JP7229247B2 - 非ニューロンsnare切断性ボツリヌス神経毒 - Google Patents
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Description
血清型B、D、F及びGは、VAMP-2を切断し;
血清型A及びEは、SNAP-25を切断し;及び
血清型Cは、SNAP-25及びシンタキシンlaを切断する。
a)細胞不含アッセイ(好ましくは、約37℃で約1時間インキュベートされた、1マイクロモル濃度改変BoNT/A L鎖、20マイクロモル濃度hSNAP-23)における、0.2%を超える(例えば、0.5%を超える、好ましくは、1%を超える、より好ましくは、5%を超える)hSNAP-23切断-実施例2、図1を参照のこと;及び/又は
b)細胞不含アッセイ(好ましくは、約37℃で約1時間インキュベートされた、1マイクロモル濃度改変BoNT/A L鎖;20マイクロモル濃度hSNAP-23)における、225のKm未満(例えば、200未満、好ましくは、150未満)マイクロモル濃度-実施例2、図1を参照のこと;及び/又は
c)細胞不含アッセイ(好ましくは、約37℃で約1時間インキュベートされた、1マイクロモル濃度改変BoNT/A L鎖、20マイクロモル濃度hSNAP-23)における、0.2のKcat(1/分)未満(例えば、0.18未満、好ましくは、0.1未満)-実施例2、図1を参照のこと。
塩基性: アルギニン、リジン、ヒスチジン
酸性: グルタミン酸、アスパラギン酸
極性: グルタミン、アスパラギン
疎水性: ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン
芳香族: フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
小さい: グリシン、アラニン、セリン、スレオニン。
中性、極性アミノ酸と置換される酸性アミノ酸;
非極性アミノ酸と置換される極性アミノ酸;
非極性アミノ酸と置換される非極性アミノ酸;
極性アミノ酸と置換される非極性アミノ酸;
塩基性アミノ酸と置換される極性アミノ酸;
酸性アミノ酸と置換される非極性アミノ酸;
極性アミノ酸と置換される非極性アミノ酸。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148、T307、A308及びY312によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン及びチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基T307に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にフェニルアラニン、イソロイシン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基A308に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にプロリン、アスパラギン、スレオニン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iv.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y312 に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にリジン、バリン、メチオニン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン及びチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148、T307、A308及びY312によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基T307に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にフェニルアラニン、イソロイシン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基A308に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にプロリン、アスパラギン、スレオニン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y312 に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にリジン、バリン、メチオニン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換E148Y又はE148Nを含む改変BoNT/A L鎖;
置換T307I、A308P及びY312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換T307F、A308N及びY312Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148N、T307I及びA308P、Y312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307F、A308N及びY312Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307I、A308P及びY312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307L、A308T及びY312Mを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307L、A308I及びY312Mを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y又はE148Nを含む改変BoNT/A L鎖;
置換T307I、A308P及びY312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換T307F、A308N及びY312Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148N、T307I、A308P及びY312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307F、A308N及びY312Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307I、A308P及びY312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307L、A308T及びY312Mを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307L、A308I及びY312Mを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Yを含む改変BoNT/A L鎖;
置換T307Fを含む改変BoNT/A L鎖;
置換T307Iを含む改変BoNT/A L鎖;
置換Y312Kを含む改変BoNT/A L鎖;
置換Y312K、E148Yを含む改変BoNT/A L鎖;
置換T307I、A308P及びY312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148N、T307I、A308P及びY312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307F、A308N及びY312Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307L、A308T及びY312Mを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Yを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148N、T307I、A308P及びY312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307F、A308N及びY312Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307L、A308T及びY312Mを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Yを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148N、T307I、A308P及びY312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307F、A308N及びY312Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、T307L、A308T及びY312Mを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Yを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Yを含む改変BoNT/A L鎖;
置換T307Fを含む改変BoNT/A L鎖;
置換T307Iを含む改変BoNT/A L鎖;
置換Y312Kを含む改変BoNT/A L鎖;
