JP2021517825A - Bacillus系を用いたボツリヌスニューロトキシンの生産 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、「PRODUCTION OF BOTULINUM NEUROTOXINS USING BACILLUS SYSTEMS」と題された、2018年1月30日に出願された米国仮出願第62/623715号の35U.S.C.§119(e)下における利益を主張し、この全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ボツリヌスニューロトキシン(BoNT)は、Clostridium botulinumにより産生される致死的な毒素である。これらの毒素は、具体的には、様々な脊椎動物の神経終末を標的とし、神経伝達物質放出を遮断し、通常「ボツリヌス中毒症」と呼ばれる弛緩性麻痺を引き起こし得る。BoNTの神経遮断活性は、とくに、BoNTの神経遮断活性は、特に眼瞼痙攣、斜視、上部運動ニューロン症候群、発汗、頸部ジストニア、および慢性片頭痛などの神経関連疾患の治療目的に利用することができる。BoNTはまた、化粧品産業においても幅広く使用されている。
本開示のいくつかの側面は、ボツリヌスニューロトキシン(BoNT)をBacillusにおいて組み換え的に生産する方法であって、BoNTを発現するための好適な条件下で、BoNTをコードするヌクレオチド配列を含むBacillus細胞を培養することを含む、前記方法を提供する。
いくつかの態様において、BoNTをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
いくつかの態様において、BoNTをコードするヌクレオチド配列は、Bacillusにおける発現のためにコドン最適化されている。
いくつかの態様において、方法は、BoNTをコードするヌクレオチド配列をBacillus細胞に送達することをさらに含む。いくつかの態様において、BoNTをコードするヌクレオチド配列は、形質転換、形質導入、抱合、および電気穿孔を介して送達される。
いくつかの態様において、Bacillus細胞は、Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、およびBacillus brevisからなる群から選択される。いくつかの態様において、Bacillus細胞は、野生型細胞である。いくつかの態様において、Bacillus細胞は、改変された細胞である。いくつかの態様において、Bacillusは、プロテアーゼ欠損Bacillus細胞である。
いくつかの態様において、BoNTをコードするヌクレオチド配列は、発現ベクター中に存在する。いくつかの態様において、発現ベクターは、pHT01、pHT08、pHT09、pHT10、pHT43、pHT253、pHT254、pHT255、pNZ8901、pNZ8902、pNZ8910、pNZ8911、pWH1520、pMM1522、pMM1525、pHIS1522、pHIS1525、pSTREP1525、pSTREPHIS1525、pC−His1622、pC−Strep1622、pN−His−TEV1622、pN−Strep−TEV1622、pN−StrepXa1622、pSTOP1622、p3STOP1623hp、pC−HIS1623hp、pN−His−TEV1623hp、pSP−LipA−hp、pSP−YocH−hp、p3STOP1623−2RBShp、pC−STREP1623hp、pN−STREP−Xa1623hp、pN−STREP_TEV1623hp、pMGBm19、pPT7、pPT7−SPlipA、pPconst1326、pBP26、pBP27、pBQ200、pGP380、pGP382、pGP886、pGP888、pGP1459、pGP1460、pGP1389、pBE−S、およびpRB374からなる群から選択される。
いくつかの態様において、BoNTをコードするヌクレオチド配列は、Bacillusにおける発現のためにコドン最適化されている。いくつかの態様において、BoNTは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、BoNT/En、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。いくつかの態様において、BoNTは、触媒的に不活性なBoNTである。いくつかの態様において、BoNTは、全長BoNTである。いくつかの態様において、BoNTは、キメラBoNTである。いくつかの態様において、BoNTは、配列番号1〜139のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、BoNTは、配列番号1〜139のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
添付の図面は、縮尺とおりに描かれることを意図していない。図面において、様々な図面に示されている同一またはほぼ同一の各構成要素は、同様の数字で表される。明確性のために、すべての構成要素がすべての図面においてラベル付けされているとは限らない。
ボツリヌスニューロトキシン(BoNT)は、Clostridium botulinumにより産生される致死的な毒素である。これらの毒素は、具体的には、様々な脊椎動物の神経終末末端を標的とし、神経伝達物質放出を遮断し、通常「ボツリヌス中毒症」と呼ばれる弛緩性麻痺を引き起こし得る。他方、毒素のこの特性は、とくに神経関連疾患の治療目的に利用することができる。BoNTはまた、化粧品産業においても幅広く使用されている。1960年代から、神経疾患の処置におけるBoNTの有効性が探究され、BoNTは現在、限定せずに、眼瞼痙攣、斜視、上部運動ニューロン症候群、発汗、頸部ジストニア、および慢性片頭痛などを含む、数多の神経疾患に現在幅広く使用されている。BoNTはまた、化粧品産業においても幅広く使用されている。1989年12月に、最初のBoNT製品であるBOTOXが、臨床処置のために、米国食品医薬品局(FDA)によって承認された。
