CN107624115B - 肉毒神经毒素特异性捕获剂、组合物、使用方法和制造方法 - Google Patents

肉毒神经毒素特异性捕获剂、组合物、使用方法和制造方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供了稳定的基于肽的肉毒神经毒素(BoNT)A型捕获剂、以及作为检测试剂和诊断试剂使用以及在治疗疾病和病症中使用的方法。该申请还提供了使用迭代珠粒原位点击化学制备BoNT A型捕获剂的方法。

Description

肉毒神经毒素特异性捕获剂、组合物、使用方法和制造方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年3月16日提交的美国临时专利申请第62/133,891号的优先权，通过引用将其全部内容并入本文。
背景技术
肉毒神经毒素(BoNT)A型是已知的最致命的毒素。BoNT是由细菌属(梭菌属)的一些菌种产生，并且是一种化学去神经锌依赖性蛋白酶，其通过切割突触小泡形成和释放所需的三种SNARE蛋白之一来阻止神经肌肉接点中的Ca2+诱发的乙酰胆碱释放。BoNT/A中毒是通过以下进行的：选择性结合神经元受体，通过受体介导的内吞作用进入细胞，通过pH诱导的易位逃离胞内体，最后在细胞质切割其SNAP-25底物。BoNT/A由结合受体的重链和二硫键连接的催化性轻链(LC)组成。这种二硫键需要是完整的而对神经元产生毒害，但是对于LC在细胞质中起催化作用而需将其破坏。亚域(“带”)在结构上地封闭了完整全毒素活性位点，使得药物诱导的抑制仅仅在带释放后才发生，而这通过细胞质环境的二硫键的还原得以促进。BoNT毒素快速地螯合至运动神经元中，限制了目前基于抗体的疗法，然而分子抑制剂不能进入循环BoNT的封闭活性位点。BoNT是潜在致命性生物武器，又是治疗剂和美容剂，同时伴随着意外的过量给药的风险。仍需要强有力和有效的抑制剂。
发明内容
本公开涉及设计成与肉毒神经毒素(BoNT)A型结合的化学合成的捕获剂(称为蛋白质催化的捕获剂或PCC试剂)、制备所述捕获剂的方法、使用所述捕获剂的方法，以抑制BoNT A型以及治疗或预防肉毒中毒或肉毒毒素中毒。
在一个方面，本文提供了特异性结合BoNT A型的稳定的合成捕获剂，其中肉毒神经毒素A型蛋白包含重链和轻链，其中轻链包含酶活性位点，其中捕获剂包含锚定配体和第二配体，其中锚定配体和第二配体选择性结合BoNT A型。
在另一方面，本文提供了包含一种以上的本发明的特异性结合BoNT A型的合成捕获剂的组合物。
在另一方面，本文提供了用于检测生物样品中BoNT A型的方法，包括使用一种以上的本发明捕获剂处理生物样品的步骤。
在另一方面，本文提供了抑制在有需要的受试者的一个以上的神经元中由肉毒神经毒素A型蛋白介导的SNAP-25切割的方法，所述方法包括向神经元给予有效量的一种以上的本发明的捕获剂。
在另一方面，本文提供了治疗有需要的受试者肉毒中毒的方法，所述方法包括给予治疗有效量的一种以上的本发明的捕获剂。
锚定配体
在捕获剂的一个实施方式中，锚定配体特异性地结合BoNT A型的酶活性位点。在另一个实施方式中，锚定配体包含式Dab(DNP)-R-Lys(N3)-T-Dab-Pra-L-NH-(SEQ ID NO:2)的环肽，其中N3部分和Pra部分一起表示Tz4键或Tz5键。在另一个实施方式中，锚定配体包含式Inh-1的分子
Figure GDA0001410449800000021
其中R1不存在或者是连接至第二配体的接头。
第二配体
在一个实施方式中，第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型蛋白上距离肉毒神经毒素A型蛋白的酶活性位点3-10埃的位点。在另一个实施方式中，第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型轻链。在另一个实施方式中，第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型全毒素的封闭构象。在另一个实施方式中，第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型轻链的第166-179位残基。在另一个实施方式中，第二配体包含式-Pra-NYRWL-Lys(N3)(SEQ ID NO:7)的环肽，其中N3部分和Pra部分一起表示Tz4键或Tz5键。在另一个实施方式中，第二配体包含式L2的分子
Figure GDA0001410449800000031
其中R2不存在或者是连接至锚定配体的接头。
在另一个实施方式中，第二配体选自由针对110万单元(element)的大环5-聚体肽文库筛选的BoNT轻链的第166-179位残基构成的表位。在另一个实施方式中，文库针对相同表位的加扰版本是抗筛选的。
接头
在一个实施方式中，本文所描述的捕获剂包含接头。在某些实施方式中，接头是三肽。例如，接头可以包含氨基酸序列Gly-Aib-Leu或Leu-Aib-Gly。在其它实施方式中，接头包含PEG4。
在某些实施方式中，锚定配体和/或第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)或通过1,5-取代的1,2,3-三唑残基(Tz5)连接至接头。在其它实施方式中，锚定配体通过Tz4连接至接头。
在某些实施方式中，接头的长度为3-10埃。在其它实施方式中，接头的长度为5-8埃。在其它实施方式中，接头的长度在锚定配体和第二配体之间距离的100％至110％之间。
三唑连接
在捕获剂的一个实施方式中，锚定配体和第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)连接在一起。在另一个实施方式中，第二配体和第三配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)连接在一起。在另一个实施方式中，第三配体和第四配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)连接在一起。在另一个实施方式中，锚定配体和第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基连接在一起，并且第二配体和第三配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基连接在一起。在另一个实施方式中，锚定配体和第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基连接在一起，并且第二配体和第三配体通过1,4-取代的1,3-三唑残基连接在一起，并且第三配体和第四配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基连接在一起。
双配体
在一个实施方式中，本发明的捕获剂是双配体，其包含锚定配体和第二配体。第二配体的非限制性实例也在图16中公开。
在某些实施方式中，捕获剂包含式Inh-2的分子
Figure GDA0001410449800000041
其中R3是氢、封端基团(例如，酰胺)，或者包含标记或自发转位肽。
性质
在某些实施方式中，本文提供的BoNT A型捕获剂在较宽范围的温度、pH、储存时间、储存条件和反应条件下是稳定的，并且在某些实施方式中，捕获剂比可比较的抗体或生物制品更稳定。在某些实施方式中，捕获剂作为冻干粉末储存是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在约-80℃至约60℃的温度下储存是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在室温下是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在人血清中稳定至少24个小时。在某些实施方式中，捕获剂在约3至约12范围内的pH下是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在约60℃的温度下作为粉末在两个月内是稳定的。
可检测的标记物
在一些实施方式中，捕获剂标记有选自由以下所组成的组的标记物：生物素、铜-DOTA、生物素-PEG3、氨氧基乙酸酯、19FB、18FB、FITC-PEG3、荧光素和荧光素衍生物(例如，5-羧基荧光素)。在其它实施方式中，捕获剂标记有由64Cu DOTA、68Ga DOTA、18F、64Cu、68Ga、89Zr、124I、86Y、94mTc、110mIn、11C和76Br所组成的可检测部分。在其它实施方式中，标记物是荧光标记物。在一个具体实施方式中，可检测的标记物是18F。
转位肽
在一些实施方式中，捕获剂包含转位肽。这些转位肽允许捕获剂进入真核细胞。在某些实施方式中，这些真核细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方式中，这些哺乳动物细胞是人类细胞。在某些实施方式中，转位肽是自发转位肽。任选地，自发转位肽包含氨基酸序列pliylrllrGqf(SEQ ID NO:24)。
可以使用的其它转位肽包括HIV-TAT、穿透素、SynB1、SynB2、PTD-4、PTD-5、FHVCoar(35-49)、BMV Gag(7-25)、HTLV-II Rex 4-16)、D-Tat、R9-Tat、运输蛋白、MAP、SBP、FBP、MPG、Pep-1、Pep-2、聚精氨酸或聚赖氨酸。可以使用与任何转位肽或其片段至少90％相同的任何序列。
方法与用途
本文提供了抑制在有需要的受试者的一个以上的神经元中由肉毒神经毒素A型蛋白介导的SNAP-25切割的方法，该方法包括向神经元给予有效量的本文提供的捕获剂。在某些实施方式中，BoNT A型活性的抑制导致治疗或预防肉毒中毒或肉毒毒素中毒。
捕获剂的合成
本文提供了制备(即合成)本发明的BoNT A型捕获剂的方法。在一个实施例中，该方法包括以下步骤：
a.鉴定在不同表位结合至相同靶肽的锚定配体和第二配体；
b.鉴定靶肽上的锚定配体和第二配体的结合位点；
c.计算锚定配体与第二配体的结合位点之间的距离；和
d.选择接头以将锚定配体连接至第二配体，从而产生捕获剂，其中用于结合靶蛋白的捕获剂的解离常数低于用于结合靶蛋白的锚定配体或第二配体的解离常数。
在一个实施例中，该方法进一步地包括以下步骤：
e.合成包含步骤(a)的锚定配体和第二配体以及步骤(d)的接头的捕获剂。
在一个实施方式中，使用接头将锚定配体和第二配体连接。在某些实施方式中，在锚定配体和第二配体都与肉毒神经毒素A型蛋白结合时，接头的长度为两者配体之间距离的100％至110％之间。
本文还提供了制备(即合成)本发明的BoNT A型捕获剂的方法。在一个实施方式中，该方法包括以下步骤：
a.选择特异性结合肉毒神经毒素A型蛋白的酶活性位点的锚定配体；
b.选择与在肉毒神经毒素A型蛋白上的与锚定配体的表位不同且相距5-10埃内的表位特异性结合第二配体；和
c.将锚定配体和第二配体连接在一起；
其中，第二配体需要与表位结合，使得该第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型全毒素的封闭构象，从而合成用于抑制一个以上的神经元中由肉毒神经毒素A型蛋白介导的SNAP-25切割的捕获剂。
附图说明
图1：BoNT/A的双配体抑制剂的开发。Inh-1(橙色，Dab(DNP)-R-Lys(N3)-T-Dab-Pra-L-R1(SEQ ID NO:3))是基于BoNT LC的天然肽底物和先前对拟肽底物模拟物的结构研究的。使用表位靶向以筛选靶向在全毒素封闭带(红色)存在下暴露的邻近的非结构化表位(BoNT LC 166-179，绿色)的第二配体。被选择的配体(L2，红色，R2-Pra-NYRWL-Lys(N3)(SEQ ID NO:7))选自1100000单元(member)的大环肽文库。
图2：用于二价配体开发的接头筛选。用C-末端叠氮化物和生物素标签合成Inh-1，该生物素标签用于原位点击筛选的示值读数并用于溶液，而用N-末端炔烃和Tentagel树脂上的一至五个单元的寡肽的全面接头文库合成L2。进行原位蛋白催化的点击筛选以选择最低限度扰动的正确定向的接头，并产生击中序列Gly-Aib-Leu和Leu-Aib-Gly。作为比较，还将PEG4接头用于初步测定(参见图18和19)。Inh-2是为了将来所有检测而选择的双配体。
图3A-3D：体外配体结合和抑制的表征。图3A)Inh-1的抑制曲线(左轴)和荧光偏振结合曲线(右轴)。通过Hill曲线拟合获得的抑制IC50值为70±10nM以及kD值为68±29nM。图3B)化合物L2的抑制曲线(左轴)和荧光偏振结合曲线(右轴)。未观察到抑制，测定出kD值为78±8nM。图3C)比较Inh-1(粉红)与Inh-2(红色)的抑制曲线。观察到IC50值分别为60±11nM和165±15pM。图3D)结合至还原的BoNT/A全毒素(有效的活性位点)和完整BoNT/A全毒素(带封闭的)的化合物的单点ELISA结合数据。误差条表示重复的标准偏差。
图4A和4B：配体在具有BoNT全毒素的源自hiPSC的神经元系统中的抑制作用。图4A)顶部图示出了针对β-微管蛋白(对照)和SNAP(切割的和未切割的)的神经元裂解物的蛋白质印迹。切割的SNAP产物在蛋白质印迹中作为更长的运行条带出现在完整SNAP的运行条带下方。用各种浓度的化合物Inh-1和Inh-2以及已知的抑制内吞作用的多克隆绵羊抗-BoNT重链抗体进行测定。下部图示出了完整SNAP百分比相对于配体浓度的函数。将百分数计算为完整条带的累积强度与条带的总共累积强度的比值。图4B)顶部图示出了FM1-43突触小泡染料加载后和在存在或不存在现有的BoNT中毒下去极化后的活神经元的代表性荧光图像；比例尺:40μm。下部图示出了在含有1μM所相关的添加化合物的所有条件下，基于每个细胞的突触小泡染色的平均累积强度。误差条表示重复的标准偏差。
图5A-5C：拯救BoNT中毒的源自hiPSC的神经元。图5A)55U大剂量毒素暴露(i)和用2U毒素孵育24小时(ii)的实验时间表。通过利用1μm抑制性抗-BoNT pAb或Inh-2-STP预孵育毒素来评估保护作用，并且在暴露于毒素后1小时、3小时和12小时时通过裂解细胞评估拯救效应，这种评估是通过蛋白质印迹分析和密度测定将SNAP切割进行定量。在所有情况下，细胞在毒素暴露后24小时时被裂解。图5B)在图5A所示的拯救实验之后，针对β-微管蛋白(对照)和SNAP(切割的和未切割的)的神经元裂解物的代表性蛋白质印迹。切割的SNAP产物在蛋白质印迹中作为更长的运行条带出现在完整的SNAP下方。图5C)完整SNAP百分比相对于处理前暴露时间的函数。将百分比计算为完整条带的累积强度与条带的总共累积强度的比值。误差条表示重复的标准偏差。
图6：点击环化的BoNT LC抑制剂(1nh-1)(生物素化的)。序列Dab(DNP)-R-[Lys(N3)-T-Dab-Pra]-L-PEG4-生物素(SEQ ID NO:4)，其中方括号表示闭合环。预计的m/z为1518.77，测量的m/z为1518.61。
图7：点击环化的BoNT LC抑制剂(Inh-1)(荧光素)。序列Dab(DNP)-R-[Lys(N3)-T-Dab-Pra]-L-Lys(PEG5-生物素)(SEQ ID NO:5)，其中方括号表示闭合环。预计的m/z为1779.82，测量的m/z为1780.11。
图8：L-2环状次结合体(生物素化的)。序列生物素-PEG5-[Pra-NYRWL-Lys(N3)](SEQ ID NO:11)，其中方括号表示闭合环。预计的m/z为1516.75，测量的m/z为1516.35。
图9：L-2环状次结合体(荧光素)。序列荧光素-PEG5-[Pra-NYRWL-Lys(N3)](SEQID NO:11)，其中方括号表示闭合环。预计的m/z为1648.72，测量的m/z为1648.89。
