TR201802754T4 - Mühendislik uygulanmış botulinum nörotoksini. - Google Patents

Mühendislik uygulanmış botulinum nörotoksini. Download PDF

Info

Publication number
TR201802754T4
TR201802754T4 TR2018/02754T TR201802754T TR201802754T4 TR 201802754 T4 TR201802754 T4 TR 201802754T4 TR 2018/02754 T TR2018/02754 T TR 2018/02754T TR 201802754 T TR201802754 T TR 201802754T TR 201802754 T4 TR201802754 T4 TR 201802754T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
bont
polypeptide
syt
binding
modified
Prior art date
Application number
TR2018/02754T
Other languages
English (en)
Inventor
Erik Gustav Stenmark Pål
Per-Arne Berntsson Ronnie
Dong Min
Peng Lisheng
Original Assignee
Harvard College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College filed Critical Harvard College
Publication of TR201802754T4 publication Critical patent/TR201802754T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

Serotip B'de, suş 1'de, sübstitüsyon mutasyonlarına karşılık gelen, bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu, V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V, içeren Clostridial botulinum serotip B'nin (B-HC) bir modifiye edilmiş reseptör bağlama alanı içeren botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptitleri burada açıklanır. Spesifik kombinasyon mutasyonları, E1191M ve S1199L, E1191M ve S1199Y, E1191M ve S1199F, E1191Q ve S1199L, E1191Q ve S1199Y, veya E1191Q ve S1199F'yi içerir. Diğer sübstitüsyon mutasyonları da açıklanır. İzole edilmiş modifiye edilmiş reseptör bağlama alanları, kimerik moleküller, farmasötik bileşimler ve bunları kullanmanın yöntemleri de açıklanır.

