JP2022550769A - 神経障害の治療のためのクロストリジウム神経毒変異型の使用 - Google Patents

神経障害の治療のためのクロストリジウム神経毒変異型の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドに対するものであり、このポリペプチドはクロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片を含む。患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復の促進に使用するためのさらなるポリペプチドも、また、対応する方法および使用も提供されている。【選択図】図9

Description

本発明は神経障害の治療に関する。
神経障害はニューロン損傷、神経変性疾患、感覚障害、および、自律神経障害を含む。
脊髄損傷(SCI)などのニューロン損傷は損傷した軸索の変性を誘発し、正常な感覚、運動、および、自律機能を阻害する。回復は損傷した軸索の再生および未損傷の軸索の側枝発芽などの内因性メカニズムにより進行し得るものであり、神経が麻痺した対象部位の神経再生をもたらす。しかし、損傷ニューロン(特に、脊髄)の再生能は成体哺乳類では限界があり、患者は生活の質に著しく影響する様々な身体障碍を被り得る。
ニューロン損傷に対する従来の治療法はインターロイキン-6(IL-6)と幹細胞移植を含むが、外来診療所での使用のための開発段階にあるものはほとんどない。したがって、ニューロンの成長または修復を促進できるニューロン損傷の治療法が依然として必要とされている。
Clostridia属の細菌は非常に強力で特異なタンパク質毒素を産生し、これらの毒素は送達されたニューロンおよび他の細胞を毒することが可能である。このようなクロストリジウム毒素の例はC. tetaniによって産生される神経毒(TeNT)およびC. botulinum血清型AからGおよびXによって産生されるもの(BoNT)(国際公開第2018/009903 A2号を参照)、ならびに、C. baratiiおよびC. butyricumによって産生されるものを含む。
クロストリジウム神経毒の中には、いくつかの知られている最も強力な毒素がある。例として、ボツリヌス菌神経毒は血清型によって0.5から5 ng/kgの範囲のハツカネズミに対する半数致死量(LD50)値を有する。破傷風およびボツリヌス菌の毒素はともに、冒されたニューロンの機能、特に神経伝達物質の放出を阻害することによって作用する。ボツリヌス菌毒素が神経筋接合部で作用し、末梢神経系のコリン作動性伝達を阻害する一方、破傷風毒素は中枢神経系内で作用する。
本来、クロストリジウム神経毒はジスルフィド結合によって一体に連結された2本のポリペプチド鎖を形成するためのタンパク質分解性開裂事象によって翻訳語に修飾される一本鎖ポリペプチドとして合成される。開裂は、鎖間のジスルフィド結合をもたらすシステイン残基間に所在する活性化部位としばしば呼ばれる特定の開裂部位で起こる。毒素の活性形状であるのがこの2本鎖形状である。2本の鎖は、分子量が約100kDaである重鎖(H鎖)と分子量が約50kDaである軽鎖(L鎖)と命名されている。H鎖はN末端トランスロケーション成分(HNドメイン)およびC末端標的指向性成分(HCドメイン)を含む。開裂部位はL鎖とトランスロケーションドメイン成分との間に所在している。HCドメインのその標的ニューロンへの結合および結合した毒素のエンドソームを介した細胞内への取り込みに続き、HNドメインはL鎖をエンドソーム膜を超えて細胞質ゾル内にトランスロケーションさせ、L鎖は(非細胞毒性タンパク質分解酵素としても知られている)タンパク質分解酵素機能を提供する。
非細胞毒性タンパク質分解酵素は、SNAREタンパク質(例えば、SNAP-25、VAMP、または、シンタキシン)として知られている細胞間輸送タンパク質をタンパク質分解的に開裂させることによって作用する。頭字語SNAREは用語Soluble NSF Attachment Receptor(可溶性NSF付着受容体)に由来し、NSFはN-ethylmaleimide-Sensitive Factor(N-エチルマレイミド感受性因子)を意味する。SNAREタンパク質は細胞間小胞融合に不可欠であり、したがって、細胞からの小胞輸送を介した分子の分泌に不可欠である。タンパク質分解酵素機能は亜鉛依存エンドペプチダーゼ活性であり、SNAREタンパク質に対する高い基質特異性を示す。そのため、一旦所望の標的細胞に送達されると、非細胞毒性タンパク質分解酵素は標的細胞からの細胞分泌を阻害可能となる。クロストリジウム神経毒のL鎖タンパク質分解酵素はSNAREタンパク質を開裂させる非細胞毒性タンパク質分解酵素である。
SNAREタンパク質の遍在性の観点から、ボツリヌス菌毒素などのクロストリジウム神経毒は、広い範囲の治療に上首尾に採用されてきている。
国際公開第2016/170,501 A1号は脊髄損傷による麻痺の治療のための(L鎖、および、HNとHCドメインを含むH鎖を含む)触媒として活性な全長BoNT/Aの使用を記載している。国際公開第2016/170501 A1号は、BoNT/Aの機能性ドメインのそれぞれが、H鎖の結合能およびトランスロケーション能ならびにL鎖の非細胞毒性タンパク質分解酵素活性を含めて、観察された治療効果に不可欠であることを教示している。上記のとおり、全長クロストリジウム神経毒は極端に強力であり、この毒を扱う際は特定の安全手順の採用が必要となる。さらに、標的組織から離れた毒の広がりは、極端な場合には生命を脅かす可能性もある望ましくない副作用の原因になると考えられている。このことは、クロストリジウム神経毒治療法(BoNT治療法など)を高用量、高濃度、かつ、高注入量で使用する際に特有の懸案事項となり得る。一般向けのBoNT/A治療法について報告されているこの問題に伴う弊害は、無力症、全身性筋力低下、複視、下垂症、嚥下障害、発声困難、構音障害、尿失禁、および、呼吸困難を含む。嚥下および呼吸の困難は生命を脅かし得るものであり、毒素の効果の広がりに関連した死亡も報告されている。したがって、ニューロンの成長または修復を促進するためのより安全な治療法が必要となっている。
大きさを考えると、全長クロストリジウム神経毒(～150kDa)またはこれの完全なH鎖(～100kDa)の使用は、前記ポリペプチドで治療中の患者の免疫反応を引き起こすリスクの増大を伴う。さらに、H鎖全体(および、特にHCドメイン)の存在は結果的にクロストリジウム神経毒の標的受容体へのポリペプチド結合をもたらし、これは前記ポリペプチドが投与されている患者における無用の的外れな効果を伴う可能性がある。
本発明は上述の問題の1つまたは複数を克服するものである。
本発明者らは、クロストリジウム神経毒L鎖および/またはクロストリジウム神経毒H鎖の断片(例えば、トランスロケーションドメイン(HN)または受容体結合ドメイン(HC))を含むポリペプチドが、ニューロンの成長または修復を促進することを驚きとともに発見し、したがって、神経障害の治療における有用性を見出している。好都合なことに、このことは、クロストリジウム神経毒の非毒性(または、実質的に非毒性)の断片の使用を可能にし、これらの断片は、(全長H鎖または全長クロストリジウム神経毒と比較して)より小さなサイズを考えると、前記断片を投与された患者に免疫反応を引き起こす可能性がより低い。さらに、非毒性(または、実質的に非毒性)の断片は全長クロストリジウム神経毒よりも価格が低くかつ/または製造の複雑さも低い。加えて、非毒性(または、実質的に非毒性)の断片は全長クロストリジウム毒素よりも明確に規定された治療法を構成し、かつ、ポリペプチドのより短い長さを考えると、例えば、ドメイン間のシステインシャッフルの可能性が低い。
したがって、一態様において、本発明は患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、 クロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片、および/または、 クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片を含む。
関連態様において、患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復の促進のための方法が提供され、方法は患者へのポリペプチドの投与を含み、ポリペプチドは、 クロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、 クロストリジウム神経毒H鎖の断片を含む。
他の態様において、患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復の促進のための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用が提供され、ポリペプチドは、 クロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、 クロストリジウム神経毒H鎖の断片を含む。
一態様において、本発明は患者の神経障害の治療において使用するためのポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、 クロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片、および/または、 クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片を含む。
関連態様において、患者の神経障害を治療するための方法が提供され、方法は患者へのポリペプチドの投与を含み、ポリペプチドは、 クロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、 クロストリジウム神経毒H鎖の断片を含む。
他の態様において、患者の神経障害を治療するための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用が提供され、前記ポリペプチドは、 クロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、 クロストリジウム神経毒H鎖の断片を含む。
一態様において、本発明のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒L鎖を含む。好ましくは、このL鎖は触媒として不活性である。
したがって、一態様において、本発明は患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドが提供され、ポリペプチドは触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含む。
関連態様において、本発明は患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復の促進のための方法を提供し、方法は患者へのポリペプチドの投与を含み、ポリペプチドは触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含む。
他の関連態様において、本発明は患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復の促進のための薬剤の製造における触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含むポリペプチドの使用を提供する。
一態様において、本発明は患者の神経障害の治療における使用のためのポリペプチドを提供し、ポリペプチドは触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含む。
関連態様において、本発明は患者の神経障害を治療するため方法を提供し、方法は患者へのポリペプチドの投与を含み、ポリペプチドは触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含む。
他の関連態様において、本発明は患者の神経障害の治療のための薬剤の製造における触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含むポリペプチドの使用を提供する。
本発明者らは、クロストリジウム神経毒L鎖の触媒活性がニューロンの成長またはニューロンの修復を促進するために必要ではないことを初めて示した。したがって、本発明はより安全な(より毒性の低い)治療法の提供を可能にするものとなっている。
活性クロストリジウム神経毒L鎖は非細胞毒性タンパク質分解酵素活性を有する。特に、活性クロストリジウム神経毒L鎖はエンドペプチダーゼ活性を有し、標的細胞内の開口分泌融合装置のタンパク質を開裂可能である。開口分泌融合装置のタンパク質は、好ましくは、SNAP-25、シナプトブレビン/VAMP、または、シンタキシンなどのSNAREタンパク質である。
クロストリジウム神経毒L鎖に関して本明細書で使用の用語「触媒として不活性な」とは、前記L鎖が非細胞毒性タンパク質分解酵素活性を実質的に示さないことを意味し、好ましくは、クロストリジウム神経毒L鎖に関して本明細書で使用の用語「触媒として不活性な」とは、前記L鎖が非細胞毒性タンパク質分解酵素活性を示さないことを意味する。実施の一形態において、触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖は標的細胞内の開口分泌融合装置のタンパク質を開裂しないものである。用語「実施的に非細胞毒性タンパク質分解酵素活性のない」とは、クロストリジウム神経毒L鎖が、触媒として活性なクロストリジウム神経毒L鎖の非細胞毒性タンパク質分解酵素活性の5%未満、例えば、触媒として活性なクロストリジウム神経毒L鎖の非細胞毒性タンパク質分解酵素活性の2%未満、1%未満、または、好ましくは0.1%未満を有することを意味する。非細胞毒性タンパク質分解酵素活性は、同条件下で触媒として活性なクロストリジウム神経毒L鎖によって開裂されたSNAREタンパク質の量に比較した際に、SNAREタンパク質で試験クロストリジウム神経毒L鎖を培養し、試験クロストリジウム神経毒L鎖によって開裂されたSNAREタンパク質の量を比較することによって生体外で決定可能である。SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法などの定例技術も、開裂されたSNAREタンパク質の量を定量するために使用可能である。適した生体外試験は参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2019/145,577 A1号に記載されている。
細胞に基づく、および、生体内での各検定も、L鎖と機能性細胞結合トランスロケーションドメインを含むクロストリジウム神経毒が非細胞毒性タンパク質分解酵素活性を有するか否かを決定するために使用可能である。指外転スコア(DAS)、後根ガンクリア(DRG)検定、脊髄ニューロン(SCN)検定、および、ハツカネズミ横隔神経片側横隔膜(PNHD)検定などの検定は当技術分野では定例的なものである。非細胞毒性タンパク質分解酵素活性の決定に適した検定は参照により本明細書に組み込まれるDonald他によるPharmacol Res Perspect(「薬理学、研究、および、展望」)e00446 1-14 (2018)に記載されたものであってよい。
触媒として不活性なL鎖は前記触媒活性を不活性化する1つまたは複数の変異を有してよい。例えば、触媒として不活性なBoNT/AL鎖はHis223、Glu224、His227、Glu262、および/または、Tyr366などの活性部位残基の変異を含んでよい。位置の番号付けは配列番号62のアミノ酸位置に対応し、ポリペプチドを配列番号62に整列させることによって決定可能である。配列番号62の位置1におけるメチオニン残基の存在が任意であるので、当業者はアミノ酸残基の番号付けを決定する際にメチオニン残基の存在/不在を考慮されよう。例えば、配列番号62がメチオニンを含む場合、位置の番号付けは上記に定義したとおりとなる(例えば、His223は配列番号62のHis223となる)。代案として、メチオニンが配列番号62に不在である場合、アミノ酸残基の番号付けは-1によって修正されたい(例えば、His223は配列番号62のHis222となる)。同様の考慮は本明細書に記載の他のポリペプチド配列の位置1におけるメチオニンが存在/不在の際にも適用され、当業者は当技術分野で定例の技術を使用して正しいアミノ酸残基番号付けを直ちに決定されよう。
実施の特に好ましい形態において、本発明のポリペプチドは、修飾BoNT/Aまたはその断片(好ましくは、BoNT/AHCドメインまたはその断片)を含んでよい。修飾BoNT/Aまたはその断片は、ASN886、ASN905、GLN915、ASN918、GLU920、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、GLU992、GLN995、ASN1006、ASN1025、ASN1026、ASN1032、ASN1043、ASN1046、ASN1052、ASP1058、HIS1064、ASN1080、GLU1081、GLU1083、ASP1086、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274、および、THR1277から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における修飾を含むものでよい。この修飾BoNT/Aまたはその断片は、知られているBoNT/Aの使用と比較して副作用の低減または不在を実証可能である。本発明の修飾BoNT/Aの増強された組織保持特性は、知られているクロストリジウム毒素治療法に比べて、活性の有効性および/または持続期間の増加(または、いかなる追加の悪影響もない投薬量の増加)も提供可能であり、したがって、さらなる長所を提供する。
修飾は配列番号62として示す未修飾BoNT/Aと比較した際の修飾であってよく、アミノ酸残基の番号付けは配列番号62との整列によって決定される。配列番号62(ならびに、本明細書に記載の修飾BoNT/Aポリペプチドまたはその断片に対応する各SEQ ID NO)の位置1のメチオニン残基の存在が任意であるため、当業者はアミノ酸残基番号付けを決定する際にメチオニン残基の存在/不在を考慮されよう。例えば、配列番号62がメチオニンを含む場合、位置の番号付けは上記に定義したとおりとなる。代案として、配列番号2にメチオニンが不在の場合、アミノ酸残基の番号付けは-1によって修正されたい(例えば、ASN886は配列番号62のASN885となる)。同様の考慮は本明細書に記載の他のポリペプチド配列の位置1におけるメチオニンが存在/不在の際にも適用され、当業者は、当技術分野で定例の技術を使用して正しいアミノ酸残基番号付けを直ちに決定されよう。
上記の修飾のために示したアミノ酸残基は表面露出アミノ酸残基である。
修飾BoNT/Aまたはその断片は、ASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、ASN1052、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274、および、THR1277から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における修飾を含んでよい。
修飾BoNT/Aまたはその断片の文脈で使用される際の用語「1つまたは複数のアミノ酸残基」とは、好ましくは、示されたアミノ酸残基の少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、または、7個を意味する。したがって、修飾BoNT/Aは示されたアミノ酸残基における少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、または、7個(好ましくは、7個)の修飾を含んでよい。修飾BoNT/Aまたはその断片は1～30個、3～20個、または、5～10個のアミノ酸修飾を含んでよい。より好ましくは、修飾BoNT/Aまたはその断片の文脈において使用される際の用語「1つまたは複数のアミノ酸残基」とは、示されたアミノ酸残基のすべてを意味する。
好ましくは、示されたアミノ酸残基における1つまたは複数のアミノ酸修飾を超えて、修飾BoNT/Aまたはその断片は、配列番号62と比較した際に、いかなるさらなるアミノ酸修飾も含まない。
修飾は、
i.酸性表面露出アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換、
ii.酸性表面露出アミノ酸残基の非荷電アミノ酸残基との置換、
iii.非荷電表面露出アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換、
iv.塩基性アミノ酸残基の挿入、および、
v.酸性表面露出アミノ酸残基の欠失から選択可能である。
上記に示した修飾は、対応する未修飾BoNT/Aまたはその断片と比較した際に、増加した正の表面電荷および増加した等電点を有する修飾BoNT/Aまたはその断片をもたらす。
等電点(pl)は特定のタンパク質の固有の特性である。当技術分野ではよく知られているように、タンパク質は(タンパク質内の時は、アミノ酸残基とも呼ばれる)アミノ酸の固有の配列から作られている。20種の標準セットのそれぞれのアミノ酸は異なった側鎖(またはR基)を有し、タンパク質内のそれぞれのアミノ酸残基が電荷および疎水性などの異なった化学特性を示すことを意味している。これらの特性は温度およびpHなどの周囲の化学的環境に影響を受け得る。タンパク質のすべての化学的特徴はこれらの様々な要因の総和に依存する。
(以下に詳細を示す)特定のアミノ酸残基は周囲のpHに応じて電荷を示し得るイオン化可能側鎖を有する。この側鎖が特定のpHにおいて荷電されているか否かは、関連するイオン化可能部分のpKaに依存し、pKaは共役塩基からの特定の陽子の酸解離定数(Ka)の負の対数である。
例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性残基は、pKa値が約4.1の側鎖カルボン酸基を有する(正確なpKa値はイオン化可能基の温度、イオン強度、および、微環境に依存し得る)。したがって、これらの側鎖は(しばしば「生理学的pH」と呼ばれる)7.4のpHで負の荷電を示す。低いpH値では、これらの側鎖は陽子が付加されて電荷を失う。
逆に、リジンおよびアルギニンなどの塩基性残基は、pKa値が約10～12の窒素含有側鎖基を有する。したがって、これらの側鎖は7.4のpHで正の荷電を示す。これらの側鎖は高pH値で陽子が脱離して電荷を失う。
したがって、タンパク質分子の全(正味)電荷は、タンパク質内に存在する酸性および塩基性の残基の数(およびそれらの表面露出の程度)、ならびに、周囲のpHに依存する。周囲のpHを変化させることは、タンパク質の全電荷を変化させる。したがって、、各タンパク質について、正および負の電荷の数が等しく、タンパク質が全体の正味電荷を示さない特定のpHがある。この点は等電点(pl)として知られている。等電点は当業者が精通するタンパク質生化学における標準的な概念である。
したがって、等電点(pl)はタンパク質がゼロの正味電荷を示すpH値として定義されている。plの増加は、タンパク質がゼロの正味電荷を示すためにより高いpH値が必要であることを意味する。したがって、plの増加は特定のpHでのタンパク質の正味の正電荷の増加を表す。逆に、plの減少は、タンパク質がゼロの正味電荷を示すためにより低いpH値が必要であることを意味する。したがって、plの減少は特定のpHでのタンパク質の正味の正電荷の減少を表す。
タンパク質のplを決定する方法は当技術分野では知られており、当業者も精通していよう。例として、タンパク質のplは、タンパク質内に存在するそれぞれのアミノ酸の平均pKa値から算出可能である(「算出pl」)。この算出は、本発明によるplを計算するための好ましい方法であるExPASy(https://web.expasy.org/compute_pl/)からのCompute pl/MW Toolなどの当技術分野で知られているコンピュータプログラムを使用して実行可能である。異なる分子間でのpl値の比較は同じ計算技術/プログラムを使用して実行されたい。
適切である場合、タンパク質の算出plは等電点電気泳動法の技術を使用して実験的に確認可能である(「観測pl」)。この技術は、タンパク質をそのplによって分離するための電気泳動法を使用している。等電点電気泳動法は、固定化pH勾配を有するゲルを使用して典型的に行われる。電場が印加されると、タンパク質は、タンパク質がゼロの正味電荷を有するpHに到達するまでpH勾配を介して移動し、この点がそのタンパク質のplとなる。等電点電気泳動法により提供される結果は、事実上、典型的に、相対的に低分解能であり、そのため、本発明者らは、(上記のとおりの)算出plによって提供される結果が使用するにはより適切であると考えている。
本明細書全体を通じて、他に明言されていない限り、「pl」とは「算出pl」を意味する。
タンパク質のplはその表面上に示された塩基性および/または酸性の基の数を変化させることによって増加または減少が可能である。これはそのタンパク質の1つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって達成可能である。例えば、plの増加は酸性残基の数を減少させることによって、または、塩基性残基の数を増加させることによってもたらすことが可能である。
本発明の修飾BoNT/Aまたはその断片は、未修飾BoNT/A(例えば、配列番号62)またはその断片のものより高い少なくとも0.2、0.4、0.5、または、1pl単位であるpl値を有することが可能である。好ましくは、修飾BoNT/Aまたはその断片は少なくとも6.6、例えば、少なくとも6.8のplを有することが可能である。
20種の標準アミノ酸の特性を以下の表に示す。
Figure 2022550769000002
以下のアミノ酸は荷電アミノ酸であると考えられている:アスパラギン酸(負)、グルタミン酸(負)、アルギニン(正)、および、リジン(正)。
pHが7.4では、アスパラギン酸(pKaは3.1)およびグルタミン酸(pKaは4.1)の側鎖が負の電荷を有する一方、アルギニン(pKaは12.5)およびリジン(pKaは10.8)の側鎖は正の電荷を有する。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、酸性アミノ酸残基と呼ばれている。アルギニンおよびリジンは塩基性アミノ酸残基と呼ばれている。
以下のアミノ酸は非荷電かつ(これらが水素結合に参加可能であることを意味する)有極性のアミノ酸であると考えられている:アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、および、トリプトファン。
以下のアミノ酸は非荷電の疎水性アミノ酸であると考えられている:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、および、グリシン。
アミノ酸挿入では、追加のアミノ酸残基(通常は存在しないもの)がBoNT/Aポリペプチド配列またはその断片内に組み込まれ、したがって、前記配列内のアミノ酸残基の総数を増加させる。アミノ酸欠失では、アミノ酸残基がクロストリジウム毒素アミノ酸配列から除去され、したがって、前記配列内のアミノ酸残基の総数を減少させる。
好ましくは、修飾は置換であり、これは修飾BoNT/Aまたはその断片内のアミノ酸残基の同じ数を有利に維持する。アミノ酸置換では、BoNT/Aポリペプチド配列またはその断片の一部を形成するアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基で代替される。代替アミノ酸残基は上記の20種の標準アミノ酸の1つであってよい。代案として、アミノ酸置換での代替アミノ酸は非標準アミノ酸(上記の20種の標準セットの一部でないアミノ酸)であってよい。例として、代替アミノ酸は塩基性非標準アミノ酸、例えば、L-オルニチン、L-2-アミノ-3-グアニジノプロピオン酸、または、リジン、アルギニン、および、オルニチンのD異性体)であってよい。タンパク質内に非標準アミノ酸を導入する方法は当技術分野では知られており、E.coli栄養要求性発現ホストを使用した組換えタンパク質合成を含む。
実施の一形態において、置換は、酸性アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換、酸性アミノ酸残基の非荷電アミノ酸残基との置換、および、非荷電アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換から選択される。実施の一形態において、置換は酸性アミノ酸残基の非荷電アミノ酸残基との置換であり、酸性アミノ酸残基はその対応する非荷電アミドアミノ酸残基で代替される(すなわち、アスパラギン酸はアスパラギンで代替され、グルタミン酸はグルタミンで代替される)。
好ましくは、塩基性アミノ酸残基はリジン残基またはアルギニン残基である。言い換えると、置換はリジンまたはアルギニンとの置換である。最も好ましくは、修飾はリジンとの置換である。
好ましくは、本発明での使用のための修飾BoNT/Aまたはその断片はクロストリジウム毒素HCNドメイン内に所在する4個と40個との間のアミノ酸修飾を含む。前記修飾BoNT/Aまたはその断片は、好ましくは、少なくとも6.6のplも有する。前記修飾BoNT/Aは、好ましくは、ASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、および、ASN1052から選択される少なくとも4個のアミノ酸の修飾を含み、前記修飾はアミノ酸のリジン残基またはアルギニン残基との置換を含む。例えば、前記修飾BoNT/Aまたはその断片は、ASN886、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、ASN1052、および、GLN1229から選択される少なくとも5個のアミノ酸の修飾を含んでよく、前記修飾はアミノ酸のリジン残基またはアルギニン残基との置換を含む。
アミノ酸残基の置換、挿入、または、欠失によってタンパク質を修飾する方法は当技術分野では知られている。例として、アミノ酸修飾はポリペプチドを符号化した (例えば、未修飾BoNT/Aまたはその断片を符号化した) DNA配列の修飾によって導入可能である。これは、標準分子クローン技術、例えば、所望のアミノ酸のためのDNA(オリゴヌクレオチド)コードの短鎖がポリメラーゼ酵素を使用して本来のコード配列を置き換えるために使用される位置指定変異誘発法によるもの、または、遺伝子の部分の様々な酵素(例えば、リガーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ)による挿入/欠失によるものを使用して達成可能である。代案として、修飾遺伝子配列は化学的に合成可能である。
一態様において、本発明は患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドを提供し、ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、かつ/または、ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む。
関連態様において、患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法が提供され、方法は患者へのポリペプチドの投与を含み、ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、かつ/または、ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む。
さらなる関連態様において、患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復の促進に使用するための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用が提供され、ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、かつ/または、ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む。
一態様において、本発明は患者の神経障害の治療における使用のためのポリペプチドを提供し、ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、かつ/または、ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む。
関連態様において、患者の神経障害を治療するための方法が提供され、方法は患者へのポリペプチドの投与を含み、ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、かつ/または、ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む。
さらなる関連態様において、患者の神経障害を治療するための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用が提供され、ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、かつ/または、ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む。
実施の一形態において、本発明による使用のためのポリペプチドは、配列番号42に対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明による使用のためのポリペプチドは配列番号42に示されているポリペプチド配列を含む。
実施の一形態において、本発明による使用のためのポリペプチドは、配列番号41に対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明による使用のためのポリペプチドは配列番号41に示されているヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む。
実施の一形態において、本発明による使用のためのポリペプチド(例えば、配列番号42を含むもの、または、配列番号41によって符号化されたもの)は配列番号61または65に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチドの一部であってよい。したがって、実施の一形態において、本発明による使用のためのポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでよい。好ましくは、本発明による使用のためのポリペプチドは配列番号61または65を含んでよい(より好ましくは、からなってよい)。実施の一形態において、ポリペプチドは触媒として不活性なL鎖(例えば、配列番号65によるもの)を含む。
実施の一形態において、本発明による使用のためのポリペプチド(例えば、配列番号42を含むもの、または、配列番号41によって符号化されたもの)は配列番号60に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されてよい。したがって、実施の一形態において、本発明による使用のためのポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されてよい。好ましくは、本発明による使用のためのポリペプチドは配列番号60を含む(より好ましくは、からなる)ヌクレオチド配列によって符号化されてよい。実施の一形態において、ポリペプチドは触媒として不活性なL鎖を含む。
配列番号42は修飾BoNT/A断片の例であり、配列番号61および65はそれぞれ触媒として活性および不活性な修飾BoNT/Aポリペプチドの例である。これらの修飾BoNT/Aポリペプチドおよび断片は本発明による使用のために特に好ましい。配列番号42、61、および62として示すポリペプチドは、ポリペプチドの等電点を増加させる野生型BoNT/Aと比較して多くのアミノ酸修飾(例えば、置換)を有する。理論にかかわらず、増加した正味の正電荷はポリペプチドと陰イオン性細胞外成分との間の静電相互作用を促進、これにより、ポリペプチドと細胞表面との間の結合を促進し、したがって、作用の投与部位における保持および継続期間を増大させる、と考えられている。したがって、配列番号42、61、および、65のニューロンの成長および/または修復の特性は、前記修飾のない同等のポリペプチドに比較して、向上することが予想される。
上記の触媒として活性な修復BoNT/Aポリペプチド(例えば、配列番号61)について、(治療指数の増加を表す)これらの有利な特性が定義可能な1つの方法は修飾BoNT/Aの安全率に関している。これに関して、(投与部位から離れた毒素の拡散が引き起こす)クロストリジウム神経毒の不要な効果は関連する動物モデルにおける体重減少(例えば、ハツカネズミ、この体重減少は投与の7日以内に検出された)の割合の測定によって実験的に評価可能である。逆に、クロストリジウム神経毒の所望の狙いどおりの効果は、筋麻痺の測定である指外転スコア(DAS)検定によって実験的に評価可能である。DAS検定は、ハツカネズミの腓腹筋/ヒラメ筋複合体へのゼラチンリン酸緩衝液中で処方されたクロストリジウム神経毒の20μlの注入と、それに続く、Aoki (Aoki KRによるToxicon(「毒物学」)39: 1815-1820; 2001)の方法を使用した指外転スコアの評価によって実行可能である。DAS検定では、ハツカネズミが後肢を伸展し後指を外転させる特異的驚愕反応を引き起こすためにハツカネズミを尾で短時間吊り下げる。クロストリジウム神経毒の注入に続き、様々な程度の指外転が5段階(0=正常から4=指の外転および脚の進展の最大減少)で採点する。
クロストリジウム神経毒の安全率は(ハツカネズミへの投薬後の最初の7日間以内のピーク効果において測定された)体重の10%の低下に必要な毒素の量と、DASの評点の2に必要な毒素の量との間の比率として表すことが可能である。したがって、高い安全率評点が所望され、これは無用の的外れな効果がほとんどなしに標的筋肉を効果的に麻痺させることが可能な毒素を示すものである。本発明の触媒として活性な修飾BoNT/Aは、同等の未修飾(天然の)ボツリヌス菌毒素(例えば、配列番号62)の安全率より高い安全率を有することが可能である。
したがって、実施の一形態において、本発明の触媒として活性な修飾BoNT/Aは、少なくとも8(例えば、少なくとも8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、または、50)の安全率を有し、安全率は～10%の体重変化に必要な毒素の投薬量(pg/ハツカネズミ)をDAS ED50(pg/ハツカネズミ)で除したものとして算出される[ED50=2のDAS評点をもたらすために必要な投薬量]。
