TW202304956A - 陽離子型神經毒素 - Google Patents
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Abstract
本發明提供包含至少一個胺基酸修改之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素，其中該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的等電點(pI)值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出0.2個pI單位。本發明亦提供該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素於治療之對應用途。
Description
本發明關於包含至少一個胺基酸修改之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素，及這類經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素於醫藥和治療之用途。
梭狀芽胞桿菌屬之細菌製造強效及特異性蛋白毒素，其可能傳遞至神經元及其他細胞並加以毒害。這類梭狀芽孢桿菌毒素之實例包括由破傷風梭狀芽孢桿菌(C.tetani)(TeNT)和由肉毒梭狀芽孢桿菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A至G製造之神經毒素，以及由巴氏梭狀芽孢桿菌(C.baratii)和丁酸梭狀芽孢桿菌(C.butyricum)所製造者。
梭狀芽孢桿菌毒素中有些為已知之最強的毒素。舉例而言，小鼠之肉毒桿菌神經毒素的半數致死劑量(LD50)的中位數根據血清型係在0.5至5毫微克/公斤之範圍內。破傷風及肉毒桿菌毒素均藉由抑制受影響之神經元的功能
(具體的說，釋出神經遞質)來作用。雖然肉毒桿菌毒素係作用於神經肌肉接合處並抑制周圍神經系統中之膽鹼能傳遞，破傷風毒素係作用於中樞神經系統。
在自然界中，梭狀芽孢桿菌毒素係以單鏈多肽形式合成，其係在轉譯後藉由蛋白水解切割進行修改，以形成藉由二硫鍵連接在一起的兩條多肽鏈。切割係發生在位於提供鏈間二硫鍵之半胱胺酸殘基之間的特定切割位點，通常稱為活化位點。此二鏈形式正是該毒素之活性形式。此兩鏈稱為重鏈(H-鏈)(其分子量約為100kDa)及輕鏈(L-鏈)(其分子量約為50kDa)。H-鏈包含N-端轉位組分(HN結構域)及C-端定向組分(HC結構域)。切割位點係位於L-鏈與轉位結構域組分之間。HC結構域與其靶向神經元結合並經由核內體將經結合之毒素內化入細胞後，HN結構域將L-鏈轉位穿越核內體膜進入細胞溶質，而L-鏈提供蛋白酶功能(亦稱為非細胞毒性蛋白酶)。
非細胞毒性蛋白酶係藉由蛋白水解切割稱為SNARE蛋白質(例如SNAP-25、VAMP或Syntaxin)之胞內轉運蛋白來作用-參見Gerald K(2002)"Cell and Molecular Biology"(第4版)，John Wiley & Sons公司。首字母縮略詞SNARE係源自術語可溶性NSF連接受體(Soluble NSF Attachment Receptor)，其中NSF意指N-乙基馬來醯亞胺敏感因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白對胞內囊泡融合物從細胞經由囊泡轉運是不可或缺的，因而對分泌之分子從細胞經由囊泡轉運也是不可或缺的。
該蛋白酶之功能為鋅依賴性內肽酶活性，並顯示出對SNARE蛋白具有高受質特異性。因此，一旦被遞送至所欲之標靶細胞，該非細胞毒性蛋白酶能夠抑制來自靶細胞之細胞分泌。梭狀芽孢桿菌毒素之L-鏈蛋白酶為切割SNARE蛋白之非細胞毒性蛋白酶。
鑑於SNARE蛋白之無處不在的性質，梭狀芽孢桿菌毒素，諸如肉毒桿菌毒素已成功地用於廣泛之療法中。
舉例而言，我們參考William J.Lipham，Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin(Slack公司，2004)，其描述在多種治療和美容應用中使用梭狀芽孢桿菌神經毒素(諸如肉毒桿菌神經毒素(BoNT)，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G，以及破傷風神經毒素(TeNT))來抑制神經元傳遞-例如BOTOXTM目前被核准作為下列適應症之治療劑：賁門失弛緩症(achalasia)、成人痙攣(adult spasticity)、肛裂(anal fissure)、背痛(back pain)、眼瞼痙攣(blepharospasm)、磨牙症(bruxism)、頸部肌張力不全(cervical dystonia)、原發性震顫(essential tremor)、眉間紋(glabellar lines)或臉部運動過強的皺紋(hyperkinetic facial lines)、頭痛、半面痙攣(hemifacial spasm)、膀胱過動(hyperactivity of bladder)、多汗症(hyperhidrosis)、幼年型腦性麻痺(juvenile cerebral palsy)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、肌陣攣性病症(myoclonic disorders)、鼻唇皺紋(nasal labial lines)、痙攣性發音障礙
(spasmodic dysphonia)、斜視(strabismus)及第VⅡ神經病症(VⅡ nerve disorder)。此外，梭狀芽孢桿菌毒素療法被描述可用於治療神經肌肉病症(參見US 6,872,397)；用於治療子宮病症(參見US 2004/0175399)；用於治療潰瘍和胃食道逆流疾病(參見US 2004/0086531)；用於治療肌張力不全(參見US 6,319,505)；用於治療眼睛病症(參見US 2004/0234532)；用於治療眼瞼痙攣(blepharospasm)(參見US 2004/0151740)；用於治療斜視眼(strabismus)(參見US 2004/0126396)；用於治療疼痛(參見US 6,869,610、US 6,641,820、US 6,464,986及US 6,113,915)；用於治療纖維肌痛(參見US 6,623,742、US 2004/0062776)；用於治療下背痛(參見US 2004/0037852)；用於治療肌肉損傷(參見US 6,423,319)；用於治療竇性頭痛(參見US 6,838,434)；用於治療緊張性頭痛(參見US 6,776,992)；用於治療頭痛(參見US 6,458,365)；用於減輕偏頭痛(參見US 5,714,469)；或用於治療心血管疾病(參見US 6,767,544)；用於治療神經系統疾病，諸如帕金森氏病(參見US 6,620,415、US 6,306,403)；用於治療神經精神病症(參見US 2004/0180061、US 2003/0211121)；用於治療內分泌紊亂(參見US 6,827,931)；用於治療甲狀腺病症(參見US 6,740,321)；用於治療膽鹼能影響之汗腺病症(參見US 6,683,049)；用於治療糖尿病(參見US 6,337,075、US 6,416,765)；用於治療胰腺病症(參見US 6,261,572、US 6,143,306)；用於治療癌症，諸如骨腫瘤(參見US
6,565,870、US 6,368,605、US 6,139,845、US 2005/0031648)；用於治療耳部病症(參見US 6,358,926、US 6,265,379)；用於治療自主神經病症，諸如胃腸道肌肉病症及其他平滑肌機能障礙(參見US 5,437,291)；用於治療與皮膚細胞增殖性病症相關之皮膚損傷(參見US 5,670,484)；用於管理神經原性發炎性病症(參見US 6,063,768)；用於減少脫髮及刺激毛髮生長(參見US 6,299,893)；用於治療嘴角下垂(參見US 6,358,917)；用於降低食慾(參見US 2004/40253274)；用於牙科療法及程序(參見US 2004/0115139)；用於治療神經肌肉病症及病況(參見US 2002/0010138)；用於治療各種病症和病況，及相關疼痛(參見US 2004/0013692)；用於治療從黏液高度分泌造成之病況，諸如哮喘和COPD(參見WO 00/10598)；及用於治療非神經元病況，諸如發炎、內分泌病況、外分泌病況、免疫病況、心血管病況、骨病況(參見WO 01/21213)。所有上述刊物之全部內容以引用方式併入本文。
預料非細胞毒性蛋白酶，諸如梭狀芽孢桿菌毒素(例如BoNT和TeNT)於人類及其他哺乳動物之治療劑和美容治療中的用途可擴展至日益擴大之能受益於這些毒素之性質的疾病及失調範圍。
為了避免全身性神經系統的影響，許多梭狀芽孢桿菌毒素療法係採用直接將梭狀芽孢桿菌毒素治療劑投予在指定之標靶位點(諸如標靶組織)。以此方式投予以梭狀芽孢
桿菌毒素為基礎之治療劑的問題是毒素從投予位點擴散開並進入周圍組織或系統循環。咸信，毒素從標靶組織擴散開會造成不欲有之副作用，在極端的情況下，可能會危及生命。當使用高劑量、濃度及注射體積之梭狀芽孢桿菌毒素治療劑(諸如BoNT治療劑)時，可能需要特別關注此點。市售之BoNT/A治療劑已有與此問題相關之副作用的報告，包括虛弱(asthenia)、全身肌肉無力、複視(diplopia)、上瞼下垂(ptosis)、吞嚥困難、發音困難、構音障礙、小便失禁及呼吸困難。吞嚥和呼吸困難可危及生命，且已有與毒素效果擴散相關之死亡的報導。
因此，本技藝需要具有以下性質之梭狀芽孢桿菌毒素：與已知之梭狀芽孢桿菌毒素相比較，其在投予位點之組織滯留增加，因此顯現出減少從投予位點擴散開。
本發明藉由提供如申請專利範圍中具體指明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素來解決上述問題。
於一態樣中，本發明提供包含至少一個胺基酸修改之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素，其中該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的等電點(pI)值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出0.2(例如，至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)個pI單位。於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改增加該經遺
傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出0.4個pI單位。於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出0.5個pI單位。於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出0.6個pI單位。於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出0.8個pI單位。於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出1個pI單位。
於一態樣中，本發明提供包含至少一個胺基酸修改之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素，其中該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的等電點(pI)值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出一個pI單位。
於某些實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素包含至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、
35、40、45、50、55、60、65、70、75或80個胺基酸修改。
於某些實施態樣中，該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出2、3、4或5個pI單位。
本發明者已發現經由增加梭狀芽孢桿菌毒素之pI，例如增加至少0.2個pI單位、或0.5個pI單位、或一個pI單位(透過在該梭狀芽孢桿菌毒素蛋白中引入至少一個胺基酸修改)，所產生之經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素可有利地顯示出組織滯留增加，且減少擴散至遠離投藥之位點的性質，但保留與靶細胞結合、轉位及將SNARE蛋白切割之能力。因此，與缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素相比較，梭狀芽孢桿菌毒素顯著減少從給藥位點擴散。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素適合用於上述之任一療法，有利的是，與已知之梭狀芽孢桿菌毒素治療劑相比較，顯示出副作用減少，或無副作用。
與已知之梭狀芽孢桿菌毒素治療劑相比較，本發明之經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的增加組織滯留之性質亦提供增加之作用效力及/或持續時間，並可允許降低欲使用之劑量(或增加劑量，但無任何額外之不利影響)，從而提供進一步之利益。
如下文中更詳細之討論，由至少一個胺基酸修改提供
之pI值增加意指本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素在指定之pH值下所具有的淨電荷較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素所具有的淨電荷更為正數。不欲受限於任一理論，本發明者相信此增加之正電荷使本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素顯示出在給藥位點的組織保留時間較長，因為在給藥位點處之經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素與陰離子性胞外組分(諸如細胞膜及硫酸肝素蛋白聚醣)之間具有有利之靜電交互作用。這些改善之靜電交互作用有助於減少經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素擴散遠離給藥位點，從而改善在組織中滯留。
舉例而言，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素的組織滯留性改善可允許(i)較高之劑量進入個別肌肉，諸如胸鎖乳突肌，但不會擴散入附近之頸部肌肉而引起吞嚥困難，及(ii)在單一治療中之較高的總劑量(進入所有肌肉中)，但不會擴散入循環中而造成全身性影響，諸如呼吸困難。對患者之利益可包括更有效地治療大肌肉(諸如胸鎖乳突肌)、增加在每次治療期間注射數種不同肌肉的機會及由於較高之劑量而可能較長之有效治療持續期間(需要再次進行治療前的時間較長)。
於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素在使用時具有正淨電荷(例如當使用之經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素係位在組織中之所需的給藥位點)。
等電點(pI)為指定蛋白質之特異性質。如本技藝中所周知，蛋白質係從胺基酸之特異序列(當在蛋白質中亦稱為胺基酸殘基)製造。具有20個胺基酸之標準組的每個胺基酸均具有不同的側鏈(或R基團)，意指蛋白質中之各胺基酸殘基顯示出不同的化學性質，諸如電荷及疏水性。這些性質可能受周圍的化學環境，諸如溫度和pH值影響。蛋白質之總體化學特性將取決於這些各種因素之總和。
某些胺基酸殘基(詳述於下文中)擁有可根據周圍pH值顯示電荷之可離子化的側鏈。這類側鏈在指定之pH值下是否帶電係取決於該相關之可離子化部分的pKa，其中pKa為來自共軛鹼之特定質子的酸解離常數(Ka)之負對數。
例如酸性殘基，諸如天門冬胺酸及麩胺酸具有pKa值約為4.1之側鏈羧酸基團(精確之pKa值可能取決於該可離子化基團之溫度、離子強度及微環境)。因此，這些側鏈在pH 7.4下顯示出負電荷(通常稱為“生理pH”)。在低pH值下，這些側鏈將成為質子化的並失去其電荷。
相反地，鹼性殘基，諸如離胺酸和精胺酸具有pKa值約為10至12之含氮側鏈基團。因此，這些側鏈在pH 7.4下顯示出正電荷。在高pH值下，這些側鏈將成為去質子化的，並失去其電荷。
因此，蛋白質分子之總(淨)電荷取決於存在於蛋白質中之酸性和鹼性殘基的數目(及其表面暴露程度)和周圍pH值。周圍pH值的變化改變蛋白質上之總電荷。因此，每
一蛋白質均有一個指定的pH值，在此pH值下，正電荷及負電荷之數目相等，而蛋白質顯示出無總淨電荷。此點被稱為等電點(pI)。等電點為熟習本技藝之人士所熟悉之蛋白質生物化學中的標準概念。
因此，等電點(pI)之定義為蛋白質在此顯示出淨電荷為零之pH值。pI增加意指蛋白質需要更高之pH值以顯示淨電荷為零。因此，pI增加代表蛋白質在指定之pH值下淨正電荷增加。相反地，pI下降意指蛋白質需要較低之pH值以顯示淨電荷為零。因此，pI降低代表蛋白質在指定之pH值下淨正電荷減少。