Description

TARIFNAME MÜHENDISLIK UYGULANMIS BOTULINUM NÖROTOKSINI HÜKÜMET DESTEGI Bu bulus, Ulusal Saglik Enstitüsü tarafindan NCRR RR000168 altinda ödüllenmistir Hükümet Destegi ile yapilmistir. Hükümet, bulus üzerinde bazi haklara sahiptir.
BULUSUN SAHASI Mevcut bulus, nöro-müsküler bozukluklar için terapötikler alani ile ilgilidir.
BULUSUN ALT YAPISI Botulinum nörotoksinleri, yedi majör serotipi (BoNT/A-G) içeren, bir bakteriyel toksinler familyasidir.1 Bu toksinler, nöronlardan salinan nörotransmitteri bloke etme, böylece hayvanlari ve insanlari paralize etme, ile etki eder. Yakin tarihlerde, BoNT'ler tibbi rahatsizliklarin artan bir listesini tedavi etmek için yaygin bir sekilde kullanilmaktadir: toksinlerin yok denecek kadar az miktarlardaki lokal enjeksiyonlari, hedeflenmis bölgelerde nöronal aktiviteyi atenüe edebilir, bu çok sayida tibbi rahatsizlikta ayni zamanda kozmetik amaçlar için yararli olabilir?`4 BoNT/A ve BoNT/B, insanlarda kullanilmasi için güncel olarak FDA-onayli olan yegâne iki B0NT'dir.2`4 Bunlar, (dogal tip, WT, olarak tanimlanan) herhangi bir dizi modifikasyonu olmadan bakterilerden saflastirilmis toksinlerdir. BoNT'lerin uygulanmasi arttikça, sinirlandirmalar ve advers etkiler bildirilmektedir. Majör sinirlandirma, hastalarda gelecekteki tedaviyi etkisiz hâle getiren nötralize etme antikorlarinin üretilmesidir.5 BoNT kullaniminin sonlandirilmasi siklikla, hastalari bozukluklarini tedavi etmek/rahatlatmak için baska etkili yollardan yoksun birakir. Antikor yanitlarinin olasiligi dogrudan, hem toksin dozlari hem de enjeksiyon sikligi ile iliskilidir.5 Bundan dolayi, bu sinirlandirma agirlikli olarak, görece yüksek dozlarda toksinler içeren kas spazmlarini tedavi etmede gerçeklesir. Tutarli olarak, antikor yaniti hayli düsük toksin dozlari kullanan kozmetik uygulamalarda gözlenmemistir.5 Majör advers etkiler ayrica siklikla, kozmetik uygulamalar ile degil kas spazmlarini tedavi etme ile iliskilidir. Bunun nedeni, advers etkilerin büyük olasilikla, toksinlerin vücudun diger bölgelerine difüzyonundan kaynaklanmasidir ve toksin difüzyonunun olasiliginin dogrudan, enjekte edilmis dozlar ile ilgili olmasidir. Advers etkiler, geçici, ciddi-olmayan olaylar, örnegin, ptoz ve diplopi ila ölüm dâhil olinak üzere yasami-tehdit eden olaylar araliginda yer alir.657 Dr.
Sidney Wolfe tarafindan FDA'ya gönderilen 2008'de dosyalanmis bir dilekçe mektubunda, 16 ölümü içeren toplamda 180 ciddi advers olay belgelenmistir.
Bunun bir sonucu olarak, FDA simdi, tüm BoNT ürünleri üzerinde, Avrupa Birligi tarafindan yayinlanan benzer uyarilari takip eden, toksinlerin yayilmasinin riskini vurgulayan "Kara kutu uyarisi" sart kosar.
Hem nötralize etme antikorlarinin üretilmesi hem de toksin difüzyonu dogrudan, enjekte edilmis dozlar ile iliskili oldugundan, (ayni düzeylerde toksin aktivitesini idame ettirirken) toksin dozlarini düsürmek hayli arzu edilir; bu, münferit toksin moleküllerinin etkinliginin güçlendirilmesi gerektigi anlamina gelir. Nöronlar için iyilestirilmis özgüllügü olan bu tarz modifiye edilmis BoNT'ler de, diger hücre tiplerine spesifik-olmayan giristen kaynaklanan herhangi bir potansiyel hedef-disi etkiyi azaltacaktir.
BoNT'ler, literatürde iyi-tanimlanmis, nöronlari hedef alir ve bunlarin reseptör baglama alanlari yoluyla bunlarin spesifik reseptörlerini baglama ile nöronlara girer (BoNT-Hc, Sekil 1A, B).i Reseptör baglama, nöronlari tanimak için BoNT'lerin etkinligini ve özgüllügünü dikte eder. BoNT'lerin reseptör baglama yetisini iyilestirme, nöronlari hedef almak için bunlarin etkinligini ve özgüllügünü güçlendirecektir. Çogu BoNT'ler için reseptörler tanimlanmistir (Sekil IC).
BoNT/B, D-C ve G, bunlarin reseptörleri olarak iki hoinolog sinaptik vezikül proteini sinaptotaginin I'i ve II'yi (Syt I/II) paylasirkeng'”, BoNT/A, E, D ve F, bir 9* 14"& Protein reseptörlerine ek baska sinaptik vezikül proteini SV2'yi kullanir. olarak, tüm BoNT'ler nöronal yüzeyler üzerinde bol bulunan lipit ko-reseptör gangliyositleri gerektirir (Sekil 1D).19 Kemirgenlerde ve büyük olasilikla çogu memelide iki Syt izofonnu arasinda, Syt II, Syt I'e kiyasla BoNT/B için ~10-kat daha yüksek baglama afinitesine sahiptir ve ayrica BoNT'ler için hedeflenmis nöronlar olan motor sinir uçlarinda eksprese edilen baskin izoformdur (Sekil 2A).20,21 Bundan dolayi, (üstünde çogu arastirmanin yürütüldügü) kemirgenlerde, motor sinir uçlarinda Syt lI'nin majör toksin reseptörü oldugu düsünülürken, Syt 1 Bir kisi, BoNT'ler hâlihazirda nöronlara yüksek özgüllüge sahip oldugundan, bunlarin nöronlari baglamasini ilaveten iyilestirmek mümkün müdür? sorusunu tartisabilir. Insan Syt Il'nin, toksin baglama yeri içinde kemirgen (siçan/fare) Syt bir sekilde azaltilmis baglamaya ve fonksiyona sahip oldugu yakin tarihlerde kesfedildiginden, cevap insanlar için bir "Evet'"tir.l3>22 Bu, (fare Syt 11 dizisi) pozisyon 54'te bir fenilalaninden (F) lösine (L) degisimdir (Sekil 2B). Dizi hizalamalari, bu pozisyondaki fenilalaninin, ornitorenki, baligi, kemirgenleri ve maymunlari içeren omurgalar arasinda hem Syt I'de hem de Syt II'de hayli korundugunu ortaya çikarmistir.23 Yalnizca insan ve sempanze Syt II'si, bu pozisyonda lösin içerir. Bu rezidü degisiminin bir sonucu olarak, fare Syt Il'sine kiyasla, insan ve sempanze Syt II'si, BoNT/B'ye, D-C'ye ve G'ye büyük bir sekilde azaltilmis baglamaya sahiptir (Sekil 2C) ve BoNT/B'nin girisine aracilik etmede anlamli olarak daha az etkilidir (Sekil 2D). Insan ve sempanze Syt I'i ayni pozisyonda hâlâ fenilalanin içerdiginden ve BoNT/B'yi, D-C'yi ve G'yi (Sekil 2E) baglayabildiginden, insanlarda BoNT/B, D-C ve G için yüksek afiniteli reseptör minör reseptör Syt 1 için sinirlandirilir. Bu bulgular, (farkli bir reseptörü baglayan) BoNT/A'ya kiyasla BoNT/B'nin çok daha yüksek bir dozunun hastalarda ayni düzeylerde terapötik etkiler basarmak için gerekli olduguna yönelik klinik gözlemler için bir açiklama saglar.”25 Önceden, bu gözlemler diger nedenlere, örnegin, hazirlanan preparasyonlarda aktif nörotoksinin yüzdesine, atfedilmistir. Diger türlerin Syt ll'sine kiyasla BoNT/B'nin ve insan Syt Il'sinin bu tarz baglama farkliliklarinin yakin tarihli gözlemleri, BoNT/B'nin farkli rezidülerinin insan Syt ll'sini baglamaya dâhil edilebilecegini öne sürer.
Böylelikle, BoNT/B'ye, kemirgen Syt ll'sini baglamayi etkilemesi beklenen dizi modifikasyonu, insan Syt II'sini BoNT/B baglamasi üzerinde tahmin edilemeyen etkilere sahip olabilir.
KISA AÇIKLAMA Bulusun bir yönü, bir proteaz alani, bir proteaz klevaj yeri, bir translokasyon alani ve Clostrz'di'al botulinum serotip B'nin (B-Hc), serotip B'de, sus 1'de, sübstitüsyon Ell9lT; Sll99F; Sll99L; SlZOlV ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içeren bir modifiye edilmis reseptör baglama alanini içeren bir botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi ile ilgilidir, burada sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B- Hc'nin insan Syt II'yi güçlendirilmis baglamasini üretir. Bir uygulamada, modifiye edilmis (B-Hc) iki sübstitüsyon mutasyonu içerir. Bir uygulamada, iki karsilik gelir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191M ve S] 199L'ye karsilik gelir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191M ve Sll99Y'ye karsilik gelir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191M ve S] 199F'ye karsilik gelir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191Q ve Sl 199L'ye karsilik gelir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191Q ve S] 199Y'ye karsilik gelir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191Q ve S] 199F'ye karsilik gelir.
Bulusun bir baska yönü, bir proteaz alani, bir proteaz klevaj yeri, bir translokasyon alani ve d) Clostridial botulinum serotip B'nin (B-Hc), serotip B'nin, sus l'in, Sll99'una veya SlZOl'ine karsilik gelen bir pozisyonunda bir sübstitüsyon mutasyonu içeren bir modifiye edilmis reseptör baglama alanini içeren bir botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi ile ilgilidir. Sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt II'yi güçlendirilmis baglamasini ve/veya modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt I'i azaltilmis baglamasini üretebilir.
Sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt II'yi güçlendirilmis baglamasini ve/veya modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt I'i aiîtirilmis baglamasini üretebilir. Sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis A, R, N, D, C, Q, B, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y ve V'den olusan gruptan seçilebilir.
Sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis bir dogal olusumlu-olmayan amino asit olabilir. Modifiye edilmis B-Hc, sus 1'e ait olabilir. Bir uygulamada, proteaz alani, translokasyon alani ve proteaz klevaj yeri, A, B, C, D, E, F, G ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen serotipten elde edilir. Bir uygulamada, proteaz alani, translokasyon alani ve proteaz klevaj yeri, serotip B'den, sus l'den, elde edilir. Bir uygulamada, proteaz alani, translokasyon alani ve proteaz klevaj yeri, serotip A'dan, sus 1'den, elde edilir.
Bulusun bir baska yönü, serotip B'de, sus 1'de, sübstitüsyon mutasyonlarina Sll99L; SlZOlV ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içeren Clostri'dial botulinum serotip B'nin (B-Hc) bir modifiye edilmis reseptör baglama alanini içeren bir polipeptit ile ilgilidir, burada sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt II'yi güçlendirilmis baglamasini üretir. Bir uygulamada, modifiye edilmis (B-Hc) iki sübstitüsyon mutasyonu içerir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, Ell9lM ve Sll99L'ye karsilik gelir.
Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191M ve Sll99Y'ye karsilik gelir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191M ve Sll99F'ye karsilik gelir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, El l9lQ ve Sl 199L`ye karsilik gelir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191Q ve Sll99Y'ye karsilik gelir. Bir uygulamada, iki sübstitüsyon mutasyonu. E1191Q Serotip E`nin, sus l'in, Sl 199'una veya Sl201'ine karsilik gelen bir pozisyonda bir sübstitüsyon mutasyonu içeren Clostri'di'al botuli'num serotip B'nin (B-Hc) bir modifiye edilmis reseptör baglama alanini içeren bir polipeptit burada tarif edilir.
Sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt Il'yi güçlendirilmis baglamasim ve/veya modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt l'i azaltilmis baglamasini üretebilir. Sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syf Il'yi güçlendirilmis baglamasini ve/veya modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt I'i arttirilmis baglamasini üretebilir. Sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y ve V'den olusan gruptan seçilebilir. Sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis bir dogal olusumlu- olmayan amino asit olabilir. Modifiye edilmis B-Hc, sus l'e ait olabilir.
Bir ikinci kisma bagli Clostri'di'al botuli'mim serotip B'nin (B-Hc) bir modifiye edilmis reseptör baglama alani olan bir birinci kisim içeren bir kimerik molekül de burada tarif` edilir, burada modifiye edilmis B-Hc, serotip B'de, sus 1'de, kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içerir. Modifiye edilmis B-l-Ic iki sübstitüsyon mutasyonu içerebilir.
Iki sübstitüsyon mutasyonu, El l9lM ve Sll99L, El l9lM ve Sll99Y, El l9lM karsilik gelebilir. Iki sübstitüsyon mutasyonu, Ell9lM ve Sll99L'ye karsilik gelebilir. Iki sübstitüsyon mutasyonu, Ell9lM ve Sl 199Y'ye karsilik gelir. Iki sübstitüsyon mutasyonu, El 191 M ve Sl 199F'ye karsilik gelebilir. Iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191Q ve Sl 199L'ye karsilik gelebilir. Iki sübstitüsyon mutasyonu, 81199F'ye karsilik gelebilir. ModiIiye edilmis B-Hc, serotip B'nin, sus 1'in, 81199'una veya SlZOl'ine karsilik gelen bir pozisyonda bir sübstitüsyon mutasyonu içeren Clostri'di'al botuli'num serotip B'nin (B-Hc) bir modifiye edilmis reseptör baglama alanini içerebilir. Sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B- Hc'nin insan Syt Il'yi güçlendirilmis baglamasini ve/veya modifiye edilmis B- Hc'nin insan Syt l'i azaltilmis baglamasini üretebilir. Sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt ll'yi güçlendirilmis baglamasini ve/veya modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt 1'i arttirilmis baglamasini üretebilir. Sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis A, R, N, D, C, Q, B, G, H, 1, L, K, M, F, P, T, W, Y ve V'den olusan gruptan seçilebilir. Sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis bir dogal olusumlu-olmayan amino asit olabilir. Modifiye edilmis B-Hc, sus l'e ait olabilir. Birinci kisim ve ikinci kisim kovalent bir sekilde baglanabilir.
Birinci kisim ve ikinci kisim kovalent olmayan bir sekilde baglanabilir. Ikinci kisim, bir küçük molekülden, bir nükleik asitten, bir kisa polipeptitten ve bir proteinden olusan gruptan seçilebilir. Ikinci kisim, bir biyo-aktif molekül olabilir.
Ikinci kisim, bir terapötik polipeptit veya polipeptit-olmayan ilaç olabilir.
Bulusun bir baska yönü, burada tarif edilen polipeptidi veya kimerik molekülü sifreleyen bir nükleotid dizisi içeren bir nükleik asit ile ilgilidir.
Bulusun bir baska yönü, burada tarif edilen nükleik asidi içeren bir nükleik asit vektörü ile ilgilidir.
Bulusun bir baska yönü, burada tarif edilen nükleik asit vektörünü veya burada tarif edilen nükleik asidi içeren bir hücre ile ilgilidir.
Bulusun bir baska yönü, burada tarif edilen polipeptidi veya kimerik molekülü eksprese eden bir hücre ile ilgilidir.
Bulusun bir baska yönü, burada tarif edilen botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidini veya burada tarif edilen kimerik molekülü veya burada tarif edilen nükleik asit vektörünü veya burada tarif edilen nükleik asidini içeren bir farmasötik bilesim ile ilgilidir. Bir uygulamada, farmasötik bilesim ilaveten bir farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyan içerir.
Bulusun bir baska yönü, burada tarif edilen bir farmasötik bilesimi ve farmasötik bilesimin terapötik uygulamasi için talimatlari içeren bir kit ile ilgilidir.
Bulusun bir baska yönü, bir botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi üretmek için bir yöntem ile ilgilidir, yöntem burada tarif edilen konak hücreyi burada söz konusu BoNT polipeptidinin üretildigi kosullar altinda kültürleme adimlarini içerir. Bir uygulamada, yöntem ilaveten BoNT polipeptidini kültürden geri- kazanmayi içerir.
Istenmeyen nöronal aktivite ile iliskili bir rahatsizligi tedavi etmek için, burada tarif edilen BoNT polipeptidinin bir terapötik olarak etkili miktarini böylece istenmeyen nöronal aktivite gösteren bir veya birden fazla nörona temas etmek için, böylece rahatsizligi tedavi etmek için, bir süjeye uygulamayi içeren bir yöntem de tarif edilir. Rahatsizlik, Spazmodik disfoniden, Spazmodik tortikollisten, larinjeyal distoniden, oromandibüler disfoniden, lingual distoniden, servikal distoniden, fokal el distonisinden, blefarospazmdan, strabismustan, hemifasiyal spazmdan, göz kapagi bozuklugundan, serebral palsiden, fokal spastisiteden ve diger ses bozukluklarindan, Spazmodik kolitten, nörojenik mesaneden, anismustan, uzuv spastisitesinden, tiklerden, tremorlardan, 01761-P-0002 bruksizmden, anal Iissürden, akalazyadan, disfajiden ve diger kas tonu bozukluklarindan ve kas gruplarinin istemsiz hareketleri ile karakterize edilen diger bozu'kluklardan, lakrimasyondan, hiperhidrozdan, asiri tükürük salgilamadan, asiri gastrointestinal salgilardan, sekretuvar bozukluklardan, kas spazmlarindan kaynaklanan agridan, bas agrisindan ve dermatolojik veya estetik/kozmetik rahatsizliklardan olusan gruptan seçilebilir.
Herhangi birinin bir ilaçta veya tipta kullanilmasi için, burada tarif edilen bir botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi, burada tarif edilen farmasötik bilesim, burada tarif edilen kimerik molekül veya burada tarif edilen polipeptit de tarif Bulusun bir baska yönü, herhangi birinin istenmeyen nöronal aktivite ile iliskili bir rahatsizligi tedavi etmede kullanilmasi için, burada tarif` edilen bir botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi, burada tarif edilen farmasötik bilesim, burada tarif edilen kimerik molekül veya burada tarif edilen polipeptit ile ilgilidir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1A - Sekil 1D, BoNT'lerin nasil nöronlari hedef aldiginin sematik modellerini (A), bunlarin genel protein yapisini (B), tanimlanmis reseptörlerin bir listesini (C) ve bunun reseptörleri Syt'yi ve gangliyositleri BoNT/B baglamasi için yapisal modeli (D) gösterir. Sekil 1A), BoNT etkilerinin sematik bir gösterimi: BoNT'ler bunlarin spesifik reseptörlerini baglama ile nöronlari tanir (adim 1), reseptör-aracili endositoz vasitasiyla nöronlara girer (adim 2), akabinde BoNT'lerin hafif Zincirlerini endozomal membranlari geçerek sitozole yerini degistirir (adim 3), burada bu hafif zincirler hedef konak proteinleri yarmak için proteazlar olarak etki eder uyarlanir. Sekil 18: BoNT'ler., bir disüliit bag vasitasiyla bagli olan bir hafif zincirden ve bir agir zincirden olusur. Agir zincir ilaveten iki alana 01761-P-0002 bölünebilir: translokasyon alani (HN) ve reseptör baglama alani (Hc). Bu fonksiyonel alanlar, iyi-tanimlanmistir ve farkli BoNT'ler arasinda degistirilebilir.l Bu, modifiye edilmis BoNT/B-Hc'nin kimerik toksinler üretmek için BoNT/A-Hc'yi degistirmek için kullanilabilecegini öne sürer.
Sekil IC) Tanimlanmis toksin reseptörlerinin bir listesi. Sekil 1D) BoNT/B'nin hücre yüzeyi üzerinde, bunun protein reseptörünü,` kemirgen Syt I//Il'sini ayni zamanda bunun lipit ko-reseptörünü, gangliyositleri baglamasini gösteren bir yapisal model. D, Chai et al., Nature, 444:1096, 2006,“ kaynagindan uyarlanir.
Sekil 2A - Sekil 2G, (1) insan Syt II'sinin BoNT/B, D-C ve G için etkili bir reseptör olmadigini; (2) BoNT/B'nin reseptör baglama alanindaki rezidü degisimlerinin Syt II'nin baglama afinitesini ve toksinlerin potensini anlami bir sekilde degistirebilecegini; (3) Syt Il'yi baglamaya katki sagladigi hipotezi ortaya koyulan BoNT/B'nin reseptör baglama alani içindeki kilit rezidüleri gösteren yayinlanmis literatürden uyarlanmis önceki verileri gösterir. Sekil 2A) Kemirgen Syt I'i ve Syt [l'si arasindaki karsilastirma, kemirgen motor nöronlarinda Syt II'nin majör toksin reseptörü olurken Syt I'in bir minör toksin reseptörü oldugunu gösterir.
Sekil 2B) Insan Syt II'si toksin baglama yeri içinde bir tek rezidü (fare Syt ll'si içinde rezidü 54, insan Syt II'si içinde 51) ile fare/siçan Syt ll'sinden farklilik gösterir. Sekil 2C) Glutatyon S-transferaz (GST) etiketli rekombinant fare Syt ll'si 1-87 (in-Syt Il) ve insan Syt ll'sini taklit eden bir fare Syt II'si 1-87 mutanti (F54L, burada h-Syt II olarak ifade edilir), glutatyon-Sefaroz bilyeleri üzerinde immobilize edilmistir ve gangliyosit (Gangl) varliginda veya yoklugunda, BoNT/B'yi, BoNT/D-C'yi veya BoNT/G'yi asagi çekmek için kullanilmistir. Üç toksinin tümü, asagi- çekme analizlerinde m-Syt II'si l-87'yi baglar, ancak h-Syt II'sini baglamaz. Sekil 2D) Kültürlenmis siçan hipokampal nöronlar yalnizca Syt l eksprese eder, ancak Syt ll eksprese etmez.8 Bundan dolayi, Syt l'i nakavt etme (KD), endojen toksin reseptörleri olmayan nöronlar üretir.
Akabinde, tam-boy in-Syt Il'si ve h-Syt ll'si Syt l KD hipokampal 01761-P-0002 nöronlarda eksprese edilmistir ve bu nöronlar BoNT/B'ye (20 HM, 5 dk maruziyet, 24 sa inkübasyon) maruz birakilmistir. Toksin substrat sinaptobrevin (Syb) klevajinin derecesi ile bulgulandigi üzere, h-Syt ll'sinin BoNT/B'nin, BoNT/D-C'nin ve BoNT/G'nin Syt l KD nöronlara girisine aracilik etmede m-Syt l'ine kiyasla anlamli olarak daha az etkili oldugu bulunmustur. Sekil 2E) Panel C`de tarif edildigi üzere, siçan Syt 1'i 1-83 ve insan Syt I'i 1-80 BoNT/B'yi, BoNT/D-C'yi ve BoNT/G'yi asagi çekmek için kullanilmistir. Insan Syt I'i, üç toksinin tümü için siçan Syt 2A ila E, asagidaki yakin tarihli yayindan uyarlanir: Peng et al., J. Cell Sekil 2F) (ayrica BoNT/Bl olarak tanimlanan) BoNT/B'nin ve BoNT/B2 olarak bilinen bunun alt-tiplerinin birinin siçan Syt [l'sini baglama afinitesi, rekombinant Syt 11 üzerinde 1251 etiketli BoNT/Bl'in baglamasi (sol panel) ile rekabet etmek için BoNT/Bl'in ve B2'nin reseptör baglama alani (sag panel) kullanilmasi ile bir kompetisyon analizinde belirlenir.
(Baglama atinitesini yansitan) IC50, BoNT/Bl için 0,48 nM'dir ve BoNT/B2 için 2 nM'dir, ~4-katlik fark. BoNT/Bl ve BONT/B2 arasindaki bu bölgeyi degistirme (sag panel) esas itibariyle bunlarin baglama afinitesini (sag panel) degistireceginden, bu afinite farki reseptör baglama alaninin (rezidü 1028-1291) C-ucundan kaynaklanir. Sekil 2G), BoNT/Bl ve BONT/B2 arasinda farkli olan rezidülerin listesi (sag panel). Bu rezidülerin bu iki toksin arasinda kemirgen Syt II'sini baglama afinitesi farki için neden oldugu düsünülür. Bundan dolayi, bunlar BoNT/B ve insan Syt II'si arasinda baglama afinitesini etkileyebilen kilit rezidüler uyarlanir. (H) Tablo'da gösterildigi üzere BoNT/A'nin ve BoNT/B'nin reseptör baglama alani içinde tek rezidü mutasyonlari bu toksinlerin potensini ve toksisitesini anlamli bir sekilde degistirebilir. Bu panel, (I) Syt II'yi (kirmizi) BoNT/B (gri) baglamasinin es-kristal yapisi, BoNT/B 01761-P-0002 içinde baglama cebini olusturan (sagdaki tabloda listelenen) kilit rezidüleri Sekil 3A - Sekil 3B, BoNT/B/Hc'nin hedeflenmis mutajenezini ve bunlarin m-Syt ll'sini ve h-Syt Il'sini baglama üzerindeki etkilerini gösterir. Sekil 3A) WT BoNT/B-Hc ve gösterilen BONT/B-Hc mutantlar, E. coli'de rekombinant proteinler olarak eksprese edilmistir. Bakteriyel lizatlar hasat edilmistir ve immobilize edilmis m-Syt II'si (1-87) veya h-Syt II'si (1-87) ile inkübe edilmistir. Bagli peletler, HA antikoru kullanilarak BoNT/B- Hc'yi saptayan immünoblot analizleri ile analiz edilmistir. "Girdi", bakteriyel lizatlari temsil eder. h-Syt Il'sini güçlü baglama gösteren mutantlar oklar ile gösterilir. sekil 3B)Sekil 3A'da test edilen BoNT/B-Hc mutasyonlarini kategorize eden bir tablo.
Sekil 4A - Sekil 4B, bunlarin Syt 1'i ve Syt Il'yi baglamasi için seçilmis BoNT/B-Hc mutantlarinin ilave karakterizasyonunu gösterir. Sekil 4A) BoNT/B-Hc WT ve gösterilen mutantlar E. coli'de eksprese edilmistir.