実施の一形態において、本発明の触媒として活性な修飾BoNT/Aは少なくとも10の安全率を有する。実施の一形態において、本発明の修飾BoNT/Aまたはその断片は少なくとも15の安全率を有する。
配列番号61に対して少なくとも70%の配列同一性を含むポリペプチドは参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第2015/004,461 A1号に記載されている。
実施の一形態において、配列番号42、61、または、65に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、かつ/または、配列番号41または60に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含むポリペプチドは、位置930、955、991、1026、1052,1229,および、886の1つまたは複数(好ましくは、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、または、6個以上、より好ましくは、全て)に置換を含む。位置の番号付けは配列番号62の位置に対応し、配列番号62(未修飾/野生型BoNT/A)にポリペプチド配列を整列させることにより決定可能である。配列番号62の位置1におけるメチオニン残基の存在が任意であるため、当業者はアミノ酸残基の番号付けを決定する際にメチオニン残基の存在/不在を考慮されよう。例えば、配列番号62がメチオニンを含む場合、位置の番号付けは上記に定義したとおりとなる(例えば、位置886は配列番号62のASN885となる)。代案として、配列番号62にメチオニンが不在の場合、アミノ酸残基の番号付けは-1によって修正されたい(例えば、位置886はは配列番号62のASN885となる)。本明細書に記載の他のポリペプチド配列の位置1におけるメチオニンが存在/不在の際にも同様の考慮が適用され、当業者は当技術分野では定例の技術を使用して正しいアミノ酸残基の番号付けを直ちに決定されよう。
好ましくは、配列番号42、61、または、65に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、かつ/または、配列番号41または60に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含むポリペプチドは、位置930、955、991、1026、1052,1229,および、886の1つまたは複数にリジンまたはアルギニン(より好ましくは、リジン)を含む。実施の一形態において、ポリペプチドは位置930、955、991、1026、1052,1229,および、886の少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、または、すべてにリジンまたはアルギニン(より好ましくは、リジン)を含む。最も好ましくは、ポリペプチドは位置930、955、991、1026、1052,1229,および、886のすべてにリジンまたはアルギニン(より好ましくは、リジン)を含む。
本発明のポリペプチドはニューロン成長および/またはニューロン修復を促進する。したがって、前記ポリペプチドは神経障害の治療において有用性を見出す。本明細書で使用の用語「神経障害」は患者のニューロンの成長および/または修復を促進することによって治療可能な障害である。
したがって、一態様において、本発明はニューロン成長および/またはニューロン修復を促進するための方法を提供し、この方法はポリペプチドの患者への投与を含み、ポリペプチドはクロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片を含む。他の態様において、本発明はニューロン成長および/またはニューロン修復を促進するための方法を提供し、この方法はポリペプチドの患者への投与を含み、ポリペプチドは触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含む。他の態様において、ニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法が提供され、この方法は、患者へのポリペプチドの投与を含み、ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、かつ/または、ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む。他の態様において、ニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法が提供され、方法は患者へのポリペプチドの投与を含み、ポリペプチドは配列番号63に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
用語「ニューロン成長および/またはニューロン修復を促進する」とは、本発明のポリペプチドが、例えば、ニューロン成長および/またはニューロン修復が起こらかった場合に、ニューロン成長および/またはニューロン修復を開始させることを意味し得る。実施の他の形態において、用語「ニューロン成長および/またはニューロン修復を促進する」とは、本発明のポリペプチドがニューロン成長および/またはニューロン修復の速度を増加させることを意味し得る。前記増加は、本発明のポリペプチドの不在におけるニューロン成長および/またはニューロン修復の速度と比較した際の増加であってよい。実施の一形態において、ニューロン成長および/またはニューロン修復は損傷を受けた神経回路の再建を可能にし、それによって、ニューロンのネットワークまたは集団における活動および/またはニューロン伝達を回復する。したがって、本明細書で使用の用語「ニューロン修復」は特定のニューロンの修復ならびに神経回路の修復も包含し得る。
用語「ニューロン成長および/またはニューロン修復」は神経可塑性も同じく包含し得る。したがって、実施の一形態において、本発明のポリペプチドは神経可塑性を促進する。本明細書で使用の用語「神経可塑性」は軸索発芽、樹状突起発芽、神経新生(例えば、新しいニューロンの生成)、成熟、分化、および/または、(例えば、シナプスの強さ、活動、構造、および/または、接続への変化を含めた)シナプス可塑性を包含する。実施の一形態において、本発明のポリペプチドは(例えば、損傷部位における、または、これの近くの)機能性シナプスの確立を促進する。
ニューロンの成長および/または修復は、本発明のポリペプチドの不在または代替ポリペプチドの存在下におけるニューロンの成長および/または修復と比較した際、本発明のポリペプチドの存在下において少なくとも10%、20%、30%、40、50%、60%、または、70%(好ましくは、少なくとも80%)増加され得る。実施のいくつかの形態において、ニューロンの成長および/または修復は、本発明のポリペプチドの不在または代替ポリペプチドの存在下におけるニューロンの成長および/または修復と比較した際、本発明のポリペプチドの存在下において少なくとも100%、150%、または、200%増加され得る。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドはニューロン成長を促進する。本明細書で使用の用語「ニューロン成長」は軸索および/または樹状突起の成長を含めてニューロンのいかなる部分の成長をも包含する。本発明のポリペプチドは神経突起の長さ、神経突起の数(例えば、細胞当たりの神経突起の数)を増加させ得る、かつ/または、ニューロンの細胞体または細胞膜からの突起の長さおよび/または数を増加させ得る。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ニューロン、例えば、患者のニューロンの軸索成長を促進する。言い換えると、好ましくは、本発明のポリペプチドは軸索成長、例えば、軸索発芽を増加させ得る。前記軸索成長はニューロン間の接続および/または化学的伝達を促進し得る。
本発明のポリペプチドによって治療される神経障害は、ニューロン損傷、神経変性障害、感覚障害、または、自律神経障害であってよい。
神経障害はニューロン損傷であってよい。実施の一形態において、ニューロン損傷は神経外傷、ニューロパチー(例えば、末梢神経ニューロパチー)、脊髄損傷、神経切断、脳損傷(例えば、外傷性脳損傷)、非外傷性損傷(例えば、脳卒中もしくは脊髄梗塞)、または、腕神経叢への損傷、例えば、エルブ麻痺もしくはクルンプケ麻痺であってよい。
実施の一形態において、神経外傷は傷および/または骨折に起因するものでよい。神経外傷のこのような例では、神経末端が損傷を受ける。本発明のポリペプチドは、好都合なことに、前記神経末端または遠位神経末端の修復を可能にし、神経外傷の治療を許容する。
ニューロン損傷は精髄損傷(例えば、圧迫、締め付け、および/または、伸張によるもの)によって引き起こされる麻痺などの麻痺であってよい。実施の一形態において、脊髄損傷は対麻痺または四肢麻痺である。
神経障害は感覚障害であってよい。実施の一形態において、感覚障害は感覚ニューロパチー、感覚運動多発性ニューロパチー、糖尿病性ニューロパチー、痛み、ブラウン・セカール症候群、シャルコー・マリー・ツース病、または、デビック症候群である。好ましくは、本明細書に記載の感覚障害は痛みではない。言い換えると、好ましくは、本明細書に記載の神経障害は痛みではない。
神経障害は自律神経障害であってよい。実施の一形態において、自律神経障害は自律神経ニューロパチー、多系統萎縮症、急性突発性多発性ニューロパチー、自律神経不全、家族性自律神経不全、糖尿病性自律神経機能停止、純粋自律神経不全症、体温調節不全、多汗症、神経調節性失神(血管迷走神経性、咳、嚥下、および、他の状況型)、勃起障害、起立性高血圧症、起立性頻脈症候群(PoTS)、または、ギラン・バレー症候群である。
神経障害は神経変性障害であってよい。実施の一形態において、神経変性障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病関連障害、運動ニューロン疾患、末梢神経ニューロパチー、運動神経ニューロパチー、プリオン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、単肢筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、ハレルフォルデン・スパッツ病、または、前頭側頭葉変異症である。好ましくは、神経変性障害はパーキンソン病または運動ニューロン疾患である。有利に、本発明のポリペプチドは、(例えば、ニューロン可塑性も含めて)ニューロン成長および/またはニューロン修復を促進する能力の恩恵により、かつ、さらに、損傷を受けたニューロン回路を再建する能力の恩恵により、神経変性障害の治療において有用性を見出し、これによって、ニューロンのネットワークまたは集団内の活動および/またはニューロン伝達を回復するものと考えられている。
本発明のポリペプチドは、そのニューロン成長および/またはニューロン修復を促進する能力の観点において、神経栄養性ポリペプチドであると考えてよい。本明細書に記載のニューロンは、(自律神経ニューロンを含めた)運動ニューロン、感覚ニューロン、脊髄介在ニューロン、および、脳介在ニューロンから選択される1つまたは複数であってよい。したがって、実施の一形態において、本発明のポリペプチドは運動ニューロン、感覚ニューロン、および/または、介在ニューロンの成長および/または修復を促進する。好ましくは、本発明のポリペプチドは運動ニューロンの成長および/または修復を促進する。
本明細書で使用の「患者」はヒトまたは他の哺乳類などの哺乳類であってよい。好ましくは、「患者」とはヒトの患者を意味する。
本明細書で使用の用語「障害」は「疾患」も包含する。実施の一形態において、障害は疾患である。
本明細書で使用の用語「治療する」または「治療」は(例えば、障害の発症を防止するための)予防的治療ならびに矯正治療(既に障害を被っている患者の治療)を包含する。好ましくは、本明細書で使用の「治療する」または「治療」とは矯正治療を意味する。
本明細書で使用の用語「治療する」または「治療」は障害および/またはその症状を指向する。
したがって、本発明のポリペプチドは、治療上効果的な量または予防上効果的な量で患者に投与されてよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは治療上効果的な量で患者に投与される。
「治療上効果的な量」は、前記障害(または、その症状)の治療のために単独で、または、組み合わせで患者に投与された際に、障害またはその症状の治療を有効とするために十分であるポリペプチドのいれかの量である。
「予防上効果的な量」は、単独で、または、組み合わせで患者に投与された際に、障害(または、その症状)の発症または再発を抑止または遅らせるポリペプチドのいれかの量である。実施のいくつかの形態において、予防上効果的な量は障害の発症または再発を完全に防止する。発症を「抑止する」とは、障害の発症(またはその症状)の可能性の低下、または、発症の完全な防止の何れかを意味する。
本発明のポリペプチドは、例えば医薬組成物の一部として、患者への投与の何れか適した方法で処方されてよい。したがって、一態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、ならびに、薬学上許容可能な担体、付形剤、補助剤、推進剤、および/または、塩類を含む医薬組成物を提供する。実施のいくつかの形態において、本発明のポリペプチドは一本鎖型であってよい一方、実施の他の形態において、例えば二本鎖がジスルフィド架橋によって連結されている場合、ポリペプチドは二本鎖型であってよい。好ましくは、ポリペプチドは二本鎖型である。
本発明のポリペプチドは、経口、非経口、持続注入、吸入、または、局所塗布のために処方してよい。注入に適した組成物は溶液、懸濁液、もしくは、乳液、または、使用前に適した伸展剤中に溶解または懸濁させる乾燥粉の形態であってよい。
局部的に送達されるポリペプチドの場合、ポリペプチドは(例えば、局所使用のための)クリームとして、または、皮下注入のために処方されてよい。
局所への送達の手段は、エアロゾルまたは他のスプレー(例えば、噴霧器)を含んでよい。この点で、ポリペプチドのエアロゾル処方は、肺ならびに/または他の鼻および/もしくは気管支あるいは気道の通路への送達を可能にする。
本発明のポリペプチドは、罹患器官の神経支配に関与する脊髄分節の水準で脊柱内への髄腔内または硬膜外注入によって患者に投与されてよい。
投与経路は腹腔鏡または局所での注入を介してよい。実施の一形態において、本発明のポリペプチドは、損傷部位に、または、その近くに、好ましくは損傷部位に投与される。例えば、損傷が脊髄損傷である場合、ポリペプチドは髄腔内または脊髄内(好ましくは髄腔内)に投与されてよい。実施の一形態において、本発明のポリペプチドの投与経路は末梢、神経内、脊髄内、および/または、髄腔内であってよい。
本発明のポリペプチドの投与のための投薬量範囲は、所望の治療および/または予防の効果を生み出すための範囲である。必要な投薬量範囲はクロストリジウム神経毒または組成物の詳細な性質、処方の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度、または、重症度、もしあれば禁忌、および、主治医の判断に依存することを理解されよう。多様な投薬量水準は最適化のための標準的な経験的定例手順を使用して調整可能である。
実施の一形態において、ポリペプチドの投薬量は一律投与量である。一律投与量は50pgから250μg、好ましくは100pgから100μgの範囲であってよい。実施の一形態において、一律投与量は少なくとも50pg、100pg、500pg、1ng、50ng、100ng、500ng、1μg、または50μgであってよい。前記投薬量は単一の一律投与量であってよい。
流体投薬形態は、ポリペプチド、および、発熱物質のない無菌の伸展剤を利用して典型的に調整される。クロストリジウム神経毒は、使用する伸展剤および濃度に依存して、伸展剤中に溶解または懸濁の何れかを行うことができる。溶液の調整において、ポリペプチドは伸展剤中に溶解可能であり、溶液は、必要であれば塩化ナトリウムの添加によって等浸透圧とされ、適した無菌の小瓶またはアンプルに満たされて封止される前に無菌法を使用した無菌フィルタを介した濾過によって無菌化される。代案として、溶液の安定性が適切であれば、封止容器内の溶液は加圧滅菌器による処理によって無菌化されてよい。有利に、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤もしくは殺菌剤、懸濁化剤もしくは乳化剤、および、または、局部麻酔薬などの添加物も伸展剤中に溶解されてよい。
使用前に適した伸展剤中に溶解または懸濁された乾燥粉は、無菌領域内で無菌法を使用して無菌容器内に事前無菌化された含有物を満たすことによって調整されてよい。代案として、含有物は無菌領域内で無菌法を使用して適した容器内に溶解されてよい。続いて、製品はフリーズドライ化され、容器は無菌で封止される。
本明細書に記載の投与経路に適した非経口懸濁液は、無菌成分が溶解される代わりに無菌の伸展剤中に懸濁され、無菌化が濾過によっては達成不可能であることを除き、実質的に同じ方法で調整される。成分は無菌状態に隔離されてよく、または、代案として、例えばガンマ線照射によって、隔離後に無菌化されてもよい。
有利に、懸濁化剤、例えばポリビニルピロリドンは、成分の均一な分布を促進するために成分に含まれる。
本発明による投与は、微小粒子、カプセル化、または、高圧エアロゾル入射を含めた様々な送達技術を活用してよい。
本発明のポリペプチドはクロストリジウム神経毒またはその断片、好ましくは、その断片であってよい。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、または、60の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されてよい。実施の一形態において、本発明のポリペプチドは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、または、60の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されてよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、または、60の何れか1つを含むヌクレオチド配列によって符号化されてよい。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドは配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでよい。実施の一形態において、本発明のポリペプチドは配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つのポリペプチド配列を含んでよい。
実施の一形態において、本発明は、クロストリジウム神経毒L鎖およびクロストリジウム神経毒H鎖を含み、前記クロストリジウム神経毒L鎖が触媒として不活性であるという条件付きの全長クロストリジウム神経毒を包含する。
用語「クロストリジウム神経毒」はC. botulinum(ボツリヌス菌神経毒血清型A、B、C1、D、E、F、G、および、X)、C. tetani(破傷風神経毒)、C. butyricum(ボツリヌス菌神経毒血清型E)、ならびに、C. baratii(ボツリヌス菌神経毒血清型F)、さらに、修飾クロストリジウム神経毒、または、前述の何れかから誘導された誘導体を包含する。
ボツリヌス菌神経毒(BoNT)は巨大タンパク質複合体の形でC. botulinumによって産生され、多くの付属タンパク質に複合化されたBoNT自体からなる。現在、8種の異なった分類のボツリヌス菌神経毒、すなわち、ボツリヌス菌神経毒血清型A、B、C1、D、E、F、G、およびXがあり、これらのすべてが同様の構造および作用形態を共有している。異なったBoNT血清型は、アミノ酸レベルにおける百分率配列同一性と相関する血清型によるそのような分類のある特定の中和抗血清による不活性化に基づいて識別可能である。特定の血清型のBoNTタンパク質はアミノ酸百分率配列同一性に基づく異なった亜型にさらに分割されている。
各BoNTは消化管内で吸収され、全身循環に進入後、コリン作用性神経末端のシナプス前膜に結合し、神経伝達物質アセチルコリンの放出を阻害する。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、および、BoNT/Gはシナプトブレビン/小嚢関連膜タンパク質(VAMP)を開裂し、BoNT/C1、BoNT/A、および、BoNT/Eは25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAPー25)を開裂し、さらに、BoNT/C1はシンタキシンを開裂する。BoNT/XはSNAPー25、VANP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、Ykt6、および、シンタキシン1を開裂すると見出されている。
破傷風毒素はC. tetaniによって単一の血清型で産生され、C. butyricumはBoNT/Eを産生する一方、C. baratiiはBoNT/Fを産生する。
用語「クロストリジウム神経毒」は、以下に記載のものを限定せずに含めて修飾クロストリジウム神経毒およびその誘導体も包含することが意図されている。修飾クロストリジウム神経毒または誘導体は、クロストリジウム神経毒の天然(未修飾)型と比較して修飾されている1つまたは複数のアミノ酸を含んでよく、または、クロストリジウム神経毒の天然(未修飾)型には存在しない1つまたは複数の挿入アミノ酸を含んでよい。例として、修飾クロストリジウム神経毒は天然(未修飾)クロストリジウム神経毒の配列と比べて1つまたは複数のドメインに修飾アミノ酸配列を有してよい。この修飾は毒素の機能面、例えば、生物学的な活性または持続性を修飾し得る。したがって、実施の一形態において、本発明のクロストリジウム神経毒は修飾クロストリジウム神経毒、または、修飾クロストリジウム神経毒誘導体、もしくは、クロストリジウム神経毒誘導体である。
修飾クロストリジウム神経毒は(修飾HCドメインなどの)重鎖のアミノ酸配列における1つまたは複数の修飾を有してよく、前記修飾重鎖は天然(未修飾)クロストリジウム神経毒より高い、または、低い親和力で標的神経細胞に結合する。HCドメインでのこの修飾はHCドメインのガングリオシド結合部位における、または、ガングリオシド受容体への結合を変えるタンパク質(SV2もしくはシナプトタグミン)結合部位および/もしくは標的神経細胞のタンパク質受容体における残基の修飾を含むことができる。このような修飾クロストリジウム神経毒の例は、ともにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2006/027,207号および国際公開第2006/114,308号に記載されている。
修飾クロストリジウム神経毒は軽鎖のアミノ酸配列内に1つまたは複数の修復、例えば、修飾L鎖のSNAREタンパク質特異性を変更または修飾可能な基質結合または触媒ドメインにおける修飾を有してよい。このような修飾クロストリジウム神経毒の例は、ともにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2010/120766号および米国特許出願第2011/0,318,385号に記載されている。
修飾クロストリジウム神経毒はこの修飾クロストリジウム神経毒の生物学的活性および/または生物学的持続性を増加または減少させる1つまたは複数の修飾を含んでよい。例えば、修飾クロストリジウム神経毒はロイシン系またはチロシン系のモチーフを含んでよく、前記モチーフはこの修飾クロストリジウム神経毒の生物学的活性および/または生物学的持続性を増加または減少させる。適したロイシン系モチーフは、xDxxxLL、xExxxIL、および、xExxxLMを含む(xは何れかのアミノ酸である)。適したチロシン系モチーフはY-x-x-Hyを含む(Hyは疎水性アミノ酸である)。ロイシン系およびチロシン系のモチーフを含む修飾クロストリジウム神経毒の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2002/08268号に記載されている。
上記のとおり、修飾クロストリジウム神経毒(またはクロストリジウム神経毒断片)は、前記1つまたは複数の修飾のない同等の未修飾クロストリジウム神経毒と比較して、このクロストリジウム神経毒の等電点を増加させる1つまたは複数の修飾を含むものであってよい。適した修飾クロストリジウム神経毒は上記に、および、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/004461 A1号および国際公開第2016/110662A1号に記載されている。例示的配列は本明細書に記載の配列番号61および42を含む。
用語「クロストリジウム神経毒」はハイブリッドおよびキメラのクロストリジウム神経毒を包含することが意図されている。ハイブリッドクロストリジウム神経毒は1つのクロストリジウム神経毒またはその亜型からの軽鎖の少なくとも一部、および、別のクロストリジウム神経毒またはクロストリジウム神経毒亜型からの重鎖の少なくとも一部を含む。実施の一形態において、ハイブリッドクロストリジウム神経毒は1つのクロストリジウム神経毒亜型からの軽鎖の軽鎖全体および別のクロストリジウム神経毒亜型からの重鎖を含んでよい。実施の他の形態において、キメラクロストリジウム神経毒は1つのクロストリジウム神経毒亜型の重鎖の一部(例えば、結合ドメイン)を、別のクロストリジウム神経毒亜型からの重鎖の別の一部とともに含んでよい。同様に、または、代案として、治療要素は異なった各クロストリジウム神経毒からの軽鎖部分を含んでよい。このハイブリッドまたはキメラのクロストリジウム神経毒は、例えば、特定のクロストリジウム神経毒亜型に免疫抵抗を持つ患者、特定のクロストリジウム神経毒重鎖結合ドメインへの平均濃度より低い濃度の受容体を有する可能性のある患者、または、膜または小嚢毒素基質(例えば、SNAP-25、VAMP、および、シンタキシン)の抗タンパク質分解酵素変異体を有する可能性のある患者にこのクロストリジウム神経毒の治療上の恩恵を届ける手段として有用である。ハイブリッドおよびキメラのクロストリジウム神経毒は、その公報の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,071,110号に記載されている。したがって、実施の一形態において、本発明のクロストリジウム神経毒(または、その断片)はハイブリッドクロストリジウム神経毒またはキメラクロストリジウム神経毒である。
実施の特に好ましい形態において、本発明のポリペプチドは、BoNT/A軽鎖およびトランスロケーションドメイン、ならびに、BoNT/B受容体結合ドメイン(HCドメイン)またはその一部)を含む(好ましくは、からなる)キメラクロストリジウム神経毒であってよい。適したキメラおよび/またはハイブリッドのクロストリジウム神経毒は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/191315号に教示されているものであってよい。この好ましい配列は配列番号44、63、および、64を含む。
BoNT/A LHNドメインはBoNT/B HCドメインに共有結合で連結されている。前記キメラBoNT/Aは本明細書において「BoNT/AB」または「BoNT/ABキメラ」とも呼ばれる。
LHNドメインのC末端アミノ酸残基はBoNT/AのLHNドメインとHCドメインを分断する310らせんの第1アミノ酸残基に対応してよく、HCドメインのN末端アミノ酸残基はBoNT/BのLHNドメインとHCドメインを分断する310らせんの第2アミノ酸残基に対応してよい。
本明細書における「BoNT/AのLHNドメインとHCドメインを分断する310らせんの第1アミノ酸残基」への言及は、LHNドメインとHCドメインを分断する310らせんのN末端残基を意味する。
本明細書における「BoNT/BのLHNドメインとHCドメインを分断する310らせんの第2アミノ酸残基」への言及は、LHNドメインとHCドメインを分断する310らせんのN末端残基に続くアミノ酸残基を意味する。
「310らせん」は、αらせん、βシート、および、逆巻きを伴ってタンパク質およびポリペプチドに見出される一種の二次構造である。310らせん内のアミノ酸は右手らせん構造に配置され、ここでは1巻きの全体がその間の分子内水素結合を分断する3個の残基および10個の原子によって完成されている。各アミノ酸はらせん内の120度の巻き(すなわち、らせんは1巻き当たり3個の残基を有する)、および、らせんの軸に沿った2.0Å(=0.2nm)の翻訳に対応し、水素結合することによって形成される環に10個の原子を有する。最重要として、アミノ酸のN-H基はアミノ酸の3個の残基のC=O基とより早期に水素結合を形成し、この反復されるi+3→i水素結合は310らせんを定義する。310らせんは当業者がよく知る構造生物学における標準概念である。
この310らせんは、実際のらせん、および、これらの4個の残基の各端部に1個ずつある2個のキャップ(または、移行)残基を形成する4個の残基に対応する。本明細書で使用の用語「LHNドメインとHCドメインを分断する310らせん」はそれらの6個の残基からなる。
構造解析および配列整列の実行を介して、LHNドメインとHCドメインを分断する310らせんが同定された。この310らせんは、そのN末端における(すなわち、LHNドメインのC末端部分における)αらせん、および、そのC末端における(すなわち、HCドメインのN末端分における)βストランドによって囲まれている。310らせんの第1(N末端)残基(キャップまたは移行残基)は、このαらせんのC末端残基にも対応する。
LHNドメインとHCドメインを分断する310らせんは、例えば、ボツリヌス菌神経毒の公表されている入手可能な結晶構造、例えば、それぞれボツリヌス菌神経毒A1およびB1に対する3BTA(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA)および1EPW(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW)から決定可能である。
公表されて入手可能なコンピュータによるモデリングおよび整列の手段、例えば、相同性モデリングサーバーのLOOPP(Learning,, Observing, and Outputting Protein Patterns「タンパク質パターンの学習、観察、および、出力」、http://loopp.org)、PHYRE(Protein Homology/analogY Recognition Engine(「タンパク質相同/類似認識エンジン」)、 http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)、および、Rosetta(「ロゼッタ」)(https://www.rosettacommons.org/)、タンパク質重ね合わせサーバーのSuperPose(「スーパーローズ」)(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)、整列プログラムのClustal Omega(「クラスタルオメガ」)(http://www.clustal.org/omega/)、ならびに、Internet Resources for Molecular and Cell Biologists(「分子および細胞生物学者のためのインターネットリソース」)(http://molbiol-tools.ca/)に列挙されている他の多くの手段/サービスなども、他の神経毒においてLHNドメインとHCドメインを分断する310らせんの所在を決定するために使用可能である。特に、「HN/HCN」接合の周辺領域は構造的に高度に保存され、異なった血清型を重ね合わせるための理想的な領域をこれに与えている。
例えば以下の方法が、他の神経毒における310らせんの配列を決定するために使用可能である:
1.構造的相同性モデリング手段LOOP(http://loopp.org)は、BoNT/A1結晶構造(3BTA.pdb)に基づく他のBoNT血清型の予測された構造を得るために使用した;
2.このように得られた構造(pdb)ファイルは、HCNドメインのN末端端部および(HNドメインの一部である)その前の約80個の残基のみを含むように編集され、これによって、構造的に高緯度に保存されている「HN/HCN」領域を保持した;
3.タンパク質重ね合わせサーバーのSuperPose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)は、各血清型を3BTA.pdb構造に重ね合わせるために使用した;
4.重ね合わされたpdbファイルは、BoNT/A1のHCドメインの開始部における310らせんの所在を見出すために検査され、続いて、他の血清型の対応する残基を同定した;
5.他のBoNT血清型配列は、対応する残基が正しいことを確認するためにClustal Omega(「クラスタルオメガ」)と整列させた。
この方法によって決定されたLHN、HC,および、310らせんの各ドメインの例を以下に示す。
Figure 2022550769000003
構造解析および配列整列を使用して、LHNドメインとHCドメインを分断する310らせんに続くβストランドがすべてのボツリヌス菌および破傷風神経毒における保存された構造であり、LHNドメインとHCドメインを分断する310らせんの第1残基から開始した際に第8番目の残基(例えば、BoNT/A1に対する残基879)において開始することが見出された。
BoNT/ABキメラはBoNT/BからHCドメインに共有結合で連結するBoNT/AからのLHNドメインを含んでよく、
・LHNドメインのC末端アミノ酸残基はBoNT/AのHCドメインの開始端(N末端)に所在するβストランドにN末端で続く第8番目のアミノ酸残基に対応する、かつ
・HCドメインのN末端アミノ酸残基はBoNT/BのHCドメインの開始端(N末端)に所在するβストランドにN末端で続く第7番目のアミノ酸残基に対応する。
BoNT/ABキメラはBoNT/BからHCドメインに共有結合で連結するBoNT/AからのLHNドメインを含んでよく、
・LHNドメインのC末端アミノ酸残基はBoNT/AのLHNドメインの終端(C末端)に所在するαらせんのC末端アミノ酸残基に対応する、かつ
・HCドメインのN末端アミノ酸残基はBoNT/BのLHNドメインの終端(C末端)に所在するαらせんのC末端アミノ酸残基へのC末端に接するアミノ酸残基に対応する。
BoNT/ABキメラの設計過程の論理的根拠は、二次構造が明らかでなく、これによって、三次構造および各ドメインの機能へのいかなる変更も最小に抑えることを確保しようとすることであった。理論にかかわらず、BoNT/ABキメラの310らせんの4個の中央アミノ酸残基を破壊しないことによって、キメラ神経毒のための最適な立体配座を確保し、これによって、キメラ神経毒がその最大能力まで機能を発揮することを可能にすることが仮定されている。
BoNT/AからのLHNドメインは配列番号62のアミノ酸残基1から872またはこれに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列に対応してよい。BoNT/AからのLHNドメインは配列番号62のアミノ酸残基1から872またはこれに対して少なくとも80%、90%、または、95%の配列同一性を有するポリペプチド配列に対応してよい。好ましくは、BoNT/AからのLHNドメインは配列番号62のアミノ酸残基1から872に対応する。
BoNT/BからのHCドメインは配列番号52のアミノ酸残基860から1291またはこれに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列に対応してよい。BoNT/BからのHCドメインは配列番号52のアミノ酸残基860から1291またはこれに対して少なくとも80%、90%、または、95%の配列同一性を有するポリペプチド配列に対応してよい。好ましくは、BoNT/BからのHCドメインは配列番号52のアミノ酸残基860から1291に対応する。
好ましくは、BoNT/ABキメラはBoNT/A LHNドメインおよびBoNT/B HCドメインを含む。より好ましくは、LHNドメインはBoNT/A(配列番号62)のアミノ酸残基1から872に対応し、HCドメインはBoNT/B(配列番号52)のアミノ酸残基860から1291に対応する。
好ましくは、BoNT/B HCドメインは天然BoNT/B配列と比較してヒトSyt IIに対するBoNT/B神経毒の結合親和性を増大する効果を有するHCCサブドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸残基置換、付加、または、欠失をさらに含む。BoNT/B HCCサブドメインにおける適したアミノ酸残基置換、付加、または、欠失は(ともに参照により本明細書に組み込まれる)国際公開第2013/180799号および国際公開第2016/154534号に開示されている。
BoNT/B HCCサブドメインにおける適したアミノ酸残基置換、付加、または、欠失は、V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、および、これらの組み合わせからなる群から選択された置換変異を含む。
BoNT/B HCCサブドメインにおける適したアミノ酸残基置換、付加、または、欠失は、E1191MとS1199L、E1191MとS1199Y、E1191MとS1199F、E1191QとS1199L、E1191QとS1199Y、E1191QとS1199F、E1191MとS1199W、E1191MとW1178Q、E1191CとS1199W、E1191CとS1199Y、E1191CとW178Q、E1191QとS1199W、E1191VとS1199W、E1191VとS1199Y、または、E1191VとW1178Qからなる群から選択された2個の置換変異の組をさらに含む。
BoNT/B HCCサブドメインにおける適したアミノ酸残基置換、付加、または、欠失は、E1191M、S1199W、および、W1178Qである3個の置換変異の組も含む。
好ましくは、BoNT/B HCCサブドメインにおける適したアミノ酸残基置換、付加、または、欠失はE1191MとS1199Yである2個の置換変異の組を含む。
修飾は配列番号52として示される未修飾BoNT/Bと比較した際の修飾であってよく、アミノ酸残基の番号付けは配列番号52との整列によって決定される。配列番号52の位置1のメチオニン残基の存在が任意であるため、当業者はアミノ酸残基の番号付けを決定する際にメチオニン残基の存在/不在を考慮されよう。例えば、配列番号52がメチオニンを含む場合、位置の番号付けは上記に定義したとおりとなる(例えば、E1191は配列番号52のE1191となる)。代案として、メチオニンが配列番号52に不在の場合、アミノ酸残基の番号付けは-1によって修飾されたい(例えば、E1191は配列番号52のE1190となる)。同様の考慮は本明細書に記載の他のポリペプチド配列の位置1のメチオニンが存在/不在である際にも適用され、当業者は当技術分野では定例の技術を使用して正しいアミノ酸残基番号を直ちに決定されよう。
