UA128185C2 - Ботулінічний нейротоксин, який розщеплює ненейронний snare - Google Patents
Ботулінічний нейротоксин, який розщеплює ненейронний snare Download PDFInfo
- Publication number
- UA128185C2 UA128185C2 UAA202003732A UAA202003732A UA128185C2 UA 128185 C2 UA128185 C2 UA 128185C2 UA A202003732 A UAA202003732 A UA A202003732A UA A202003732 A UAA202003732 A UA A202003732A UA 128185 C2 UA128185 C2 UA 128185C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- chain
- vomt
- amino acid
- modified
- acid residue
- Prior art date
Links
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 title description 19
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 title description 17
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 263
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 259
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 255
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 502
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 365
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 176
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 105
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 90
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 69
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 69
- 101710127332 Protease I Proteins 0.000 claims description 52
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 claims description 52
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 25
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 23
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 21
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Chemical group CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 17
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 16
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 claims description 15
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 11
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 11
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 5
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 2
- MCNQUWLLXZZZAC-UHFFFAOYSA-N 4-cyano-1-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methoxyphenyl)-n-piperidin-1-ylpyrazole-3-carboxamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(C#N)C(C(=O)NN2CCCCC2)=NN1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl MCNQUWLLXZZZAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 241001376324 Melon yellowing-associated virus Species 0.000 claims 1
- 241001436793 Meru Species 0.000 claims 1
- 241000549435 Pria Species 0.000 claims 1
- 235000015241 bacon Nutrition 0.000 claims 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims 1
- 101000652300 Homo sapiens Synaptosomal-associated protein 23 Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000052522 human SNAP23 Human genes 0.000 abstract 3
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 abstract 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 147
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 117
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 51
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 50
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 39
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 22
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 20
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 18
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 13
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 10
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 9
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 9
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 9
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- -1 6-M-methyllysine Chemical compound 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- 101710117523 Botulinum neurotoxin type C Proteins 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010069023 botulinum toxin type E Proteins 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 6
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 101001082628 Mus musculus H-2 class II histocompatibility antigen gamma chain Proteins 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 5
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 4
- 101000941893 Felis catus Leucine-rich repeat and calponin homology domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 101710117524 Botulinum neurotoxin type B Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 3
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 3
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 3
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000050389 Syntaxin Human genes 0.000 description 3
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 231100001102 clostridial toxin Toxicity 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 3
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 101100264174 Mus musculus Xiap gene Proteins 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000036617 axillary hyperhidrosis Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N cis-4-Hydroxy-L-proline Chemical compound O[C@@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 2
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 2
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 2
- 210000004020 intracellular membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-phenylpropan-2-amine Chemical compound CNC(C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- UJXJZOCXEZPHIE-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(2-hydroxyethylamino)-4-sulfanylbutanoic acid Chemical compound OCCN[C@H](C(O)=O)CCS UJXJZOCXEZPHIE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- PDRJLZDUOULRHE-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-3-pyridin-2-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=N1 PDRJLZDUOULRHE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- DFZVZEMNPGABKO-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-3-pyridin-3-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CN=C1 DFZVZEMNPGABKO-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- FQFVANSXYKWQOT-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-azaniumyl-3-pyridin-4-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=NC=C1 FQFVANSXYKWQOT-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- FXGZFWDCXQRZKI-VKHMYHEASA-N (2s)-5-amino-2-nitramido-5-oxopentanoic acid Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)N[N+]([O-])=O FXGZFWDCXQRZKI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- CCAIIPMIAFGKSI-DMTCNVIQSA-N (2s,3r)-3-hydroxy-2-(methylazaniumyl)butanoate Chemical compound CN[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CCAIIPMIAFGKSI-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- CNPSFBUUYIVHAP-WHFBIAKZSA-N (2s,3s)-3-methylpyrrolidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound C[C@H]1CCN[C@@H]1C(O)=O CNPSFBUUYIVHAP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N (4R,5S)-dethiobiotin Chemical compound C[C@@H]1NC(=O)N[C@@H]1CCCCCC(O)=O AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- PYVRVRFVLRNJLY-KTKRTIGZSA-N 1-oleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(O)COP(O)(=O)OCCN PYVRVRFVLRNJLY-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 4-fluoro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(F)C=C1 XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000035315 Avulavirus Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 108090000932 Calcitonin Gene-Related Peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000004414 Calcitonin Gene-Related Peptide Human genes 0.000 description 1
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010063006 Facial spasm Diseases 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 108090001053 Gastrin releasing peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000004862 Gastrin releasing peptide Human genes 0.000 description 1
- 108010016122 Ghrelin Receptors Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102100039256 Growth hormone secretagogue receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000004095 Hemifacial Spasm Diseases 0.000 description 1
- 241000893570 Hendra henipavirus Species 0.000 description 1
- 241000035314 Henipavirus Species 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 101000652315 Homo sapiens Synaptosomal-associated protein 25 Proteins 0.000 description 1
- YZJSUQQZGCHHNQ-UHFFFAOYSA-N Homoglutamine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(N)=O YZJSUQQZGCHHNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 208000008454 Hyperhidrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241000087799 Koma Species 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 101800002739 Melanin-concentrating hormone Proteins 0.000 description 1
- 102400001132 Melanin-concentrating hormone Human genes 0.000 description 1
- 241000351643 Metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 description 1
- 101100069023 Mus musculus Gmip gene Proteins 0.000 description 1
- 101100072790 Mus musculus Irf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 235000009421 Myristica fragrans Nutrition 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 231100000742 Plant toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 241000713656 Simian foamy virus Species 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 235000018087 Spondias lutea Nutrition 0.000 description 1
- 241000713675 Spumavirus Species 0.000 description 1
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 1
- 102100030545 Synaptosomal-associated protein 23 Human genes 0.000 description 1
- 102100030552 Synaptosomal-associated protein 25 Human genes 0.000 description 1
- 108700023707 TUG1 Proteins 0.000 description 1
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010011107 Urotensins Proteins 0.000 description 1
- 241000711970 Vesiculovirus Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108040006828 beta2-adrenergic receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014974 beta2-adrenergic receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 201000002866 cervical dystonia Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- WDRWZVWLVBXVOI-QTNFYWBSSA-L dipotassium;(2s)-2-aminopentanedioate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O WDRWZVWLVBXVOI-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N gastrin-releasingpeptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- MWFRVMDVLYIXJF-BYPYZUCNSA-N hydroxyethylcysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSCCO MWFRVMDVLYIXJF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000037315 hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 231100000568 intoxicate Toxicity 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- GCHPUFAZSONQIV-UHFFFAOYSA-N isovaline Chemical compound CCC(C)(N)C(O)=O GCHPUFAZSONQIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001847 jaw Anatomy 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000001115 mace Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- ORRDHOMWDPJSNL-UHFFFAOYSA-N melanin concentrating hormone Chemical compound N1C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CCSC)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCNC(N)=N)NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC(O)=O)C(C)O)CCSC)CSSCC(C(=O)NC(CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(C(C)C)C(O)=O)NC(=O)C2CCCN2C(=O)C(CCCNC(N)=N)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 ORRDHOMWDPJSNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940078547 methylserine Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000013919 monopotassium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003040 nociceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N pipecolic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 description 1
- 230000018448 secretion by cell Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 1
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 210000001260 vocal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
- A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
Abstract
Винахід стосується модифікованої протеази L-ланцюга ботулінічного нейротоксину А (BoNT/А), яка демонструє підвищене розщеплення людського SNAP-23 (hSNAP-23) порівняно з немодифікованою протеазою L-ланцюга BoNT/А дикого типу, а також її застосування для розщеплення hSNAP-23.