Hasat edilmis bakteriyel lizatlar, gangliyositlerin varliginda veya yoklugunda, immobilize edilmis GST-etiketli insan Syt I'i (1-80) ile inkübe edilmistir. Bagli malzemeler, BoNT/B-Hc'yi saptayan immünoblot analizleri ile analiz edilmistir. E1191M, BoNT/B-Hc'nin insan Syt I'ini baglamasini anlamli bir sekilde güçlendirmis iken, V1118M, WT BoNT/B-Hc'ye kiyasla insan Syt 1'ini azaltilmis baglamaya sahiptir. Sekil 4B) WT BoNT/B-Hc ve E1191M mutanti, Hisö-etiketli rekombinant proteinler olarak saflastirilmistir ve lipit ko-reseptör gangliyositler (Gangl) varliginda veya yoklugunda, immobilize edilmis GST-etiketli m-Syt II'si (1-87) veya h-Syt II'si (1-87) ile inkübe edilmistir. BoNT/B-Hc, gangliyositler olmadan h-Syt Il'sini baglayamaz ve gangliyositlerin varliginda yalnizca zayif bir baglama gösterir. Sailastirilmis E1191M mutantlari gangliyositler olmadan h-Syt Il'sini baglar ve baglama gangliyositlerin varliginda ilaveten güçlendirilir. 01761-P-0002 Sekil 5A - Sekil 5B, insan Syt I/Il'yi baglamanin seçilmis tek rezidü sübstitüsyonlarini birlestirme ile ilaveten güçlendirilebilecegini gösterir.
Sekil 5A) Gösterildigi üzere iki mutasyon yerini birlestiren seçilmis ikili mutantlar Sekil 3A'da tarif edildigi üzere asagi-çekme analizlerinde bunlarin m-Syt ll'sini ve h-Syt ll'sini baglama yetisi için test edilmistir. Iki veya E1191Q (oklarla gösterilir), h-Syt II'sini güçlü baglama göstermistir.
Sekil 5B) Seçilmis ikili mutantlarin insan Syt I'ini baglamasi asagi-çekme analizlerinde analiz edilmistir. Tüm ikili mutantlar, WT BoNT/B-Hc'ye kiyasla insan Syt I'ini anlamli bir sekilde güçlendirilmis baglama göstermistir.
Sekil 6A - Sekil 6D, bir temsili ikili mutantin, E1191M/Sll99Y, ilave karakterizasyonunu gösterir. Sekil 6A) BoNT/B-Hc WT, El 191M ve E1191M/Sll99Y mutantlari E. coli'de eksprese edilmistir ve His6-etiketli rekombinant proteinler olarak saflastirilmistir. Bu proteinlerin esit miktarlari ( varliginda veya yoklugunda, gösterildigi üzere immobilize edilmis GST-etiketli m-Syt II'si (1-87) veya h-Syt II'si (1-87) ile inkübe edilmistir. Bagli malzemeler immünoblot analizine tabi tutulmustur. "Girdi", asagidaki siralarda saflastirilmis rekombinant proteinleri temsil eder: WT, El 191M, El l9lM/Sl 199Y. WT BoNT/B-Hc gangliyostler olinadan h-Syt ll'sini baglayamaz ve gangliyositlerin varliginda yalnizca zayif bir baglama gösterir (satir 4, 5), E1191M mutanti, gangliyositler olmadan h-Syt ll'sini baglar ve baglama gangliyositlerin varliginda ilaveten güçlendirilir (satir 6, 7). sekilde güçlendirmistir (satir 8, 9). E1191M/Sll99Y'nin hem h-Syt ll'sini (satir 8, 9) hem de m-Syt II'sini /satir 10, 11) baglamasi, m-Syt ll'sini WT BoNT/B-Hc baglamasi ile benzer düzeylerdedir (satir 13, 14). Sekil 6B) mutantlari GST etiketli h-Syt I'i ile inkübe edilmistir. Bagli malzemeler immünoblot analizine tabi tutulmustur. Hem E1191M hem de 01761-P-0002 E1191M/Sll99Y, WT BoNT/B-Hc'ye kiyasla h-Syt I'ini baglainayi anlamli bir sekilde güçlendirmistir. Sekil 6C) Gösterildigi üzere, saflastirilmis WT BoNT/B-Hc'nin titrasyonlari (nM) m-Syt Il'si ile inkübe edilirken, saflastirilmis El 191M/S] 199Y titrasyonlari h-Syt II'si ile inkübe edilmistir. Bagli malzemeler immünoblot analizine tabi tutulmustur.
E1191M/Sll99Y'nin h-Syt Il'sini baglamasi, WT BoNT/B-Hc'nin m-Syt h-Syt 11 arasindaki baglama afinitesi panel C'de elde edilen immünoblot sonuçlarini kantifiye etmeye dayanarak tahmin edilmistir. Kd'nin h-Syt edilirken, m-Syt H'sini WT BoNT/B baglarnasi için Kd, 68 +/- 12 nM'dir.
Bundan dolayi, E1191M/51199Y'nin h-Syt II'sini baglamasi m-Syt II'sini WT BoNT/B baglarnasina kiyasla ~3,5 kat daha yüksektir.
Sekil 7, BoNT/B-Hc E1191M/Sll99Y mutantinin nöronlarin yüzeyi üzerinde eksprese edilen h-Syt II'sini baglayabildigini gösterir.
Kültürlenmis siçan hipokampal nöronlari, yalnizca Syt I'i eksprese eder, ancak Syt II'yi eksprese etmez. Bundan dolayi, lentiviral enfeksiyon vasitasiyla Syt I ekspresyonunu nakavt-etme (KD) herhangi bir endojen Syt'si olmayan nöronlar olusturmustur ve bu WT ve E1191M/Sll99Y BoNT/B-Hç` baglainasini feshetmistir (soldan ikinci çerçeve). Akabinde, m-Syt II'si, m-Syt lI'si (F54L) ve h-Syt II'si lentiviral enfeksiyon vasitasiyla bu nöronlarda eksprese edilmistir. WT BoNT/B-Hc, m-Syt baglayarnaz. E1191M/Sll99Y mutanti, nöron yüzeyi üzerinde hem m-Syt belirteç olarak da etiketlenmistir.
Sekil 8, BoNT/B-Hc'nin amino asit dizisidir (sus 1; BoNT/B 1 Okra susu).
Sekil 9, E. coli'de ekspresyon için optimize edilmis, BoNT/B-Hc ((sus BI, 01761-P-0002 rezidüleri) sifreleyen nükleik asit dizisidir. Nükleik asit dizisi, SEQ ID NO: 2'de gösterilir.
Sekil 10, C. botuli'num serotipi A'nin amino asit dizisini gösterir (1296 a.a.) (SEQ ID NO: 3).
Sekil 11, C. botuli'num serotipi B'nin amino asit dizisini gösterir (1291 a.a.) (SEQ ID NO: 4).
Sekil 12, C. botulinum serotipi Cl'in amino asit dizisini gösterir (1291 a.a.) (SEQ ID NO: 5).
Sekil 13, C. botuli'num serotipi D'nin amino asit dizisini gösterir (1276 a.a.) (SEQ ID NO: 6).
Sekil 14, C. botuli'num serotipi E'nin amino asit dizisini gösterir (1252 a.a.) (SEQ ID NO: 7).
Sekil 15, C. botulinum serotipi F'nin amino asit dizisini gösterir (1274 a.a.) (SEQ ID NO: 8).
Sekil 16, C. botuli'num serotipi G'nin amino asit dizisini gösterir (1297 a.a.) (SEQ ID NO: 9).
BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bulusun yönleri, bir modifiye edilmis reseptör baglama alaninin katilmasi yoluyla bunun insan reseptörlerini iyilestirilmis baglamasina sahip olan C. botulinum nörotoksini (BONT) polipeptidi ile ilgilidir. Bu bulgulardan, terapötik BoNT'lerin yeni bir jenerasyonu, güncel olarak yararlanilan WT BONT'lere kiyasla insan nöronlarini hedef almak için iyilestirilmis etkinligi ve özgüllügü olan burada tanimlanmis modifiye edilmis reseptör baglama alanindan yararlanma ile olusturulabilir.
Tanimlar Burada kullanildigi sekliyle, "baglama afinitesi" terimi, bir molekülün baglama aktivitesinin özel bir reseptör sistemi için ne kadar güçlü oldugu anlamina gelir. 01761-P-0002 Genel olarak, yüksek baglama afinitesi bir baglama alani ve bunun reseptör sistem arasinda daha büyük moleküller-arasi kuvvetten kaynaklanirken, düsük baglama afinitesi, ligand ve bunun reseptörü arasinda daha az moleküller-arasi kuvvet içerir. Yüksek baglama afinitesi, düsük baglama afinitesi için olan duruma kiyasla, bunun reseptör baglama yerinde baglama alani için daha uzun bir kalma süresini içerir. Böylelikle, yüksek bir baglama atinitesi olan bir molekül, bir reseptör sisteminin baglama yerlerini maksimal olarak mesgul etmek ve bir fizyolojik yanit tetiklemek için bu molekülün daha düsük bir konsantrasyonunun gerekli oldugu anlamina gelir. Aksine, düsük baglama afinitesi, bir reseptör sisteminin reseptör baglama yerleri maksimal olarak mesgul edilmeden ve maksimum fizyolojik yanit basarilmadan önce bir molekülün görece daha yüksek bir konsantrasyonunun gerekli oldugu anlamina gelir. Böylelikle, mevcut bulusun yüksek baglama afinitesinden dolayi arttirilmis baglama aktivitesi olan bir botulinum nörotoksini toksinin azaltilmis dozlarinin uygulanmasina, böylelikle hedeflenmemis alanlara toksin dagilmasi ile iliskili istenmeyen yan-etkileri azaltmaya veya önlemeye olanak saglayacaktir.
Burada kullanilan terim olarak, "anlamli bir sekilde güçlendirilmis baglama" mevcut bulusun bir C. botulinum nörotoksini molekülünün bir spesifik reseptörü baglama afinitesini tarif etmek için kullanildiginda, molekülün sübstüte- edilmemis versiyonuna kiyasla, bir spesifik reseptör için baglama afinitesinde kayda deger ölçüde (örnegin, dogal tip molekülün baglama afinitesinin %lO'u, ifade eder. Bir uygulamada, güçlendirilmis baglama sübstüte-edilmemis nörotoksinin (örnegin, bir dogal olusumlu BoNT Hc molekülünün) Kd'sine kiyasla bir bir büyüklük mertebesi veya fazla yüksektir. Burada tarif edilen nokta mutasyonlari ile üretilen bir BoNT/B-Hc baglama fragmaninin baglama afinitesini tarif etmek için kullanildiginda "anlamli bir sekilde güçlendirilmis baglama" terimi, molekülün sübstüte-edilmemis versiyonunun baglamasina kiyasla, (tam BoNT proteininin bir izole edilmis fragmani olarak eksprese edilen) modifiye edilmis baglama alaninin spesifik bir reseptörü baglama afinitesinde (örnegin, 01761-P-0002 veya %90'1) arttirilinis bir artisi ifade eder. Bir uygulamada, güçlendirilmis baglama, sübstüte-edilmemis fragmanin Kd'sine kiyasla anlamli olarak daha yüksektir (örnegin, 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X, vb.).
Burada kullanildigi sekliyle, "botulinum nörotoksini" terimi, bu yolla bir C. botulinum toksininin bir nörona girdigi ve nörotransmitter salimini inhibe ettigi ve bir C. botulmum toksininin bir düsük veya yüksek afiniteli reseptör kompleksini baglamasini, toksinin içsellestirilmesini, toksin hafif zincirinin sitoplazmaya translokasyonunu ve bir C. botuli'num toksini substratinin modiûkasyonunu kapsayan genel hücresel mekanizmayi yerine getirebilen herhangi bir polipeptit anlamina gelir.
Burada kullanilan terim olarak, bir "modifiye edilmis reseptör baglama alani" veya "modifiye edilmis Hc", bunun dâhil edildigi C. botulinum nörotoksini molekülünün C. botulinum nörotoksini için bir hedef hücrenin yüzeyi üzerinde yer alan bir reseptörü baglamasini kolaylastirir. Bu tarz bir molekül tipik olarak, genetik rekombinasyon teknolojisi yoluyla üretilir. Modifiye edilmis Hc, C. botulinum nörotoksini için bir hedef hücrenin yüzeyi üzerinde yer alan reseptör için bir baglama aktivitesine sahiptir. Burada kullanildigi sekliyle, "baglama aktivitesi" terimi, bir molekülün, sinirlandirma olmaksizin, bir kovalent bagi, bir iyonik bagi, bir metalik bagi, bir hidrojen bagini, bir hidrofobik etkilesimi, bir van der Waals etkilesimini ve benzerlerini veya bunlarin herhangi bir kombinasyonunu içeren en az bir moleküller-arasi veya molekül-içi kuvvet vasitasiyla bir baska moleküle dogrudan veya dolayli olarak temas ettigi anlamina gelir. "Bagli" ve "baglamak", baglama için düsünülen terimlerdir.
Burada kullanildigi sekliyle, "C. botuli'num toksini proteaz alani" terimi, intoksikasyon prosesinin enzimatik hedefmoditikasyon adimini yerine getirebilen bir C. botuli'num toksini alani anlamina gelir. Böylelikle, bir C. botulinum toksini proteaz alani spesifik olarak, bir C. botuli'num toksini substratini hedefler ve bir C. 01761-P-0002 botulz'num toksini substratinin, mesela, örnegin, bir SNAP-25 substrati, bir VAMP substrati ve bir Syntaxin substrati gibi SNARE proteinlerinin, proteolitik klevajini C. botulinum toksini proteaz alanlarinin sinirlayici-olmayan örnekleri, Tablo 1'de ve 2'de saglanir.
Burada kullanildigi sekliyle, "C botulinum toksini translokasyon alani" veya "HN" terimi, C. botuli'num toksini hafif zinciri translokasyonuna aracilik eden intoksikasyon prosesinin translokasyon adimini yerine getirebilen bir C. botulinum toksini alani anlamina gelir. Böylelikle, bir HN, bir C. botulinum toksini hafif zincirinin bir ineinbrani geçen hareketini kolaylastirir ve bir C. botuli'num toksini hafif zincirinin bir intraselüler vezikülün membrani yoluyla bir hücrenin sitoplazmasina hareketini kapsar. Bir l-lN'nin sinirlayici-olmayan örnekleri, amino asit dizileri Tablo 1'de ve Sekiller 10-16'da saglanan bir BoNT/A HN, bir BoNT/B HN, bir BoNT/Cl HN, bir BoNT/D HN, bir BoNT/E HN, bir BoNT/F HN ve bir BoNT/G HN'yi içerir.
Burada kullanildigi sekliyle, "C. botulinum reseptörü-baglama alani" terimi, "HC alani" ile es-anlamlidir ve örnegin, C. botulinum toksininin bir hedef hücrenin plazma membrani yüzeyi üzerinde yer alan bir C. botuli'num toksini-spesifik reseptör sistemini baglamasini içeren, intoksikasyon prosesinin hücre baglama adimini yerine getirebilen herhangi bir dogal olusumlu C. botulinum reseptör baglama alani anlamina gelir. Baglama aktivitesinin degistirilmesinin, örnegin, tüm C. botuli'num HC alanini bir modifiye edilmis (örnegin, güçlendirilmis) HC alani ile degistirme, ile basarilabilecegi tasavvur edilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "C. botuli'num toksini hedef hücresi" terimi, bir dogal olusumlu C. botulinum toksininin intoksike edebildigi bir dogal olusumlu hücre olan, sinirlandirma olmaksizin, motor nöronlari; duyusal nöronlari; otonomik nöronlari; mesela, örnegin, sempatik nöronlari ve parasempatik nöronlari; 01761-P-0002 petiderjik-olmayan nöronlari, mesela, örnegin, kolinerjik nöronlari, adrenerjik nöronlari, nöradrenerjik nöronlari, serotonerjik nöronlari, GABAerj ik nöronlari ve peptiderjik nöronlari, mesela, örnegin, Madde P nöronlarmi, Kalsitonin Geni Iliskili Peptit nöronlarini, vazo-aktif intestinal peptit nöronlarini, Nöropeptit Y nöronlarini, kolesistokinin nöronlarini, içeren bir hücre anlamina gelir. eden bilesenlerden çesitlilik gösteren derecelerde muaf olan bir malzeme kastedilir. "Izolat", orijinal kaynaktan veya etrafindakilerden, örnegin, iki yanindaki DNA'dan veya DNA'nin dogal kaynagindan, bir ayirma derecesini gösterir. (örnegin, diger polipeptitler) açisindan, "kayda deger ölçüde sat" olan bir polipeptidi ifade etmek için kullanilir. Bu, diger bilesenler açisindan, en az en az yaklasik %90 ve en tercihen en az yaklasik %95 saf olan bir polipeptidi ifade edebilir. Farkli bir sekilde ifade edildiginde, bir polipeptit açisindan "kayda deger ölçüde saf” veya "esas olarak saflastirilmis" terimleri, yaklasik %20'den daha az, daha tercihen yaklasik %15'ten, %10'dan, %8'den, %7'den daha az, en tercihen yaklasik %S'ten, %4'ten, %3'ten, %2'den, %l'den daha az veya %l'den daha az diger bilesenlerin birini veya birden fazlasini (örnegin, diger polipeptitleri veya hücresel bilesenleri) içeren bir preparasyonu ifade eder.
Burada kullanildigi sekliyle, "konservatif' veya "konservatif sübstitüsyon mutasyonu" terimi, bir amino asidin benzer özelliklere sahip olan bir baska amino asit için Sübstüte edildigi bir mutasyonu ifade eder, böylece peptit kimyasi tekniginde uzmanligi olan bir kisi polipeptidin sekonder yapisinin, kimyasal özelliklerinin ve/veya hidropatik dogasinin kayda deger ölçüde degistirilmemis olmasini bekleyecektir. Amino asitlerin asagidaki gruplari tarih boyunca, konservatif degisimler olarak bir digeri için Sübstüte edilmektedir: (1) ala, pro, 01761-P-0002 gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, try, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his ve (5) phe, tyr, trp, his. Yaygin bir sekilde kabul edilmis diger konservatif sübstitüsyonlar asagida listelenir: Rezidü KonservatifSübstitüsyonlar Rezidü KonservatifSübstitüsyonlar Ala Ser Leu lie; Val Arg Lys Lys Arg; Gln Asn Gln; His Met Leu; Ile Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr Gln Asn Ser Thr; Gly Cys Ser Thr Ser; Val Gly Pro Tyr Trp; Phe His Asn; Gln Val Ile; Leu Spesifik bir amino aside atif yapilmadan, "sübstitüsyon mutasyonu" terimi, bu pozisyonda normal olarak bulunan dogal tip rezidü disindaki herhangi bir amino asidi içerebilir. Bu tarz sübstitüsyonlar, polar-olmayan (hidrofobik) amino asitler, örnegin, glisin, alanin, valin, lösin, izolösin, metiyonin, fenilalanin, triptofan ve prolin, ile degistirme olabilir. Sübstitüsyonlar, polar (hidrofilik) amino asitler, örnegin, serin, treonin, sistein, tirozin, asparajin ve glutamin, ile degistirme olabilir. Sübstitüsyonlar, elektriksel olarak yüklü amino asitler, örnegin, negatif elektrik yüklü amino asitler, örnegin, aspartik asit ve glutamik asit ve pozitif elektrik yüklü amino asitler, örnegin, lizin, arjinin ve histidin, ile degistirme olabilir. 01761-P-0002 Burada tarif edilen sübstitüsyon mutasyonlari tipik olarak, bir farkli dogal olusumlu amino asit rezidüsü ile degistirme olacaktir, ancak bazi durumlarda dogal olusumlu olmayan amino asit rezidüleri de sübstüte edilebilir. Burada kullanilan terim olarak, dogal-olmayan amino asitler, dogal olusumlu olan veya kimyasal olarak sentezlenen proteinojenik-olmayan (yani, protein kodlamayan) amino asitlerdir. Örnekler, sinirlandirma olmaksizin, ß-amino asitlerini (B3 ve [32), home-amino asitlerini, prolin ve pirüvik asit türevlerini, 3-sübstüte edilmis alanin türevlerini, glisin türevlerini, halka-sübstüte edilmis fenilalanin ve tirozin türevlerini, lineer çekirdek amino asitlerini, diamino asitleri, D-amino asitleri ve N-metil amino asitleri, içerir. Bazi uygulamalarda, amino asit sübstüte edilebilir veya sübstüte edilmeyebilir. Sübstüte edilmis amino asit veya sübstütent bir halojenlenmis aromatik veya alifatik amino asit, hidrofobik yan zincir üzerinde bir halojenlenmis alifatik veya aromatik modifikasyon veya bir alifatik veya aromatik modifikasyon olabilir. uygulandiginda rahatsizligin bir veya birden fazla semptomunda bir terapötik olarak anlamli düsüsü etkilemek için yeterli olan bir miktari ifade eder. Bir semptomda bir terapötik olarak anlamli düsüs, bir kontrole veya tedavi-edilmemis süjeye kiyasla örnegin, yaklasik %10, yaklasik %20, yaklasik %30, yaklasik %40, semptomlari elimine etmektir veya azaltmaktir. Yararli veya arzu edilen klinik sonuçlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, semptomlarin eliminasyonunu, semptomlarin hafitletilmesini, rahatsizligin boyutunun azaltilmasini, rahatsizligin stabilize edilmis (yani, agirlasmayan) hâlini, rahatsizligi progresyonunu geciktirmeyi veya yavaslatmayi, içerir. 01761-P-0002 Burada kullanildigi sekliyle, bir "süje", bir insani veya hayvani ifade eder. Genel olarak, hayvan bir omurgalidir, örnegin, bir primattir, kemirgendir, evcil hayvandir veya oyun hayvanidir. Primatlar, sempanzeleri, sinomolgus maymunlarini, örümcek maymunlari ve makaklari, örnegin, Rhesus'u, içerir.
Kemirgenler, fareleri, siçanlari, dag siçanlarini, dag gelinciklerini, tavsanlari ve hamsterlari içerir. Evcil hayvanlar ve oyun hayvanlari, inekleri, atlari,` domuzlari, geyikleri, bizonlari, bufalolari, kedi türlerini, örnegin, evcil kediyi. kanin türlerini, örnegin, köpegi, tilkiyi, kurdu. kus türlerini, örnegin, tavugu, emuyu, devekusunu ve baligi, örnegin, alabaligi, kedi baligini ve somon baligini, içerir. Hasta veya süje yukaridakilerin herhangi bir alt-kümesini, örnegin, bir veya birden fazla grubu veya türü, örnegin, insanlari, primatlari veya kemirgenleri dâhil etmeyerek yukaridakilerin tüinünü içerir. Burada tarif edilen yönlerin belirli uygulamalarinda, süje bir memelidir, örnegin, bir primattir, örnegin, bir insandir. kadin olabilir. Bir süje, bir tam olarak gelismis süje (örnegin, bir eriskin) veya gelisimsel proses geçirmekte olan olan bir süje (örnegin, bir çocuk, bebek veya fetüs) olabilir.
Tercihen, süje bir memelidir. Memeli, bu örnekler ile sinirli kalmamak kaydiyla, bir insan, insan-olmayan primat, fare, siçan, köpek, kedi, at veya inek, olabilir.
Insanlar disindaki memeliler avantajli bir sekilde, istenmeyen nöronal aktivite ile iliskili bozukluklarin hayvan modellerini temsil eden süjeler olarak kullanilabilir.
Buna ek olarak, burada tarif edilen yöntemler ve bilesimler evcillestirilmis hayvanlari ve/veya evcil hayvanlari tedavi etmek için kullanilabilir.
Uygulamalar BoNT/B'nin bunun insan Syt II'sini baglayamama yetisinden dolayi insanlarda daha az spesifik ve güçlü oldugu gözlemi, BoNT/B'ye kiyasla karsilastirmali olarak daha yüksek dozlarin neden gerekli oldugunu açiklayabilir. Daha yüksek BoNT/B dozlari antikor yanitlarini tetiklemek için ve ciddi yan-etkilerin 01761-P-0002 gerçeklesmesi için arttirilmis sanslara karsilik gelir. Bundan dolayi, bunun insan nöronlarini hedef almak için etkinligini ve özgüllügünü arttirmak için BoNT/B'nin insan reseptörü Syt ll'sini iyilestirilmis baglamasi terapötik uygulamalarda kullanilan toksin dozlarinin bir azaltilmis miktarina olanak saglamalidir.
Bulusun yönleri, BoNT/B-Hc'nin protein dizisini modifiye etmenin reseptör baglama alani içeren fragmanin insan Syt II reseptörünü baglamasini modifiye ettigi bulgusundan dogar. Baglamayi güçlendiren, böylece insan Syt II'sini yüksek-afinite ile baglayan bir alan üreten, spesifik inoditikasyonlar tanimlanmistir. Bir tam boy BoNT proteini baglaminda oldugunda, modifiye edilmis BoNT/B-Hc, bu baglama özelliklerini muhafaza eder. Güçlendirilmis baglamasi olan bir modifiye edilmis reseptör baglama alaninin diger BoNT alanlarini içeren bir moleküle katilmasi, bu yolla benzer sekilde güçlendirilmis reseptör baglamalari olan bir tam boy BoNT molekülü üretir. Böylelikle, BoNT'nin insan Syt ll'sini yüksek-afinite ile baglayan yeni versiyonlari üretilir.
Anlamli bir sekilde güçlendirilmis baglamasi olan BoNT, güncel olarak mevcut BONT moleküllerine kiyasla daha düsük dozlarda olmasina ragmen, benzer terapilerde kullanilabilir, böylece tedavinin daha güvenli yöntemlerini saglayabilir.
Burada tarif edilen tam-boy BoNT polipeptitlerini ve BoNT polipeptidi fragmanlarini veya alanlarini içeren BoNT polipeptitleri ve bunlari sifreleyen nükleik asit molekülleri açik bir sekilde bulusta kapsanir. Bu polipeptitler ve nükleik asit moleküller, teknikte bilinen rekombinant DNA prosedürleri ile üretilebilir. Bu tarz polipeptitler tipik olarak, "rekombinant polipeptitler" veya BoNT, Sekil lB'de gösterilen genel yapiya sahiptir. BoNT, her bir alanin bir spesifik ve bagimsiz fonksiyona sahip oldugu üç alandan olusur: bir proteaz alani (ayni zamanda, hafif zincir olarak ifade edilir), bir translokasyon alani (HN) ve bir reseptör-baglama alani (HC). C. botulinum nörotoksininin çesitli suslarinin 01761-P-0002 alanlarinin, (U.S. Patent 8,052,9797da. dogal olusumlu kimerik toksinler, örnegin, BoNT/D'nin Hc'si ile birlikte BoNT/C'nin hafif zincirinden ve HN'sinden olusan BoNT/CD34, ile gösterildigi üzere) büyük ölçüde degistirilebilir oldugu gösterilmistir. Protein tek Zincirli formda veya iki-Zincirli formda olabilir. Iki- zincirli form, proteaz alani ve translokasyon alani arasinda yer alan bir proteaz klevaj yerinin dogal olusumlu proteaz islenmesinden kaynaklanir. Protein, bir di- sülfit bag varligi ile proteaz islemeyi takiben iki-Zincirli formda idame ettirilir.
Bulusun bir yönü, burada tarif edildigi üzere, Clostri'di'al botulinum serotipi B'nin bir proteaz alanini, bir translokasyon alanini ve bir modifiye edilmis reseptör baglama alanini ve bir proteaz klevaj yerini içeren bir botulinum nörotoksini (BoNT) ile ilgilidir. Tipik olarak bunlar, proteaz alani, proteaz klevaj yeri, translokasyon alani ve modifiye edilmis reseptör baglama alani olan bir lineer amino-ila-karboksil tek polipeptit sirasinda dizilir. Bununla birlikte, çesitli alanlarin farkli diziliinlerinin fonksiyonel olarak yeterli olmasi beklenir. Modifiye edilmis reseptör baglama alani, insan Syt I reseptörünü ve/veya insan Syt Il reseptörünü anlamli bir sekilde güçlendirilmis baglamaya yol açan bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içerir.