置換Y312K及びE148Yを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Yを含む改変BoNT/A L鎖;
置換T307Iを含む改変BoNT/A L鎖;
置換Y312Kを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Yを含む改変BoNT/A L鎖。
置換A308Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換A308Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換A308Iを含む改変BoNT/A L鎖;
置換A308Pを含む改変BoNT/A L鎖;
置換A308Nを含む改変BoNT/A L鎖;
置換A308Tを含む改変BoNT/A L鎖;
置換Y312Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換Y312Mを含む改変BoNT/A L鎖;
置換Y312Lを含む改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のR186結合部位との結合のための第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143によって定義され;
c)前記アミノ酸残基変化は;
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換V304Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換V304Eを含む改変BoNT/A L鎖;
置換G305Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換G305Eを含む改変BoNT/A L鎖;
置換S143Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換S143Eを含む改変BoNT/A L鎖;
置換S143Qを含む改変BoNT/A L鎖;
置換K166Fを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y及びS143Eを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y及びS143Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y及びS143Qを含む改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための、第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義される;及び
b)hSNAP-23のR186結合部位との結合のための第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143によって定義される;
を含み:
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義される;及び
b)hSNAP-23のR186結合部位との結合のための第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143によって定義される;
を含み;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換E148Y及びS143Eを有する改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y及びS143Dを有する改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y、S143Dを含む改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のK185結合部位との結合のための第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基V304及びG305によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基V304に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換V304Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換V304Eを含む改変BoNT/A L鎖;
置換G305Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換G305Eを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y及びG305Dを有する改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義される;及び
b)hSNAP-23のK185 結合部位との結合のための第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305によって定義される;
を含み;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
a)hSNAP-23のD189/D192結合部位との結合のための第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアミノ酸残基アラニン;
を含む。
置換Q29Aを有する改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y、Q29Aを有する改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義される;及び
b)hSNAP-23のD189/D192結合部位との結合のための第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29によって定義される;
を含み;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換E148Y、Q29A及びS143Dを含む改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義される;及び
b)hSNAP-23のD189/D192結合部位との結合のための第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29によって定義される;及び
c)hSNAP-23のR186結合部位との結合のための第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143によって定義される;
を含み
d)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換E148Y、Q29A及びG305Dを含む改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義される;及び
b)hSNAP-23のD189/D192結合部位との結合のための第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29によって定義される;及び
c)hSNAP-23のK185 結合部位との結合のための第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305によって定義される;
を含み;
d)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
a)hSNAP-23のK206結合部位との結合のための第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251、L256、V258、L367及びF369によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基L256に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、アラニン及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基V258に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にセリン、アラニン、プロリン、ロイシン及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iv.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基L367に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニン及びグリシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
v.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基F369に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグリシン、セリン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