图10：具有原位选择的G-Aib-I接头的二价抑制剂(1hh-2)。序列NH2-Dab(DNP)-R-[Lys(N3)-T-Dab-Pra]-L-Lys(生物素)-Tz4-G-Aib-l-[Pra-NYRWL-Lys(N3)](SEQ ID NO:12)，其中方括号表示闭合环。预计的m/z为2848.44，测量的m/z为2851.23。
图11：文献310螺旋BoNT LC抑制剂(生物素化的)。序列Dab(DNP)-RWT-Dab-ML-PEG4-生物素(SEQ ID NO:14)。预计的m/z为1586.81，测量的m/z为1586.16。
图12：抑制性配体的初步ELISA曲线。通过夹心ELISA评估了候选底物模拟配体BoNTLC结合，并与文献抑制剂(蓝色)进行了比较。
图13A-13C：代表性的体外BoNT LC活性测定。典型的时间-荧光迹线示出了具有不同浓度的BoNT LC的SNAP-25FRET底物的切割，其中最初2000秒放大并拟合成Vmax初始斜率以收集动力学数据。示出了观察到的Vmax相对于BoNT LC浓度的函数。
图14：生物素化的BoNT LC片段的MALDI-TOF谱图。BoNT LC的第166-179位氨基酸。序列Lys(N3)-SFGHEVLNLTRN-PEG4-生物素(SEQ ID NO:15)。预计的m/z为2099.09，测量的m/z为2099.45。
图15：生物素化的加扰片段的MALDI-TOF谱图。序列Lys(N3)-NGTLFNLSELRH-PEG4-生物素(SEQ ID NO:16)。预计的m/z为2099.09，测量的m/z为2098.06。
图16：表位靶向筛选的击中序列的列表。通过Edman降解对珠粒测序，相同颜色表示相似的侧链残基以更好地说明同源性，破折号表示点击环中涉及的氨基酸。
图17：用于靶标导向筛选的点击环化的BoNT LC抑制剂(lnh-1)。序列Dab(DNP)-R-[Lys(N3)-T-Dab-Pra]-L-Lys(生物素)-Lys(N3)(SEQ ID NO:6)。预计的m/z为1510.77，测量的m/z为1510.90。
图18：具有PEG4接头的二价抑制剂(Inh-2)。序列NH2-Dab(DNP)-R-[Lys(N3)-T-Dab-Pra]-L-Lys(生物素)-Tz4-PEG4-[Pra-NYRWL-Lys(N3)](SEQ ID NO:19)。预计的m/z为2801.38，测量的m/z为2799.45。
图19：单点夹心ELISA以比较BoNT配体变体。将肽固定在浓度为1μM的中性亲和素树脂上，并在3％BSA中封闭3小时。将结合的配体与50nM BoNT LC-GST缀合物或空白缓冲液孵育3小时。按照方案详述的，用抗-GST-HRP mAb检测ELISA，并进行显影。
图20：具有g-Aib-I接头和STP的二价抑制剂(Inh-2-STP)。序列NH2-Dab(DNP)-R-[Lys(N3)-T-Dab-Pra]-L-Lys(DBCO-STP)-Tz4-G-Aib-I-[Pra-NYRWL-Lys(N3)](SEQ IDNO:12)，其中STP是D-肽Lys(N3)-pliyirlirGqf(SEQ ID NO:22)。预计的m/z为4533.21，测量的m/z为4536.45。
图21：iCell神经元中的神经突生长。根据制造商的说明书，利用神经突染色和活力染色(Life Technologies)将铺板4天后的神经元进行染色，染色包括钙黄绿素活力染色(绿色)和Dil C18膜染色(蓝色)。所有细胞示出了与神经元生长一致的形态。
图22A-22D：iCell神经元中的突触小泡再循环。在铺板后15天的活神经元上的FM1-43染色(黄色)和核染色(红色)。图22A)FM1-43标记的对照细胞，无去极化图22B)去极化后的FM1-43标记的BoNT中毒细胞，图22C)去极化后的FM1-43标记的对照细胞，图22D)未标记的BoNT中毒细胞。在SI步骤中描述了所有标记和去极化。
图23：突触小泡强度的图像分析。通过ImageJ分析图像。使用分水岭分析以发掘传输通道中神经元细胞体的边缘，并为每个细胞分配给定的细胞间区域。然后将这些区域映射到FM1-43层，并使用PunctaAnalyzer软件包计数每个区域中的点，同时忽略先前鉴定的细胞体，以便仅发掘沿着神经突的突触小泡点。将在两个孔内的为每个细胞计数的点平均化，每个孔具有两个观察视野。
图24：评价STP对极性物质的细胞质递送。肽序列为Cy5-DBCO-Lys(N3)-pliyIrlIrGqf(SEQ ID NO:25)。将浓度为1μM的细胞处理30分钟。孵育完成后，用神经元培养基将细胞洗涤一次，用HBSS洗涤两次。用NucBlue Live Readyprobe(LifeTechnologies)的建议稀释液最后一次洗涤细胞，以便使细胞核可视化。
具体实施方式
本文提供了特异性结合肉毒神经毒素A型并抑制其切割神经元中的SNAP-25的能力的捕获剂。在一个实施方式中，捕获剂包含至少两个配体。两个配体中的一个特异性地结合位于肉毒神经毒素A型的轻链上的酶活性位点，另一个配体结合肉毒神经毒素A型蛋白的不同位置。根据某些实施方式，第二结合位点在第一结合位点的3-10埃内。根据其它实施方式，结合第二结合位点的配体能够特异性地结合肉毒神经毒素A型全毒素的封闭构象。根据其它实施方式，第二结合位点也位于肉毒神经毒素A型的轻链上。
根据某些实施方式，选择与肉毒神经毒素A型蛋白的酶活性位点结合的锚定配体。该酶活性位点位于蛋白质的轻链上。根据某些实施方式，锚定配体抑制肉毒神经毒素A型蛋白的酶活性位点的活性。根据一些实施方式，锚定蛋白以10至1000nM之间的抑制常数抑制肉毒神经毒素A型蛋白的活性。根据其它实施方式，抑制常数在10至200nM之间。根据其它实施方式，抑制常数在30至100nM之间、50至80nM之间或65至75nM之间。根据某些实施方式，抑制常数为约70nM。
根据某些实施方式，选择也与肉毒神经毒素A型蛋白结合的第二配体。在某些实施方式中，第二配体能够结合肉毒神经毒素A型全毒素的封闭构象。在某些实施方式中，第二配体结合至与锚定配体的结合位点足够接近的表位，因此可以提供接头将这两个配体连接。在某些实施方式中，作为筛选组合文库的结果是选择了第二配体。
根据某些实施方式，选择将两个配体连接的接头。在某些实施方式中，在这两个配体与肉毒神经毒素A型蛋白结合时，接头的长度是精确的并且与这两个配体的至少一部分之间的距离接近。在某些实施方式中，配体的部分是N-末端或C-末端。在一个实施方式中，接头的长度等于两个结合位点的平均间距的均方根。在某些实施方式中，作为筛选组合接头文库的结果是选择了接头。
本发明的以下描述仅旨在说明本发明的各种实施方式。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种等同、改变和修改，并且应当理解，本文包括这些等效实施方式。
除非上下文另有要求，否则贯穿整个本说明书和权利要求书，单词“包括(comprise)”及其变体，例如“包含(comprises)”和“含有(comprising)”应解释为以开放性的、包含的意义，即“包括但不仅限于”。
贯穿整个说明书中对“一个(one)实施方式”或“(an)实施方式”的参考是指结合实施方式描述的特定的特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，贯穿整个本说明书的各个地方出现的短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”不一定全都是表示相同的实施方式。此外，特定的特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合在一个以上的实施方式中。
定义
如在本文中所使用的，术语“本发明的捕获剂(capture agent of theinvention)”和“一种以上的本发明的捕获剂(capture agents of the invention)”是指如本文所描述的结合肉毒神经毒素A型的合成蛋白质催化的捕获剂。
“氨基”是指-NH2基团。
“氰基”是指-CN基团。
“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”是指-OH基团。
“亚氨基”是指＝NH取代基。
“硝基”是指-NO2基团。
“氧代”是指＝O取代基。
“硫代”是指＝S取代基。
“烷基”是指仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链的烃链基团，其是饱和或不饱和的(即，含有一个以上的双键和/或三键)，具有1至12个碳原子(C1-C12烷基)，优选1至8个碳原子(C1-C8烷基)或1至6个碳原子(C1-C6烷基)，并且通过单键连接到分子的其余部分，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非说明书另有具体说明，否则烷基可以是任选取代的。
“亚烷基”或“亚烷基链”是指仅由碳和氢组成的直链或支链的二价烃链，其将分子的其余部分连接至基团，其是饱和或不饱和的(即，含有一个以上的双键和/或三键)，并且具有1至12个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基、亚丙炔基、亚正炔基等。亚烷基链通过单键或双键连接到分子的其余部分，并通过单键或双键与基团连接。亚烷基链与分子的其余部分和基团的连接点可以是通过链中的一个碳或任何两个碳的。除非在本说明书中另有具体说明，否则亚烷基链可以是任选取代的。
“烷氧基”是指式-ORa的基团，其中Ra是如上所定义的含有1至12个碳原子的烷基基团。除非在本说明书中另有具体说明，否则烷氧基可以是任选取代的。
“氨基羰基”是指式-C(＝O)NRaRa的基团，其中每个Ra独立地为H、烷基或接头部分。
“α-氨基羰基”是指式-C(＝O)CRb(NRaRa)-的基团，其中每个Ra独立地是H、烷基或接头部分，并且Rb是H或烷基。在一些实施方式中，α-氨基羰基是部分的环状部分(例如，肽)，其中羰基在环内并且氨基(NRaRa)在环外。例如，在某些实施方式中，α-氨基羰基可用于Edman降解环肽。
“α-酰氨基羰基”是指式-C(＝O)CRb(N(C＝O)RaRa)-的基团，其中每个Ra独立地是H、烷基或接头部分，并且Rb是H或烷基。在一些实施方式中，α-酰氨基羰基是部分的环状部分(例如，肽)，其中羰基在环内且酰氨基(N(C＝O)RaRa)在环外。
“烷基氨基”是指式-NHRa或-NRaRa的基团，其中每个Ra独立地是如上所定义的含有1至12个碳原子的烷基基团。除非在本说明书中另有具体说明，否则烷基氨基可以是任选取代的。
“硫代烷基”是指式-SRa的基团，其中Ra是如上定义的含有1至12个碳原子的烷基基团。除非在本说明书中另有具体说明，否则硫代烷基可以是任选取代的。
“芳基”是指包含氢、6至18个碳原子和至少一个芳环的烃环体系基团。为了本发明的目的，芳基基团可以是单环、双环、三环或四环系统，其可以包括稠合的或桥连的环系。芳基基团包括但不限于衍生自醋蒽烯、苊、醋菲烯、蒽、薁、苯、
Figure GDA0001410449800000121
荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、非那烯、菲、七曜烯、芘和三亚苯。除非在本说明书中另有具体说明，否则术语“芳基”或前缀“ar-”(如在“芳烷基”中的)是指包括任选被取代的芳基基团。
“芳烷基”是指式-Rb-Rc的基团，其中Rb是如上所定义的亚烷基链，并且Rc是如上所定义的一个以上的芳基基团，例如苄基、二苯基甲基等。除非在本说明书中另有具体说明，否则芳烷基可以是任选取代的。
“环烷基”或“碳环”是指仅由碳和氢原子组成的稳定的非芳族单环或多环烃基，其可以包括具有3至15个碳原子、优选具有3至10个碳原子的稠合或桥连环系，其是饱和或不饱和的且通过单键与分子的其余部分连接。单环基团包括，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环基团包括，例如金刚烷基、降冰片基、十氢化萘基、7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等。除非在本说明书中另有具体说明，否则环烷基可以是任选取代的。
“环烷基烷基”是指式-RbRd的基团，其中Rb是如上定义的亚烷基链，并且Rd是如上定义的环烷基基团。除非在本说明书中另有具体说明，否则环烷基烷基可以是任选取代的。
“稠合”是指本发明化合物中与现有环结构稠合的本文所描述的任何环结构。当稠合环是杂环基环或杂芳基环时，可以用氮原子代替成为稠合杂环基环或稠合杂芳基环的一部分的现有环结构上的任何碳原子。
“卤代”或“卤素”是指溴、氯、氟或碘。
“卤代烷基”是指被一个以上的如上定义的卤素基团取代的如上所定义的烷基基团，例如三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基等。除非在本说明书中另有具体说明，否则卤代烷基可以是任选取代的。
“杂环基”或“杂环”是指由2至12个碳原子和1至6个选自氮、氧和硫组成的组的杂原子组成的稳定的3至18元非芳族环基团。除非在本说明书中另有具体说明，否则杂环基基团可以是单环、二环、三环或四环系统，其可以包括稠合或桥连环系；并且杂环基基团中的氮、碳或硫原子可以任选被氧化；氮原子可以任选被季铵化；并且杂环基基团可以是部分或完全饱和的。这些杂环基基团的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。除非在本说明书中另有具体说明，否则杂环基可以是任选取代的。
“N-杂环基”是指含有至少一个氮的以上定义的杂环基基团，其中杂环基基团与分子的其余部分的连接点是通过杂环基基团中的氮原子的。除非在说明书另有具体说明，否则N-杂环基可以是任选取代的。
“杂环基烷基”是指式-RbRe的基团，其中Rb是如上所定义的亚烷基链，并且Re是如上定义的杂环基基团，如果杂环基是含氮杂环基，则杂环基可以在氮原子处连接到烷基基团。除非在本说明书中另有具体说明，否则杂环基烷基可以是任选取代的。
“杂芳基”是指包含氢原子、1至13个碳原子、1至6个选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子和至少一个芳环的5至14元环系基团。为了本发明的目的，杂芳基基团可以是单环，双环，三环或四环系统，其可以包括稠合或桥连环系；并且杂芳基基团中的氮、碳或硫原子可以任选被氧化；氮原子可以任选被季铵化。实例包括但不限于氮杂
Figure GDA0001410449800000131
基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚烷基、1,4-苯并二噁烷基、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二噁英基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并苯硫基)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并苯硫基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、吲哚啉基、异吲哚啉基、异喹啉基、吲嗪基、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、2-氧代氮杂
Figure GDA0001410449800000132
基、噁唑基、环氧乙烷基、1-氧化吡啶基、1-氧化嘧啶基、1-氧化吡嗪基、1-氧化哒嗪基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和噻吩基(即，噻吩基)。除非在本说明书中另有具体说明，否则杂芳基可以是任选取代的。