したがって、一態様において、本発明は患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドを提供し、ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
関連態様において、患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復の促進のための方法が提供され、この方法は患者へのポリペプチドの投与を含み、ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
さらなる関連態様において、患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復の促進のための薬剤の製造でのポリペプチドの使用が提供され、ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一態様において、本発明は患者の神経障害の治療での使用のためのポリペプチドを提供し、ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
関連態様において、患者の神経障害を治療するための方法が提供され、この方法は患者へのポリペプチドの投与を含み、ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
さらなる関連態様において、患者の神経障害を治療するための薬剤の製造でのポリペプチドの使用が提供され、ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
実施の一形態において、本発明による使用のためのポリペプチドは、配列番号63または64に対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明による使用のためのポリペプチドは配列番号63または64に示されているポリペプチド配列を含む(より好ましくは、からなる)。
好ましくは、配列番号63に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列は配列番号64などの触媒として不活性なL鎖を含む。
本発明での使用のためのキメラおよび/またはハイブリッドのクロストリジウム神経毒はBoNT/Aポリペプチドの一部およびBoNT/Bポリペプチドの一部を含んでよく、その例は配列番号44として本明細書に記載のポリペプチドを含む。
適したキメラクロストリジウム神経毒はBoNT/FAを含んでよい。確かに、実施の特に好ましい形態において、本発明のポリペプチドはBoNT/FAまたはその断片を含んでよい。BoNT/FAの触媒として不活性な形態は配列番号26および34として本明細書に記載されている。BoNT/FAの適した断片も配列番号28、30、および、32として本明細書に記載されている。
用語「クロストリジウム神経毒」はBoNT/Xに最も近い配列同一性を有するエンテロコッカス属符号化毒、W89～W90におけるVAMP2を開裂するBoNT/Wo(NCBI Ref.Seq:WP_027699549.1)と呼ばれるWeisselia oryzae符号化毒、VAMP2およびSNAP25を開裂するEnterococcus faecium符号化毒(GenBank:OTO22244.1)、および、Chryseobacterium pipero符号化毒(NCBI Ref.Seq:WP_034687872.1)などの非クロストリジウム性微生物によって発現される新しく発見されたボツリヌス菌神経毒タンパク質ファミリーの構成要素も包含してよい。
本発明のポリペプチドはクロストリジウム神経毒の機能性HCドメインを欠いてもよく、同様に、機能的に同等な外因性リガンド標的指向部分(TM)を欠いてもよい。
したがって、実施の特に好ましい形態において、本発明のクロストリジウム神経毒は再標的化クロストリジウム神経毒ではない。再標的化クロストリジウム神経毒において、クロストリジウム神経毒は標的指向部分(TM)として知られている外因性リガンドを含むように修飾されている。TMは所望の標的細胞に対する結合特異性を提供するように選択され、再標的化過程の一部として、クロストリジウム神経毒の固有の結合部分(例えば、HCドメインまたはHCCドメイン)は除去されてよい。再標的化技術は、例えば、すべての全体が参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第0689459号、国際公開第1994/021300号、欧州特許第0939818号、米国特許第 6,461,617号、米国特許第7,192,596号、国際公開第1998/007864号、欧州特許第0826051号、米国特許第5,989,545号、米国特許第6,395,513号、米国特許第6,962,703号、国際公開第1996/033273号、欧州特許第0996468号、米国特許第7,052,702号、国際公開第1999/017806号、欧州特許第1107794号、米国特許第6,632,440号、国際公開第2000/010598号、国際公開第2001/21213号、国際公開第2006/059093号、国際公開第2000/62814号、国際公開第2000/04926号、国際公開第1993/15766、国際公開第2000/61192号、および、国際公開第1999/58571号に記載されている。
上記に検討したように、(全長)クロストリジウム神経毒は2本のポリペプチド鎖、約100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)および約50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖)から形成されている。H鎖はC末端標的指向性成分(受容体結合ドメインまたはHCドメイン)およびN末端翻訳成分(HNドメイン)を含む。
クロストリジウム神経毒はBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、および、TeNT(破傷風神経毒)から選択されてよい。好ましくは、クロストリジウム神経毒はBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、および、BoNT/Xから選択されるボツリヌス菌神経毒などのボツリヌス菌神経毒である。
実施の一形態において、クロストリジウム神経毒はBoNT/Aであってよい。参照BoNT/A配列は配列番号51として示されている。実施の他の形態において、クロストリジウム神経毒はBoNT/Bであってよい。参照BoNT/B配列は配列番号52として示されている。実施の他の形態において、クロストリジウム神経毒はBoNT/Cであってよい。参照BoNT/C配列は配列番号53として示されている。実施の他の形態において、クロストリジウム神経毒はBoNT/Dであってよい。参照BoNT/D配列は配列番号54として示されている。実施の他の形態において、クロストリジウム神経毒はBoNT/Eであってよい。参照BoNT/E配列は配列番号55として示されている。実施の他の形態において、クロストリジウム神経毒はBoNT/Fであってよい。参照BoNT/F配列は配列番号56として示されている。実施の他の形態において、クロストリジウム神経毒はBoNT/Gであってよい。参照BoNT/G配列は配列番号57として示されている。実施の他の形態において、クロストリジウム神経毒はTeNTであってよい。参照TeNT配列は配列番号58として示されている。実施の他の形態において、クロストリジウム神経毒はBoNT/Xであってよい。参照BoNT/X配列は配列番号59として示されている。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドはBoNT/Aの断片またはBoNT/Fの断片を含む。実施の他の形態において、本発明のポリペプチドはBoNT/AまたはBoNT/Fの触媒として不活性なL鎖を含む。
実施の形態において、本明細書に記載のポリペプチドが精製のための標識(例えば、His標識)および/またはリンカーを有する場合、前記標識および/またはリンカーは任意である。
適した全長クロストリジウム神経毒は本明細書に記載されている。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドは配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を、前記ポリペプチドのクロストリジウム神経毒L鎖が触媒として不活性であるという条件付きで含んでよい。実施の一形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を、前記ポリペプチドのクロストリジウム神経毒L鎖が触媒として不活性であるという条件付きで含んでよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つを含むポリペプチド配列を、前記ポリペプチドのクロストリジウム神経毒L鎖が触媒として不活性であるという条件付きで含んでよい。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドのクロストリジウム神経毒L鎖が触媒として不活性であるという条件付きで、配列番号1、9、11、13、15、17、25、33、または、60の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものであってよい。実施の一形態において、本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドのクロストリジウム神経毒L鎖が触媒として不活性であるという条件付きで、配列番号1、9、11、13、15、17、25、33、または、60の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものである。好ましくは、本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドのクロストリジウム神経毒L鎖が触媒として不活性であるという条件付きで、配列番号1、9、11、13、15、17、25、33、または、60の何れか1つを含むヌクレオチド配列によって符号化されたものである。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドのクロストリジウム神経毒L鎖が触媒として不活性であるという条件付きで、配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでよい。実施の一形態において、本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドのクロストリジウム神経毒L鎖が触媒として不活性であるという条件付きで、配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドのクロストリジウム神経毒L鎖が触媒として不活性であるという条件付きで、配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、または、65の何れか1つを含む。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドはBoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F,BoNT/G、BoNT/X、および、TeNTから選択される全長クロストリジウム神経毒である。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドは配列番号52～59、61、または、63に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでよい。実施の一形態において、本発明のポリペプチドは配列番号52～59、61、または、63に対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでよい。実施の一形態において、本発明のポリペプチドは配列番号52～59、61、または、63に対して少なくとも99%、または、99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号52～59、61、または、63の何れか1つを含むポリペプチド配列を含んでよい(より好ましくは、からなる)。
実施の特に好ましい形態において、本発明のポリペプチドは触媒として活性な全長クロストリジウム神経毒ではなく、例えば、触媒として活性な全長BoNT/Aではない。
本発明のポリペプチドはクロストリジウム神経毒の断片、例えば、本明細書に記載の何れの全長クロストリジウム神経毒の断片も含んでよい(または、からなる)。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドは配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列の断片を含んでよい。実施の一形態において、本発明のポリペプチドは配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列の断片を含んでよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つを含むポリペプチド配列の断片を含んでよい。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖またはその断片を含む(または、からなる)。クロストリジウム神経毒L鎖の断片はクロストリジウム神経毒L鎖の≦400個、≦350個、≦300個、≦250個、≦200個、≦150個、≦100個、または、≦50個のアミノ酸残基を有してよい。実施の一形態において、クロストリジウム神経毒L鎖の断片はクロストリジウム神経毒L鎖の少なくとも20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、120個、150個、または、200個のアミノ酸残基を有する。例えば、クロストリジウム神経毒L鎖の断片はクロストリジウム神経毒L鎖の20個～400個、50個～300個、または、100個～200個のアミノ酸残基を有してよい。
L鎖参照配列の例は以下を含む。
ボツリヌス菌タイプA神経毒:アミノ酸残基1～448
ボツリヌス菌タイプB神経毒:アミノ酸残基1～440
ボツリヌス菌タイプC1神経毒:アミノ酸残基1～441
ボツリヌス菌タイプD神経毒:アミノ酸残基1～445
ボツリヌス菌タイプE神経毒:アミノ酸残基1～422
ボツリヌス菌タイプF神経毒:アミノ酸残基1～439
ボツリヌス菌タイプG神経毒:アミノ酸残基1～441
破傷風神経毒:アミノ酸残基1～457
最近同定されたBoNT/Xについては、L鎖がそのアミノ酸残1～439に対応するとして報告されており、L鎖境界は約25個のアミノ酸(例えば、1～414または1～464)だけ潜在的に変化する。
上記に明らかになった参照配列は、下位血清型によって僅かな変化が生じることがあるため、指針と考えられたい。例として、(参照により全体が本明細書に組み込まれる)米国特許出願第2007/0,166,332号は以下の僅かに異なったクロストリジウム配列に言及している:
ボツリヌス菌タイプA神経毒:アミノ酸残基M1～K448
ボツリヌス菌タイプB神経毒:アミノ酸残基M1～K441
ボツリヌス菌タイプC1神経毒:アミノ酸残基M1～K449
ボツリヌス菌タイプD神経毒:アミノ酸残基M1～R445
ボツリヌス菌タイプE神経毒:アミノ酸残基M1～R422
ボツリヌス菌タイプF神経毒:アミノ酸残基M1～K439
ボツリヌス菌タイプG神経毒:アミノ酸残基M1～K446
破傷風神経毒:アミノ酸残基M1～A457
適したクロストリジウム神経毒L鎖は本明細書に記載されている。
クロストリジウム神経毒L鎖は配列番号6、24、32、もしくは、40、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでよい。実施の一形態において、クロストリジウム神経毒L鎖は配列番号6、24、32、もしくは、40、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、クロストリジウム神経毒L鎖は配列番号6、24、32、もしくは、40、または、その断片の何れか1つを含むポリペプチド配列を含む(より好ましくは、からなる)。
クロストリジウム神経毒L鎖は配列番号5、23、31、もしくは、39、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものであってよい。実施の一形態において、クロストリジウム神経毒L鎖は配列番号5、23、31、もしくは、39、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものである。好ましくは、クロストリジウム神経毒L鎖は配列番号5、23、31、もしくは、39、または、その断片の何れか1つを含むヌクレオチド配列によって符号化されたものである。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドはクロストリジウム神経毒H鎖の断片を含む(または、からなる)。クロストリジウム神経毒H鎖の断片はクロストリジウム神経毒H鎖の≦800個、≦700個、≦600個、≦500個、≦400個、≦350個、≦300個、≦250個、≦200個、≦150個、≦100個、または、≦50個のアミノ酸残基を有してよい。実施の一形態において、クロストリジウム神経毒H鎖の断片はクロストリジウム神経毒H鎖の少なくとも20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、120個、150個、または、200個のアミノ酸残基を有する。例えば、クロストリジウム神経毒H鎖の断片はクロストリジウム神経毒H鎖の20個～800個、30個～600個、40個～400個、50個～300個、または、100個～200個のアミノ酸残基を有してよい。
クロストリジウム神経毒H鎖は2つの構造的/機能的ドメイン、トランスロケーションドメイン(HN)および受容体結合ドメイン(HC)を含む。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドはクロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインまたはその断片を含む(または、からなる)。クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインの断片は、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインの≦400個、≦350個、≦300個、≦250個、200個、≦150個、≦100個、または、≦50個のアミノ酸残基を有してよい。実施の一形態において、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインの断片は、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインの少なくとも20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90語、100個、120個、150個、または、200個のアミノ酸残基を有する。例えば、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインの断片は、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインの20個～400個、50個～300個、または、100個～200個のアミノ酸残基を有してよい。
トランスロケーションドメインは、H鎖の半分のアミノ末端にほぼ同等のクロストリジウム神経毒のH鎖の断片、または、未損傷のH鎖におけるその断片に対応するドメインである。実施の一形態において、H鎖のHC機能は(核酸分解酵素またはタンパク質分解酵素の処理によってDNA合成レベルまたは合成後レベルの何れかでの)HCアミノ酸配列の欠失によって除去されてよい。代案として、HC機能は化学的または生物学的処理によって不活性化されてよい。したがって、実施のいくつか形態において、H鎖は天然クロストリジウム神経毒(すなわち、ホロトキシン)が結合する標的細胞上の結合部位への結合が不可能であってよい。
適した(参照)トランスロケーションドメインの例は以下を含む:
ボツリヌス菌タイプA神経毒 - アミノ酸残基(449～871)
ボツリヌス菌タイプB神経毒 - アミノ酸残基(441～858)
ボツリヌス菌タイプC神経毒 - アミノ酸残基(442～866)
ボツリヌス菌タイプD神経毒 - アミノ酸残基(446～862)
ボツリヌス菌タイプE神経毒 - アミノ酸残基(423～845)
ボツリヌス菌タイプF神経毒 - アミノ酸残基(440～864)
ボツリヌス菌タイプG神経毒 - アミノ酸残基(442～863)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基(458～879)
上記に明らかにした参照配列は、下位血清型によって僅かな変化が生じることがあるため、指針と考えられたい。例として、(参照により本明細書に組み込まれる)米国特許出願第2007/0,166,332号は以下の僅かに異なったクロストリジウム配列に言及している:
ボツリヌス菌タイプA神経毒 - アミノ酸残基(A449～K871)
ボツリヌス菌タイプB神経毒 - アミノ酸残基(A442～S858)
ボツリヌス菌タイプC1神経毒 - アミノ酸残基(T450～N866)
ボツリヌス菌タイプD神経毒 - アミノ酸残基(D446～N862)
ボツリヌス菌タイプE神経毒 - アミノ酸残基(K423～K845)
ボツリヌス菌タイプF神経毒 - アミノ酸残基(A440～K864)
ボツリヌス菌タイプG神経毒 - アミノ酸残基(S447～S863)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基(S458～V879)
本発明の流れにおいて、トランスロケーションドメインを含む様々なクロストリジウム神経毒HN領域が本発明の各態様において有用とすることができる。実施の一形態において、これらの活性断片は、細胞内小胞から標的細胞の細胞質内への非細胞毒性タンパク質分解酵素(例えば、クロストリジウムL鎖)の放出を促進することができ、したがって、細胞機構全体の実行に参加でき、これによって、クロストリジウム神経毒は基質をタンパク質分解により開裂する。クロストリジウム神経毒重鎖からのHN領域は長さが約410個～430個のアミノ酸であり、トランスロケーションドメインを含む。調査は、クロストリジウム神経毒重鎖からのHN領域の全体長はトランスロケーションドメインのトランスロケーション活性には必要でないことを示している。したがって、この実施の形態の各態様は、例えば、少なくとも350個のアミノ酸、少なくとも375個のアミノ酸、少なくとも400個のアミノ酸、および、少なくとも425個のアミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム神経毒HN領域を含むことができる。この実施の形態の他の各態様は、例えば、最も多くとも350個のアミノ酸、最も多くとも375個のアミノ酸、最も多くとも400個のアミノ酸、および、最も多くとも425個のアミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム神経毒HN領域を含むことができる。
Clostridium botulinumおよびC. tetani,における毒素産生の遺伝学的基礎のさらなる詳細についてはHenderson他によるThe Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis(「クロストリジウム属嫌気性桿菌:分子生物学と発症」)Academic press, (1997)を参照。
用語HNは、天然に生じる神経毒HN部分、ならびに、天然には生じないアミノ酸配列および/または合成アミノ酸残基を有する修飾HN部分を包含する。実施の一形態において、前記修飾HN部分は上記のトランスロケーション機能を未だに示すものである。
実施の好ましい形態において、本発明のポリペプチドはクロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HC)またはその断片を含む(または、からなる)。クロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HC)の断片は、クロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HC)の≦350個、≦300個、≦250個、≦200個、≦150個、≦100個、または、≦50個のアミノ酸残基を有してよい。実施の一形態において、クロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HC)の断片は少なくとも20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、120個、150個、または、200個のアミノ酸残基を有する。例えば、クロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HC)の断片はクロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HC)の20個～350個、50個～300個、または、100個～200個のアミノ酸残基を有してよい。
クロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HC)の参照配列は以下を含む:
BoNT/A - N872～L1296
BoNT/B - E859～E1291
BoNT/C1 - N867～E1291
BoNT/D - S863～E1276
BoNT/E - R846～K1252
BoNT/F - K865～E1274
BoNT/G - N864～E1297
TeNT-I880～D1315
最近同定されたBoNT/Xについては、HCドメインがそのアミノ酸893～1306に対応し、ドメイン境界は約25個のアミノ酸(例えば、868～1306または918～1306)だけ潜在的に変化すると報告されている。
クロストリジウム神経毒H鎖はトランスロケーション促進ドメインをさらに含んでよい。前記ドメインは標的細胞の細胞質ゾル内へのL鎖の送達を促進し、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる国際公開第08/008,803号および国際公開第08/008,805号に記載されている。
例として、トランスロケーション促進ドメインはクロストリジウム神経毒HCNドメイン、または、その断片もしくはその変異型を含んでよい。より詳細には、クロストリジウム神経毒HCNトランスロケーション促進ドメインは少なくとも200個のアミノ酸、少なくとも225個のアミノ酸、少なくとも250個のアミノ酸、少なくとも275個のアミノ酸の長さを有してよい。この点で、クロストリジウム神経毒HCNトランスロケーション促進ドメインは、好ましくは、最も多くとも200個のアミノ酸、もっと多くとも225個のアミノ酸、最も多くとも250個のアミノ酸、または、最も多くとも275個のアミノ酸の長さを有する。特定の(参照)例は以下を含む:
ボツリヌス菌タイプA神経毒 - アミノ酸残基(872～1110)
ボツリヌス菌タイプB神経毒 - アミノ酸残基(859～1097)
ボツリヌス菌タイプC神経毒 - アミノ酸残基(867～1111)
ボツリヌス菌タイプD神経毒 - アミノ酸残基(863～1098)
ボツリヌス菌タイプE神経毒 - アミノ酸残基(846～1085)
ボツリヌス菌タイプF神経毒 - アミノ酸残基(865～1105)
ボツリヌス菌タイプG神経毒 - アミノ酸残基(864～1105)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基(880～1127)
上記の配列位置は血清型/下位型によって少々変化してよく、適した(参照)クロストリジウム神経毒HCNドメインのさらなる例は以下を含む:
ボツリヌス菌タイプA神経毒 - アミノ酸残基(874～1110)
ボツリヌス菌タイプB神経毒 - アミノ酸残基(861～1097)
ボツリヌス菌タイプC神経毒 - アミノ酸残基(869～1111)
ボツリヌス菌タイプD神経毒 - アミノ酸残基(865～1098)
ボツリヌス菌タイプE神経毒 - アミノ酸残基(848～1085)
ボツリヌス菌タイプF神経毒 - アミノ酸残基(867～1105)
ボツリヌス菌タイプG神経毒 - アミノ酸残基(866～1105)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基(882～1127)
適したクロストリジウム神経毒HCドメインは本明細書に記載されている。
クロストリジウム神経毒HCドメインは配列番号8、22、30、38、42、44、46、48、もしくは、50、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでよい。実施の一形態において、クロストリジウム神経毒HCドメインは配列番号8、22、30、38、42、44、46、48、もしくは、50、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、クロストリジウム神経毒HCドメインは配列番号8、22、30、38、42、44、46、48、もしくは、50、または、その断片の何れか1つ含むポリペプチド配列を含む(より好ましくは、からなる)。
クロストリジウム神経毒HCドメインは配列番号7、21、29、37、41、43、45、47、もしくは、49、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものであってよい。実施の一形態において、クロストリジウム神経毒HCドメインは配列番号7、21、29、37、41、43、45、47、もしくは、49、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものである。好ましくは、クロストリジウム神経毒HCドメインは配列番号7、21、29、37、41、43、45、47、もしくは、49、または、その断片の何れか1つを含むヌクレオチド配列によって符号化されたものである。
実施の一形態において、本発明での使用のためのクロストリジウム神経毒HCドメインは変異型BoNT/AHCドメインである。前記変異型BoNT/AHCドメインはY1117、F1252、H1253、および、L1278から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基の修飾を含んでよい。例えば、変異型BoNT/AHCドメインは、以下の修飾、Y1117V、F1252Y、H1253K、および、L1278FまたはL1278Hの1つまたは複数(好ましくは、2個以上)を含んでよい。
実施の一形態において、変異型BoNT/AHCドメインは、以下の修飾、Y1117VおよびH1253K、または、Y1117V、F1252Y、H1253K、および、L1278F、または、Y1117V、F1252Y、H1253K、および、L1278Hを含む。
好ましくは、変異型BoNT/AHCドメインは以下の修飾、Y1117VおよびH1253K、または、Y1117V、F1252Y、H1253K、および、L1278Hを含む。
修飾は、配列番号62として示された未修飾BoNT/Aと比較した際の修飾であってよく、アミノ酸残基の番号付けは配列番号62と整列させることによって決定される。配列番号62の位置1のメチオニン残基の存在が任意であるため、当業者は、アミノ酸残基の番号付けを決定する際にメチオニン残基の存在/不在を考慮されよう。例えば、配列番号 62がメチオニンを含む場合、位置の番号付けは上記に定義したとおりとなる(例えば、Y1117は配列番号62のY1117と整列する)。代案として、配列番号 62にメチオニンが不在の場合、アミノ酸残基の番号付けは-1によって修正されたい(例えば、Y1117は配列番号52のY1116と整列する)。同様の考慮は、本明細書に記載の他のポリペプチド配列の位置1におけるメチオニンが存在/不在の際にも適用され、当業者は当技術分野での定例の技術を使用して正しいアミノ酸残基の番号付けを直ちに決定されよう。
変異型BoNT/AHCドメインは配列番号46、48、もしくは、50、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで含んでよい。実施の一形態において、変異型BoNT/AHCドメインは配列番号46、48、もしくは、50、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで含む。実施の一形態において、変異型BoNT/AHCドメインは配列番号46、48、もしくは、50、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも99%または99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで含む。好ましくは、変異型BoNT/AHCドメインは配列番号46、48、もしくは、50、または、その断片の何れか1を含むポリペプチド配列を含む(より好ましくは、からなる)。
変異型BoNT/AHCドメインは配列番号46、もしくは、50、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで含んでよい。実施の一形態において、変異型BoNT/AHCドメインは配列番号46、もしくは、50、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで含む。実施の一形態において、変異型BoNT/AHCドメインは配列番号46、もしくは、50、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも99%または99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで含む。好ましくは、変異型BoNT/AHCドメインは配列番号46、もしくは、50、または、その断片の何れか1を含むポリペプチド配列を含む(より好ましくは、からなる)。
変異型BoNT/AHCドメインは、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで、配列番号45、47、もしくは、49、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものであってよい。実施の一形態において、変異型BoNT/AHCドメインは、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで、配列番号45、47、もしくは、49、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものである。実施の一形態において、変異型BoNT/AHCドメインは、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで、配列番号45、47、もしくは、49、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも99%または99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものである。好ましくは、変異型BoNT/AHCドメインは配列番号45、47、もしくは、49、または、その断片の何れか1つによって符号化されたものである。
変異型BoNT/AHCドメインは、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで、配列番号45、もしくは、49、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものであってよい。実施の一形態において、変異型BoNT/AHCドメインは、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで、配列番号45、もしくは、49、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものである。実施の一形態において、変異型BoNT/AHCドメインは、変異型BoNT/AHCドメインが上記の修飾を含むという条件付きで、配列番号45、もしくは、49、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも99%または99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものである。好ましくは、変異型BoNT/AHCドメインは配列番号45、もしくは、49、または、その断片の何れか1つによって符号化されたものである。
上記の促進ドメインの何れも本発明での使用に適した上記のトランスロケーションドメインペプチドの何れとも組合せ可能である。したがって、例として、非クロストリジウム性促進ドメインは非クロストリジウム性トランスロケーションドメインペプチドまたはクロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組合せ可能である。代案として、クロストリジウム神経毒HCNトランスロケーション促進ドメインは非クロストリジウム性トランスロケーションドメインペプチドと組合せ可能である。代案として、クロストリジウム神経毒HCN促進ドメインはクロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組合せ可能であり、これの例は以下を含む:
ボツリヌス菌タイプA神経毒 - アミノ酸残基(449～1110)
ボツリヌス菌タイプB神経毒 - アミノ酸残基(442～1097)
ボツリヌス菌タイプC神経毒 - アミノ酸残基(450～1111)
ボツリヌス菌タイプD神経毒 - アミノ酸残基(446～1098)
ボツリヌス菌タイプE神経毒 - アミノ酸残基(423～1085)
ボツリヌス菌タイプF神経毒 - アミノ酸残基(440～1105)
ボツリヌス菌タイプG神経毒 - アミノ酸残基(447～1105)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基(458～1127)