a)hSNAP-23のK206結合部位との結合のための第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1のアミノ酸残基Y251、L256、V258、L367及びF369によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基L256に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基V258に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にセリン、ロイシン及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iv.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基L367に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニン及びグリシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
v.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基F369に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグリシン、セリン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
a)hSNAP-23のK206結合部位との結合のための第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251、L256、V258、L367及びF369によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択さアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基L256に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基V258に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にセリン、ロイシン及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iv.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基L367に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニン及びグリシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
v.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基F369に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグリシン、セリン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換Y251Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換Y251Eを含む改変BoNT/A L鎖;
置換L256Dを含む改変BoNT/A L鎖。
置換Y251Eを含む改変BoNT/A L鎖。
置換V245Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換L256Eを含む改変BoNT/A L鎖;
置換L256Gを含む改変BoNT/A L鎖;
置換L256Qを含む改変BoNT/A L鎖;
置換L256Aを含む改変BoNT/A L鎖;
置換V258Aを含む改変BoNT/A L鎖;
置換V258Pを含む改変BoNT/A L鎖;
置換V258Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換L256E及びV258Pを含む改変BoNT/A L鎖;
置換L256Q及びV258Pを含む改変BoNT/A L鎖;
置換L256A及びV258Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換L256G及びV258Lを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y及びY251Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y及びL256Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y及びY251Eを含む改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義される;及び
b)hSNAP-23のK206結合部位との結合のための第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251によって定義される;
を含み;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換E148Y、S143D、Q29A及びY251Eを含む改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義される;及び
b)hSNAP-23のR186結合部位との結合のための第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143によって定義される;及び
c)hSNAP-23のD189/D192結合部位との結合のための第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29Aによって定義される;及び
d)hSNAP-23のK206結合部位との結合のための第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251によって定義される;
を含み;
e)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
iv.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
a)hSNAP-23のI198結合部位との結合のための第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にバリン、フェニルアラニン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換K166Vを含む改変BoNT/A L鎖;
置換K166Fを含む改変BoNT/A L鎖;
置換K166Lを含む改変BoNT/A L鎖;
置換K166Iを含む改変BoNT/A L鎖。
置換K166Fを含む改変BoNT/A L鎖;
置換K166Lを含む改変BoNT/A L鎖。
置換K166Fを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y、K166F及びG305Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、K166V及びG305Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、S143D及びK166Fを含む改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義される;及び
b)hSNAP-23のI198結合部位との結合のための第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166によって定義される;及び
c)hSNAP-23のK185結合部位との結合のための第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305によって定義される;
を含み;
d)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換E148Y、K166F及びG305Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、S143D及びK166Fを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y、Q29A、K166V及びG305Dを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、Q29A、K166F及びG305Dを含む改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義される;及び
b)hSNAP-23のI198結合部位との結合のための第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166によって定義される;及び
c)hSNAP-23のD189/D192結合部位との結合のための第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29Aによって定義される;及び
d)hSNAP-23のK185結合部位との結合のための第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化;ここで、前記の第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305によって定義される;
を含み;