Description
(54) БОТУЛІНІЧНИЙ НЕЙРОТОКСИН, ЯКИЙ РОЗЩЕПЛЮЄ НЕНЕЙРОННИЙ 5МАВЕ (57) Реферат:
Винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка демонструє підвищене розщеплення людського ЗМАР-23 (пеМАР-23) порівняно з немодифікованою протеазою І-ланцюга ВоМТ/А дикого типу, а також її застосування для розщеплення ПЗМАР-23.
Вступ
Даний винахід стосується модифікованої протеази ботулінічного нейротоксину, що має здатність розщеплювати ненейронний білок 5МАКЕ, та її застосування для пригнічення небажаної секреції з клітини ссавця шляхом розщеплення вказаного ненейронного білка ЗМАКЕ у вказаній клітині ссавця.
Токсини зазвичай поділяються на один з двох класів, а саме: цитотоксичні токсини (наприклад, рослинний токсин, такий як рицин), які вбивають їхні природні клітини-мішені, і нецитотоксичні токсини (наприклад, ботулінічні нейротоксини), які не вбивають їхні природні клітини-мішені. Нецитотоксичні токсини здійснюють свій вплив на клітину-мішень, інгібуючи клітинний процес, відмінний від синтезу білка.
Протеази ботулінічного нейротоксину діють шляхом протеолітичного розщеплення внутрішньоклітинних транспортних білків, відомих як білки ЗМАКЕ (наприклад, ЗМАР-25, МАМР або синтаксин). Скорочення 5МАКЕ походить від терміну "розчинний рецептор білка приєднання М5Е", де МО5Е означає чутливий до М-етилмалеіїміду фактор. Білки ЗМАКЕ - це велике суперсімейство білків. Важливою функцією білків «МАКЕ є опосередкування екзоцитозу молекул нейромедіаторів до постсинаптичного з'єднання. Тому білки 5МАКЕ є невід'ємною частиною секреції молекул за допомогою везикулярного транспорту з клітини.
Сіозігідіит Боїшіпит продукує сім (від А до (3) різних нейротоксинів (ВоМТ), які диференційовані серологічно відповідно до відсутності антисироваткової перехресної нейтралізації серотипу. ВоОМТ викликають нейрон-специфічний атонічний параліч шляхом впливу на нейрони і розщеплення нейрон-специфічних білків ЗМАКЕ.
ВоМтТ мають поліпептидний ланцюг 150 кДа, що містить важкий ланцюг 100 кДа і легкий ланцюг 50 кДа, зв'язані дисульфідним зв'язком. ВоМТ організовані в три функціональних домени: М-кінцевий протеолітичний легкий ланцюг (І -ланцюг); ії С-кінцевий важкий ланцюг (Н- ланцюг), останній складається з транслокаційного домену (Н»к) і С-кінцевого нейрон-зв'язуючого домену (Нс). Токсичний ефект ВоМтТ (нервова інтоксикація) здійснюється за триетапним механізмом дії. Спочатку, частина Нс зв'язується з холінергічною нервовою клітиною |і інтерналізується шляхом опосередкованого рецептором ендоцитозу. Потім, частина Нм транслокує І -ланцюг через ендосомальну мембрану в цитозоль нервової клітини. І нарешті, 1 -
Зо ланцюг зв'язується і розщеплює нейронний білок ЗМАКЕ в цитозолі, тим самим пригнічуючи вивільнення нейромедіатора з нервової клітини і призводячи до інтоксикації нервової клітини.
Сім серотипів ВОМТ розщеплюють специфічні залишки в одному з трьох білків ЗМАКЕ: серотипи В, 0, Е ії 5 розщеплюють МАМР-2; серотипи А і Е розщеплюють З5МАР-25; і серотип С розщеплює ЗМАР-25 і синтаксин Іа.
У той час як нативні ВОоМТ здатні націлюватися і розщеплювати нейронні ізоформи ЗМАКЕ, такі як МАМР-2, 5МАР-25 і синтаксин-1а, вказані протеази мають незначну або зовсім не мають розщеплювальної дії на більшість ненейронних білків 5МАКЕ. Ця субстратна специфічність відносно нейронних 5МАКЕ відповідає і розуміється як відображення природної специфічності зв'язування нервових клітин, ВоОМТ, що демонструється. Наприклад, ВоМТ/А розщеплює людський ЗМАР-25, але не його людські ненейронні ізоформи.
Ще в 1989 році Управління з контролю якості харчових продуктів і лікарських препаратів (ЕСОА США) схвалило ВоМТ/А для лікування косоокості, блефароспазму і геміфаціального спазму, а потім для лікування шийної дистонії, косметичного застосування, для усунення глабелярних зморшок обличчя і пахвового гіпергідрозу. Ефективність ВоОМТ/А при дистонії та інших розладах, пов'язаних з мимовільною активністю скелетних м'язів, в поєднанні із задовільним профілем безпеки, підштовхнула медиків до його емпіричного/не за призначенням застосування при різноманітних виділеннях, а також при болях і косметичних розладах.