測定蛋白質之pI的方法為本技藝已知且為技術人員所熟悉。舉例而言，蛋白質之pI可從存在於蛋白質中之各胺基酸的平均pKa值計算出。或者，蛋白質之pI可使用等電聚焦技術，藉由實驗方法測定。此技術使用電泳法來根據蛋白質之等電點分離蛋白質。等電聚焦法通常使用具有固定之pH梯度的凝膠進行。當施加電場時，該蛋白質通過pH梯度移行，直到該蛋白質到達在其淨電荷為零的pH值，此點為該蛋白質之等電點。
蛋白質之pI值可經由改變顯示在其表面上之鹼性及/或酸性基團的數目來增加或減少。此可經由修改該蛋白質之一或多個胺基酸來達成。例如，經由減少酸性殘基之數目，或增加鹼性殘基之數目可使pI增加。這類胺基酸修改更詳細地討論於下文中。
天然(未修改)梭狀芽孢桿菌毒素之pI約為5-6。因
此，在pH值7.4下，天然肉毒桿菌毒素具有負淨電荷。舉例而言，BoNT/A之pI為6.4，而BoNT/A分子在pH值7.4下之淨電荷為-8。這些pI值係依上述計算。
如上述，於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素包含至少一個胺基酸修改，其中該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的等電點(pI)值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出0.2個pI單位。
因此，在本發明之背景下，在經遺傳工程處理之BoNT/A梭狀芽孢桿菌毒素的情況中pI增加0.2個單位將使pI從6.4增加至6.6。
如上述，於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素包含至少一個胺基酸修改，其中該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的等電點(pI)值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但
其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出一個pI單位。
因此，在本發明之背景下，在經遺傳工程處理之BoNT/A梭狀芽孢桿菌毒素的情況中pI增加1個單位將使pI值從6.4增加至7.4。
於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的等電點(pI)值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出2個pI單位。
於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的等電點(pI)值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值高出2至5個pI單位。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的pI至少為6(例如至少6、至少7、至少8或至少9)。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的pI至少為7。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的pI值係介於6和10之間(例如pI介於7和9之間、或pI介於8和9之間)。
如上文所討論者，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素具有增加之組織滯留性質，此性質亦提供增加之效力及/或作用持續時間，且與已知之梭狀芽孢桿菌毒
素治療劑相比較，可允許減少欲使用之劑量(或增加劑量，但無任何額外的效果)。定義這些有利特性(其代表治療指數增加)的一種方法係就該經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素之安全性來定義。就此點而言，梭狀芽孢桿菌毒素之不欲有的作用(由毒素擴散至遠離給藥位點所造成)可在相關的動物模型中經由實驗方式測量體重損失的百分比來評估(例如在老鼠模型中，其中係在投藥之七天內檢測體重之損失)。相反地，所需之梭狀芽孢桿菌毒素的指標效果可經由實驗方式藉由指頭外展積分(Digital Abduction Score)(DAS)分析(測量肌肉麻痺)來評估。DAS分析可經由下述步驟進行：在老鼠腓腸肌/比目魚肌群注射20微升在明膠磷酸鹽緩衝液中配製之梭狀芽孢桿菌毒素，再使用Aoki之方法(Aoki KR，Toxicon 39：1815-1820，2001)，藉由指頭外展積分評估。在DAS分析中，藉著尾巴將小鼠短暫懸起，以引出其中老鼠伸展其後肢且外展其後指頭之特色驚嚇反應。注射梭狀芽孢桿菌毒素後，在五分量表上記錄指頭外展的不同程度(0=正常至4=指頭外展且腿部伸展減少最多)。
梭狀芽孢桿菌毒素之安全性比可以體重下降10%(在給予小鼠劑量後的前七天內之尖峰效果下測量)所需之毒素量與DAS積分為2所需之毒素量之間的比率表示。因此，高安全比積分是有需要的，且表示此毒素能有效地麻痺目標肌肉，但僅有一點不欲有之脫靶效果。本發明之經遺傳工程處理之毒素所具有之安全比較同等的未經修改
(天然)之肉毒桿菌毒素高。
因此，於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素之安全比至少為8(例如，至少8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50)，其中安全比之計算如下：-10%體重變化所需之毒素劑量(皮克/老鼠)除以DAS ED50(皮克/老鼠)[ED50=產生DAS積分2時所需之劑量]。
於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素之安全比至少為10，於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素之安全比至少為15。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素包含至少一個胺基酸修改。如上交中所討論者，該至少一個胺基酸修改增加梭狀芽孢桿菌毒素之pI。在本發明之背景中，胺基酸修改為梭狀芽孢桿菌毒素之胺基酸序列的修改。這類修改可經由以另一胺基酸替代序列中之一個胺基酸(即，取代)、在序列中插入一個新胺基酸或刪除序列中之一個胺基酸來生效。被併入蛋白質中之胺基酸序列的胺基酸亦稱為胺基酸殘基。
在蛋白質中發現之20個標準胺基酸如下：
下列胺基酸被視為帶電荷之胺基酸：天門冬胺酸(負電荷)、麩胺酸(負電荷)、精胺酸(正電荷)及離胺酸(正電荷)。
在pH 7.4下，天門冬胺酸(pKa 3.1)及麩胺酸(pKa 4.1)之側鏈具有負電荷，而精胺酸(pKa 12.5)及離胺酸(pKa 10.8)之側鏈具有正電荷。天門冬胺酸及麩胺酸被稱為酸性胺基酸殘基。精胺酸及離胺酸被稱為鹼性胺基酸殘基。
下列胺基酸被視為不帶電荷、極性(意味其可參與氫鍵鍵結)之胺基酸：天門冬醯胺、麩胺醯胺、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、色胺酸。
下列胺基酸被視為不帶電荷，疏水性胺基酸：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸及甘胺酸。
增加梭狀芽孢桿菌毒素之pI可經由在梭狀芽孢桿菌毒素中引入一或多個能增加該梭狀芽孢桿菌毒素中之正電荷對負電荷之比的胺基酸修改來進行。
於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改係選自：胺基酸取代、胺基酸插入及胺基酸缺失。
於胺基酸取代中，形成梭狀芽孢桿菌毒素胺基酸序列之一部分的胺基酸殘基被不同的胺基酸殘基替換。替換之胺基酸殘基可為如上述之20個標準胺基酸之一。
或者，在胺基酸取代中之替換的胺基酸可為非標準胺基酸(非上述20個標準胺基酸組之一部分的胺基酸)。舉例而言，替換之胺基酸可為鹼性非標準胺基酸，例如L-鳥胺酸、L-2-胺基-3-胍基丙酸或離胺酸、精胺酸及鳥胺酸之D-異構體。用於將非標準胺基酸引入蛋白質的方法為本技藝中已知，且包括使用大腸桿菌營養缺陷型表現宿主之重組蛋白質合成法。
在胺基酸插入中係在梭狀芽孢桿菌毒素的胺基酸序列中納入額外之胺基酸殘基(並非正常存在之胺基酸殘基)，從而增加該序列中之胺基酸殘基的總數。在胺基酸删除中
係從梭狀芽孢桿菌毒素的胺基酸序列移除胺基酸殘基，從而減少該序列中之胺基酸殘基的總數。
經由取代、插入或删除胺基酸殘基來修改蛋白質之方法為本技藝所已知。舉例而言，胺基酸修改可經由修改編碼梭狀芽孢桿菌毒素之DNA序列來引入。此可使用標準分子選殖技術來達成，例如定點誘變，其中使用聚合酶，以編碼所需胺基酸之DNA(寡核苷酸)的短股替代原始之編碼序列，或以各種不同的酶(例如連接酶及限制性核酸內切酶)插入/刪除部分基因進行。或者，可以化學方式合成修改之基因序列。
於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改係選自：以鹼性胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基；以不帶電荷之胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基；以鹼性胺基酸殘基取代不帶電荷之胺基酸殘基；插入鹼性胺基酸殘基；及删除酸性胺基酸殘基。
於一較佳之實施態樣中，該至少一個胺基酸修改為取代，其有利地將梭狀芽孢桿菌毒素中之胺基酸殘基的數目保持相同。於一實施態樣中，該取代係選自：以鹼性胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基、以不帶電荷之胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基及以鹼性胺基酸殘基取代不帶電荷之胺基酸殘基。於一實施態樣中，該鹼性胺基酸殘基為離胺酸殘基或精胺酸殘基。於一實施態樣中，該鹼性胺基酸殘基為離胺酸殘基。於一實施態樣中，該鹼性胺基酸殘基為精胺酸殘基。於一其中該取代為以不帶電荷之胺基酸殘基取
代酸性胺基酸殘基的實施態樣中，該酸性胺基酸殘基係被其對應之不帶電荷的胺基酸殘基所取代(即，天門冬胺酸被天門冬醯胺所取代，麩胺酸被麩胺醯胺所取代)。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素可包含一個以上之胺基酸修改。因此，於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素(如上述)包含1至80個胺基酸修改(例如1至70個、1至60個、1至50個、4至40個、4至30個、5至40個、5至30個或10至25個胺基酸修改)。於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素(如上述)包含4至40個胺基酸修改。在於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、或至少10個胺基酸修改。於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素包含至少4個胺基酸修改(例如，至少4個胺基酸取代)。該胺基酸之各個修改為如上述之胺基酸修改。因此，該胺基酸之各個修改有助於增加該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的pI(與缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之梭狀芽孢桿菌毒素的pI相比較)。
任何梭狀芽孢桿菌毒素之胺基酸(即，胺基酸殘基)均可依上述加以修改，只要該修改之結果為使梭狀芽孢桿菌毒素的pI增加(如上述)。然而，本發明者已鑑定出為特別合適之修改目標的梭狀芽孢桿菌毒素的胺基酸之子集。
較佳之目標胺基酸可能具有某些特質。舉例而言，較
佳之目標胺基酸可為：(i)表面暴露之胺基酸；(ii)位於梭狀芽孢桿菌毒素蛋白之二級結構外面；(iii)位於對蛋白質功能而言非必需之梭狀芽孢桿菌毒素蛋白區；(iv)其特性未被保留在梭狀芽孢桿菌毒素類型、亞型或血清型之間的胺基酸；(iv)其修改不會創建預定之泛素化位點的胺基酸；或(v)前述之任何組合。
如上文所討論者，梭狀芽孢桿菌毒素係從兩條多肽鏈(分子量約100kDa之重鏈(H-鏈)及分子量約50kDa之輕鏈(L-鏈))形成。H-鏈包含C-端定向組分(受體結合結構域或HC結構域)及N-端轉位組分(HN結構域)。
於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改(如上述)位於梭狀芽孢桿菌毒素受體結合結構域(HC結構域)中。
輕鏈參考序列之實例包括：
A型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-448
B型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-440
C1型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-441
D型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-445
E型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-422
F型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-439
G型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-441
破傷風神經毒素：胺基酸殘基1-457
上文中鑑別之參考序列應被視為指南，因為根據亞血清型可能出現些微變化。舉例而言，美國2007/0166332(其全文以引用方式被併入本文)列舉略有不同的梭狀芽孢
桿菌序列：
A型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K448
B型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K441
C1型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K449
D型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-R445
E型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-R422
F型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K439
G型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K446
破傷風神經毒素：胺基酸殘基M1-A457
梭狀芽孢桿菌毒素HC結構域參考序列之實例包括：
BoNT/A-N872-L1296
BoNT/B-E859-E1291
BoNT/C1-N867-E1291
BoNT/D-S863-E1276
BoNT/E-R846-K1252
BoNT/F-K865-E1274
BoNT/G-N864-E1297
TeNT-I880-D1315
梭狀芽孢桿菌毒素(諸如BoNT)之HC結構域包含稱為HCC及HCN結構域之兩種不同的結構特性。咸信，涉及受體結合之胺基酸殘基主要位於HCC結構域。
於一實施態樣中，其中該至少一個胺基酸修改(如上述)係位於梭狀芽孢桿菌毒素受體結合結構域(HC結構域)中，該至少一個胺基酸修改係位於梭狀芽孢桿菌毒素HCN結構域(亦稱為轉位促進結構域)中。於一實施態樣中，其
中該至少一個胺基酸修改(如上述)係位於梭狀芽孢桿菌毒素受體結合結構域(HC結構域)中，該至少一個胺基酸修改係位於梭狀芽孢桿菌毒素HCC結構域中。
梭狀芽孢桿菌毒素HCN結構域參考序列之實例包括：
A型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基872-1110
B型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基859-1097
C1型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基867-1111
D型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基863-1098
E型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基846-1085
F型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基865-1105
G型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基864-1105
破傷風神經毒素：胺基酸殘基880-1127
上述序列位置根據血清型/亞型可能有些微變化且其他合適(參考)之梭狀芽孢桿菌毒素HCN結構域之實例包括：
A型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基874-1110