実施のいくつかの形態において、本発明のクロストリジウム神経毒ははクロストリジウム神経毒の機能性HCドメインを欠いてもよい。実施の一形態において、クロストリジウム神経毒は、好ましくは、クロストリジウム神経毒ホロトキシンの最後の50個のC末端アミノ酸を欠く。実施の他の形態において、クロストリジウム神経毒は、クロストリジウム神経毒ホロトキシンの好ましくは最後の100個、好ましくは最後の150個、より好ましくは最後の200個、特に好ましくは最後の250個、および、最も好ましくは最後の300個のC末端アミノ酸残基を欠く。代案として、HC結合活性は変異生成によって無効化/削減されてよく、例として、便宜上、BoNT/Aを参照すると、ガングリオシド結合ポケット内の1つまたは2つのアミノ酸残基変異(W1266からLおよびY1267からF)の修飾がHC領域にその受容体結合機能を失わせる。類似の変異は、非血清型Aクロストリジウムペプチド成分、例えば、変異(W1262からLおよびY1263からF)、または、ボツリヌス菌E(W1224からLおよびY1225からF)を持つボツリヌス菌Bに基づく構造物に生じさせることが可能てある。活性部位への他の変異はHC受容体結合活性、例えば、ボツリヌス菌タイプA毒素のY1267Sおよび他のクロストリジウム神経毒の対応する高度に保存された残基の同じ切断を達成する。これの詳細および他の変異は参照により本明細書に組み込まれるRummel他による(Molecular Microbiol.(「分子微生物学」), 51:631-634) (2004)に記載されている。
天然クロストリジウム神経毒のHCペプチドは約400個～440個のアミノ酸残基を含み、それぞれが約25kDaの2個の機能上区別可能なドメイン、すなわち、(一般にHCNペプチドまたはドメインと呼ばれる)N末端領域および(一般にHCCペプチドまたはドメインと呼ばれる)C末端領域からなる。この事実は、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の出版物、Umland TC によるNat. Struct. Biol.(「自然構造生物学」)4: 788-792 (1997)、Herreros JによるBiochem. J(「税物化学ジャーナル」)347: 199-204 (2000)、Halpern JによるJ. Biol. Chem.(「生物学化学ジャーナル」)268, 15, pp. 11188-11192 (1993)、Rummel A によるPNAS(「米国科学アカデミー紀要」)104: 359-364 (2007)、Lacey DBによるNat. Struct. Biol.(「自然構造生物学」) 5: 898-902 (1998)、Knapp によるAm. Cryst. Assoc. Abstract Papers(「米国結晶学会要約論文集」)25: 90 (1998)、SwaminathanおよびEswaramoorthyによるNat. Struct. Biol.(「自然構造生物学」)7: 1751-1759 (2000)、ならびに、Rummel AによるMol. Microbiol.(「分子微生物学」)51(3), 631-643 (2004)によって確認される。さらに、C末端の160～200個のアミノ酸残基を構成するC末端領域(HCC)がクロストリジウム神経毒のその天然の細胞受容体への、すなわち、神経筋接合部の神経末端への結合に貢献していることは良好に文書化されており、この事実も上記出版物によって確認される。したがって、天然クロストリジウム神経毒が結合する細胞表面受容体に重鎖が結合できないように機能性重鎖HCペプチド(またはドメイン)を欠くクロストリジウム重鎖に対する本明細書全体を通じた言及は、クロストリジウム重鎖が単に機能性HCCペプチドを欠いていることを意味する。言い換えると、HCCペプチド領域は部分的もしくは全体的の何れかで欠失されてよく、または、神経筋接合部の神経末端に対するその天然の結合能を低減するように(例えば、従来の化学的もしくはタンパク質分解性の処理を介して)他の修飾がなされてよい。
したがって、実施の一形態において、本発明のクロストリジウム神経毒HNペプチドはクロストリジウム神経毒のC末端ペプチド部分(HCC)の一部を欠き、したがって、天然クロストリジウム神経毒のHC結合機能を欠く。例として、実施の一形態において、C末端延長クロストリジウムHNペプチドはクロストリジウム神経毒重鎖のC末端の40個のアミノ酸残基、または、C末端の60個のアミノ酸残基、または、C末端の80個のアミノ酸残基、または、C末端の100個のアミノ酸残基、または、C末端の120個のアミノ酸残基、または、C末端の140個のアミノ酸残基、または、C末端の150個のアミノ酸残基、または、C末端の160個のアミノ酸残基を欠く。実施の他の形態において、本発明のクロストリジウムHNペプチドはクロストリジウム神経毒のC末端ペプチド部分(HCC)全体を欠き、したがって、天然クロストリジウム神経毒のHC結合機能を欠く。例として、実施の一形態において、クロストリジウムHNペプチドはクロストリジウム神経毒重鎖のC末端の165個のアミノ酸残基、または、C末端の170個のアミノ酸残基、または、C末端の175個のアミノ酸残基、または、C末端の180個のアミノ酸残基、または、C末端の185個のアミノ酸残基、または、C末端の190個のアミノ酸残基、または、C末端の195個のアミノ酸残基を欠く。さらなる例として、本発明のクロストリジウムHNペプチドは以下からなる群から選択されるクロストリジウムHCC参照配列を欠く:
ボツリヌス菌タイプA神経毒 - アミノ酸残基(Y1111～L1296)
ボツリヌス菌タイプB神経毒 - アミノ酸残基(Y1098～E1291)
ボツリヌス菌タイプC神経毒 - アミノ酸残基(Y1112～E1291)
ボツリヌス菌タイプD神経毒 - アミノ酸残基(Y1099～E1276)
ボツリヌス菌タイプE神経毒 - アミノ酸残基(Y1086～K1252)
ボツリヌス菌タイプF神経毒 - アミノ酸残基(Y1106～E1274)
ボツリヌス菌タイプG神経毒 - アミノ酸残基(Y1106～E1297)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基(Y1128～D1315)
上記に明らかにした参照配列は下位血清型によって僅かな変化が生じることがあるため、指針と考えられたい。
実施の好ましい形態において、本発明のポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖またはその断片、および、クロストリジウム神経毒H鎖の断片を含む(または、からなる)。例えば、ポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖またはその断片、および、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメイン(HN)を含んで(または、からなって)よい。好ましくは、ポリペプチドはクロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HC)またはクロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HCC)の少なくともC末端部分をさらに含まない。したがって、実施の一形態において、本発明のポリペプチドはクロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HCC)のC末端部分を欠く。有利に、このポリペプチドは内因性クロストリジウム神経毒受容体結合能を欠き、したがって、前記ポリペプチドを投与されている患者においてより少ない的外れの効果を示す。
実施の一形態において、本発明のポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒H鎖の断片から本質的になる。この文脈において使用される用語「から本質的になる」とは、ポリペプチドが、例えば患者に投与された際に、ポリペプチドに追加の機能性を与える1つまたは複数のアミノ酸残基をさらには含まないことを意味する。言い換えると、クロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒H鎖の断片から本質的になるポリペプチドは(クロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒H鎖の断片のアミノ酸残基への)1つまたは複数アミノ酸残基をさらに含んでよいが、前記1つまたは複数のさらなるアミノ酸残基は、例えば患者に投与された際に、ポリペプチドに追加の機能性を与えない。追加の機能性は酵素活性、結合活性、および/または、何であれ何れかの生理学的活性を含んでよい。
実施の一形態において、ポリペプチドは何れかのクロストリジウム神経毒配列に加えて非クロストリジウム神経毒配列を含んでよい。非クロストリジウム神経毒配列は、好ましくは、ニューロンの成長またはニューロン修復を促進するための本発明のポリペプチドの能力を妨害しない。好ましくは、非クロストリジウム神経毒配列は触媒活性、例えば酵素活性を有するものではない。好ましくは、非クロストリジウム性配列は細胞受容体に結合するものではない。言い換えると、非クロストリジウム性配列は細胞受容体のためのリガンドではないことが最も好ましい。細胞受容体は、内在性膜タンパク質などのタンパク性細胞受容体であってよい。細胞受容体の例はhttps://www.guidetopharmacology.org/download.jsp#db_reportsにおいて入手可能なthe IUPHAR Guide to Pharmacology Database(「薬理学データベースへの国際薬理学連合ガイド」)version 2019.4に見出すことが可能である。非クロストリジウム神経毒配列は、His標識などの精製において支援するための標識を含んでよい。好ましくは、前記ポリペプチドに含まれる何れのクロストリジウム神経毒配列もクロストリジウム神経毒L鎖またはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒H鎖の断片からなる。実施の一形態において、前記ポリペプチドに含まれるクロストリジウム神経毒配列はクロストリジウム神経毒L鎖からなってよい。実施の一形態において、前記ポリペプチドに含まれるクロストリジウム神経毒配列はクロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインからなってよい。実施の一形態において、前記ポリペプチドに含まれるクロストリジウム神経毒配列はクロストリジウム神経毒受容体結合ドメインからなってよい。実施の一形態において、前記ポリペプチドに含まれるクロストリジウム神経毒配列はクロストリジウム神経毒L鎖およびクロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインからなってよい。
クロストリジウム神経毒L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(または、からなる)適したポリペプチドは本明細書に記載されている。
クロストリジウム神経毒L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(または、からなる)クロストリジウム神経毒は配列番号4、20、28、もしくは、36、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでよい。1つにおいて、クロストリジウム神経毒L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(または、からなる)クロストリジウム神経毒は配列番号4、20、28、もしくは、36、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。好ましくは、クロストリジウム神経毒L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(または、からなる)クロストリジウム神経毒は配列番号4、20、28、もしくは、36、または、その断片の何れか1つを含むポリペプチド配列を含む(より好ましくは、からなる)。
クロストリジウム神経毒L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(または、からなる)クロストリジウム神経毒は配列番号3、19、27、もしくは、35、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものであってよい。実施の一形態において、クロストリジウム神経毒L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(または、からなる)クロストリジウム神経毒は配列番号3、19、27、もしくは、35、または、その断片の何れか1つに対して少なくとも80%、90%、95%、または、98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたものである。好ましくは、クロストリジウム神経毒L鎖およびトランスロケーションドメインを含む(または、からなる)クロストリジウム神経毒は配列番号3、19、27、もしくは、35、または、その断片の何れか1つを含むヌクレオチド配列によって符号化されたものである。
本発明のポリペプチドは天然に生じるクロストリジウム神経毒複合体に存在する各複合タンパク質がなくてよい。
本発明のポリペプチドは組換え核酸技術を使用して生産可能である。したがって、実施の一形態において、(上記の)ポリペプチドは組換えポリペプチドである。
実施の一形態において、ポリペプチドを符号化する核酸配列を含む核酸(例えば、DNA)が提供される。実施の一形態において、核酸配列はプロモーターおよびターミネータを含むDNAベクターの一部として調整される。
実施の好ましい形態において、ベクターは以下から選択されるプロモーターを有する:
プロモーター / 誘導剤 / 典型的な誘導条件
Tac(ハイブリッド) / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
AraBAD / L-アラビノース / 0.2%(0.002～0.4%)
T7-Iacオペレータ / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
実施の他の好ましい形態において、ベクターは以下から選択されるプロモーターを有する:
プロモーター / 誘導剤 / 典型的な誘導条件
Tac(ハイブリッド) / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
AraBAD / L-アラビノース / 0.2%(0.002～0.4%)
T7-Iacオペレータ / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
T5-Iacオペレータ / IPTG / 0.2mM(0.05～2.0mM)
核酸分子は当技術分野知られている何れかの適した処理を使用して作成されてよい。したがって、核酸分子は化学的合成技術を使用して作成されてよい。代案として、本発明の拡散分子は分子生物学技術を使用して作成されてよい。
本発明のDNA構築物は、好ましくは、コンピュータで設計され、続いて、従来のDNA合成技術によって合成される。
上述の核酸配列情報は、採用されることになっている最終宿主細胞(例えば、E. coli)発現系によるコドンバイアスのために任意で修飾される。
用語「ヌクレオチド配列」と「核酸」は本明細書において同意語として使用されている。好ましくは、ヌクレオチド配列はDNA配列である。
本発明のポリペプチド(および、特に、その何れかのクロストリジウム神経毒部分)は1本鎖として、または、2本鎖として存在してよい。
本発明は軽鎖および重鎖を有する1本鎖ポリペプチドを生産する方法を提供し、この方法は発現宿主で本明細書に記載の核酸を発現させるステップと、1本鎖ポリペプチドを含む宿主細胞ホモジネートを提供するために宿主細胞を溶解するステップと、1本鎖ポリペプチドを単離するステップと、を含む。一態様において、本発明は本明細書に記載のポリペプチドを活性化する方法を提供し、この方法はポリペプチドの活性化ループ内のペプチド結合を加水分解するタンパク質分解酵素にポリペプチドを接触させるステップと、それによって、(1本鎖)ポリペプチドを(例えば、ジスルフィド結合によって軽鎖と重鎖が一体に連結された)対応する2本鎖ポリペプチドに変換するステップと、を含む。
したがって、本発明は、本発明の方法によって取得可能な2本鎖ポリペプチドを提供する。
本発明の様々な治療上の使用に関連した実施の各形態は治療の方法、本発明のポリペプチドに等しく適用され、かつ、その逆も同様であることが意図されている。
配列相同性
包括的方法、個別の方法、および、例えばセグメントアプローチ法などの混成方法を限定なく含めて、様々な配列整列法の何れも百分率同一性を決定するために使用可能である。百分率同一性を決定するための規定手順は当業者の技術範囲内の定例の手順である。包括的方法は分子の最初から最後までの配列を整列させ、個々の残基対のスコアの合算および開隙のペナルティを課すことによって最善の整列を決定する。非限定方法は、例えば、CLUSTAL W(「クラスタルダブル」)、例えば、Julie D. Thompson他によるCLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice(「クラスタルダブル:配列重み付け、位置固有開隙ペナルティ、および、重み行列の選択を介した累進的多配列の感度の改良」), 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照、および、反復改良、例えば、Osamu GotohによるSignificant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments(「構造整列の参照により評価された反復改良による多種タンパク質配列整列の精度の大幅な改良」), 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)を参照、を含む。個別方法は入力された配列のすべてによって共有されている1つまたは複数の保存されているモチーフを同定することによって配列を整列させる。非限定方法は、例えば、Match-box(「マッチボックス」)、例えば、Eric DepiereuxおよびErnest FeytmansによるMatch-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences(「マッチボックス:数種のタンパク質配列の同時整列のための根本的に新しいアルゴリズム」), 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)を参照、Gibbs sampling(「ギブズサンプリング」)、例えば、 C. E. Lawrence他によるDetecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment(「微かな配列信号を検出する:多重整列のためのギブズサンプリング戦略」), 262(5131 ) Science 208-214 (1993)を参照、Align-M(「アラインエム」),例えば、Ivo Van WaIIe他によるAlign-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences(「アラインエム・非常に相違する配列の多重整列のための新しいアルゴリズム」), 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)を参照、を含む。
したがって、百分率配列同一性は従来の方法によって決定されている。例えば、Altschul他によるBull. Math. Bio.(「数理生物学会会誌」). 48: 603-16, 1986ならびにHenikoffおよびHenikoffによるProc. Natl. Acad. Sci. USA(「米国科学アカデミー紀要」), 89:10915-19, 1992を参照。簡略には、2つのアミノ酸配列が10の開隙オープンペナルティ、1の開隙延長ペナルティ、ならびに、以下に示す(アミノ酸が標準の1文字コードによって示されている)HenikoffおよびHenikoff (ibid.)の「blosum 62」評点法行列を使用して整列スコアを最適化するために整列される。
2個以上の核酸またはアミノ酸配列の間の「百分率配列同一性」は各配列によって共有されている同一位置の数の関数である。したがって、%同一性は、同一のヌクレオチド/アミノ酸の数をヌクレオチド/アミノ酸の総数で除し、100を乗じたものとして算出されてよい。%配列同一性の算出は開隙の数、および、2個以上の配列の整列を最適化するために導入が必要な各開隙の長さも考慮してよい。2個以上の配列間の配列の比較および百分率同一性の決定は、当業者がよく知るBLAST(「ブラスト」)などの特定の数学アルゴリズムを使用して実行可能である。
Figure 2022550769000004
したがって、百分率同一性は以下のように算出される。
Figure 2022550769000005
実質的に相同な各ポリペプチドは1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、または、付加を有することを特徴とする。これらの変化は、好ましくは軽度のものであり、これは保存アミノ酸残基の置換(以下を参照)、および、ポリペプチドの折り畳みまたは活性に重大な影響を及ぼさない他の置換と、典型的には約30個のアミノ酸に対するものである小さな欠失と、ならびに、アミノ末端メチオニン残基、最大約20～25個の残基の小さなリンカーペプチド、または、親和性標識などの小さなアミノ末端またはカルボキシル末端の延長と、である。
保存アミノ酸置換
塩基性:
アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性:
グルタミン酸
アスパラギン酸
有極性:
グルタミン
アスパラギン
疎水性:
ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族:
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小さなもの:
グリシン
アラニン
セリン
トレオニン
メチオニン
20種の標準アミノ酸に加えて、(4―ヒドロキシプロリン、6―N―メチルリジン、2―アミノイソ酪酸、イソバリン、および、α―メチルセリンなどの)非標準アミノ酸が本発明のポリペプチドのアミノ酸残基に対して置換されてよい。限られた数の非保存アミノ酸、遺伝コードによって符号化されていないアミノ酸、および、非天然アミノ酸はポリペプチドアミノ酸残基に対して置換されてよい。本発明のポリペプチドは非天然に生じたアミノ酸残基も含むことが可能である。
非天然に生じたアミノ酸は、トランス―3―メチルプロリン、2,4―メタノ―プロリン、シス―4―ヒドロキシプロリン、トランス―4―ヒドロキシプロリン、N―メチルグリシン、アロ―トレオニン、メチル―トレオニン、ヒドロキシ―エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ―システイン、ニトロ―グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert―ロイシン、ノルバリン、2―アザフェニルアラニン、3―アザフェニル―アラニン、4―アザフェニル―アラニン、および、4―フルオロフェニルアラニンを限定せずに含む。非天然に生じたアミノ酸残基をタンパク質に組み込むためのいくつかの方法は当技術分野で知られている。例えば、生体外の系が採用可能であり、ここでは、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを使用してナンセンス変異が抑制される。アミノ酸およびアミノアシル化tRNAを合成する方法は当技術分野で知られている。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写および翻訳はE. coliS30抽出物および市販の酵素、ならびに、他の試訳を含む無細胞系において実行される。タンパク質はクロマトグラフィーで精製される。例えば、Robertson他によるJ. Am. Chem. Soc.(「米国化学会誌」)113:2722, 1991、Ellman他による, Methods Enzymol(「酵素学における方法」). 202:301, 1991、Chung他によるScience(「サイエンス」), 259:806-9, 1993、および、Chung他によるProc. Natl. Acad. Sci. USA(「米国科学アカデミー紀要」), 90:10145-9, 1993)を参照。第2の方法において、翻訳は変異mRNAおよび科学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAの顕微注射によってXenopus oocytes内で実行される(Turcatti他によるJ. Biol. Chem.(「米国生物化学会誌」) 271:19991-8, 1996)。第3の方法において、E. coliの細胞の培養が、置き換えることになる天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の不在、かつ、所望の非天然に生じたアミノ酸(例えば、2―アザフェニルアラニン、3―アザフェニルアラニン、4―アザフェニルアラニン、、または、4―フルオロフェニルアラニン)の存在下で行なわれる。非天然に生じたアミノ酸はその天然の対応物に代わりポリペプチド内に組み込まれる。Koide他によるBiochem.(「生物化学」) 33:7470-6, 1994を参照。天然に生じたアミノ酸残基は生体外の化学的修飾によって非天然に生じる種に変換可能である。化学的修飾は置換の範囲をさらに拡張するために部位特異的な変異生成と組合せ可能である(WynnおよびRichardsによるProtein Sci.(「タンパク質化学」)2:395-403, 1993)。
限られた数の非保存アミノ酸、遺伝コードによって符号化されていないアミノ酸、非天然に生じたアミノ酸、および、非天然アミノ酸は本発明のポリペプチドのアミノ酸残基に対して置換してよい。
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的な変異生成またはアラニン走査変異生成などの当技術分野で知られている手順により同定可能である(CunninghamおよびWellsによるScience(「サイエンス」) 244: 1081-5, 1989)。生物相互作用の部位は、推定接触部位アミノ酸の変異に関した核磁気共鳴、結晶構造解析、電子線回折、または、光親和性標識などの技術によって決定されるような構造の物理分析によっても決定可能である。例えば、de Vos他によるScience(「サイエンス」), 255:306-12, 1992、Smith他によるJ. Mol. Biol(「分子生物学会誌」). 224:899-904, 1992、Wlodaver他によるFEBS Lett(「欧州生化学連合レター」). 309:59-64, 1992を参照。必須アミノ酸の正体は本発明のポリペプチドの関連成分(例えば、トランスロケーションまたはタンパク質分解酵素成分)との相同性の解析からも推測可能である。
多重アミノ酸置換は、Reidhaar-OlsonおよびSauer(Science(「サイエンス」)241:53-7, 1988)またはBowieおよびSauer(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(「米国科学アカデミー紀要」)86:2152-6, 1989)によって開示されているものなどの変異生成および選別の知られている方法を使用して実行および検査が可能である。簡略には、これらの著者は、ポリペプチド内の2個以上の位置を同時に無作為抽出し、機能性ポリペプチドを選択し、かつ、続いて、各位置での許容可能な置換のスペクトルを決定するために変異生成されたポリペプチドの配列を決定するための方法を開示している。使用可能な他の方法はファージ提示法(例えば、Lowman他によるBiochem.(「生物化学」). 30:10832-7, 1991、Ladner他による米国特許第5,223,409号、Huseによる国際公開92/06204)および 領域特異的変異生成(Derbyshire他によるGene(「遺伝子」)46:145, 1986、Ner他によるDNA 7:127, 1988)を含む。
他に定義されていない限り、本明細書で使用のすべての技術的および科学的な用語は本開示が属する技術分野における通常の熟練者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。Singleton他によるDICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(「微生物学と分子生物学の辞書」), 20 ED、John WileyおよびSonsによるNew York(「ニューヨーク」), (1994)ならびにHale & MarhamによるTHE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(「ハーパーコリンズ生物学辞書」), Harper PerennialによるNY (1991)は本開示で使用されている用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
本開示は本明細書に開示の例示としての方法および物質によっては限定されず、本明細書に記載のものと同様または同等の何れの方法および物質も本開示の実施の各形態の実施または試験において使用可能である。数値範囲はその範囲を定義する数を含む、他に示されていない限り、何れの核酸配列も5’から3’の配向で左から右に書かれ、アミノ酸配列はそれぞれアミノからカルボキシの配向で左から右に書かれている。
本明細書に設けられた見出しは本開示の様々な態様または実施の形態の限定ではない。
アミノ酸は本明細書においてそのアミノ酸の名称、3文字略称、または、1文字略称を使用して呼ばれている。本明細書で使用の用語「タンパク質」はタンパク質、ポリペプチド、および、ペプチドを含む。本明細書で使用されているように、用語「アミノ酸配列」は用語「ポリペプチド」および/または用語「タンパク質」と同義である。いくつかの例において、用語「アミノ酸配列」は用語「ペプチド」と同義である。いくつかの例において、用語「アミノ酸配列」は用語「酵素」と同義である。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は本明細書において相互交換可能に使用されている。本開示および特許請求の範囲においては、アミノ酸残基に対する従来の1文字および3文字のコードは使用可能である。IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN)(国際純正応用化学連合国際生化学連合生化学命名法連合委員会)に準拠して定義されたとおりのアミノ酸に対する3文字コード。ポリペプチドは遺伝コードの縮退により2個以上のヌクレオチド配列によって符号化されてよいことが理解されよう。
用語の他の定義は本明細書全体を通じて現れることが可能てある。例示的実施の各形態がより詳細に説明される前に、本開示は説明されている特定の実施の形態に限定されず、これ自体が変化する可能性があることを理解されたい。本明細書で使用の専門用語が特定の実施の形態のみを説明する目的のためのものであり、限定的であることを意図されていないことも理解されたい。なぜなら、本開示の範囲は従属する特許請求の範囲によってのみ定義されるからである。
値の範囲が設けられている場合、その範囲の上限値と下限値との間の各中間値は、文脈が他に明らかに指示していない限り下限の単位の10分の1まで、同じく詳細に開示されていることが理解されよう。いずれかの明言された値または明言された範囲内の中間の間と、いずれか他の明言された値、または、その明言された範囲内のいずれか他の中間の値との間のより小さな各範囲は本開示内に包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限は独立にその範囲に含まれ、または、から排除されてよく、かつ、より小さな範囲に上限および下限の何れかが含まれる、その双方がともに含まれない、または、ともに含まれる場合にも、その明言された範囲内の何れの特別に排除された限界に従いつつ、各範囲も本開示に包含される。明言された範囲が限界の一方または双方を含む場合、それらの含まれた限界の一方、または、双方を排除する範囲も本開示に含まれる。
本明細書および従属の特許請求の範囲での使用のとおり、単数形「a」、「an」、および、「the」は、文脈が他に明確に指示していない限り複数の指示対象を含むことに注意されたい。したがって、例えば、「1つのクロストリジウム神経毒」への言及は複数のそのような候補薬剤を含み、「そのクロストリジウム神経毒」への言及は1つまたは複数のクロストリジウム神経毒および当業者に知られているその同等物などへの言及を含む。
本明細書で検討の出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供されている。本明細書には、そのような出版物が、本明細書に従属する特許請求の範囲に対する従来技術を構成するとの了解として解釈されるものは何もない。
以下の図面と実施例を参照して本発明の実施の各形態を例としてのみ説明する。
運動ニューロン状細胞株NSC34内の陽性対照脳由来神経栄養因子(BDNF)と比較した、組換えで発現させた触媒として不活性な異なったBoNT/血清型の神経栄養効果を示す図である。*未処置対照に対してp<0.05、ダネット多重比較検定が後に続く一方向性ANOVA。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差であり、各実験は6個の複製ウエル内で行なわれた。 運動ニューロン状細胞株NSC34内のボツリヌス菌神経毒血清型A断片の神経栄養効果、および、組換えで発現させた触媒として不活性なBoNT/Aの効果を示す図である。BDNFは陽性対照として使用された。*未処置対照に対してp<0.05、ダネット多重比較検定が後に続く一方向性ANOVA。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差であり、各実験は6個の複製ウエル内で行なわれた。 運動ニューロン状細胞株NSC34内の陰性対照と組換えで発現させた触媒として不活性なBoNT/A(BoNT/A(0))の神経栄養効果を示す図である。BDNFは陽性対照として使用された。*未処置対照に対してp<0.05、ダネット多重比較検定が後に続く一方向性ANOVA。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差であり、各実験は6個の複製ウエル内で行なわれた。 100pg、100ng、または、50μgで伸展剤対照(PBS)またはrBoNT/A(0)が投与されたハツカネズミに対する水平橋子試験の結果を示す図である。 (A)伸展剤(PBS)(左のパネル)または100ngのrBoNT/A(0)(右のパネル)の投与後4週間での神経フィラメント200(NF200)に結合する抗体を使用した免疫組織化学的状況、および、(B)伸展剤(PBS)(左のパネル)または100ngのrBoNT/A(0)(右のパネル)の投与後4週間でのMAP1bに結合する抗体を使用した免疫組織化学的状態を示す図である。病変部位は*によって示す(かつ、図5Bについては白い矢印で示す)。 細胞当たりの神経突起の数に対する(A)触媒として不活性なBoNT/A(0)、(B)BoNT/A軽鎖に加えてトランスロケーションドメイン断片(LHN/A)、(C)BoNT/A軽鎖(LC/A、すなわち、L/A)、および、(D)BoNT/A受容体結合ドメイン(HC/A)の効果を示す図である。BoNTまたはBoNT断片はBSA(陰性対照)、BDNF(陽性対照)に比較され、0.1nM、1nM、および、10nMの濃度で試験された。*BSA対照に対してp<0.05、ダネット事後検定が後に続く一方向性ANOVA。データは平均値±標準誤差である。 細胞当たりの神経突起の数に対する(A)触媒として不活性なBoNT/FA(0)、(B)BoNT/FA軽鎖に加えてトランスロケーションドメイン断片(LHN/FA)、(C)BoNT/FA軽鎖(LC/FA、すなわち、L/FA)、および、(D)BoNT/FA受容体結合ドメイン(HC/FA)の効果を示す図である。BoNTまたはBoNT断片はBSA(陰性対照)、BDNF(陽性対照)に比較され、0.1nM、1nM、および、10nMの濃度で試験された。*BSA対照に対してp<0.05、ダネット事後検定が後に続く一方向性ANOVA。データは平均値±標準誤差である。 細胞当たりの神経突起の数に対する(A)BoNT/F軽鎖に加えてトランスロケーションドメイン断片(LHN/F)、(B)BoNT/F軽鎖(LC/F、すなわち、L/F)、および、(C)BoNT/F受容体結合ドメイン(HC/F)の効果を示す図である。BoNTまたはBoNT断片はBSA(陰性対照)、BDNF(陽性対照)に比較され、0.1nM、1nM、および、10nMの濃度で試験された。*BSA対照に対してp<0.05、ダネット事後検定が後に続く一方向性ANOVA。データは平均値±標準誤差である。 細胞当たりの神経突起の数に対する陽イオン性rHC/A(すなわち、mrHC/A)の効果を示す図である。陽イオン性BoNT断片はBSA(陰性対照)、BDNF(陽性対照)に比較され、0.1nM、1nM、および、10nMの濃度で試験された。*BSA対照に対してp<0.05、ダネット事後検定が後に続く一方向性ANOVA。データは平均値±標準誤差である。 細胞当たりの神経突起の数に対する(A)toxHC/A YH(すなわち、rHC/A Variant Y1117V H1253K)、および、(B)toxHC/A YFHL(LからH)(すなわち、rHC/A Variant Y1117V F1252Y H1253K L1278H)の効果を示す図である。変異型BoNT断片はBSA(陰性対照)、BDNF(陽性対照)に比較され、0.1nM、1nM、および、10nMの濃度で試験された。*BSA対照に対してp<0.05、ダネット事後検定が後に続く一方向性ANOVA。データは平均値±標準誤差である。
配列表
最初のMetアミノ酸残基または対応する最初のコドンが以下のSEQ ID NOの何れかに示されている場合、前記残基/コドンは任意である。
配列番号1 - ヌクレオチド配列, 触媒として不活性な組換えBoNT/A (rBoNT/A(0))
配列番号2 - ポリペプチド配列, rBoNT/A(0)
配列番号3 - ヌクレオチド配列, rLHN/A (軽鎖とトランスロケーションドメインのみ).