“N-杂芳基”是指含有至少一个氮的如上定义的杂芳基基团，其中杂芳基基团与分子的其余部分的连接点是通过杂芳基基团中的氮原子的。除非在本说明书中另有具体说明，否则N-杂芳基可以是任选取代的。
“杂芳基烷基”是指式-RbRf的基团，其中Rb是如上定义的亚烷基链，并且Rf是如上定义的杂芳基基团。除非在本说明书中另有具体说明，否则杂芳基烷基可以是任选取代的。
如在本文中所使用的术语“取代的”是指任何上述基团(例如，烷基、亚烷基、烷氧基、烷基氨基、氨基羰基、α-氨基羰基、α-酰氨基羰基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基)，其中至少一个氢原子被非氢原子的键所取代，例如但不限于：卤素原子，如F、Cl、Br和I；如羟基、烷氧基和酯基的基团中的氧原子；如硫醇基、硫代烷基、砜基、磺酰基和亚砜基的基团中的硫原子；如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺的基团中的氮原子；如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基的基团中的硅原子；和其它各种基团中的其它杂原子。“取代的”还表示任何以上的基团，其中一个以上的氢原子被杂原子(如含氧的、羰基、羧基和酯基中的氧；和如亚胺、肟、腙和腈的基团中的氮)的高级键(例如，双键或三键)取代。例如，“取代的”包括任何以上的基团，其中一个以上的氢原子被-NRgRh、-NRgC(＝O)Rh、-NRgC(＝O)NRgRh、-NRgC(＝O)ORh、-NRgSO2Rh、-OC(＝O)-NRgRh、-ORg、-SRg、-SORg、-SO2Rg、-OSO2Rg、-SO2ORg、＝NSO2Rg和-SO2NRgRh取代。取代的”还表示任何以上的基团，其中一个以上氢原子被C(＝O)Rg、C(＝O)ORg、C(＝O)NRgRh、CH2SO2Rg、CH2SO2NRgRh取代。在上述中，Rg和Rh是相同或不同的，并且独立地是氢、烷基、烷氧基、烷氨基、烷硫基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基。“取代的”进一步地表示任何以上的基团，其中一个以上的氢原子被氨基、氰基、羟基、亚氨基、硝基、氧代、硫代、卤素、烷基、烷氧基、烷氨基、烷硫基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基的键取代。另外，上述取代基中的每一个也可以任选地被一个以上的上述取代基取代。
“前药”是指可以在生理条件下或通过溶剂分解转化为本发明的生物活性化合物的化合物。因此，术语“前药”是指药学上可接受的本发明化合物的代谢前体。在向有需要的受试者给予前药时，前药可以是无活性的，但是其在体内被转化成本发明的活性化合物。前药通常在体内被迅速地转化以产生本发明的母体化合物，例如通过在血液中水解。前药化合物通常在哺乳动物生物体中提供溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见，Bundgard，H.，Design of Prodrugs(1985)，页码：7-9、21-24(Elsevier，Amsterdam))。在Higuchi，T.等人，A.C.S.研讨会系列，第14卷以及1987年出版的Bioreversible Carriersin Drug Design(Edward B.Roche(编者)，American Pharmaceutical Association andPergamon Press(美国制药协会和佩加蒙出版社))中提供了关于前药的讨论。
术语“前药”还表示包含任何共价键合的载体，在向哺乳动物受试者给予此类前药时，前药将在体内释放本发明的活性化合物。本发明化合物的前药可以是通过将存在于本发明化合物中的官能团修饰而制备的，以这种方式，使修饰物以常规操作或在体内裂解为本发明的母体化合物。前药包含本发明的化合物，其中羟基、氨基或巯基与任意基团结合，使得在将本发明化合物的前药给予至哺乳动物受试者时，这些羟基、氨基或巯基被切割以分别地形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的实例包括但不限于本发明化合物中的醇官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或胺官能团的酰胺衍生物等。
本文公开的本发明还表示包括被同位素标记(通过具有一个以上的被具有不同原子质量或质量数的原子替代的原子)的结构(I)或(I')的所有药学上可接受的肽。可以掺入所公开的化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，分别地，如2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl、123I和125I。这些放射性标记的化合物可用于帮助确定或测量化合物的有效性，通过例如作用位点或作用方式，或与药理学上重要的作用位点的结合亲和力进行表征。本发明的某些同位素标记的肽(例如，掺入放射性同位素的那些)，可用于药物和/或底物组织分布研究。放射性同位素氚(即，3H)和碳-14(即，14C)对该目的特别有用，鉴于其易于掺入和便于检测的方式。
用较重的同位素如氘(即，2H)进行取代，由于代谢稳定性更大(例如，体内半衰期增加或剂量需求降低)，而可以产生某些治疗优点，因此在某些情况下可能是优选的。
用正电子发射同位素(如11C、18F、15O和13N)进行取代，可用于正电子发射断层成像(PET)研究中，用于检查底物受体占有率。同位素标记的肽通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或者通过类似于以下所述的制备和实施例中所描述的方法，使用适当的同位素标记的试剂(代替先前采用的未标记的试剂)进行制备。
本文公开的本发明还表示包括所公开的肽的体内代谢产物。这类产物可以是由于所给予化合物的例如氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等而产生的，主要是由于酶促过程。因此，本发明包括通过以下方法制备的化合物，该方法包括向哺乳动物给予本发明化合物，持续足以产生其代谢产物的时期。通常通过以下方式检测这类产物：通过向动物(如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或人)给予可检测剂量的本发明的放射性标记化合物，使时间足够用于进行新陈代谢，并从尿液、血液或其它生物样品中分离其的转化产物。
“哺乳动物”包括人类以及家畜，如实验室动物和家庭宠物(例如，猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔)和非家畜(如野生动物)等。
“突变体”或“变体”是指与野生型氨基酸序列具有高同源性但与野生型氨基酸序列不具有100％同一性的蛋白质。与突变体或变体相关的高同源性高于95％、96％、97％、98％或99％但小于100％。在某些实施方式中，突变体或变体与野生型序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸不同。
在某些实施方式中，BoNT A型的序列是指以下示出的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
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以上序列是全酶的完整序列。该全酶被切割成轻链肽和重链肽。在某些实施方式中，轻链由以上第1-448位氨基酸组成，重链由第449-1291位氨基酸组成。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况以及不发生的情况。例如，“任选取代的芳基”是指芳基基团可以是取代的或可以不是取代的，并且该描述既包括取代的芳基基团又包括不取代的芳基基团。
“药学上可接受的载体、稀释剂或辅料“包括但不限于任何佐剂、载体、辅料、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂，这些是被美国食品和药物管理局批准为可接受用于人或家畜的。
“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。
“药学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物学效力和性质的那些盐，其不具有生物学或其它方面的不利条件，并且由无机酸形成，例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，以及有机酸形成，例如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖醛酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
“药学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物学效力和性质的那些盐，其不具有生物学或其它方面的不利条件。这些盐是通过向游离酸中加入无机碱或有机碱而制备的。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。优选的无机盐是铵、钠、钾、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐，取代胺(包括天然存在的取代胺)的盐，环胺和碱性离子交换树脂(如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因)的盐。
本发明的化合物(肽)或其药学上可接受的盐可以含有一个以上的不对称中心，因此可产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构形式，这些立体异构形式可以根据绝对立体化学将氨基酸定义为(R)-或(S)-，或(D)-或(L)-。本发明旨在包括所有这些可能的异构体，以及它们的外消旋和光学纯的形式。光学活性(+)和(-)、(R)-和(S)-、或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂进行制备，或使用常规技术(例如，色谱法和分级结晶法)进行拆分。用于制备/拆分单个对映异构体的常规技术包括由合适的光学纯前体进行手性合成，或者利用例如手性高压液相色谱(HPLC)拆分外消旋物(或盐或衍生物的外消旋物)。除非另有说明，在本文所描述的化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心时，旨在化合物包括E几何异构体和Z几何异构体。同样地，所有的互变异构形式也被包括在内。在本文中(D)-氨基酸(也称为D-氨基酸)以小写字母表示(例如，D-缬氨酸称为“v”)，而(L)-氨基酸(本文也称作为L-氨基酸)以大写字母表示(例如，L-缬氨酸或缬氨酸被称为“V”)。甘氨酸是非手性的，称为“G”。
“立体异构体”是指由相同键键合的相同原子构成的化合物，但是具有不同的三维结构，其是不可互换的。本发明考虑了各种立体异构体及其混合物，并且包括“对映异构体”，其是指其分子是彼此不可重合的镜像的两种立体异构体。
“互变异构体”是指从分子的一个原子到同一分子的另一个原子的质子位移。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。
通常结晶产生本发明化合物的溶剂合物。如在本文中所使用的，术语“溶剂化物”是指包含一种以上的本发明化合物分子与一种以上的溶剂分子的聚集体。溶剂可以是水，在这种情况下，溶剂化物可以是水合物。可替换地，溶剂可以是有机溶剂。因此，本发明的化合物可以作为水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及相应的溶剂化形式。本发明的化合物可以是真正的溶剂合物，而在其它情况下，本发明的化合物可以仅仅保留外来水，或者是水与一些偶然溶剂的混合物。
如在本文中所使用的术语“捕获剂”是指包含一个以上的结合靶的部分并且经由那些结合靶的部分特异性结合靶蛋白的组合物。每个结合靶的部分单独地或与其它结合靶的部分组合显示出对靶蛋白的结合亲和力。在某些实施方式中，每个结合靶的部分通过一个以上的非共价相互作用结合靶蛋白，包括例如氢键、疏水相互作用和范德华相互作用。捕获剂可以包含一种以上有机分子，包括例如多肽、肽、多核苷酸和其它非聚合物分子。在某些方面，捕获剂是蛋白质催化的捕获剂(PCC)。
如在本文中所使用的术语“表位”是指蛋白质(例如，BoNT A型蛋白)的不同分子表面。通常，表位是多肽，并且它可以作为10-40个氨基酸的有限序列本身起作用。在本公开中，结合了至少两个表位。第一个表位涉及表位BoNT A型的酶活性位点。在某些实施方式中，锚定配体以高亲和力结合该酶活性位点，从而抑制其活性。在某些实施方式中，第二表位是BoNT A型全毒素的一部分，其以封闭构象暴露于溶剂中。例如，该表位可以是BoNT A型(轻链)的第166-179位氨基酸。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指包含氨基酸残基的聚合物的氨基酸序列。该术语适用于其中一个以上的氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物及其异构体。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及稍后被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸及其异构体。术语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团(例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)结合的碳。这样的类似物具有经过修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。术语“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的通常化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。在本文中氨基酸可以是通过其通常已知的三个字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号引用的。
如在本文中所使用的术语“非天然氨基酸”是指在其侧链官能度上与二十个天然存在的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)不同的氨基酸。非天然氨基酸可以是二十种天然氨基酸之一的紧密类似物，或者其可以引入全新的官能度和化学结构，只要非天然氨基酸的疏水性等于或大于天然氨基酸的疏水性。非天然氨基酸可以替代蛋白质的现有氨基酸(取代)，或者是野生型序列的添加物(插入)。可以通过已知的化学方法来实现非天然氨基酸的掺入，包括固相肽合成或天然化学连接，或通过生物学方法。非天然氨基酸可以包括2-氨基异丁酸(Aib)和炔丙基甘氨酸(Pra)。
如在本文中所使用的术语“特异性结合(specific binding)”、“选择性结合(selective binding)”、“选择性结合(selectively binds)”或“特异性结合(specifically binds)”是指与预先确定的抗原上的表位结合的捕获剂。通常，捕获剂以约小于10-5M，如约小于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M甚至更低的亲和力(KD)进行结合。