e)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び
iv.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む。
置換E148Y、Q29A、K166F及びG305Dを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y、Q29A、K166F、Y251E及びG305Dを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y及びK166Fを含む改変BoNT/A L鎖;
置換G305D及びK166Fを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y及びK166Fを含む、改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のD210結合部位との結合のための第7のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第7のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S254によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S254に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置に1個の(例えば、その)アミノ酸残基アラニンを含む。
置換S254Aを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y、K166F及びS254Aを含む改変BoNT/A L鎖;
置換E148Y、K166F、S254A及びG305Dを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y、K166F、S254A及びG305Dを含む改変BoNT/A L鎖。
a)hSNAP-23のD168結合部位との結合のための第8のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第8のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K340によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K340に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置に1個の(例えば、その)アミノ酸残基ヒスチジンを含む。
置換K340Hを含む改変BoNT/A L鎖。
置換E148Y及びK340Hを含む改変BoNT/A L鎖。
a)本発明の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は本発明の改変BoNT/A L鎖をコードする核酸配列を含む、若しくはからなる核酸構築物、並びに
b)前記改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は前記核酸構築物を標的細胞に送達するための手段。
1)クロストリジウム神経毒L鎖;
2)送達ビヒクルを、選択した標的細胞に向ける標的化部分(TM)。通常、天然クロストリジウム神経毒結合ドメイン(HCC)は、HCCの天然標的細胞以外の所望の標的細胞との送達ビヒクルの選択的結合を提供するために、リガンドによって置き換えられ得る。好ましい実施形態では、1つより多いTMが使用され得る(随意により、クロストリジウム神経毒結合ドメインを含む);
3)クロストリジウム神経毒L鎖の、標的細胞への送達を確実にするための転位置ペプチド(例えば、クロストリジウム神経毒HN転位置ドメイン)、次いで、クロストリジウム神経毒L鎖は、標的細胞において、そのタンパク質分解効果(すなわち、SNAREタンパク質の切断)を発揮できる。
- i)送達ビヒクルを標的細胞と結合させる標的化部分(TM)。前記標的化部分は、天然クロストリジウム神経毒結合ドメイン(HCC)又は、より好ましくは、前記HCCの天然標的細胞以外の標的細胞との結合を提供するリガンドのいずれかであり得る;及び
- ii)本発明の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼを、標的細胞中、好ましくは、前記細胞のサイトゾル中に転位置する転位置ペプチド。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(Y1111~L1296)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(Y1098~E1291)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(Y1112~E1291)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(Y1099~E1276)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(Y1086~K1252)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(Y1106~E1274)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(Y1106~E1297)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(Y1128~D1315)
が挙げられる。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(449~871)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(441~858)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(442~866)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(446~862)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(423~845)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(440~864)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(442~863)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(458~879)
が挙げられる。
ボツリヌスA型神経毒-アミノ酸残基(872~1110)
ボツリヌスB型神経毒-アミノ酸残基(859~1097)
ボツリヌスC型神経毒-アミノ酸残基(867~1111)
ボツリヌスD型神経毒-アミノ酸残基(863~1098)
ボツリヌスE型神経毒-アミノ酸残基(846~1085)
ボツリヌスF型神経毒-アミノ酸残基(865~1105)
ボツリヌスG型神経毒-アミノ酸残基(864~1105)
テタヌス神経毒-アミノ酸残基(880~1127)。
1)送達ビヒクルの、その標的化部分(TM)を介した標的細胞との結合;及び
2)改変BoNT/A L鎖の、標的細胞への、好ましくは、前記標的細胞のサイトゾルへの、送達ビヒクルの転位置ペプチドを介した転位置。
配列番号1 - 野生型 BoNT/A 軽鎖 (Uniprot A5HZZ9 の アミノ酸残基 1-438)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSK
配列番号2 - ヒト SNAP23
MDNLSSEEIQQRAHQITDESLESTRRILGLAIESQDAGIKTITMLDEQKEQLNRIEEGLDQINKDMRETEKTLTELNKCCGLCVCPCNRTKNFESGKAYKTTWGDGGENSPCNVVSKQPGPVTNGQLQQPTTGAASGGYIKRITNDAREDEMEENLTQVGSILGNLKDMALNIGNEIDAQNPQIKRITDKADTNRDRIDIANARAKKLIDS
配列番号3 - ヒト 及び げっ歯類 SNAP25
MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG
配列番号4 - IgA-プロテアーゼ部位 His6Tag (artificial)
PPTPGHHHHHH
配列番号5 - Twin Strep Tag (artificial)
MASWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEKGAGS
配列番号6 - His6 Tag (artificial)
GHHHHHH
配列番号7 - V-IgA-プロテアーゼ部位 His6Tag (artificial)
VPPTPGHHHHHH
配列番号8 - 野生型 BoNT/A1
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
配列番号9 - LHN リンカー (artificial)
vrgiitsktksldkgynkalndl
配列番号10 - enterokinase 活性化部位
DDDDK
配列番号11 - BoNT/A1 活性化ループ
VDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQ
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148、T307、A308及びY312によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン及びチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基T307に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にフェニルアラニン、イソロイシン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基A308に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にプロリン、アスパラギン、スレオニン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iv.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y312に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にリジン、バリン、メチオニン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼ。
2.a)hSNAP-23のR186結合部位との結合のための第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、条項1に従う改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
3.a)hSNAP-23のK185結合部位との結合のための第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基V304及びG305によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基V304に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、条項1又は2に従う改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
4.a)hSNAP-23のD189/D192結合部位との結合のための第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、任意の前記の条項に従う改変BoNT/ A L鎖プロテアーゼ。
5.a)hSNAP-23のK206結合部位との結合のための第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251、L256、V258、L367及びF369によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基L256に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、アラニン及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基V258に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にセリン、アラニン、プロリン、ロイシン及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iv.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基L367に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニン及びグリシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
v.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基F369に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグリシン、セリン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、任意の前記の条項に従う改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
6.a)hSNAP-23のI198結合部位との結合のための第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にバリン、フェニルアラニン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、任意の前記の条項に従う改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
7.a)hSNAP-23のD210結合部位との結合のための第7のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第7のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S254によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S254に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、任意の前記の条項に従う改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
8.a)hSNAP-23のD168結合部位との結合のための第8のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第8のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K340によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K340に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、任意の前記の条項に従う改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
9.ヒトSNAP-23(hSNAP-23)を切断し、かつ、野生型BoNT/A L鎖)(配列番号1)と比較して改変されたアミノ酸配列を有する、改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼであって、これは:
a)hSNAP-23のD189/D192結合部位との結合のための第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼ。
10.ヒトSNAP-23(hSNAP-23)を切断し、かつ、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)と比較して改変されたアミノ酸配列を有する改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼであって、これは:
a)hSNAP-23のI198結合部位との結合のための第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にバリン、フェニルアラニン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼ。
11.ヒトSNAP-23(hSNAP-23)を切断し、かつ、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)と比較して改変されたアミノ酸配列を有する改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼであって、これは:
a)hSNAP-23のK206結合部位との結合のための第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251、L256、V258、L367及びF369によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基L256に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン酸、グルタミン、グリシン、アラニン及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基V258に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にセリン、アラニン、プロリン、ロイシン及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iv.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基L367に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニン及びグリシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
v.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基F369に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグリシン、セリン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼ。