B型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基861-1097
C1型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基869-1111
D型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基865-1098
E型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基848-1085
F型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基867-1105
G型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基866-1105
破傷風神經毒素：胺基酸殘基882-1127
於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改(如上述)為
修改表面暴露之胺基酸殘基。相對於位於折疊蛋白內部之胺基酸殘基而言，表面暴露之胺基酸殘基為那些存在於折疊蛋白外部，因而可被周圍溶劑接近者。胺基酸殘基之表面暴露程度(從而推及其暴露於周圍溶劑之程度)係取決於其在折疊蛋白內之位置，亦取決於該蛋白質採取之構型。因此，修改高度表面暴露之胺基酸殘基對於蛋白質之等電點的影響可能高於修改低度表面暴露之胺基酸殘基。用於測定胺基酸殘基之表面暴露程度的方法為本技藝所已知。舉例而言，可使用電腦程式AreaIMol(電腦程式之CCP4套件的一部分)來計算指定之蛋白質中之胺基酸殘基的表面暴露程度。表面暴露之胺基酸殘基亦可藉由視覺檢查蛋白質晶體結構(諸如由X射線晶體學所提供者)來鑑定。於一實施態樣中，表面暴露之胺基酸殘基的AreaIMol值的總和至少為40。
於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改包含修改選自下列群組之胺基酸殘基：天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、組胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、天門冬醯胺殘基、麩胺醯胺殘基、半胱胺酸殘基或酪胺酸殘基。本發明者已確認來自此群組之胺基酸殘基(帶負電荷之殘基和極性殘基)代表特別適合作為根據本發明之修改的標的。不希望受限於任一理論，本發明者相信此群組中之胺基酸殘基出現在梭狀芽孢桿菌毒素之表面上的頻率較未列出之疏水性殘基來得高。
於一實施態樣中，其中該胺基酸修改包含修改選自下
列群組之胺基酸殘基：天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、組胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、天門冬醯胺殘基、麩胺醯胺殘基、半胱胺酸殘基或酪胺酸殘基(如上述)，該胺基酸殘基被離胺酸殘基或精胺酸殘基所取代。因此，於一實施態樣中，帶負電荷之殘基或極性殘基被帶正電荷之殘基所取代，從而增加正電荷對負電荷之比率，並增加該梭狀芽孢桿菌毒素之pI。
於一實施態樣中，該至少一個胺基酸修改(如上述)包含修改天門冬醯胺胺基酸殘基或麩胺醯胺胺基酸殘基(均為不帶電荷之極性殘基)。於一實施態樣中，該天門冬醯胺或麩胺醯胺胺基酸殘基被離胺酸殘基或精胺酸殘基(均為正電荷殘基)所取代。於一實施態樣中，該天門冬醯胺或麩胺醯胺胺基酸殘基被離胺酸殘基所取代。於一實施態樣中，該天門冬醯胺或麩胺醯胺胺基酸殘基被精胺酸殘基所取代。
當天門冬醯胺及麩胺醯胺殘基為極性，僅與其他殘基形成微弱之偶極交互作用，且構成14%之典型梭狀芽孢桿菌毒素分子(諸如BoNT/A)時，其對修改之合適性是有利的。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A。BoNT/A參考序列之UniProtKB登錄編號為P10845。
本發明者已鑑定出某些代表BoNT/A梭狀芽孢桿菌毒素中較佳之胺基酸修改的標的之胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086及GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、
GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086及GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086及GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢
桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083及ASP 1086；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN
1242、ASN 1243、SER 1274及THR 1277；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274及THR 1277；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含
以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274及THR 1277；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5或6個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修
改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI值高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5或6個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5或6個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修
改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列7個胺基酸之修改：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列7個胺基酸之修改：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1
個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列7個胺基酸之修改：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5或6個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣
中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5或6個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5或6個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該
修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列7個胺基酸之修改：ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列7個胺基酸之修改：ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢
桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列7個胺基酸之修改：ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5或6個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5或6個)選自下列群組
之胺基酸的修改：ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5或6個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列7個胺基酸之修改：ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺
基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列7個胺基酸之修改：ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列7個胺基酸之修改：ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的
pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、6或7個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、6或7個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面
完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、6或7個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列8個胺基酸之修改：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、
0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列8個胺基酸之修改：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含下列8個胺基酸之修改：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺
基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、6或全部7個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052、HIS 1064及GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或全部11個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052、HIS 1064、ASN 1080、ASN 1147及GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/A，該經遺傳工程處理之BoNT/A包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或全部13個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 886、ASN 905、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、HIS 1064、ASN 1080、ASN 1147及GLN 1229；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/B。BoNT/B參考序列之UniProtKB登錄編號為P10844。
本發明者已鑑別出某些代表用於BoNT/B梭狀芽孢桿菌毒素中之胺基酸修改的較佳標的之胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/B，該經遺傳工程處理之BoNT/B包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 873、ASN 874、
GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN 979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP 1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、GLU 1189、GLU 1252及ASN 1273；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/B的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/B的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/B，該經遺傳工程處理之BoNT/B包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 873、ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN 979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP 1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、GLU 1189、GLU 1252及ASN 1273；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/B的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/B的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、
0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/B，該經遺傳工程處理之BoNT/B包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 873、ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN 979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP 1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、GLU 1189、GLU 1252及ASN 1273；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/B的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/B的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/C1。BoNT/C1參考序列之UniProtKB登錄編號為P18640。
本發明者已鑑定出某些代表用於BoNT/C1梭狀芽孢桿菌毒素中之胺基酸修改的較佳標的之胺基酸。
因此，於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/C1，該經遺傳工程處理之BoNT/C1包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10或15個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 881、ASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、ASP 996、ASN 1000、GLU 1036、ASN 1041、ASP 1062、ASP 1064、GLU 1079及ASP 1081；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/C1的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/C1的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
因此，於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/C1，該經遺傳工程處理之BoNT/C1包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10或15個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 881、ASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN984、GLU 985、ASP 986、ASP 996、ASN 1000、GLU 1036、ASN 1041、ASP 1062、ASP 1064、GLU 1079及ASP 1081；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/C1的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但