如在本文中所使用的术语“KD”是指特定捕获剂-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的捕获剂以小于约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M甚至更低的解离平衡常数(KD)结合至BoNT A型蛋白，例如，采用捕获剂作为配体和BoNT A型蛋白作为分析物，利用表面等离子体共振(SPR)技术以Biacore仪器进行测定，并且以比结合至非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)(而不是上述预先确定的抗原或紧密相关的抗原)的亲和力低至少10倍，如低至少100倍，例如低至少1000倍，如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍的相应KD的亲和力结合至BoNT A型蛋白。亲和力较低的量取决于捕获剂的KD，因此在捕获剂的KD非常低(即，捕获剂是高度特异性)时，则抗原的亲和力低于非特异性抗原的亲和力的量可以为至少10,000倍。
如在本文中所使用的术语“kd”(sec-1)是指特定捕获剂-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为koff值。
如在本文中所使用的术语“ka”(M-1×sec-1)是指特定捕获剂-抗原相互作用的结合速率常数。
如在本文中所使用的术语“KD”(M)是指特定捕获剂-抗原相互作用的解离平衡常数。
如在本文中所使用的术语“KA”(M-1)是指特定捕获剂-抗原相互作用的结合平衡常数，并且通过ka除以kd而获得。
“药物组合物”是指本发明的化合物和本领域通常所接受的用于将生物活性化合物递送至哺乳动物(例如，人类)的介质的制剂。这种介质包括其所有药学上可接受的载体、稀释剂或辅料。
如在本文中所使用的术语“病症”通常是指疾病、事件或健康状况的变化。健康状况的变化可能与特定疾病或事件相关，在这种情况下，该变化可能与疾病或事件同时发生或在疾病或事件之前发生。在健康状况的变化于疾病或事件之前发生的情况下，健康状况的变化可能作为疾病或事件的预测因素。例如，健康状况的变化可能是与疾病或事件相关的特定基因的表达水平的改变。可替换地，健康状况的变化可能与特定疾病或事件无关。在具体实施方式中，该病症是肉毒中毒或肉毒毒素中毒。
如在本文中所使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”通常是指预防病症或事件、减缓病症的发病或发展速度或延缓事件的发生、降低病症发展或经历事件的风险、预防或延缓与病症或事件相关的症状的发展、减少或终止与病症或事件相关的症状、使病症完全或部分消退、减轻病症或事件的严重性或其某种组合。
如在本文中所使用的“有效量”或“治疗有效量”指在实现期望治疗结果所需要的剂量和时间段内有效的量。捕获剂的治疗有效量可以根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及捕获剂在个体内引起期望反应的能力而变化。
如在本文中所使用的术语“抗体”是指在抗原刺激后由活化的B细胞产生的并且可以与促进生物系统中的免疫应答的抗原特异性结合的那种蛋白质。完整抗体通常由四个亚基组成，包括两条重链和两条轻链。术语抗体包括天然抗体和合成抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体或其片段。示例性的抗体包括IgA、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgM等。示例性的片段包括Fab、Fv、Fab'、F(ab')2等。单克隆抗体是特异性结合至另一种生物分子的单一特定空间的和极性的组织(被称为“表位”)的抗体，并因此被限定为与另一种生物分子的单一特定空间的和极性的组织(被称为“表位”)互补。在一些形式中，单克隆抗体也可以具有相同的结构。多克隆抗体是指不同单克隆抗体的混合物。在一些形式中，多克隆抗体可以是单克隆抗体的混合物，其中至少两种单克隆抗体结合至不同的抗原表位。不同的抗原表位可以在相同靶标、不同靶标或组合上。抗体可以通过本领域众所周知的技术制备，如免疫宿主和收集血清(多克隆)，或者通过制备连续的杂交瘤细胞系和收集分泌的蛋白质(单克隆)。
在关于捕获剂蛋白质催化的捕获剂或其药物制剂方面，如在本文中使用的术语“稳定的”是指在足够的时间段内保持结构和功能完整性的在本文所述方法中使用的试剂或制剂。
在关于蛋白质催化的捕获剂或捕获剂方面，如在本文中使用的术语“合成的”是指捕获剂是已经通过化学而非生物学方法所产生的。
除非另有说明，本文所提供的序列同一性/相似性值是指采用默认参数利用BLAST2.0程序集所获得的值(Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402)。
如本领域普通技术人员理解的那样，BLAST搜索假设可以将蛋白质建模为随机序列。然而，许多真正的蛋白质包含非随机序列的区域，其可以是均聚域、短周期重复序列或富含一个以上的氨基酸的区域。即使蛋白质的其它区域完全不相同，这类低复杂度区域也可以在不相关的蛋白质之间进行比对。可以采用许多低复杂度过滤程序来减少这种低复杂度比对。例如，可以单独地或组合地使用SEG(Wooten和Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63)和XNU(Claverie and States，(1993)Comput.Chem.17：191-201)低复杂度过滤器。
如在本文中所使用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括对两个序列中的残基的参照，其在针对在指定比较窗口内的最大对应性进行比对时是相同的。在有关蛋白质方面使用序列同一性百分数时，认识到不相同的残基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被替代为具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此不改变分子的功能特性。在保守取代中序列相异的情况下，可以将序列同一性百分数上调以校正取代的保守性质。称因这类保守取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行该调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常包括将保守取代作为部分而不是完全不匹配进行评分，从而增加序列同一性百分数。因此，例如，在相同的氨基酸得分为1且非保守取代得分为零的情况下，保守取代评分为0至1之间。例如，根据Meyers和Miller的算法(Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988))计算保守取代的评分，例如，如以程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，Calif.，USA)实现的。
如在本文中所使用的，“序列同一性百分数”是指通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列而确定的值，其中为了两个序列的最佳比对而与参考序列(其不包括添加或缺失)相比较时，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括添加或缺失(即，间隙)。通过以下计算百分数：确定在两个序列中都出现的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分数。
多核苷酸序列的术语“基本同一性”或“基本相同”是指采用标准参数、利用所描述的比对程序之一而与参考序列进行比较时，多核苷酸包含的序列具有50-100％序列同一性，优选至少50％序列同一性，优选至少60％序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％且最优选至少95％。技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框架定位等，可以适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常是指序列同一性在55-100％之间，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％且最优选至少95％。
如在本文中所使用的，在环肽的上下文中，应理解N3和Pra部分一起表示Tz4或Tz5键。
BoNT A型捕获剂的开发
抗体目前是用于诊断平台的默认检测剂。然而，抗体具有几个缺点，包括成本高、稳定性差，并且在许多情况下，缺乏适当的表征且缺乏高特异性。用于诊断测定的理想替代物应该是合成的，在一定范围的热和化学条件下是稳定的，并且对感兴趣的靶标显示出高亲和性和特异性。
高质量的单克隆抗体具有低纳摩尔亲和力和高靶标特异性。有趣的是，抗原识别表面的结构和基因分析表明，大部分可变环的分子多样性都包含在单个高度可变环(CDR-H3)中。人类的这种环的大小范围为1-35个残基(平均15个)，可以采用广泛的结构构象，并且对大部分与抗原之间的相互作用负责。其它五个环的差异不明显，并且仅采用少量构象。这表明精心选择的“锚”肽可以主导捕获剂与其靶蛋白之间的相互作用的模式和强度。其还表明，虽然其它肽组分对总共的相互作用能量仅仅提供适度的贡献，但它们可以提供重要的脚手架(scaffold)特征和特异性单元。
原位点击化学是一种将小分子酶抑制剂分离成两个部分，然后使每个部分发展成一部分含有乙炔官能团而其余含有叠氮基的小文库的技术。然后酶本身通过选择性地促进乙炔和叠氮基之间的1,3-偶极环加成形成三唑键(“点击”反应)，而从这些文库组分中组装“最佳配合”抑制剂。该蛋白质有效地起到通常用于这种偶联的Cu(I)催化剂的极端选择性变体的作用。该酶仅在以正确方向结合蛋白质的那些文库组分之间促进点击反应。相对于基于两个文库所形成的初始抑制剂，所得到的抑制剂可表现出远远优异的亲和特性。
顺序原位点击化学扩展了原位点击化学概念，以使得能够发现多配体捕获剂(参见USSN 20100009896，通过引用并入本文)。以前使用该方法以产生针对模型蛋白质碳酸酐酶II(CAII)的三配体捕获剂。顺序原位点击化学具有一些优点。首先，将有关蛋白质靶标的结构信息替换为采集非常大的化学空间以鉴定捕获剂的配体组分的能力。例如，可以通过针对大型(>106个单元)的单珠-单化合物(OBOC)肽文库筛选蛋白质来鉴定初始配体，其中肽本身可以由天然的、非天然的和/或人造氨基酸组成。然后将所得锚定配体用于原位点击筛选，再次使用大型OBOC文库来鉴定双配体结合体。第二个优点是，可以重复该过程，使得将双配体用作锚以识别三配体，等等。然后可以使用相对简单且大部分自动化的化学方法来扩大最终的捕获剂，并且可以用如生物素基团的标记物作为其结构的固有部分来进行开发。这种方法允许探索支化、环状和线性的捕获剂体系结构。虽然已经描述了用于蛋白质指导的多配体组装的许多策略，但是大多数需要有关靶标的详细结构信息来指导筛选策略，并且针对低多样性的小分子文库，优化了大多数方法(如，原始的原位点击方法)。
本发明的实施方式进一步概括了原位点击应用，以发掘将两个配体连接到单个蛋白质的接头。该方法使用协同性结合以制备亲和力比其任一组分配体的亲和力更高的捕获配体。
BoNT A型捕获剂
在一个方面，本文提供了特异性结合BoNT A型的稳定的合成捕获剂，其中捕获剂包含设计的锚定配体、设计的第二配体、任选地设计的第三配体，以及任选地设计的第四配体，并且其中这些配体选择性地结合BoNT A型。在一个实施方式中，捕获剂特异性地结合BoNT A型的酶活性位点。在另一个实施方式中，捕获剂特异性地结合可接近全毒素的封闭构象的BoNT A型的位点。
在某些实施方式中，本文提供了包含两个结合靶的部分的双配体BoNT A型捕获剂。第一结合靶的部分被称为锚定配体，并且第二结合靶的部分被称为第二配体。还提供了包含第三配体和第四配体的捕获剂，其中第三结合靶的部分被称为第三配体，并且第四结合靶的部分被称为第四配体。
在某些实施方式中，结合靶的部分包含一个以上的多肽或肽。在这些实施方式的某些实施方式中，结合靶的部分包含一种以上的包含D-氨基酸、L-氨基酸和/或被官能团取代的氨基酸的肽，这些官能团选自由以下所组成的组：取代和未取代的烷基、取代和未取代的叠氮基、取代和未取代的炔基、取代和未取代的生物素基、取代和未取代的叠氮基烷基、取代和未取代的聚氧乙烯基和取代和未取代的1,2,3-三唑。
在某些实施方式中，锚定配体和第二配体通过共价键相互连接以形成捕获剂双配体。在这些实施方式的某些实施方式中，锚定配体和第二配体通过酰胺键或如下所示的1,4-二取代-1,2,3-三唑键相互连接：
Figure GDA0001410449800000241
在其中锚定配体和第二配体通过1,4-二取代-1,2,3-三唑键相互连接的那些实施方式中，1,4-二取代的-1,2,3-三唑键可以由Cu-催化的叠氮化物/炔烃环加成(CuAAC)形成。
在某些实施方式中，锚定配体和第二配体通过具有以下结构的Tz4键相互连接：
Figure GDA0001410449800000242
在某些实施方式中，锚定配体和第二配体通过具有以下结构的Tz5键相互连接：
Figure GDA0001410449800000243
在某些实施方式中，第三配体和/或第四配体通过共价键，优选通过双配体中的第二配体连接至捕获剂双配体。在这些实施方式的某些实施方式中，第三配体和双配体和/或第四配体和第三配体通过Tz4键相互连接。
在其中一个以上的锚定配体、第二配体、第三配体和/或第四配体通过酰胺键相互连接的那些实施方式中，酰胺键可以在偶联剂(例如，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、N-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt)或二异丙基乙胺(DIEA)的DMF溶液)的存在下，通过将羧酸基团和胺基偶联而形成。
在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在一定范围的反应条件和/或储存时间内是稳定的。如在本文中使用的“稳定的”捕获剂保持特异性地结合靶蛋白的能力。在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在一种以上的反应和/或储存条件下比与相同靶蛋白结合的抗体更稳定。例如，在某些实施方式中，本文提供的捕获剂比结合相同靶蛋白的抗体更能抵抗蛋白水解降解。
在某些实施方式中，本文提供的捕获剂具有大于6个月的保质期，这意味着它们在超过6个月的储存内是稳定的。在这些实施方式的某些实施方式中，捕获剂的保质期为一年以上、两年以上或超过三年。在这些实施方式的某些实施方式中，捕获剂作为冻干粉末储存。在某些实施方式中，本文提供的捕获剂的保质期比结合相同靶蛋白的抗体的保质期更长。
在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在约-80°至约120℃的温度范围内是稳定的。在这些实施方式的某些实施方式中，捕获剂在以下温度范围内是稳定的：-80°至-40℃；-40°至-20℃；-20°至0℃；0°至20℃；20°至40℃；40°至60℃；60°至80℃；和/或80℃至120℃。在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在较宽的温度范围内比结合至相同靶蛋白的抗体更稳定，和/或在特定温度下比结合至相同靶蛋白的抗体能够在更长时间段内保持稳定。
在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在约3.0至约8.0的pH范围内是稳定的。在某些实施方式中，该范围为约4.0至约7.0。在某些实施方式中，该范围为约7.0至约8.0。
