantos que se unieron a m-Syt II y a h-Syt II, que incluyen V1118M, S1199Y/L/F, Y1183M, S1201V, E1191M/I/Q/T (Fig. 3B). De esta manera, se determinó que estos residuos están en posiciones claves para acomodar los residuos L en la Syt II humana o para compensar la carencia del residuo de fenilalanina en esta posición en la Syt II humana. Aunque la Syt I humana se expresa en niveles significativamente menores en las neuronas motoras que la Syt II humana, no obstante, es un receptor de toxina importante y capaz, como se demuestra por la efectividad de la BoNT/B en pacientes. Para alcanzar la unión más alta posible a las neuronas humanas, en algunos aspectos, los mutantes BoNT/B modificados deseablemente no deben afectar adversamente la unión a la Syt I humana. Idealmente, ellos pueden inclusive incrementar la unión a Syt I. Por lo tanto, se examinó, además, la unión de los mutantes de la BoNT/B seleccionados a la Syt I humana inmovilizada, mediante el uso del mismo ensayo de extracción de escala pequeña (Fig. 4A). Debido a que la unión de Syt I a la BoNT/B tiene una afinidad menor en comparación con Syt II, este requiere la presencia de gangliósidos co-receptores lipídicos1020. Esta necesidad se dirigió mediante la adición de gangliósidos de cerebro purificados en lisados bacterianos en los ensayos de extracción. Como se indica en la Fig. 4A, el fragmento de Syt I humana (1-80) que contiene el sitio de unión de la toxina se purificó como proteínas marcadas con GST y se inmovilizó sobre cuentas de WT extraídas y BoNT/B-HC mutantes, con y sin la presencia de gangliósidos (Gangl). Como se esperaba, WT BoNT/B-HC se une a Syt I únicamente en presencia de gangliósidos. Se encontró que los mutantes E1191M y E1191Q incrementaron significativamente la unión a Syt I: estos mutantes inclusive pueden unirse a la Syt I humana sin los gangliósidos (Fig. 4A). Otros mutantes o bien redujeron la unión a Syt I (por ejemplo, V118M) o mantuvieron los niveles similares de unión en comparación a WT BoNT/B-Hc (por ejemplo, S1201V). Esto indica que E1191M y E1191Q son mutantes que permiten la unión a la Syt II humana y aumentan la unión a la Syt I humana.
La mutación V1118M también fue de interés, ya que se une a la Syt II humana, pero no a la Syt I humana. Por lo tanto, tiene el potencial para usar para crear toxinas terapéuticas que son más específicas para las neuronas que expresan Syt II que la WT BoNT/B en humanos, por lo tanto, reduce la entrada no específica en células que expresan Syt-I en humanos.
Mediante el uso de E1191M como un ejemplo, sus interacciones con la Syt II humana se validaron, además, mediante el uso de proteínas recombinantes purificadas, lo que permite comparar la unión de cantidades iguales de WT BoNT/B-H c y el mutante E1191M a m-Syt II y h-Syt II (Fig. 4B). Se encontró que E1191M se une a m-Syt II y a h-Syt II sin gangliósidos, y la adición de gangliósidos elevó aún más la unión (Fig. 4B). Estos resultados confirmaron que E1191M gana la habilidad para unir Syt II humana en ausencia de gangliósidos y puede formar complejos de afinidad alta con la Syt II humana en la presencia de los gangliósidos co-receptores lipídicos.
Mediante el uso de E1191M/Q como la columna principal, se realizaron experimentos para analizar si la combinación con otras sustituciones de residuos puede aumentar adicionalmente la unión a la Syt I/II humana. La combinación de S1199L/Y/ o /F con E1191M/o Q generó mutantes dobles que exhibieron uniones significativamente más altas a la Syt II humana (Fig. 5A). Por ejemplo, E1191M/S1199Y alcanzó niveles similares de unión a m-Syt II y a h-Syt II (Fig. 5A, franjas 5 y 6). Esto fue un aumento significativo en comparación con E1191M solo, el cual medió menos enlace a h-Syt II que su unión a m-Syt II (Fig. 4B). Además, todos los mutantes dobles seleccionados exhibieron uniones significativamente más altas a la Syt I humana que a WT BoNT/B-Hc (Fig. 5B).
Mediante el uso de E1191M/S1199Y como un ejemplo, la unión de WT, E1191M y E1191M/S1199Y o h-Syt II se comparó, además, con cantidades iguales de proteínas recombinantes purificadas. Como se muestra en la Fig. 6A, WT BoNT/B-Hc no se pudo unir a h-Syt II en ausencia de gangliósidos en las condiciones de ensayo actuales. E1191M mostró una unión moderada a h-Syt II sin gangliósidos, mientras que la unión de E1191M/SI199Y a h-Syt II aumentó significativamente en comparación con E1191M solo, especialmente sin gangliósidos (comparando las franjas 6 contra 8). Además, tanto E1191M como E1191M/S1199Y aumentaron significativamente la unión a la Syt I humana en comparación con WT BoNT/B-Hc (Fig. 6B).