いくつかの態様において、コードヌクレオチド配列は、その自然環境においてコードされた配列と通常関連しないプロモーターを指す、組み換えのまたは異種のプロモーターの制御下に配置され得る。かかるプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター;任意の他の細胞から単離されたプロモーター;および、例えば、当技術分野で知られている遺伝子工学の方法を通じて発現を変化させる異なる転写調節領域および/または突然変異の異なる要素を含有するものなどの、「天然に存在しない」合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、配列は、組み換えクローニングおよび/またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む核酸増幅技術(米国特許第4,683,202号および米国特許第5,928,906号を参照のこと)を使用して生産されてもよい。
いくつかの態様において、本開示の誘導性プロモーターは、原核細胞(例として、細菌細胞)からのものである。原核細胞において使用するための誘導性プロモーターの例は、限定せずに、バクテリオファージプロモーター(例として、Pls1con、T3、T7、SP6、PL)および細菌プロモーター(例として、Pbad、PmgrB、Ptrc2、Plac/ara、Ptac、Pm)、またはそれらのハイブリッド(例として、PLlacO、PLtetO)を含む。本開示に従って使用するための細菌プロモーターの例は、限定せずに、正に調節されたσ70プロモーター(例として、誘導性pBad/araCプロモーター、Luxカセットライトプロモーター、改変されたラムダPrmプロモーター、plac Or2−62(正)、さらなるREN部位を有するpBad/AraC、pBad、P(Las) TetO、P(Las) CIO、P(Rhl)、Pu、FecA、pRE、cadC、hns、pLas、pLux)、σSプロモーター(例として、Pdps)、σ32プロモーター(例として、ヒートショック)およびσ54プロモーター(例として、glnAp2)などの正に調節されたE. coliプロモーター;負に調節されたσ70プロモーター(例として、プロモーター(PRM+)、改変されたラムダPrmプロモーター、TetR−TetR−4C P(Las) TetO、P(Las) CIO、P(Lac) IQ、RecA_DlexO_DLacO1、dapAp、FecA、Pspac−hy、pcI、plux−cI、plux−lac、CinR、CinL、グルコース制御され、改変されたPr、改変されたPrm+、FecA、Pcya、rec A(SOS)、Rec A(SOS)、EmrR調節、BetI調節、pLac_lux、pTet_Lac、pLac/Mnt、pTet/Mnt、LsrA/cI、pLux/cI、LacI、LacIQ、pLacIQ1、pLas/cI、pLas/Lux、pLux/Las、LexA結合部位を有するpRecA、リバースBBa_R0011、pLacI/ara−1、pLacIq、rrnB P1、cadC、hns、PfhuA、pBad/araC、nhaA、OmpF、RcnR)、σSプロモーター(例として、代替のシグマ因子σ38を有するLutz−Bujard LacO)、σ32プロモーター(例として、代替のシグマ因子σ32を有するLutz−Bujard LacO)、およびσ54プロモーター(例として、glnAp2)などの負に調節されたE. coliプロモーター;抑制性B. subtilisσAプロモーター(例として、グラム陽性IPTG誘導性、Xyl、hyper−spank)およびσBプロモーターなどの負に調節されたB. subtilisプロモーターを含む。他の誘導性微生物プロモーターは、本開示に従って使用されてもよい。
いくつかの態様において、Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、およびBacillus anthracis、およびBacillus brevis。
C. botulinumはグラム陽性細菌であり、モデル細菌であるBacillus subtilisに進化的に近いが、E. coliには遺伝的に遠い(図1)。この研究では、BacillusにおけるBoNTの発現の可能性を探る。発現宿主としてBacillusを使用することによるいくつかの利点には以下のものがある:(1)Bacillus種は、BoNTの天然の宿主であるC. botulinumに進化的に最も近い。したがって、Bacillus種は、これらのトキシンのタンパク質翻訳と連関する折り畳みのためのより良い内部環境を提供する可能性がある。既知の例は、TcdA/BトキシンはBacillus megateriumにおいては十分に発現することができるが、E. coliにおいては発現できないことである。(2)B. subtilisはよく研究されている細菌のモデル生物であり;この細菌種において、遺伝子操作は非常に修正可能である。したがって、この細菌を宿主として使用する場合、タンパク質操作は実現可能であり得る。(3)B. subtilisを使用する場合の細胞培養とタンパク質精製のコストは比較的低い。よって、この系は大規模なタンパク質生産に極めて好適である。(4)B. subtilisは、ヒトの一般的な腸の共生生物として知られており、通常はGRAS(一般に安全と認められている)生物と考えられている。食品医薬品局(FDA)は、B. subtilisの非毒素性および非病原性株からのタンパク質生成物は幅広く入手可能であり、様々な食品用途において安全に使用されていると述べている。Bacillus細菌で成功裏に生産されている生成物には、アミラーゼ、ヒアルロン酸、ポリヒドロキシアルカノアート、および多くの抗生物質を含む。組み換えタンパク質発現技法の予測不可能性に起因して、無傷で活性なBoNTをBacillusにおいて高収率で生産できるかは未だ試験されていない。
全長BoNT/A、BoNT/BおよびBoNT/Eの結晶構造はこれまでに解明されており、これらの分子の全体像を与えている。これらの150kdの分子内には多くのジスルフィド結合が見出されず、これは、酸化環境または追加の酸化的な補因子がBoNTの生産に必須でないことを示唆しており;C. botulinumは嫌気性菌であるため、これは予想される。疎水性および親水性残基の表面分布は、BoNT/AおよびBoNT/Bのようなこれらの毒素にわたって比較的均一である(図2A〜2B)。