配列番号4 - ポリペプチド配列, rLHN/A
配列番号5 - ヌクレオチド配列, rL/A (軽鎖のみ)
配列番号6 - ポリペプチド配列, rL/A
配列番号7 - ヌクレオチド配列, rHC/A
配列番号8 - ポリペプチド配列, rHC/A
配列番号9 - ヌクレオチド配列, rBoNT/B(0)
配列番号10 - ポリペプチド配列, rBoNT/B(0)
配列番号11 - ヌクレオチド配列, rBoNT/C(0)
配列番号12 - ポリペプチド配列, rBoNT/C(0)
配列番号13 - ヌクレオチド配列, rBoNT/E(0)
配列番号14 - ポリペプチド配列, rBoNT/E(0)
配列番号15 - ヌクレオチド配列, rBoNT/F(0)
配列番号16 - ポリペプチド配列, rBoNT/F(0)
配列番号17 - ヌクレオチド配列, rBoNT/A(0) (Hisタグ付加)
配列番号18 - ポリペプチド配列, rBoNT/A(0) (Hisタグ付加)
配列番号19 - ヌクレオチド配列, rLHN/A (Hisタグ付加)
配列番号20 - ポリペプチド配列, rLHN/A (Hisタグ付加)
配列番号21 - ヌクレオチド配列, rHC/A (Hisタグ付加)
配列番号22 - ポリペプチド配列, rHC/A (Hisタグ付加)
配列番号23 - ヌクレオチド配列, rLC/A (Hisタグ付加)
配列番号24 - ポリペプチド配列, rLC/A (Hisタグ付加)
配列番号25 - ヌクレオチド配列, rBoNT/FA(0) (Hisタグ付加)
配列番号26 - ポリペプチド配列, rBoNT/FA(0) (Hisタグ付加)
配列番号27 - ヌクレオチド配列, rLHN/FA (Hisタグ付加)
配列番号28 - ポリペプチド配列, rLHN/FA (Hisタグ付加)
配列番号29 - ヌクレオチド配列, rHC/FA (Hisタグ付加)
配列番号30 - ポリペプチド配列, rHC/FA (Hisタグ付加)
配列番号31 - ヌクレオチド配列, rLC/FA (Hisタグ付加)
配列番号32 - ポリペプチド配列, rLC/FA (Hisタグ付加)
配列番号33 - ヌクレオチド配列, rBoNT/F(0) (Hisタグ付加)
配列番号34 - ポリペプチド配列, rBoNT/F(0) (Hisタグ付加)
配列番号35 - ヌクレオチド配列, rLHN/F (Hisタグ付加)
配列番号36 - ポリペプチド配列, rLHN/F (Hisタグ付加)
配列番号37 - ヌクレオチド配列, rHC/F (Hisタグ付加)
配列番号38 - ポリペプチド配列, rHC/F (Hisタグ付加)
配列番号39 - ヌクレオチド配列, rLC/F (Hisタグ付加)
配列番号40 - ポリペプチド配列, rLC/F (Hisタグ付加)
配列番号41 - ヌクレオチド配列, 陽イオン性 rHC/A (Hisタグ付加)
配列番号42 - ポリペプチド配列, 陽イオン性 rHC/A (Hisタグ付加)
配列番号43 - ヌクレオチド配列, rHC/AB (Hisタグ付加)
配列番号44 - ポリペプチド配列, rHC/AB (Hisタグ付加)
配列番号45 - ヌクレオチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V H1253K (Hisタグ付加)
配列番号46 - ポリペプチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V H1253K (Hisタグ付加)
配列番号47 - ヌクレオチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V F1252Y H1253K L1278F (Hisタグ付加)
配列番号48 - ポリペプチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V F1252Y H1253K L1278F (Hisタグ付加)
配列番号49 - ヌクレオチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V F1252Y H1253K L1278H (Hisタグ付加)
配列番号50 - ポリペプチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V F1252Y H1253K L1278H (Hisタグ付加)
配列番号51 - ポリペプチド配列, BoNT/A - UniProt P10845
配列番号52 - ポリペプチド配列, BoNT/B - UniProt P10844
配列番号53 - ポリペプチド配列, BoNT/C - UniProt P18640
配列番号54 - ポリペプチド配列, BoNT/D - UniProt P19321
配列番号55 - ポリペプチド配列, BoNT/E - UniProt Q00496
配列番号56 - ポリペプチド配列, BoNT/F - UniProt A7GBG3
配列番号57 - ポリペプチド配列, BoNT/G - UniProt Q60393
配列番号58 - ポリペプチド配列, TeNT - UniProt P04958
配列番号59 - ポリペプチド配列, BoNT/X
配列番号60 - ヌクレオチド配列, mrBoNT/A
配列番号61 - ポリペプチド配列, mrBoNT/A
配列番号62 - ポリペプチド配列, 無修飾 BoNT/A1
配列番号63 - ポリペプチド配列, mrBoNT/AB
配列番号64 - ポリペプチド配列, mrBoNT/AB(0)
配列番号65 - ポリペプチド配列, mrBoNT/A(0)
配列番号1 - ヌクレオチド配列, rBoNT/A(0)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATcAACTGATCtACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
配列番号2 - ポリペプチド配列, rBoNT/A(0)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
配列番号3 - ヌクレオチド配列, rLHN/A
atggagttcgttaacaaacagttcaactataaagacccagttaacggtgttgacattgcttacatcaaaatcccgaacgctggccagatgcagccggtaaaggcattcaaaatccacaacaaaatctgggttatcccggaacgtgatacctttactaacccggaagaaggtgacctgaacccgccaccggaagcgaaacaggtgccggtatcttactatgactccacctacctgtctaccgataacgaaaaggacaactacctgaaaggtgttactaaactgttcgagcgtatttactccaccgacctgggccgtatgctgctgactagcatcgttcgcggtatcccgttctggggcggttctaccatcgataccgaactgaaagtaatcgacactaactgcatcaacgttattcagccggacggttcctatcgttccgaagaactgaacctggtgatcatcggcccgtctgctgatatcatccagttcgagtgtaagagctttggtcacgaagttctgaacctcacccgtaacggctacggttccactcagtacatccgtttctctccggacttcaccttcggttttgaagaatccctggaagtagacacgaacccactgctgggcgctggtaaattcgcaactgatcctgcggttaccctggctcacgaactgattcatgcaggccaccgcctgtacggtatcgccatcaatccgaaccgtgtcttcaaagttaacaccaacgcgtattacgagatgtccggtctggaagttagcttcgaagaactgcgtacttttggcggtcacgacgctaaattcatcgactctctgcaagaaaacgagttccgtctgtactactataacaagttcaaagatatcgcatccaccctgaacaaagcgaaatccatcgtgggtaccactgcttctctccagtacatgaagaacgtttttaaagaaaaatacctgctcagcgaagacacctccggcaaattctctgtagacaagttgaaattcgataaactttacaaaatgctgactgaaatttacaccgaagacaacttcgttaagttctttaaagttctgaaccgcaaaacctatctgaacttcgacaaggcagtattcaaaatcaacatcgtgccgaaagttaactacactatctacgatggtttcaacctgcgtaacaccaacctggctgctaattttaacggccagaacacggaaatcaacaacatgaacttcacaaaactgaaaaacttcactggtctgttcgagttttacaagctgctgtgcGTCGACGGCATCATTACCTCCAAAACTAAATCTGACGATGACGATAAAAACAAAGCGCTGAACCTGCAGtgtatcaaggttaacaactgggatttattcttcagcccgagtgaagacaacttcaccaacgacctgaacaaaggtgaagaaatcacctcagatactaacatcgaagcagccgaagaaaacatctcgctggacctgatccagcagtactacctgacctttaatttcgacaacgagccggaaaacatttctatcgaaaacctgagctctgatatcatcggccagctggaactgatgccgaacatcgaacgtttcccaaacggtaaaaagtacgagctggacaaatataccatgttccactacctgcgcgcgcaggaatttgaacacggcaaatcccgtatcgcactgactaactccgttaacgaagctctgctcaacccgtcccgtgtatacaccttcttctctagcgactacgtgaaaaaggtcaacaaagcgactgaagctgcaatgttcttgggttgggttgaacagcttgtttatgattttaccgacgagacgtccgaagtatctactaccgacaaaattgcggatatcactatcatcatcccgtacatcggtccggctctgaacattggcaacatgctgtacaaagacgacttcgttggcgcactgatcttctccggtgcggtgatcctgctggagttcatcccggaaatcgccatcccggtactgggcacctttgctctggtttcttacattgcaaacaaggttctgactgtacaaaccatcgacaacgcgctgagcaaacgtaacgaaaaatgggatgaagtttacaaatatatcgtgaccaactggctggctaaggttaatactcagatcgacctcatccgcaaaaaaatgaaagaagcactggaaaaccaggcggaagctaccaaggcaatcattaactaccagtacaaccagtacaccgaggaagaaaaaaacaacatcaacttcaacatcgacgatctgtcctctaaactgaacgaatccatcaacaaagctatgatcaacatcaacaagttcctgaaccagtgctctgtaagctatctgatgaactccatgatcccgtacggtgttaaacgtctggaggacttcgatgcgtctctgaaagacgccctgctgaaatacatttacgacaaccgtggcactctgatcggtcaggttgatcgtctgaaggacaaagtgaacaataccttatcgaccgacatcccttttcagctcagtaaatatgtcgataaccaacgccttttgtccactctagaagcaCACCATCATCACcaccatcaccatcaccat
配列番号4 - ポリペプチド配列, rLHN/A
MEFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEAHHHHHHHHHH
配列番号5 - ヌクレオチド配列, rL/A
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGggtctagaagcaCACCATCATCACcaccatcaccatcaccat
配列番号6 - ポリペプチド配列, rL/A
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLGLEAHHHHHHHHHH
配列番号7 - ヌクレオチド配列, rHC/A
ATGCATCATCACCATCACCACAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
配列番号8 - ポリペプチド配列, rHC/A
MHHHHHHKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
配列番号9 - ヌクレオチド配列, rBoNT/B(0)
ATGCCGGTGACGATTAACAACTTCAACTACAACGACCCGATTGACAACAACAACATTATCATGATGGAACCGCCGTTTGCACGCGGCACGGGCCGTTATTACAAAGCGTTTAAAATCACCGATCGTATTTGGATTATCCCGGAACGCTACACGTTTGGTTATAAACCGGAAGACTTCAACAAAAGCTCTGGCATCTTCAACCGTGATGTTTGCGAATACTACGATCCGGACTACCTGAACACCAACGATAAGAAAAACATTTTTCTGCAAACGATGATCAAACTGTTCAATCGCATTAAAAGCAAACCGCTGGGTGAAAAACTGCTGGAAATGATTATCAATGGCATTCCGTATCTGGGTGATCGTCGCGTGCCGCTGGAAGAATTTAACACCAATATCGCGAGTGTTACGGTCAACAAACTGATTTCCAATCCGGGTGAAGTCGAACGTAAAAAAGGCATCTTCGCCAACCTGATCATCTTCGGCCCGGGTCCGGTGCTGAACGAAAATGAAACCATTGATATCGGTATTCAGAACCATTTTGCCTCACGCGAAGGCTTCGGCGGTATTATGCAAATGAAATTTTGCCCGGAATATGTGTCGGTTTTCAACAATGTTCAGGAAAACAAAGGTGCAAGCATCTTTAATCGTCGCGGCTATTTCTCTGATCCGGCTCTGATCCTGATGCACcAACTGATTtATGTGCTGCACGGCCTGTATGGTATCAAAGTGGATGACCTGCCGATCGTTCCGAACGAGAAAAAATTTTTCATGCAGAGCACCGACGCAATTCAAGCTGAAGAACTGTATACGTTTGGCGGTCAGGACCCGTCTATTATCACCCCGAGCACCGACAAAAGCATCTACGATAAAGTGCTGCAAAACTTTCGTGGCATTGTTGACCGCCTGAATAAAGTCCTGGTGTGTATCTCTGATCCGAACATCAACATCAACATCTACAAAAACAAATTCAAAGACAAATACAAATTCGTTGAAGATTCTGAAGGCAAATATAGTATTGACGTCGAATCCTTTGATAAACTGTACAAAAGTCTGATGTTCGGTTTCACCGAAACGAACATCGCGGAAAACTACAAAATCAAAACCCGCGCCTCCTATTTCAGCGACTCTCTGCCGCCGGTTAAAATCAAAAATCTGCTGGATAACGAAATTTATACGATCGAAGAAGGTTTCAACATCAGCGATAAAGACATGGAAAAAGAATACCGTGGCCAGAATAAAGCAATCAACAAACAGGCGTATGAAGAAATTAGTAAAGAACATCTGGCGGTCTACAAAATTCAGATGTGCAAATCCGTGAAAGCCCCGGGTATTTGTATCGATGTTGACAATGAAGACCTGTTTTTCATCGCCGATAAAAACAGTTTTTCCGATGACCTGTCAAAAAATGAACGCATCGAATACAACACCCAATCGAACTACATCGAAAACGATTTCCCGATCAACGAACTGATTCTGGATACGGACCTGATTAGTAAAATCGAACTGCCGTCAGAAAACACCGAATCGCTGACGGACTTTAATGTTGATGTCCCGGTGTATGAAAAACAGCCGGCAATTAAGAAAATTTTTACCGATGAAAACACGATCTTCCAGTACCTGTACAGCCAAACCTTTCCGCTGGACATTCGCGATATCTCTCTGACGAGTTCCTTTGATGACGCACTGCTGTTCAGCAACAAAGTGTACTCCTTTTTCTCAATGGATTACATCAAAACCGCTAACAAAGTGGTTGAAGCGGGCCTGTTTGCCGGTTGGGTGAAACAGATCGTTAACGATTTCGTCATCGAAGCCAACAAAAGTAACACGATGGATAAAATTGCTGATATCTCCCTGATTGTCCCGTATATTGGCCTGGCACTGAATGTGGGTAACGAAACGGCGAAAGGCAATTTTGAAAACGCCTTCGAAATTGCAGGCGCTTCAATCCTGCTGGAATTTATTCCGGAACTGCTGATCCCGGTCGTGGGTGCGTTCCTGCTGGAATCTTACATCGACAACAAAAACAAAATCATCAAAACCATTGATAACGCGCTGACGAAACGTAACGAAAAATGGTCAGATATGTACGGCCTGATTGTTGCCCAGTGGCTGAGCACCGTCAACACGCAATTTTACACCATCAAAGAAGGTATGTACAAAGCGCTGAATTATCAGGCGCAAGCCCTGGAAGAAATCATCAAATACCGCTACAACATCTACAGCGAAAAAGAAAAATCTAACATCAACATCGACTTTAATGATATCAACAGCAAACTGAACGAAGGTATCAACCAGGCAATCGATAACATCAACAACTTCATCAACGGCTGCTCAGTGTCGTATCTGATGAAGAAAATGATCCCGCTGGCTGTTGAAAAACTGCTGGATTTTGACAACACCCTGAAGAAAAACCTGCTGAACTACATCGATGAAAACAAACTGTACCTGATCGGCTCAGCCGAATACGAAAAATCGAAAGTGAACAAATACCTGAAAACCATCATGCCGTTTGACCTGAGTATTTACACCAACGATACGATCCTGATCGAAATGTTCAACAAATACAACTCCGAAATTCTGAACAATATTATCCTGAACCTGCGTTACAAAGACAACAATCTGATCGATCTGAGCGGCTATGGTGCAAAAGTTGAAGTCTACGACGGTGTCGAACTGAACGATAAAAACCAGTTCAAACTGACCTCATCGGCTAACTCAAAAATTCGTGTGACGCAGAACCAAAACATCATCTTCAACTCGGTCTTTCTGGACTTCAGCGTGTCTTTCTGGATTCGCATCCCGAAATATAAAAATGATGGCATCCAGAACTACATCCATAACGAATACACCATCATCAACTGTATGAAAAACAACAGTGGTTGGAAAATTTCCATCCGTGGCAACCGCATTATCTGGACCCTGATTGATATCAATGGTAAAACGAAAAGCGTGTTTTTCGAATACAACATCCGTGAAGATATCTCTGAATACATCAATCGCTGGTTTTTCGTGACCATTACGAACAATCTGAACAATGCGAAAATCTATATCAACGGCAAACTGGAAAGTAATACCGACATCAAAGATATTCGTGAAGTTATCGCCAACGGTGAAATCATCTTCAAACTGGATGGCGACATCGATCGCACCCAGTTCATTTGGATGAAATACTTCTCCATCTTCAACACGGAACTGAGTCAGTCCAATATCGAAGAACGCTACAAAATCCAATCATACTCGGAATACCTGAAAGATTTCTGGGGTAACCCGCTGATGTACAACAAAGAATACTACATGTTCAACGCGGGCAACAAAAACTCATACATCAAACTGAAAAAAGATTCGCCGGTGGGTGAAATCCTGACCCGTAGCAAATACAACCAGAACTCTAAATACATCAACTATCGCGATCTGTACATTGGCGAAAAATTTATTATCCGTCGCAAAAGCAACTCTCAGAGTATTAATGATGACATCGTGCGTAAAGAAGACTACATCTATCTGGATTTCTTTAATCTGAACCAAGAATGGCGCGTTTATACCTACAAATACTTCAAAAAAGAAGAAGAGAAACTGTTCCTGGCCCCGATTAGCGACAGCGATGAATTTTACAACACCATCCAGATCAAAGAATACGATGAACAGCCGACGTATAGTTGCCAACTGCTGTTCAAAAAAGACGAAGAATCCACCGATGAAATTGGCCTGATTGGTATCCACCGTTTCTATGAAAGCGGTATCGTTTTCGAAGAATACAAAGATTACTTCTGTATCTCTAAATGGTATCTGAAAGAAGTCAAACGCAAACCGTACAACCTGAAACTGGGCTGCAACTGGCAATTTATCCCGAAAGACGAAGGCTGGACCGAA
配列番号10 - ポリペプチド配列, rBoNT/B(0)
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHQLIYVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
配列番号11 - ヌクレオチド配列, rBoNT/C(0)
ATGCCGATCACGATTAATAATTTCAACTATAGCGATCCGGTGGACAATAAGAATATTCTGTATCTGGATACTCATCTGAATACGCTGGCTAACGAACCGGAGAAAGCGTTCCGCATCACAGGCAACATCTGGGTTATTCCCGATCGCTTTTCACGCAACAGCAACCCTAATCTGAACAAACCTCCTCGTGTCACCAGTCCTAAATCCGGTTATTACGACCCAAACTATCTGAGTACGGATAGCGATAAAGATCCCTTTCTGAAAGAGATCATTAAGCTGTTCAAACGCATTAACTCTCGCGAAATTGGGGAAGAGCTGATCTATCGGCTTTCGACAGATATCCCGTTCCCAGGTAACAATAATACCCCGATTAATACTTTCGACTTTGATGTTGATTTCAATTCTGTGGATGTGAAAACGCGTCAAGGCAATAATTGGGTGAAAACTGGTAGCATTAACCCGAGTGTAATTATCACAGGTCCCCGTGAGAACATCATCGACCCGGAAACCTCTACCTTCAAGCTGACGAACAACACGTTTGCTGCACAGGAAGGGTTTGGTGCCCTGTCAATCATTTCCATCTCACCGCGTTTCATGTTAACCTACTCCAATGCCACAAATGATGTTGGCGAAGGACGTTTTAGCAAATCAGAATTTTGCATGGACCCAATTCTCATTCTGATGggCacGCTGAACaATGCGATGCACAACTTGTATGGCATTGCTATTCCAAACGATCAAACCATTAGCTCCGTTACCAGTAATATCTTCTATAGCCAGTATAATGTCAAATTGGAGTATGCCGAAATTTACGCCTTTGGAGGCCCGACCATTGACCTGATTCCGAAATCTGCACGCAAATACTTCGAAGAAAAGGCGTTAGATTACTATCGCAGCATCGCGAAACGCCTGAACTCGATTACCACGGCCAATCCGTCGTCGTTCAACAAATACATTGGTGAATATAAACAGAAACTGATTCGCAAATATCGGTTTGTCGTAGAAAGCTCTGGTGAAGTGACTGTAAACCGCAACAAATTTGTCGAACTCTACAACGAGTTGACCCAAATCTTTACCGAGTTTAACTACGCAAAGATCTATAACGTACAGAACCGCAAGATTTATCTTAGCAATGTATACACACCGGTTACTGCGAACATCTTAGACGACAATGTGTATGATATTCAGAATGGCTTTAACATCCCGAAATCAAATCTGAACGTTCTGTTTATGGGCCAGAACCTGAGTCGTAATCCAGCACTGCGTAAAGTGAACCCGGAAAATATGCTCTACTTGTTTACCAAATTTTGCCACAAAGCGATTGATGGCCGCTCTCTCTATAACAAAACGCTGGATTGTCGTGAGTTACTTGTGAAGAACACTGATTTACCGTTCATTGGGGATATCTCCGACGTGAAAACCGATATCTTCCTGCGCAAAGACATTAATGAAGAAACGGAAGTCATCTATTACCCCGACAATGTGAGCGTTGATCAGGTCATTTTATCGAAGAACACCTCCGAACATGGTCAGTTGGATTTGCTGTACCCTAGCATTGACTCGGAGAGTGAAATCCTTCCGGGCGAAAATCAAGTGTTTTACGACAACCGTACCCAAAATGTTGATTATTTGAATTCTTATTACTACCTGGAATCTCAGAAATTGAGCGACAATGTGGAAGATTTCACGTTCACACGCTCCATTGAGGAAGCGCTGGATAATAGCGCGAAAGTGTATACGTATTTCCCTACCTTGGCGAATAAAGTAAATGCTGGTGTCCAGGGAGGCTTATTTCTGATGTGGGCGAATGATGTGGTAGAAGATTTTACGACCAATATTTTGCGTAAGGACACCTTAGATAAAATTAGCGATGTTAGCGCCATCATCCCCTATATTGGCCCAGCACTGAATATCTCGAACTCTGTGCGTCGCGGAAACTTCACCGAAGCATTTGCGGTGACCGGGGTTACTATTCTGTTGGAAGCCTTTCCGGAGTTTACTATTCCGGCGCTGGGTGCGTTTGTGATTTATTCGAAAGTACAAGAACGCAATGAAATTATCAAAACCATCGATAATTGCCTGGAACAACGCATTAAACGCTGGAAGGATTCTTATGAATGGATGATGGGCACCTGGTTATCCCGTATTATCACACAGTTTAACAACATCTCGTATCAGATGTACGATTCACTGAACTACCAAGCAGGGGCGATCAAAGCCAAGATCGACTTAGAATACAAGAAATATTCAGGTAGCGATAAAGAGAATATTAAAAGCCAGGTTGAAAACCTGAAGAACTCTCTGGATGTCAAAATTTCAGAGGCTATGAACAACATTAACAAATTTATCCGCGAATGTAGCGTCACGTATCTGTTTAAAAACATGCTCCCGAAAGTGATTGATGAGCTCAACGAGTTTGATCGCAACACAAAGGCCAAACTGATTAACCTGATTGATAGTCACAATATTATTTTAGTCGGTGAAGTTGACAAGCTGAAGGCTAAGGTCAATAACAGCTTTCAGAACACTATTCCGTTTAATATTTTCTCCTATACGAACAATAGTCTGCTGAAAGACATTATCAACGAATACTTCAACAATATTAATGACAGCAAAATTCTGAGCCTGCAGAATCGTAAGAATACGCTGGTAGATACCAGTGGATATAATGCGGAAGTCTCAGAAGAGGGTGATGTACAGCTGAACCCGATCTTTCCGTTCGACTTTAAACTGGGGTCTAGTGGTGAAGATCGCGGTAAAGTGATCGTTACCCAAAACGAGAACATTGTGTATAACAGCATGTACGAGAGTTTCTCAATTTCTTTCTGGATTCGCATCAATAAATGGGTTTCTAATTTGCCTGGCTATACCATCATTGATAGCGTCAAAAACAACTCGGGCTGGTCGATTGGCATTATTAGCAACTTTCTGGTGTTTACCCTGAAACAGAATGAGGATTCGGAACAGAGCATTAACTTCTCCTACGACATCAGCAACAATGCACCAGGGTATAACAAATGGTTCTTCGTAACGGTGACGAACAATATGATGGGCAATATGAAAATCTACATTAACGGGAAACTTATCGACACCATTAAAGTGAAAGAGCTTACTGGGATCAATTTTAGTAAAACCATTACCTTTGAGATCAACAAAATTCCGGACACGGGTCTGATTACCTCCGATTCGGATAATATCAATATGTGGATTCGCGACTTTTATATCTTCGCCAAAGAACTTGATGGCAAAGATATCAACATTTTGTTTAATTCCCTGCAGTATACCAATGTCGTTAAGGACTATTGGGGCAATGATCTCCGCTACAATAAAGAATACTACATGGTTAACATCGACTATCTCAATCGCTACATGTATGCTAACTCGCGTCAAATTGTGTTTAACACACGTCGTAACAACAACGATTTTAACGAAGGTTATAAAATCATTATCAAACGGATCCGCGGCAATACGAACGATACTCGTGTTCGTGGCGGTGACATTCTGTATTTCGACATGACGATTAATAATAAAGCGTACAATCTGTTCATGAAGAACGAAACCATGTACGCCGATAACCATTCCACTGAAGATATCTACGCAATCGGACTTCGCGAACAGACCAAAGACATTAACGACAACATCATCTTTCAGATTCAACCGATGAATAATACCTACTACTATGCCTCCCAGATCTTCAAAAGTAATTTCAACGGCGAAAACATTTCAGGCATTTGCTCAATCGGCACTTATCGGTTCCGGTTAGGTGGTGATTGGTATCGTCACAACTACCTTGTTCCCACAGTGAAACAAGGCAACTATGCATCGCTCTTAGAAAGCACATCTACGCATTGGGGTTTTGTGCCAGTCAGTGAA
配列番号12 - ポリペプチド配列, rBoNT/C(0)
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配列番号13 - ヌクレオチド配列, rBoNT/E(0)
atgccgaaaatcaactctttcaactacaacgacccggttaacgaccgtaccatcctgtatatcaaaccgggtggttgccaggagttctacaaatctttcaacatcatgaaaaacatctggatcatcccggaacgtaacgttatcggtaccaccccgcaggacttccacccgccgacctctctgaaaaacggtgactcttcttactacgacccgaactacctccagtctgacgaagaaaaagaccgtttcctgaaaatcgttaccaaaatcttcaaccgtatcaacaacaacctgtctggtggtatcctgctggaagaactgtctaaagctaacccgtacctgggtaacgacaacaccccggacaaccagttccacatcggtgacgcttctgctgttgaaatcaaattctctaacggttctcaggacatcctgctgccgaacgttatcatcatgggtgctgaaccggacctgttcgaaaccaactcttctaacatctctctgcgtaacaactacatgccgtctaaccacggtttcggttctatcgctatcgttaccttctctccggaatactctttccgtttcaacgacaacagcatgaacgagttcatccaggacccggctctgaccctgatgcaccaactgatctactctctgcacggtctgtacggtgctaaaggtatcaccaccaaatacaccatcacccagaaacagaacccgctgatcaccaacatccgtggtaccaacatcgaagagttcctgaccttcggtggtaccgacctgaacatcatcacctctgctcagtctaacgacatctacaccaacctgctggctgactacaaaaaaatcgcttctaaactgtctaaagttcaggtttctaacccgctgctgaacccgtacaaagacgttttcgaagctaaatacggtctggacaaagacgcttctggtatctactctgttaacatcaacaaattcaacgacatcttcaaaaaactgtactctttcaccgagttcgacctggcgaccaaattccaggttaaatgccgtcagacctacatcggtcagtacaaatacttcaaactgtctaacctgctgaacgactctatctacaacatctctgaaggttacaacatcaacaacctgaaagttaacttccgtggtcagaacgctaacctgaacccgcgtatcatcaccccgatcaccggtcgtggtctggttaaaaaaatcatccgtttctgcAAGAATATTGTAAGCGTTAAAGGAATAAGAAAAAGTATCtgcatcgaaatcaacaacggtgaactgttcttcgttgcttctgaaaactcttacaacgacgacaacatcaacaccccgaaagaaatcgacgacaccgttacctctaacaacaactacgaaaacgacctggaccaggttatcctgaacttcaactctgaatctgctccgggtctgtctgacgaaaaactgaacctgaccatccagaacgacgcttacatcccgaaatacgactctaacggtacctctgacatcgaacagcacgacgttaacgaactgaacgttttcttctacctggacgctcagaaagttccggaaggtgaaaacaacgttaacctgacctcttctatcgacaccgctctgctggaacagccgaaaatctacaccttcttctcttctgagttcatcaacaacgttaacaaaccggttcaggctgctctgttcgtttcttggattcagcaggttctggttgacttcaccaccgaagctaaccagaaatctaccgttgacaaaatcgctgacatctctatcgttgttccgtacatcggtctggctctgaacatcggtaacgaagctcagaaaggtaacttcaaagacgctctggaactgctgggtgctggtatcctgctggagttcgaaccggaactgctgatcccgaccatcctggttttcaccatcaaatctttcctgggttcttctgacaacaaaaacaaagttatcaaagctatcaacaacgctctgaaagaacgtgacgaaaaatggaaagaagtttactctttcatcgtttctaactggatgaccaaaatcaacacccagttcaacaaacgtaaagaacagatgtaccaggctctccagaaccaggttaacgctatcaaaaccatcatcgaatctaaatacaactcttacaccctggaagaaaaaaacgaactgaccaacaaatacgacatcaaacagatcgaaaacgaactgaaccagaaagtttctatcgctatgaacaacatcgaccgtttcctgaccgaatcttctatctcttacctgatgaaactcatcaacgaagttaaaatcaacaaactgcgtgaatacgacgaaaacgttaaaacctacctgctgaactacatcatccagcacggttctatcctgggtgaatctcagcaggaactgaactctatggttaccgacaccctgaacaactctatcccgttcaaactgtcttcttacaccgacgacaaaatcctGATCTCTTACTTCAACAAATTCTTTAAAcgcATTAAGAGTTCATCGGTTctgaatATGCGGTACAAAAATGATAAAtatGTCGATACTTCTGGATATgatAGCAATATCAACATTAACGGCGACGTGTATAAATATccgACAAATAAAAACCAGTTTGGGATATATAACGACAAGctgTCGGAGGTCAATattTCTCAAAACGACtatATCattTACGATAATaaaTATAAAAACTTTAGCATTAGTtttTGGGTTcgtATACCTAATtatGACAATaaaattGTAAATGTGAATAACGAGTATACCATTATAAACTGTATGcgcGACAATAACAGTGGTTGGAAGGTATCGctgAACCATAATGAGATTATCTGGACCctgcagGATAATgcaGGTATAAACCAGAAACTGGCTTTTAACTATGGAAACGCAAATGGGATCTCAGATTACATTaataaaTGGatttttGTTaccATTACGAACGATcgcTTAGGCGACTCAAAACTTTATATTAATggcAATctgATAGATCAGAAATCAATCTTAAATTTGGGCAATATTCATGTCTCTgatAACATCTTGTTCAAGATCGTTAATTGCAGTTACACTcgtTATATTGGCATTCGTTACTTTAATATCTTCgataaaGAActgGACGAGACGGAAATCcagACTCTGTATTCAAACGAGCCCAATACTAATATATTGAAAGATTTTTGGGGTAACTATCTTTTATATGATAAAGAATACTATCTCCTGaatGTATTGAAGCCAAACAATTTCATAGATAGACGCAAGGATAGCACATTAAGTATCAACAATATCAGATCTACTATActgttaGCAAATCGCCTcTACTCCggtATTAAAGTGAAGATTcagCGGGTTAATAACTCCAGTACCAATGATAATCTGGTCCGTAAGAACGATCAGGTATACATCaatTTCGTCGCGAGCAAAACTcatCTCTTCCCGCTTTACGCCgatACAGCTACGACAAACAAGGAAAAAACCATAAAAATTTCCAGCTCCGGAAACAGATTCAATCAAGTAGTTGTAATGAACTCTGTGGGTaatAATTGTACGATGAACTTTaagAATAACAATGGGAACAATattGGACTTTTGGGCTTcAAAGCCGACACAGTGGTGGCGTCCACCTGGTATTACACGcacATGcggGACCATACGAATTCGAACGGTTGCTTCTGGAACTTTATCTCGGAAgaaCACGGGTGGCAAGAAAAA
配列番号14 - ポリペプチド配列, rBoNT/E(0)
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHQLIYSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
配列番号15 - ヌクレオチド配列, rBoNT/F(0)
ATGCCGGTGGTCATCAACAGCTTCAACTACAACGACCCAGTAAACGACGACACGATCCTGTATATGCAAATCCCGTATGAAGAGAAGAGCAAGAAGTACTATAAGGCCTTTGAAATCATGCGCAATGTGTGGATTATTCCGGAGCGTAATACGATTGGTACTGACCCAAGCGACTTCGATCCACCTGCGTCTTTGGAAAACGGCTCGTCCGCATATTACGACCCGAATTACCTGACCACCGATGCGGAGAAAGATCGTTATTTGAAAACCACCATCAAGCTGTTCAAACGCATTAACAGCAATCCGGCAGGTGAGGTCCTGCTGCAAGAGATTAGCTACGCAAAGCCTTATCTGGGTAATGAGCATACGCCTATTAACGAGTTTCACCCGGTTACCCGCACTACCAGCGTTAACATCAAGTCCTCGACCAACGTGAAGTCTAGCATTATCCTGAACCTGCTGGTTCTGGGTGCCGGTCCGGACATCTTCGAAAACTCTAGCTACCCGGTGCGTAAACTGATGGATAGCGGCGGTGTTTATGACCCGAGCAATGACGGTTTTGGCAGCATCAATATCGTGACGTTTAGCCCGGAGTACGAGTACACCTTCAATGATATCAGCGGTGGTTACAATTCTTCTACCGAGAGCTTCATCGCCGACCCGGCGATCAGCCTGGCACACCAACTGATCTATGCATTGCATGGCTTGTACGGTGCCCGTGGTGTGACGTATAAAGAGACTATCAAGGTTAAGCAGGCACCTCTGATGATTGCGGAAAAGCCGATTCGCCTGGAAGAGTTCCTGACCTTCGGCGGTCAAGATTTGAACATCATTACCTCGGCCATGAAAGAGAAAATCTATAACAATTTGCTGGCCAACTATGAAAAGATTGCAACGCGCTTGTCTCGTGTTAACTCCGCTCCGCCGGAATACGACATTAATGAGTACAAAGACTACTTTCAATGGAAATATGGCCTGGACAAAAATGCGGATGGTTCTTATACCGTGAATGAAAACAAATTCAATGAAATCTACAAGAAACTGTACAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCGAACAAGTTCAAAGTCAAATGTCGTAATACCTACTTCATCAAATATGGCTTCCTGAAAGTCCCGAACCTGCTGGACGATGACATCTATACCGTCAGCGAAGGCTTCAACATCGGCAATCTGGCCGTGAATAATCGTGGTCAGAACATCAAACTGAATCCGAAAATCATTGACTCCATCCCAGACAAGGGCCTGGTTGAGAAAATCGTGAAGTTCTGCAAAAGCGTTATTCCGCGTAAAGGTACGAAAGCACCGCCTCGCCTGTGCATTCGCGTTAACAACCGTGAGTTGTTCTTTGTGGCATCTGAAAGCAGCTACAACGAGAACGACATCAACACCCCTAAAGAAATTGATGATACCACGAACCTGAATAACAATTATCGCAACAATCTGGACGAGGTGATCCTGGATTACAATTCGGAAACCATTCCGCAAATTAGCAATCAGACGCTGAACACCCTGGTTCAGGACGATAGCTACGTTCCGCGTTACGACTCCAATGGTACTAGCGAGATTGAAGAACACAACGTAGTGGACTTGAACGTTTTCTTTTATCTGCACGCCCAGAAGGTTCCGGAGGGCGAAACCAATATTAGCCTGACCAGCTCGATCGACACCGCGCTGTCTGAGGAGAGCCAAGTCTACACCTTTTTCAGCAGCGAGTTTATCAACACTATTAACAAGCCAGTTCATGCTGCATTGTTTATCTCTTGGATTAACCAGGTGATTCGCGACTTTACGACGGAGGCGACCCAGAAGTCTACCTTCGACAAAATTGCAGACATCTCCCTGGTCGTCCCATACGTCGGCCTGGCGTTGAATATTGGCAATGAAGTTCAAAAAGAGAACTTCAAAGAAGCGTTCGAGCTGCTGGGTGCAGGCATCCTGCTGGAGTTCGTGCCGGAACTGTTGATCCCGACCATCCTGGTGTTCACCATTAAGAGCTTCATTGGATCCTCCGAGAATAAGAACAAGATCATCAAGGCGATCAATAACAGCCTGATGGAGCGTGAAACGAAGTGGAAAGAAATCTATAGCTGGATTGTTAGCAATTGGCTGACTCGTATTAACACGCAATTCAACAAGCGTAAAGAGCAAATGTACCAAGCCCTGCAAAACCAAGTTGACGCCATCAAAACGGTAATTGAATACAAGTACAACAATTACACGAGCGATGAGCGCAACCGCCTGGAAAGCGAATACAACATCAACAACATTCGCGAAGAATTGAACAAGAAAGTGAGCCTGGCGATGGAGAACATTGAGCGTTTTATCACCGAAAGCAGCATCTTTTACCTGATGAAATTGATTAATGAGGCGAAAGTCTCGAAACTGCGTGAGTACGACGAAGGTGTGAAAGAGTATCTGCTGGATTACATTAGCGAGCACCGTAGCATCTTGGGTAACTCGGTTCAGGAGCTGAACGATCTGGTGACCTCTACCCTGAACAATAGCATCCCGTTCGAACTGAGCAGCTATACCAATGACAAGATTCTGATTCTGTATTTCAATAAACTGTATAAGAAGATCAAGGATAACAGCATTCTGGATATGCGTTACGAAAACAATAAGTTTATCGACATTTCTGGTTACGGCAGCAACATTTCCATCAATGGCGATGTCTACATCTACAGCACCAATCGCAACCAGTTCGGCATCTACTCTAGCAAACCGAGCGAAGTTAACATCGCACAGAACAATGATATTATTTATAACGGTCGTTATCAAAACTTCTCTATCAGCTTTTGGGTCCGTATCCCGAAGTACTTCAATAAAGTCAATCTGAATAATGAATACACGATCATCGACTGCATTCGCAATAACAACAGCGGTTGGAAAATCAGCCTGAATTACAACAAAATTATTTGGACCCTGCAAGATACGGCGGGTAACAATCAGAAACTGGTGTTTAACTACACGCAAATGATCAGCATTTCTGACTATATCAACAAGTGGATCTTTGTTACCATCACCAATAATCGTCTGGGCAATAGCCGTATTTACATCAACGGTAACCTGATTGATGAGAAAAGCATCAGCAACCTGGGCGATATTCACGTCAGCGACAACATTCTGTTCAAAATTGTTGGTTGTAACGATACCCGTTACGTCGGCATCCGTTATTTCAAGGTTTTCGATACGGAGCTGGGTAAAACGGAAATCGAAACGTTGTACTCCGATGAACCAGATCCGAGCATTCTGAAGGACTTTTGGGGTAACTACTTGCTGTACAATAAACGTTACTATCTGCTGAATCTGTTGCGCACCGACAAGAGCATTACCCAAAACAGCAATTTCCTGAACATTAATCAGCAACGCGGCGTATACCAAAAACCGAACATCTTCAGCAATACGCGCCTGTATACTGGTGTTGAAGTGATCATTCGTAAGAACGGTAGCACCGACATTAGCAACACGGACAATTTCGTCCGTAAGAATGACCTGGCGTACATTAACGTCGTGGACCGTGATGTCGAGTATCGTCTGTACGCAGACATCAGCATTGCGAAACCGGAAAAGATTATCAAGCTGATCCGTACCAGCAACAGCAACAACAGCCTGGGTCAGATCATTGTGATGGACAGCATTGGTAATAACTGCACGATGAACTTCCAGAACAACAATGGTGGTAATATCGGTCTGCTGGGTTTTCACAGCAATAATCTGGTTGCTTCCAGCTGGTACTACAATAACATTCGTAAAAACACGTCTAGCAATGGTTGTTTTTGGAGCTTTATCAGCAAAGAGCACGGCTGGCAAGAAAAT
配列番号16 - ポリペプチド配列, rBoNT/F(0)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHQLIYALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN
配列番号17 - ヌクレオチド配列, rBoNT/A(0) (Hisタグ付加)