Клінічне застосування ВоМТ сфокусоване на розладах, пов'язаних з нервово-м'язовою активністю. Зовсім недавно піонерне дослідження, проведене компанією Зупіахіп ЦО, дозволило розробити перенапралені ВоМТ, які зв'язуються з унікальною групою нейронів (наприклад, ноцицептивними аферентами - див. Міжнародну патентну заявку, М/О96/33273, зміст якої повністю включений в даний винахід) і/або з клітинами, які не є нейронами (наприклад, клітинами епітелію дихальних шляхів - див. Міжнародну патентну заявку
ММО00/10598, зміст якої повністю включений в даний винахід). Ця технологія, відома як технологія направленого інгібування секреції (Т5І), включає заміну нативного зв'язуючого домену ВОоМТ іншим націлюючим фрагментом (наприклад, фактором росту або іншою сигнальною молекулою), і вона відкрила двері для нових методів лікування і видів терапії, які грунтуються на використанні ВОоМТ. бо Однак вибіркове розщеплення нейрон-специфічних білків ЗМАКЕ з допомогою ВоМтТ обмежило розробку нових методів лікування в цих ненейронних системах. Вважається, що нейронні і ненейронні білюм З5МАКЕ однаково важливі для процесу злиття внутрішньоклітинних везикул і, отже, для секреції молекул за допомогою транспорту везикул з клітини. Відповідно, застосування традиційних терапевтичних засобів на основі ВоОМТ для інактивації секреції, керованої нейронним білком 5МАКЕ, не буде направлене на будь-яку відповідну клітинну секрецію, керовану ненейронними ЗМАКЕ.
Відповідно, існує потреба в сконструйованій протеазі |-ланцюга ВоМТ, яка ефективно розщеплює ненейронний білок ЗМАКЕ.
Даний винахід вирішує одну або більше з вищезгаданих проблем шляхом створення сконструйованої протеази І-ланцюга ВоМТ/А, яка розщеплює ізоформу білка ЗМАКЕ, яка в основному експресується в клітинах, що не є нейронами, а саме - в ЗХМАР-23 людини (П5МАР- 23). Даний винахід, таким чином, стосується нового класу нецитотоксичного терапевтичного агента.
Детальний опис винаходу
Якщо тут не вказане інше, то наукові і технічні терміни, що використовуються в зв'язку з даним винаходом, повинні мати значення, які зазвичай розуміють фахівці в даній галузі техніки.
Крім того, якщо з контексту не слідує інше, то номенклатури і методики культивування клітин і тканин, що використовуються тут, є добре відомими і широко використовуються в даній галузі техніки.
Проте, що стосується використання різних термінів в даному описі, то більш конкретно застосовні наступні визначення.
Терміни, вжиті в однині, включають значення множини, таке як "один або більше" або "щонайменше один", якщо контекст не вимагає іншого.
Використовуваний тут термін "протеаза" означає фермент, який здатний гідролітично розщеплювати білки та/або пептиди. У контексті даного винаходу вказана протеаза, зокрема, являє собою протеазу легкого ланцюга (І-ланцюг) ботулінічного нейротоксину (ВоМТ), тобто протеазу (що також називається протеолітичним доменом), отриману з ботулінічного нейротоксину, зокрема з ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А). Як добре відомо фахівцеві в даній галузі техніки, легкий ланцюг ботулінічного нейротоксину має функцією протеази (також
Зо відомої як нецитотоксична функція протеази) і зазвичай має молекулярну масу приблизно 50 кДа. Такі нецитотоксичні протеази зазвичай діють шляхом протеолітичного розщеплення внутрішньоклітинних транспортних білків, відомих як білки ЗМАКЕ (наприклад, ЗМАР-25, МАМР або синтаксин) - (див. сегаїа К (2002) "СеїЇ апа МоїІесшаг Віоіоду" (Ап еайіоп) допп Уміеу 5 5опв,
Іпс. І-ланцюг ВоМТ/А)Ї, що зустрічається в природі (тобто дикого типу), зокрема здатний ефективно розщеплювати 5МАР-25, але тільки в незначній мірі здатний розщеплювати ПЗМАР- 23, як додатково пояснено нижче. На противагу цьому, протеаза І -ланцюга ВоМТ/А даного винаходу, як більш детально описано нижче, відрізняється від І-ланцюга ВоМТ/А, що зустрічається в природі, тим, що вона має поліпшену здатність розщеплювати ПЗ5МАР-23 і згадується тут як "модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, який розщеплює ПЗМАР-23".
Здатність розщеплювати ПЗМАР2З може бути підтверджена за допомогою звичайного аналізу, такого як аналіз, описаний в Прикладі 2 нижче. Використовуваний тут термін "розщеплення П5МАР-23" більш конкретно означає, що модифікований І -ланцюг ВОМТ/А даного винаходу демонструє поліпшене розщеплення П5МАР-23 порівняно з І-ланцюгом ВоМТт/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1). Для цієї мети може бути використаний будь-який простий порівняльний аналіз, такий як аналіз ПЗМАР-23, описаний в Прикладі 2. І-ланцюг ВОМТ/А дикого типу здатний тільки в незначній мірі (тобто на рівні фону) розщеплювати ПЗМАР-23.
Таким чином, модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу має одну або більше (переважно дві) з наступних властивостей: а) більше ніж 0,295 (наприклад, більше ніж 0,595, переважно більше ніж 1 95, більш переважно більше ніж 595) розщеплення ПЗМАР-23 в безклітинному аналізі (1 мкмоль модифікованого І -ланцюга ВОоМТ/А; 20 мкмоль П5МАР-23; переважно інкубують при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. Приклад 2, Фіг. 1; і/або
БЮ) Кт менше ніж 225 (наприклад, менше ніж 200, переважно менше ніж 150) мкмоль в безклітинному аналізі (І мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль ПЗМАР-23; переважно інкубують при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див.
Приклад 2, Фіг. 1; і/або с) Ксаї (1/хв.) менше ніж 0,2 (наприклад, менше ніж 0,18, переважно менше ніж 0,1) в безклітинному аналізі (І мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль ПЗМАР-23; переважно інкубують при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 60 Приклад 2, Фіг. 1.
Модифікована протеаза і-ланцюга ВоМТ/А даного винаходу може необов'язково розщеплювати не тільки П5МАР-23, а також 5МАР-25. Розщеплення ЗМАР-25 може бути підтверджене за допомогою звичайного аналізу, такого як аналіз, описаний в Прикладі З нижче.
Відповідно до цього необов'язкового варіанта здійснення винаходу використовуваний тут термін "розщеплення ЗМАР-25" означає, що модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу переважно демонструє щонайменше 0,595, щонайменше 1 96, щонайменше 2 95, переважно щонайменше З 95, ще більш переважно щонайменше 10 95 розщеплення ЗМАР-25 порівняно з
Ї-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1). Для цієї мети може бути використаний будь- який простий порівняльний аналіз, такий як аналіз «МАР-25, описаний в Прикладі 3.
У переважному варіанті здійснення винаходу модифікована протеаза І -ланцюга ВоМТт/А даного винаходу розщеплює ПЗМАР-23, але не розщеплює ЗМАР-25, такий як ПЗМАР-25.