Se conoce que la unión de WT BoNT/B-Hc a m-Syt II tiene una afinidad alta2021. De esta manera, se comparó la unión entre E1191M/S1199Y y h-Syt II contra el "estándar de oro": unión de WT BoNT/B-HC a m-Syt II. Como se muestra en la Fig. 6C, la titulación de las concentraciones de BoNT/B-Hc reveló que E1191M/S1199Y tiene niveles similares de unión en todas las concentraciones como la unión WT a m-Syt II. La Kd se estimó que es ~ 19 nM entre E1191M/S1199Y y h-Syt II, y ~ 68 nM para la unión de WT BoNT/B-Hc a m-Syt II en estas condiciones de ensayo (Fig. 6D). Esta es una gran mejora para la unión de h-Syt II en comparación con WT BoNT/B-Hc , el cual no logró unirse a h-Syt II en estas condiciones de ensayo (Fig. 6A). En conclusión, la combinación de E1191M con S1199Y proporcionó una mejora sinérgica en la afinidad de unión, lo que supera una mejora aditiva sobre el mutante E1191M y produjo nuevos mutantes de BoNT/B-Hc con unión de alta afinidad a la Syt I y a la Syt II humana. En contraste, las combinaciones de algunas otras mutaciones individuales beneficiosas no dieron por resultado dominios de BoNT/B-Hc mutantes dobles mejorados adicionalmente.
Finalmente, se examinó si el mutante E1191M/S1199Y puede recuperar la unión a h-Syt II sobre la superficie de la neurona. Las neuronas del hipocampo de rata cultivadas únicamente expresan Syt I, pero no Syt II. La Syt I se inactivó (KD) en estas neuronas y después se reemplazó con m-Syt II exógena, m-Syt II (F54L) y h-Syt II a través de la transducción lentiviral. Después se evaluó la unión de WT BoNT/B-Hc y E1191M/S1199Y a estas neuronas (Fig. 7). WT BoNT/B-Hc únicamente se unió a m-Syt II, mientras que E1191M/Sl199Y se unió a m-Syt II (F54L) y a h-Syt II sobre la superficie de la neurona, lo que demuestra que el mutante E1191M/S1199Y puede usar h-Syt II como un receptor funcional en las neuronas.
Materiales y Métodos
Anticuerpos y materiales: El anticuerpo anti-HA monoclonal de ratón se adquirió de Covance (16B12). Los gangliósidos de cerebro mezclados de bovino se adquirieron de Matreya LLC (Pleasant Gap, PA) y se reconstituyeron en solución salina tamponada con Tris (TBS: Tris 20 mM, NaCl 150 mM) como se describió previamente9. BoNT/B (Okra) se purificó en el laboratorio de E. Johnson (Madison, WI) a partir de cepas indicadas.
ADNc y constructos: el ADN que codifica BoNT/B-Hc (residuos 856-1291, basado en GenBank acceso No: AB232927.1) se sintetizó mediante Geneart Inc. y su codón se optimizó para la expresión en E. coli. El ADN que codifica BoNT/B-Hc se subclonó mediante PCR en el vector pET28a, con una etiqueta His6 y con una etiqueta HA (YPYDVPDYA) fusionado a su N-terminal. Las mutaciones en BoNT/B-Hc se generaron mediante PCR mediante el uso del kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio Quickchange (Agilent Technologies, CA), siguiendo el manual del fabricante. El siguiente ADN se proporcionó generosamente por los grupos indicados: Syt I de rata (T.C. Sudhof, Palo Alto, CA), Syt II de ratón (M. Fukuda, Ibaraki, Japón) Syt I humana (R.B. Sutton, Lubbock, TX). Los fragmentos Syt I/II marcados con GST y las mutaciones Syt II se describieron previamente101314. Todos los constructos se verificaron mediante secuenciación.
Expresión de proteínas y purificación: WT y mutantes de BoNT/B-Hc se expresaron como proteínas recombinantes marcadas con His6 en E. Coli. Los fragmentos Syt I/II y mutantes se expresaron como proteínas recombinantes marcadas con GST en E. Coli. Ambas proteínas de fusión-GST y fusión-His6 se purificaron como se describió previamente9 , con la temperatura de inducción a 20°C durante la noche con IPTG 0,25 mM.