ATGCCGTTTGTGAACAAGCAGTTCAACTATAAAGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAAAGCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACACCAGCTGATTTATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCCATTAATCCGAATCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCCTATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGAGTTTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCAGCAAAACCAAAAGTCTGGATAAAGGCTACAATAAAGCCCTGAATGATCTGTGCATTAAGGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAGGATAATTTCACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTCGATAATGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCACTGACCAATAGCGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTTAACAAAGCAACCGAAGCAGCCATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTTTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATTACCATCATCATCCCGTATATCGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTGAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATCGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTGTACAAGTATATCGTGACCAATTGGCTGGCAAAAGTTAACACCCAGATTGACCTGATTCGCAAGAAGATGAAAGAAGCACTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAATAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCAGCAAACTGAACGAAAGCATCAACAAAGCCATGATTAACATTAACAAATTTCTGAACCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGTCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCCCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGTCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTGAACAACACCCTGAGTACCGATATTCCTTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGTCTGCTGTCAACCTTTACCGAATACATTAAGAACATCATCAACACCAGCATTCTGAACCTGCGTTATGAAAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCCAGCAAAATCAATATAGGCAGCAAGGTTAACTTCGACCCGATTGACAAAAATCAGATACAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATTGAGGTGATCCTGAAAAACGCCATTGTGTATAATAGCATGTACGAGAATTTCTCGACCAGCTTTTGGATTCGTATCCCGAAATACTTTAATAGCATCAGCCTGAACAACGAGTACACCATTATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGCTGGAAAGTTAGCCTGAATTATGGCGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCCAAGAAATCAAACAGCGTGTGGTTTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAATAATCGCCTGAATAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGTCTGATTGACCAGAAACCGATTAGTAATCTGGGTAATATTCATGCGAGCAACAACATCATGTTTAAACTGGATGGTTGTCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAGTACTTCAACCTGTTCGATAAAGAGTTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTATGATAACCAGAGCAACAGCGGTATTCTGAAGGATTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAATCTGTACGACCCGAATAAATACGTGGATGTGAATAATGTTGGCATCCGTGGTTATATGTACCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTATGACCACAAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGAACCAAATTCATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGTGCCCTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTGATGAAAAGCAAAAATGATCAGGGCATCACCAACAAGTGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAATATTGCGAAACTGGTTGCAAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGGAAAACCTGTATTTTCAAGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA
配列番号18 - ポリペプチド配列, rBoNT/A(0) (Hisタグ付加)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号19 - ヌクレオチド配列, rLHN/A (Hisタグ付加)
ATGCCGTTTGTGAACAAGCAGTTCAACTATAAAGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTCGAATTTTACAAACTGCTGTGTGTTCGTGGCATTATTACCAGCAAAACCAAAAGTCTGGATAAAGGCTACAATAAAGCCCTGAATGATCTGTGCATTAAGGTGAATAATTGGGACCTGTTTTTTAGCCCGAGCGAGGATAATTTCACCAACGATCTGAACAAAGGCGAAGAAATTACCAGCGATACCAATATTGAAGCAGCCGAAGAAAACATTAGCCTGGATCTGATTCAGCAGTATTATCTGACCTTCAACTTCGATAATGAGCCGGAAAATATCAGCATTGAAAACCTGAGCAGCGATATTATTGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAATATTGAACGTTTTCCGAACGGCAAAAAATACGAGCTGGATAAATACACCATGTTCCATTATCTGCGTGCCCAAGAATTTGAACATGGTAAAAGCCGTATTGCACTGACCAATAGCGTTAATGAAGCACTGCTGAACCCGAGCCGTGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGATTACGTGAAAAAGGTTAACAAAGCAACCGAAGCAGCCATGTTTTTAGGTTGGGTTGAACAGCTGGTTTATGATTTCACCGATGAAACCAGCGAAGTTAGCACCACCGATAAAATTGCAGATATTACCATCATCATCCCGTATATCGGTCCGGCACTGAATATTGGCAATATGCTGTATAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATTTTTAGCGGTGCAGTTATTCTGCTGGAATTTATTCCGGAAATTGCCATTCCGGTTCTGGGCACCTTTGCACTGGTGAGCTATATTGCAAATAAAGTTCTGACCGTGCAGACCATCGATAATGCACTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTGTACAAGTATATCGTGACCAATTGGCTGGCAAAAGTTAACACCCAGATTGACCTGATTCGCAAGAAGATGAAAGAAGCACTGGAAAATCAGGCAGAAGCAACCAAAGCCATTATCAACTATCAGTATAACCAGTACACCGAAGAAGAGAAAAATAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCAGCAAACTGAACGAAAGCATCAACAAAGCCATGATTAACATTAACAAATTTCTGAACCAGTGCAGCGTGAGCTATCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGTGTGAAACGTCTGGAAGATTTTGATGCAAGCCTGAAAGATGCCCTGCTGAAATATATCTATGATAATCGTGGCACCCTGATTGGTCAGGTTGATCGTCTGAAAGATAAAGTGAACAACACCCTGAGTACCGATATTCCTTTTCAGCTGAGCAAATATGTGGATAATCAGCGTCTGCTGTCAACCGAAAATCTGTATTTCCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA
配列番号20 - ポリペプチド配列, rLHN/A (Hisタグ付加)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号21 - ヌクレオチド配列, rHC/A (Hisタグ付加)
atgcatcatcaccatcaccacGAAAATCTATACTTCCAAGGAaaaaacatcatcaatactagcattctgaacctgcgttacgagagcaatcatctgattgatctgagccgttatgcaagcaagatcaacatcggtagcaaggtcaattttgacccgatcgataagaaccagatccagctgtttaatctggaatcgagcaaaattgaggttatcctgaaaaacgccattgtctacaactccatgtacgagaatttctccaccagcttctggattcgcatcccgaaatacttcaacagcattagcctgaacaacgagtatactatcatcaactgtatggagaacaacagcggttggaaggtgtctctgaactatggtgagatcatttggaccttgcaggacacccaagagatcaagcagcgcgtcgtgttcaagtactctcaaatgatcaacatttccgattacattaatcgttggatcttcgtgaccattacgaataaccgtctgaataacagcaagatttacatcaatggtcgcttgatcgatcagaaaccgattagcaacctgggtaatatccacgcaagcaacaacattatgttcaaattggacggttgccgcgatacccatcgttatatctggatcaagtatttcaacctgtttgataaagaactgaatgagaaggagatcaaagatttgtatgacaaccaatctaacagcggcattttgaaggacttctggggcgattatctgcaatacgataagccgtactatatgctgaacctgtatgatccgaacaaatatgtggatgtcaataatgtgggtattcgtggttacatgtatttgaagggtccgcgtggcagcgttatgacgaccaacatttacctgaactctagcctgtaccgtggtacgaaattcatcattaagaaatatgccagcggcaacaaagataacattgtgcgtaataacgatcgtgtctacatcaacgtggtcgtgaagaataaagagtaccgtctggcgaccaacgcttcgcaggcgggtgttgagaaaattctgagcgcgttggagatccctgatgtcggtaatctgagccaagtcgtggttatgaagagcaagaacgaccagggtatcactaacaagtgcaagatgaacctgcaagacaacaatggtaacgacatcggctttattggtttccaccagttcaacaatattgctaaactggtagcgagcaattggtacaatcgtcagattgagcgcagcagccgtactttgggctgtagctgggagtttatcccggtcgatgatggttggggcgaacgtccgctgtaa
配列番号22 - ポリペプチド配列, rHC/A (Hisタグ付加)
MHHHHHHENLYFQGKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
配列番号23 - ヌクレオチド配列, rLC/A (Hisタグ付加)
ATGCCGTTTGTGAACAAGCAGTTCAACTATAAAGATCCGGTTAATGGTGTGGATATCGCCTATATCAAAATTCCGAATGCAGGTCAGATGCAGCCGGTTAAAGCCTTTAAAATCCATAACAAAATTTGGGTGATTCCGGAACGTGATACCTTTACCAATCCGGAAGAAGGTGATCTGAATCCGCCTCCGGAAGCAAAACAGGTTCCGGTTAGCTATTATGATAGCACCTATCTGAGCACCGATAACGAGAAAGATAACTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGCATTTATAGTACCGATCTGGGTCGTATGCTGCTGACCAGCATTGTTCGTGGTATTCCGTTTTGGGGTGGTAGCACCATTGATACCGAACTGAAAGTTATTGACACCAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAACTGAATCTGGTTATTATTGGTCCGAGCGCAGATATCATTCAGTTTGAATGTAAATCCTTTGGCCACGAAGTTCTGAATCTGACCCGTAATGGTTATGGTAGTACCCAGTATATTCGTTTCAGTCCGGATTTTACCTTTGGCTTTGAAGAAAGCCTGGAAGTTGATACAAATCCGCTGTTAGGTGCAGGTAAATTTGCAACCGATCCGGCAGTTACCCTGGCACATGAACTGATTCATGCCGGTCATCGTCTGTATGGTATTGCAATTAATCCGAACCGTGTGTTCAAAGTGAATACCAACGCATATTATGAAATGAGCGGTCTGGAAGTGTCATTTGAAGAACTGCGTACCTTTGGTGGTCATGATGCCAAATTTATCGATAGCCTGCAAGAAAATGAATTTCGCCTGTACTACTATAACAAATTCAAGGATATTGCGAGCACCCTGAATAAAGCCAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCAAGCCTGCAGTATATGAAAAATGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGATACCAGCGGTAAATTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGATAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTATACCGAAGATAACTTCGTGAAGTTTTTCAAAGTGCTGAACCGCAAAACCTACCTGAACTTTGATAAAGCCGTGTTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTGAACTATACCATCTATGATGGTTTTAACCTGCGCAATACCAATCTGGCAGCAAACTTTAATGGTCAGAACACCGAAATCAACAACATGAACTTTACCAAACTGAAGAACTTCACCGGTCTGTTTGAAGAGAATCTGTATTTCCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA
配列番号24 - ポリペプチド配列, rLC/A (Hisタグ付加)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号25 - ヌクレオチド配列, rBoNT/FA(0) (Hisタグ付加)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATGATGATCCGGTGAACGATAACACCATCATTTATATCCGTCCGCCTTATTATGAAACCAGCAACACCTATTTCAAAGCCTTCCAGATTATGGATAACGTGTGGATTATTCCGGAACGTTATCGTCTGGGTATTGATCCGAGCCTGTTTAATCCGCCTGTTAGCCTGAAAGCAGGTAGTGATGGTTATTTTGATCCGAATTATCTGAGCACCAACACCGAGAAAAACAAATACCTGCAGATTATGATCAAGCTGTTCAAACGCATTAATAGCAAACCGGCAGGTCAGATTCTGCTGGAAGAAATCAAAAATGCAATTCCGTATCTGGGCAACAGCTATACCCAAGAAGAACAGTTTACCACCAATAATCGTACCGTGAGCTTTAATGTTAAACTGGCCAATGGTAATATCGTTCAGCAGATGGCAAATCTGATTATTTGGGGTCCGGGTCCTGATCTGACCACAAATAAAACCGGTGGTATCATCTATAGCCCGTATCAGAGCATGGAAGCAACCCCGTATAAAGATGGTTTTGGTAGCATTATGACCGTGGAATTTAGTCCGGAATATGCAACCGCCTTTAACGATATTTCAATTGCAAGCCATAGTCCGTCGCTGTTTATCAAAGATCCGGCACTGATTCTGATGCACCAGCTGATTTATGTTCTGCATGGTCTGTATGGCACCTATATCACCGAATACAAAATTACCCCGAATGTGGTTCAGAGCTATATGAAAGTTACCAAACCGATTACCAGCGCAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCGTGATCGCAATATTGTTCCGCAGAGCATTCAGAGCCAGCTGTATAACAAAGTTCTGAGCGATTATAAACGTATTGCCAGCCGTCTGAATAAAGTTAATACCGCAACCGCACTGATCAACATCGATGAATTCAAAAACCTGTACGAGTGGAAATACCAGTTTGCCAAAGATAGCAATGGTGTGTATAGCGTGGATCTGAACAAATTTGAGCAGCTGTACAAAAAAATCTATAGCTTCACCGAATTCAACCTGGCCTATGAGTTTAAAATCAAAACCCGTCTGGGTTATCTGGCCGAAAATTTTGGTCCGTTTTATCTGCCGAATCTGCTGGATGATAGCATTTATACCGAAGTGGATGGTTTTAACATTGGTGCACTGAGCATTAACTATCAGGGTCAGAATATTGGCAGCGATATCAACAGCATCAAAAAACTGCAAGGTCAGGGTGTTGTTAGCCGTGTTGTTCGTCTGTGTAGCAATAGCAATACCAAAAACAGCCTGTGCATTACCGTTAATAATCGCGACCTGTTTTTTATCGCAAGCCAAGAAAGCTATGGCGAGAATACCATTAACACCTATAAAGAGATTGACGATACCACCACACTGGATCCGAGCTTTGAAGATATTCTGGATAAAGTGATCCTGAACTTCAACGAACAGGTTATTCCGCAGATGCCGAATCGTAATGTTAGCACCGATATTCAGAAAGACAACTACATCCCGAAATACGATTATAACCGCACCGACATTATCGATAGCTATGAAGTTGGTCGCAACTACAACACCTTTTTCTATCTGAATGCCCAGAAATTTAGCCCGAACGAAAGCAATATTACCCTGACCAGCAGCTTTGATACAGGTCTGTTAGAAGGTAGCAAAGTGTATACCTTTTTCAGCAGCGATTTCATTAACAACATCAACAAACCGGTTCAGGCCCTGCTGTTTATTGAATGGGTTAAACAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCAAAACCTCAACCGTTGATAAACTGAAAGATATTAGCCTGGTGGTGCCGTATATTGGTCTGGCACTGAATATTGGTGATGAGATCTACAAACAGCATTTTGCAGAAGCAGTTGAACTGGTTGGTGCAGGTCTGCTGCTGGAATTTTCACCGGAATTTCTTATTCCGACGCTGCTGATTTTTACCATCAAAGGTTATCTGACCGGTAGCATTCGCGATAAAGACAAAATCATTAAAACCCTGGATAACGCCCTGAATGTTCGTGATCAGAAATGGAAAGAACTGTATCGTTGGGTTGTTAGCAAATGGCTGACCACCATTAATACGCAGTTCAACAAACGCAAAGAACAAATGTACAAAGCCCTGAAAAATCAGGCCACCGCCATTAAAAAGATCATCGAGAACAAATATAACAACTATACCACCGATGAAAAAAGCAAGATCGATAGCAGCTATAACATCAACGAAATTGAACGCACCCTGAACGAAAAAATCAATCTGGCCATGAAAAACATCGAGCAGTTTATTACCGAAAGCAGCATTGCCTATCTGATCAATATCATCAACAACGAAACGATCCAGAAACTGAAAAGCTATGATGACCTGGTTCGTCGTTATCTGCTGGGTTATATTCGTAATCATAGCAGCATTCTGGGCAATAGCGTTGAAGAACTGAATTCCAAAGTGAACAACCATCTGGATAATGGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGTTATACCAATGATAGCCTGCTGATCCGCTACTTCAATAAAAACTATGGCGAACTGAAGTACAACTGCATTCTGAACATCAAATATGAGATGGATCGTGACAAACTGGTTGATAGCAGCGGTTATCGTAGCCGTATCAATATTGGTACAGGCGTCAAATTTAGCGAGATCGATAAAAATCAAGTGCAGCTGAGCAATCTGGAATCCAGCAAAATTGAAGTCATTCTGAATAACGGCGTCATCTATAACAGCATGTATGAAAACTTTTCGACCAGCTTTTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTCGCAACATCAATAACGAGTACAAGATCATCAGCTGTATGCAGAATAATAGCGGTTGGGAAGTGAGCCTGAATTTTAGCAATATGAACTCGAAAATCATCTGGACCCTGCAGGATACCGAAGGTATCAAAAAAACCGTTGTGTTTCAGTACACCCAGAACATTAACATTAGCGACTATATCAACCGCTGGATCTTTGTGACCATTACAAATAATCGTCTGAGCAACAGCAAAATCTACATTAATGGTCGCCTGATCAACGAAGAAAGCATTAGCGATCTGGGTAATATCCATGCCAGCAACAACATTATGTTTAAACTGGATGGTTGCCGTGATCCGCATCGTTATATCTGGATTAAATACTTTAACCTGTTTGACAAAGAGCTGAACAAGAAAGAAATTAAAGATCTGTACGACAACCAGAGCAATAGCGGTATTCTGAAAGATTTCTGGGGTGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAATCTGTATGACCCGAATAAGTATCTGGATGTGAATAATGTTGGCATCCGTGGCTATATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGTCGTATTGTGACCACCAACATTTATCTGAATAGCACCCTGTATATGGGCACCAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTATATTAACGTGGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGCGCAGTTGAAATCCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTGATGAAAAGCGAAAATGATCAGGGCATTCGCAACAAGTGTAAAATGAATCTGCAAGACAATAACGGCAACGATATTGGCTTTATCGGCTTTCACCAGTTTAATAACATTGCAAAACTGGTGGCCAGCAACTGGTATAACCGTCAGATTGGTAAAGCAAGCCGTACCTTTGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCGGTTGATGATGGTTGGGGTGAAAGCAGCCTGGAAAATCTGTATTTCCAGGGTGCCAGTCATCATCACCACCATCACCATCACTGA
配列番号26 - ポリペプチド配列, rBoNT/FA(0) (Hisタグ付加)
MPVVINSFNYDDPVNDNTIIYIRPPYYETSNTYFKAFQIMDNVWIIPERYRLGIDPSLFNPPVSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNKYLQIMIKLFKRINSKPAGQILLEEIKNAIPYLGNSYTQEEQFTTNNRTVSFNVKLANGNIVQQMANLIIWGPGPDLTTNKTGGIIYSPYQSMEATPYKDGFGSIMTVEFSPEYATAFNDISIASHSPSLFIKDPALILMHQLIYVLHGLYGTYITEYKITPNVVQSYMKVTKPITSAEFLTFGGRDRNIVPQSIQSQLYNKVLSDYKRIASRLNKVNTATALINIDEFKNLYEWKYQFAKDSNGVYSVDLNKFEQLYKKIYSFTEFNLAYEFKIKTRLGYLAENFGPFYLPNLLDDSIYTEVDGFNIGALSINYQGQNIGSDINSIKKLQGQGVVSRVVRLCSNSNTKNSLCITVNNRDLFFIASQESYGENTINTYKEIDDTTTLDPSFEDILDKVILNFNEQVIPQMPNRNVSTDIQKDNYIPKYDYNRTDIIDSYEVGRNYNTFFYLNAQKFSPNESNITLTSSFDTGLLEGSKVYTFFSSDFINNINKPVQALLFIEWVKQVIRDFTTEATKTSTVDKLKDISLVVPYIGLALNIGDEIYKQHFAEAVELVGAGLLLEFSPEFLIPTLLIFTIKGYLTGSIRDKDKIIKTLDNALNVRDQKWKELYRWVVSKWLTTINTQFNKRKEQMYKALKNQATAIKKIIENKYNNYTTDEKSKIDSSYNINEIERTLNEKINLAMKNIEQFITESSIAYLINIINNETIQKLKSYDDLVRRYLLGYIRNHSSILGNSVEELNSKVNNHLDNGIPFELSSYTNDSLLIRYFNKNYGELKYNCILNIKYEMDRDKLVDSSGYRSRINIGTGVKFSEIDKNQVQLSNLESSKIEVILNNGVIYNSMYENFSTSFWIRIPKYFRNINNEYKIISCMQNNSGWEVSLNFSNMNSKIIWTLQDTEGIKKTVVFQYTQNINISDYINRWIFVTITNNRLSNSKIYINGRLINEESISDLGNIHASNNIMFKLDGCRDPHRYIWIKYFNLFDKELNKKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYLDVNNVGIRGYMYLKGPRGRIVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSAVEIPDVGNLSQVVVMKSENDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSLENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号27 - ヌクレオチド配列, rLHN/FA (Hisタグ付加)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATGATGATCCGGTGAACGATAACACCATCATTTATATCCGTCCGCCTTATTATGAAACCAGCAACACCTATTTCAAAGCCTTCCAGATTATGGATAACGTGTGGATTATTCCGGAACGTTATCGTCTGGGTATTGATCCGAGCCTGTTTAATCCGCCTGTTAGCCTGAAAGCAGGTAGTGATGGTTATTTTGATCCGAATTATCTGAGCACCAACACCGAGAAAAACAAATACCTGCAGATTATGATCAAGCTGTTCAAACGCATTAATAGCAAACCGGCAGGTCAGATTCTGCTGGAAGAAATCAAAAATGCAATTCCGTATCTGGGCAACAGCTATACCCAAGAAGAACAGTTTACCACCAATAATCGTACCGTGAGCTTTAATGTTAAACTGGCCAATGGTAATATCGTTCAGCAGATGGCAAATCTGATTATTTGGGGTCCGGGTCCTGATCTGACCACAAATAAAACCGGTGGTATCATCTATAGCCCGTATCAGAGCATGGAAGCAACCCCGTATAAAGATGGTTTTGGTAGCATTATGACCGTGGAATTTAGTCCGGAATATGCAACCGCCTTTAACGATATTTCAATTGCAAGCCATAGTCCGTCGCTGTTTATCAAAGATCCGGCACTGATTCTGATGCATGAACTGATTCATGTTCTGCATGGTCTGTATGGCACCTATATTACCGAATACAAAATTACCCCGAATGTGGTGCAGAGCTATATGAAAGTTACCAAACCGATTACCAGCGCAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCGTGATCGCAATATTGTTCCGCAGAGCATTCAGAGCCAGCTGTATAACAAAGTTCTGAGCGATTATAAACGTATTGCCAGCCGTCTGAATAAAGTTAATACCGCAACCGCACTGATCAACATCGATGAATTCAAAAACCTGTACGAGTGGAAATACCAGTTTGCCAAAGATAGCAATGGTGTGTATAGCGTGGATCTGAACAAATTTGAGCAGCTGTACAAAAAAATCTATAGCTTCACCGAATTCAACCTGGCCTATGAGTTTAAAATCAAAACCCGTCTGGGTTATCTGGCCGAAAATTTTGGTCCGTTTTATCTGCCGAATCTGCTGGATGATAGCATTTATACCGAAGTGGATGGTTTTAACATTGGTGCACTGAGCATTAACTATCAGGGTCAGAATATTGGCAGCGATATCAACAGCATCAAAAAACTGCAAGGTCAGGGTGTTGTTAGCCGTGTTGTTCGTCTGTGTAGCAATAGCAATACCAAAAACAGCCTGTGCATTACCGTTAATAATCGCGACCTGTTTTTTATCGCAAGCCAAGAAAGCTATGGCGAGAATACCATTAACACCTATAAAGAGATTGACGATACCACCACACTGGATCCGAGCTTTGAAGATATTCTGGATAAAGTGATCCTGAACTTCAACGAACAGGTTATTCCGCAGATGCCGAATCGTAATGTTAGCACCGATATTCAGAAAGACAACTACATCCCGAAATACGATTATAACCGCACCGACATTATCGATAGCTATGAAGTTGGTCGCAACTACAACACCTTTTTCTATCTGAATGCCCAGAAATTTAGCCCGAACGAAAGCAATATTACCCTGACCAGCAGCTTTGATACAGGTCTGTTAGAAGGTAGCAAAGTGTATACCTTTTTCAGCAGCGATTTCATTAACAACATCAACAAACCGGTTCAGGCCCTGCTGTTTATTGAATGGGTTAAACAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCAAAACCTCAACCGTTGATAAACTGAAAGATATTAGCCTGGTGGTGCCGTATATTGGTCTGGCACTGAATATTGGTGATGAGATCTACAAACAGCATTTTGCAGAAGCAGTTGAACTGGTTGGTGCAGGTCTGCTGCTGGAATTTTCACCGGAATTTCTTATTCCGACGCTGCTGATTTTTACCATCAAAGGTTATCTGACCGGTAGCATTCGCGATAAAGACAAAATCATTAAAACCCTGGATAACGCCCTGAATGTTCGTGATCAGAAATGGAAAGAACTGTATCGTTGGGTTGTTAGCAAATGGCTGACCACCATTAATACGCAGTTCAACAAACGCAAAGAACAAATGTACAAAGCCCTGAAAAATCAGGCCACCGCCATTAAAAAGATCATCGAGAACAAATATAACAACTATACCACCGATGAAAAAAGCAAGATCGATAGCAGCTATAACATCAACGAAATTGAACGCACCCTGAACGAAAAAATCAATCTGGCCATGAAAAACATCGAGCAGTTTATTACAGAAAGCAGCATTGCCTACCTGATCAATATCATCAACAACGAAACCATTCAGAAACTGAAAAGCTATGATGACCTGGTTCGTCGTTATCTGCTGGGTTATATTCGTAATCATAGCAGCATTCTGGGCAATAGCGTTGAAGAACTGAATTCCAAAGTGAACAACCATCTGGATAATGGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGTTATACCAATGATAGCCTGCTGATCCGCTACTTCAATAAAAACTATGGCGAAGAGAACCTGTATTTCCAGGGTGCCAGTCATCATCACCACCATCACCATCACTGA
配列番号28 - ポリペプチド配列, rLHN/FA (Hisタグ付加)
MPVVINSFNYDDPVNDNTIIYIRPPYYETSNTYFKAFQIMDNVWIIPERYRLGIDPSLFNPPVSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNKYLQIMIKLFKRINSKPAGQILLEEIKNAIPYLGNSYTQEEQFTTNNRTVSFNVKLANGNIVQQMANLIIWGPGPDLTTNKTGGIIYSPYQSMEATPYKDGFGSIMTVEFSPEYATAFNDISIASHSPSLFIKDPALILMHELIHVLHGLYGTYITEYKITPNVVQSYMKVTKPITSAEFLTFGGRDRNIVPQSIQSQLYNKVLSDYKRIASRLNKVNTATALINIDEFKNLYEWKYQFAKDSNGVYSVDLNKFEQLYKKIYSFTEFNLAYEFKIKTRLGYLAENFGPFYLPNLLDDSIYTEVDGFNIGALSINYQGQNIGSDINSIKKLQGQGVVSRVVRLCSNSNTKNSLCITVNNRDLFFIASQESYGENTINTYKEIDDTTTLDPSFEDILDKVILNFNEQVIPQMPNRNVSTDIQKDNYIPKYDYNRTDIIDSYEVGRNYNTFFYLNAQKFSPNESNITLTSSFDTGLLEGSKVYTFFSSDFINNINKPVQALLFIEWVKQVIRDFTTEATKTSTVDKLKDISLVVPYIGLALNIGDEIYKQHFAEAVELVGAGLLLEFSPEFLIPTLLIFTIKGYLTGSIRDKDKIIKTLDNALNVRDQKWKELYRWVVSKWLTTINTQFNKRKEQMYKALKNQATAIKKIIENKYNNYTTDEKSKIDSSYNINEIERTLNEKINLAMKNIEQFITESSIAYLINIINNETIQKLKSYDDLVRRYLLGYIRNHSSILGNSVEELNSKVNNHLDNGIPFELSSYTNDSLLIRYFNKNYGEENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号29 - ヌクレオチド配列, rHC/FA (Hisタグ付加)
ATGCTGAAGTATAACTGCATCCTGAACATCAAATATGAGATGGATCGTGATAAACTGGTTGATAGCAGCGGTTATCGTAGCCGTATCAATATTGGCACCGGTGTGAAATTTAGCGAGATCGATAAAAATCAGGTGCAGCTGAGCAATCTGGAAAGCAGCAAAATTGAAGTGATTCTGAATAACGGCGTGATCTACAATAGCATGTATGAAAACTTTTCGACCAGCTTCTGGATTCGCATTCCGAAATACTTTCGCAACATCAACAACGAGTACAAGATTATCAGCTGTATGCAGAATAATAGCGGTTGGGAAGTTAGCCTGAATTTCAGCAATATGAACAGCAAAATCATTTGGACCCTGCAGGATACCGAAGGTATCAAAAAAACCGTTGTGTTTCAGTACACCCAGAACATTAACATCAGCGATTACATTAACCGCTGGATCTTTGTGACCATTACCAATAATCGTCTGAGCAACAGCAAGATCTATATTAACGGTCGCCTGATTAACGAAGAGAGCATTAGCGATCTGGGTAATATTCATGCCAGCAACAACATCATGTTTAAACTGGATGGTTGTCGTGATCCGCATCGTTATATTTGGATCAAATACTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAACAAAAAAGAAATCAAAGACCTGTATGATAACCAGAGCAATAGCGGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGTGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTACATGCTGAATCTGTACGATCCGAACAAATATCTGGATGTGAATAATGTGGGTATCCGTGGCTATATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGTCGTATTGTTACCACCAACATTTATCTGAATAGCACCCTGTATATGGGCACCAAATTCATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTATATCAATGTGGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGTCTGGCCACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGCGCAGTTGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTTATGAAAAGCGAAAATGATCAGGGCATTCGCAACAAATGCAAAATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAACGATATTGGTTTTATTGGCTTCCACCAGTTCAACAACATTGCAAAACTGGTGGCGAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGGTAAAGCAAGCCGTACCTTTGGTTGTAGCTGGGAATTTATTCCGGTTGATGATGGTTGGGGTGAAAGCAGCCTGGAAAATCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCACCATCACCATCATTAA
配列番号30 - ポリペプチド配列, rHC/FA (Hisタグ付加)
MLKYNCILNIKYEMDRDKLVDSSGYRSRINIGTGVKFSEIDKNQVQLSNLESSKIEVILNNGVIYNSMYENFSTSFWIRIPKYFRNINNEYKIISCMQNNSGWEVSLNFSNMNSKIIWTLQDTEGIKKTVVFQYTQNINISDYINRWIFVTITNNRLSNSKIYINGRLINEESISDLGNIHASNNIMFKLDGCRDPHRYIWIKYFNLFDKELNKKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYLDVNNVGIRGYMYLKGPRGRIVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSAVEIPDVGNLSQVVVMKSENDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSLENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号31 - ヌクレオチド配列, rLC/FA (Hisタグ付加)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATGATGATCCGGTGAACGATAACACCATCATTTATATCCGTCCGCCTTATTATGAAACCAGCAACACCTATTTCAAAGCCTTCCAGATTATGGATAACGTGTGGATTATTCCGGAACGTTATCGTCTGGGTATTGATCCGAGCCTGTTTAATCCGCCTGTTAGCCTGAAAGCAGGTAGTGATGGTTATTTTGATCCGAATTATCTGAGCACCAACACCGAGAAAAACAAATACCTGCAGATTATGATCAAGCTGTTCAAACGCATTAATAGCAAACCGGCAGGTCAGATTCTGCTGGAAGAAATCAAAAATGCAATTCCGTATCTGGGCAACAGCTATACCCAAGAAGAACAGTTTACCACCAATAATCGTACCGTGAGCTTTAATGTTAAACTGGCCAATGGTAATATCGTTCAGCAGATGGCAAATCTGATTATTTGGGGTCCGGGTCCTGATCTGACCACAAATAAAACCGGTGGTATCATCTATAGCCCGTATCAGAGCATGGAAGCAACCCCGTATAAAGATGGTTTTGGTAGCATTATGACCGTGGAATTTAGTCCGGAATATGCAACCGCCTTTAACGATATTTCAATTGCAAGCCATAGTCCGTCGCTGTTTATCAAAGATCCGGCACTGATTCTGATGCATGAACTGATTCATGTTCTGCATGGTCTGTATGGCACCTATATTACCGAATACAAAATTACCCCGAATGTGGTGCAGAGCTATATGAAAGTTACCAAACCGATTACCAGCGCAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCGTGATCGCAATATTGTTCCGCAGAGCATTCAGAGCCAGCTGTATAACAAAGTTCTGAGCGATTATAAACGTATTGCCAGCCGTCTGAATAAAGTTAATACCGCAACCGCACTGATCAACATCGATGAATTCAAAAACCTGTACGAGTGGAAATACCAGTTTGCCAAAGATAGCAATGGTGTGTATAGCGTGGATCTGAACAAATTTGAGCAGCTGTACAAAAAAATCTATAGCTTCACCGAATTCAACCTGGCCTATGAGTTTAAAATCAAAACCCGTCTGGGTTATCTGGCCGAAAATTTTGGTCCGTTTTATCTGCCGAATCTGCTGGATGATAGCATTTATACCGAAGTGGATGGTTTTAACATTGGTGCACTGAGCATTAACTATCAGGGTCAGAATATTGGCAGCGATATCAACAGCATCAAAAAACTGCAAGGTCAGGGTGTTGTTAGCCGTGTTGTTCGTCTGTGTAGCAATAGCGAAAATCTGTATTTTCAGGGTGCCAGTCATCATCACCACCATCACCATCACTGA
配列番号32 - ポリペプチド配列, rLC/FA (Hisタグ付加)
MPVVINSFNYDDPVNDNTIIYIRPPYYETSNTYFKAFQIMDNVWIIPERYRLGIDPSLFNPPVSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNKYLQIMIKLFKRINSKPAGQILLEEIKNAIPYLGNSYTQEEQFTTNNRTVSFNVKLANGNIVQQMANLIIWGPGPDLTTNKTGGIIYSPYQSMEATPYKDGFGSIMTVEFSPEYATAFNDISIASHSPSLFIKDPALILMHELIHVLHGLYGTYITEYKITPNVVQSYMKVTKPITSAEFLTFGGRDRNIVPQSIQSQLYNKVLSDYKRIASRLNKVNTATALINIDEFKNLYEWKYQFAKDSNGVYSVDLNKFEQLYKKIYSFTEFNLAYEFKIKTRLGYLAENFGPFYLPNLLDDSIYTEVDGFNIGALSINYQGQNIGSDINSIKKLQGQGVVSRVVRLCSNSENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号33 - ヌクレオチド配列, rBoNT/F(0) (Hisタグ付加)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATAACGATCCGGTGAACGATGATACCATCCTGTATATGCAGATTCCGTATGAAGAGAAAAGCAAAAAGTACTACAAAGCCTTTGAGATCATGCGCAACGTTTGGATTATTCCGGAACGTAATACCATTGGCACCGATCCGAGCGATTTTGATCCGCCTGCAAGCCTGGAAAATGGTAGCAGCGCATATTATGATCCGAATTATCTGACCACCGATGCCGAAAAAGATCGTTATCTGAAAACCACCATCAAACTGTTCAAACGCATTAATAGCAATCCGGCAGGCGAAGTTCTGCTGCAAGAAATTAGCTATGCAAAACCGTATCTGGGCAATGAACATACCCCGATTAATGAATTTCATCCGGTTACACGTACCACGAGCGTTAACATTAAAAGCAGCACCAATGTGAAGTCCAGCATTATTCTGAATCTGCTGGTTTTAGGTGCAGGTCCGGATATTTTTGAAAATTCAAGCTATCCGGTGCGCAAACTGATGGATAGCGGTGGTGTGTATGATCCGTCAAATGATGGTTTTGGCAGCATTAACATTGTGACCTTTAGTCCGGAATATGAATACACCTTCAACGATATTAGCGGTGGCTATAATAGCAGCACCGAAAGTTTTATTGCAGATCCGGCAATTAGCCTGGCACACCAGCTGATTTATGCACTGCATGGTCTGTATGGTGCACGTGGTGTTACCTATAAAGAAACCATTAAAGTTAAACAGGCACCGCTGATGATTGCGGAAAAACCGATTCGTCTGGAAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCAGGATCTGAACATTATTACCAGCGCAATGAAAGAGAAAATCTATAATAACCTGCTGGCCAACTATGAGAAAATTGCAACCCGTCTGAGCCGTGTTAATAGCGCACCTCCTGAATATGATATCAACGAGTATAAAGACTATTTTCAGTGGAAATACGGCCTGGATAAAAATGCAGATGGTAGCTATACCGTGAACGAGAACAAATTTAACGAGATCTACAAAAAACTGTATAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCCAACAAATTCAAAGTGAAATGCCGCAACACCTACTTCATCAAATATGGCTTTCTGAAAGTTCCGAACCTGCTTGATGATGATATCTATACCGTTAGCGAAGGCTTTAACATTGGTAATCTGGCCGTTAATAATCGCGGTCAGAACATTAAACTGAACCCGAAAATTATCGATAGCATCCCGGATAAAGGCCTGGTTGAAAAAATTGTGAAATTCTGCAAAAGCGTGATTCCGCGTAAAGGCACCAAAGCACCGCCTCGTCTGTGTATTCGTGTGAATAATCGTGAACTGTTTTTTGTTGCAAGCGAGAGCAGCTATAACGAGAATGATATTAACACCCCGAAAGAGATTGACGATACCACCAATCTGAATAACAACTATCGCAACAATCTGGATGAAGTGATCCTGGATTATAACAGCGAAACCATTCCGCAGATTAGCAATCAGACCCTGAATACCCTGGTTCAGGATGATAGCTATGTTCCGCGTTATGATAGCAATGGCACCAGCGAAATTGAAGAACATAATGTGGTTGATCTGAACGTGTTCTTTTATCTGCATGCACAGAAAGTGCCGGAAGGTGAAACCAATATTAGCCTGACCAGCAGCATTGATACCGCACTGAGCGAAGAAAGCCAGGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGAATTCATCAACACCATTAACAAACCGGTTCATGCAGCACTGTTTATTAGCTGGATTAATCAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCCAGAAAAGCACCTTTGATAAAATTGCCGATATTAGTCTGGTGGTGCCGTATGTTGGTCTGGCACTGAATATTGGTAATGAAGTGCAGAAAGAGAACTTTAAAGAAGCCTTCGAACTGTTAGGTGCCGGTATTCTGCTGGAATTTGTGCCGGAACTGCTGATTCCGACCATTCTGGTTTTTACCATTAAGAGCTTTATTGGCAGCAGCGAGAACAAGAACAAAATCATTAAAGCCATCAACAACAGCCTGATGGAACGCGAAACCAAATGGAAAGAAATTTACAGCTGGATTGTGAGCAATTGGCTGACCCGTATCAATACCCAGTTTAACAAACGCAAAGAACAAATGTATCAGGCCCTGCAGAATCAGGTTGATGCAATTAAAACCGTGATCGAATACAAATACAACAACTATACCAGCGACGAACGTAATCGCCTGGAAAGCGAATACAACATTAATAACATTCGCGAAGAACTGAACAAAAAAGTGAGCCTGGCAATGGAAAACATCGAACGTTTTATTACCGAAAGCAGCATCTTCTACCTGATGAAACTGATTAACGAAGCCAAAGTTAGCAAACTGCGCGAATATGATGAAGGCGTTAAAGAATATCTGCTGGACTATATTAGCGAACATCGTAGCATTCTGGGTAATAGCGTTCAAGAGCTGAATGATCTGGTTACCAGCACACTGAATAATAGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGCTACACCAACGATAAAATCCTGATCCTGTACTTCAACAAACTGTACAAGAAGATCAAGGACAACAGCATACTGGATATGCGCTATGAAAACAACAAGTTCATTGATATCAGCGGCTATGGTAGCAACATTAGCATTAATGGTGATGTGTATATCTACAGCACCAACCGCAATCAGTTTGGTATTTATAGCAGCAAACCGAGCGAAGTTAATATTGCGCAGAATAACGATATCATCTACAACGGTCGCTATCAGAACTTTAGCATTAGCTTTTGGGTTCGCATTCCGAAATACTTTAACAAGGTGAACCTGAACAACGAGTACACCATTATTGATTGCATTCGCAATAATAACAGCGGCTGGAAAATCAGCCTGAACTATAACAAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCGCAGGTAATAATCAGAAACTGGTGTTTAACTACACCCAGATGATTAGCATCAGCGACTATATCAACAAATGGATCTTTGTGACCATTACCAACAATCGTCTGGGTAACAGCCGCATTTATATCAATGGCAATCTGATCGACGAAAAAAGCATTTCAAATCTGGGCGATATTCACGTGAGCGATAACATTCTGTTCAAAATTGTTGGCTGCAACGATACCCGTTATGTTGGTATTCGTTACTTCAAAGTGTTTGATACGGAACTGGGCAAAACGGAAATTGAAACCCTGTATAGTGATGAACCGGATCCGAGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGTAATTATCTGCTGTACAACAAACGCTACTATCTGCTGAACCTGCTGCGTACCGATAAAAGCATTACACAGAATAGCAACTTTCTGAACATCAATCAGCAGCGTGGTGTTTATCAGAAACCGAACATTTTTAGCAACACCCGTCTGTATACCGGTGTGGAAGTTATTATTCGTAAAAACGGTAGCACCGATATCAGCAACACCGATAACTTTGTGCGTAAAAATGACCTGGCCTATATTAACGTTGTTGATCGTGATGTTGAGTATCGTCTGTATGCGGATATTAGCATTGCCAAACCGGAAAAGATTATCAAACTGATCCGTACCAGCAACAGCAATAATTCACTGGGTCAGATTATCGTGATGGACAGCATTGGTAACAATTGCACCATGAATTTCCAGAACAATAACGGTGGTAATATTGGCCTGCTGGGCTTTCATAGCAATAATCTGGTTGCAAGCAGCTGGTATTACAACAACATCCGTAAAAATACCAGCAGTAATGGTTGCTTTTGGAGCTTTATCAGTAAAGAACATGGCTGGCAAGAAAACGAGAACCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA
配列番号34 - ポリペプチド配列, rBoNT/F(0) (Hisタグ付加)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHQLIYALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQENENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号35 - ヌクレオチド配列, rLHN/F (Hisタグ付加)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATAACGATCCGGTGAACGATGATACCATCCTGTATATGCAGATTCCGTATGAAGAGAAAAGCAAAAAGTACTACAAAGCCTTTGAGATCATGCGCAACGTTTGGATTATTCCGGAACGTAATACCATTGGCACCGATCCGAGCGATTTTGATCCGCCTGCAAGCCTGGAAAATGGTAGCAGCGCATATTATGATCCGAATTATCTGACCACCGATGCCGAAAAAGATCGTTATCTGAAAACCACCATCAAACTGTTCAAACGCATTAATAGCAATCCGGCAGGCGAAGTTCTGCTGCAAGAAATTAGCTATGCAAAACCGTATCTGGGCAATGAACATACCCCGATTAATGAATTTCATCCGGTTACACGTACCACGAGCGTTAACATTAAAAGCAGCACCAATGTGAAGTCCAGCATTATTCTGAATCTGCTGGTTTTAGGTGCAGGTCCGGATATTTTTGAAAATTCAAGCTATCCGGTGCGCAAACTGATGGATAGCGGTGGTGTGTATGATCCGTCAAATGATGGTTTTGGCAGCATTAACATTGTGACCTTTAGTCCGGAATATGAATACACCTTCAACGATATTAGCGGTGGCTATAATAGCAGCACCGAAAGTTTTATTGCAGATCCGGCAATTAGCCTGGCACATGAACTGATTCATGCACTGCATGGTCTGTATGGTGCACGTGGTGTTACCTATAAAGAAACCATTAAAGTTAAACAGGCACCGCTGATGATTGCGGAAAAACCGATTCGTCTGGAAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCAGGATCTGAACATTATTACCAGCGCAATGAAAGAGAAAATCTATAATAACCTGCTGGCCAACTATGAGAAAATTGCAACCCGTCTGAGCCGTGTTAATAGCGCACCTCCTGAATATGATATCAACGAGTATAAAGACTATTTTCAGTGGAAATACGGCCTGGATAAAAATGCAGATGGTAGCTATACCGTGAACGAGAACAAATTTAACGAGATCTACAAAAAACTGTATAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCCAACAAATTCAAAGTGAAATGCCGCAACACCTACTTCATCAAATATGGCTTTCTGAAAGTTCCGAACCTGCTTGATGATGATATCTATACCGTTAGCGAAGGCTTTAACATTGGTAATCTGGCCGTTAATAATCGCGGTCAGAACATTAAACTGAACCCGAAAATTATCGATAGCATCCCGGATAAAGGCCTGGTTGAAAAAATTGTGAAATTCTGCAAAAGCGTGATTCCGCGTAAAGGCACCAAAGCACCGCCTCGTCTGTGTATTCGTGTGAATAATCGTGAACTGTTTTTTGTTGCAAGCGAGAGCAGCTATAACGAGAATGATATTAACACCCCGAAAGAGATTGACGATACCACCAATCTGAATAACAACTATCGCAACAATCTGGATGAAGTGATCCTGGATTATAACAGCGAAACCATTCCGCAGATTAGCAATCAGACCCTGAATACCCTGGTTCAGGATGATAGCTATGTTCCGCGTTATGATAGCAATGGCACCAGCGAAATTGAAGAACATAATGTGGTTGATCTGAACGTGTTCTTTTATCTGCATGCACAGAAAGTGCCGGAAGGTGAAACCAATATTAGCCTGACCAGCAGCATTGATACCGCACTGAGCGAAGAAAGCCAGGTTTATACCTTTTTTAGCAGCGAATTCATCAACACCATTAACAAACCGGTTCATGCAGCACTGTTTATTAGCTGGATTAATCAGGTGATTCGCGATTTTACCACCGAAGCAACCCAGAAAAGCACCTTTGATAAAATTGCCGATATTAGTCTGGTGGTGCCGTATGTTGGTCTGGCACTGAATATTGGTAATGAAGTGCAGAAAGAGAACTTTAAAGAAGCCTTCGAACTGTTAGGTGCCGGTATTCTGCTGGAATTTGTGCCGGAACTGCTGATTCCGACCATTCTGGTTTTTACCATTAAGAGCTTTATTGGCAGCAGCGAGAACAAGAACAAAATCATTAAAGCCATCAACAACAGCCTGATGGAACGCGAAACCAAATGGAAAGAAATTTACAGCTGGATTGTGAGCAATTGGCTGACCCGTATCAATACCCAGTTTAACAAACGCAAAGAACAAATGTATCAGGCCCTGCAGAATCAGGTTGATGCAATTAAAACCGTGATCGAATACAAATACAACAACTATACCAGCGACGAACGTAATCGCCTGGAAAGCGAATACAACATTAATAACATTCGCGAAGAACTGAACAAAAAAGTGAGCCTGGCAATGGAAAACATCGAACGTTTTATTACCGAAAGCAGCATCTTCTACCTGATGAAACTGATTAACGAAGCCAAAGTTAGCAAACTGCGCGAATATGATGAAGGCGTTAAAGAATATCTGCTGGACTATATTAGCGAACATCGTAGCATTCTGGGTAATAGCGTTCAAGAGCTGAATGATCTGGTTACCAGCACACTGAATAATAGCATTCCGTTTGAACTGAGCAGCTACACCAACGATAAAATCCTGATCCTGTACTTCAACAAACTGTACAAGAAAGAAAACCTGTATTTTCAGGGTGCAAGCCATCATCACCACCATCACCATCATTAA
配列番号36 - ポリペプチド配列, rLHN/F (Hisタグ付加)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号37 - ヌクレオチド配列, rHC/F (Hisタグ付加)
ATGATCAAGGATAACAGCATTCTGGATATGCGCTATGAGAACAACAAATTCATTGATATTAGCGGCTATGGCAGCAACATTAGCATTAATGGTGATGTGTATATCTACAGCACCAACCGTAATCAGTTTGGCATTTATAGCAGCAAACCGAGCGAAGTTAATATTGCCCAGAACAACGATATCATCTATAACGGTCGCTATCAGAACTTCAGCATTAGCTTTTGGGTTCGCATTCCGAAATACTTCAATAAGGTGAACCTGAACAACGAGTATACCATCATTGATTGCATTCGCAATAATAACAGCGGCTGGAAAATTAGCCTGAACTACAACAAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCGCAGGTAATAATCAGAAACTGGTGTTTAACTACACCCAGATGATTAGCATCAGCGACTATATCAACAAATGGATCTTTGTGACCATTACCAATAATCGCCTGGGTAATAGCCGCATTTATATCAATGGTAACCTGATCGATGAGAAAAGCATTAGCAATCTGGGTGATATTCATGTGAGCGATAACATCCTGTTTAAAATCGTGGGTTGTAACGATACCCGTTATGTTGGTATTCGCTACTTCAAAGTGTTTGATACCGAACTGGGTAAAACCGAAATTGAAACCCTGTATAGTGATGAACCGGATCCGAGCATTCTGAAAGATTTTTGGGGTAATTATCTGCTGTACAACAAACGCTACTATCTGCTGAATCTGCTGCGTACCGATAAATCAATTACCCAGAATAGCAACTTCCTGAACATTAATCAGCAGCGTGGTGTTTATCAGAAACCGAACATTTTTAGCAACACCCGTCTGTATACCGGTGTGGAAGTTATTATTCGTAAAAATGGCAGCACCGATATCAGCAACACCGATAACTTTGTTCGCAAAAATGATCTGGCGTATATCAACGTTGTTGATCGTGATGTTGAATATCGTCTGTATGCCGATATTAGCATTGCCAAACCGGAAAAAATCATCAAACTGATCCGTACCAGCAACAGCAATAATTCACTGGGTCAGATTATTGTGATGGATAGCATTGGTAATAACTGCACCATGAACTTTCAGAACAATAACGGTGGTAATATTGGTCTGCTGGGCTTTCATAGTAATAATCTGGTTGCAAGCAGCTGGTATTATAACAACATCCGTAAAAATACCAGCAGCAATGGTTGCTTTTGGAGCTTTATTAGCAAAGAACATGGCTGGCAAGAAAACGAGAATCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCACCATCACCATCATTAA
配列番号38 - ポリペプチド配列, rHC/F (Hisタグ付加)
MIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQENENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号39 - ヌクレオチド配列, rLC/F (Hisタグ付加)
ATGCCGGTTGTGATTAACAGCTTCAATTATAACGATCCGGTGAACGATGATACCATCCTGTATATGCAGATTCCGTATGAAGAGAAAAGCAAAAAGTACTACAAAGCCTTTGAGATCATGCGCAACGTTTGGATTATTCCGGAACGTAATACCATTGGCACCGATCCGAGCGATTTTGATCCGCCTGCAAGCCTGGAAAATGGTAGCAGCGCATATTATGATCCGAATTATCTGACCACCGATGCCGAAAAAGATCGTTATCTGAAAACCACCATCAAACTGTTCAAACGCATTAATAGCAATCCGGCAGGCGAAGTTCTGCTGCAAGAAATTAGCTATGCAAAACCGTATCTGGGCAATGAACATACCCCGATTAATGAATTTCATCCGGTTACACGTACCACGAGCGTTAACATTAAAAGCAGCACCAATGTGAAGTCCAGCATTATTCTGAATCTGCTGGTTTTAGGTGCAGGTCCGGATATTTTTGAAAATTCAAGCTATCCGGTGCGCAAACTGATGGATAGCGGTGGTGTGTATGATCCGTCAAATGATGGTTTTGGCAGCATTAACATTGTGACCTTTAGTCCGGAATATGAATACACCTTCAACGATATTAGCGGTGGCTATAATAGCAGCACCGAAAGTTTTATTGCAGATCCGGCAATTAGCCTGGCACATGAACTGATTCATGCACTGCATGGTCTGTATGGTGCACGTGGTGTTACCTATAAAGAAACCATTAAAGTTAAACAGGCACCGCTGATGATTGCGGAAAAACCGATTCGTCTGGAAGAATTTCTGACCTTTGGTGGTCAGGATCTGAACATTATTACCAGCGCAATGAAAGAGAAAATCTATAATAACCTGCTGGCCAACTATGAGAAAATTGCAACCCGTCTGAGCCGTGTTAATAGCGCACCTCCTGAATATGATATCAACGAGTATAAAGACTATTTTCAGTGGAAATACGGCCTGGATAAAAATGCAGATGGTAGCTATACCGTGAACGAGAACAAATTTAACGAGATCTACAAAAAACTGTATAGCTTCACCGAAATCGATCTGGCCAACAAATTCAAAGTGAAATGCCGCAACACCTACTTCATCAAATATGGCTTTCTGAAAGTTCCGAACCTGCTTGATGATGATATCTATACCGTTAGCGAAGGCTTTAACATTGGTAATCTGGCCGTTAATAATCGCGGTCAGAACATTAAACTGAACCCGAAAATTATCGATAGCATCCCGGATAAAGGCCTGGTTGAAAAAATTGTGAAATTCTGCAAAAGCGAGAACCTGTATTTTCAGGGTGCAAGTCATCATCACCATCACCACCATCATTAA
配列番号40 - ポリペプチド配列, rLC/F (Hisタグ付加)
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSENLYFQGASHHHHHHHH
配列番号41 - ヌクレオチド配列, 陽イオン性 rHC/A (Hisタグ付加)
ATGATCATCAACACCAGCATTCTGAACCTGCGTTATGAAAGCAAACATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCCAGCAAAATCAATATAGGCAGCAAGGTTAACTTCGACCCGATTGACAAAAATCAGATACAGCTGTTTAATCTGGAAAGCAGCAAAATTGAGGTGATCCTGAAAAAAGCGATCGTGTATAATAGCATGTACGAGAATTTTTCGACCAGCTTTTGGATTCGCATCCCGAAATACTTTAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACCATCATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGTTGGAAAGTCAGCCTGAATTATGGCGAAATTATCTGGACCCTGCAGGATACCAAAGAAATCAAACAGCGTGTGGTGTTCAAATACAGCCAGATGATTAATATCAGCGACTATATCAACCGCTGGATTTTTGTGACCATTACCAATAATCGGCTGAACAAGAGCAAGATCTATATTAACGGTCGTCTGATTGACCAGAAACCGATTAGTAATCTGGGTAATATTCATGCGAGCAACAAAATCATGTTTAAACTGGATGGTTGCCGTGATACCCATCGTTATATTTGGATCAAATACTTCAACCTGTTCGATAAAGAGTTGAACGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTACGATAACCAGAGCAATAGCGGCATACTGAAAGATTTTTGGGGAGATTATCTGCAGTATGACAAACCGTATTATATGCTGAATCTGTACGACCCGAATAAATACGTGGATGTTAATAATGTGGGCATCCGTGGTTATATGTACCTGAAAGGTCCGCGTGGTAGCGTTATGACCACAAACATTTATCTGAATAGCAGCCTGTATCGCGGAACCAAATTCATCATTAAAAAGTATGCCAGCGGCAACAAGGATAATATTGTGCGTAATAATGATCGCGTGTACATTAACGTTGTGGTGAAGAATAAAGAATATCGCCTGGCAACCAATGCAAGCCAGGCAGGCGTTGAAAAAATTCTGAGTGCCCTGGAAATTCCGGATGTTGGTAATCTGAGCCAGGTTGTTGTGATGAAAAGCAAAAACGATAAAGGCATCACCAACAAATGCAAGATGAATCTGCAGGACAATAACGGCAATGATATTGGCTTCATTGGCTTTCACCAGTTTAACAACATTGCAAAACTGGTTGCGAGCAATTGGTATAATCGTCAGATTGAACGTAGCAGTCGTACCCTGGGTTGTAGCTGGGAATTTATCCCTGTGGATGATGGTTGGGGTGAACGTCCGCTGAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
配列番号42 - ポリペプチド配列, 陽イオン性 rHC/A (Hisタグ付加)
MIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLKLAAALEHHHHHH
配列番号43 - ヌクレオチド配列, rHC/AB (Hisタグ付加)
ATGATTCTGAACAATATTATCCTGAACCTGCGTTACAAAGACAACAATCTGATCGATCTGAGCGGCTATGGTGCAAAAGTTGAAGTCTACGACGGTGTCGAACTGAACGATAAAAACCAGTTCAAACTGACCTCATCGGCTAACTCAAAAATTCGTGTGACGCAGAACCAAAACATCATCTTCAACTCGGTCTTTCTGGACTTCAGCGTGTCTTTCTGGATTCGCATCCCGAAATATAAAAATGATGGCATCCAGAACTACATCCATAACGAATACACCATCATCAACTGTATGAAAAACAACAGTGGTTGGAAAATTTCCATCCGTGGCAACCGCATTATCTGGACCCTGATTGATATCAATGGTAAAACGAAAAGCGTGTTTTTCGAATACAACATCCGTGAAGATATCTCTGAATACATCAATCGCTGGTTTTTCGTGACCATTACGAACAATCTGAACAATGCGAAAATCTATATCAACGGCAAACTGGAAAGTAATACCGACATCAAAGATATTCGTGAAGTTATCGCCAACGGTGAAATCATCTTCAAACTGGATGGCGACATCGATCGCACCCAGTTCATTTGGATGAAATACTTCTCCATCTTCAACACGGAACTGAGTCAGTCCAATATCGAAGAACGCTACAAAATCCAATCATACTCGGAATACCTGAAAGATTTCTGGGGTAACCCGCTGATGTACAACAAAGAATACTACATGTTCAACGCGGGCAACAAAAACTCATACATCAAACTGAAAAAAGATTCGCCGGTGGGTGAAATCCTGACCCGTAGCAAATACAACCAGAACTCTAAATACATCAACTATCGCGATCTGTACATTGGCGAAAAATTTATTATCCGTCGCAAAAGCAACTCTCAGAGTATTAATGATGACATCGTGCGTAAAGAAGACTACATCTATCTGGATTTCTTTAATCTGAACCAAGAATGGCGCGTTTATACCTACAAATACTTCAAAAAAGAAGAAATGAAACTGTTCCTGGCCCCGATTTACGACAGCGATGAATTTTACAACACCATCCAGATCAAAGAATACGATGAACAGCCGACGTATAGTTGCCAACTGCTGTTCAAAAAAGACGAAGAATCCACCGATGAAATTGGCCTGATTGGTATCCACCGTTTCTATGAAAGCGGTATCGTTTTCGAAGAATACAAAGATTACTTCTGTATCTCTAAATGGTATCTGAAAGAAGTCAAACGCAAACCGTACAACCTGAAACTGGGCTGCAACTGGCAATTTATCCCGAAAGACGAAGGCTGGACCGAAAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
配列番号44 - ポリペプチド配列, rHC/AB (Hisタグ付加)
MILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEKLAAALEHHHHHH
配列番号45 - ヌクレオチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V H1253K (Hisタグ付加)
ATGATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGgtTGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCaAaCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTGCaCcatcaccatCaCcatcaccatCaCcatT
配列番号46 - ポリペプチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V H1253K (Hisタグ付加)
MIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLVDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFKQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLHHHHHHHHHH
配列番号47 - ヌクレオチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V F1252Y H1253K L1278F (Hisタグ付加)
ATGATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGgtTGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTaCaAaCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTtGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTGCaCcatcaccatCaCcatcaccatCaCcatTAA
配列番号48 - ポリペプチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V F1252Y H1253K L1278F (Hisタグ付加)
MIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLVDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGYKQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTFGCSWEFIPVDDGWGERPLHHHHHHHHHH
配列番号49 - ヌクレオチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V F1252Y H1253K L1278H (Hisタグ付加)
ATGATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGgtTGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTaCaAaCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTcatGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTGCaCcatcaccatCaCcat
配列番号50 - ポリペプチド配列, rHC/A 変異型 Y1117V F1252Y H1253K L1278H (Hisタグ付加)
MIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLVDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGYKQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTHGCSWEFIPVDDGWGERPLHHHHHH
配列番号51 - ポリペプチド配列, BoNT/A - UniProt P10845
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNVGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLN
PPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGG
STIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGY
GSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPN
RVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKA
KSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKV
LNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFT
GLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEE
ITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNG
KKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEA
AMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSG
AVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAK
VNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKA
MININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDK
VNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINI
GSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNN
EYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTIT
NNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELN
EKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR
GSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQA
GVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAK
LVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
配列番号52 - ポリペプチド配列, BoNT/B - UniProt P10844
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
配列番号53 - ポリペプチド配列, BoNT/C - UniProt P18640
MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE
配列番号54 - ポリペプチド配列, BoNT/D - UniProt P19321
MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE
配列番号55 - ポリペプチド配列, BoNT/E - UniProt Q00496
MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHRFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNCMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLRTKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTFEDNRGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
配列番号56 - ポリペプチド配列, BoNT/F - UniProt A7GBG3
MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN
配列番号57 - ポリペプチド配列, BoNT/G - UniProt Q60393
MPVNIKXFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE
配列番号58 - ポリペプチド配列, TeNT - UniProt P04958
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND
配列番号59 - ポリペプチド配列, BoNT/X
MKLEINKFNYNDPIDGINVITMRPPRHSDKINKGKGPFKAFQVIKNIWIVPERYNFTNNT
NDLNIPSEPIMEADAIYNPNYLNTPSEKDEFLQGVIKVLERIKSKPEGEKLLELISSSIP
LPLVSNGALTLSDNETIAYQENNNIVSNLQANLVIYGPGPDIANNATYGLYSTPISNGEG
TLSEVSFSPFYLKPFDESYGNYRSLVNIVNKFVKREFAPDPASTLMHELVHVTHNLYGIS
NRNFYYNFDTGKIETSRQQNSLIFEELLTFGGIDSKAISSLIIKKIIETAKNNYTTLISE
RLNTVTVENDLLKYIKNKIPVQGRLGNFKLDTAEFEKKLNTILFVLNESNLAQRFSILVR
KHYLKERPIDPIYVNILDDNSYSTLEGFNISSQGSNDFQGQLLESSYFEKIESNALRAFI
KICPRNGLLYNAIYRNSKNYLNNIDLEDKKTTSKTNVSYPCSLLNGCIEVENKDLFLISN
KDSLNDINLSEEKIKPETTVFFKDKLPPQDITLSNYDFTEANSIPSISQQNILERNEELY
EPIRNSLFEIKTIYVDKLTTFHFLEAQNIDESIDSSKIRVELTDSVDEALSNPNKVYSPF
KNMSNTINSIETGITSTYIFYQWLRSIVKDFSDETGKIDVIDKSSDTLAIVPYIGPLLNI
GNDIRHGDFVGAIELAGITALLEYVPEFTIPILVGLEVIGGELAREQVEAIVNNALDKRD
QKWAEVYNITKAQWWGTIHLQINTRLAHTYKALSRQANAIKMNMEFQLANYKGNIDDKAK
IKNAISETEILLNKSVEQAMKNTEKFMIKLSNSYLTKEMIPKVQDNLKNFDLETKKTLDK
FIKEKEDILGTNLSSSLRRKVSIRLNKNIAFDINDIPFSEFDDLINQYKNEIEDYEVLNL
GAEDGKIKDLSGTTSDINIGSDIELADGRENKAIKIKGSENSTIKIAMNKYLRFSATDNF
SISFWIKHPKPTNLLNNGIEYTLVENFNQRGWKISIQDSKLIWYLRDHNNSIKIVTPDYI
AFNGWNLITITNNRSKGSIVYVNGSKIEEKDISSIWNTEVDDPIIFRLKNNRDTQAFTLL
DQFSIYRKELNQNEVVKLYNYYFNSNYIRDIWGNPLQYNKKYYLQTQDKPGKGLIREYWS
SFGYDYVILSDSKTITFPNNIRYGALYNGSKVLIKNSKKLDGLVRNKDFIQLEIDGYNMG
ISADRFNEDTNYIGTTYGTTHDLTTDFEIIQRQEKYRNYCQLKTPYNIFHKSGLMSTETS
KPTFHDYRDWVYSSAWYFQNYENLNLRKHTKTNWYFIPKDEGWDED
配列番号60 - ヌクレオチド配列, mrBoNT/A
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
配列番号61 - ポリペプチド配列, mrBoNT/A
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
配列番号62 - ポリペプチド配列, 無修飾 BoNT/A1
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
配列番号63 - ポリペプチド配列, mrBoNT/AB
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
配列番号64 - ポリペプチド配列, mrBoNT/AB(0)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHQLIYAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
配列番号65 - ポリペプチド配列, mrBoNT/A(0)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDT
FTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYS
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実施例1
触媒として不活性な複数のBoNT血清型は未処置対照細胞に比較して神経突起の全長を増大する
材料および方法
5種の触媒として不活性な(すなわち、エンドペプチダーゼ不活性)ボツリヌス菌神経毒(BoNT)血清型をE. coli内に組換えにより発現させた。これは、すなわち、血清型A、B、C、E、および、Fに対応し、rBoNT/A(0)、rBoNT/B(0)、rBoNT/C(0)、rBoNT/E(0)、および、rBoNT/F(0)で表す。触媒として不活性である結果、これらの分子はそれらの個々の(SNARE)タンパク性基質を開裂できなかった。
運動ニューロン状ハイブリッド細胞株(NSC34細胞)(Tebu-Bio、Cedariane laboratories、フランス)がD-リジンのみでコーティングされた黒色マルチウエル上で5000細胞/ウエルにて培養され、追加の10%のFCSおよびペニシリン/ストレプトマイシンとともにDMEM内で培養された。平板培養の後、細胞は1μMのレチノイン酸および低血清に4日間曝露することによって運動ニューロンに分化させ、続いて、細胞は3種の異なる濃度、0.1、1、および、10nMで4日間にわたりrBoNT/A(0)、rBoNT/B(0)、rBoNT/C(0)、rBoNT/E(0)、および、rBoNT/F(0)を使用して処置され、パラホルムアルデヒド4%-ショ糖4%を使用して固定された。脳由来神経栄養因子(BDNF)(ReproTech EC Ltd、ロンドン、英国より市販)1ng/mLが神経突起伸長の陽性対照として使用された。細胞はパラホルムアルデヒド4%-ショ糖4%で固定され、続いて、適切な抗体で染色された。特に、抗βIIIチューブリンmAb(Promega G7121)を1×PBS+2%BSA+0.3%TritonX-10中に希釈(1:1,000)し、プレートは37℃で3時間保持された。続いて、Alexa Fluor 488ヤギ抗ハツカネズミlgG(H+L)二次抗体(Life Tech cat. A-11001)が37℃で1時間投与された(1×PBS+2%BSA+0.3%TritonX-100中に1:2,000)。核をDAPIで染色した。画像分析:ウエル当たり6枚の画像をArrayScan XTI HCA読取装置(Thermo Fisher Scientific)を使用して10倍の対物レンズで撮影した。すべての分析はImage Jソフトウェア(NIH、メリーランド州、米国からのオープンソースソフトウェア)を使用して行った。3回の独立した実験を行った。それぞれの独立した実験は6個の複製を含んでいた。
結果
細胞を異なった触媒として不活性なBoNT血清型に4日間曝した(図1)。図1は3種の異なった濃度に曝露されたNSC34細胞の平均神経突起伸長を示す。グラフは3回の独立した実験実施の平均値を提示している。平均神経突起伸長のデータは、未処置対照に、同じく、陽性対照BDNFに比較した際にrBoNT/A(0)がNSC34細胞当たりの神経突起の長さを増大させることを裏付けている。rBoNT/B(0)、rBoNT/C(0)、rBoNT/E(0)、および、rBoNT/F(0)もNSC34細胞当たりの神経突起の長さを増大させることが見出された。
したがって、これらのデータは、BoNT/Aの神経栄養特性が他のBoNT血清型にも推定可能であることを裏付けている。
実施例2
BoNT L鎖およびLHNは対照に対して神経突起の全長を増大する
材料および方法
触媒として不活性なボツリヌス菌毒rBoNT/A(0)をE. coli内で組換えにより発現させた。BoNT/Aの断片もE. coli内で発現させた。これらは軽鎖(L/A)、軽鎖およびトランスロケーションドメイン(LHN/A)、ならびに、重鎖の細胞結合ドメイン断片(HC/A)で表す。NSC34細胞を実施例1に関してBoNT/A断片ならびに全長rBoNT/A(0)に曝露した。
結果
図2は3種の異なった濃度のrBoNT/A(0)、rL/A、rLHN/A、および、rHC/Aに曝露したNSC34細胞の平均神経突起伸長を示す。グラフは3回の独立した実験実施の平均値を提示している。
rHC/Aと同様に、rL/AおよびrLHN/Aもともに、未処置対照に、同様に陽性対照BDNFに比較した際に、各濃度においてNSC34細胞当たりの神経突起の長さを増大することが見出された。rL/AおよびrLHN/A断片が神経栄養性であることは特に予想されなかった。なぜなら、双方とも(rHC/Aには存在する)クロストリジウム毒素受容体結合ドメインを欠いているからである。
実施例3
BoNT/A(0)またはその断片と同様の濃度で投与された他のタンパク質は神経突起伸長を増大しなかった
材料および方法
NSC34細胞を分化させ、続いて、以下の実験条件下で4日間培養した。(1)未処置細胞対照:細胞に同数の操作、すなわち、化合物処置細胞として洗浄/補給を施したが、未処置対照細胞は成長培地のみに曝露した、(2)BDNF-陽性検定対照、1ng/ml。(3)3種の投与量(0.1、1、および、10nM)でのBoNT/A(0)、(4)陰性検定対策(タンパク質対照):1.A7030、Sigma、ウシ血清アルブミン(BSA)、2.NBP1-37082、Bio-techne、組換えヒトアネキシンA4タンパク質、3.U-100AT、Bio-techne、組換え植物ユビキチンタンパク質、4.ボツリヌス菌神経毒またはその断片を含まないE. coli発現溶解物。すべての陰性対照タンパク質は1.5μg/mlの最終濃度で試験した。この濃度はBoNT/A(0)の10nMに相当する。タンパク質溶液はPBS中にあったが、20%のグリセロールと0.2MのNaClを含むアネキシン4～20mMのTris-HCl緩衝溶液(pH8.0)を除いた。すべてのタンパク質溶液は1mg/mlであった。細胞は抗ベータIIIチューブリン希釈用液1:1,000を使用して1×PBS-4%BSA-0.3%TritonX100および二次抗体抗ハツカネズミAlexa Fluor488内で染色し、核染色剤としてDAPIを使用した。ベータ3-チューブリン信号のすべての原本画像はNeurphologyJ(画像Jマクロ、NIH、メリーランド州、米国)を使用して処理した。
結果
細胞は異なった実験条件に曝露された。図3はNSC34細胞における平均神経突起長を示す。グラフは3回の独立した実験実施の平均値を提示している。平均神経突起伸長についてのデータは、未処置対照と比較してrBoNT/A(0)がNSC34細胞当たりの神経突起の長さを増大する一方、陽性対照BDNFにも同様であることを裏付けている。これに対して、他の「陰性対照」条件の何れも神経突起の長さを増大しなかった。これは、rL/AおよびrLHN/A(ならびに、様々なBoNT血清型およびrHC/A)への曝露において観察された神経栄養効果を確認し、その効果がタンパク質への、または、ボツリヌス菌毒素調合液中に存在する推定残余E. coli成分へのNSC34細胞の曝露から単に生じたものではないことを実証するものである。
実施例4
生体内でのニューロン損傷の治療
生体内ハツカネズミ脊柱病変モデルを使用した機能回復および神経再生の増強における触媒として不活性なボツリヌス菌毒素rBoNT/A(0)の有効性を調べるための研究が設計された。このモデルは局所発芽および/または、長索軸索の再生を引き起こす分子の有効性の分析に有用である。十分に認識されているように、圧挫損傷は脊髄損傷でよく見られる状況であり、したがって、このモデルは外傷後の脊髄に生じる病理学的変化のほとんどを模倣するものである(このモデルおよび傷害応答の詳細についてはLagord他によるMolecular and Cellular Neuroscience(「分子および細胞の神経科学」)20:69 (2002)、Esmaelli他によるNeural Regeneration Research(「神経再生研究」)9:1653 (2014)、Surey他によるNeuroscience(「神経科学」)275C:62 (2014)、Almutiri他によるScientific Reports (「サイエンティフィック・リポーツ」)8:10707 (2018)を参照)。
材料および方法
脊髄損傷のハツカネズミモデル
手術の前に、C57/BLハツカネズミにブプレノルフィンを皮下注射し、1.8ml/lのO2中の5%イソフルレンを使用して麻酔し、手術中は体温および心拍数を終始モニターした。胸部高さ8(T8)での部分的椎弓切除の後、脊柱(SDC)の上行感覚軸索、下行運動軸索、および、分節固有感覚軸索(SPA)を、深さ1mm×幅1mmの較正済み時計職人用鉗子を使用して左右相称に圧挫した。
薬剤投与
rBoNT/A(0)の投与は、手術の際に3種の投与量(100pg、100ng、おおび、50μg/ハツカネズミ)の1つの(脊柱管のCSF内への)1回の10μl髄腔内注射の方法によって行った。3種の投与量のそれぞれに対する治療群は以下のとおりである。
1. 伸展剤(リン酸緩衝生理食塩水[PBS])、すなわち、SDC損傷に加えて伸展剤の速やかな1回の10μl髄腔内注射、n=6匹のハツカネズミ。
2. BoNTで処置された牟、すなわち、SDC損傷に加えてBoNTの3種の投与量(100pg、100ng、および、50μg/ハツカネズミ)の1つの速やかな1回の10μlの髄腔内注射、3×n=6/群、18匹のハツカネズミ。
BoNTの髄腔内注射は以下のように行われた。ハツカネズミを腹臥位に置き、L5脊椎骨とS1脊椎骨との間に注射を行った。棘突起を切開し、黄色靭帯が露出するように吻方に反転させ、鈍い25G針を水平に60°で黄色靭帯を介して挿入し、髄腔内空間への到達を脳脊髄液(CSF)の逆流および「尾部フリック」の存在によって確認した。続いて、10μlの注入液を1分間かけてゆっくり注入し、優しく尾を持ち上げてCSFの発現を促進した。
測定されたエンドポイント
1. 基準値(損傷前)とSDC損傷の2日後、1週間後、2週間後、3週間後、および、4週間後に再び水平梯子歩行試験を使用して自発運動機能を測定した。
2. 運動および感覚のニューロン/軸索からの発芽および再生の4週間の時点での定性的組織学的評価、すなわち、短距離(<1mm)および長距離(～5mm)にわたる軸索成長。Neurofilament200(NF200)について染色した組織切片は成熟した軸索を検出する。リン酸化MAP1bは成長中の軸索および成長円錐内に存在し、そこで細胞骨格成分間の動的バランスを維持し、細胞微小管およびアクチンの安定および相互作用を調節し、軸索成長、神経接続、および、中枢神経系の再生を促進している。MAP1bの染色は活発な軸索発芽の領域を明らかにしている。
水平梯子試験
これは自発運動機能を試験するものであり、幅が8cmで、1～2cmの可変間隔を持つ無作為に調整された横木を備えた0.6mの長い水平梯子上で行なわれる。損傷の前に、および、SDC損傷の2日後、1週間後、2週間後、3週間後、および、4週間に再び、梯子の縦走についてハツカネズミを評価し、治療グループの不注意な個体による総歩数とともに左右の後肢の滑りの回数を記録した。平均エラー率を算出するために、滑りの回数を総歩数で除した。
組織標本および低温切開
SDC損傷の4週間後、ハツカネズミを4%ホルムアルデヒド(Raymond A Lamb、ピーターバラ、英国)を心臓内に還流させ、DC損傷部位(病変部位+どちらか一方の側5mm)を含むT8脊髄の切断切片を脛骨頭筋とともに室温で2時間事後固定し、段階的な一連のショ糖中で低温切開し、最適な切断温度媒体(OCT、Raymond A Lamb)中に閉じ込め、Bright低温保持装置を使用して15μmの厚さの切片とした。
免疫細胞化学的状況
切片を、pH7.4の0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Raymond A Lamb)で2回洗浄する前に室温で30分間解かした。続いて、切片をPBS(Sigma)中の0.1%TritonX100中で10分間透過性を持たせ、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1%Triton-X100を含むPBS(すべてSigmaより)に室温で30分間閉じ込めた。続いて、切片を、抗体希釈緩衝液(ADB、0.5%BSAおよび0.05%Tween-20を含むPBS(すべてSigmaより))で希釈した適切な一次抗体とともに培養し、加湿室内で4℃で一晩培養した。続いて、切片をPBS中で洗浄し、ADB中に希釈した蛍光標識が付けられた適切な二次抗体とともに培養した。続いて、切片をPBS中で洗浄し、DAPIを含むVectashield(Vector Laboratories、ピーターバラ、英国)を使用してカバースリップを搭載した。陰性対照は、一次抗体の欠落を含む各回に含め、これらは画像取り込みのための背景閾値レベルを設定するために使用した。切片を観察し、Axiovisionソフトウェアを実行するAxiocamHRcを備えたAxioplan2落射蛍光顕微鏡を使用して画像を取り込んだ。
使用した一次抗体は以下のとおりであった。
・ウサギ抗-NF200、Sigma、プール、英国(1:300希釈)
・ウサギMAP1b、Abcam、ケンブリッジ、英国(1:400希釈)
使用した二次抗体は以下のとおりであった。
・Alexa488抗ウサギlgG Invitrogen、ペーズリー、英国(1:400希釈)
・Alexa594抗ウサギlgG Invitrogen、ペーズリー、英国(1:400希釈)
統計
SPSS20(IBM、米国)を使用して機能に関するデータの統計分析を行った。各治療を比較するために、最も適切な統計分析を決定するための正規分布検定を実行した。統計的優位性をp<0.05に決定した。
結果
図4は100pgおよび100ngの投薬量に対する伸展剤対照に比較してrBoNT/A(0)の投与が2日において脊柱損傷誘発自発運動欠如の程度を低減したことを示す。rBoNT/A(0)の投与は、試験されたすべての投薬量における伸展剤対照と比較して4週間において脊柱損傷誘発自発運動欠如および回復率を有意に低減した。さらに、効果は、rBoNT/A(0)を脊髄内に投与した時(データは示さない)より髄腔内に投与した時の方がより顕著であった。
免疫組織化学的評価はNeurofilament200(NF200)およびMAP1bへの抗体の使用を採用した。Neurofilament200(NF200)は成熟した軸索において発現され、pMAP1b抗体は活発に発芽している軸索の末端の神経フィラメントを露わにし、病変部位の周囲および内部で未だに活発に発芽している軸索を表す。
図5Aは未処置動物の損傷部位の中核部分内に存在する、もしあれば極く少数のNF200+軸索とともに、多くのNF200染色した軸索が伸展剤処置の動物の病変部位を囲んで見えていることを示す。これに対して、病変部位の中核部分内にも見える非常に多くのNF200+軸索とともに、多くのNF200染色軸索がrBoNT/A(0)処置の動物の病変部位を囲んで見えている。