Використовуваний тут термін "ЗМАР-23" (асоційований з синаптосомами білок 23) означає білок ЗМАКЕ, який здатний зв'язуватися з різними іншими білками 5МАРЕ і з високою афінністю утворювати з цими білками комплекс в клітині, переважно в нервовій клітині, тим самим регулюючи злиття внутрішньоклітинної мембрани у вказаній клітині. Термін "иНЗМАР-23" більш конкретно стосується людського ЗМАР-23 і переважно білка, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2.
Використовуваний тут термін "ЗМАР-25" (асоційований з синаптосомами білок 25) означає білок ЗМАКЕ, який здатний зв'язуватися з різними іншими білками 5МАРЕ і з високою афінністю утворювати з цими білками комплекс в клітині, переважно в нервовій клітині, тим самим регулюючи злиття внутрішньоклітинної мембрани у вказаній клітині. Термін "иИЗМАР-25" більш конкретно стосується людського ЗМАР-25 і переважно білка, що має послідовність «ЕО ІЮ МО:
З.
Терміни "модифікація", "заміна" або "мутація" можуть використовуватися тут взаємозамінно і стосуються зміни в амінокислотній послідовності порівняно з послідовністю еталонного білка, тобто в даному винаході порівняно з послідовністю І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1). Амінокислотна послідовність, показана тут як ЗЕО ІЮ МО: 1, має довжину 438 амінокислотних залишків і закінчується К438. Зрозуміло, що К438 є першим амінокислотним залишком лізину в петлі активації і найбільш ймовірно представляє С-кінцевий кінець І -ланцюга
Зо після протеолітичного розщеплення петлі активації. Таким чином, ЗЕО ІЮ МО: 1 являє собою (природно) активовану форму І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу. У зв'язку з цим до протеолітичної активації І -ланцюг ВОоМТ/А дикого типу зазвичай має довжину «448 амінокислотних залишків, і включає коротке С-кінцеве подовження амінокислотних залишків петлі активації.
Як додатково пояснюється нижче, даний винахід розкриває ідентифікацію критичних амінокислотних положень в І -ланцюзі ВОоМТ/А дикого типу, які потребують раціональної заміни іншим амінокислотним залишком, щоб зробити І-ланцюг ВоМТ/А здатним до розщеплення
ПЗМАР-23. У зв'язку з цим, введення амінокислотної заміни (тобто мутації) може бути здійснене за допомогою вставки, делеції або заміни амінокислоти і переважно шляхом заміни амінокислоти. Способи, що дозволяють вводити таку мутацію, відомі фахівцеві в даній галузі техніки. Наприклад, можливо ввести мутацію шляхом випадкового або направленого мутагенезу, з допомогою ПЛР з використанням виродженних праймерів, наприклад, в нуклеотидній послідовності, що кодує еталонний білок. Вказані методи, зокрема, (описані в затьгоок еї аї. "МоІесціаг Сіопіпо: А Іарогаїогу Мапиаї!", Ап еййіоп, Со 5ргіпд Нагрог І абогафогу
Ргез5, (2012, і оновлення 2014), і в А!изибеї еї а. "Сигтепі Ргоїосої5 іп МоїІесшаг Віоіоду", допп
ММієу б Боп5 (2012).
Амінокислотна заміна відбувається в одному або більше "зв'язувальних карманах" І- ланцюга відносно І-ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1). Використовуваний тут термін "зв'язувальний карман" означає ділянку І-ланцюга ВоОМТ/А, яка містить одну або більше амінокислот, які є точками контакту (наприклад, через водневий зв'язок, сольовий місток та/або гідрофобний контакт) для зв'язування з відповідним сайтом зв'язування П5МАР-23, та/або які забезпечують простір для розміщення інших амінокислотних залишків субстрату (наприклад, шляхом модифікації, такої як заміщення), здатних зв'язувати П5МАР-23. Використовуваний тут термін "зв'язування з/із" означає "придатний для зв'язування" і становить частину наукового обгрунтування заявника для даного винаходу - вказане обгрунтування не є істотною технічною ознакою даного винаходу. Наприклад, зв'язувальний карман протеази І -ланцюга ВоМТ/А, що визначається амінокислотними залишками Е148, 7307, АЗОВ і 312 5ЕО ІЮО МО: 1, стосується ділянки протеази І -ланцюга ВоМТ/А, що містить амінокислоти Е148, 7307, АЗО8 і/або У312, і/або їхні мутанти, як описано в даному винаході, які, як вважає заявник, беруть участь в зв'язуванні з передбаченим сайтом зв'язування на П5МАР-23 (наприклад, із сайтом зв'язування Р182/0178 60 ПЗМАР-23).
Термін "сайт зв'язування", що використовується тут, стосується ділянки ПОМАР-23, яка містить одну або більше амінокислот, які можуть бути зв'язані відповідним зв'язувальним карманом І-ланцюга ВоМТ/А. Наприклад, сайт зв'язування "Р182/0178" НЗМАР-23 містить амінокислоти Р182 і/або 0178 П5МАР-23. Термін "сайт зв'язування", що використовується тут, просто означає "гіпотетичний сайт зв'язування" (як теоретично передбачено Заявником) і є частиною наукового обгрунтування заявника для даного винаходу - вказане обгрунтування не є істотною технічною ознакою даного винаходу. "Ідентичність за послідовністю" між амінокислотними або нуклеотидними послідовностями може бути визначена шляхом порівняння положення в кожній з послідовностей, які можуть бути вирівняні для цілей порівняння. Коли положення в послідовностях, що порівнюються, зайняте одним і тим же нуклеотидом або амінокислотою, тоді послідовності в цьому положенні ідентичні. Ступінь ідентичності між амінокислотними послідовностями є функцією кількості ідентичних амінокислотних послідовностей, які є загальними для цих послідовностей. Ступінь ідентичності за послідовністю між нуклеїновими кислотами є функцією кількості ідентичних нуклеотидів в положеннях, загальних для цих послідовностей.
Щоб визначити "відсоток ідентичності за послідовністю" між двома амінокислотними послідовностями або двома послідовностями нуклеїнових кислот, послідовності вирівнюють для оптимального порівняння. Наприклад, пропуски можуть бути введені в послідовність першої амінокислотної послідовності або першої нуклеотидної послідовності для оптимального вирівнювання з другою амінокислотною послідовністю або другою нуклеотидною послідовністю.
Потім порівнюють амінокислотні залишки або нуклеотиди у відповідних амінокислотних положеннях або нуклеотидних положеннях. Коли положення в першій послідовності зайняте тим же амінокислотним залишком або нуклеотидом, що і відповідне положення у другому послідовності, молекули в цій позиції вважаються ідентичними.