其他方面完全相同之BoNT/C1的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
因此，於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/C1，該經遺傳工程處理之BoNT/C1包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10或15個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 881、ASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、ASP 996、ASN 1000、GLU 1036、ASN 1041、ASP 1062、ASP 1064、GLU 1079及ASP 1081；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/C1的等電點(PI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/C1的pI值高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/D。BoNT/D參考序列之UniProtKB登錄編號為P19321。
本發明者已鑑定出某些代表用於BoNT/D梭狀芽孢桿
菌毒素中之胺基酸修改的較佳標的之胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/D，該經遺傳工程處理之BoNT/D包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 877、ASP 893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、ASN 979、GLU 1030、ASP 1031、ASP 1033、GLU 1047、GLU 1051、ASN 1052、GLU 1066及GLN 1122；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/D的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/D的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/D，該經遺傳工程處理之BoNT/D包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 877、ASP 893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、ASN 979、GLU 1030、ASP 1031、ASP 1033、GLU 1047、GLU 1051、ASN 1052、GLU 1066及GLN 1122；且該胺基酸修改增加
該經遺傳工程處理之BoNT/D的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/D的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/D，該經遺傳工程處理之BoNT/D包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 877、ASP 893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、ASN 979、GLU 1030、ASP 1031、ASP 1033、GLU 1047、GLU 1051、ASN 1052、GLU 1066及GLN 1122；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/D的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/D的pI高出至少至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/E。BoNT/E參考序列之UniProtKB登錄編號為Q00496。
本發明者已鑑定出某些代表用於BoNT/E梭狀芽孢桿菌毒素中之胺基酸修改的較佳標的之胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/E，該經遺傳工程處理之BoNT/E包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 859、ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU 936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 981、ASP 985、GLN 1014、ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035及ASN 1140；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/E的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/E的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/E，該經遺傳工程處理之BoNT/E包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 859、ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU 936、ASP 945、
ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 981、ASP 985、GLN 1014、ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035及ASN 1140；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/E的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/E的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/E，該經遺傳工程處理之BoNT/E包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 859、ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU 936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 981、ASP 985、GLN 1014、ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035及ASN 1140；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/E的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/E的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含
以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/F。BoNT/F參考序列之UniProtKB登錄編號為YP_001390123。
本發明者已鑑定出某些代表用於BoNT/F梭狀芽孢桿菌毒素中之胺基酸修改的較佳標的之胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/F，該經遺傳工程處理之BoNT/F包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 879、ASP 896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055及ASP 1056；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/F的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/F的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/F，該經遺傳工程處理之BoNT/F包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20個)選
自下列群組之胺基酸的修改：ASN 879、ASP 896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055及ASP 1056；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/F的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/F的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/F，該經遺傳工程處理之BoNT/F包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 879、ASP 896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN953、GLU 954、ASN 963、ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055及ASP 1056；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/F的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/F的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離
胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/G。BoNT/G參考序列之UniProtKB登錄編號為Q60393。
本發明者已鑑定出某些代表用於BoNT/G梭狀芽孢桿菌毒素中之胺基酸修改的較佳標的之胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/G，該經遺傳工程處理之BoNT/G包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10或15個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASP 900、ASN 909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、ASN 1001、ASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075及ASN 1090；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/G的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/G的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/G，該經遺傳工程處理之BoNT/G包含
至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10或15個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASP 900、ASN 909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、ASN 1001、ASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075及ASN 1090；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/G的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/G的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為BoNT/G，該經遺傳工程處理之BoNT/G包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10或15個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASP 900、ASN 909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、ASN 1001、ASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075及ASN 1090；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/G的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之BoNT/G的pI高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺
基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為TeNT。TeNT參考序列之UniProtKB登錄編號為P04958。
本發明者已鑑定出某些代表用於TeNT梭狀芽孢桿菌毒素中之胺基酸修改的較佳標的之胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為TeNT，該經遺傳工程處理之TeNT包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10或15個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 893、ASP 894、ASP 911、ASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP 1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081及ASN 1097；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之TeNT的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之TeNT的pI高出至少0.2個(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為TeNT，該經遺傳工程處理之TeNT包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10或15個)選自下列群
組之胺基酸的修改：ASN 893、ASP 894、ASP 911、ASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP 1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081及ASN 1097；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之TeNT的等電點(pI)值較缺乏該胺基酸修改但其他方面完全相同之TeNT的pI高出至少0.5個(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1個)pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
於一實施態樣中，其中該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為TeNT，該經遺傳工程處理之TeNT包含至少一個(例如至少1、2、3、4、5、10或15個)選自下列群組之胺基酸的修改：ASN 893、ASP 894、ASP 911、ASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP 1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081及ASN 1097；且該胺基酸修改增加該經遺傳工程處理之TeNT的等電點(pI)值至少較缺乏該至少一個胺基酸修改但其他方面完全相同之TeNT的pI值高出至少一個pI單位。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以離胺酸殘基取代胺基酸。於一實施態樣中，該修改包含以精胺酸殘基取代胺基酸。