在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在人血清中稳定超过12小时。在这些实施方式的某些实施方式中，捕获剂在人血清中稳定超过18小时、超过24小时、超过36小时或超过48小时。在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在人类血清中比结合至相同靶蛋白的抗体稳定更长的时间段。在某些实施方式中，捕获剂在约60℃的温度下作为粉末稳定两个月。
在某些实施方式中，本文提供的捕获剂可以包含一种以上的检测标记物，包括例如生物素、铜-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(铜-DOTA)、64Cu DOTA、68GaDOTA、18F、64Cu、68Ga、89Zr、124I、86Y、94mTc、110mIn、11C、76Br、123I、131I、67Ga、111In和99mTc，或其它放射性标记的产物，其可以包括γ发射体、质子发射体、正电子发射体、氚或由其它方法可检测的覆盖标签(如，钆)等。在特定的实施方式中，检测标签是18F。在某些实施方式中，可以将捕获剂修饰以作为成像剂使用。成像剂可以作为诊断剂使用。
在某些实施方式中，可以将本文提供的捕获剂修饰以获得所需的化学或生物学活性。所需的化学或生物活性的实例包括但不限于改善的溶解度、稳定性、生物利用度、可检测性或反应性。可以引入至捕获剂的特定修饰的实例包括但不限于通过形成二硫键使捕获剂环化；用其它官能团或分子修饰捕获剂。类似地，可以合成捕获剂以结合蛋白质上的非典型或非生物的表位，从而增加其通用性。在某些实施方式中，可以通过在偶联反应之前修饰结合靶的部分的合成嵌段来修饰捕获剂。
制备/筛选捕获剂的方法
在某些实施方式中本文提供了筛选结合靶的部分和/或制备包含这些结合靶的部分的捕获剂的方法。用于筛选结合靶的部分和/或制备包含这些结合靶的部分的捕获剂的方法也可以出现在国际公开号WO 2012/106671、WO 2013/033561、WO 2013/009869和WO2014/074907中，其中的每一个通过引用将其全部内容并入本文。
本文公开的捕获剂生产方法开始于鉴定短链锚定肽，继而通过由靶蛋白促进的过程添加额外的共价偶联的肽配体。由外周肽配体增强最终的多配体捕获剂的特异性和抑制效力。
体外
为了检测溶液中的BoNT A型，可以可检测地标记本发明的捕获剂，然后将其与溶液接触，之后可以检测捕获剂与BoNT A型靶标复合物的形成。作为实例，荧光标记的捕获剂可用于体外BoNT A型检测测定，其中在允许发生结合的条件下，将捕获剂加入至待测试BoNTA型的溶液中。可以将荧光标记的捕获剂和BoNT A型靶标之间的复合物进行检测和定量，例如，通过测量相对于游离肽的荧光偏振的复合物结合的肽所产生的增强的荧光偏振。
可替换地，可以使用夹心型“ELISA”测定法，其中将捕获剂固定到固体支持物(如塑料管或孔)上，然后将猜测含有BoNT A型的溶液与固定化的结合部分接触，将未结合的物质洗涤掉，并使用用于识别BoNT A型的合适的检测试剂检测复合多肽。
为了检测或纯化溶液中的可溶性BoNT A型，可以将本发明的捕获剂固定到固体基质(如，色谱载体)或其它基质材料上，然后可以在适合形成捕获剂/BoNT A型复合物的条件下，加载固定化的结合体或将其与溶液接触。可以除去溶液中的非结合部分，并且可以例如使用抗-TBNTA型抗体或抗结合多肽抗体检测复合物，或者可以在适当的洗脱条件下，从结合部分释放出BoNT A型。
体内诊断成像
用于本发明的捕获剂的特别优选的用途是用于创建生物流体中的BoNT A型或BoNT A型表达细胞的视觉可读图像。可以通过将捕获剂与适合于诊断检测的标记物缀合而将本文公开的BoNT A型捕获剂转化为成像试剂。优选地，将针对BoNT A型表现出比其它蛋白质更高特异性的捕获剂缀合或连接至适合于待使用的检测方法的标记物。例如，捕获剂可以与或不与接头缀合成适合于磁共振成像(MRI)的顺磁性螯合物，捕获剂可以与适用于x射线、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或闪烁照相成像(包括用于放射性金属的螯合剂)的放射性标记物缀合，捕获剂可以与适用于超声检测的超声造影剂(例如，稳定的微泡、微珠、微球或称为气体填充的“脂质体”)缀合，或者捕获剂可以与光学成像染料缀合。
在另一个实施方式中，不是将捕获剂与可检测的标记物或放射治疗的构建体直接标记，而是可以将本发明的一种以上的肽或构建体与例如结合可检测的标记物或放射治疗物的亲和素、生物素或抗体或抗体片段缀合。
A.磁共振成像
本文所描述的BoNT A型捕获剂可以有利地与顺磁性金属螯合物缀合，以便形成用于MRI的造影剂。优选的顺磁性金属离子的原子序数为21-29、42、44或57-83。这包括具有一个、更优选五个或更多个不成对电子和至少1.7个玻尔磁子的磁矩的过渡金属或镧系元素的离子。优选的顺磁性金属包括但不限于铬(III)、锰(II)、锰(III)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(Ⅲ)、铒(Ⅲ)、铕(Ⅲ)和镱(III)、铬(III)、铁(III)和钆(III)。由于三价阳离子Gd3+的弛豫性高和毒性低，特别优选其以用于MRI造影剂，其另外的优点是其仅存在于一种生物可及的氧化态，其将患者对金属不期望的代谢分解最小化。另一种有用的金属是相对便宜的Cr3+。Gd(III)螯合物是自从1988年以来一直被用于临床和放射学MR应用，约30％的MRI检查目前使用钆基造影剂。
顺磁性金属螯合剂是具有一个以上的极性基团的分子，该极性基团作为顺磁性金属的配体，并且与顺磁性金属复合。合适的螯合剂是本领域已知的，并且包括具有亚甲基膦酸基团、亚甲基羧肟胺酸基团、羧基亚乙基基团或羧基亚甲基基团的酸。螯合剂的实例包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环-十四烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1-取代的1,4,7-三羧甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DO3A)、乙二胺四乙酸(EDTA)和1,4,8,11-四-氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)。另外的螯合配体是亚乙基双-(2-羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-Cl-EHPG、5-Br-EHPG、5-Me-EHPG、5-t-Bu-EHPG和5-仲-Bu-EHPG；苯并二亚乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、苄基-DTPA和二苄基DTPA；双-2(羟基苄基)-亚乙基二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；含有至少3个碳原子、更优选至少6个和至少两个杂原子(O和/或N)的大环化合物类，该大环化合物可以由在杂环元素处连接起来的一个环或两个或三个环组成，例如，苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA，其中NOTA是1,4,7-三氮杂环壬烷N,N',N”-三乙酸、苯并-TETA、苯并-DOTMA，其中DOTMA是1,4,7,10-四氮杂环十四烷-1,4,7,10-四(甲基四乙酸)和苯并-TETMA，其中TETMA是1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-(甲基四乙酸)；1,3-亚丙基-二胺四乙酸(PDTA)和三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)的衍生物；1,5,10-N,N',N”-三(2,3-二羟基苯甲酰基)-三酸胆酸酯(LICAM)的衍生物；和1,3,5-N,N',N”-三(2,3-二羟基苯甲酰基)氨基甲基苯(MECAM)。用于本发明的优选螯合剂是DTPA，特别优选地使用DO3A。本发明考虑的代表性螯合剂和螯合基团的实例在WO 98/18496、WO 86/06605、WO91/03200、WO 95/28179、WO 96/23526、WO 97/36619、PCT/US98/01473、PCT/US98/20182和美国专利第4,899,755号、美国专利第5,474,756号、美国专利第5,846,519号以及美国专利第6,143,274号中进行了描述，通过引用将其全部并入。
根据本发明，MRI造影剂的螯合剂与BoNT A型捕获剂偶联。应选择螯合物的定位，以免干扰BoNT A型捕获剂的结合亲和力或特异性。螯合物也可以附着在捕获剂上的任何位置。
通常，BoNT A型捕获剂可以直接地或共价地结合到金属螯合剂(或其它可检测的标记物)上，或者可以使用接头偶联或缀合到金属螯合剂，该接头可以但不限于是酰胺、脲、缩醛、缩酮、双酯、羰基、氨基甲酸酯、硫脲、砜、硫酯、酯、醚、二硫化物、内酯、亚胺、磷酰基或磷酸二酯键；取代或未取代的饱和或不饱和烷基链；单个氨基酸或不同氨基酸的线性、支化或环状的氨基酸链(例如，BoNT A型结合部分的N-末端或C-末端的延伸)；衍生化或未衍生的聚乙二醇(PEG)、聚氧化乙烯或聚乙烯吡啶链；取代或未取代的聚酰胺链；衍生化或未衍生的多胺、聚酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸酯、聚(乙烯醇)、聚甘油或寡糖(例如，葡聚糖)链；交替的嵌段共聚物；丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸；己酸；简单的二胺和二醇；本文公开的任何其它接头；或本领域已知的任何其它简单的聚合物接头(参见，例如WO 98/18497和WO 98/18496)。优选地，可以严格控制接头的分子量。分子量可以在小于100到大于1000的范围内。优选地，接头的分子量小于100。此外，可以期望地利用在体内可生物降解的接头，为本发明的成像试剂提供有效的排泄途径。根据这种可生物降解的官能团在接头内的位置，它们可以包括酯、双酯、酰胺、磷酸酯、醚、缩醛和缩酮官能团。
通常，已知的方法可用于使用这类接头(WO 95/28967、WO 98/18496、WO 98/18497及其讨论)来偶联金属螯合物和BoNT A型捕获剂。可以通过N-末端或C-末端经由酰胺键将BoNT A型结合部分连接至例如金属螯合物的金属配位骨架氮或金属螯合物本身的乙酸酯臂。本公开内容考虑了螯合物在任何位置的连接，条件是金属螯合物保持紧密结合金属以最小化毒性的能力。
根据本文公开内容制备的MRI造影剂可以以与常规MRI造影剂相同的方式使用。可以优选某些MR技术和脉冲序列来增强位点与背景血液和组织的对比度。这些技术包括(但不限于)，例如，试图使血液变暗的黑血管造影术序列，例如快速自旋回波序列(Alexander,A.et al.,1998.Magn.Reson.Med.,40:298-310)和流动扰相梯度回波序列(Edelman,R.等人,1990.Radiology,177:45-50)。这些方法还包括增强对比度差异的流动独立技术，如反转恢复制备的序列或饱和恢复制备的序列，其将增加BoNT A型阳性组织与阴性组织之间的对比度。最后，磁化转移制剂也可以改善与这些试剂的对比度(Goodrich,K.等人,1996.Invest.Radia,31:323-32)。
治疗应用
在某些实施方式中本文提供了采用本文公开的BoNT A型捕获剂在体外或在体内抑制BoNT A型活性的方法。本文公开的BoNT A型捕获剂可用于治疗肉毒中毒或改善与肉毒中毒相关的一种以上症状。
在某些实施方式中，本文公开的BoNT A型捕获剂能够结合BoNT A型全毒素的封闭构象。在BoNT A型移位至细胞(例如神经元)内部时，该封闭构象解除。这使得抑制剂能够进入至BoNT A型的酶活性位点。在某些实施方式中，在BoNT A型捕获剂内部化至细胞内之前，BoNT A型捕获剂与该蛋白结合，使得在其与BoNT A型蛋白一起转移到细胞中时为捕获剂的活性位点结合部分提供通路。
提供以下实施例以更好地说明所要求保护的本发明，而不应被解释为限制本发明的范围。在提及特定材料的程度上，仅仅是为了说明的目的，并不意图限制本发明。本领域技术人员在不发挥创造能力并且不脱离本发明的范围的情况下可以开发等同的装置或反应物。
实施例
实施例1.肉毒神经毒素特异性配体的筛选策略。
开发了为BoNT的底物模拟物的大环肽配体(Inh-1，图6和7)。Inh-1以约70nM的结合亲和力(kD)和相似的抑制常数结合至活性位点。采用全合成原位点击表位靶向方法(如图1所示)，用于鉴定折叠蛋白质结构中与该活性位点几埃远的位点结合的第二肽大环化合物(L2，图8和9)。L2表现出约80nM的kD，但没有抑制作用。最后，采用由BoNT LC促进的原位点击筛选来鉴定连接两个大环化合物的线性肽(如图2所示)。最终的二价配体(Inh-2，图10)以165±15pM的IC50抑制BoNT LC。Inh-2还被BoNT本身携带到神经元细胞内，并抑制活细胞内的全毒素。该技术通过原位点击靶标导向合成为从用于组合的初始文库开发外周结合体和活性位点结合体提供了潜在的一般途径。
起催化作用的BoNT/A LC的活性位点识别SNAP-25蛋白的7残基QRATKML序列(SEQID NO:24)。已经报道了许多基于该基序的抑制剂。由基于结构搜索所产生的一种拟肽抑制剂变体以紧密的310螺旋构象结合BoNT，其在体外具有低纳摩尔的BoNT LC抑制(图11和12)。为了加强溶液中的这一构象并增加该化合物的化学和生物稳定性，合成了(i,i+3)-点击环状衍生物的小文库。一种化合物(Inh-1)以利用基于FRET的底物切割测定法在体外测量为70±8nM的抑制常数(图13A-13C)以及利用荧光偏振法测量的68±29nM的结合亲和力(图3A)抑制BoNT/A LC。然而，用封闭的LC活性位点抑制完整的BoNT全毒素是更具挑战性的。单点ELISA结合数据(图3D)示出了尽管Inh-1紧密结合至LC，但是Inh-1表现出对全毒素的结合性最低。因此，将Inh-1扩展为包含与活性位点相邻的BoNT LC的非封闭区域结合的部分。为此，选择了全毒素的封闭构象中的暴露于溶剂中的表位，以利用表位催化的原位点击进行筛选。
用N-末端叠氮赖氨酸和C-末端生物素合成表位(BoNT LC第166-179位残基，图14)，并针对在被N-末端炔丙基甘氨酸取代的Tentagel树脂上合成的大环五聚体肽的1.1M单元文库进行筛选(如图2所示)，并且针对相同表位的加扰版本进行抗筛选(图15)。由于相对于线性肽，结合的稳定性增加而熵罚分降低，因此采用了这种约束的大环肽文库。在与靶表位孵育后，用碱性磷酸酶抗生物素单克隆抗体将珠粒剥离、检测并显影。利用Edman降解对九个击中珠粒进行测序，并且发现具有显著的序列同源性(图16)。在荧光偏振后选择L2，显示对BoNT LC和BoNT全毒素两者均具有78±13nM的结合亲和力，但测量不出对LC的抑制(图3B)。
为了将Inh-1与L2最佳地结合，利用组合接头文库(图2所示)进行动力学原位靶标导向合成以鉴定优化的分子桥。为此，在Tentagel树脂上合成L2，并附加有用炔丙基甘氨酸封端的N-末端接头文库。这种附加文库具有全面的零个至五个残基，其中四个非典型和可替换的手性氨基酸由于其结构上的刚性而被选择。这种文库的合理性是为了将在组合两个独立的结合体时可以实现的亲合力最大限度地增强。使用长度等于两个结合位点的分离平均值的均方根的刚性接头使该增强效果最大化。用C-末端叠氮赖氨酸和生物素测定手柄合成Inh-1(图17)。添加了BoNTLC，通过使反应性叠氮化物和炔烃基团接近来促进二价配体的靶向引导合成。在筛选后，用碱性磷酸酶抗生物素单克隆抗体将珠粒剥离、检测、并进行显影。利用Edman降解对击中珠粒进行测序，得到两个接头序列的共有序列：Gly-Aib-Leu和Leu-Aib-Gly(如图2所示)。用具有相似RMSD长度的PEG4接头合成对照二价配体，与通过靶标导向合成选择的接头进行比较(图18和19)。如上所述，将候选二价配体放大并且作为BoNT LC的抑制剂在体外进行评价。选择Inh-2用于所有随后的测定，并显示针对BoNT LC的抑制常数为165±15pM。以用于荧光偏振的荧光素染料、用于结合测定的生物素以及用于将极性物质递送至细胞质报告的的自发转位肽(STP)合成配体的变体(图20)。