Відсоток (965) ідентичності між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних положень, загальних для послідовностей. Отже, відсоток ідентичності може бути розрахований шляхом множення кількості ідентичних положень на 100 і ділення на довжину вирівняної ділянки (положення, що перекриваються), включаючи проміжки (тільки внутрішні проміжки, а не проміжки на кінцях послідовності).
Зо У цьому порівнянні послідовності можуть бути однакової довжини або можуть мати різну довжину. Оцінка ідентичності враховує тільки ідеальні збіги і не враховує ступінь схожості амінокислот одна з одною.
Відповідно до даного винаходу оптимальне вирівнювання послідовностей переважно може проводитися за допомогою алгоритму глобального вирівнювання гомології, якщо вирівнювання виконується з використанням послідовностей однакової або схожої довжини, наприклад, алгоритмом, описаним в Мееадіетап апа Ууип5сп (Чоигпа! ої МоїІесшаг Віоіоду; 1970, 48 (3): 443- 53), за допомогою комп'ютерних реалізацій цього алгоритму (наприклад, з використанням програмного забезпечення ЮОМАБТАКФ |азегдепе) або шляхом візуального огляду.
Альтернативно, якщо вирівнювання виконується з використанням послідовностей різної довжини (наприклад, амінокислотна послідовність легкого ланцюга даного винаходу порівнюється з повною амінокислотною послідовністю ботулінічного нейротоксину, що зустрічається в природі), то в цьому випадку оптимальне вирівнювання послідовностей може переважно проводитись за допомогою алгоритму локального вирівнювання гомології, такого як алгоритм, описаний в 5тйй апа УУаїет5оп Юоишгпа! ої МоїІесшаг Віоіоду; 1981, 147: 195-197), за допомогою комп'ютерних реалізацій цього алгоритму (наприклад, з використанням програмного забезпечення ОМАЗТАКФ І азегдепе) або шляхом візуального огляду. Вибирається найкраще вирівнювання (тобто таке, що призводить до найбільшого відсотка ідентичності між послідовностями, що порівнюються), що генерується різними методами. Приклади алгоритмів вирівнювання на основі глобальної та локальної гомології добре відомі фахівцеві в даній галузі техніки і включають, без обмеження, СіивіаІМ (глобальне вирівнювання), СіиєїаМмУ (локальне вирівнювання) і ВГА5Т (локальне вирівнювання).
Фахівець в даній галузі техніки також легко зрозуміє, що даний винахід включає модифіковані І-ланцюги ВОоМТ/А, які значною мірою гомологічні та які зберігають здатність розщеплювати ПЗМАР-23, тобто функціональні варіанти або гомологи. Ці функціональні варіанти або гомологи можуть бути охарактеризовані як такі, що мають одну або більше амінокислотних мутацій (таких як делеція, додавання та/або заміна амінокислот), відмінних від розкритих тут у зв'язку з розщепленням ПЗМАР-23, і які трохи впливають на укладання або протеазну активність, зокрема розщеплення П5МАР-23. Наприклад, такі мутації включають без обмежень консервативні заміни, невеликі делеції (зазвичай від 1 до 30 амінокислот), невеликі бо аміно- або карбокси-кінцеві подовження (такі як аміно-кінцевий залишок метіоніну), додавання невеликого лінкерного пептиду до приблизно 20-25 залишків або афінної мітки.
Функціональні варіанти або гомологи відповідно до даного винаходу переважно містять мутації мінорної природи, такі як консервативні амінокислотні заміни. Консервативні амінокислотні заміни добре відомі фахівцеві в даній галузі техніки і включають без обмеження:
Основні: аргінін, лізин, гістидин
Кислотні: глутамінова кислота, аспарагінова кислота
Полярні: глютамін, аспарагін
Гідрофобні: лейцин, ізолейцин, валін, метіонін
Ароматичні: фенілаланін, триптофан, тирозин
Малі: гліцин, аланін, серин, треонін.
На доповнення до 20 стандартних амінокислот нестандартні амінокислоти (такі як 4- гідроксипролін, 6-М-метиллізин, 2-аміноїзомасляна кислота, ізовалін і с-метилсерин) можуть замінювати амінокислотні залишки поліпептидів даного винаходу. Обмежена кількість неконсервативних амінокислот, амінокислот, які не кодуються генетичним кодом, і неприродних амінокислот можуть бути замінені амінокислотними залишками клостридіального поліпептиду.
Поліпептиди даного винаходу також можуть містити неприродні амінокислотні залишки.
Амінокислоти, що не зустрічаються в природі, включають без обмежень транс-3- метилпролін, 2,4-метанолполін, цис-4-гідроксипролін, транс-4-гідроксипролін, М-метилгліцин, ало-треонін, метил-треонін, гідроксіетилцистеїн, гідроксіетилгомоцистеїн, нітроглутамін, гомоглутамін, піпеколінову кислоту, тре-лейцин, норвалін, 2-азафенілаланін, З-азафенілаланін, 4-азафенілаланін і 4-фторфенілаланін. У даній галузі техніки відомо декілька способів включення амінокислотних залишків, що не зустрічаються в природі, в білки.
Заміна амінокислоти може включати заміну амінокислоти, що має певну фізико-хімічну властивість (наприклад, гідрофобність), на амінокислоту, що має схожу або альтернативну властивість. Приклади таких замін наведені нижче:
Кисла амінокислота, заміщена нейтральною полярною амінокислотою;
Полярна амінокислота, заміщена неполярною амінокислотою;
Неполярна амінокислота, заміщена неполярною амінокислотою;
Неполярна амінокислота, заміщена полярною амінокислотою;
Полярна амінокислота, заміщена основною амінокислотою;
Неполярна амінокислота, заміщена кислою амінокислотою;
Неполярна амінокислота, заміщена полярною амінокислотою.
Відповідно, даний винахід включає І -ланцюг всіх підтипів ВОМТ/А, такий як будь-який з 1- ланцюгів ВоМТ/А1-ВоМТ/А8, який містить одну або більше мутацій, як описано тут, для розщеплення ПЗ5МАР-23. Вказаний І -ланцюг ВоМТ/А може додатково містити додаткові мутації для створення ненативного сайту активації розщеплення, такого як сайт розщеплення ентерокінази (ЗЕО ІЮ МО: 10), протеази Ргезсізвзіоп, фактора Ха, тромбіну, протеази ТЕМ тощо.
Додаткові визначення наведені в описі.
Даний винахід може бути описаний наступним чином.