本發明適合應用在許多不同種類梭狀芽孢桿菌毒素上。因此，在本發明之背景中，術語“梭狀芽孢桿菌毒素”包含由肉毒梭狀芽孢桿菌(A、B、C1、D、E、F及G型肉毒桿菌神經毒素)、破傷風梭狀芽孢桿菌(破傷風神經毒素)、丁酸梭狀芽孢桿菌(E型肉毒桿菌神經毒素)和巴氏梭狀芽孢桿菌(F型肉毒桿菌神經毒素)製造之毒素，以及源自任何前述毒素之經修改的梭狀芽孢桿菌毒素或衍生物。術語“梭狀芽孢桿菌毒素”亦包含H型肉毒桿菌神經毒素。
肉毒桿菌神經毒素(BoNT)係由肉毒梭狀芽孢桿菌製造之大蛋白質複合物形式的神經毒素，其係由與一些輔助蛋白複合之BoNT本身所組成。目前有八種不同類別之肉毒桿菌神經毒素，即：A、B、C1、D、E、F、G及H型肉毒桿菌神經毒素，其全體共有類似之結構及作用模式。不同之BoNT血清型可藉由特異性中和抗血清造成之去活化來區別，而藉由與胺基酸層級之序列同一性百分比相關之血清型分類。指定之血清型的BoNT蛋白根據胺基酸序列同一性百分比被進一步分成不同亞型。
BoNTs係在胃腸道中吸收，且在進入周圍循環後結合在膽鹼能神經末梢之突觸前膜，並防止其神經遞質乙醯膽鹼釋出。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F及BoNT/G切割小突觸囊泡蛋白(synaptobrevin)/與囊泡聯結之膜蛋白(VAMP)；BoNT/C1、BoNT/A及BoNT/E切割25kDa(SNAP-25)之與突觸體聯結之蛋白；而BoNT/C1切割突觸融合蛋白。
破傷風毒素係由破傷風梭狀芽孢桿菌製造之單一血清
型毒素。丁酸梭狀芽孢桿菌製造BoNT/E，而巴氏梭狀芽孢桿菌製造BoNT/F。
術語“梭狀芽孢桿菌毒素”亦欲包含經修改之梭狀芽孢桿菌毒素及其衍生物，包括，但不限於描述於下文中者。經修改之梭狀芽孢桿菌毒素或衍生物可含有一或多個與天然(未經修改的)形式之梭狀芽孢桿菌毒素相比較下已被修改之胺基酸，或可含有一或多個不存在於天然(未經修改的)形式之梭狀芽孢桿菌毒素中的插入之胺基酸。舉例而言，相對於天然(未經修改的)梭狀芽孢桿菌毒素序列，經修改之梭狀芽孢桿菌毒素可在一或多個結構域中具有經修改之胺基酸序列。這類修改可修改毒素之功能性面向，例如生物活性或持久性。因此，於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素為經遺傳工程處理之經修改的梭狀芽孢桿菌毒素，或經遺傳工程處理之修改的梭狀芽孢桿菌毒素衍生物，或經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素衍生物。
經修改之梭狀芽孢桿菌毒素的重鏈胺基酸序列(諸如經修改之HC結構域)中可具有一或多個修改，其中該經修改之重鏈以較天然(未經修改的)梭狀芽孢桿菌毒素為高或低之親和力結合標靶神經細胞。在HC結構域中之這類修改可包括修改在HC結構域之神經節苷脂結合位點中之殘基或在改變對標靶神經細胞之神經節苷脂受體及/或蛋白質受體之結合的蛋白質(SV2或突觸結合蛋白(synaptotagmin))結合位點中之殘基。這類經修改之梭狀芽
孢桿菌毒素的實例描述於WO 2006/027207及WO 2006/114308，此兩篇之全部內容以引用方式被併入本文。
經修改之梭狀芽孢桿菌毒素的輕鏈胺基酸序列中可具有一或多個修改，例如在可改變或修改該經修改之LC的SNARE蛋白之特異性的受質結合或催化結構域中之修改。這類經修改之梭狀芽孢桿菌毒素的實例描述於WO 2010/120766及US 2011/0318385中，此兩篇之全部內容以引用方式被併入本文。
經修改之梭狀芽孢桿菌毒素可包含一或多個能增加或減少該經修改之梭狀芽孢桿菌毒素的生物活性及/或生物持久性的修改。例如，經修改之梭狀芽孢桿菌毒素可包含以白胺酸或酪胺酸為基礎之基序(motif)，其中該基序增加或減少該經修改之梭狀芽孢桿菌毒素的生物活性及/或生物持久性。合適之以白胺酸為基礎之基序包括xDxxxLL、xExxxLL、xExxxIL及xExxxLM(其中x為任意胺基酸)。合適之以酪胺酸為基礎之基序包括Y-x-x-Hy(其中Hy為疏水性胺基酸)。包含以白胺酸或酪胺酸為基礎之基序的經修改之梭狀芽孢桿菌毒素的實例描述於WO 2002/08268中，其全部內容以引用方式被併入本文。
術語“梭狀芽孢桿菌毒素”意欲包含雜交型及嵌合型梭狀芽孢桿菌毒素。雜交型梭狀芽孢桿菌毒素包含至少一部分來自一種梭狀芽孢桿菌毒素或其亞型之輕鏈及至少一部分來自另一種梭狀芽孢桿菌毒素或其亞型之重鏈。於一實
施態樣中，該雜交型梭狀芽孢桿菌毒素含有來自一種梭狀芽孢桿菌毒素亞型之輕鏈的整個輕鏈及來自另一種梭狀芽孢桿菌毒素亞型之重鏈。於另一實施態樣中，嵌合型梭狀芽孢桿菌毒素可含有一種梭狀芽孢桿菌毒素亞型之重鏈的一部分(例如結合結構域)，該重鏈之另一部分係來自另一種梭狀芽孢桿菌毒素亞型。類似地或可選地，該治療性元件可包含來自不同梭狀芽孢桿菌毒素之輕鏈部分。這類雜交型或嵌合型梭狀芽孢桿菌毒素可用於，例如作為輸送工具以將這類梭狀芽孢桿菌毒素之治療益處提供給予對指定的梭狀芽孢桿菌毒素亞型具免疫抗性之患者、給予具有低於平均濃度之指定梭狀芽孢桿菌毒素重鏈結合結構域之受體的患者，或給予可能具有膜或囊泡毒素受質(例如SNAP-25、VAMP及突觸融合蛋白)之蛋白酶抗性變體的患者。雜交型及嵌合型梭狀芽孢桿菌毒素描述於US 8,071,110中，此刊物之全部內容以引用方式被併入本文。因此，於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素為經遺傳工程處理之雜交型梭狀芽孢桿菌毒素，或經遺傳工程處理之嵌合型梭狀芽孢桿菌毒素。
術語“梭狀芽孢桿菌毒素”意欲包含重定向之梭狀芽孢桿菌毒素。於重定向之梭狀芽孢桿菌毒素中，該梭狀芽孢桿菌毒素係經修改以包括稱為靶向部分(Targeting Moiety)(TM)之外源配體。TM係經過選擇以提供對所欲之靶細胞的結合特異性，且在一部分重定向之過程中可將該梭狀芽孢桿菌毒素之天然結合部分(例如HC結構域，或
HCC結構域)移除。重定向之技術描述於，例如EP-B-0689459；WO 1994/021300；EP-B-0939818；US 6,461,617；US 7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US 5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US 7,052,702；WO 1999/017806；EP-B-1107794；US 6,632,440；WO 2000/010598；WO 2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO 2000/61192；及WO 1999/58571；所有這些之全部內容以引用方式被併入本文。因此，於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素為經遺傳工程處理之重定向的梭狀芽孢桿菌毒素。
本發明亦包含具有非天然蛋白酶切割位點的梭狀芽孢桿菌毒素。於這類梭狀芽孢桿菌毒素中，該天然蛋白酶切割位點(亦稱為活化位點，如上述)被修改或以非梭狀芽孢桿菌毒素之天然蛋白酶切割位點(即，外源性切割位點)取代。這類位點將需要用於切割之外源性蛋白酶，此外源性蛋白酶能夠改善對切割事件之時間和位置的控制。可用於梭狀芽孢桿菌毒素中之非天然蛋白酶切割位點包括：
腸激酶 (DDDDK↓)
Xa因子 (IEGR↓/IDGR↓)
TEV(煙草蝕刻病毒) (ENLYFQ↓G)
凝血酶 (LVPR↓GS)
PreScission (LEVLFQ↓GP)。
額外之蛋白酶切割位點包括被非細胞毒性蛋白酶切割(例如由梭狀芽孢桿菌神經毒素之輕鏈切割)的識別序列。這些包括被非細胞毒性蛋白酶(諸如梭狀芽孢桿菌神經毒素之輕鏈)切割之SNARE(例如SNAP-25、突觸融合蛋白、VAMP)蛋白識別序列。包含非天然蛋白酶切割位點之梭狀芽孢桿菌毒素描述於US 7,132,259、EP 1206554-B2及US 2007/0166332中，所有這些之全部內容以引用方式被併入本文。術語蛋白酶切割位點亦包含內蛋白(intein)，此為自我切割序列。自我剪接反應是可控制的，例如經由改變存在之還原劑的濃度。
本發明亦包括包含“破壞性切割位點”之梭狀芽孢桿菌毒素。在該梭狀芽孢桿菌毒素中，非天然蛋白酶切割位點係被納入梭狀芽孢桿菌毒素中之選定的位置從而使得在該位點之切割將可降低該梭狀芽孢桿菌毒素之活性或將其去活化。該破壞性蛋白酶切割位點可為容易被局部蛋白酶切割的，在梭狀芽孢桿菌毒素的事件中，其在投予後，移行至非標靶位置。合適之非天然蛋白酶切割位點包括那些上述者。包含破壞性切割位點之梭狀芽孢桿菌毒素描述於WO 2010/094905及WO 2002/044199中，此兩者之全部內容以引用方式併入本文。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素，尤其是其輕鏈組分，可為聚乙二醇化的-這可能有助於增加穩定性，例如該輕鏈組分之作用持續時間。當該輕鏈包含BoNT/A、B或C1蛋白酶時，聚乙二醇化為特佳者。較佳
地，PEG化包括在該輕鏈組分之N-端添加PEG。舉例而言，輕鏈之N-端可藉由一或多個可為相同或相異之胺基酸(例如半胱胺酸)殘基延展。該胺基酸殘基中有一或多個殘基可能具有連接(例如共價連接)在其上之自有的PEG分子。一種此技術之實例描述於WO 2007/104567(其全部內容以引用方式被併入本文)中。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素可不含以天然梭狀芽孢桿菌毒素複合物形式存在之複合蛋白質。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素亦可包含數量有限之非標準胺基酸。因此，除了該20種標準胺基酸外，非標準胺基酸(諸如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸及α-甲基絲胺酸)可取代本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素的胺基酸殘基。數量有限之非保守胺基酸、非由遺傳密碼編碼之胺基酸，及非天然胺基酸可取代梭狀芽孢桿菌多肽胺基酸殘基。本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素亦可包含非天然胺基酸殘基。
非天然胺基酸包括，但不限於反式-3-甲基脯胺酸、2,4-亞甲基-脯胺酸、順式-4-羥基脯胺酸、反式-4-羥基-脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別-蘇胺酸、甲基-蘇胺酸、羥基-乙基半胱胺酸、羥乙基高半胱胺酸、硝基麩胺醯胺、高麩胺醯胺、哌可酸(pipecolic acid)、第三白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸及4-氟苯丙胺酸。本技藝已知數種用於將非天然胺基酸殘基納
入蛋白質的方法。例如，可採用體外系統，其中係使用以化學方式胺基醯化之抑制子tRNA抑制無意義突變。用於合成胺基酸及胺基醯化tRNA的方法為本技藝所已知。含有無意義突變之質體的轉錄和轉譯係在包含大腸桿菌S30萃取物及市售之酶和其他試劑的無細胞系統中進行。蛋白質係藉由色層分析法純化。參見，例如Robertson等人，J.Am.Chem.Soc.113：2722,1991；Ellman等人，Methods Enzymol.202：301,1991；Chung等人，Science 259：806-9,1993；及Chung等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10145-9,1993。在第二種方法中，轉譯係經由在非洲爪蟾(Xenopus)卵母細胞中顯微注射突變之mRNA及以化學方式胺基醯化之抑制子tRNA來進行(Turcatti等人，J.Biol.Chem.271：19991-8,1996)。在第三種方法中係在不含欲被替代之天然胺基酸(例如苯丙胺酸)且存有所欲之非天然胺基酸(例如2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸或及4-氟苯丙胺酸)下培養大腸桿菌細胞。該非天然胺基酸係被納入多肽中以代替其天然對應部分。參見，Koide等人，Biochem.33：7470-6,1994。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素可使用重組核酸技術製造。因此，於一實施態樣中，經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素(如上述)為重組之梭狀芽孢桿菌毒素。
於另一態樣中，本發明提供包含編碼如上述之經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素之核酸序列的核酸(例如
DNA)。於一實施態樣中，該核酸序列係經過製備而為包含啟動子及終止子之DNA載體的一部分。
於一較佳之實施態樣中，該載體具有選自下列群組之啟動子：
於一較佳之實施態樣中，該載體具有選自下列群組之啟動子：
本發明之核酸分子可使用本技藝已知之任何合適的方法製備。因此，該核酸分子可使用化學合成技術製備。或者，本發明之核酸分子可使用分子生物學技術製備。
較佳地，本發明之DNA構造體係由電腦模擬設計，再藉由習知之DNA合成技術合成。
上述之核酸序列信息可選擇地根據欲採用之最終宿主細胞(例如大腸桿菌)表現系統來修改密碼子偏倚(codon-biasing)。
於一實施態樣中，編碼如上述之經遺傳工程處理的梭
狀芽胞桿菌毒素之核酸序列為與選自SEQ ID NO：3、5、7及9之核酸序列具有至少70%(例如至少75、80、85、90、95、97、98或99%)之序列同一性的核酸序列。
於一態樣中，本發明提供與選自SEQ ID NO：3、5、7及9之核酸序列具有至少70%(例如至少75、80、85、90、95、97、98或99%)之序列同一性的核酸序列。於一實施態樣中，該核酸序列與選自SEQ ID NO：3、5、7及9之核酸序列具有至少90%之序列同一性。
本發明亦提供由如上述之核酸序列編碼的多肽。因此，於一態樣中，本發明提供包含與選自SEQ ID NO：4、6、8及10之胺基酸序列具有至少70%(例如至少75、80、85、90、95、97、98或99%)之序列同一性的胺基酸序列之多肽。於一實施態樣中，該胺基酸序列與選自SEQ ID NO：4、6、8及10之胺基酸序列具有至少90%之序列同一性。
於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素為如上述之經遺傳工程處理的BoNT/A且該BoNT/A包含(或由其組成)與選自SEQ ID NO：4、6、8及10之胺基酸序列具有至少70%(例如至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9%)之序列同一性的胺基酸序列。
於一實施態樣中，本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素為如上述之經遺傳工程處理的BoNT/A且該經遺傳工程處理之BoNT/A包含(或由其組成)SEQ ID NO：
4、6、8或10之胺基酸序列。
於一態樣中，本發明提供包含(或由其組成)SEQ ID NO：4、6、8或10之胺基酸序列的多肽。
於一態樣中，本發明提供編碼如上述之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素之核酸，其中該核酸包含與選自SEQ ID NO：3、5、7及9之核酸序列具有至少70%(例如至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9%)之序列同一性的核酸序列。於一實施態樣中，該核酸包含(或由其組成)SEQ ID NO：3、5、7或9之核酸序列。
於一態樣中，本發明提供包含(或由其組成)SEQ ID NO：3、5、7或9之核酸序列的核酸。
二或多個核酸或胺基酸序列之間的“序列同一性百分比”為各序列所共有之同一位置之數目的函數。因此，%同一性可被計算為同一核苷酸/胺基酸之數目除以核苷酸/胺基酸之總數，再乘以100。計算%序列同一性亦可考慮間隙數及需要引入以優化二或多個序列之比對的各個間隙之長度。二或多個序列間之序列比較及同一性百分比之測定可使用特定之數學演算法，諸如技術熟習人士所熟悉之BLAST來進行。
於一態樣中，本發明提供製造具有輕鏈及重鏈之單鏈經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素蛋白質之方法，該方法包含在合適的宿主細胞中表現核酸(該核酸為如上述者)，將該宿主細胞溶解以提供含有單鏈經遺傳工程處理
的梭狀芽孢桿菌毒素蛋白質之宿主細胞勻漿，再分離出該單鏈經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素蛋白質。