Clostridia botulinum suslari, insanlarda (BoNT/A, /B, /E ve /F), hayvanlarda (BoNT/Cl ve /D) botulizm salginlarini arastirma ile tanimlanmis veya topraktan izole edilmis (BoNT/G) yedi antijenik olarak ayri Botulinum toksini (BoNT) tipi üretir. Yedi BoNT serotipinin tümü benzer yapi özelliklerine ve farmakolojik özelliklere sahip iken, her biri ayrica, heterojen bakteriyolojik karakteristikler de gösterir. C. botulinum suslarinin genetik çesitliligi, Hill et al., kaynaginda detayli Çesitli C. botulinum suslarindan elde edilen toksinler ayni fonksiyonel alan organizasyonunu ve genel yapisal yapiyi paylasir. C. botulinum toksinlerinin her biri, bir dogal olusumlu proteaz, mesela, örnegin, bir endojen C. botulinum toksini proteazi veya ortamda üretilen bir dogal olusumlu proteazlar ile proteolitik 01761-P-0002 kesilme ile müteakiben yarilan yaklasik olarak 150 kDa'luk bir tek Zincirli polipeptit olarak aktarilir. Bu post-translasyonel isleme, bir tek disülfit bag ve kovalent-olmayan etkilesimler ile birlikte tutulan yaklasik olarak 50 kDa'luk bir hafif zincir (Lc) ve yaklasik olarak içeren bir iki- Zincirli molekül üretir. Her bir matür iki-Zincirli molekül, üç fonksiyonel olarak ayri alan içerir: 1) Lc içinde yer alan, nörotransmitter salim aparatinin çekirdek bilesenlerini spesifik olarak hedef alan bir çinko-bagimli endopeptidaz aktivite içeren bir metalloproteaz bölge içeren bir proteolitik alan; 2) Hc'nin amino-ucu yarisina (HN) dâhil edilen, intraselüler veziküllerden hedef hücrenin sitoplazmasina LC salimini kolaylastiran bir translokasyon alani ve 3) Hc'nin karboksil-ucu yarisi içinde bulunan, toksinin hedef hücrenin yüzeyinde yer alan reseptör kompleksini baglama aktivitesini ve baglama özgüllügünü belirleyen bir baglama alani. Toksin içindeki spesifik alanlarin lokasyonlari, Tablo 1'de saglanir: Çesitli suslardan C. botulinum toksini alanlari Toxin LC HN Hc Toksinlerin tam amino asit dizileri, Sekiller 10-16'da saglanir. 01761-P-0002 Bu üç fonksiyonel alanin baglama, translokasyon ve proteaz aktivitesinin tümü toksisite için gereklidir. Bu yolla C. botuli'num toksinlerinin bir nörona girdigi ve nörotransmitter salimini inhibe ettigi genel hücresel intoksikasyon mekanizmasi, serotipe veya alt-tipe bakilmaksizin, benzerdir. Teoriye ile baglanmayi istemeden, intoksikasyon mekanizmasi en az dört adimi içerir: 1) reseptör baglama, 2) kompleks içsellestirilmesi, 3) hafif zincir translokasyonu ve 4) proteaz hedef modifikasyonu. Bir C. botulinum toksininin Hc alani bir hedef hücrenin plazma membrani yüzeyi üzerinde yer alan bir toksin-spesifik reseptörü bagladiginda, proses baslatilir. Bir reseptör kompleksinin baglama özgüllügünün, kismen, gangliyositlerin ve protein reseptörlerinin spesifik kombinasyonlari ile basarilacagi düsünülür. Baglandiginda, toksin/reseptör koinpleksleri endositoz ile içsellestirilir ve içsellestirilmis veziküller spesifik intraselüler yollara ayrilir.
Translokasyon adimi, vezikül kompartimammn asidifikasyonu ile tetiklenir.
Aktarildiginda, toksinin hafif zincir endopeptidazi intraselüler vezikülden sitozole salinir; burada, bu nörotransmitter salim aparatinin çekirdek bilesenleri olarak bilinen üç proteinin birini (vezikül-iliskili membran proteini (VAMP)/sinapt0brevin, 25 kDa'luk sinaptozomal-iliskili protein (SNAP-25) ve Syntaxin) spesifik olarak hedef alir. Bu çekirdek bilesenler sinaptik vezikül kenetlenmesi ve sinir ucunda füzyon için gereklidir ve çözünebilen N- etilmaleimid-duyarli faktör-eklenme proteini-reseptörü (SNARE) familyasinin üyelerini olusturur. BoNT/A ve BoNT/E, sirasiyla bir dokuz veya yirmi alti amino asitlik segment salarak karboksil-ucu bölgesinde SNAP-25'i yarar ve BoNT/Cl ayrica, SNAP25'i karboksil-ucundan da yarar. Botulinum serotipleri BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F ve BoNT/G ve tetanos toksini, VAMP'nin korunmus merkezi kismi üzerine etki eder ve VAMP'nin amino-ucu kismini sitozol içine salar.
BoNT/Cl, sintaksini sitozolik plazma membrani yüzeyinin yakininda bir tek yerden yarar. Sinaptik SNARE'lerin selektif proteolizi, C. botulinum toksinlerinden kaynaklanan in vi'vo nörotransmitter salimi blokuna katki saglar. C. botulinum toksinlerinin SNARE proteini hedefleri, çesitli nöronal-olmayan tiplerde ekzositoz için ortaktir; nöronlarda oldugu gibi, bu hücrelerde hafif zincir peptidaz aktivitesi ekzositozu inhibe eder, bakiniz, örnegin, Yann Humeau et al., 01761-P-0002 How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(l 1) Trends Mevcut bulusun botulinum nörotoksini, bir modifiye edilmis reseptör baglama alani içerir. Modifiye edilmis reseptör baglama alani, tipik olarak bir veya birden fazla C. botulinum toksini suslari tarafindan baglanan ve yararlanilan bir veya birden fazla insan reseptörünü anlamli bir sekilde güçlendirilmis baglama gösterir.
Spesifik modifiye edilmis reseptör baglama alanlarinin örnekleri, burada saglanir.
Burada tarif edilen izole edilmis modifiye edilmis reseptör baglama alani da, bunun bunlar tarafindan sifrelendigi izole edilmis nükleik asit molekülünün oldugu gibi, mevcut bulus tarafindan kapsanir.
Mevcut bulusun botulinum nörotoksini ayrica, teknikte bir hafif zincir varyanti olarak da ifade edilen bir proteaz alani da içerir. Hafif zincir varyanti, bir dogal olusumlu hafif zincir varyanti, mesela, örnegin, C. botulinum toksini hafif zincir izoformlari ve C. botulinum toksini hafif zincir alt-tipleri veya bir dogal olusumlu olmayan C. botulinum toksini hafif zincir varyanti, mesela, örnegin, konservatif sübstitüsyon C. botulinum toksini hafif zincir varyantlari, olabilir.
Mevcut bulusun botulinum nörotoksini ayrica, bir toksin translokasyon alani (HN) da içerir.
Burada tarif edilen çesitli alanlar (örnegin, HN, Hc veya proteaz alani), sinirlandirma olmaksizin, dogal olusumlu varyantlari, mesela, örnegin, izoformlari ve alt-tipleri; dogal olusumlu olmayan varyantlari, mesela, örnegin, konservatif sübstitüsyon mutasyonlarini, içerir. Dogal olusumlu olmayan varyantlar, (örnegin, Tablo 1'den veya Sekiller 10-16'dan) referans dizilerin karsilik gelen bölgesinden en az bir amino asit degisimine sahip olan bir alani 01761-P-0002 ifade eder ve bu referans dizinin karsilik gelen bölgesine özdeslik yüzdesi cinsinden tarif edilebilir.
Teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan, C. botuli'num toksininin her bir serotipi içinde, bunlarin amino asit dizisi açisindan ve ayrica bu proteinleri sifreleyen nükleik asitler açisindan bir dereceye kadar farklilik gösteren dogal olusumlu C. botulinum alani varyantlari olabildigini fark eder. Mevcut bulusun BoNT'sinin üretilmesinde kullanilmasi için tasarlanan bir dogal olusumlu C. botuli'num toksini alani (örnegin, hafif zincir, HN veya Hc) varyanti, dogal olusumlu C. botulinum alani varyantinin buna dayandirildigi referans C. botuli'num toksini alani ile kayda deger ölçüde ayni sekilde islev gösterebilir ve mevcut bulusun herhangi bir yönünde referans C. hotuli'num toksini alani için sübstüte edilebilir.
Bir dogal olusumlu C. botulinum toksini alani varyantinin bir sinirlayici-olmayan örnegi, bir C. botulinum toksini alani izoformudur, mesela, örnegin, bir BoNT/A alani izoformudur, bir BoNT/B alani izoformudur, bir BoNT/Cl alani izoformudur, bir BONT/D alani izofonnudur, bir BoNT/E alani izoformudur, bir BoNT/F alani izoformudur ve bir BoNT/G alani izofonnudur. Bir C. botuli'num toksini alani izoformu, C. botulinum toksini alani izoformunun buna dayandirildigi referans C. botulinum toksini alani ile kayda deger ölçüde ayni sekilde islev gösterebilir ve mevcut bulusun herhangi bir yönünde referans C. botulinum toksini alani için sübstüte edilebilir.
Bir dogal olusumlu C. botulmum toksini alani varyantinin bir baska sinirlayici- olmayan örnegi, bir C. botulinum toksini alani alt-tipidir, mesela, örnegin, BoNT/Al, BoNT/A2,BONT/A3, BONT/A4, BoNT/AS alt-tipinden elde edilen bir alandir; BoNT/Bl, BoNT/BZ, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/BS, B0NT/B6, BoNT/B7 alt-tipinden elde edilen bir alandir; BoNT/Cl-l, BONT/C1-2, BoNT/D- C alt-tipinden elde edilen bir alandir; BoNT/El, BoNT/EZ, B0NT/E3, BoNT/E4, BONT/ES, BONT/E6, BONT/E7, BoNT/ES alt-tipinden elde edilen bir alandir ve 01761-P-0002 tipinden elde edilen bir alandir. Bir C. botulinum toksini alani alt-tipi, C. botuli'num toksini alani alt-tipinin buna dayandirildigi referans C. botuli'num toksini alani ile kayda deger ölçüde ayni sekilde islev gösterebilir ve mevcut bulusun herhangi bir yönünde referans C. botulinum toksini alani için sübstüte edilebilir.
Burada kullanildigi sekliyle, "dogal olusumlu olmayan varyant" terimi (örnegin, C. botulmum toksini hafif zincir varyanti, HC ve HN), insan manipülasyonu yardimi ile üretilen, sinirlandirma olmaksizin, rastgele mutajenez veya akla yatkin tasarim kullanilan genetik mühendisligi ile üretilen alanlari ve kimyasal sentez ile üretilen C. botulinum alanlarini içeren bir C. botulinum alani anlamina gelir.
Dogal olusumlu olmayan C. botuli'num alani varyantlarinin sinirlayici-olmayan örnekleri, örnegin, konservatif C. botuli'num alani varyantlarini içerir. Burada kullanildigi sekliyle, "konservatif C. botulinum alani varyanti" terimi, bir baska amino asit ile sübstüte edilmis en az bir amino aside veya referans C. botuli'num alani dizisinden elde edilen orijinal amino asidinkine benzeyen en az bir özellige sahip olan bir amino asit analoguna sahip olan bir C. botuli'num alani anlamina gelir (örnegin, Tablo 1 ve Sekiller 10-16). Varyant, referans alan dizisine kiyasla bir, iki, üç, dört, bes veya daha fazla konservatif amino asit sübstitüsyonuna sahip olabilir. Özelliklerin örnekleri, sinirlandirma olmaksizin, benzer boyutu, topografyayi, yükü, hidrofobisiteyi, hidrofilisiteyi, lipofilisiteyi, kovalent-baglama kapasitesini, hidrojen-baglama kapasitesini, bir fiziko-kimyasal özelligi, bunlarin benzerlerini veya herhangi bir kombinasyonunu, içerir. Bir konservatif C. botulinum alani varyanti, konservatif C, botu/Mum toksini alani varyantinin buna dayandirildigi referans C. botuli'num toksini alani ile kayda deger ölçüde ayni sekilde islev gösterebilir ve mevcut bulusun herhangi bir yönünde referans C. botulinum toksini alani için sübstüte edilebilir.
Bir dogal olusumlu olmayan C. botulinum toksini alani varyanti, dogal olusumlu C. botulinum toksini alaninin buna dayandirildigi referans C botulinum toksini alanindan bir veya birden fazla (örnegin, bir, iki, üç, dört, bes veya daha fazla) 01761-P-0002 amino asidi sübstüte edebilir. Bir dogal olusumlu olmayan C. botulinum toksini alani varyanti ayrica, dogal olusumlu C. botulinum alani varyantinin buna dayandirildigi referans C. botulinum toksini alanina %95'lik veya daha fazla (örnegin, %96'lik, %97'1ik, %98'lik veya %99'luk) amino asit özdesligine de sahip olabilir. Çesitli dogal olusumlu olmayan C. botulinum nörotoksinleri veya bunlarin Uluslararasi Patent Yayinlari'nda tarif edilir.
Burada tarif edilen C. botulinum nörotoksini veya bunun spesifik alani tipik olarak, dogal olusumlu ainino asit rezidüleri içerecektir, ancak bazi durumlarda dogal olusumlu olmayan amino asit rezidüleri de bulunabilir. Bundan dolayi, özel bir amino asidin veya peptidin yapisini taklit ede amino asit-olmayan kimyasal yapilar içerebilen "peptit mimetikleri" ve "peptit analoglari" denilen yapilar da kullanilabilir. Bu tarz mimetikler veya analoglar genel olarak, bunlarin dogal peptit karsiliklarinda bulunan benzer fiziksel karakteristikler, örnegin, boyut, yük veya hidrofobisite ve uygun uzaysal oryantasyon, gösterdigi seklinde karakterize edilir. Bir peptit mimetigi bilesiginin spesifik bir örnegi, amino asitlerin bir veya birden fazlasi arasindaki amid baginin, teknikte iyi bilindigi üzere, bir karbon- karbon bagi veya baska amid-olmayan bag, ile degistirildigi bir bilesiktir (bakiniz, örnegin, Sawyer, in Peptide Based Drug Design, pp. 378-422, ACS, Washington DC 1995).
Bulusun bir yönünde, mevcut bulusun botulinum nörotoksini (BoNT), C. botulinum serotipi B'nin bir modifiye edilmis reseptör baglama alanini (BoNT/B- Hc) içerir. Modifiye edilmis BoNT/B-Hc, insan Syt I reseptörünü ve/veya insan Syt II reseptörünü anlamli bir sekilde güçlendirilmis baglamaya yol açan bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içerir. Bir uygulamada, BoNT/B-Hc, BoNT/Bl'den elde edilir (GenBankasi Erisim No.: AB232927.1). Mevcut bulusta referans sablon olarak kullanilan BoNT/Bl-HcOkra susunun amino asit dizisi 01761-P-0002 Sekil 8`de gösterilir. Burada tarif edilen Bl'de belirtilmis pozisyona (pozisyonlara) karsilik gelen amino asitlerin sübstitüsyonu ile diger suslardan B-Hc üretilmesi de tasarlanir. Burada tarif edilen bir izole edilmis, saflastirilmis modifiye edilmis reseptör baglama alani polipeptidi de bulusta kapsanir. Mevcut bulus ayrica, burada tarif edilen bir modifiye edilmis reseptör baglama alani içeren bir polipeptidi de kapsar. Bulus ayrica, bu tarz bir polipeptidi sifreleyen bir nükleik asit molekülünü de kapsar. Bir uygulamada, modifiye edilmis reseptör baglama alani, (örnegin, BoNT/Bl'den elde edilen) BoNT/B-Hc'dir.
BoNT/B-Hc proteini dizisinin modifikasyonu, Syt I/II baglamasi için bilinen bölge içinde her bir amino asit rezidüsünün hedeflenmis mutajenezi (yere- yönlendirilmis mutajanezi) veya rastgele mutajenezi ile gerçeklestirilebilir. Bu Syt baglama bölgeleri, fare veya siçan Syt reseptörleri l,29,363l,32 ile ilgili önceki çalismalar ile iyi tanimlanmistir ancak BoNT/B-Hc ve insan Syt reseptörleri arasindaki etkilesimler için açik bir sekilde belirlenmemistir. BoNT/B'nin farkli alt-tipleri, Bl-Hc için burada tarif edilen karsilik gelen mutasyonlari üretme ile ayni veya benzer mutasyonlari olusturmak için sablon olarak kullanilabilir.
Mutasyona ugratilmasi için seçilen rezidüler için karsilik gelen pozisyonlar, B1 alt-tipi ile dizi hizalamasi ile kolaylikla belirlenebilir. Elde edilen polipeptit ürünleri, söz konusu ürünleri içeren polipeptitlerin ve söz konusu polipeptitleri ve ürünleri sifreleyen nükleik asit moleküllerinin oldugu gibi, mevcut bulus tarafindan kapsanir.
Modifiye edilmis reseptör baglama alani üretmek için amino asit dizisi modifikasyonlari, bir farkli amino aside bir tek rezidünün mutasyonu (tek yer sübstitüsyonu), ayni yerde çok sayida rezidünün mutasyonu (çok sayida yer sübstitüsyonu), bir veya birden fazla rezidünün silinmesi (silinme) ve bir veya birden fazla rezidünün içeri yerlestirilmesi (içeri yerlestirme) ayni zamanda bunlarin kombinasyonlari olabilir. Proteinleri mutasyona ugratmak için yöntemler (örnegin, BoNT/B-Hc dizisini sifreleyen DNA üzerinde hedeIlenmis tek yer veya çok sayida yer sübstitüsyonu) teknikte iyi-bilinir. 01761-P-0002 Burada tarif edildigi üzere, BoNT/B-Hc içinde, BoNT/B reseptörü baglama alani konusunda önceki literatüre29 ve bildirilmis BoNT/B-Syt II yapisina (PDB ID: 2NM1)31*32 dayanarak, kemirgen Syt ll'sine veya etrafindaki bölgelere temas eden bir veya birden fazla rezidü modifiye edilebilir. Bunlar, sinirlandiima olmaksizin, pozisyonuna karsilik gelen pozisyonlari içerir. Bu rezidülerin biri veya birden fazlasi, bir hidrofobik amino aside (örnegin, V, 1, L, M, F, W, C) modifiye edilebilir. Bu rezidülerin biri veya birden fazlasi, daha az hidrofobi bir amino aside (örnegin, A, Y, H, T, 8, P, Q, N ve G) modifiye edilebilir. Burada bahsedilen çesitli amino asitlerin herhangi bir çesidine, sinirlandirma olmaksizin, iki veya daha fazla bahsedilen pozisyonun mutasyonlarini, içeren çesitli modifikasyonlarin kombinasyonlari da tasarlanir.
BoNT/B-Hc, WT BoNT/B-Hc'ye kiyasla insan Syt ll'sini baglamayi güçlendiren pozisyonlarina karsilik gelen pozisyonlarda) bir veya birden fazla sübstitüsyon Y1181M, A1196Y'sine veya bunlarin kombinasyonlarina karsilik gelen bir veya birden fazla mutasyon içerebilir (Sekil 3A, B). Uygun bir sekilde, mutasyonlar biri veya birden fazlasi arasindan seçilen mutasyonlar yararli olabilir. Daha özel olarak, bunlar h-Syt II'yi baglamak için en güçlü güçlendirmeyi gösterdiginden, B1'in E1191M veya E1191Q pozisyonuna karsilik gelen mutasyon tasarlanir.
B1'in E1191M veya E1191Q'suna karsilik gelen mutasyonlar da, WT BoNT/B- Hc'ye kiyasla BoNT/B-Hc'nin insan Syt l'ini baglamasini anlamli bir sekilde güçlendirmistir (Sekil 4A). Bir uygulamada, BoNT/B-Hc iki sübstitüsyon mutasyonuna sahiptir. 01761-P-0002 Çok sayida yer sübstitüsyonlari da, bu tanimlanmis kilit rezidülerdeki mutasyonlari birlestirme ile üretilebilir. Bu tarz çok sayida yer sübstitüsyonu mutantlari, insan Syt I'ini ve h-Syt Il'yi ilaveten güçlendirilmis baglamaya sahiptir (Sekil 5). Sinirlayici-olmayan bir örnek olarak, iki tek yer sübstitüsyonunu, 81199F'si ile birlestiren mutasyonlar hem insan Syt I'ine veya h-Syt Il'ye anlamli bir sekilde güçlendirilmis baglama göstermistir (Sekil 5). Yalnizca 1199 pozisyonunda mutasyonlar ile basarilan baglama aktivitesinde görece ilimli güçlendirme veren baglama gücündeki güçlendirme sasirticidir.
Burada tarif edildigi üzere, bu insan Syt Il'sini güçlendirilmis baglamasi olan bir sübstitüsyonu tasarlanir. Bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla Bl'in E] 191, S] 199, pozisyonlarda ilave kombinasyon sübstitüsyonlari, insan Syt Il'sini güçlendirilmis baglamasi olan BoNT/B-Hc mutantlari üretir.
Bu dogrultuda, bulus WT BoNT/B-Hdnin dizisine göre modifiye edilmis amino asit dizisi olan BoNT/B-Hc içeren polipeptitleri kapsar, burada modifiye edilmis BoNT/B-Hc, WT BoNT/B-Hc'ye kiyasla insan Syt 1'ini ve Il'sini anlamli sekilde güçlendirilmis baglamaya sahiptir. Bulus ilaveten, bu tarz polipeptitleri sifreleyen nükleik asit moleküllerini kapsar. Modifiye edilinis BoNT/B-Hc mutantlari Bl'in gelen amino asit rezidülerinin birinde veya kombinasyonlarinda amino asit sübstitüsyonlari içerebilir. Bu modifikasyonlar, B1*in Sl 199L, Sl 199Y veya mutasyonlar içerebilir.
Insanlarda terapötik uygulamalar için yukarida tarif edildigi üzere B-Hc'de ayni amino asit sübstitüsyonlari içeren mutant tam-boy BoNT/B de tarif edilir. Tam- 01761-P-0002 Y1183 ve A1 196 pozisyonuna karsilik gelen amino asit rezidülerinin birinde veya kombinasyonlarmda ainino asit sübstitüsyonlari içerebilir. Modifikasyonlar, içerebilir. Mutasyonlar. sablonlar olarak BoNT/B alt-tiplerinin herhangi biri kullanilarak, BoNT/B-Hc için yukarida açiklanan ile ayni sekilde yapilabilir. Bu mutant BoNT/B toksinleri, hem insan Syt II'si hem de insan Syt I'i için anlamli bir sekilde güçlendirilmis baglamaya sahiptir, böylelikle WT BoNT/B'ye kiyasla insan nöronlarini hedef almak için daha yüksek etkinlik ve özgüllük saglayacaktir.
Toksin difüzyonu ve nötralizasyon antikorlarinin üretilmesi, BoNT/B ile sinirlandirilmaz, ancak ayrica BoNT/A için de gözlenir; bu, BoNT/A'nin bunun reseptörü SV2'yi baglama afinitesinin de iyilestirilmesi gerektigini gösterir. Syt l/ll'yi BoNT/B baglamasi SV2 l4,20,26,27`yi BoNT/A baglamasina kiyasla çok daha yüksek afiniteye sahip oldugundan, insan Syt ll'sini baglama yetisi olan bir moditiye edilmis BoNT/B reseptörü baglama alani (BoNT/B-Hc) ayrica, WT BoNT/A'ya kiyasla insan nöronlari için daha büyük etkinligi ve özgüllügü olan bir modifiye edilmis kimerik BoNT/A üretmek amaciyla BoNT/A-HC'yi degistirmek Yukarida tarif edilen modifiye edilmis BoNT/B-Hc'den tüm diger BoNT'lerin Hc'sini degistirmek için yararlanilabilecegi ilaveten tasarlanir. Her bir BoNT'nin HC bölgesi iyi tanimlanmistir ve bunlarin degistirilmesi, teknikte iyi-belirlenmis, BoNT/B-Hc'yi sifreleyen DNA'nin diger BoNT'lerin HN/Lc'si ile standart PCR füzyonu vasitasiyla gerçeklestirilebilir. Buna ek olarak, her bir BoNT'de protein reseptörleri ve gangliyositler için baglama yerini içeren bölge olan, (Hcc olarak gösterilen) BoNT/B-Hc'nin C-ucu parçasi kullanilarak da gerçeklestirilebilir. Elde edilen kimerik toksinler, insan Syt I/II'sini baglama vasitasiyla insan nöronlarini hedef alma yetisine sahip olacaktir. Sinirlayici-olmayan bir örnek olarak, modifiye edilmis BoNT/B-Hc BoNT/A'nin Hc'sini degistirmek için kullanilabilir.
Elde edilen polipeptitler, mevcut bulus tarafindan kapsanir. Bu kimerik toksinler, 01761-P-0002 WT BoNT/A'ya kiyasla insan nöronlarini hedef alan daha yüksek bir etkinlige ve özgüllüge sahip olacaktir. Bu tarz bir kimerik BoNT/A toksini, insanlarda terapötik uygulamalar için kullanilabilir ve WT BoNT/A'ya kiyasla anlamli iyilestirmeler sunar.
Bulusun bir baska yönü, burada tarif edilen polipeptitleri sifreleyen bir nükleotid dizisi içeren bir izole edilmis nükleik asit molekülü (örnegin, burada tarif edilen modifiye edilmis reseptör baglama alani veya modifiye edilmis reseptör baglama alani içeren botulinum nörotoksini) ile ilgilidir. Nükleik asit molekülü Sekil 9'da gösterilen nükleik asit dizisini içerebilir. Bu tarz nükleik asit molekülleri, rekombinant DNA teknikleri ile üretilebilir.
Bulusun bir baska yönü, burada tarif edilen nükleik asit molekülü içeren bir nükleik asit vektörü ile ilgilidir. Vektör, bir ekspresyon vektörü olabilir. Bu tarz bir ekspresyon vektörü, burada bir ekspresyon yapisi olarak ifade edilir ve bir hücre veya hücresiz ekstrakt içinde nükleik asit molekülünü eksprese etmek için yararli olan ekspresyon vektörüne operatif olarak bagli olan burada açiklanan bir nükleik asit molekülünü içerir. Sinirlandirma olmaksizin, bir viral ekspresyon vektörünü; bir prokaryotik ekspresyon vektörünü, ökaryotik ekspresyon vektörlerini, mesela, örnegin, bir maya ekspresyon vektörünüa bir böcek ekspresyon vektörünü ve bir memeli ekspresyon vektörünü ve hücresiz ekstrakt ekspresyon vektörünü içeren, çok çesitli ekspresyon vektörleri, mevcut bulusun bir C. bolulinum nörotoksinini sifreleyen bir nükleik asit molekülünü eksprese etmek için kullanilabilir. Bu yöntemlerin yönlerini tatbik etmek için yararli olan ekspresyon vektörlerinin bir konstitütif, doku-spesifik, hücre-spesifik veya indüklenebilir promotör elemaninin, hizlandirici elemanin veya her ikisinin kontrolü altinda C. botulinum nörotoksini eksprese edenleri içerebildigi ilaveten anlasilir. Bu tarz ekspresyon vektörlerinden bir ekspresyon yapisi yapmak ve kullanmak için iyi-belirlenmis reaktifler ve kosullar ile birlikte, ekspresyon vektörlerinin sinirlayici-olmayan örneklerine, sinirlandirma olmaksizin, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, Calif; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, 01761-P-0002 Calif.; Invitrogen, Inc, Carlsbad, Calif.; EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wis.; QIAGEN, Inc., Valencia, Calif. ve Stratagene, La Jolla, Calif, kaynaklarini içeren ticari saglayicilarindan kolaylikla erisilebilir. Uygun bir ekspresyon vektörünün seleksiyonu, yapilmasi ve kullanilmasi, teknikte uzmanligi olan bir kisinin kapsami içinde olan ve buradaki ögretilerden elde edilen rutin prosedürlerdir.