У першому аспекті даний винахід стосується модифікованої протеази І1-ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка розщеплює людський ЗМАР-23 (НЗМАР-23), що має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з І -ланцюгом ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1), яка містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
РІ82/0178 НЗМАР-23;
Б) де вказаний перший зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотними залишками Е148, 7307, АЗОВ і 312 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспарагіну і тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і/або і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з фенілаланіну, ізолейцину і лейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 1307 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1); і/або ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з проліну, аспарагіну, треоніну і ізолейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І - ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку АЗОВ І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ 60 МО: 1); і/або їм. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з лізину, валіну, метіоніну і лейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У312 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
Не обмежуючи себе будь-якою теорією, заявник вважає, що визначений вище зв'язувальний карман І -ланцюга ВоМТ/А впливає на важливий фермент-субстратний зв'язок з послідовністю розпізнавання НЗМАР-23.
Таким чином, даний винахід грунтується на несподіваному відкритті (наприклад, несподіваному технічному ефекті), що цільові амінокислотні заміни, як заявлено, дозволяють отримувати І -ланцюг(и) ВОМТ/А з підвищеною ефективністю розщеплення П5МАР-23 (порівняно з Ї-ланцюгом ВоМтТ дикого типу). Автори даного винаходу не тільки успішно ідентифікували відповідні амінокислотні положення І-ланцюга ВоМТт/А, які можуть бути змінені (наприклад, заміщені) для збільшення ефективності розщеплення П5МАР-23, але також ідентифікували точні амінокислотні заміни, які забезпечують цей ефект.
У першому аспекті даний винахід стосується модифікованої протеази Іі-ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка розщеплює людський ЗМАР-23 (НЗМАР-23), що має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з І -ланцюгом ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1), яка містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
РІ82/0178 НЗМАР-23;
Б) де вказаний перший зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспарагіну і тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1).
У одному аспекті даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка розщеплює людський ЗМАР-23 (П5МАР-23), що має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу. (ЗЕО ІЮ МО: 1), яка
Зо містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
РІ82/0178 НЗМАР-23;
Б) де вказаний перший зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотними залишками Е148, 7307, АЗОВ і 312 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з фенілаланіну, ізолейцину і лейцину в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 1307 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1); і/або і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з проліну, аспарагіну, треоніну та ізолейцину в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І - ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку АЗО8 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1); і/або ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з лізину, валіну, метіоніну і лейцину в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У312 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІО МО: 1).
Модифікований І-ланцюг ВоМТ/А може містити одну амінокислотну заміну (порівняно з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 1 дикого типу). Модифікований І-ланцюг ВоМТ/А може містити дві амінокислотні заміни (порівняно з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 1 дикого типу). Модифікований І - ланцюг ВоМТ/А може містити три амінокислотні заміни (порівняно з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1 дикого типу). Модифікований І-ланцюг ВОоОМТ/А може містити чотири амінокислотні заміни (порівняно з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1 дикого типу).
Модифіковані І-ланцюги ВоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р1І82/0178 пПЗМАР-23, зазвичай демонструють щонайменше в 1,15 рази підвищену ефективність розщеплення ПЗМАР-23 (порівняно з І-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу) - див. 1-й стовпець даних на Фіг. ТА. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів
ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом
ВОоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮО МО: 1) включають: бо модифікований І -ланцюг ВОоМТ/А, що містить заміну Е148У або Е148М;
модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 73071, АЗОВ8Р їі 312; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Т307Р, АЗОВМ і 3121: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148М, 73071 ії АЗО8Р, У312М; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, Т307Р, АЗОВ8М і 3121; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 73071, АЗОВР їі 312; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 73071, АЗОВ8Т ії У312М; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 73071, АЗОВІ ї У312М.
У одному варіанті здійснення модифіковані І -ланцюги ВоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 ПЗМАР-23, зазвичай демонструють щонайменше в 1,35 рази підвищену ефективність розщеплення ПЗМАР-23 (порівняно з І -ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу) - див. 1-й стовпець даних на Фіг. ТА. Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У або Е148М; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 73071, АЗОВ8Р їі 312; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Т307Р, АЗОВМ і 3121: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148М, 73071, АЗОВР і 312; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, Т307Р, АЗОВ8М і 3121; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 73071, АЗОВР їі 312; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 73071, АЗОВ8Т і х312М; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 73071, АЗОВІ ї У312М.
У іншому варіанті здійснення модифіковані І -ланцюги ВОМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 Н5ОМАР-23, зазвичай демонструють щонайменше в 1,7 рази підвищену ефективність розщеплення ПЗМАР-23 (порівняно з І-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу) - див. 1-й стовпець даних на Фіг. 1А. Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮО МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е1487У; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Т307Е;
Зо модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Т3071; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну У312К; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Х312К, Е148У; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 73071, АЗОВ8Р їі 312; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148М, 73071, АЗОВР і 312; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, Т307Р, АЗОВ8М і 3121; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 73071, АЗОВ8Т ії У312М.
У додатковому варіанті здійснення модифіковані І-ланцюги ВОоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р1І82/0178 П5МАР-23, можуть демонструвати щонайменше 2,0-кратне збільшення ефективності розщеплення П5МАР-23 (порівняно з І-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу) - див. 1-й стовпець даних на Фіг. 1А. Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮО МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е1487У; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148М, 73071, АЗОВР і 312; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, Т307Р, АЗОВ8М і 3121; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 73071, АЗОВ8Т ії У312М.
У додатковому варіанті здійснення модифіковані І-ланцюги ВОоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р1І82/0178 П5МАР-23, можуть демонструвати щонайменше 4,0-кратне збільшення ефективності розщеплення П5МАР-23 (порівняно з І-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу) - див. 1-й стовпець даних на Фіг. 1А. Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮО МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е1487У; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148М, 73071, АЗО8Р і 312; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, Т307Р, АЗОВ8М і 3121; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 73071, АЗОВ8Т ії У312М.
У іншому варіанті здійснення модифіковані ІЇ-ланцюги ВОоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 ПЗМАР-23, демонструють щонайменше 6,0), переважно щонайменше 7,0, більш переважно щонайменше 8-кратне бо збільшення ефективності розщеплення ПЗМАР-23 (порівняно з І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу)
- див. 1-й стовпець даних на Фіг. ТА. Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТт/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу БЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е1487У.
Модифіковані І-ланцюги ВоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 пПЗМАР-23, зазвичай демонструють більше ніж 1,5 95 розщеплення ПОМАР-23 (95 при 1 мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТтТ/А; 20 мкмоль
ПЗМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних на Фіг. ТА. Для довідки: І -ланцюг ВоМТ/А дикого типу (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 1) демонструє менше ніж 0,5 906 розщеплення ПЗ5МАР-23 (95 при 1 мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТт/А; 20 мкмоль П5МАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години). Приклади таких модифікованих І - ланцюгів ВоОМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І - ланцюгом ВоМТ/А дикого типу БЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е14873; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Т307Е; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 73071; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну У312К; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну У312К і Е148У.