测试了Inh-2预防和拯救人类神经元BoNT中毒的能力(分别为图4A-4B和5A-5C)。使用了一种类型的人类诱导的多能干细胞衍生的神经元(称为iCell神经元)，该iCell神经元已被报道为作为用于监测在活细胞的复杂环境中由BoNT进行的SNAP-25切割的敏感模型(图21)。将细胞铺板于具有层粘连蛋白基质的聚-D-赖氨酸包被的96孔板上并暴露于用各种浓度的Inh-1和Inh-2预孵育的2个小鼠LD50单位(U)的BoNT中。所有细胞在24小时后裂解，并通过蛋白质印迹法评估SNAP-25切割。切割的SNAP-25作为第二条带出现在完整的SNAP-25条带下面(图4A)。通过光密度法定量蛋白质印迹数据，以得出配体在防止BoNT中毒上的剂量-反应性质。Inh-1在给药高达10μM时却表现出微不足道的保护作用。这可能是由于在BoNT进入细胞质之前封闭的活性位点一直都不可用于结合，以及Inh-1具有不能渗透膜的性质。Inh-2也是不能渗透细胞膜的，但是在低至100nM的浓度下，却对BoNT中毒显示出显著的保护作用。已经报道了神经元模型中的BoNT LC活性位点的抑制剂具有这类保护作用，但是抑制剂浓度仅仅在中等微摩尔的范围内。作为比较，评估了具有已知显著抗毒素作用的从陆军关键试剂项目储存库(Army Critical Reagents program repository)获得的多克隆抗体。该抗体通过中断重链受体介导的内吞作用来预防BoNT中毒，并为较低至中等纳摩尔范围提供显著的保护。
在经铺板后延长至成熟之后，iCell神经元显示功能性突触小泡再循环，表明突触前隔室的发育。通过FM1-43囊泡染色，然后通过Ca2+/K+依赖性去极化监测突触小泡再循环(图22A-22D)。BoNT中毒的神经元的突触小泡可以被染色，然而Ca2+/K+去极化不会诱导囊泡胞吐作用和随后的FM1-43荧光消失。在突触小泡暴露于用1μM抑制性配体预孵育的BoNT后，以每个细胞为基础将在活神经元的荧光图像中作为点出现的突触小泡定量(图23)。图4B中示出了去极化后的代表性细胞，以及每种在三个孔内定量的条件下突触小泡的计数。如在蛋白质印迹测定中观察到的，该功能测定法示出Inh-1对BoNT中毒的保护作用微不足道，而Inh-2提供了充分的保护作用。这些结果与特洛伊木马样抑制机制一致，其中Inh-2的非抑制性L2部分与BoNT全毒素结合，使得Inh-2在BoNT中毒的胞吞作用期间通过全毒素本身而穿梭至细胞中。一旦带被释放，Inh-1部分就会夹紧到活性部位上，从而抑制蛋白质。为了评估被动递送到细胞质的作用，将配体附加有STP(图24)。与不能渗透膜的Inh-1相比，靶向活性位点的Inh-1-STP化合物显示出保护作用增强，尽管对于在体外的BoNT LC，并未预料到在该浓度下的完整保护作用。
能渗透膜和不能渗透膜的Inh-2变体都提供了对神经元的完整的功能保护。接下来评估的是通过拯救测定法测定不依赖BoNT进入细胞的Inh-2-STP，其中在加入抑制剂之前便开始了BoNT进入和BoNT中毒。以大剂量55U在细胞刺激培养基中暴露五分钟后进行洗涤以及1U延长暴露而不进行洗涤来评估对于iCell神经元的拯救。在这两个实验中，在暴露后1、3和12小时向细胞中加入1μM抑制性配体。所有细胞在暴露后24小时裂解，并通过蛋白质印迹法评估SNAP-25切割(图5B)。对每个条件进行两次印迹，并通过光密度法测定且进行平均化(图3C)。在大剂量暴露中，Inh-2-STP在迟至暴露后3小时才显示出对于内部化BoNT的部分拯救作用，随后的时间点表明内部化的BoNT在12小时后将SNAP-25全部切割掉。如预计的的那样，绵羊pAb由于其防止BoNT内吞作用的作用机制而显示拯救作用不能检测出。在1U延长暴露下，绵羊pAb和化合物Inh-2-STP都显示出类似的拯救水平。在低浓度和非刺激性的培养基中，BoNT内吞的过程显著减缓，可以通过pAb保护机制进行保护。
蛋白质靶标的三级结构的合理使用被作为用于组装高效抑制剂的景观而进行了报道。具体应用是产生了配体Inh-2，尽管BoNT全毒素的活性位点是天然封闭的，但是Inh-2成功地成为了一种强抑制剂。Inh-2有效地作为特洛伊木马；它以BoNT手段被携带到神经元细胞中。一旦进入细胞质，BoNT LC活性位点暴露，Inh-2就会发挥其抑制功能。据我们所知，这种二价抑制性配体是所报道的在体外和在BoNT/A的细胞抑制剂中最有效的，并且代表了第一次使用外周结合位点以增强结合亲合力并促进BoNTiA全毒素结合。这种基本方法可能具有开发高亲和力和高特异性配体的一般适用性，其被设计用于改变细胞间和细胞内靶标的功能。
标准材料
所有氨基酸购自Aapptec，其作为具有标准TFA侧链保护基团的Fmoc羧酸，用于固相肽合成。HATU(2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)和PEG4(Fmoc-NH-PEG4-CH2CH2COOH、Fmoc-18-氨基-4,7,10,13,16-五氧杂十八烷酸)购自ChemPep。DIEA(二异丙基乙胺)、三乙基硅烷(TES)和TFA(三氟乙酸)购自Sigma Aldrich。TentaGel珠粒作为90μm S-NH2珠粒(0.29mmol/g，2.86×10 6珠粒/g)购自Rapp Polymere(德国)，Rink Amide树脂购自Anaspec以及C-末端生物素化肽合成于Biotin NovaTag树脂上(EMD Millipore)。
环肽文库构建
采用90μm TentaGel S-NH2珠粒，经由标准FMOC SPPS偶联化学，在Titan 357裂解和混合自动肽合成仪(Aapptec)上合成环肽文库。所有环状文库包含C-末端Lys(N3)残基，即18种天然氨基酸(除去半胱氨酸和甲硫氨酸)的L-立体异构体，在任意的五个随机位置之后是炔丙基甘氨酸残基。在以1.5当量CuI和5当量L-抗坏血酸的20％哌啶:NMP合成文库后，在室温下将其环化过夜。用5％w/v二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物和5％v/v DIEA的NMP全面地螯合树脂。对于原位点击筛选，在环化后将叠氮化物或炔烃点击手柄偶联到N-末端。在合成文库时，使用至少五倍过量的珠粒以确保将每个序列过量取样。采用采用比例为95:5:5的TFA:H2O:TES，通过TFA不稳定的保护基团保护氨基酸侧链，在文库合成后立即将其全部除去。
按比例扩大肽合成
利用标准FMOC SPPS肽化学方法在Titan 357自动肽合成仪(AAPPTEC)或Liberty1微波肽合成仪(CEM Corporation)上将肽序列大量合成。典型规模为Rink酰胺树脂上的300mg，除非另有说明。在以1.5当量CuI和5当量L-抗坏血酸的20％哌啶:NMP合成之后，在室温下将点击环化肽环化过夜。用5％w/v二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物和5％v/v DIEA的NMP全面地螯合树脂。采用比例为95:5:5的TFA:H2O:TES，从含有已脱保护的侧链的珠粒上切下肽。利用反相C18柱(Phenomenex)，以制备规模的Dionex U3000 HPLC纯化肽。利用MALDI-TOF MS检查所有肽的正确质量和杂质，并将其冻干至粉末，以在室温下长期储存。通过将粉末溶解在少量DMSO中制备用于测定的浓缩肽储液，并通过Nanodrop测量A280吸光度以确定储液浓度。
合成310螺旋点击稳定的抑制剂变体
如上所述用C-末端PEG4生物素和N-末端PEG4生物素将Zuniga等人(2011)报道的肽模拟抑制剂Dab(二硝基苯酚)-RWT-Dab-ML(SEQ ID NO:26)按比例放大。N-末端标记的变体在点ELISA形式下显示出检测不出的结合，并且在体外BoNT LC活性测定中显示出抑制作用，这与结合时指示部分掩埋的N-末端的晶体结构一致。在筛选各种环状变体期间，将C-末端标记的变体用作为对照(图17)。合成了十六种变体。所有这些均基于上述抑制剂，用炔丙基甘氨酸和叠氮化物进行(i,i+3)取代。针对每种取代以及C-末端最多两个残基甘氨酸延伸，将这些残基的两种可能的排列进行了测试。如上所述将所有化合物环化。
夹心ELISA测定以初始评估BoNT LC结合
进行这些测定以测试各种配体与BoNT LC蛋白的结合。对于该测定，为了统计目的，将所有样品一式三份取出。所用的靶蛋白是BoNT LC-GST缀合物(List Labs)。首先将肽配体以1μM浓度固定在Neutravidin ELISA板(Pierce)上1小时。由于GST蛋白具有与空白的中性抗生物素蛋白板显著的背景结合，因此采用PEG4-生物素作为无配体空白。然后将板用5％BSA封闭过夜。将蛋白质以100nM的浓度孵育于样品孔和空白孔。GST蛋白(Abcam)也单独地与配体和作为对照的空白孵育。将蛋白质在室温下孵育3小时，然后用1×TBS+0.05％吐温-20洗涤3次。然后用1:10,000抗-GST小鼠mAb(Fisher)检测蛋白质1小时，用1×TBS+0.05％吐温-20洗涤三次，并用1:1的TMB底物混合物显影十分钟。通过减去空白并将样品孔平均化来绘制样品，同时包含的误差线表示正负标准偏差。
基于FRET的体外BoNT-LC活性测定
按照FRET对标记的BoNT底物(List Labs，SNAPtide#523)的制造商所建议的，进行基于FRET的BoNT-LC活性测定。在37度下在Flexstation3荧光酶标仪中进行所有的时间分辨的荧光测定。简言之，在黑色荧光96孔板中以测定缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，含有0.3mM ZnCl2，1.25mM DTT和0.05％吐温-20)制备8μM的FRET标记的底物。将BoNT LC-GST缀合物稀释至指定浓度(一般为1nM，除非另有说明)，并用指定浓度的抑制肽配体或0.05％DMSO对照进行预孵育。在时间＝0时，用酶标仪将BoNT-LC加入至底物，并开始监测荧光。激发波长设定为490nm，发射523nm的波长，截止值为495nm。将孔监测大约1小时。将初始切割速度与抑制剂浓度作图。
荧光偏振测定
用荧光素合成Inh-1和L2，用于荧光偏振(FP)测定。通过制备1μM起始蛋白质浓度并以测定缓冲液稀释3倍，在黑色96孔聚苯乙烯板的一系列10个孔中完成BoNT LC结合测定。将配体加入孔中，终浓度为20nM。将板在室温下振荡孵育1小时，并在Flexstation3酶标仪上读数。
通过将低浓度基线的平均值减去零来拟合数据，以便使用Hill拟合。使用GraphPad Prism，使用共同饱和点将曲线拟合成Hill函数。
第二结合体表位靶向的筛选
使用形式为Pra-Pra-XXXXX-Lys(N3)-TG(SEQ ID NO:9)的文库进行筛选，其中将最接近珠粒的叠氮基和炔丙基氨基酸同时点击以形成闭合环。肽文库是含有18种L-氨基酸的全面的五聚体，由于稳定性原因而不包含Met和Cys。N-末端含有炔基氨基酸，用于与靶标13聚体表位片段上的Lys(N3)进行原位点击。采用400mg干燥文库珠粒进行筛选，该珠粒是在1×TBS(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，10mM MgCl2，pH＝7.5)缓冲液中溶胀了至少六小时，并且在封闭缓冲液(1×TBS+1％BSA+0.05％吐温-20)中封闭过夜的。以两个主要步骤进行针对BoNT LC 166-179表位的筛选：加扰表位预处理和靶表位产物筛选。
步骤1：加扰表位预清洗
将溶胀的文库珠粒在封闭缓冲液中封闭过夜，然后用1×TBS洗涤三次。将浓度为5μM的加扰表位(Lys(N3)-NGTLFNLSEVRH-PEG4-生物素)(SEQ ID NO:17)图15)加入至封闭缓冲液中，并在室温下振荡孵育4小时。用封闭缓冲液将珠粒洗涤三次。将1:10 000小鼠mAb抗-生物素碱性磷酸酶缀合物(Abcam)加入封闭缓冲液中1小时，然后用封闭缓冲液洗涤三次，1×TBS+0.05％吐温-20洗涤三次和用高盐TBS缓冲液(1×TBS，750mM NaCl)洗涤三次(每次15分钟)，然后在高盐缓冲液中振荡1小时。然后将珠粒用BCIP缓冲液(100mM Tris-Cl，150mM NaCl，1mM MgCl2，pH＝9.0)洗涤三次，并通过加入15mL BCIP缓冲液以及13pLBCIP和26pL NBT(两部分系统，Promega)进行显影。显影进行30分钟。显影完成后，将珠粒用浓HCl淬灭至0.1N，并用MilliQ水洗涤十次以除去底物。将珠粒置于含有0.05N HCl的板中。通过微量移液管除去紫色珠粒(通常约1-5％)并弃去。将剩余的珠粒在NMP中孵育4小时以除去来自于BCIP/NBT反应的痕量紫色沉淀，然后用甲醇洗涤5次，用水洗涤5次，用1×TBS洗涤5次，并在封闭缓冲液中重新封闭过夜。
步骤2：靶表位产物筛选
用封闭缓冲液将在预清洗步骤中残留的珠粒洗涤三次，然后与5μM靶表位(Lys(N3)-SFGHEVLNLTRN(SEQ ID NO:18)，图14)一起在封闭缓冲液中孵育12小时以允许原位点击反应发生。然后将珠粒用1×TBS洗涤三次，并用7.5M胍-HCl缓冲液(pH＝2.0)孵育1小时以除去未共价连接至珠粒的所有靶表位。然后将这些珠粒用1×TBS洗涤十次，在封闭缓冲液中重新封闭过夜，然后用1:10000小鼠mAb抗生物素碱性磷酸酶缀合物(Abcam)在封闭缓冲液中孵育1小时1小时以检测存在的点击至击中珠粒的生物素化的靶表位。抗体被孵育之后，将其用封闭缓冲液洗涤三次，用1×TBS+0.05％吐温-20洗涤三次，用高盐TBS缓冲液(1×TBS，750mM NaCl)洗涤三次(每次15分钟)，然后在高盐缓冲液中振荡1小时。然后，将珠粒再次用BCIP缓冲液洗涤三次，并按照预清洗步骤进行显影。通过移液管将紫色珠粒作为击中珠粒从筛选物取出。将这些击中物在胍-HCl缓冲液中孵育以除去连接的链霉亲和素，用水洗涤十次，并在Applied Biosystems的Procise CLC系统上通过Edman降解进行测序。产物筛选的序列参见表SX。
二价抑制剂的动态原位点击靶标导向合成
使用形式为Pra-XXXXX-Pra-NYRWL-Lys(N3)-TG(SEQ ID NO:10)的文库进行筛选，将最接近珠粒的叠氮基和炔丙基氨基酸同时点击以形成闭合环。肽文库从长度为零到长度为5，全部仅含有四种可能的残基(甘氨酸、D-亮氨酸、氨基异丁酸酯和D-脯氨酸，参见图2)。N-末端含有炔氨基酸，用于与Inh-1-生物素-Lys(N3)锚抑制剂进行原位点击(图17)。采用50mg干燥的文库珠粒进行筛选，该珠粒是在1×TBS(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，10mMMgCl2，pH＝7.5)缓冲液中溶胀至少6小时，并在封闭缓冲液(1×TBS+1％BSA+0.05％吐温-20)封闭过夜的。用Inh-1-生物素-Lys(N3)锚抑制剂化合物和BoNT LC蛋白进行筛选。
步骤1：Inh-1相互作用预清洗