Bulusun bir baska yönü, burada tarif edilen nükleik asit molekülü veya ekspresyon yapisi içeren bir hücre ile ilgilidir. Hücre, nükleik asidin çogaltilmasi için nükleik asidin ekspresyonu için veya her ikisi için olabilir. Bu tarz hücreler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, sinirlandirma olmaksizin aerobik, mikroaerofilik, kapnofilik, fakültatif, anaerobik, gram-negatif ve gram-pozitif bakteriyel hücre suslarini, mesela, örnegin, Escherz'chi'a coli, Baci'llus subti'lis, Baci'llus li'chengfbrmis, Bacteroi'des fragili's, Closîridia perfri'ngens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lacti's, Methylobacterium extorquens, Nei'sseri'a meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens ve Salmonella typhi'murium'dan türetilenleri içeren prokaryotik hücreleri ve sinirlandirma olmaksizin, maya suslarini, mesela, örnegin, Pichia pastori's, Pichi'a methanolica, Pichi'a angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisi'ae ve Yarrowi'a lipolytica'dan türetilenleri; böcek hücrelerini ve böceklerinden türetilen hücre hatlarini, mesela, örnegin, Spodoptera jirugiperda, T richoplusi'a m', Drosophi'la melanogaster ve Manduca sexta'dan türetilenleri ve memeli hücrelerini ve memeli hücrelerinden türetilen hücre hatlarini, mesela, örnegin, fareden, siçandan, hamsterdan, domuzdan, sigir cinsinden, attan, primattan ve insandan türetilenleri içeren ökaryotik hücreleri içerir. Hücre hatlari, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan, Avrupa Hücre Kültürleri Koleksiyonu'ndan ve Alman Mikroorganizmalar ve Hücre kültürleri Koleksiyonu'ndan elde edilebilir. Uygun bir hücre hatti seçmek, yapmak ve kullanmak için spesifik protokollerin sinirlayici-olmayan örnekleri, örnegin, Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND 01761-P-0002 APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al., eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al., eds., John Wiley and Sons, 1998); R. lan Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4.sup.th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3.sup.rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2.sup.nd ed. 2002) ve CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, (2004), kaynaklarinda tarif edilir. Bu protokoller, teknikte uzmanligi olan bir kisinin kapsami içinde olan ve buradaki ögretilerden elde edilen rutin prosedürlerdir.
Burada tarif edilen modifiye edilmis BoNT/B-Hc'den insanlarda nöronlari hedef almak için bir araç olarak yararlanilabilecegi de tasarlanir. Örnegin, modifiye edilmis BoNT/B-Hc, kovalent bir sekilde veya kovalent olmayan bir sekilde, diger terapötik ajanlara baglanabilir ve terapötik ajanlari insan Syt I/Il'sini baglama ile insanlarda nöronlara aktarmak için hedefleme vehikülü olarak etki eder.
Böylelikle, bir ikinci kisma bagli olan, C. botulinum serotipi B'nin bir modifiye edilmis reseptör baglama alani olan bir birinci kismi içeren, insan Syt 1 reseptörünü ve/veya insan Syt 11 reseptörünü anlamli bir sekilde güçlendirilmis baglamaya yol açan bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içeren, bir kimerik polipeptit molekülü de burada tarif edilir. Molekülün ikinci kismi, bir biyo-aktif molekül, örnegin, bir terapötik ajan (örnegin, bir polipeptit veya ilaç) olabilir. Molekülün birinci ve ikinci kisimlarinin baglantisi, kovalent olabilir (örnegin, bir füzyon proteini formunda) veya kovalent olmayabilir. Bu tarz baglanti yöntemleri teknikte iyi bilinir ve uzmanligi olan uygulayici tarafindan kolaylikla uygulanabilir. 01761-P-0002 Mevcut bulusun bir baska yönü, C. botulinum nörotoksini veya burada tarif edilen kimerik molekül içeren bir farmasötik bilesim ile ilgilidir. Bir uygulamada, burada tarif edilen polipeptit, bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici içeren bir bilesim içinde bir etken maddedir (burada bir farmasötik bilesim olarak ifade edilir). Bir "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici", hedeflenmis aktarim bilesimini karistirmak ve/veya bir süjeye aktarmak için herhangi bir farmasötik olarak kabul edilebilir araç anlamina gelir. Burada kullanildigi sekliyle, bir organindan veya parçasindan, vücudun bir baska organina veya parçasina tasimaya veya nakletmeye dâhil edilen bir farmasötik olarak kabul edilebilir malzeme, bilesim veya vehikül, örnegin, bir sivi veya kati dolgu, diluent, eksipiyan, çözücü veya enkapsüle etme malzemesi, anlamina gelir. Her bir tasiyicinin, bilesimin diger içerik maddeleri ile uyumlu olma anlaminda "kabul edilebilir" olmasi gerekir ve her bir tasiyici bir süjeye, örnegin, bir insana, uygulama ile uyumludur. Bu tarz bilesimler, çok sayida yolun, örnegin, burada tarif edilen uygulama yollarinin, biri veya birden fazlasi vasitasiyla uygulama için spesifik olarak formüle edilebilir. Takviye etken maddeler de bilesimlere katilabilir. Burada tarif edilen bir ajan, formülasyon veya farmasötik bilesim bir süjeye uygulanir, tercihen bir terapötik olarak etkili miktar uygulanir. Burada kullanildigi sekliyle, "terapötik olarak etkili miktar" terimi, rahatsizligin bir iyilestirilmesi veya sagaltilmasi ile sonuçlanan bir miktari ifade eder. Farmasötik bilesim, enjeksiyon ile uygulama için formüle edilebilir. Farmasötik bilesim, mikro-küreler içinde enkapsüle edilmis botulinum nörotoksini içerebilir.
Farmasötik bilesim, yavas salim için formüle edilmis botulinum nörotoksini içerebilir.
Botulinum nörotoksini, polipeptidi veya kimerik molekülü, bir kontrollü salim formülü formunda olabilir. uygulama için bu tarz bilesimler ve yöntemler, U.S. 01761-P-0002 Botulinum nörotoksini, bilinen prosedürlere uygun sekilde bir fermentör içinde Clostridi'um botulinum kültürlerini olusturma ve büyütme ve akabinde fermente edilmis karisimi hasat etme ve satlastirma ile elde edilebilir. Tüm botulinum toksini serotipleri baslangiçta, nöro-aktit` hâle gelmesi için proteazlar ile yarilmasi veya çektik atilmasi gereken inaktif tek Zincirli proteinler olarak sentezlenir.
Botulinum toksini serotipleri A ve G yapan bakteriyel suslar, endojen proteazlara sahiptir ve bundan dolayi serotipler A ve G agirlikli olarak bunlarin aktif formunda bakteriyel kültürlerden geri-kazanilabilir. Aksine, botulinum toksini serotipleri C1, D ve E, proteolitik-olmayan suslar tarafindan sentezlenir ve bundan dolayi tipik olarak, kültürden geri-kazanildiginda aktive-edilmemis hâldedir.
Serotipler B ve F, hem proteolitik hem de proteolitik-olmayan suslar tarafindan üretilir ve bundan dolayi aktif veya inaktif formda geri-kazanilabilir. Örnegin, botulinum toksini tip B serotipi üreten proteolitik suslar yalnizca, üretilen toksinin bir parçasini yarabilir. Çektik atilmis moleküllerin çentik atilmamis moleküllere tam orani, inkübasyonun uzunluguna ve kültürün sicakligina baglidir. Bundan dolayi, örnegin, botulinum toksini tip B toksininin bir preparasyonunun belirli bir yüzdesi inaktif olabilir. Nörotoksin bir aktif hâlde olabilir. Nörotoksin bir inaktif hâlde olabilir. Aktif ve inaktif nörotoksinin bir kombinasyonu da tasarlanir.
Mevcut bulusta, burada tarif edilen farmasötik bilesimi içeren bir kit de kapsanir.
Kit ilaveten, bilesimin terapötik uygulamasi için bir aktarim araci veya cihazi ve/Veya terapötik uygulama için talimatlar içerebilir.
Burada tarif edilen farmasötik bilesimlerin uygulanmasi için, (örnegin, tek kullanim için) farmasötik bilesim ile önceden-doldurulmus, bir aktarim araci veya cihazi da tarif edilir. Bu tarz cihazlar, bilesimlerin aktarimi için bir siringa veya bir mikro-igne cihazi olabilir. Siringa, bilesimin etkili bir miktari ile Önceden- doldurulmus bir tek kullanimlik siringa olabilir. Mikro-igne cihazi, burada tarif edilen bilesim ile kapli bir veya birden fazla mikro-igne içerebilir, örnegin, U.S. 01761-P-0002 Tedavi Yöntemleri Tipik olarak bir nörotoksin ile tedavi edilen bir rahatsizligi (örnegin, iskelet kasi rahatsizliklarini, düz kas rahatsizliklarini, glandüler rahatsizliklari, bir nöro- müsküler bozuklugu, bir otonomik bozuklugu, agriyi veya bir estetik/kozmetik rahatsizligi) tedavi etmek için yöntemler tarif edilir. Bu tarz rahatsizliklar, uzmanligi olan uygulayici tarafindan belirlendigi üzere, istenmeyen nöronal aktivite ile iliskilidir. Yöntem, istenmeyen nöronal aktiviteyi azaltmak, böylece rahatsizligi tedavi etmek için, burada tarif edilen (örnegin, bir botulinum nörotoksini (BoNT) veya bir kimerik molekül içeren) bir farmasötik bilesimin bir terapötik olarak etkili miktarini memelide uygun lokasyona uygulama adimini içerir. Uygulama, bilesimin etkili bir miktarini istenmeyen aktivite gösteren nöronlara temas ettiren bir yol iledir.
Burada tartisilan yöntemler ile tedavi için öngörülen spesifik rahatsizliklar, sinirlandirma olmaksizin, spazmodik disfoniyi, spazmodik tortikollisi, larinjeyal distoniyi, oromandibüler disfoniyi, lingual distoniyi, servikal distoniyi, fokal el distonisini, blefarospazmi, strabismusu, hemifasiyal spazmi, göz kapagi bozuklugunu, serebral palsiyi, fokal spastisiteyi ve diger ses bozukluklarini, spazmodik koliti, nörojenik mesaneyi, anisinusu, uzuv spastisitesini, tikleri, tremorlari, bruksizmi, anal fissürü, akalazyayi, disfajiyi ve diger kas tonu bozukluklarini ve kas gruplarinin istemsiz hareketleri ile karakterize edilen diger bozukluklari, lakrimasyonu, hiperhidrozu, asiri tükürük salgilamayi, asiri gastrointestinal salgilari ayni zamanda diger sekretuvar bozukluklari, kas spazmlarindan kaynaklanan agriyi, bas agrisini içerir. Buna ek olarak, yöntemler, dermatolojik veya estetik/kozmetik rahatsizliklari tedavi etmek, örnegin, alin kirisikliklarimn azaltilmasi, Cilt kirisikliklarinin azaltilmasi, için kullanilabilir.
Yöntemler ayrica. spor yaralanmalarinin tedavisinde de kullanilabilir.
Borodic U.S. Pat. No. 5,053,005, botulinum tip A kullanilarak jüvenil omurga egriligini, yani, skolyozu, tedavi etmek için yöntemleri açiklar. Borodic tarafindan 01761-P-0002 açiklanana büyük ölçüde benzeyen yöntemler kullanilarak, bir modifiye edilmis nörotoksin omurga egriligini tedavi etinek için bir memeliye, tercihen bir insana, uygulanabilir. Uygun bir uygulamada, bir Iösin-bazli motif ile kaynastirilmis botulinum tip E içeren bir modifiye edilmis nörotoksin uygulanir. Hatta daha tercihen, bunun hafif zincirinin karboksil ucuna kaynastirilmis bir lösin-bazli motif tasiyan botulinum tip A-E içeren bir modifiye edilmis nörotoksin omurga egriligini tedavi etmek için memeliye, tercihen bir insana, uygulanir.
Buna ek olarak, modifiye edilmis nörotoksin botulinum tip A ile yaygin bir sekilde gerçeklestirilen iki bilinen teknikler kullanilarak diger nöro-müsküler bozukluklari tedavi etmek için uygulanabilir. Örnegin, modifiye edilmis nörotoksin agriyi, örnegin, bas agirini, kas spazmlarindan kaynaklanan agriyi ve enflamatuvar agrinin çesitli formlarini, tedavi etmek için kullanilabilir. Örnegin, etmek için botulinum toksini tip A'yi kullanmanin yöntemlerini açiklar.
Otonomik sinir sistemi bozukluklari ayrica, bir modifiye edilmis nörotoksin ile de tedavi edilebilir. Örnegin, glandüler fonksiyon bozuklugu bir otonomik sinir sistemi bozuklugudur. Glandüler fonksiyon bozuklugu, asiri terlemeyi ve asiri tükürük salgilamayi içerir. Respiratuvar fonksiyon bozuklugu, bir otonomik sinir sistemi bozuklugunun bir baska örnegidir. Respiratuvar fonksiyon bozuklugu, kronik obstrüktif pulmoner hastaligi ve astimi içerir. Sanders et al., dogal olusumlu botulinum toksinlerini kullanarak otonomik sinir sistemini tedavi etmek; örnegin, otonomik sinir sistemi bozukluklarini, örnegin, asiri terlemeyi, asiri tükürük salgilamayi, astimi, vb. tedavi etmek için, yöntemleri açiklar. Otonomik sinir sistemi bozukluklarini, örnegin, yukarida tartisilanlari, tedavi etmek için, Sanders vd.ne büyük ölçüde benzeyen, ancak bir modifiye edilmis nörotoksin kullanilan, yöntemler kullanilabilir. Örnegin, bir modifiye edilmis nörotoksin, otonomik sinir sisteminin nazal kavitede muköz salgilamayi kontrol eden kolinerjik nöronlarini dejenere etmek yeterli olan bir miktarda memelinin nazal kavitesine lokal olarak uygulanabilir. 01761-P-0002 Bir modifiye edilmis nörotoksin ile tedavi edilebilen agri, kas geriliminden veya spazmdan kaynaklanan agriyi veya kas spazmi ile iliskili olmayan agriyi içerir. Örnegin, U.S. Pat. No. 5,714,468”de Binder, vasküler bozukluklardan, inüsküler gerilimden, nöraljiden ve nöropatiden kaynaklanan bas agrisinin bir dogal olusumlu botulinuin toksini, örnegin, Botulinum tip A, ile tedavi edilebilecegini açiklar. Bas agrisini, özellikle vasküler bozukluklardan, müsküler gerilimden, nöraljiden ve nöropatiden kaynaklanani, tedavi etmek için Binder'inkine büyük ölçüde benzeyen, ancak bir modifiye edilmis nörotoksin kullanilan, yöntemler kullanilabilir. Müsküler spazmdan kaynaklanan agri da, bir modifiye edilmis nörotoksinin bir uygulamasi ile tedavi edilebilir. Örnegin, tercihen botulinum tip E hafif zincirinin karboksil ucunda bir lösin-bazli motif ile kaynastirilmis bir botulinum tip E agriyi hafifletmek için agri/spazm lokasyonuna intramüsküler olarak uygulanabilir.
Dahasi, bir modifiye edilmis nörotoksin bir müsküler bozukluk, örnegin, spazm, ile iliskili olmayan agriyi tedavi etmek için bir memeliye uygulanabilir. Spazm ile iliskili olmayan agriyi tedavi etmek için yöntemler, modifiye edilmis nörotoksinin santral uygulanmasini veya periferik uygulanmasini içerir. Örnegin, U.S. Pat. No. 5,989,5457te Foster et al., bir hedefleme kismi ile konjuge edilmis bir botulinum toksininin agriyi hafifletmek için santral olarak (intratekal olarak) uygulanabilecegini açiklar. Agriyi tedavi etmek için Foster Vd.ne büyük ölçüde benzeyen, ancak burada tarif edilen bilesimler kullanilan, yöntemler kullanilabilir. Tedavi edilecek olan agri, bir akut agri veya kronik agri olabilir.
Bir kas spazmi ile iliskili olmayan bir akut veya kronik agri ayrica, modifiye edilmis nörotoksinin memeli üzerindeki bir gerçek veya bir algilanmis agir lokasyonuna bir lokal, periferik uygulanmasi ile de hafifletilebilir. Modifiye edilmis nörotoksin, agrinin lokasyonuna veya yakinina, örnegin, bir kesige veya yakinina. subkütan olarak uygulanabilir. Modifiye edilmis nörotoksin, agrinin lokasyonuna veya yakinina, örnegin, memeli üzerindeki bir çürük lokasyonuna 01761-P-0002 veya yakinina, intramüsküler olarak uygulanabilir. Modifiye edilmis nörotoksin, artritik rahatsizliklardan kaynaklanan agriyi tedavi etmek veya hafifletmek için bir memelinin eklemine dogrudan enjekte edilebilir. Modifiye edilmis nörotoksinin bir periferik agri lokasyonuna sik tekrarli enjeksiyonu veya infüzyonu da tasarlanir.
Bu tarz yöntemler için uygulama yollari teknikte bilinir ve uzmanligi olan uygulayici tarafindan burada tarif edilen yöntemlere kolaylikla adapte edilebilir (örnegin, bakiniz, mesela, McGraW Hill tarafindan yayimlanmis, Anthony Fauci et al., 14.sup.th edition, tarafindan düzeltilmis, Harrison's Principles of Internal Medicine (1998)). Sinirlayici-olmayan örnek olarak, bir nöro-müsküler bozuklugun tedavisi, molekülün etkili bir miktarini bir kasa veya bir kaslar grubuna lokal olarak uygulamanin bir adimini içerebilir, bir otonomik bozuklugun tedavisi, molekülün etkili bir miktarini bir beze veya bezlere lokal olarak uygulamanin bir adimini içerebilir ve agrinin tedavisi, inolekülün etkili bir miktarini agri yerine uygulamanin bir adimini içerebilir. Buna ek olarak, agrinin tedavisi, bir modifiye edilmis nörotoksinin etkili bir miktarini omurilige uygulamanin bir adimini içerebilir.
Burada ve asagidaki örneklerde tarif edilen uygulamalar yalnizca açiklayici amaçlar tasir ve teknikte uzmanligi olan kisiler için asikâr olan çesitli modifikasyonlar veya degisimler bulusun kapsamina dâhil edilir.
Burada aksi tanimlanmadikça, mevcut basvuru ile baglantili olarak kullanilan bilimsel ve teknik terimler teknikte normal uzmanligi olan kisiler tarafindan yaygin olarak anlasilan anlamlara sahip olmalidir. ilaveten, baglam tarafindan aksi gerektirilmedikçe, tekil terimler çogullari içermelidir ve çogul terimler tekilleri içermelidir.
Bu bulusun burada tarif edilen özel metodoloji, protokol ve reaktifler, vb. ile sinirlandirilmadigi ve bundan dolayi çesitlilik gösterebilecegi anlasilmalidir. 01761-P-0002 Burada kullanilan terminoloji, yalnizca özel uygulamalari tarif etme amaci tasir ve sadece istemler ile tanimlanan mevcut bulusun kapsamini sinirlandirmasi amaçlanmaz.
Isletim örneklerinde veya baska türlü gösterildigi yerler disinda, burada kullanilan içerik maddelerinin miktarlarini veya reaksiyon kosullarini ifade eden tüm sayilar, tüm durumlarda "yaklasik" terimi ile modifiye edildigi sekilde anlasilmalidir.
Yüzdeler ile baglantili olarak mevcut bulusu tarif etmek için kullanildiginda Bir yönünde, mevcut bulus, bulus için esansiyel oldugu üzere, burada tarif edilen bilesimler, yöntemler ve bunlarin ilgili bileseni (bilesenleri) ile ilgilidir, yine de esansiyel olan veya olmayan, belirtilmemis elemanlarin dâhil edilmesine açiktir ("içeren"). Bazi uygulamalarda, bilesiinin, yöntemin veya bunun ilgili bileseninin açiklamasina dâhil edilecek olan diger elemanlar, bulusun temel ve yeni karakteristigini (karakteristiklerini) materyal olarak etkilemeyenler ile sinirlandirilir ("esas olarak olusan"). Bu, tarif edilen bir yöntemdeki adimlar ayni zamanda buradaki bilesimler ve bilesenler için esit sekilde geçerlidir. Diger uygulamalarda, burada tarif edilen buluslarin, bilesimlerin, yöntemlerin ve bunlarin ilgili bilesenlerinin, bilesen, bilesim veya yöntem için bir esansiyel eleman olarak varsayilmayan herhangi bir elemanin disinda olmasi amaçlanir ("olusan").
Mevcut basvurunun açiklamasi, asagidaki numaralandirilmis paragraflarda verilir: 1. Asagidakileri içeren bir botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi: a) bir proteaz alani; b) bir proteaz klevaj yeri; 0) bir translokasyon alani ve 01761-P-0002 d) Clostri'dial botuli'num serotip B'nin (B-Hc), serotip B'de, sus 1'de, sübstitüsyon mutasyonlarina karsilik gelen asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içeren bir modifiye edilmis reseptör baglama alani: 2. Paragraf 1'in BoNT polipeptididir, burada modifiye edilmis (B-Hç) iki 3. Paragraf 2'nin BoNT polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu ve Sl l99L, El l9lQ ve Sl l99Y veya El l9lQ ve S] 199F'ye karsilik gelir. 4. Paragraflar 2-3'ün birinin BoNT polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191M ve Sl 199L'ye karsilik gelir.
. Paragraflar 2-3'ün birinin BoNT polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, El l9lM ve Sl 199Y'ye karsilik gelir. 6. Paragraflar 2-3'ün birinin BoNT polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191M ve S] 199F'ye karsilik gelir. 7. Paragraflar 2-3'ün birinin BoNT polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, El 19 lQ ve Sl 199L'ye karsilik gelir. 8. Paragraflar 2-3'ün birinin BoNT polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191Q ve Sl 199Y'ye karsilik gelir. 9. Paragraflar 2-3'ün birinin BoNT polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191Q ve Sl 199F'ye karsilik gelir.
. Asagidakileri içeren bir botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi: a) bir proteaz alani; b) bir proteaz klevaj yeri; 0) bir translokasyon alani ve 01761-P-0002 d) Clostridial botulinum serotip B'nin (B-Hc), serotip B'nin, sus 1'in, Sl]99'una veya Sl201'ine karsilik gelen bir pozisyonunda bir sübstitüsyon mutasyonu içeren bir modifiye edilmis reseptör baglama 11. Paragraf 10'un BoNT polipeptididir, burada sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt II'yi güçlendirilmis baglamasini ve/Veya modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt I'i azaltilmis baglamasini üretir. 12. Paragraf 10'un BoNT polipeptididir, burada sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt II'yi güçlendirilmis baglamasini ve/veya modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt I'i arttirilmis baglamasini üretir. 13. Paragraflar 11-12'nin herhangi birinin BoNT polipeptididir, burada sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis A, R, N, D, C, Q, E, G, H, 1, L, K, M, F, P, T, W, Y ve V'den olusan gruptan seçilir. 14. Paragraflar 11 ila 13`ten herhangi birinin BoNT polipeptididir, burada sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis bir dogal olusumlu-olmayan amino asittir.
. Paragraflar 1 ila 14°ten herhangi birinin BoNT polipeptididir, burada modiIiye edilmis B-Hc, sus l'e aittir. 16. ParagraIlar 1 ila 15”ten herhangi birinin BoNT polipeptididir, burada proteaz alani, translokasyon alani ve proteaz klevaj yeri, A, B, C, D, E, F, G ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen serotipten elde edilir. 17. Paragraf 16'nin BoNT polipeptididir, burada proteaz alani, translokasyon alani ve proteaz klevaj yeri, serotip B'den, sus 1'den, elde edilir. 18. Paragraf l6'nin BoNT polipeptididir, burada proteaz alani, translokasyon alani ve proteaz klevaj yeri, serotip A'dan, sus 1'den, elde edilir. 19. Serotip B'de, sus 1'de, sübstitüsyon mutasyonlarina karsilik gelen, Sl 199L; SlZOlV ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen bir 01761-P-0002 veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içeren Clostri'di'al botulinum serotip B'nin (B-Hc) bir modifiye edilmis reseptör baglama alanini içeren bir polipeptittir.
. Paragraf l9'un polipeptididir, burada modifiye edilmis (B-Hc) iki 2] .Paragraf 20'nin polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, El l9lM 22. Paragrailar 20-21'in birinin polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, El 191M ve Sl 199L'ye karsilik gelir. 23. Paragraflar 20-2l'in birinin polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191M ve Sl 199Y'ye karsilik gelir. 24. Paragraflar 20-21'in birinin polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, El 191 M ve Sl l99F'ye karsilik gelir.
. Paragraflar 20-21'in birinin polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, El l9lQ ve 81 l99L'ye karsilik gelir. 26. Paragrailar 20-2l'in birinin polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, El l9lQ ve Sl l99Y'ye karsilik gelir. 27. Paragraflar 20-21'in birinin polipeptididir, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, El l9lQ ve S] 199F'ye karsilik gelir. 28. Serotip B'nin, sus l'in, Sl l99'una veya SlZOl'ine karsilik gelen bir pozisyonda bir sübstitüsyon mutasyonu içeren Clostri'di'al botulinum serotip B'nin (B-Hc) bir modifiye edilmis reseptör baglama alanini içeren bir polipeptittir. 29. Paragraf 28'in polipeptididir, burada sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B- Hc'nin insan Syt II'yi güçlendirilmis baglamasini ve/veya modifiye edilmis B- Hc'nin insan Syt I'i azaltilmis baglamasini üretir.
. Paragraf 28'in polipeptididir, burada sübstitüsyon mutasyonu. sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B- 01761-P-0002 Hc'nin insan Syt II'yi güçlendirilmis baglamasini ve/Veya modifiye edilmis B- Hc'nin insan Syt I'i arttirilmis baglamasini üretir. 31. Paragraflar 29-30'un herhangi birinin polipeptididir, burada sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis A, R, N, D, C, Q, E, G, H, 1, L, K, M, F, P, T, W, Y ve V'den olusan gruptan seçilir. 32. Paragraflar 29 ila 315den herhangi birinin polipeptididir, burada sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis bir dogal olusumlu-olmayan amino asittir. 33. Paragraflar 19 ila 32"den herhangi birinin polipeptididir, burada modifiye edilmis B-Hc, sus l'e aittir. 34. Bir ikinci kisma bagli Clostri'dial botuli'num serotip B'nin (B-Hc) bir modifiye edilmis reseptör baglama alani olan bir birinci kisim içeren bir kimerik moleküldür, burada modifiye edilmis B-Hc, serotip B'de, sus 1'de, sübstitüsyon mutasyonlarina karsilik gelen asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içerir: Sl 199F; Sl 199L; SlZOlV ve bunlarin kombinasyonlari.