於另一態樣中，本發明提供活化經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的方法，該方法包含提供藉由如上述之製造單鏈經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素蛋白質之方法取得的單鏈經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素蛋白質，將該多肽與能將該多肽在位於輕鏈和重鏈之間的識別位點(切割位點)切割的蛋白酶接觸，從而將該多肽轉化成二鏈多肽，其中該輕鏈及重鏈係藉由二硫鍵接合在一起。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素可用於預防或治療某些醫療或美容疾病和病症。因此，於進一步之態樣中，本發明提供用於醫藥中之如上述的經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素。
於一相關之態樣中，本發明提供用於預防或治療選自下列群組之疾病或症狀的如上述之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素：斜視眼(strabismus)、眼瞼痙攣(blepharospasm)、斜視(squint)、肌張力不全(dystonia)(例如痙攣性肌張力不全(spasmodic dystonia)、口下頜肌張力不全(oromandibular dystonia)、局部肌張力不全、遲發性肌張力不全、喉肌張力不全、四肢肌張力不全、頸部肌張力不全症)、斜頸(torticollis)(例如痙攣性斜頸)、受益於細胞/肌肉無力的美容(cosmetic)應用(經由SNARE下調或去活化)、眼球運動之神經肌肉障礙或病況(例如共轉性斜視(concomitant strabismus)、垂直斜視(vertical
strabismus)、外直肌麻痺(lateral rectus palsy)、眼球震顫(nystagmus)、甲狀腺機能障礙肌病(dysthyroid myopathy))、書寫痙攣(writer's cramp)、眼瞼痙攣、磨牙症(bruxism)、威爾遜氏症(Wilson's disease)、震顫(tremor)、抽搐症(tics)、節段性肌陣攣(segmental myoclonus)、痙攣(spasms)、由慢性多發性硬化症導致之痙攣、由痙攣導致之不正常的膀胱控制、敵意(animus)、背部痙攣、四頭肌僵痛(charley horse)、緊張性頭痛、骨盆腔提肌症候群(levator pelvic syndrome)、脊柱裂(spina bifida)、遲發性運動障礙(tardive dyskinesia)、巴金森氏症、口吃(stuttering)、半面痙攣(hemifacial spasm)、眼瞼疾病、腦性麻痺、局部痙攣、痙攣性結腸炎(spasmodic colitis)、神經性膀胱、肛門痙攣(anismus)、肢體痙攣、抽搐症、震顫、磨牙、肛裂(anal fissure)、食道遲緩不能症(achalasia)、吞嚥困難(dysphagia)、催淚(lacrimation)、多汗(hyperhydrosis)、唾液分泌過多、胃腸分泌過多、肌肉疼痛(例如由肌肉痙攣導致之疼痛)、頭痛(例如緊張性頭痛)、額頭皺紋、皮膚皺紋、癌，子宮病症、泌尿生殖器病症、泌尿生殖器-神經系統病症、慢性神經性發炎及平滑肌病症。
使用時，本發明採用包含經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素，加上至少一種選自藥學上可接受之載體、賦形劑、佐劑、推進劑及/或鹽的組分之醫藥組成物。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素可配製
成用於口服、經腸胃道外、連續輸注、吸入或局部施用。適合用於注射之組成物可為溶液、懸浮液或乳劑之形式，或為在使用前溶解或懸浮在合適之載體中的乾燥粉末形式。
在欲經由局部輸送的經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的情況中，該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素可配製成乳膏形式(例如用於局部施用)，或用於皮下注射。
局部輸送裝置可包括氣霧劑或其他噴霧(例如噴霧器)。在這方面，經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素的氣溶膠製劑使輸送至肺及/或其他鼻及/或支氣管或氣道成為可行。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素可經由在涉及受影響之器官的神經分佈之脊柱節段的高度處進行脊柱鞘內或硬膜外注射來投予患者。
較佳之投予途徑係經由腹腔鏡及/或局部投予，尤其是肌內注射。
本發明之經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素的投予劑量範圍為用於產生所需之治療效果藥的劑量範圍。可理解的是，所需之劑量範圍係取決於該經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素或組成物之確切性質、投予途徑、製劑之性質、患者之年齡、患者之症狀的性質、程度或嚴重性、禁忌症(若有的話)及主治醫師之判斷。這些劑量水準中之變化可使用用於優化之標準經驗慣例調整。
合適之日劑量(每公斤患者體重)係在0.0001-1奈克/
公斤之範圍內，較佳為0.0001-0.5奈克/公斤，更佳為0.002-0.5奈克/公斤，且特佳為0.004-0.5奈克/公斤。該單位劑量可在每一劑量少於1皮克至30奈克之間變化，但通常將在每一劑量0.01至1奈克之間變化，其可每日，或較佳地，較不頻繁地投予，諸如每週或每六個月。特佳之給藥方案係以0.05奈克經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素為基礎來作為1X劑量。在這方面，較佳之劑量係在1X-100X(即，0.05-5奈克)之範圍內。
流體劑量型通常係使用經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素及無熱原之無菌載體製備。根據所使用之載劑和濃度，可將該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素溶解或懸浮於載劑中。在製備溶液時，可將該經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素溶解於載劑中，若需要時，可經由在該溶液中加入氯化鈉來將其製成等張液並使用無菌技術，經由通過無菌過濾器過濾來滅菌，再填充入合適之無菌小瓶或安瓿中並密封之。或者，若溶液之穩定性足夠，可藉由高壓滅菌將在其密閉容器中之溶液消毒。有利的是，可將添加劑，諸如緩衝劑、增溶劑、穩定劑、防腐劑或殺菌劑、助懸劑、或乳化劑、或局部麻醉劑溶解在載劑中。
在使用前被溶解或懸浮在合適之載劑中的乾燥粉末可經由在無菌區域，使用無菌技術將預消毒之成分填入無菌容器中來製備。或者，可在無菌區域，使用無菌技術將該成分溶解在合適的容器中。然後，將產物冷凍乾燥並以無菌方式密封在容器中。
適合用於肌肉內、皮下或皮內注射之胃腸道外懸浮液係以基本上相同的方法製備，不同的是該無菌組分係懸浮，而非溶解在無菌載劑中，且無法藉由過濾來完成滅菌。該組分可以無菌狀態分離出，或者，其可在分離出後滅菌，例如藉由伽瑪照射滅菌。
有利的是，在組成物中包含助懸劑，例如聚乙烯基吡咯啶酮，以促進該組分均勻分佈。
根據本發明之投予可利用多種輸送技術，包括微粒包封、病毒輸送系統或高壓氣霧劑衝擊。
序列
SEQ ID NO：1.BoNT/A1核酸序列
SEQ ID NO：2.BoNT/A1胺基酸序列
SEO ID NO：3.經遺傳工程處理的BoNT/A1“Cat-A”核酸序列
SEQ ID NO：4.經遺傳工程處理的BoNT/A1“Cat-A”胺基酸序列
SEQ ID NO：5.經遺傳工程處理的BoNT/A1“Cat-B”核酸序列
SEQ ID NO：6.經遺傳工程處理的BoNT/A1“Cat-B”胺基酸序列
SEQ ID NO：7.經遺傳工程處理的BoNT/A1“Cat-C”核酸序列
SEQ ID NO：8.經遺傳工程處理的BoNT/A1“Cat-C”胺基酸序列
SEQ ID NO：9.經遺傳工程處理的BoNT/A1“Cat-D”核酸序列
SEQ ID NO：10.經遺傳工程處理的BoNT/A1“Cat-D”胺基酸序列
第1圖
陽離子構造體之等電聚焦(IEF)凝膠。
第2圖
在大鼠胚胎脊髓神經元(eSCN)中，Cat5v2(K1064H/N954K)(A)、Cat5v2(K1064H/N886K)(B)和Cat5v2(K1064H/N1025K)(C)之SNAP-25切割百分比，以及相對於nBoNT/A1之pEC50匯總。將(A、B、C)大鼠胚胎脊髓神經元培養三週並以Cat5v4處理24小時，再以SNAP-25特異性抗體進行西方墨點法。數據係來自一式三份，三個獨立實驗的平均值±SEM。(D)在大鼠eSCN SNAP-25切割效力分析中，Cat5v2(K1064H/N886K)、Cat5v2(K1064H/N954K)及Cat5v2(K1064H/N1025K)相對於nBoNT/A1(List生物實驗室)之相關效力。每個點對應於一
個單獨批次且為3個獨立pEC50測定值(根據8點濃度反應曲線(CRC)測定)的平均值。以一式三份評估CRC中之各濃度。效力比較係使用列表之批次，合併數據n=24之平均值進行。數據為每一Cat5v4之3個批次(n=3)的平均值±SEM。
第3圖
在老鼠膈神經偏側膈分析(mPNHD)中nBoNT/A1和Cat5v4之效力(t50)。依指示將小鼠膈神經偏側膈組織與Cat5v4或天然BoNT/A1一起培育。記錄膈肌收縮力，直到不能再檢測到收縮或記錄至140分鐘後。每個點對應於獨立之測定。t50值為抑制50%小鼠偏側膈收縮力所需之時間。
下列實施例係用來說明本發明之特定實施例，而非以
任何方式限制申請專利範圍中所定義之本發明範圍。
實施例1
製造三種根據本發明之經遺傳工程處理的BoNT/A1
分子的不同實例。
使用一些不同標準來選擇選定之用於修改(突變位點)之胺基酸。
殘基替代之標準如下：
1.殘基類型；
2.表面暴露程度；
3.相關於二級/三級結構之位置；
4.相關於BoNT之已知功能結構域的位置；
5.跨越BoNT/A或BoNT/E亞型之序列保守程度；
6.引入額外之泛素化位點的可能性。
本實施例中，由於天門冬醯胺(Asn，N)及麩胺醯胺(Gln，Q)為極性的，尺寸與離胺酸相似，與其他殘基僅形成較弱之偶極交互作用，且14%之分子係由此二個殘基所組成，所以選擇彼等用於進行突變。
從BoNT/A1之晶體結構(PDB ID：3BTA)鑑別出可在分子表面上看到之Asn及Gln殘基。此確保所有被替換之殘基能在外部顯示其電荷。從此列表，經由應用上述3-5項之選擇標準有可能排除那些被認為較不適合替換者(反複之過程)。
BoNT/A1內之非保守殘基係從與其他BoNT/A亞型及功能上類似之BoNT/E血清型的亞型進行比對來鑑定。選擇那些以鹼性殘基之形式出現在其他序列中者作為用於替換之熱門候選殘基。
透過上述之選擇標準連續進行幾輪選擇後，確定最後
之候選殘基列表。篩選這些候選殘基產生額外之泛素化共有序列(consensus sequence)的潛力(使用CKSAAP_UbSite伺服器)。經由將替換之離胺酸改變成精胺酸來除去鑑定出的那幾個。
BoNT/A1序列之最終合成的陽離子型構造體的實例列於下表中，命名為Cat-A、Cat-B及Cat-C。各構造體之分子量為149,637道耳吞。
Cat-A：N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,N886K。
Cat-B：N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,N954K。
Cat-C：N930K,S955K,Q991K,N1026K,N1052K,Q1229K,N1025K。
實施例2
評估BoNT/B、F及E胺基酸序列中可以Lys或Arg取代之可能殘基。此初始評估鑑定出可被取代之殘基以產生具有增加之pI值的BoNT/B、E或F蛋白。
分析BoNT/B(Ac：P10844)、BoNT/E(Ac：Q00496)及BoNT/F(Ac：P30996)之一級序列，該胺基酸組成概述於下表中：
從該表中可知，如同BoNT/A1中所觀察到者，類似之大量極性Asn/Gln殘基存在於胺基酸序列中。其中亦存
有相當大量可能被改變為其對應之中性殘基(Asn/Gln)或鹼性殘基(Lys或Arg)之酸性(Asp/Glu)殘基。
實施例3
鑑定用於修改之較佳的梭狀芽孢桿菌毒素胺基酸。
BoNT/A、BoNT/B及BoNT/E之全長結構數據已可取得；然而，在其餘4種血清型方面，使用LOOPP電腦程式根據序列及相關之結構同源性來產生理論模型。
藉由AreaIMol(CCP4套件)分析各個結構，總和大於40者被鑑定為暴露出的殘基。從此列表中選出具有極性側鏈之殘基，且較佳者為酸性殘基(Asp&Glu)，或具有氫鍵受體側鏈(Asn & Gln)。最後計算步驟涉及根據來自Stride伺服器之分析數據選擇在α螺旋及β股之間的殘基。目視檢查各分子之結構以鑑定位於界面區內之殘基-避免這些。
在BoNT/A1方面，將在至少90%所有比對之序列中的功能上非保守殘基補充在較佳之殘基的列表中[大的非極性側鏈(Met、Pro、Phe、Trp)被視為相等，小的非極性側鏈(Gly、Ala、Val、Leu、Ile)被視為相等，酸性側鏈(Asp、Glu)被視為相等，而鹼性側鏈(Arg、Lys)被視為相等]。更具體地說，選擇那些在至少10%序列中以鹼性殘基形式出現之非保守殘基及在參考序列中之非保守Asn、Gln、Asp或Glu作為候選殘基。
在其餘的血清型方面，進行亞型之間的多重序列比對
以鑑定在至少10%序列中以鹼性殘基形式出現之功能上非保守殘基。
用於修改之較佳的梭狀芽孢桿菌毒素胺基酸：
BoNT/A：
ASN 886,ASN 905,GLN 915,ASN 918,GLU 920,ASN 930,ASN 954,SER 955,GLN 991,GLU 992,GLN 995,ASN 1006,ASN 1025,ASN 1026,ASN 1032,ASN 1043,ASN 1046,ASN 1052,ASP 1058,HIS 1064,ASN 1080,GLU 1081,GLU 1083,ASP 1086.
BoNT/B：
ASN 873,ASN 874,GLU 892,ASP 895,ASN 906,ASP 940,ASN 948,GLU 949,ASN 958,ASN 959,ASN 979,ASN 990,GLU 993,ASP 994,GLU 997,ASN 1012,ASN 1019,ASP 1030,ASP 1047,ASP 1049,GLU 1065,GLU 1072,GLN 1176,GLU 1189,GLU 1252,ASN 1273.
BoNT/C1：
ASN 881,ASP 898,GLU 916,GLU 927,ASN 952,ASN 964,ASN 965,ASN 984,GLU 985,ASP 986,ASP 996,ASN 1000,GLU 1036,ASN 1041,ASP 1062,ASP 1064,GLU 1079,ASP 1081.
BoNT/D：
ASN 877,ASP 893,ASN 894,ASN 898,ASN 920,ASN 945,ASN 948,GLU 957,GLN 958,ASN 959,ASN 968,ASN 979,GLU 1030,ASP 1031,ASP 1033,GLU 1047,GLU 1051,ASN 1052,GLU 1066,GLN 1122.
BoNT/E：
ASN 859,ASP 860,ASN 892,ASP 893,ASP 904,ASP 909,ASN 928,ASN 932,ASN 934,ASN 935,GLU 936,ASP 945,ASN 946,ASN 947,ASN 966,ASN 976,ASN 979,ASN 981,ASP 985,GLN 1014,ASN 1019,ASN 1022,ASP 1027,ASN 1035,and ASN 1140.
BoNT/F：
ASN 879,ASP 896,ASN 922,ASN 923,ASN 928,ASN 947,ASN 950,ASN 952,ASN 953,GLU 954,ASN 963,ASN 964,ASN 965,ASN 987,GLN 997,ASN 1037,ASP 1040,ASP 1045,ASN 1055,ASP 1056.
BoNT/G：
ASP 900,ASN 909,ASN 910,GLU 912,ASN 913,ASN 945,ASN 947,GLU 956,ASN 965,ASP 966,ASN 986,ASN 1001,ASN 1038,ASP 1040,ASN 1046,ASP 1057,GLU 1073,ASN 1075,ASN 1090.
TeNT：
ASN 893,ASP 894,ASP 911,ASN 919,ASN 927,ASN 928,GLU 929,GLN 968,ASN 972,GLU 973,GLU 1010,ASP 1018,ASN 1079,ASN 1080,ASN 1081,ASN 1097.