У одному варіанті здійснення модифіковані І -ланцюги ВоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 ПЗМАР-23, зазвичай демонструють більше ніж 2956 розщеплення ПЗМАР-23 (95 при 1 мкмоль модифікованого І - ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль пП5МАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних на Фіг. ТА. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВОМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е1487У; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 73071; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну У312К.
Зо У ще одному варіанті здійснення модифіковані І-ланцюги ВоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 пПЗМАР-23, демонструють щонайменше підвищені 995 розщеплення ПЗМАР-23 (956 при 1 мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМтТ/А; 20 мкмоль ПеМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних на Фіг. ТА.
Приклади таких модифікованих І!-ланцюгів ВоОоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕБО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У.
Додаткові приклади модифікованих мутантів І-ланцюга ВоМТ/А, що мають мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 пП5МАР-23, (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО 10
МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну АЗОВІ; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну АЗОВМ; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну АЗОВІ; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну АЗОВР; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну АЗОВМ; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну АЗО8Т; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 312; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну У312М; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 3121.
Модифікований І -ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 пПЗМАР-23, може містити одну або більше замін амінокислотних залишків порівняно з І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу, як визначено тут раніше.
Як ілюстрація, модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу може мати одну мутацію амінокислотного залишку (в межах зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178
ПЗМАР-23, як визначено вище), наприклад, мутацію, що відповідає амінокислотному залишку
Е148 І-ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1). Аналогічно, модифікований І -ланцюг
ВоМТ/А даного винаходу може містити більше ніж одну мутацію амінокислотного залишку (в бо межах зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 П5МАР-23, як визначено вище),
наприклад мутації, що відповідають амінокислотним залишкам 7307, АЗО8 ї У312 І -ланцюга
ВоОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
У переважному варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВОоМТ/А даного винаходу, що має одну або більше мутацій зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 П5МАР- 23, додатково містить одну або більше мутацій в одному або більше різних зв'язувальних карманах І -ланцюга ВОМТ/А для П5МАР-23, як додатково описано нижче.
Вказані одна або більше різні зв'язувальні кармани І-ланцюга ВоМТ/А для ПЗМАР-23 включають другий зв'язувальний карман протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0189/0192 ПЗ5МАР-23; третій зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВОоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування І198 Н5МАР-23; четвертий зв'язувальний карман протеази
Ї-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К185 П5МАР-23; п'ятий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К1І8б6 пПЗМАР-23; шостий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМтТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К206 ПЗМАР-23; сьомий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0210 п5МАР-23; восьмий зв'язувальний карман протеази І - ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0168 ПЗМАР-23.
Альтернативно, згідно з різними технічними ознаками даного винаходу, модифікований |І - ланцюг ВоМТтТ/А може містити одну або більше мутацій всередині одного або більше зв'язувальних карманів І -ланцюга ВоМТ/А, що відмінні від зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р1ТІ82/0178 ПЗ5МАРЗЗ, як визначено вище.
Вказані зв'язувальні кармани І-ланцюга ВоМТ/А для ПЗ5МАР-23 і відповідні мутації, що становлять інтерес, додатково описані нижче.
Відповідно, як додаткову технічну ознаку або як альтернативну технічну ознаку даний винахід включає мутанти І -ланцюга ВоМТ/А, що містять одну або більше мутацій у визначеному тут кармані І-ланцюга ВоМТ/А. Як приклад, модифікований І -ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, який розщеплює людський ЗМАР-23 (НОМАР-23), має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з І -ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮ МО: 1) яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в п'ятому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К186 пПЗМАР-23;
Зо Б) де вказаний п'ятий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 5143 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутаміну, глутамату і аспартату в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5143 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
Не обмежуючи себе будь-якою теорією, заявник вважає, що визначений вище зв'язувальний карман І-ланцюга ВоМТ/А забезпечує стабілізуючий сольовий місток між залишками К186 на
ПЗМАР-23 і 5143 на ВоМТ/А.
Модифіковані І-ланцюги ВоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування К186 ПЗ5МАР-23, як правило, мають КМ для П5МАР-23 менше ніж 100 мкмоль, наприклад, менше ніж 95 мкмоль - 3-й стовпець даних на Фіг. 1А. Для довідки:
Ї-ланцюг ВоМТ/А дикого типу (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 1) має КМ для ПЗМАР-23 більше 150 мкмоль, наприклад, більше 200 мкмоль. Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоОМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну М3040; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну МЗО4Е; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 53050; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну ЗЗО5Е; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 51430; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 5143Е; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 51430); модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну К166РЕ.
У переважному варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВОоМТ/А даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування К1І86 П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій у межах одного або більше різних зв'язувальних карманів І - ланцюга ВоМТ/А, як описано тут (наприклад, в зв'язувальному кармані для сайту зв'язування
РІ82/0178 НЗМАР-23, як визначено вище). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 0,5-кратне зниження ефективності розщеплення П5МАР-23 (порівняно з Е148У-модифікованим бо Ї-ланцюгом ВоМТ/А) або, іншими словами збільшене щонайменше в 4,0 рази розщеплення
ПЗМАР-23 (порівняно з І-ланцюгом ВоМтТ дикого типу) - див. 1-й стовпець даних для багатокарманних мутантів на Фіг. 18; або щонайменше 5 95 розщеплення П5МАР-23 (95 при 1 мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТт/А; 20 мкмоль П5МАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних на Фіг. 18.
Приклади таких модифікованих І!-ланцюгів ВоОоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕО ІО МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У ії 5143Е; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У ї 51430; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У ї 51430).
Таким чином, в одному варіанті здійснення даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ВОоМТ/А, яка розщеплює людський ЗМАР-23 (ПЗМАР-23) і має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО) ІЮ МО: 1), яка містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування Р1ТІ82/0178 П5МАР-23; де вказаний перший зв'язувальний карман протеази і-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і
Б) заміну амінокислотного залишку, розташованого в п'ятому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К186 НЗ5МАР-23; де вказаний п'ятий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТтТ/А визначається амінокислотним залишком 5143 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5143 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
Зо У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга
ВоМТ/А, яка розщеплює людський 5МАР-23 (Н5МАР-23) і має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО) ІО МО: 1), яка містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування Р182/0178 П5МАР-23; де вказаний перший зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і
Б) заміну амінокислотного залишку, розташованого в п'ятому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К186 НЗ5МАР-23; де вказаний п'ятий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 5143 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5143 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1).