12.ヒトSNAP-23(hSNAP-23)を切断し、かつ、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)と比較して改変されたアミノ酸配列を有する改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A) L鎖プロテアーゼであって、これは:
a)hSNAP-23のD210結合部位との結合のための第7のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第7のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S254によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S254に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼ。
13.ヒトSNAP-23(hSNAP-23)を切断し、かつ、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)と比較して改変されたアミノ酸配列を有する改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼであって、これは:
a)hSNAP-23のD168結合部位との結合のための第8のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第8のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K340によって定義され;
c)前記アミノ酸残基変化は
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K340に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼ。
14.異なるBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を更に含み、前記アミノ酸残基変化及び前記の別のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、条項1~13のいずれか1つに列挙される技術的特徴によって定義される、条項9~13のいずれかに従う改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼ。
15.任意の先行する条項において定義されるような改変BoNT/A L鎖プロテアーゼをコードする核酸配列を含む、又はからなる核酸構築物。
16.a)任意の条項1~14において定義されるような改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は条項15の核酸構築物;及び
b)前記改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は前記核酸構築物を、標的細胞に、好ましくは、非ニューロン標的細胞に送達する手段;
を含む、送達ビヒクル。
17.前記改変BoNT/A L鎖プロテアーゼを標的細胞に送達する手段b)が:
i)送達ビヒクルを標的細胞と結合する標的化部分;及び
ii)改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は核酸構築物を標的細胞に、好ましくは、非ニューロン標的細胞に転位置する転位置ペプチド;
を含む、条項16に従う送達ビヒクル。
18.hSNAP-23を、条項1~14のいずれかに従う(BoNT/A)L鎖プロテアーゼと、又は条項15に従う核酸構築物と、又は条項16若しくは17に従う送達ビヒクルと接触させることを含む、hSNAP-23を切断する方法。
19.条項18に従う方法において使用するための、条項1~14のいずれかに従う(BoNT/A)L鎖プロテアーゼ、又は条項15に従う核酸構築物、又は条項16若しくは17に従う送達ビヒクル。
[態様1]
ヒトSNAP-23(hSNAP-23)を切断し、かつ、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)と比較して改変されたアミノ酸配列を有する改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼであって、これは:
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148、T307、A308及びY312によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアスパラギン及びチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
ii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基T307に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にフェニルアラニン、イソロイシン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iii.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基A308に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にプロリン、アスパラギン、スレオニン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;及び/又は
iv.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y312に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にリジン、バリン、メチオニン及びロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼ。
[態様2]
a)hSNAP-23のD189/D192結合部位との結合のための第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、態様1に記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
[態様3]
a)hSNAP-23のI198結合部位との結合のための第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、態様1又は態様2に記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
[態様4]
a)hSNAP-23のK185結合部位との結合のための第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、先行する態様のいずれか一項に記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
[態様5]
a)hSNAP-23のR186結合部位との結合のための第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、先行する態様のいずれか一項に記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
[態様6]
a)hSNAP-23のK206結合部位との結合のための第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、先行する態様のいずれか一項に記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。
[態様7]
いずれかの先行する態様に記載される改変BoNT/A L鎖プロテアーゼをコードする核酸配列を含む、又はからなる核酸構築物。
[態様8]
a)態様1から6のいずれかに記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は態様7に記載の核酸構築物;及び
b)前記改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は前記核酸構築物を、標的細胞に、好ましくは、非ニューロン標的細胞に送達する手段;
を含む、送達ビヒクル。
[態様9]
前記改変BoNT/A L鎖プロテアーゼを標的細胞に送達する手段b)が:
i)送達ビヒクルを標的細胞と結合する標的化部分;及び
ii)改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は核酸構築物を、標的細胞に、好ましくは、非ニューロン標的細胞に転位置する転位置ペプチド;
を含む、態様8に記載の送達ビヒクル。
[態様10]
hSNAP-23を切断する方法であって、hSNAP-23を、態様1から6のいずれかに記載の(BoNT/A) L鎖プロテアーゼと、又は態様7に記載の核酸構築物と、又は態様8若しくは9に記載の送達ビヒクルと接触させることを含む、方法。
[態様11]
態様10に記載の方法において使用するための、態様1から6のいずれかに記載の(BoNT/A) L鎖プロテアーゼ又は態様7に記載の核酸構築物又は態様8若しくは9に記載の送達ビヒクル。
[態様12]
医薬として使用するための、態様1から6のいずれかに記載の(BoNT/A) L鎖プロテアーゼ又は態様7に記載の核酸構築物又は態様8若しくは9に記載の送達ビヒクル。