ここに、改善されたタンパク質の品質と収率を有するB. subtilisにおける全長BoNTを発現させるための新しいプロトコルが開発された。このプロトコルは、科学的研究のための全長BoNTとそのバリアントを生産するために、医学療法または化粧品のための活性トキシンを生産するために、および天然/組み換えトキソイドワクチンの開発のために使用することができる。
当業者は、本明細書に記載の態様の通常の実験法、多くの均等物のみを使用して認識または確認することができる。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図しておらず、むしろ添付のクレームに記載されているとおりである。
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、1以上を意味し得るが、ただし反対の定めがあるかまたは文脈から別様に明らかである場合を除く。1つの群の2以上のメンバーの間に「または」を含むクレームまたは記載は、群のメンバーの1つ、1つより多く、または全てが存在する場合、満たされていると見なされるが、ただし反対の定めがあるかまたは文脈から別様に明らかである場合を除く。2以上のメンバーの群の間に「または」を含む群の開示は、群の正確に1つのメンバーが存在する態様、群の1より多くのメンバーが存在する態様、および群の全てのメンバーが存在する態様を提供する。簡潔にするために、これらの態様は、本明細書では個別に詳述されていないが、これらの態様のそれぞれが本明細書で提供され、具体的に請求または放棄されてもよいことが理解される。
加えて、本開示の任意の特定の態様は、1以上のクレームから明示的に除外される場合があることは理解されるべきである。範囲が与えられている場合、範囲内の任意の値は、1以上のクレームから明示的に除外されてもよい。任意の態様、要素、特色、適用、または組成物の側面および/または本開示の方法は、任意の1以上のクレームから除外され得る。簡潔にするために、1以上の要素、特色、目的、または側面が除外される態様の全ては、本明細書に明示的に説明されない。
Claims (42)
- ボツリヌスニューロトキシン(BoNT)を生産する方法であって、BoNTを発現するために好適な条件下で、BoNTをコードするヌクレオチド配列を含むBacillus細胞を培養することを含む、前記方法。
- BoNTをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1に記載の方法。
- プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項2に記載の方法。
- BoNTをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクター中に存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 発現ベクターが、pHT01、pHT08、pHT09、pHT10、pHT43、pHT253、pHT254、pHT255、pNZ8901、pNZ8902、pNZ8910、pNZ8911、pWH1520、pMM1522、pMM1525、pHIS1522、pHIS1525、pSTREP1525、pSTREPHIS1525、pC−His1622、pC−Strep1622、pN−His−TEV1622、pN−Strep−TEV1622、pN−StrepXa1622、pSTOP1622、p3STOP1623hp、pC−HIS1623hp、pN−His−TEV1623hp、pSP−LipA−hp、pSP−YocH−hp、p3STOP1623−2RBShp、pC−STREP1623hp、pN−STREP−Xa1623hp、pN−STREP_TEV1623hp、pMGBm19、pPT7、pPT7−SPlipA、pPconst1326、pBP26、pBP27、pBQ200、pGP380、pGP382、pGP886、pGP888、pGP1459、pGP1460、pGP1389、pBE−S、およびpRB374からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- BoNTが、NまたはC末端において融合ドメインに融合されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 融合ドメインが、アフィニティータグである、請求項6に記載の方法。
- アフィニティータグが、His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、カルモジュリン、Softag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo、およびFcからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- BoNTをコードするヌクレオチド配列が、Bacillusにおける発現のためにコドン最適化されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- BoNTが、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、BoNT/En、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- BoNTが、触媒的に不活性なBoNTである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- BoNTが、全長BoNTである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- BoNTが、キメラBoNTである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- BoNTが、配列番号1〜139のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- BoNTが、配列番号1〜139のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の方法。