将溶胀的文库珠粒在封闭缓冲液中封闭过夜，然后用1×TBS洗涤三次。向封闭缓冲液中加入浓度为10μM的锚抑制剂(Inh-1-生物素-Lys(N3))图17)，并将其在室温下振荡孵育4小时。用封闭缓冲液将珠粒洗涤三次。将1:10 000小鼠mAb抗生物素碱性磷酸酶缀合物(Abcam)加入至封闭缓冲液中1小时，然后用封闭缓冲液洗涤三次，用1×TBS+0.05％吐温-20洗涤三次并用高盐TBS缓冲液(1×TBS，750mM NaCl)洗涤三次(每次15分钟)，然后在高盐缓冲液中振荡1小时。然后将珠粒用BCIP缓冲液(100mM Tris-Cl，150mM NaCl，1mMMgCl2，pH＝9.0)洗涤三次，并通过加入15mL BCIP缓冲液以及13pL BCIP和26pL NBT(两部分系统，Promega)进行显影。显影进行30分钟。显影完成之后，用浓HCl将珠粒淬灭至0.1N，并用MilliQ水洗涤十次以除去底物。将珠粒置于含有0.05N HCl的板中。通过微量移液管除去紫色珠粒(约1％)并弃去。将剩余的珠粒在NMP中孵育4小时以除去来自于BCIP/NBT反应的痕量紫色沉淀，然后用甲醇洗涤5次，用水洗涤5次，用1×TBS洗涤5次，并在封闭缓冲液中重新封闭过夜。
步骤2：靶标导向合成产物筛选
用封闭缓冲液将在预清洗步骤中残留的珠粒洗涤三次，然后与10μM锚抑制剂(Inh-1-生物素-Lys(N3))图17)和100nM BoNT LC一起在封闭缓冲液中孵育2小时或12小时，以允许原位点击反应发生。然后将珠粒用1×TBS洗涤三次，并用7.5M胍-HCl缓冲液(pH＝2.0)孵育1小时以除去所有未共价连接至珠粒的Inh-1。然后将这些珠粒用1×TBS洗涤10次，在封闭缓冲液中重新封闭过夜，然后与1:10000小鼠mAb抗生物素碱性磷酸酶缀合物(Abcam)在封闭缓冲液中孵育1小时1小时以检测存在的点击至击中珠粒的生物素化的Inh-1。抗体被孵育之后，将其用封闭缓冲液洗涤三次，用1×TBS+0.05％吐温-20洗涤三次，用高盐TBS缓冲液(1×TBS，750mM NaCl)洗涤三次(每次15分钟)，然后在高盐缓冲液中振荡1小时。然后，将珠粒再次用BCIP缓冲液洗涤三次，并按照预清洗步骤进行显影。通过移液管将紫色珠粒作为击中珠粒从筛选物取出。将这些击中物在胍-HCl缓冲液中孵育以除去连接的链霉亲和素，用水洗涤十次，并在Applied Biosystems的Procise CLC系统上通过Edman降解进行测序。产物筛选的序列参见图16。
iCell神经元培养
冷冻保存的源自hiPSC的神经元(iCell神经元)提供自Cellular DynamicsInternational。该神经元是GABA能神经元、谷氨酸能神经元和多巴胺能神经元(百分数非常小(<1％))的纯度为98％的(Tuj1+/Nestin-)泛神经元群。根据提供的说明书，将神经元解冻，并且利用台盼蓝排除法对活细胞进行计数。除非另有说明，否则将细胞以密度为每孔50,000个细胞接种到聚-D-赖氨酸包被的96孔板(Corning)和8.3μg/cm2人类层粘连蛋白(Sigma)中，并将其孵育在含有由Cellular Dynamics International提供的补充物的神经元细胞培养基中。每3天更换50％的培养基。神经生长染色(Life Technologies)示出显著的神经突生长，并且在铺板3天后成熟(图S16)。通过FM1-43(Life Technologies)染色监测当K+/Ca2+去极化时活性突触小泡再循环，几乎所有神经元在铺板后第15天示出可重复的染色和脱色(图22A-D)。
神经元BoNT毒性测定
对于所有的神经元毒性测定，将在铺板后3天的源自hiPSC的神经元暴露于指定浓度的BoNT/A全毒素(List Labs)与指定的抑制化合物中，其中使该BoNT/A全毒素在50μL神经元培养基中与指定的抑制化合物在37度下预孵育1小时。总是包括不含毒素的阴性对照。在暴露24小时后，除去毒素溶液，将细胞在50μl的1×十二烷基硫酸锂(LDS)加载缓冲液(Invitrogen)中裂解。通过蛋白质印迹分析细胞裂解物的SNAP-25切割并且将β-微管蛋白作为加载对照。采用Ms抗-SNAP-25SMI-81(Abcam)作为一抗以及山羊抗-Ms H&LAlexafluor 790(Life Technologies)作为二抗检测SNAP-25，并且利用奥尼赛(Odyssey)仪器在800nm波长下成像。采用Rb抗-β微管蛋白(Life Technologies)作为一抗和山羊抗-Rb H&L Alexafluor 680(Life Technologies)作为二抗检测β-微管蛋白，并且利用奥尼赛(Odyssey)仪器在700nm波长下成像。切割的SNAP-25条带出现在完整的SNAP-25条带下方，并且通过密度测定以ImageJ对每一条带进行定量，图4A-4B和5A-3C示出了完整SNAP-25的相对分数。
对于保护测定，培养神经元并将其暴露于如上所述的毒素。在指定时间，以适当浓度加入10μL掺有抑制性化合物的神经元培养基，使孔内的总浓度为1μM，总体积为60μL。如上所述，暴露后24小时，用1×LDS裂解所有细胞，并通过蛋白质印迹进行分析。
突触小泡再循环测定
如上所述，培养源自hiPSC的神经元，并使其成熟，每三天替换50％的神经元培养基。15天后，采用FM1-43染色然后K+/Ca2+去极化，神经元示出突触小泡染色和脱色。将这些成熟的神经元培养物暴露于所描述的与抑制剂预孵育的指定BoNT/A全毒素，然后用FM1-43测定。
对于FM1-43加载，用Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤对照和毒素/抑制剂暴露的神经元，并在37度下用含有2mM CaCl2和2mM FM1-43的等渗HBSS(Life Technologies)中的56mMKCl去极化5分钟。用不含Ca2+且含有0.5mM EGTA的HBSS将培养物洗涤两次，每次10分钟，以洗涤表面膜的染料，同时防止神经元激活以及已经标记的末端内的FM1-43的损失。在该洗涤溶液中将标记的神经元成像；将一些孔进行第二轮去极化(在不存在FM1-43下)以使突触末端脱色，并评估功能性中毒。在成像之前，用NucRed Live 647活细胞核染料(LifeTechnologies)的建议稀释液对所有条件的神经元细胞进行最后一次洗涤。使用EVOS FL显微镜拍摄FM1-43标记的培养物。可以在RFP/GFP通道上监测FM1-43，并在Cy5通道上监测NucRed染色。
通过ImageB分析图像。我们使用分水岭分析来发掘传输信道中的神经元细胞体的边缘，并为每个细胞分配给定的细胞间区域。然后将这些区域映射到FM1-43层，并使用PunctaAnalyzer软件包计数每个区域中的点，同时忽略先前鉴定的细胞体，以便仅发掘沿着神经突的突触小泡点。将在两个孔内的为每个细胞计数的点平均化，每个孔具有两个观察视野。典型的分析如图23所示。
STP-DBCO-Cy5的细胞渗透
由具有N-末端Lys(N3)的D-立体异构体氨基酸合成先前报道的自发易位肽(pliyIrlIrGqf)。然后利用应变促进的点击化学在DMF中过夜，以1.1当量将DBCO-Cy5偶联至叠氮化物。为了验证这种肽可以将相当大的极性物质递送至神经元细胞质，将STP-DBCO-Cy5在神经元介质中稀释至1μM浓度，并加入到神经元中孵育30分钟。孵育完成后，用神经元培养基将细胞洗涤一次，用HBSS洗涤两次。用NucBlue Live Readyprobe(LifeTechnologies)的建议稀释液将细胞最后一次洗涤，以便使细胞核可视化。使用EVOS FL显微镜系统对神经元进行实时成像。可以在DAPI通道上监控NucBlue，可以在Cy5通道上监控STP-DBCO-Cy5。显示细胞质中的Cy5的细胞的代表性图示于图24中。
Inh-2和Inh-2-STP肽双环的合成
由在树脂上合成L-2环肽NH2-Pra-NYRWL-Lys(N3)(SEQ ID NO:20)开始，在Rink酰胺树脂上合成化合物Inh-2。如先前所述，将该肽环化和螯合。然后将接头区域偶联，产生化合物NH2-G-Aib-I-[Pra-NYRWL-Lys(N3)](SEQ ID NO:21)，其中方括号表示闭合环。然后将定制的“Tz4”残基Fmoc-Lys(N3-Boc-Pra-OH)-Otbu偶联到树脂上。在Fmoc脱保护后，根据是否需要正交可寻址的胺或生物素手柄，将Fmoc-Lys(Mtt)-OH或者Fmoc-Lys(生物素)-OH(均为Chempep)进行偶联(分别地，针对于Inh-2和Inh-2-STP)。在Fmoc脱保护后，如先前所述，偶联Inh-1肽，产生化合物NH2-Dab(DNP)-R-Lys(N3)-T-Dab(Boc)-Pra-L-Lys(MTT或生物素)-Tz4-G-Aib-I-[Pra-NYRWL-Lys(N3)](SEQ ID NO:13)，其中方括号表示闭合环。然后如上所述将该化合物再次环化并螯合，以产生双环化合物。对于Inh-2-STP合成，通过用1％TFA的DCM洗涤10次，从Lys(MTT)中除去MTT保护基团。通过黄色的洗脱液来监测已将保护基团除去。利用应变促进的点击化学在DMF中过夜，以1.1当量将DBCO-酸(Sigma)偶联至游离胺，和STP(参见上述合成)。以95:5:5的TFA:H2O:TES将该肽正常切割，并通过反相HPLC进行纯化。这些化合物的结构和MALDI-TOF谱图报道于图10、18和20中。

Claims (16)

1.一种特异性结合肉毒神经毒素A型蛋白的稳定的合成捕获剂，其中所述肉毒神经毒素A型蛋白包含重链和轻链，其中所述轻链包含酶活性位点，其中所述捕获剂包含锚定配体、第二配体和接头，并且其中所述锚定配体和第二配体特异性结合所述肉毒神经毒素A型蛋白，其中所述锚定配体与所述酶活性位点特异性结合，其中所述锚定配体包含具有式Dab(DNP)-R-[Lys(N3)-T-Dab-Pra]-L-NH-的环肽，其中方括号表示闭合环；其中所述第二配体特异性结合所述肉毒神经毒素A型蛋白轻链的第166-179位残基，其中所述第二配体包含具有式-[Pra-NYRWL-Lys(N3)]的环肽，其中方括号表示闭合环；其中所述接头为Gly-Aib-Leu或Leu-Aib-Gly、或PEG4，并且其中所述锚定配体和/或所述第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)或通过1,5-取代的1,2,3-三唑残基(Tz5)连接至所述接头。
2.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述锚定配体包含式Inh-1的分子
Figure FDA0003186551900000011
其中R1是连接至所述第二配体的所述接头。
3.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第二配体包含式L2的分子
Figure FDA0003186551900000021
其中R2是连接至所述锚定配体的所述接头。
4.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述锚定配体通过Tz4连接至所述接头。
5.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述捕获剂包含式Inh-2的分子
Figure FDA0003186551900000022
其中R3是氢、封端基团或者包含标记或自发转位肽。
6.根据权利要求5所述的捕获剂，其中所述标记选自由生物素、铜-DOTA、生物素-PEG3、氨氧基乙酸酯、19FB、18FB、5-羧基荧光素和FITC-PEG3所组成的组。
7.根据权利要求5所述的捕获剂，其中所述标记是可检测部分，选自由64Cu DOTA、68GaDOTA、68Ga NOTA、18F、Al18F NOTA、64Cu、68Ga、89Zr、124I、86Y、94mTc、110mIn、11C和76Br所组成的组。
8.根据权利要求5所述的捕获剂，其中所述自发转位肽包含pliylrllrGqf的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的捕获剂在制备药物中的用途，其中所述药物用于抑制由肉毒神经毒素A型蛋白介导的SNAP-25切割。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述捕获剂也与自发转位肽连接。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述自发转位肽包含pliylrllrGqf的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的捕获剂在制备用于治疗肉毒中毒的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述捕获剂也与自发转位肽连接。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述自发转位肽包含pliylrllrGqf的氨基酸序列。
15.一种合成根据权利要求1-8中任一项所述的捕获剂的方法，其中所述捕获剂用于抑制一个以上的神经元中由肉毒神经毒素A型蛋白介导的SNAP-25切割，其中所述肉毒神经毒素A型蛋白包含重链和轻链，其中所述轻链包含酶活性位点，所述方法包括
a.选择特异性结合所述肉毒神经毒素A型蛋白的所述酶活性位点的锚定配体；
b.选择与所述肉毒神经毒素A型蛋白轻链的第166-179位残基特异性结合的第二配体；和
c.使用接头将所述锚定配体和所述第二配体连接在一起，
其中所述锚定配体包含具有式Dab(DNP)-R-[Lys(N3)-T-Dab-Pra]-L-NH-的环肽，其中方括号表示闭合环；
其中，所述第二配体需要与表位结合，使得所述第二配体与肉毒神经毒素A型全毒素的封闭构象特异性结合，从而合成用于抑制一个以上的神经元中由肉毒神经毒素A型蛋白介导的SNAP-25切割的所述捕获剂；其中所述第二配体包含具有式-[Pra-NYRWL-Lys(N3)]的环肽，其中方括号表示闭合环；
其中所述接头为Gly-Aib-Leu或Leu-Aib-Gly、或PEG4，并且其中所述锚定配体和/或所述第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)或通过1,5-取代的1,2,3-三唑残基(Tz5)连接至所述接头。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在所述锚定配体和所述第二配体都结合至所述肉毒神经毒素A型蛋白时，所述接头的长度在所述锚定配体和所述第二配体之间距离的100％至110％以内。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6156954B2 (ja) * 2012-11-21 2017-07-05 イプセン バイオイノベーション リミテッド タンパク分解性にプロセシングされたポリペプチドの製造方法
CN107624115B (zh) 2015-03-16 2021-10-26 加州理工学院 肉毒神经毒素特异性捕获剂、组合物、使用方法和制造方法
CN109476713A (zh) * 2016-06-08 2019-03-15 儿童医学中心公司 工程改造的肉毒杆菌神经毒素
US11884707B2 (en) 2016-09-29 2024-01-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions for detection, inhibition and imaging of indoleamine 2, 3-dioxygenase 1 (IDO1) and methods of making and using same