Ensayos de extracción de GST: Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos de extracción. Las primeras series se usaron para detectar la unión del mutante BoNT/B-Hc a la Syt II de ratón marcada con GST (m-Syt II) y una Syt II de ratón mutante (F54L) que imita la secuencia de la Syt II humana (designada como h-Syt II en los Ejemplos 1 a 6). En resumen, 6 ml de E. Coli que expresan BoNT/B-Hc se centrifugaron, se resuspendieron en 800 pl de TBS, se sonicaron y después se incubaron con Tritón X-100 al 2% durante 1 h a 4°C. Las muestras después se centrifugaron a velocidad máxima durante 15 min en una microcentrífuga a 4°C. Los sobrenadantes se recolectaron y se usaron para ensayos de extracción mediante la incubación con 10 pg de proteínas Syt inmovilizadas sobre cuentas de glutation-Sefarosa (GE bioscience, Piscataway, NJ) a 4°C durante 1 h. Las muestras se lavaron tres veces en solución tampón de lavado (TBS Tritón al 0,5%) y se analizaron mediante los ensayos de inmunotransferencia que detectan BoNT/B-Hc mediante el uso del anticuerpo anti-HA. Para mutantes con unión aumentada a h-Syt II, se llevaron a cabo ensayos de extracción adicionales mediante la purificación de este mutante BoNT/B-Hc como proteínas marcadas con His6 como se describió previamente 9. Después se llevaron a cabo los ensayos de extracción mediante el uso de fragmentos de Syt inmovilizada en 100 pl de solución tampón TBS más Tritón X-100 al 0,5%, con o sin gangliósidos (60 pg/ml), durante 1 h a 4°C. Las cuentas se lavaron tres veces mediante el uso de solución tampón TBS más Tritón X-100 al 0. 5%. Diez por ciento de los materiales enlazados se sometieron a SDS-PAGE seguido por el análisis de inmunotransferencia.
Inmunotransferencia: Neuronas en cultivo se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,25% y se sometieron al análisis de inmunotransferencia lo que detecta tanto BoNT/B-Hc (con un anticuerpo HA) como sinapsina. Las imágenes se recolectaron mediante el uso de un microscopio confocal (Leica TCS SP5; objetivo de aceite 40x).
Referencias
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Claims (15)
1. Una composición farmacéutica para uso en la atenuación de la actividad neuronal o la inhibición de la liberación de neurotransmisores, en la que la composición farmacéutica comprende o suministra una molécula que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc) de Clostridial botulinum, en la que el B-Hc modificado comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1. seleccionadas del grupo que consiste en E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199F; S1199L; S1201V; V1118M; Y1183M; y combinaciones de las mismas, en la que una o más mutaciones de sustitución producen una unión mejorada del B-Hc modificado a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución.
2. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso autónomo, en la que la composición farmacéutica comprende o suministra una molécula que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc) de Clostridial botulinum, en la que el B-Hc modificado comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionadas del grupo que consiste en E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199F; S1199L; S1201V; V1118M; Y1183M; y combinaciones de las mismas, en la que una o más mutaciones de sustitución producen una unión mejorada del B-Hc modificado a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución.
3. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de un trastorno que implica un mal funcionamiento respiratorio, preferiblemente en la que el mal funcionamiento respiratorio es una enfermedad pulmonar obstructiva crónica o asma, en la que la composición farmacéutica comprende o suministra una molécula que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc) de Clostridial botulinum, en la que el B-Hc modificado comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionadas del grupo que consiste en E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199F; S1199L; S1201V; V1118M; Y1183M; y combinaciones de las mismas, en la que una o más mutaciones de sustitución producen una unión mejorada del B-Hc modificado a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución.
4. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de la curvatura espinal juvenil o escoliosis, en la que la composición farmacéutica comprende o suministra una molécula que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B (B-Hc) de Clostridial botulinum, en la que el B-Hc modificado comprende una o más mutaciones de sustitución correspondientes a mutaciones de sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionadas del grupo que consiste en E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199F; S1199L; S1201V; V1118M; Y1183M; y combinaciones de las mismas, en la que una o más mutaciones de sustitución producen una unión mejorada del B-Hc modificado a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución.
5. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el dominio de unión al receptor modificado corresponde a los residuos 1028-1291 de la SEQ ID NO: 4.
6. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el dominio de unión al receptor modificado posee un 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo silvestre de referencia de un serotipo B de Clostridial botulinum, cepa 1.
7. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la molécula es un polipéptido, en la que opcionalmente el polipéptido comprende:
a) un dominio de proteasa;
b) un sitio de escisión de proteasa;
c) un dominio de translocación; y
d) el dominio de unión al receptor modificado.
8. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el dominio de proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de la proteasa son del serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C, D, E, F, G y una combinación de los mismos, preferiblemente en la que el dominio de proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de la proteasa son del serotipo B, cepa 1 o del serotipo A, cepa 1.
9. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la molécula es una molécula quimérica que comprende una primera porción que es el dominio de unión al receptor modificado enlazado a una segunda porción.
10. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la primera porción y la segunda porción están enlazadas covalentemente o no están enlazadas covalentemente, y en la que la segunda porción se
selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido corto y una proteína, preferiblemente en la que la segunda porción es una molécula bioactiva, un polipéptido terapéutico o un fármaco no polipeptídico.
11. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que el B-Hc modificado comprende dos mutaciones de sustitución, preferiblemente en la que las dos mutaciones de sustitución corresponden a E1191M y S1199Y, E1191M y S1199L, E1191M y S1199F, E1191Q y S1199L, E1191Q y S1199Y o E1191Q y S1199F.
12. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico, preferiblemente un vector, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula que se suministra.
13. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que el uso comprende administrar la composición farmacéutica de tal manera que la molécula se suministra en una dosis menor que la requerida para una molécula de otra manera idéntica que carece de una o más mutaciones de sustitución para lograr el mismo efecto.
15. Un kit que comprende una composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior e instrucciones para la administración terapéutica de la composición farmacéutica.
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