- BoNTをコードするヌクレオチド配列をBacillus細胞に送達することをさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- BoNTをコードするヌクレオチド配列が、形質転換、形質導入、抱合、および電気穿孔を介して送達される、請求項16に記載の方法。
- Bacillus細胞からBoNTを精製することをさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- BoNTが、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせを介して精製される、請求項18に記載の方法。
- Bacillus細胞が、Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、およびBacillus brevisからなる群から選択される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- Bacillus細胞が、野生型細胞である、請求項20に記載の方法。
- Bacillus細胞が、改変された細胞である、請求項20に記載の方法。
- Bacillusが、プロテアーゼ欠損Bacillus細胞である、請求項22に記載の方法。
- ボツリヌスニューロトキシン(BoNT)をコードするヌクレオチド配列を含む、Bacillus細胞。
- BoNTをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項24に記載のBacillus細胞。
- プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項25に記載のBacillus細胞。
- BoNTをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクター中に存在する、請求項24〜26のいずれか一項に記載のBacillus細胞。
- 発現ベクターが、pHT01、pHT08、pHT09、pHT10、pHT43、pHT253、pHT254、pHT255、pNZ8901、pNZ8902、pNZ8910、pNZ8911、pWH1520、pMM1522、pMM1525、pHIS1522、pHIS1525、pSTREP1525、pSTREPHIS1525、pC−His1622、pC−Strep1622、pN−His−TEV1622、pN−Strep−TEV1622、pN−StrepXa1622、pSTOP1622、p3STOP1623hp、pC−HIS1623hp、pN−His−TEV1623hp、pSP−LipA−hp、pSP−YocH−hp、p3STOP1623−2RBShp、pC−STREP1623hp、pN−STREP−Xa1623hp、pN−STREP_TEV1623hp、pMGBm19、pPT7、pPT7−SPlipA、pPconst1326、pBP26、pBP27、pBQ200、pGP380、pGP382、pGP886、pGP888、pGP1459、pGP1460、pGP1389、pBE−S、およびpRB374からなる群から選択される、請求項27に記載のBacillus細胞。
- BoNTが、NまたはC末端において融合ドメインに融合されている、請求項24〜28のいずれか一項に記載のBacillus細胞。
- 融合ドメインが、アフィニティータグである、請求項29に記載のBacillus細胞。
- アフィニティータグが、His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、カルモジュリン、Softag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo、およびFcからなる群から選択される、請求項30に記載のBacillus細胞。
- BoNTをコードするヌクレオチド配列が、Bacillusにおける発現のためにコドン最適化されている、請求項24〜31のいずれか一項に記載のBacillus細胞。
- BoNTが、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、BoNT/En、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項24〜32のいずれか一項に記載のBacillus細胞。
- BoNTが、触媒的に不活性なBoNTである、請求項24〜33のいずれか一項に記載のBacillus細胞。
- BoNTが、全長BoNTである、請求項24〜34のいずれか一項に記載のBacillus細胞。
- BoNTが、キメラBoNTである、請求項24〜32のいずれか一項に記載のBacillus細胞。
- BoNTが、配列番号1〜139のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項24〜36のいずれか一項に記載のBacillus細胞。
- BoNTが、配列番号1〜139のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項37に記載のBacillus細胞。
- Bacillus subtilis、Bacillus megaterium、およびBacillus anthracis、およびBacillus breviからなる群から選択される、請求項24〜38のいずれか一項に記載のBacillus細胞。
- Bacillus細胞が、野生型細胞である、請求項39に記載の方法。
- Bacillus細胞が、改変された細胞である、請求項39に記載の方法。
- Bacillusが、プロテアーゼ欠損Bacillus細胞である、請求項41に記載の方法。
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