. Paragraf 33'ün kimerik molekülüdür, burada modifiye edilmis B-Hc iki 36. Paragraf 35'in kimerik molekülüdür, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, 37. Paragraflar 35-36'nin birinin kimerik molekülüdür, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, El 191M ve Sl l99L'ye karsilik gelir. 38. Paragraflar 35-36'n1n birinin kimerik molekülüdür, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191M ve Sl 199Y'ye karsilik gelir. 39. Paragraflar 35-36'nin birinin kimerik molekülüdür, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191M ve Sl 199F*ye karsilik gelir. 01761-P-0002 40. Paragraflar 35-36'nin birinin kimerik molekülüdür, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191Q ve S1199L'ye karsilik gelir, 41. Paragraflar 35-36'nm birinin kimerik molekülüdür, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191Q ve S] 199Y*ye karsilik gelir. 42. Paragraflar 35-36'nin birinin kimerik molekülüdür, burada iki sübstitüsyon mutasyonu, E1191Q ve Sl 199F'ye karsilik gelir. 43. Paragraf 34'ün kimerik molekülüdür, burada modifiye edilmis B-Hc, serotip B'nin, sus 1'in, Sl 199'una veya Sl201'ine karsilik gelen bir pozisyonda bir sübstitüsyon mutasyonu içeren Clostri'dz'al botuli'num serotip B'nin (B-Hc) bir modifiye edilmis reseptör baglama alanini içerir. 44. Paragraf 43'ün kimerik molekülüdür, burada sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt lI'yi güçlendirilmis baglamasmi ve/Veya modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt I'i azaltilmis baglamasmi üretir. 45. Paragraf 43'ün kimerik molekülüdür, burada sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt II'yi güçlendirilmis baglamasini ve/veya modifiye edilmis B-Hc'nin insan Syt I'i arttirilmis baglamasini üretir. 46. Paragrafiar 44-45'in herhangi birinin kimerik molekülüdür, burada sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis A, R, N, D, C, Q, E, G, H, 1, L, K, M, F, P, T, W, Y ve V'den olusan gruptan seçilir. 47. Paragraflar 44 ila 467dan herhangi birinin kimerik molekülüdür, burada sübstitüsyon mutasyonu, S için sübstüte edilmis bir dogal olusumlu-olmayan amino asittir. 48. Paragraflar 43 ila 47'den herhangi birinin kimerik molekülüdür, burada modifiye edilmis B-Hc, sus l'e aittir. 49. Paragraflar 32 ila 487den herhangi birinin kimerik molekülüdür, burada birinci kisim ve ikinci kisim kovalent bir sekilde baglidir. 50. Paragraflar 32 ila 487den herhangi birinin kimerik molekülüdür, burada birinci kisim ve ikinci kisim kovalent olmayan bir sekilde baglidir. 01761-P-0002 51. Paragraflar 32 ila 50“den herhangi birinin kimerik molekülüdür, burada ikinci kisim, bir küçük molekülden, bir nükleik asitten, bir kisa polipeptitten ve bir proteinden olusan gruptan seçilir. 52. Paragraf 51'in kimerik molekülüdür, burada ikinci kisim, bir biyo-aktif moleküldür. 53. Paragraf 51'in veya 52'nin kimerik molekülüdür, burada ikinci kisim, bir terapötik polipeptittir veya polipeptit-olmayan ilaçtir. 54. Paragraflar 1 ila 53iten herhangi birinin polipeptidini veya kimerik molekülünü sifreleyen bir nükleotid dizisi içeren bir nükleik asittir. 55. Paragraf 54'ün nükleik asidini içeren bir nükleik asit vektörüdür. 56. Paragraf 55'in nükleik asit vektörünü veya paragraf 54'ün nükleik asidini içeren bir hücredir. 57. Paragraflar 1 ila 53”ten herhangi birinin polipeptidini veya kimerik molekülünü eksprese eden bir hücredir. 58. Paragraflar 1 ila 18°den herhangi birinin botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidini veya paragraflar 34 ila 53°ten herhangi birinin kimerik molekülünü veya paragraf 55'in nükleik asit vektörünü veya paragraf 54'ün nükleik asidini içeren bir farmasötik bilesimdir. 59. Paragraf 58'in farmasötik bilesimidir, ilaveten bir farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyan içerir. 60. Paragraf 58'in veya 59'un bir farmasötik bilesimini ve farmasötik bilesimin terapötik uygulamasi için talimatlari içeren bir kittir. 61. Bir botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi üretmek için bir yöntemidir, yöntem paragraf 57'nin konak hücresini burada söz konusu BoNT polipeptidinin üretildigi kosullar altinda kültürleme adimlarini içerir. 62. Paragraf 61'in yöntemidir, ilaveten BoNT polipeptidini kültürden geri- kazanmayi içerir. 63. Istenmeyen nöronal aktivite ile iliskili bir rahatsizligi tedavi etmek için bir yöntemidir, paragraflar 1 ila lSiden herhangi birinin BoNT polipeptidinin bir terapötik olarak etkili miktarini böylece istenmeyen nöronal aktivite gösteren 01761-P-0002 bir veya birden fazla nörona temas etmek için, böylece rahatsizligi tedavi etmek için, bir süjeye uygulamayi, içerir. 64. Paragraf 63'ün yöntemidir, burada rahatsizlik, spazmodik disfoniden, spazmodik tortikollisten, larinjeyal distoniden, oromandibüler disfoniden, lingual distoniden, servikal distoniden, fokal el distonisinden, blefarospazmdan, strabismustan, hemifasiyal spazmdan, göz kapagi bozuklugundan, serebral palsiden, fokal spastisiteden ve diger ses bozukluklarindan, spazmodik kolitten, nörojenik mesaneden, anismustan, uzuv spastisitesinden, tiklerden, tremorlardan, bruksizmden, anal fissürden, akalazyadan, disfajiden ve diger kas tonu bozukluklarindan ve kas gruplarinin istemsiz hareketleri ile karakterize edilen diger bozukluklardan, lakrimasyondan, hiperhidrozdan, asiri tükürük salgilamadan, asiri gastrointestinal salgilardan, sekretuvar bozukluklardan, kas spazmlarindan kaynaklanan agridan, bas agrisindan ve dermatolojik veya estetik/kozmetik rahatsizliklardan olusan gruptan seçilir. 65. Tipta kullanilmasi için, paragraflar 1 ila 18°den herhangi birinin botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptididir, paragraf 58'in veya 59'un farmasötik bilesimidir veya paragraflar 34 ila 53iten herhangi birinin kimerik molekülüdür veya paragraflar 19 ila 33iten herhangi birinin polipeptididir. 66. Istenmeyen nöronal aktivite ile iliskili bir rahatsizligi tedavi etmede kullanilmasi için, paragraflar 1 ila 187den herhangi birinin botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptididir, paragraf 58'in veya 59'un farmasötik bilesimidir veya paragraflar 34 ila 53”ten herhangi birinin kimerik molekülüdür veya paragraflar 19 ila 33°ten herhangi birinin polipeptididir.
Bulus ilaveten, ek sinirlayici olarak anlam çikarilmamasi gereken asagidaki örnekler ile açiklanir. 01761-P-0002 ÖRNEKLER Asagidaki deneyler, BoNT/B reseptörü baglama alanini modifiye etme ile BoNT/B'nin insan Syt ll'sini baglama atinitesini degistirmenin mümkün olup olmadigini belirlemek için gerçeklestirilmistir. Hipotez, bir seri önceki çalismaya dayanir: (1) 1998'de bir dogal olusumlu BoNT/B alt-tipi toksininin, BONT/B2'nin, BoNT/B'ye (burada ayrica BoNT/B olarak tanimlanir, Sekil 2F) kiyasla Syt II'yi ~4 kat daha düsük baglama afinitesi gösterdigi gösterilmistir.28 Bu afinite farkinin, 2003'te bunlarin reseptör baglama alanlari içinde bir kaç amino asit farkindan kaynaklandigi gösterilmistir29 (Sekil 2F, G), bu ilk defa, BoNT/B'nin reseptör baglama alani içinde rezidüleri degistirmenin Syt Il'yi baglama atinitesini degistirebilecegini göstermistir. Bu çalismalar ayrica, Syt ll'yi baglama afinitesini etkileyen kilit rezidüleri de tanimlainistir (Sekil 2G). (2) 2004'te, BoNT/A'nin ve BoNT/B'nin reseptör baglama alani içindeki tek rezidü mutasyonlarinin bu toksinlerin toksisitesini ve potensini dramatik bir sekilde degistirebildigi bildirilmistir (Sekil 2H); bu, reseptör-baglama afinitesindeki degisimlerin toksinlerin toksisitesinin ve potensinin degisimlerine dönüstürülebilecegini gösterir.30 (3) Siçan Syt Il'sine bagli BoNT/B'nin es-kristal yapisi çözülmüstür3'>32 ve Syt ll için baglama yerini olusturan kilit rezidüler çözülmüstür.”32 Bu önceki çalismalarin tümü kemirgen Syt Il'sinden yararlanmistir, ancak insan Syt Il'sinden yararlanmamistir.
Bunun insan Syt II'sini baglama afinitesini degistirmek için BoNT/B reseptörü baglama alanina mühendislik uygulamak için hedef rezidüler, kemirgen Syt II baglamasi ile yapilan tüm bu önceki çalismalarindan tanimlanmistir.
BoNT/B'nin reseptör baglama alani iyi tanimlanmistir.
BoNT/B'nin reseptör baglama alani içindeki rezidüleri degistirmenin BoNT/B'nin siçan veya fare Syt ll'sini baglama afinitesini modüle edebildigini belirlemistir.”30 Siçan Syt Il'sin bagli BoNT/B'nin es-kristal yapisi ayrica 2006'da iki çalisma ile e çözülmüstürfil,32 Insan Syt II'si içindeki rezidü degisimi, F'den 01761-P-0002 L'ye bir görece konservatif degisimdir, her ikisi de hidrofobik rezidüdür. Bununla birlikte, keinirgen Syt II'si için BoNT/B'nin baglama afinitesindeki farklilik insan Syt lI'si için anlamli olarak daha yüksektir. llaveten, BoNT/B ve insan Syt Il'si arasindaki baglama etkilesiminin baglama yerinin ortasinda bu fenilalanin rezidüsü yoklugunu telafi etmek için nasil modifiye edilebilecegi açok degildir. örnegin, hidrofobik halkalarin istiflenmesini veya paketlenmesini içeren WT BoNT/B-Hc ve siçan veya fare Syt II arasindaki veya buradaki fenilalaninin dizi içine sübstüte edildigi bir WT BoNT/B-Hc ve bir modifiye edilmis insan Syt II'si arasindaki pozitif baglama etkilesimleri tahmin edilebilirken (ve yayinlanmis kristal yapilarinda görsellestirilebilirken); bu tarz etkilesimler bir modifiye edilmis BONT/B-Hc ve bir WT insan Syt II proteini arasinda yeniden-üretilebilir olmayabilir. Bu, BoNT/B içindeki bir kaç veya hatta bir rezidüyü degistirmenin BoNT/B-Syt Il komplekslerinin global yapisi içinde majör degisimler olmadan insan Syt Il'sini baglamayi eski hâline getiremeyebilecegini/iyilestiremeyebilecegini öne sürer.
Pozisyon 54'teki korunmus fenilalanin, BoNT/B ile çok sayida hidrofobik temas olusturur. (Insanlarda) lösin hidrofobik de oldugundan, BoNT/B baglamasinin bozulmasi büyük olasilikla, fenilalanin ve lösin arasindaki boyut/sekil farkliliklarindan kaynaklanir. Bundan dolayi, bulus için kilit olan, fenilalaninden lösine degisime uyum saglayabilen ve bu degisimi telafi edebilen BONT/B-Hc içindeki olasi degisimleri tanimlamaktir. Yaklasim iki-katlidir: kemirgen Syt BoNT/B-Hc'nin etrafindaki bölge içindeki rezidülere odaklanmak, bu pozisyon 54'te fenilalanin ile bir pozitif baglama etkilesimi yoklugunu telafi edebilir.
Potansiyel olarak BoNT/B ve insan Syt II'si arasinda karsilik gelen baglama bölgesi içinde olan bu rezidülerin, BONT/ B-siçan Syt II es-kristal yapisina atfen, bir çalismada BONT/B2'nin kemirgen Syt Il'sini baglamasini etkileyen rezidülerin 01761-P-0002 listesi arasinda oldugu da gösterilmistir (Sekil 2G)29 Rezidü sübstitüsyonlarindan tam etkiyi tahmin etmek imkânsiz oldugundan, bir "deneme ve yanilma" yaklasimi kullanilmistir. Ilk olarak, tek rezidü sübstitüsyonlari yürütülmüstür, bunu seçilmis kombinasyonlar izlemistir. Spesifik olarak, listelenen kilit rezidülerin her biri, önemli hidrofobik temaslarin idame ettirilinesini garanti etmek için hidrofobik rezidüler ile sinirlandirilmis elek ile - farkli boyutlari olan hidrofobik rezidüler ile sistematik olarak sübstüte edilmistir. Bu hidrofobik sübstitüsyon rezidüleri asagidakileri içerir: V, 1, L. M, F, W, C ve A, Y, H, T, S, P, Q, N ve G'yi içeren diger daha az hidrofobik amino asitler.
Bulusun basarisinin bir püf noktasi, mutantlari taramak için bir uygulanabilir ve ekonomik yol gelistirmektedir. Temel yaklasim, Sekil 2C'de tarif edildigi sekilde asagi-çekme analizlerinde çözünebilen rekombinant BoNT/B-Hc'nin iinmobilize edilmis fare Syt Il'sini (F54L) baglamasini saptamaktir. Bununla birlikte, asagi- çekme analizleri için tüm mutantlari saflastirmak uygulanabilir degildir. Bundan dolayi, saflastirma ihtiyaci olmadan, küçük bir miktardaki bakteriyel lizatlardan BoNT/B-Hc'yi dogrudan Syt II ile asagi-çekmenin mümkün olup olmadigi test edilmistir. Gerekçe, BoNT/B-Syt II'nin baglama afinitesinin bu yaklasim için yeteri kadar yüksek olabilinesidir (Kd ~.20 Aslinda, iminobilize edilmis siçan Syt Il'sinin bakteriyel lizatlarin dogrudan yalnizca 6 ml'sinden yeterli WT BoNT/B-Hc'yi "afiniteli-saflastirabilecegi" bulunmustur (Sekil 3A). Bu yeni gelistirilmis yöntem, oldukça fazla bir sayidaki BoNT/B-Hc mutantini taramak için çabayi büyük oranda basitlestirmistir. Bu yöntem kullanilarak, BoNT/B-Hc mutantlarini bunlarin hem bir fare Syt II'sini 1-87 (m-Syt II) ve insan Syt II dizisini (F54L, h-Syt II) taklit eden bir mutasyona ugratilmis fare Syt II'sini baglamasi için tarama test edilmistir. Bagli malzemeler, anti-HA antikoru kullanilarak BoNT/B-Hc'yi saptayan immünoblot analizine tabi tutulmustur (Sekil Mutantlarin büyük çogunlugunun iki kategoriye ayrildigi bulunmustur: (1) m-Syt 01761-P-0002 m-Syt Il'sini hâlâ baglayan, ancak h-Syt Il'sini baglamayanlar, örnegin, F1204W ve E1191W (Sekil 3B). Bu baglama sonuçlari, Sekil 3A'da gösterilen bir kaç örnegin disinda, buradan büyük ölçüde çikarilmistir.
Taranan mutantlar arasinda, hem m-Syt ll'sini hem de h-Syt Il'sini baglayan, (Sekil 3B) tanimlanmistir. Böylelikle, bu rezidülerin, insan Syt II'sinde L rezidülerine uyum saglamak için veya insan Syt II'sinde bu pozisyonda fenilalanin rezidüsü yoklugunu telafi etmek için kilit pozisyonlarda oldugu belirlenmistir.
Insan Syt I'inin, insan Syt II'sine kiyasla motor nöronlarda anlamli olarak daha düsük düzeylerde eksprese edilinesine ragmen, yine de hastalarda BoNT/B'nin etkililigi ile gösterildigi üzere, bu bir önemli ve yetenekli toksin reseptörüdür.
Insan nöronlarini en yüksek olasi baglamayi basarmak için, bazi yönlerinde, modifiye edilmis BoNT/B mutantlari arzu edilebilir bir sekilde insan Syt l`ini baglamayi advers bir sekilde etkilememelidir. Ideal olarak, bunlar Syt I'i baglamayi da arttirabilir. Bundan dolayi, ayni küçük-ölçekli asagi-çekme analizi kullanilarak, seçilmis BoNT/B mutantlarinin immobilize edilmis insan Syt I'ini baglamasi ilaveten incelenmistir. BoNT/B'yi Syt I baglamasi Syt II'ye kiyasla daha düsük bir atiniteye sahip oldugundan, bu lipit ko-reseptör gangliyositlerinin varligini gerektirir.10*20 Bu ihtiyaca, asagi-çekme analizlerinde bakteriyel lizatlara saflastirilmis beyin gangliyositlerini ekleme ile deginilmistir. Sekil 4A`da gösterildigi üzere, toksin baglama yeri içeren insan Syt l fragmani (1-80), GST- etiketli proteinler olarak saflastirilmistir ve gangliyositlerin (Gangl) varliginda veya yoklugunda, WT ve mutant BoNT/B-Hc'yi asagi çekmek için bilyeler üzerinde immobilize edilmistir. Beklendigi üzere, WT BoNT/B-Hg` yalnizca gangliyositlerin varliginda Syt 1'i baglar. E1191M ve E1191Q mutantlarinin Syt I'i baglamayi anlamli bir sekilde arttirdigi bulunmustur: bu mutantlar gangliyositler olmadan da insan Syt I'ini baglayabilir (Sekil 4A). Diger mutantlar, WT BoNT/B- Hc'ye (örnegin, Sl201V) kiyasla Syt l'i baglamayi azaltmistir (örnegin, V1 18M) veya bezer düzeylerde baglamayi (örnegin, SlZOlV) idame ettirmistir. Bu, 01761-P-0002 El 191M ve E1191Q'nun hem insan Syt Il'sini baglamaya olanak saglayan hem de insan Syt I'ini baglamayi güçlendiren mutantlar oldugunu gösterir.
Bu, insan Syt Il'sini bagladigindan, ancak insan Syt l'ini baglamadigindan, V1118M mutasyonu da söz konusudur. Bundan dolayi, bu insanlarda WT BoNT/B'ye kiyasla Syt II eksprese eden nöronlara daha spesifik olan terapötik toksinler olusturmak, böylece insanlarda Syt-l eksprese eden hücrelere spesifik- olmayan girisi azaltmak, amaciyla kullanilmasi için potansiyele sahiptir.
Bir örnek olarak E1191M kullanilarak, bunun insan Syt II'si ile etkilesimleri, saflastirilmis rekombinant proteinler kullanilarak ilaveten valide edilmistir, bu bizim esit miktarlardaki WT BoNT/B-Hc'nin ve E1191M mutantinin m-Syt ll'yi ve h-Syt ll'yi baglainasini karsilastirmamiza olanak saglar (Sekil 48).
E1191M'nin, gagliyositler olmadan hem m-Syt ll'yi hem de h-Syt ll'yi bagladigi ve gangliyositler eklemenin baglamayi ilaveten yükselttigi bulunmustur (Sekil 4).
Bu sonuçlar, E1191M'nin gangliyositlerin yoklugunda insan Syt Il'sini baglama yetisi kazandigini ve lipit ko-reseptör gangliyositlerin varliginda insan Syt II'si ile yüksek-afiniteli kompleksler olusturabilecegini dogrulamistir.
Omurga olarak E1191M/Q kullanilarak, bunu diger rezidü sübstitüsyonlari ile birlestirmenin insan Syt I/ll'sini baglamayi ilaveten güçlendirip güçlendiremeyecegini analiz etmek için deneyler yürütülmüstür. Sl 199L/Y/ veya /F'yi E1191M/ veya Q ile baglama, insan Syt II'yi anlamli olarak daha yüksek baglama gösteren ikili mutantlar üretmistir (Sekil 5A). Örnegin, E1191M/Sll99Y hem m-Syt II'yi hem de h-Syt II'yi baglamanin benzer düzeylerini saglamistir (Sekil 5A, satir 5 ve 6). Bu, bunun m-Syt Il'sini baglamasina kiyasla h-Syt Il'sini daha az baglamaya aracilik eden, te basina E1191M'ye kiyasla anlamli bir güçlendirmedir (Sekil 4B). Ilaveten, tüm seçilmis ikili mutantlar, WT BoNT/B- Hc'ye kiyasla insan Syt I'ini anlamli olarak daha yüksek baglama göstermistir (Sekil SB). 01761-P-0002 E1191M/Sl 199Y baglamasi, esit miktarlarda saflastirilmis rekombinant proteinler kullanilarak ilaveten karsilastirilmistir. Sekil 6A'da gösterildigi üzere, WT BoNT/B-Hc güncel analiz kosullari altinda gangliyositlerin yoklugunda h-Syt ll'sini baglayamaz. E1191M gangliyositler olmadan h-Syt ll'sini ilimli bir baglama gösterirken, E1191M/Sll99Y'nin h-Syt ll'sini baglama, özellikle gangliyositlerin yoklugunda, tek basina E1191M'ye kiyasla anlamli olarak güçlendirilmistir (satir 8'e kiyasla 6'yi karsilastirin). ilaveten, hem E1191M hem de E1191M/S1199Y, WT BoNT/B-Hc'ye kiyasla insan-Syt I'ini baglamayi anlamli bir sekilde arttirmistir (Sekil 6B).
WT BoNT/B-Hc'nin m-Syt ll'sini baglamasinin yüksek bir afiniteye sahip oldugu bilinir.”2l Böylelikle, I'altin standarda" kiyasla h-Syt ll'sini Ell9lM/Sll99Y arasindaki baglama: m-Syt ll'yi BoNT/B-Hc baglamasi karsilastirilmistir. Sekil 6C'de gösterildigi üzere, BoNT/B-Hc konsantrasyonlarinin titrasyonu, E1191M/Sll99Y'nin tüm konsantrasyonlarda m-Syt II'yi WT baglamasi ile benzer düzeylerde baglamaya sahip oldugunu ortaya çikarmistir. Kd'nin, bu analiz kosullari altinda, El l9lM/Sl 199Y ve h-Syt II arasinda ~19 nM oldugu ve m-Syt 6D). Bu, bu analiz kosullarinda h-Syt ll'yi baglayamayan, WT BoNT/B-Hc'ye kiyasla h-Syt ll'yi baglamak için devasa bir iyilestirmedir (Sekil 6A). Sonuç olarak, El l9lM'yi Sll99Y ile birlestirme, baglama afinitesinde E1191M mutantina kiyasla ilave bir iyilestirme açisindan agir basan sinerjistik bir iyilestirme saglamistir ve hem insan Syt I'ini hem de Syt II'sini yüksek afiniteli baglamasi olan yeni BoNT/B-Hc mutantlari üretmistir. Aksine, bazi diger yararli münferit mutasyonlarin kombinasyonlari ilave iyilestirilmis ikili-mutant BoNT/ B- Hc alanlari ile sonuçlanmaz.
Son olarak, E1191M/Sll99Y mutantinin nöron yüzeyi üzerinde h-Syt [I'yi baglamasini geri-kazanip kazanamayacagi incelenmistir. Kültürlenmis siçan hipokampal nöronlari yalnizca Syt I eksprese eder, ancak Syt II eksprese etmez. 01761-P-0002 Syt I, bu nöronlarda nakavt edilmistir (KD) ve akabinde lentiviral transdüksiyon vasitasiyla ekzojen ni-Syt II, ni-Syt II (F54L) ve h-Syt H ile degistirilmistir.
Akabinde, WT BoNT/B-Hc'nin ve El l9lM/Sl 199Y'nin bu nöronlari baglamasi test edilmistir (Sekil 7). WT BoNT/B-Hc yalnizca m-Syt ll'yi baglarken, El l9lM/Sl 199Y nöron yüzeyi üzerinde hem m-Syt Il'yi (F54L) hem de h-Syt reseptör olarak h-Syt ll kullanabilecegini gösterir.
Malzemeler ve Yöntemler Antikorlar ve malzemeler: Fare monoklonal anti-HA antikoru Covance (16B12) firmasindan satin alinmistir. Bovin karma beyin gagliyositleri Matreya LLC (Pleasant Gap, PA) firmasindan satin alinmistir ve önceden tarif edildigi üzere Tris-tamponlu salin (TBS: 20 mM Tris, içinde rekonstitüye edilmistir.9 BoNT/B (Okra), gösterilen suslardan E. Johnson laboratuvarinda (Madison, WI) sailastirilmistir. cDNA ve yapilar: BoNT/B-Hc sifreleyen DNA (GenBankasi erisim ve bunun kodonu E. coli' içinde ekspresyon için optimize edilmistir. BoNT/B- Hc'yi sifreleyen DNA, bunun N-ucuna kaynastirilmis bir Hisö etiketi ve bir HA etiketi (YPYDVPDYA) ile, pET28a vektörü içine alt-klonlanmistir. BoNT/B-Hc içindeki mutasyonlar, üreticinin manüeli izlenerek, Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit'i (Agilent Technologies, CA) kullanilarak PCR vasitasiyla üretilmistir. Asagidaki DNA, gösterilen gruplar tarafindan cömert bir sekilde saglanmistir: siçan Syt 1 (TC. Sudhof, Palo Alto, CA), fare Syt II (M. Fukuda, fragmanlari ve Syt II mutasyonlari önceden tarif edilmistir.'°3'3°14 Tüm yapilar dizileme ile dogrulanmistir. 01761-P-0002 Protein ekspresyonu ve saflastirilmasi: BoNT/B-Hc'nin WT'si ve mutantlari E. coli içinde His6 etiketli rekombinant proteinler olarak eksprese edilmistir. Syt I/II fragmanlari ve mutantlari E. 0011' içinde GST etiketli rekombinant proteinler olarak eksprese edilmistir. Hem GST-füzyon hem de Hisö-füzyon proteinleri, 0,25 mM IPTG ile 20°C'de gece boyu indüksiyon sicakligi ile, önceden tarif edildigi sekilde sailastirilmistir.9 GST asagi-çekme analizleri: Asagi-çekme analizlerinin iki tipi yapilmistir.
Birinci seri, mutant BoNT/B-Hc'nin GST-etiketli fare Syt II'sini (m-Syt II) ve insan Syt II dizisini taklit eden (Örnekler 1 ila 6'da h-Syt II olarak gösterilen) bir mutant fare Syt II'sini (F54L) baglarnasini taramak için kullanilmistir. Özet olarak, BoNT/B-Hc eksprese eden E. coli'nin 6 ml'si asagi çökmesi için döndürülmüstür, 800 ul TBS içinde yeniden-süspanse edilmistir, sonike edilmistir ve akabinde 4°C`de 1 sa boyunca %2 Triton X-lOO ile inkübe edilmistir.
Akabinde, örnekler 4°C'de bir mikro-sentrifuj içinde 15 dk boyunca maksimal hizda asagi çökmesi için döndürülmüstür. Süpernatantlar toplanmistir ve glutatyon-Sefaroz bilyeleri üzerinde immobilize edilmis 10 ug Syt proteinleri (GE bioscience, Piscataway, NJ) ile 4°C'de 1 sa boyunca inkübe etme ile asagi-çekme analizleri için kullanilmistir. Örnekler yikama tamponu (TBS + %0,5 Triton) içinde üç kere yikanmistir ve anti-HA antikoru kullanilarak BoNT/B-Hc'yi saptayan immünoblot analizleri ile analiz edilmistir. h-Syt II'yi güçlendirilmis baglamasi olan mutantlar için, ilave asagi-çekme analizleri, önceden tarif edildigi üzere bu mutant BoNT/B-Hc'yi Hisö etiketli proteinler olarak saflastirma ile yürütülmüstür.9 Akabinde, asagi-çekme analizleri, gangliyositler (60 tig/ml) ile birlikte veya gangliyositler olmadan 4°C`de 1 sa boyunca 100 ul TBS tamponu arti %0,5 Triton X-lOO içinde immobilize edilmis Syt fragmanlari kullanilarak yürütülmüstür. Bilyeler, TBS tamponu arti %0,5 Triton X-lOO kullanilarak üç kere yikanmistir. Bagli malzemelerin yüzde onu, SDS-PAGE'e tabi tutulmustur, bunu immünoblot analizi izlemistir. 01761-P-0002 Immüno-boyama: Kültür nöronlari, %4 paraformaldehit ile fikse edilmistir, antikoru ile) hem de sinapsini saptayan immüno-boyama analizine tabi tutulmustur. Görüntüler, bir konfokal mikroskop (Leica TCS SP5; 40x yagli objektif) kullanilarak toplanmistir.