WO2018232345A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Indi Molecular, Inc. Il-17f and il-17a-specific capture agents, compositions, and methods of using and making
US11638764B2 (en) * 2018-11-08 2023-05-02 Indi Molecular, Inc. Theranostic capture agents, compositions, and methods of using and making
WO2022098743A1 (en) 2020-11-03 2022-05-12 Indi Molecular, Inc. Compositions, imaging, and therapeutic methods targeting folate receptor 1 (folr1)
WO2022098745A1 (en) * 2020-11-03 2022-05-12 Indi Molecular, Inc. Compositions, delivery systems, and methods useful in tumor therapy

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4899755A (en) 1985-05-08 1990-02-13 The General Hospital Corporation Hepatobiliary NMR contrast agents
MX174467B (es) 1986-01-23 1994-05-17 Squibb & Sons Inc 1,4,7-triscarboximetil-1,4,7,10-tetraazaciclodo decano substituido en 1 y compuestos analogos
JPH05503072A (ja) 1989-08-28 1993-05-27 ザ・ゼネラル・ホスピタル・コーポレーション 診断用ｎｍｒ映像化の為のヒドロキシ―アリール金属キレート
US5582814A (en) 1994-04-15 1996-12-10 Metasyn, Inc. 1-(p-n-butylbenzyl) DTPA for magnetic resonance imaging
JPH09512265A (ja) 1994-04-20 1997-12-09 ニコムド サルター アイエヌシー コントラスト剤
TW319763B (zh) 1995-02-01 1997-11-11 Epix Medical Inc
US5547668A (en) 1995-05-05 1996-08-20 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Conjugates of folate anti-effector cell antibodies
IL125895A (en) 1996-04-01 2001-09-13 Epix Medical Inc Use of an image-enhancing moiety in the preparation of a bioactivated nmr or optical imaging contrast agent from a prodrug
WO1998018497A2 (en) 1996-10-28 1998-05-07 Nycomed Imaging As Contrast agents
ES2257771T3 (es) 1996-10-28 2006-08-01 Amersham Health As Agentes de contraste.
US5919967A (en) 1997-04-11 1999-07-06 Epix Medical, Inc. Process for synthesizing phosphodiesters
AU742438C (en) 1997-10-02 2003-05-22 Lantheus Medical Imaging, Inc. Contrast-enhanced diagnostic imaging method for monitoring interventional therapies
GB9722779D0 (en) 1997-10-28 1997-12-24 Isis Innovation Human CD8 as an inhibitor of the cellular immune system
US6667158B1 (en) * 1998-12-17 2003-12-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Antibodies against type a botulinum neurotoxin
AU2002307163B2 (en) 2001-04-10 2006-06-29 Merck & Co., Inc. A method of treating cancer
AU2002322466B2 (en) 2001-07-11 2007-08-30 Palatin Technologies, Inc. Linear and cyclic melanocortin receptor-specific peptides
US6566088B1 (en) 2001-10-04 2003-05-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Prolyl-4-hydroxylases
US20060153839A1 (en) 2002-09-16 2006-07-13 Elusys Therapeutics, Inc. Production of bispecific molecules using polyethylene glycol linkers
WO2005113762A1 (en) 2004-05-18 2005-12-01 Pfizer Products Inc. CRYSTAL STRUCTURE OF PROTEIN KINASE B-α (AKT-1) AND USES THEREOF
EP1940787A4 (en) 2005-10-27 2009-07-01 Lankenau Inst Medical Res NOVEL IDO INHIBITORS AND METHODS OF USE
GB0720118D0 (en) 2007-10-15 2007-11-28 Achour Adnane Modified mhc class 1 binding peptides
WO2009105746A2 (en) 2008-02-22 2009-08-27 University Of South Florida Triazoles and processes for producing the same
JP5647113B2 (ja) 2008-06-18 2014-12-24 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 多リガンド捕捉剤ならびに関連組成物、方法およびシステム
SG175276A1 (en) 2009-05-05 2011-11-28 Novimmune Sa Anti-il-17f antibodies and methods of use thereof
WO2010135431A2 (en) 2009-05-19 2010-11-25 The Regents Of The University Of California Compositions, devices, and methods related to prostate-specific membrane antigen
WO2011057347A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Tgr Biosciences Pty Ltd Analyte detection
AU2012212006A1 (en) 2011-02-03 2013-08-15 California Institute Of Technology PSA capture agents, compositions, methods and preparation thereof
US10108386B2 (en) 2011-02-04 2018-10-23 Qualcomm Incorporated Content provisioning for wireless back channel
EP2505641B1 (en) 2011-04-01 2015-04-15 F. Hoffmann-La Roche AG T7 RNA polymerase variants with Cysteine-Serine substitutions
US9239332B2 (en) 2011-07-11 2016-01-19 Indi Molecular, Inc. Akt-specific capture agents, compositions, and methods of using and making
CA2846030A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Indi Molecular, Inc. Vegf-specific capture agents, compositions and methods of using and making
WO2013034982A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 The University Of British Columbia Immunomodulatory peptides for treatment of progressive neurodegenerative diseases
EP3372239B1 (en) * 2012-05-30 2020-11-11 President and Fellows of Harvard College Engineered botulinum neurotoxin
US9801473B2 (en) 2012-09-13 2017-10-31 Kids Ii, Inc. Play yard with removable liner
RU2015113348A (ru) 2012-10-08 2016-11-27 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Проникающие в клетки пептиды, связывающие интерферон-регулирующий фактор 5
EP2719706A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-16 Universität Zürich Bispecific HER2 ligands for cancer therapy
WO2014074907A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Indi Molecular, Inc. C-met-specific capture agents, compositions, and methods of using and making
WO2014205317A2 (en) 2013-06-20 2014-12-24 California Institute Of Technology Cyclic peptides as protein targeting agents
US9820182B2 (en) 2013-07-12 2017-11-14 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Method for enabling control of data packet flows belonging to different access technologies
WO2015038904A1 (en) 2013-09-12 2015-03-19 California Institute Of Technology Anti-gp41 antibody-specific capture agents, compositions, and methods of using and making
WO2015171543A1 (en) 2014-05-05 2015-11-12 California Institute Of Technology Mutant akt-specific capture agents, compositions, and methods of using and making
CN107624115B (zh) 2015-03-16 2021-10-26 加州理工学院 肉毒神经毒素特异性捕获剂、组合物、使用方法和制造方法
CN108290927B (zh) 2015-07-15 2022-06-24 加州理工学院 Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法
CN109476721B (zh) 2016-04-04 2022-06-28 英蒂分子公司 Cd8-特异性捕获剂、组合物及使用和制备方法
US11884707B2 (en) 2016-09-29 2024-01-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions for detection, inhibition and imaging of indoleamine 2, 3-dioxygenase 1 (IDO1) and methods of making and using same
CN110325206A (zh) 2016-12-13 2019-10-11 埃默里大学 用于管理病毒感染的多肽
WO2018170096A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Dualogics, Llc Use of a cd4/cd8 bispecific antibody for the treatment of diabetes
US20210100920A1 (en) 2017-04-24 2021-04-08 Case Western Reserve University Methods and agents for the detection and treatment of cancer
WO2019157362A1 (en) 2018-02-09 2019-08-15 Healthtell Inc. Array-based cyclic peptide libraries
US20220032592A1 (en) 2018-12-17 2022-02-03 Polycine Gmbh Flexible multi-layered film having uv and visible light barrier layer for medical packaging
WO2022098745A1 (en) 2020-11-03 2022-05-12 Indi Molecular, Inc. Compositions, delivery systems, and methods useful in tumor therapy

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