使用之序列
登錄編號：
BoNT/A：P10845
BoNT/B：P10844
BoNT/C1：P18640
BoNT/D：P19321
BoNT/E：Q00496
BoNT/F：YP_001390123
BoNT/G：Q60393
TeNT：P04958
結構性數據來源
從RCSB取得BoNT/A(3BTA.pdb)、BoNT/B(1EPW)及BoNT/E(3FFZ.pdb)之晶體結構。
分別使用LOOPP及以下序列進行BoNT/C1、
BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G及TeNT之同源建模：P18640、P19321、YP_001390123、Q60393及P04958。
結構分析
使用來自CCP4套件之AreaIMol測定暴露之殘基。
使用Stride測定二級結構分配。
以RasMol藉由目視檢查測定界面殘基。
序列分析
從NCBI取得全長之BoNT序列。
以ClustalX進行比對。
實施例4
選殖、表現及純化
合成編碼實施例1中所描述之經遺傳工程處理之BoNT/A的DNA構造體，將其選殖入pJ401表現載體中，再轉化入BL21(DE3)大腸桿菌中。此可容許可溶性重組Cat-A、Cat-B及Cat-C蛋白在BL21(DE3)大腸桿菌中過度表現。
使用典型之色層分析技術從大腸桿菌溶胞產物純化重組之經遺傳工程處理的BoNT。採用使用陽離子交換樹脂的初始純化步驟，再使用疏水性交互作用樹脂進行中間純化步驟。然後，藉由蛋白水解來切割該重組之經遺傳工程處理的BoNT單鏈，以產生活化之二鏈經遺傳工程處理的
BoNT。然後，採用最後的純化步驟來除去殘留的污染物。
實施例5
決定純化之經遺傳工程處理的BoNT之特徵
依下述實驗決定上述實施例1中所描述之經遺傳工程處理的BoNT之特徵。
pI之測量結果顯示出該經遺傳工程處理的BoNT之等電點高於未經修改(天然)之BoNT/A1的等電點-參見第1圖和下表4。
使用大鼠胚胎脊髓神經元(eSCN)評估該經遺傳工程處理之BoNT進入神經元並切割SNAP-25(BoNT/A1之標的)的能力。第2圖顯示出該經遺傳工程處理之BoNT保留與天然BoNT/A1相同之進入神經元及切割SNAP-25的能力。
使用老鼠膈神經偏側膈分析法(mPNHD)進一步評估該經遺傳工程處理之BoNT的效力。第3圖顯示出該經遺傳工程處理之BoNT保留與天然BoNT/A1相同之抑制小鼠偏側膈收縮能力的能力。
使用體內小鼠指頭外展積分(DAS)分析來評估相對於天然BoNT/A1之效力及安全性。此兩種分子顯示出較天然BoNT/A1高之安全比及略高之效力。這些數據呈現於下表中(表5)。
- DAS ED50：計算出之用於誘導DAS 2的劑量
- 劑量DAS 4：誘導DAS 4之實驗劑量
- BW：體重
- 用於-10%△BW之劑量：計算出之用於誘導體重較D0之體重減少10%的劑量
- 安全比：用於-10%△BW/DAS ED50之劑量
安全比為BoNT治療之負面效果(體重減輕)相對於效力(半最大指頭外展積分(DAS))的測量值。其計算方法為-10%體重(BW)和DAS ED50之間的比值，其中-10%BW係指體重減少10%所需之BoNT的量(皮克/動物)，而ED50係指將產生數值為2之DAS的BoNT之量(皮克/動物)。
DAS分析係經由在老鼠腓腸肌/比目魚肌群注射明膠磷酸鹽緩衝液中配製之20微升經遺傳工程處理之梭狀芽孢桿菌毒素進行，再依先前Aoki之報導(Aoki KR，Toxicon 39：1815-1820；2001)，藉由指頭外展來評估。
實施例6
使用上述實施例1中所提出之標準設計根據本發明之另一種經遺傳工程處理的梭狀芽孢桿菌毒素。
此陽離子構造體亦源自BoNT/A1且其pI計算值為7.4，分子量為149,859。該構造體被命名為Cat-D。雖然構造體Cat-A、Cat-B及Cat-C包含突變為離胺酸之殘基，Cat-D包含突變為精胺酸之殘基。
Cat-D：N1188R、D1213R、G1215R、N1216R、N1242R、N1243R、S1274R、T1277R。
實施例7
罹患頸部肌張力不全之患者的治療方法
一名罹患痙攣性斜頸之50歲女性患者出現在診所，該患者先前曾接受投予在頸部肌肉之治療上有效量的標準
BoNT/A製劑之治療；然而，由於毒素擴散到口咽，患者經歷吞嚥困難。在患者的頸部肌肉注射約1.5奈克(或更多)之本發明的經遺傳工程處理之BoNT/A以治療該患者。3至7天後，該患者之斜頸顯著改善，未發展出吞嚥困難且患者能保持其頭部和肩部在正常位置至少5個月。由於該經遺傳工程處理之BoNT/A分子增強組織滯留及減少擴散，醫生能夠注射更多的產品而不用擔心副作用；該增強之劑量導致作用持續時間延長。
實施例8
罹患眼瞼痙攣之患者的治療方法
一名罹患眼瞼痙攣之47歲男性出現在診所。在患者之上眼瞼的外側板前眼輪匝肌及下眼瞼的外側板前眼輪匝肌注射約5至25皮克之本發明的經遺傳工程處理之BoNT/A以治療患者。約1週後患者之症狀開始減輕且持續至少5個月，無眼睛下垂。本發明之多肽所增加的安全性允許醫生增加劑量，並因此延長該臨床效果的持續時間。
實施例9
一名罹患腦癱且具有衰弱之馬蹄足和行走困難之27歲男性患者出現在診所。該患者先前曾接受治療上有效量之BoNT/A治療，此治療改善其步態，但伴隨四肢肌肉無力和疼痛。在患者之受影響的下肢腓腸肌的內側頭和外側
頭中之兩個位點各注射約20皮克/公斤的本發明之經遺傳工程處理的BoNT/A，以治療患者。一周之內，該患者的步態改善而無先前見過的副作用，且症狀緩解可持續至少四個月。給予較多量之藥品劑量的能力導致作用之持續時間延長的治療方法。
Claims (18)
- 一種經遺傳工程處理之肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素(BoNT)A型(BoNT/A)，其包含經修改之梭狀芽孢桿菌毒素受體結合結構域(HC結構域)，該修改係SEQ ID NO：2之該HC結構域經位於該HC結構域之至少4個胺基酸的修改；其中該至少4個胺基酸的修改增加該經遺傳工程處理之BoNT/A的等電點(pI)值較缺乏該至少4個胺基酸的修改但其他方面完全相同之BoNT/A的pI值高出至少0.2個pI單位；其中該至少4個胺基酸的修改係由選自下列群組之4或多個胺基酸的修改所組成：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274及THR 1277；且其中該至少4個胺基酸的修改係選自：以鹼性胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基；以不帶電荷之胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基；以鹼性胺基酸殘基取代不帶電荷之胺基酸殘基；插入鹼性胺基酸殘基；及刪除酸性胺基酸殘基。
- 如請求項1之經遺傳工程處理之 BoNT/A，其中該至少4個胺基酸的修改係取代。
- 如請求項1之經遺傳工程處理之BoNT/A，其中該經遺傳工程處理之BoNT/A具有至少為6.6之pI值。
- 如請求項1之經遺傳工程處理之BoNT/A，其中該至少4個胺基酸的修改係由下述7個胺基酸的修改所組成：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052及GLN 1229，其中該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代該胺基酸。
- 如請求項1之經遺傳工程處理之BoNT/A，其中該至少4個胺基酸的修改係由下述7個胺基酸的修改所組成：ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052及GLN 1229，其中該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代該胺基酸。
- 如請求項1之經遺傳工程處理之BoNT/A，其中該至少4個胺基酸的修改係由下述7個胺基酸的修改所組成：ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052及GLN 1229，其中該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代該胺基酸。
- 如請求項1之經遺傳工程處理之BoNT/A，其中該至少4個胺基酸的修改係由下述8個胺基酸的修改所組成：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274及THR 1277，其中該修改包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基取代該 胺基酸。
- 如請求項1至7中任一項之經遺傳工程處理之BoNT/A，其中該經遺傳工程處理之BoNT/A係二鏈經遺傳工程處理之BoNT/A。
- 如請求項8之經遺傳工程處理之BoNT/A，其中該二鏈經遺傳工程處理之BoNT/A保留與靶細胞結合、轉位及將靶SNARE蛋白切割之能力。
- 如請求項8之經遺傳工程處理之BoNT/A，其中該二鏈經遺傳工程處理之BoNT/A之安全比至少為8，其中該安全比之計算如下：-10%體重變化所需之毒素劑量(皮克/老鼠)除以DAS ED50(皮克/老鼠)，其中ED50=產生DAS積分2所需之劑量。
- 一種核酸，其包含編碼如請求項1之經遺傳工程處理之肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素(BoNT)A型(BoNT/A)的核酸序列。
- 一種製造具有輕鏈和重鏈之單鏈經遺傳工程處理之肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素(BoNT)A型(BoNT/A)之方法，該方法包含在合適之宿主細胞中表現如請求項11之核酸，裂解該宿主細胞以提供含有該單鏈經遺傳工程處理之BoNT/A的宿主細胞勻漿，及分離該單鏈經遺傳工程處理之BoNT/A。
- 一種活化經遺傳工程處理之肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素(BoNT)A型(BoNT/A)之方法，該方法包含提供藉由如請求項12之方法可取得之單鏈經遺傳工程處理 之BoNT/A，將該單鏈經遺傳工程處理之BoNT/A與能將該單鏈經遺傳工程處理之BoNT/A在位於該輕鏈與該重鏈之間的切割位點切割之蛋白酶接觸，及將該單鏈經遺傳工程處理之BoNT/A轉化成二鏈經遺傳工程處理之BoNT/A，其中該輕鏈與該重鏈係藉由二硫鍵連接在一起。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項8所述之二鏈經遺傳工程處理之BoNT/A和至少一種選自藥學上可接受之載體、賦形劑、佐劑、推進劑及/或鹽的組分。
- 一種如請求項8所述之二鏈經遺傳工程處理之肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素(BoNT)A型(BoNT/A)，其係用於醫藥。
- 如請求項14之醫藥組成物，其係用於醫藥。
- 一種如請求項8所述之二鏈經遺傳工程處理之肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素(BoNT)A型(BoNT/A)於製備藥物之用途，該藥物係用於預防或治療選自下列之疾病或症狀：斜視眼(strabismus)、眼瞼痙攣(blepharospasm)、斜視(squint)、肌張力不全(dystonia)、斜頸(torticollis)、受益自細胞/肌肉無力的美容醫療應用、眼球運動之神經肌肉障礙或病況、書寫痙攣(writer's cramp)、磨牙症(bruxism)、威爾遜氏症(Wilson's disease)、震顫(tremor)、抽搐症(tics)、節段性肌陣攣(segmental myoclonus)、痙攣(spasms)、由慢性多發性硬 化症導致之痙攣、導致之不正常的膀胱控制之痙攣、背部痙攣、四頭肌僵痛(charley horse)、緊張性頭痛、骨盆腔提肌症候群(levator pelvic syndrome)、脊柱裂(spina bifida)、遲發性運動障礙(tardive dyskinesia)、巴金森氏症、口吃(stuttering)、半面痙攣(hemifacial spasm)、眼瞼疾病、腦性麻痺、局部痙攣、痙攣性結腸炎(spasmodic colitis)、神經性膀胱、肛門痙攣(anismus)、肢體痙攣、肛裂(anal fissure)、食道遲緩不能症(achalasia)、吞嚥困難(dysphagia)、催淚(lacrimation)、多汗(hyperhydrosis)、唾液分泌過多、胃腸分泌過多、肌肉疼痛、頭痛、額頭皺紋、皮膚皺紋、癌，子宮病症、泌尿生殖器病症、泌尿生殖器-神經系統病症、慢性神經性發炎及平滑肌病症。
- 如請求項14之醫藥組成物，其係用於預防或治療選自下列之疾病或症狀：斜視眼(strabismus)、眼瞼痙攣(blepharospasm)、斜視(squint)、肌張力不全(dystonia)、斜頸(torticollis)、受益自細胞/肌肉無力的美容醫療應用、眼球運動之神經肌肉障礙或病況、書寫痙攣(writer's cramp)、磨牙症(bruxism)、威爾遜氏症(Wilson's disease)、震顫(tremor)、抽搐症(tics)、節段性肌陣攣(segmental myoclonus)、痙攣(spasms)、由慢性多發性硬化症導致之痙攣、導致之不正常的膀胱控制之痙攣、背部痙攣、四頭肌僵痛(charley horse)、緊張性頭痛、骨盆腔提肌症候群(levator pelvic syndrome)、脊柱裂(spina bifida)、遲發性運動障礙(tardive dyskinesia)、巴金森氏 症、口吃(stuttering)、半面痙攣(hemifacial spasm)、眼瞼疾病、腦性麻痺、局部痙攣、痙攣性結腸炎(spasmodic colitis)、神經性膀胱、肛門痙攣(anismus)、肢體痙攣、肛裂(anal fissure)、食道遲緩不能症(achalasia)、吞嚥困難(dysphagia)、催淚(lacrimation)、多汗(hyperhydrosis)、唾液分泌過多、胃腸分泌過多、肌肉疼痛、頭痛、額頭皺紋、皮膚皺紋、癌，子宮病症、泌尿生殖器病症、泌尿生殖器-神經系統病症、慢性神經性發炎及平滑肌病症。
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| FI3481852T3 (fi) * | 2016-07-08 | 2023-03-19 | Childrens Medical Center | Uusi botulinum-neurotoksiini ja sen johdannaisia |
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| WO2019158745A1 (de) * | 2018-02-16 | 2019-08-22 | Bontana Therapies Gmbh | Nukleinsäure-basiertes botulinum neurotoxin zur therapeutischen anwendung |
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| WO2022073360A1 (zh) * | 2020-10-10 | 2022-04-14 | 广州东盛生物科技有限公司 | 构建新型冠状病毒疫苗的方法及其应用 |
| GB202100566D0 (en) | 2021-01-15 | 2021-03-03 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of brain damage |
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| WO2023075060A1 (ko) * | 2021-10-25 | 2023-05-04 | 비피메드(주) | 보툴리눔 유래 펩타이드를 포함하는 통증개선용 조성물 |
| GB202116795D0 (en) | 2021-11-22 | 2022-01-05 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of visceral pain |
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| GB202213479D0 (en) | 2022-09-14 | 2022-10-26 | Ipsen Biopharm Ltd | Cell-free clostridial neurotoxin assays |
| CN115819526A (zh) * | 2022-12-02 | 2023-03-21 | 海雅美生物技术(珠海)有限公司 | 一种重组肉毒杆菌神经毒素及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (74)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3658093A (en) | 1992-02-10 | 1993-09-03 | Seragen, Inc. | Desensitization to specific allergens |
| GB9305735D0 (en) | 1993-03-19 | 1993-05-05 | North John R | Novel agent for controlling cell activity |
| DE69435254D1 (de) | 1993-06-10 | 2009-12-31 | Allergan Inc | Behandlung von neuromusculaeren Störungen und Zuständen mit verschiedenen botulism Serotypen |
| US5437291A (en) | 1993-08-26 | 1995-08-01 | Univ Johns Hopkins | Method for treating gastrointestinal muscle disorders and other smooth muscle dysfunction |
| US20040126396A1 (en) | 1993-12-28 | 2004-07-01 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin treatment for strabismus |
| US6974578B1 (en) | 1993-12-28 | 2005-12-13 | Allergan, Inc. | Method for treating secretions and glands using botulinum toxin |
| US5670484A (en) | 1994-05-09 | 1997-09-23 | Binder; William J. | Method for treatment of skin lesions associated with cutaneous cell-proliferative disorders |
| US5714469A (en) | 1994-09-01 | 1998-02-03 | Smithkline Beecham Corporation | Method of treating sepsis |