Claims (3)

  1. ISTEMLER Bir polipeptittir, Clostri'di'al botulinum serotip B'nin (B-Hc), serotip B'de, sus l'de, sübstitüsyon mutasyonlarina karsilik gelen Ell9lM; Ell9ll; bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içeren bir modifiye edilmis reseptör baglama alani burada sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan SytII'yi güçlendirilmis baglamasini üretir.
  2. 2. Bir botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptididir, asagidakileri içerir: a) bir proteaz alani; b) bir proteaz klevaj yeri; e) bir translokasyon alani ve d) Clostridi'al botulinum serotip B'nin (B-Hc), serotip B'de, sus 1'de, sübstitüsyon mutasyonlarina karsilik gelen asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir veya birden fazla sübstitüsyon mutasyonu içeren bir modifiye edilmis reseptör baglama alani: V] 1 l8M; Y1183M ve bunlarin kombinasyonlari, burada sübstitüsyon mutasyonu, sübstitüsyon mutasyonundan yoksun olan özdes bir moleküle kiyasla, modifiye edilmis B-Hc'nin insan SytII'yi güçlendirilmis baglamasini üretir.
  3. 3. Bir botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptididir, asagidakileri içerir: a) bir proteaz alani; b) bir proteaz klevaj yeri; 0) bir translokasyon alani ve d) Clostri'di'al botuli'num serotip B'nin (B-Hc), serotip B'nin, sus 1'in, Sll99'una veya Sl201'e karsilik gelen bir pozisyonda bir sübstitüsyon mutasyonu içeren bir modifiye edilmis reseptör baglama alani. . Istem Z'ye veya istem 3'e göre BoNT polipeptididir, burada proteaz alani, translokasyon alani ve proteaz klevaj yeri, A, B, C, D, E, F, G ve bunlarin kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilen serotipten elde edilir, tercihen burada proteaz alani, translokasyon alani ve proteaz klevaj yeri, serotip B'den, sus 1'den veya serotip A'dan, sus l'den, elde edilir. . Önceki istemlerin herhangi birine göre polipeptit veya BoNT polipeptididir, burada modifiye edilmis (B-Hc) iki sübstitüsyon mutasyonu içerir, tercihen burada iki sübstitüsyon mutasyonu El l9lM ve Sl 199Y, . Önceki istemlerin herhangi birine göre polipeptit veya BoNT polipeptididir, bir ikinci kisma bagli Closrri'di'al botulinum serotip B'nin (B-Hc) modifiye edilmis reseptör baglama alani olan bir birinci kisim . Istem 6'ya göre polipeptit veya BoNT polipeptididir, burada birinci kisim ve ikinci kisim kovalent bir sekilde baglidir veya birinci kisim ve ikinci kisim kovalent olmayan bir sekilde baglidir ve burada Ikinci kisim, bir küçük molekülden, bir nükleik asitten, bir kisa polipeptitten ve bir proteinden olusan gruptan seçilir, tercihen burada, ikinci kisim, bir biyo- aktif moleküldür, bir terapötik polipeptittir veya polipeptit-olmayan ilaçtir. Bir nükleik asit, tercihen bir vektördür, önceki istemlerin herhangi birine göre polipeptidi veya BoNT polipeptidini sifreleyen bir nükleotid dizisi Bir hücredir, istem 8'e göre nükleik asit içerir veya istemler l - 7°den herhangi birine göre polipeptidi veya BoNT polipeptidini eksprese eder. Bir farmasötik bilesimdir, istemler l - 7°den herhangi birine göre polipeptit veya botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi veya istem 8'e göre nükleik asit içerir. Istem lO'a göre farmasötik bilesimdir, ilaveten bir farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyan içerir. Bir kittir, istem 10'a veya 11'e göre bir farmasötik bilesim ve farmasötik bilesimin terapötik uygulamasi için talimatlar içerir. Bir polipeptit veya botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi üretmek için bir yöntemdir, yöntem istem 9'a göre konak hücreyi burada söz konusu polipeptidin veya BoNT polipeptidinin üretildigi kosullar altinda kültürleme ve opsiyonel olarak polipeptidi veya BoNT polipeptidini kültürden geri-kazanma adimlarini içerir. Terapide kullanilmasi için, istemler l - 7”den herhangi birine göre polipeptit veya botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptididir veya istem lO'a veya ne göre farmasötik bilesimdir. 15.Istenmeyen nöronal aktivite ile iliskili bir rahatsizligi tedavi etmede kullanilmasi için, istemler 1 - 7°den herhangi birine göre polipeptit veya botulinum nörotoksini (BoNT) polipeptidi veya istem lû'a veya 11'e göre farmasötik bilesimdir, tercihen burada rahatsizlik, spazmodik disfoniden, spazmodik tortikollisten, larinjeyal distoniden, oromandibüler disfoniden, lingual distoniden, servikal distoniden, fokal el distonisinden, blefarospazmdan, strabismustan, hemifasiyal spazmdan,` göz kapagi bozuklugundan, serebral palsiden, fokal spastisiteden ve diger ses bozukluklarindan, spazmodik kolitten, nörojenik mesaneden, anismustan, uzuV spastisitesinden, tiklerden, tremorlardan, bruksizmden, anal fissürden, akalazyadan, disfajiden ve diger kas tonu bozukluklarindan ve kas gruplarinin istemsiz hareketleri olan diger bozukluklardan, lakrimasyondan, hiperhidrozdan, asiri tükürük salgilamadan, asiri gastrointestinal salgilardan, sekretuvar bozukluklardan, kas spazmlarindan kaynaklanan agridan, bas agrisindan ve dermatolojik veya estetik/kozmetik rahatsizliklardan olusan gruptan seçilmesi ile karakterize edilir.
TR2018/02754T 2012-05-30 2013-03-13 Mühendislik uygulanmış botulinum nörotoksini. TR201802754T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261653214P 2012-05-30 2012-05-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201802754T4 true TR201802754T4 (tr) 2018-03-21