図5Bは病変部位の中核部分内に存在する、もしあれば極く少数のMAP1b軸索とともに、若干数のMAP1b染色した発芽中の軸索が伸展剤処置の動物の病変部位を囲んで見えていることを示す。これに対して、MAP1b染色は、病変部位の周囲の鮮紅色軸索発芽を露わにしている。
機能試験での成績の向上の開始の素早さは、rBoNT/A(0)が病変の下方の有用な機能性シナプスの確立を伴う軸索発芽を引き起こしたことを示す。定性的免疫組織化学的状況はSDC病変部位を介した局所的なBoNT誘発の鮮紅色軸索発芽の証拠を提供した。
これらの生体内データは神経障害の治療におけるrBoNT/A(0)の役割の正当性を立証する明確な証拠である。
実施例5
細胞当たりの神経突起数に対する触媒として不活性な全長組換えBoNT、BoNT断片、および、変異型の効果
いくつかの触媒として不活性な全長組換えBoNT血清型ならびにBoNT断片および変異型を、生体外で神経突起伸長に関するそれらの修飾作用について試験した。
材料および方法
ポリペプチドに曝露した細胞を陽性対照(1ng/mlBDNF)に曝露したものと比較した。ハツカネズミ運動ニューロン状ハイブリッド(NSC34)細胞を分化させ、3種の異なった投薬量(0.1nM、1nM、および、10nM)で異なったポリペプチドに生体外で(DIV)4日間曝露した。
NSC34細胞は運動ニューロンを豊富にした萌芽期ハツカネズミ脊髄細胞とハツカネズミ神経芽細胞腫の融合によって作成した(参照により本明細書に組み込まれるCashman他によるDev Dyn.(「発育原動力」)Jul;194(3):209-21, (1992))。前記細胞はコリン、アセチルトランスフェラーゼ、アセチルコリン、合成、保存、放出、および、神経フィラメント三重タンパク質を含めて運動ニューロンの多くの特性を模倣する。さらに、NSC34脊髄運動ニューロンはグルタミン酸塩受容体タンパク質を発現し、活動電位を発生する。NSC34ニューロンは、ニューロン信号伝達およびニューロン変性の機構を研究するために広く使用されて来ている。
以下の実験スキームを採用した。ニューロン細胞株(NSC34)に対する選抜。
Figure 2022550769000006
NSC34細胞は10%FCSを加えたDMEM中のポリ-D-リジンをコーティングしたガラスのカバースリップ上で培養した。
平板培養の後、細胞はレチノイン酸および低血清レベルに4日間曝露することによって運動ニューロンに分化させた。細胞は特定の時点(すなわち、4DIV)にポリペプチドの存在/不在の何れかにおいて培養した。試験データは陽性(BDNF)および同じく陰性(BSA)対照のデータに見られた効果と比較した。
生体外(DIV)での4日間の後、細胞は4%パラホルムアルデヒド中で固定し、特定のニューロンマーカー(ベータチューブリン)で染色し、神経突起伸長(神経突起の広がり、軸索の延長、樹枝状分岐)について定量検定を行った。20倍対物レンズを用いてOperetta CLS HCS顕微鏡(PerkinElmer)を使用して画像を取得した。各ウエル当たり6(6)視野を取得した。神経突起伸長の分析を行い、細胞当たりの平均神経突起を評価した。
結果
図6～10は3回の独立した実験実施において評価した各細胞上で数えた神経突起の数の平均値を表す。データは未処置対照細胞に関して正規化した。BSAに比較して、ポリペプチドは細胞当たりの神経突起数を統計的に有意に増加させた。
BoNT/Aについて、細胞結合ドメイン(HCドメイン)断片に比較して、LHN/A断片(軽鎖に加えてトランスロケーションドメイ)は活性を向上させた(図6を参照)。
BoNT/FAおよびBoNT/Fの双方について、HCドメイン断片に比較して、LHNおよびLC(軽鎖のみ)断片は向上した活性を示した(図7および8を参照)。
最後に、変異型HCドメイン断片は、すべてが高度に有効であることを示し(図9および10)、陽イオン性HC/Aドメイン(配列番号42-図9)は並外れた活性を提示し、これは3種の濃度の2種においてBDNFに対して向上していた。陽イオン性HC/Aドメインの高い活性は、(触媒として不活性にせよ活性にせよ)前記ドメインを含む全長ポリペプチドにおいても明白であることが期待される。
上記明細書で触れたすべての出版物は参照により本明細書に組み込まれる。本発明の説明した方法および系の様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱せずに当業者には明らかであろう。本発明は特定の実施の好ましい形態に関連して説明したが、請求されたとおりの発明がその特定の実施の形態に不当に限定されるべきでないことを理解されたい。確かに、生物化学および生物工学または関連分野の当業者には明らかな本発明を実施するための説明した形態の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内となることが意図されている。
項目
1. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドであって、 クロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片と、および/または、 クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片と、を含むポリペプチド。
2. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法であって、患者へのポリペプチドの投与を含み、前記ポリペプチドは以下を含む方法: クロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、 クロストリジウム神経毒H鎖の断片。
3. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドは以下を含む使用: クロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、 クロストリジウム神経毒H鎖の断片。
4. 前記L鎖は触媒として不活性である、項目1に記載の使用のためのポリペプチド、項目2に記載の方法、または、項目3に記載の使用。
5. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片と、および/または、クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片と、から本質的になる、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
6. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片と、および/または、クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片と、からなる、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
7. 前記クロストリジウム神経毒H鎖の前記断片は、トランスロケーションドメイン(HN)もしくはその断片、または、クロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HC)もしくはその断片を含む、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
8. 前記クロストリジウム神経毒H鎖の前記断片はHNドメインまたはその断片を含む、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
9. 前記クロストリジウム神経毒H鎖の前記断片はHNドメインまたはその断片からなる、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
10. 前記クロストリジウム神経毒H鎖の前記断片はHCドメインまたはその断片を含む、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
11. 前記クロストリジウム神経毒H鎖の前記断片はHCドメインまたはその断片からなる、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
12. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HCC)のC末端部分を欠いている、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
13. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒HNドメインおよびHCドメインの双方とも含まない、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
14. 前記ポリペプチドは非クロストリジウム性触媒ドメインをさらに含まない、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
15. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖またはその断片、および、HNドメインまたはその断片を含む、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
16. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖またはその断片、および、HNドメインまたはその断片からなる、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
17. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖およびHNドメインからなる、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
18. 先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは: a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または、
b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
19. 先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または、
b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
20. 先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または、
b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
21. 先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または、
b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
22. 先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または、
b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
23. 先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または、
b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
24. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドであって、触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含むポリペプチド。
25. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法であって、患者へのポリペプチドの投与を含み、前記ポリペプチドは触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含む方法。
26. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための薬剤の製造における触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含むポリペプチドの使用。
27. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドであって、配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、かつ/または、配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含むポリペプチド。
28. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法であって、患者へのポリペプチドの投与を含み、前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む方法。
29. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む使用。
30. 前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～29の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
31. 前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～30の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
32. 前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～31の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
33. 前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～32の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
34. 前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～33の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
35. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～34の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
36. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～35の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
37. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～36の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
38. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～37の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
39. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～38の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
40. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、項目27～39の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
41. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドであって、配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチド。
42. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法であって、患者へのポリペプチドの投与を含み、前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む方法。
43. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む使用。
44. 前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、項目41～43の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
45. 前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、項目41～44の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
46. 前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、項目41～45の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
47. 前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、項目41～46の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
48. 前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、項目41～47の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
49. 前記ポリペプチドは天然クロストリジウム神経毒H鎖を含まない、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
50. 前記ポリペプチドは神経栄養性である、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
51. 前記ポリペプチドはニューロン成長および/またはニューロン修復を促進する、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
52. 前記神経障害はニューロンの成長および/または修復を促進することによって治療可能な障害である、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
53. 前記神経障害はニューロン損傷、神経変性障害、感覚障害、または、自律神経障害である、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
54. 前記神経障害は神経外傷(例えば、傷および/または骨折に起因するもの)、ニューロパチー(例えば、末梢神経ニューロパチー)、脊髄損傷(例えば、麻痺を含める)、神経切断、脳損傷(例えば、外傷性脳損傷)、非外傷性損傷(例えば、脳卒中または脊髄梗塞)、および、腕神経叢への損傷、例えば、エルブ麻痺またはクルンプケ麻痺から選択されるニューロン損傷である、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
55. 前記神経障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病関連障害、運動ニューロン疾患、末梢神経ニューロパチー、運動神経ニューロパチー、プリオン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、単肢筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、ハレルフォルデン・スパッツ病、および、前頭側頭葉変異症から選択される神経変性障害である、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
56. 前記ポリペプチドは運動ニューロンの成長または修復を促進する、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
57. 前記ポリペプチドは、キメラクロストリジウム神経毒またはハイブリッドクロストリジウム神経毒などの修飾クロストリジウム神経毒である、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
58. 項目24～34または49～57の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
59. 項目24～34または49～58の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
60. 項目24～34または49～59の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
61. 項目24～34または49～60の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
62. 項目24～34または49～61の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
63. 項目24～34または49～62の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
64. 項目24～26または49～63の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
65. 項目24～26または49～64の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
66. 項目24～26または49～65の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
67. 項目24～26または49～66の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
68. 項目24～26または49～67の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
69. 項目24～26または49～68の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
70. 前記ポリペプチドは損傷部位に、または、その近くに投与され、好ましくは、前記ポリペプチドは髄腔内に投与される、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
71. 前記ポリペプチドは細胞受容体に結合するドメインをさらには含まない、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
72. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒の機能性HCドメインを欠き、何れの機能的に同等の外因性リガンド標的指向部分(TM)も同じく欠く、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
73. 前記ポリペプチドは患者の細胞内で発現されない、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
74. 前記ポリペプチドの前記クロストリジウム配列はクロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片からなる、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
75. 前記ポリペプチドは1つまたは複数の非クロストリジウム神経毒配列をさらに含む、先行項目の何れか一項目に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
76. 前記1つまたは複数の非クロストリジウム神経毒配列は細胞受容体に結合しない、項目75に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
77. 前記1つまたは複数の非クロストリジウム神経毒配列は細胞受容体に対するリガンドを含まない、項目75または76に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
78. 項目1～40または49～77に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは以下から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における修飾を含む修飾BoNT/Aまたはその断片であり: ASN886、ASN905、GLN915、ASN918、GLU920、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、GLU992、GLN995、ASN1006、ASN1025、ASN1026、ASN1032、ASN1043、ASN1046、ASN1052、ASP1058、HIS1064、ASN1080、GLU1081、GLU1083、ASP1086、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274、および、THR1277、ここで、前記修飾は以下から選択される:
i. 酸性表面露出アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換;
ii. 酸性表面露出アミノ酸残基の非荷電アミノ酸残基との置換;
iii. 非荷電表面露出アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換;
iv. 塩基性アミノ酸残基の挿入;および
v.酸性表面露出アミノ酸残基の欠失。
79. 前記ポリペプチドは、BoNT/A軽鎖およびトランスロケーションドメイン、ならびに、BoNT/B受容体結合ドメイン(HCドメイン)を含むキメラBoNTである、項目1～26または41～77に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
[図1、2、3]
Neurite Length per Cell: 細胞当たりの神経突起長
Untreated control: 未処置対照
[図3]
Negative controls: 陰性対照
Annexin IV: アネキシンIV
Ubiquitin: ユビキチン
E. coli lysate: 大腸菌溶解物
[図4]
Mean ratio (slips/total steps): 平均比率(滑り/総歩数)
Vehicle control: ビヒクル対照
Baseline: 基底値
2d: 2日
week: 週間
[図5]
Vehicle Control: ビヒクル対照
Animal: 動物
lesion: 損傷
[図6]
Number of neurites/cell: 神経突起数/細胞
SBA対照

Claims (79)

  1. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドであって、クロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片を含む、ポリペプチド。
  2. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法であって、患者へのポリペプチドの投与を含み、前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒H鎖の断片を含む、方法。
  3. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒H鎖の断片とを含む、使用。
  4. 前記L鎖は触媒として不活性である、請求項1に記載の使用のためのポリペプチド、請求項2に記載の方法、または、請求項3に記載の使用。
  5. 前記ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片から本質的になる、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  6. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片からなる、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  7. 前記クロストリジウム神経毒H鎖の前記断片はトランスロケーションドメイン(HN)もしくはその断片、またはクロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HC)もしくはその断片を含む、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  8. 前記クロストリジウム神経毒H鎖の前記断片はHNドメインまたはその断片を含む、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  9. 前記クロストリジウム神経毒H鎖の断片はHNドメインまたはその断片からなる、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  10. 前記クロストリジウム神経毒H鎖の前記断片はHCドメインまたはその断片を含む、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  11. 前記クロストリジウム神経毒H鎖の前記断片はHCドメインまたはその断片からなる、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  12. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒受容体結合ドメイン(HCC)のC末端部分を欠く、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  13. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒HNドメインおよびHCドメインの双方とも含まない、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  14. 前記ポリペプチドは非クロストリジウム性触媒ドメインをさらに含まない、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  15. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖またはその断片、および、HNドメインまたはその断片を含む、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  16. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖またはその断片、および、HNドメインまたはその断片からなる、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  17. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒L鎖およびHNドメインからなる、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  18. 先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは
    a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  19. 先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  20. 先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  21. 先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  22. 先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  23. 先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号3、5、7、19、21、23、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、もしくは、49の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号4、6、8、20、22、24、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、もしくは、50の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  24. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドであって、触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含むポリペプチド。
  25. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法であって、患者へのポリペプチドの投与を含み、前記ポリペプチドは触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含む方法。
  26. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための薬剤の製造における触媒として不活性なクロストリジウム神経毒L鎖を含むポリペプチドの使用。
  27. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドであって、配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、かつ/または、配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含むポリペプチド。
  28. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法であって、患者へのポリペプチドの投与を含み、前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む方法。
  29. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されたポリペプチド配列を含む使用。
  30. 前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27乃至29の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  31. 前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27乃至30の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  32. 前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27～31の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  33. 前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27乃至32の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  34. 前記ポリペプチドは配列番号42に対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号41に対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27乃至33のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  35. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27乃至34の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  36. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27乃至35の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  37. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27乃至36の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  38. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27乃至37の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  39. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27乃至38の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  40. 前記ポリペプチドは配列番号61または65に対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、かつ/または、前記ポリペプチドは配列番号60に対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている、請求項27乃至39の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  41. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進する際に使用するためのポリペプチドであって、配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチド。
  42. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための方法であって、患者へのポリペプチドの投与を含み、前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む方法。
  43. 患者の神経障害を治療するためにニューロン成長またはニューロン修復を促進するための薬剤の製造におけるポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む使用。
  44. 前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、請求項41乃至43の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  45. 前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、請求項41乃至44の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  46. 前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、請求項41乃至45の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  47. 前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、請求項41乃至46の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  48. 前記ポリペプチドは配列番号63または64に対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)、請求項41乃至47の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  49. 前記ポリペプチドは天然クロストリジウム神経毒H鎖を含まない、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  50. 前記ポリペプチドは神経栄養性である、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  51. 前記ポリペプチドはニューロン成長および/またはニューロン修復を促進する、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  52. 前記神経障害はニューロンの成長および/または修復を促進することによって治療可能な障害である、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  53. 前記神経障害はニューロン損傷、神経変性障害、感覚障害、または、自律神経障害である、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  54. 前記神経障害は、神経外傷(例えば、傷から、および/または、骨折に起因するもの)、ニューロパチー(例えば、末梢神経ニューロパチー)、脊髄損傷(例えば、麻痺を含む)、神経切断、脳損傷(例えば、外傷性脳損傷)、非外傷性損傷(例えば、脳卒中または脊髄梗塞)、および、腕神経叢への損傷、例えば、エルブ麻痺またはクルンプケ麻痺、から選択されるニューロン損傷である、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  55. 前記神経障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン病関連障害、運動ニューロン疾患、末梢神経ニューロパチー、運動神経ニューロパチー、プリオン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、単肢筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、ハレルフォルデン・スパッツ病、および、前頭側頭葉変異症から選択される神経変性障害である、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  56. 前記ポリペプチドは運動ニューロンの成長または修復を促進する、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  57. 前記ポリペプチドは、キメラクロストリジウム神経毒またはハイブリッドクロストリジウム神経毒などの修飾クロストリジウム神経毒である、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  58. 請求項24乃至34または49乃至57の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
    a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  59. 請求項24乃至34または49乃至58の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
    a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  60. 請求項24乃至34または49乃至59の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
    a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  61. 請求項24乃至34または49乃至60の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
    a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  62. 請求項24乃至34または49乃至61の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
    a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  63. 請求項24乃至34または49乃至62の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは触媒として不活性であり、かつ:
    a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33,35、37、39、41、43、45、47、49、もしくは、60の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、63、64、または、65の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  64. 請求項24乃至26または49乃至63の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  65. 請求項24乃至26または49乃至64の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  66. 請求項24乃至26または49乃至65の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  67. 請求項24乃至26または49乃至66の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  68. 請求項24乃至26または49乃至67の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  69. 請求項24乃至26または49乃至68の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは:
    a. 配列番号1、9、11、13、15、17、25、もしくは、33の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によって符号化されている;または
    b. 配列番号2、10、12、14、16、18、26、34、64、もしくは、65の何れか1つに対して少なくとも99.9%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む(好ましくは、からなる)。
  70. 先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは損傷部位に、または、その近くに投与され、好ましくは、前記ポリペプチドは髄腔内に投与される。
  71. 前記ポリペプチドは細胞受容体に結合するドメインをさらには含まない、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  72. 前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒の機能性HCドメインを欠き、任意の機能的に同等の外因性リガンド標的指向部分(TM)もやはり欠いている、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  73. 前記ポリペプチドは患者の細胞内で発現されない、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  74. 前記ポリペプチドの前記クロストリジウム配列はクロストリジウム神経毒軽鎖(L鎖)もしくはその断片、および/または、クロストリジウム神経毒重鎖(H鎖)の断片からなる、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  75. 前記ポリペプチドは1つまたは複数の非クロストリジウム神経毒配列をさらに含む、先行請求項の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  76. 前記1つまたは複数の非クロストリジウム神経毒配列は細胞受容体に結合しない、請求項75に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  77. 前記1つまたは複数の非クロストリジウム神経毒配列は細胞受容体に対するリガンドを含まない、請求項75または76に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
  78. 請求項1乃至40または49乃至77の何れか一項に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用、ここで、前記ポリペプチドは以下から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における修飾を含む修飾BoNT/Aまたはその断片であり: ASN886、ASN905、GLN915、ASN918、GLU920、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、GLU992、GLN995、ASN1006、ASN1025、ASN1026、ASN1032、ASN1043、ASN1046、ASN1052、ASP1058、HIS1064、ASN1080、GLU1081、GLU1083、ASP1086、ASN1188、ASP1213、GLY1215、ASN1216、GLN1229、ASN1242、ASN1243、SER1274、および、THR1277、前記修飾は以下から選択される:
    vi. 酸性表面露出アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換;
    vii. 酸性表面露出アミノ酸残基の非荷電アミノ酸残基との置換;
    viii. 非荷電表面露出アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基との置換;
    ix. 塩基性アミノ酸残基の挿入;および
    x. 酸性表面露出アミノ酸残基の欠失。
  79. 前記ポリペプチド、BoNT/A軽鎖およびトランスロケーションドメイン、ならびに、BoNT/B受容体結合ドメイン(HCドメイン)を含むキメラBoNTである請求項1～26または41乃至77に記載の使用のためのポリペプチド、方法、または、使用。
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