| GB9508204D0 (en) | 1995-04-21 | 1995-06-07 | Speywood Lab Ltd | A novel agent able to modify peripheral afferent function |
| GB9617671D0 (en) | 1996-08-23 | 1996-10-02 | Microbiological Res Authority | Recombinant toxin fragments |
| US7192596B2 (en) | 1996-08-23 | 2007-03-20 | The Health Protection Agency Ipsen Limited | Recombinant toxin fragments |
| US6063768A (en) | 1997-09-04 | 2000-05-16 | First; Eric R. | Application of botulinum toxin to the management of neurogenic inflammatory disorders |
| GB9721189D0 (en) | 1997-10-08 | 1997-12-03 | Speywood Lab The Limited | Analgesic conjugates |
| RU2214420C2 (ru) | 1998-05-13 | 2003-10-20 | Биотекон Гезелльшафт Фюр Биотехнологише Энтвиклунг Унд Консультинг Мбх | Гибридный белок для ингибирования дегрануляции мастоцитов и его применение |
| DK1098664T3 (da) | 1998-07-22 | 2003-11-17 | Osprey Pharmaceuticals Ltd | Sammensætninger og deres anvendelser til at behandle sekundær vævsskade og andre inflammatoriske tilstande og forstyrrelser |
| GB9818548D0 (en) | 1998-08-25 | 1998-10-21 | Microbiological Res Authority | Treatment of mucas hypersecretion |
| US6776990B2 (en) | 1999-04-08 | 2004-08-17 | Allergan, Inc. | Methods and compositions for the treatment of pancreatitis |
| US6358697B2 (en) | 1999-04-21 | 2002-03-19 | Children's Hospital Medical Center | Intracellular pharmaceutical targeting |
| EP1180999A4 (en) * | 1999-05-12 | 2005-03-30 | Us Army Medical Res And Materi | RECOMBINANT VACCINE AGAINST BOTULINUM NEUROTOXIN |
| US6767544B2 (en) | 2002-04-01 | 2004-07-27 | Allergan, Inc. | Methods for treating cardiovascular diseases with botulinum toxin |
| US6358917B1 (en) | 1999-08-24 | 2002-03-19 | Jean D. A. Carruthers | Cosmetic use of botulinum toxin for treatment of downturned mouth |
| ES2277854T5 (es) | 1999-08-25 | 2011-02-04 | Allergan, Inc. | Neurotoxinas recombinantes activables. |
| GB9922554D0 (en) | 1999-09-23 | 1999-11-24 | Microbiological Res Authority | Inhibition of secretion from non-neuronal cells |
| US6113915A (en) | 1999-10-12 | 2000-09-05 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating pain |
| US6265379B1 (en) | 1999-10-13 | 2001-07-24 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating otic disorders |
| US6139845A (en) | 1999-12-07 | 2000-10-31 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating cancer with a neurotoxin |
| US7838008B2 (en) | 1999-12-07 | 2010-11-23 | Allergan, Inc. | Methods for treating diverse cancers |
| US6337075B1 (en) | 2000-01-11 | 2002-01-08 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating diabetes |
| US6143306A (en) | 2000-01-11 | 2000-11-07 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating pancreatic disorders |
| US6261572B1 (en) | 2000-01-11 | 2001-07-17 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating a pancreatic disorder with a neurotoxin |
| US6641820B1 (en) | 2000-01-19 | 2003-11-04 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin derivatives and methods to treat pain |
| US6524580B1 (en) | 2000-02-15 | 2003-02-25 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating thyroid disorders |
| US6464986B1 (en) | 2000-04-14 | 2002-10-15 | Allegan Sales, Inc. | Method for treating pain by peripheral administration of a neurotoxin |
| US6299893B1 (en) | 2000-04-17 | 2001-10-09 | Marvin Schwartz | Method to reduce hair loss and stimulate hair regrowth |
| US6565870B1 (en) | 2000-04-28 | 2003-05-20 | Allergan, Inc. | Methods for treating bone tumors |
| US6306403B1 (en) | 2000-06-14 | 2001-10-23 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating parkinson's disease with a botulinum toxin |
| US6903187B1 (en) * | 2000-07-21 | 2005-06-07 | Allergan, Inc. | Leucine-based motif and clostridial neurotoxins |
| US6423319B1 (en) | 2000-10-04 | 2002-07-23 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating muscle injuries |
| US6827931B1 (en) | 2000-10-20 | 2004-12-07 | Allergan, Inc. | Method for treating endocrine disorders |
| US7273722B2 (en) | 2000-11-29 | 2007-09-25 | Allergan, Inc. | Neurotoxins with enhanced target specificity |
| US20040028613A1 (en) * | 2001-06-25 | 2004-02-12 | Nastech Pharmaceutical Company Inc | Dopamine agonist formulations for enhanced central nervous system delivery |
| US7255866B2 (en) | 2001-09-17 | 2007-08-14 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin therapy for fibromyalgia |
| US6623742B2 (en) | 2001-09-17 | 2003-09-23 | Allergan, Inc. | Methods for treating fibromyalgia |
| US6921538B2 (en) | 2002-05-10 | 2005-07-26 | Allergan, Inc. | Therapeutic treatments for neuropsychiatric disorders |
| CA2501856A1 (en) | 2002-10-15 | 2004-04-29 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin dental therapies and procedures |
| US7238357B2 (en) | 2002-11-05 | 2007-07-03 | Allergan, Inc. | Methods for treating ulcers and gastroesophageal reflux disease |
| US7166575B2 (en) * | 2002-12-17 | 2007-01-23 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Compositions and methods for enhanced mucosal delivery of peptide YY and methods for treating and preventing obesity |
| US8071550B2 (en) | 2003-03-03 | 2011-12-06 | Allergan, Inc. | Methods for treating uterine disorders |
| US6838434B2 (en) | 2003-05-02 | 2005-01-04 | Allergan, Inc. | Methods for treating sinus headache |
| US7220422B2 (en) | 2003-05-20 | 2007-05-22 | Allergan, Inc. | Methods and compositions for treating eye disorders |
| US20040253274A1 (en) | 2003-06-11 | 2004-12-16 | Allergan, Inc. | Use of a clostridial toxin to reduce appetite |
| DE102004043009A1 (de) | 2004-09-06 | 2006-03-23 | Toxogen Gmbh | Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen |
| WO2006059093A2 (en) | 2004-12-01 | 2006-06-08 | Health Protection Agency | Fusion proteins |
| BRPI0608249A2 (pt) * | 2005-03-03 | 2009-12-08 | Revance Therapeutics Inc | formulação, método para aplicação tópica e kit para distribuição transdérmica de toxina botulìnica |
| CA2601577A1 (en) * | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with altered targeting capabilities for clostridial toxin target cells |
| DE102005019302A1 (de) | 2005-04-26 | 2006-11-16 | Toxogen Gmbh | Carrier zum Targeting von Nervenzellen |
| ES2369558T3 (es) | 2005-09-19 | 2011-12-01 | Allergan, Inc. | Toxinas clostridiales y toxinas clostridiales activables. |
| EP1834962A1 (de) | 2006-03-15 | 2007-09-19 | Biotecon Therapeutics GmbH | PEGyliertes mutiertes Clostridium botulinum Toxin |
| JP2009543556A (ja) * | 2006-07-11 | 2009-12-10 | アラーガン、インコーポレイテッド | 増強した転位置能力および増強したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素 |
| US8486422B2 (en) * | 2007-07-26 | 2013-07-16 | Allergan, Inc. | Methods of activating clostridial toxins |
| WO2009015840A2 (en) * | 2007-07-27 | 2009-02-05 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Polypeptide for targeting of neural cells |
| WO2009042165A2 (en) * | 2007-09-25 | 2009-04-02 | Thomas Jefferson University | Mutant botulinum neurotoxin serotype a polypeptide and uses thereof |
| CN101918021A (zh) * | 2007-10-23 | 2010-12-15 | 阿勒根公司 | 使用经修饰的梭菌毒素治疗泌尿生殖系统神经疾病的方法 |
| SG172812A1 (en) * | 2008-12-31 | 2011-08-29 | Revance Therapeutics Inc | Injectable botulinum toxin formulations |
| GB0903006D0 (en) | 2009-02-23 | 2009-04-08 | Syntaxin Ltd | Modified non-cytotoxic proteases |
| EP2419128B1 (en) | 2009-04-14 | 2018-06-06 | Medical College of Wisconsin, Inc. | Engineered botulinum neurotoxin |
| JP4900443B2 (ja) | 2009-09-30 | 2012-03-21 | 大日本印刷株式会社 | 色素増感型太陽電池 |
| NZ604322A (en) * | 2010-05-20 | 2015-01-30 | Allergan Inc | Degradable clostridial toxins |
| US8853360B2 (en) | 2010-06-23 | 2014-10-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Engineered botulinum neurotoxin C1 with selective substrate specificity |
| US20120189677A1 (en) | 2011-01-20 | 2012-07-26 | Stephen Tonge | Formulations |
| WO2013068476A1 (en) * | 2011-11-09 | 2013-05-16 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Neurotoxins exhibiting shortened biological activity |
| BR112014029585A2 (pt) * | 2012-05-30 | 2017-07-25 | Harvard College | neurotoxina botulínica engendrada |
| GB201312317D0 (en) * | 2013-07-09 | 2013-08-21 | Syntaxin Ltd | Cationic neurotoxins |
| GB201407525D0 (en) * | 2014-04-29 | 2014-06-11 | Syntaxin Ltd | Manufacture of recombinant clostridium botulinum neurotoxins |
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| JP7434263B2 (ja) | 陽イオン性神経毒 | |
| US20200291073A1 (en) | Cationic neurotoxins | |
| JP6867452B2 (ja) | 陽イオン性神経毒 | |
| NZ715570B2 (en) | Cationic neurotoxins |