Family

ID=48050254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/02754T TR201802754T4 (tr) 2012-05-30 2013-03-13 Mühendislik uygulanmış botulinum nörotoksini.

Country Status (23)

Country Link
US (3) US9598685B2 (tr)
EP (2) EP3372239B1 (tr)
JP (3) JP6336970B2 (tr)
KR (1) KR102060355B1 (tr)
CN (2) CN104736166B (tr)
AU (2) AU2013267957B2 (tr)
BR (1) BR112014029585A2 (tr)
CA (2) CA3170993A1 (tr)
DK (2) DK3372239T3 (tr)
EA (1) EA029275B1 (tr)
ES (2) ES2661033T3 (tr)
HK (1) HK1210692A1 (tr)
HU (2) HUE053147T2 (tr)
IL (1) IL235934B (tr)
MX (2) MX359480B (tr)
NZ (1) NZ702310A (tr)
PL (2) PL3372239T3 (tr)
PT (2) PT2854840T (tr)
SG (2) SG11201407784UA (tr)
TR (1) TR201802754T4 (tr)
UA (1) UA116985C2 (tr)
WO (1) WO2013180799A1 (tr)
ZA (1) ZA201408757B (tr)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005019302A1 (de) * 2005-04-26 2006-11-16 Toxogen Gmbh Carrier zum Targeting von Nervenzellen
DK3372239T3 (da) 2012-05-30 2021-02-01 Harvard College Manipuleret botulinumneurotoksin
KR102083371B1 (ko) * 2012-11-21 2020-03-04 입센 바이오이노베이션 리미티드 단백질 가수분해 처리된 폴리펩티드의 제조방법
GB201312317D0 (en) * 2013-07-09 2013-08-21 Syntaxin Ltd Cationic neurotoxins
EP3270951B1 (en) * 2015-03-16 2020-09-09 California Institute of Technology Botulinum neurotoxin-specific capture agents, compositions, and methods of using and making
EP3981783A1 (en) * 2015-03-26 2022-04-13 President And Fellows Of Harvard College Engineered botulinum neurotoxin
TW201718627A (zh) * 2015-06-11 2017-06-01 梅茲製藥有限兩合公司 重組梭菌神經毒素及其使用與形成方法、包括其之醫藥組合物及對應其之前驅物、編碼前驅物之核酸序列及其獲得方法與前驅物之形成方法、載體與包括核酸序列之重組宿主細胞
GB201607901D0 (en) * 2016-05-05 2016-06-22 Ipsen Biopharm Ltd Chimeric neurotoxins
WO2017201105A1 (en) * 2016-05-16 2017-11-23 President And Fellows Of Harvard College Method for purification and activation of botulinum neurotoxin
CN109476713A (zh) * 2016-06-08 2019-03-15 儿童医学中心公司 工程改造的肉毒杆菌神经毒素
MA45492A (fr) 2016-06-23 2019-05-01 Hopitaux Paris Assist Publique Vecteurs viraux pour le traitement de l'hyperactivité vésicale neurogène
DK3481852T3 (da) * 2016-07-08 2023-02-27 Childrens Medical Center Hidtil ukendt botulinum-neurotoksin og dets derivater
WO2018039506A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Engineered botulinum neurotoxin
EP3312290A1 (en) 2016-10-18 2018-04-25 Ipsen Biopharm Limited Cellular vamp cleavage assay
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
WO2018236873A1 (en) 2017-06-19 2018-12-27 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF MICROBIAL INFECTION
JP2021500871A (ja) * 2017-09-29 2021-01-14 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション ニューロトキシン様トキシンおよびそれらの使用
TWI810228B (zh) 2017-12-20 2023-08-01 英商艾普森生物製藥有限公司 自主神經系統障礙之治療
WO2019126502A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Allergan, Inc. Botulinum toxin cell binding domain polypeptides and methods of use for skin rejuvenation
US20210040467A1 (en) * 2018-01-30 2021-02-11 Children's Medical Center Corporation Production of botulinum neurotoxins using bacillus systems
EP3752128A1 (de) * 2018-02-16 2020-12-23 Bontana Therapies Gmbh Nukleinsäure-basiertes botulinum neurotoxin zur therapeutischen anwendung
SE542539C2 (en) * 2018-02-26 2020-06-02 Toxotech Ab Chimeric botulinum neurotoxin heavy chain binding domain
US20220016221A1 (en) 2018-12-05 2022-01-20 Ipsen Biopharm Limited Treatment of symptoms of traumatic brain injury
GB201914034D0 (en) 2019-09-30 2019-11-13 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of neurological disorders
GB202001353D0 (en) 2020-01-31 2020-03-18 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of skin conditions
GB202003813D0 (en) 2020-03-16 2020-04-29 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of upper facial lines
KR20220154738A (ko) 2020-03-16 2022-11-22 입센 바이오팜 리미티드 사지 경직을 치료하기 위한 변형된 보툴리눔 신경독소
GB202011055D0 (en) 2020-07-17 2020-09-02 Ipsen Bioinnovation Ltd Treatment of post-operative pain
GB202100566D0 (en) 2021-01-15 2021-03-03 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of brain damage
AU2021438810A1 (en) 2021-03-30 2023-09-21 Ipsen Biopharm Limited Catalytically inactive clostridial neurotoxins for the treatment of pain & inflammatory disorders
AU2022247196A1 (en) 2021-03-30 2023-10-05 Ipsen Biopharm Limited Treatment of pain & inflammatory disorders
WO2023041934A1 (en) 2021-09-16 2023-03-23 Ipsen Biopharm Limited Modified bont/a for use in the treatment of cervical dystonia
WO2023047127A1 (en) 2021-09-23 2023-03-30 Ipsen Biopharm Limited Modified bont/a for use in the treatment of a disorder affecting an eyelid muscle of a subject
GB202113602D0 (en) 2021-09-23 2021-11-10 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of a disorder affecting an eyelid muscle of a subject
WO2023089343A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Ipsen Biopharm Limited Treatment of pain
GB202116795D0 (en) 2021-11-22 2022-01-05 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of visceral pain
CN114410683B (zh) * 2022-01-12 2023-11-28 中国人民解放军空军军医大学 一种基于Cre-lox重组系统的RIM3-RNAi及其应用
CN114369623B (zh) * 2022-01-12 2023-07-07 中国人民解放军空军军医大学 一种基于Cre-lox重组系统的Synaptotagmin2-RNAi及其应用
GB202206361D0 (en) 2022-04-29 2022-06-15 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of a facial dystonia
GB202206353D0 (en) 2022-04-29 2022-06-15 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of cervical dystonia
GB202206348D0 (en) 2022-04-29 2022-06-15 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of limb spasticity
GB202206362D0 (en) 2022-04-29 2022-06-15 Ipsen Biopharm Ltd Treatment of upper facial lines
GB202213479D0 (en) 2022-09-14 2022-10-26 Ipsen Biopharm Ltd Cell-free clostridial neurotoxin assays
GB202214232D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Ispen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an activating exogenous protease cleavage site
GB202214229D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Ipsen Biopharm Ltd Clostridial neurotoxins comprising an activating endosomal protease cleavage site

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US5053005A (en) 1989-04-21 1991-10-01 Gary E. Borodic Chemomodulation of curvature of the juvenile spine
US5766605A (en) 1994-04-15 1998-06-16 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Treatment of autonomic nerve dysfunction with botulinum toxin
DK1086702T3 (da) 1994-05-09 2005-05-23 William J Binder Præsynaptiske neurotoksiner til behandling af migrænehovedpine
ES2138740T3 (es) 1994-05-31 2000-01-16 Allergan Inc Modificacion de toxinas de clostridium utilizadas como proteinas de transporte.
GB9411138D0 (en) 1994-06-03 1994-07-27 Microbiological Res Authority Toxin assay
GB9508204D0 (en) 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
US5721215A (en) 1996-03-20 1998-02-24 Allergan Injectable therapy for control of muscle spasms and pain related to muscle spasms
GB9617671D0 (en) 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
WO1998008540A1 (en) * 1996-08-28 1998-03-05 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Multivalent vaccine for clostridium botulinum neurotoxin
GB9721189D0 (en) 1997-10-08 1997-12-03 Speywood Lab The Limited Analgesic conjugates
US6113915A (en) 1999-10-12 2000-09-05 Allergan Sales, Inc. Methods for treating pain
US20040033241A1 (en) 2000-06-02 2004-02-19 Allergan, Inc. Controlled release botulinum toxin system
US7148041B2 (en) 2003-09-25 2006-12-12 Allergan, Inc. Animal product free media and processes for obtaining a botulinum toxin
DK1718756T3 (da) 2004-02-24 2012-02-27 Allergan Inc Botulinumtoksinscreeningassays
KR100668570B1 (ko) 2004-06-28 2007-01-16 입센 리미티드 복재신경 포착에 의한 무릎 관절 통증 치료를 위한,보툴리눔 독소를 포함하는 제약 조성물
DE102004043009A1 (de) * 2004-09-06 2006-03-23 Toxogen Gmbh Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen
WO2006099590A2 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with altered targeting capabilities for clostridial toxin target cells
DE102005019302A1 (de) 2005-04-26 2006-11-16 Toxogen Gmbh Carrier zum Targeting von Nervenzellen
US7985554B2 (en) 2005-10-14 2011-07-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Botulinum neurotoxin A receptor and the use thereof
DE102005051789B4 (de) 2005-10-28 2014-08-07 Toxogen Gmbh Der Botulinus Neurotoxin A Proteinrezeptor und seine Anwendungen
FR2902341B1 (fr) 2006-06-16 2011-02-25 Scras Utilisation therapeutique simultanee, separee ou etalee dans le temps d'au moins une neurotoxine botulique, et d'au moins un derive opiace
FR2907680B1 (fr) 2006-10-27 2012-12-28 Scras Utilisation therapeutique d'au moins une neurotoxine botulique dans le traitement de la douleur induite par au moins un agent anti-cancereux
FR2910327B1 (fr) 2006-12-22 2013-04-26 Scras Utilisation d'au moins une neurotoxine botulique pour traiter la douleur induite par les traitements therapeutiques du virus du sida.
US8586081B2 (en) 2007-09-20 2013-11-19 University Of Massachusetts Detoxified recombinant botulinum neurotoxin
WO2009042165A2 (en) 2007-09-25 2009-04-02 Thomas Jefferson University Mutant botulinum neurotoxin serotype a polypeptide and uses thereof
FR2930447B1 (fr) 2008-04-25 2010-07-30 Sod Conseils Rech Applic Utilisation therapeutique d'au moins une neurotoxine botulique dans le traitement de la douleur dans le cas de la neuropathie diabetique
WO2010022979A1 (en) 2008-08-29 2010-03-04 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Clostridial neurotoxins with altered persistency
CN101386648B (zh) * 2008-09-25 2012-05-30 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 抗b型肉毒神经毒素中和性单克隆抗体、其制备方法及用途
TW201023928A (en) 2008-11-12 2010-07-01 Kythera Biopharmaceuticals Inc Systems and methods for delivery of biologically active agents
WO2010120766A1 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Mcw Research Foundation, Inc. Engineered botulinum neurotoxin
US8440204B2 (en) 2009-04-30 2013-05-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Subtype of Closteridium botulinum neurotoxin type A and uses thereof
DK3372239T3 (da) 2012-05-30 2021-02-01 Harvard College Manipuleret botulinumneurotoksin
EP3981783A1 (en) 2015-03-26 2022-04-13 President And Fellows Of Harvard College Engineered botulinum neurotoxin
GB201607901D0 (en) 2016-05-05 2016-06-22 Ipsen Biopharm Ltd Chimeric neurotoxins
CN109476713A (zh) 2016-06-08 2019-03-15 儿童医学中心公司 工程改造的肉毒杆菌神经毒素
WO2018039506A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Engineered botulinum neurotoxin

Also Published As

Publication number Publication date
US20170226496A1 (en) 2017-08-10
SG10201606666XA (en) 2016-09-29
HUE053147T2 (hu) 2021-06-28
AU2018200409B2 (en) 2019-10-10
ZA201408757B (en) 2018-05-30
CN108178801B (zh) 2022-05-03
EP3372239A1 (en) 2018-09-12
BR112014029585A2 (pt) 2017-07-25
HUE037310T2 (hu) 2018-08-28
DK2854840T3 (en) 2018-03-05
EP2854840B1 (en) 2018-01-17
EP2854840A1 (en) 2015-04-08
IL235934B (en) 2020-04-30
CA3170993A1 (en) 2013-12-05
PL2854840T3 (pl) 2018-07-31
JP6839239B2 (ja) 2021-03-03
PL3372239T3 (pl) 2021-05-04
ES2661033T3 (es) 2018-03-27
MX2014014540A (es) 2015-02-24
JP2017212975A (ja) 2017-12-07
NZ702310A (en) 2016-08-26
US20150166972A1 (en) 2015-06-18
UA116985C2 (uk) 2018-06-11
JP6574218B2 (ja) 2019-09-11
AU2013267957A1 (en) 2014-12-18
US9598685B2 (en) 2017-03-21
JP6336970B2 (ja) 2018-06-06
US10844362B2 (en) 2020-11-24
IL235934A0 (en) 2015-01-29
DK3372239T3 (da) 2021-02-01
AU2013267957B2 (en) 2017-10-19
WO2013180799A1 (en) 2013-12-05
CA2874587C (en) 2022-11-08
CN104736166A (zh) 2015-06-24
MX2018011854A (es) 2020-09-02
PT3372239T (pt) 2021-02-02
EA029275B1 (ru) 2018-03-30
SG11201407784UA (en) 2014-12-30
US20190256834A1 (en) 2019-08-22
KR20150029656A (ko) 2015-03-18
JP2015519362A (ja) 2015-07-09
US10190110B2 (en) 2019-01-29
CN104736166B (zh) 2018-02-16
EA201492203A1 (ru) 2015-05-29
EP3372239B1 (en) 2020-11-11
JP2019216735A (ja) 2019-12-26
PT2854840T (pt) 2018-03-02
WO2013180799A9 (en) 2014-12-24
ES2847241T3 (es) 2021-08-02
KR102060355B1 (ko) 2019-12-31
AU2018200409A1 (en) 2018-03-01
MX359480B (es) 2018-09-28
HK1210692A1 (en) 2016-05-06
CN108178801A (zh) 2018-06-19
CA2874587A1 (en) 2013-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6839239B2 (ja) 操作されたボツリヌス神経毒素
US20220154160A1 (en) Engineered botulinum neurotoxin
JP7100020B2 (ja) 操作されたボツリヌス神経毒素
TW201130974A (en) Modified clostridial toxins comprising an integrated protease cleavage site-binding domain
RU2789302C2 (ru) Сконструированный ботулинический нейротоксин