hSNAP23 binding sites: hSNAP23結合部位
Point-mutations (in wt LC/A): 点突然変異(wt LC/A中)
Fold increase hSNAP23 cleavage (vs wild type LC/A): hSNAP23切断増大倍数(野生型LC/Aに対する)
% hSNAP23 cleavage (at 1 μM LC/A, 20 μM hSNAP23): hSNAP23切断百分率(1μM LC/A、20μM hSNAP23で)
kcat [1/min]: kcat[1/分]
% hSNAP25 cleavage (at 0.5 nM LC/A, 20 μM hSNAP25): hSNAP25切断百分率(0.5nM LC/A、20μM hSNAP25で)
none (wild type LC/A): なし(野生型LC/A)
[図1B]
hSNAP23 binding sites: hSNAP23結合部位
Point-mutations (in wt LC/A): 点突然変異(wt LC/A中)
Fold increase hSNAP23 cleavage (vs LC/A-E148Y): hSNAP23切断増大倍数(LC/A-E148Yに対する)
% hSNAP23 cleavage (% at 1 μM LC/A, 20 μM hSNAP23): hSNAP23切断百分率(1μM LC/A、20μM hSNAP23での百分率)
[**% at 10 nM LC/A]: [**10nM LC/Aでの百分率]
kcat [1/min]: kcat[1/分]
% hSNAP25 cleavage (at 0.5 nM LC/A, 20 μM hSNAP25): hSNAP25切断百分率(0.5nM LC/A、20μM hSNAP25で)
[図1C]
hSNAP23 binding sites: hSNAP23結合部位
Point-mutations (in wt LC/A): 点突然変異(wt LC/A中)
Fold change hSNAP23 cleavage (vs WT LC/A): hSNAP23切断変化倍数(WT LC/Aに対する)
% hSNAP23 cleavage (% at 1 μM LC/A, 20 μM hSNAP23): hSNAP23切断百分率(1μM LC/A、20μM hSNAP23での百分率)
[**% at 10 nM LC/A]: [**10nM LC/Aでの百分率]
% hSNAP25 cleavage v WT LC/A (at 0.5 nM LC/A, 20 μM hSNAP25): WT LC/Aに対するhSNAP25切断百分率(0.5nM LC/A、20μM hSNAP25で)
[図2]
cleavable peptide bond: 切断可能なペプチド結合
Claims (12)
- 野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)と比較して、増大したヒトSNAP-23(hSNAP-23)切断を実証し、かつ、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)と比較して改変されたアミノ酸配列を有する改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼであって、これは:
a)hSNAP-23のP182/D178結合部位との結合のための第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を含み;
b)前記の第1のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化は:
野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基E148に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアミノ酸残基チロシン;
を含む、改変ボツリヌス神経毒A(BoNT/A)L鎖プロテアーゼ。 - a)hSNAP-23のD189/D192結合部位との結合のための第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第2のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Q29に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、請求項1に記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。 - a)hSNAP-23のI198結合部位との結合のための第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第3のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基K166に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にバリンからなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、請求項1又は請求項2に記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。 - a)hSNAP-23のK185結合部位との結合のための第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第4のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基G305に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、請求項1乃至3のいずれか一項に記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。 - a)hSNAP-23のR186結合部位との結合のための第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置するアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第5のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143によって定義され;
c)かつ、前記アミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基S143に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。 - a)hSNAP-23のK206結合部位との結合のための第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケット内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基変化を更に含み;
b)前記の第6のBoNT/A L鎖プロテアーゼ結合ポケットは、野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251によって定義され;
c)かつ、前記の少なくとも1つのアミノ酸残基変化が:
i.野生型BoNT/A L鎖(配列番号1)のアミノ酸残基Y251に対応する改変L鎖プロテアーゼアミノ酸配列上の位置にグルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基;
を含む、請求項1乃至5のいずれか一項に記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ。 - 請求項1乃至6のいずれか一項に記載される改変BoNT/A L鎖プロテアーゼをコードする核酸配列を含む、又はからなる核酸構築物。
- a)請求項1から6のいずれかに記載の改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は請求項7に記載の核酸構築物;及び
b)前記改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は前記核酸構築物を、標的細胞に、又は、非ニューロン標的細胞に送達する手段;
を含む、送達ビヒクル。 - 前記改変BoNT/A L鎖プロテアーゼを標的細胞に送達する手段b)が:
i)送達ビヒクルを標的細胞と結合する標的化部分;及び
ii)改変BoNT/A L鎖プロテアーゼ又は核酸構築物を、標的細胞に、又は、非ニューロン標的細胞に転位置する転位置ペプチド;
を含む、請求項8に記載の送達ビヒクル。 - hSNAP-23を切断する試験管内の又は生体外の方法であって、hSNAP-23を、請求項1から6のいずれかに記載の(BoNT/A) L鎖プロテアーゼと、又は請求項7に記載の核酸構築物と、又は請求項8若しくは9に記載の送達ビヒクルと試験管内又は生体外において接触させることを含む、方法。
- 請求項10に記載の方法において使用するための、請求項1から6のいずれかに記載の(BoNT/A) L鎖プロテアーゼ又は請求項7に記載の核酸構築物又は請求項8若しくは9に記載の送達ビヒクル。
- 医薬として使用するための、請求項1から6のいずれかに記載の(BoNT/A) L鎖プロテアーゼ又は請求項7に記載の核酸構築物又は請求項8若しくは9に記載の送達ビヒクル。
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