У іншому варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування К186 П5МАР-23, додатково містить одну або більше мутацій в одному або більше різних зв'язувальних карманах І -ланцюга ВОМТ/А, як описано тут (наприклад, в межах зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178
ПЗМАР-23, як визначено вище). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 2,0-кратне збільшення ефективності розщеплення ПОМАР-23 (порівняно з модифікованим Е148У |І- ланцюгом ВоМТ/А) - див. 1-й стовпець даних для багатокарманних мутантів на Фіг. 18.
Приклади таких модифікованих І!-ланцюгів ВоОоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕО ІО МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що має заміну Е148У і 5143Е; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що має заміну Е148у і 51430. бо У іншому варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування К186 НЗМАР-23, додатково містить одну або більше мутацій в одному або більше різних зв'язувальних карманах І -ланцюга ВОоМТ/А, як описано тут (наприклад, в межах зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178
ПЗМАР-23, як визначено вище). Такі мутанти зазвичай демонструють як мінімум 3,0-кратне збільшення ефективності розщеплення ПЗМАР-23 (в процентах порівняно з модифікованим
Е148У І -ланцюгом ВоМТ/А) - див. 1-й стовпець даних для багатокарманних мутантів на Фіг. 18.
Приклади таких модифікованих і-ланцюгів ВоОоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕБО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 51430.
Як додаткову технічну ознаку або альтернативну технічну ознаку даний винахід включає мутанти І-ланцюга ВоМТ/А, що містять одну або більше мутацій у визначеному тут кармані І - ланцюга ВоМТ/А. Наприклад, модифікований І/-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, який розщеплює людський ЗМАР-23 (П5МАР-23), має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1), який містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в четвертому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
К1І85 п5МАР-23;
БЮ) де вказаний четвертий зв'язувальний карман протеази І -ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотними залишками УЗО04 і (5305 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У304 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1); і/або і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5305 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮО МО: 1).
Не обмежуючи себе будь-якою теорією, заявник вважає, що визначений вище зв'язувальний карман І-ланцюга ВоМТ/А забезпечує стабілізуючий сольовий місток між залишком К185 на
ПЗМАР-23 і ВоМТ/А.
Модифіковані І-ланцюги ВоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування К1І85 П5МАР-23, зазвичай мають КМ для Н5МАР-23 менше ніж 100 мкмоль - див. 3-й стовпець даних на Фіг. 1А. Для довідки: І -ланцюг ВОоМТ/А дикого типу (наприклад, ЗЕО ІО МО: 1) має КМ для пПЗМАР-23 більше 150 мкмоль, наприклад, більше 200 мкмоль. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕБО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну М3040; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну МЗО4Е; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 53050; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну ЗЗ3О5Е.
Модифікований І -ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування К185 П5МАР-23, містить одну або більше заміни амінокислотних залишків порівняно з І-ланцюгом ВоОоМТтТ/А дикого типу, як визначено тут раніше. Як ілюстрація, модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу може мати одну мутацію амінокислотного залишку (в межах зв'язувального кармана для сайту зв'язування К1І85 П5МАР-23, як визначено вище), наприклад, мутант, відповідний амінокислотному залишку 305 І-ланцюга ВоМТт/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1). Аналогічно, модифікований І -ланцюг ВОоМТ/А даного винаходу може містити більше ніж одну мутацію (в межах зв'язувального кармана для сайту зв'язування К185
ПЗМАР-23, як визначено вище), наприклад, відповідну амінокислотним залишкам МЗ304 і (3305 | - ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1).
У переважному варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВОоМТ/А даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування КІ85 пП5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій у межах одного або більше різних зв'язувальних карманів І - ланцюга ВоМТ/А для П5МАР-23, як описано тут (наприклад, в межах зв'язувального кармана для сайту зв'язування РІІТ82/0178 ПЗМАР-23, як визначено вище). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 2,0-кратне, переважно щонайменше 2,5-кратне збільшення ефективності розщеплення ПЗМАР-23 (порівняно з Е148У-модифікованим І -ланцюгом ВОМТ/А) - див. 1-й стовпець даних для багатокарманних мутантів на Фіг. 1В. Приклади таких бо модифікованих І -ланцюгів ВОМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що має заміну Е1487У і (33050.
Таким чином, в іншому варіанті здійснення даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ВОоМТ/А, яка розщеплює людський ЗМАР-23 (ПЗМАР-23) і має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з ІЇ-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування Р1ТІ82/0178 П5МАР-23; де вказаний перший зв'язувальний карман протеази і-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і
БЮ) заміну амінокислотного залишку, розташованого в четвертому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К185 П5МАР-23; де вказаний четвертий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 305 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5305 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1).
Також, як додаткову технічну ознаку або як альтернативну технічну ознаку даний винахід включає мутанти І-ланцюга ВоМТт/А, що містять одну або більше мутацій у визначеному тут кармані І -ланцюга ВоМТ/А. Як приклад, модифікований І -ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, який розщеплює людський ЗМАР-23 (П5МАР-23), має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮ МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого у другому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0189/0192 П5МАР-23;
Б) де вказаний другий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 029 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІО МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і амінокислотний залишок аланіну в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 2029 І -ланцюга
ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІО МО: 1).
Не обмежуючи себе будь-якою теорією, заявник вважає, що визначений вище зв'язувальний карман І-ланцюга ВоМТ/А забезпечує стабілізуючу взаємодію між 0189/0192 на П5МАР-23 і амінокислотою 29 ВоМТ/А або сусідніми амінокислотами.
Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕБО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що має заміну О29А.
У переважному варіанті здійснення модифікований І -ланцюг ВоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування 0189/0192 П5МАР-23, додатково містить одну або більше мутацій в одному або більше різних зв'язувальних карманах І -ланцюга ВОМТ/А як описано тут (наприклад, всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178
ПЗМАР-23, як визначено вище). Такі мутанти зазвичай демонструють збільшення ефективності розщеплення ПеМАР-23 щонайменше в 1,50 рази (порівняно з Е148У-модифікованим |І- ланцюгом ВоМТ/А) - див. 1-й стовпець даних, представлений для багатокарманних мутантів на
Фіг. 18. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕБО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що має заміну Е148У, 029А.
Таким чином, в іншому варіанті здійснення даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ВОоМТ/А, яка розщеплює людський ЗМАР-23 (ПЗМАР-23) і має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно І-ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО) ІЮ МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування Р1ТІ82/0178 П5МАР-23; де вказаний перший зв'язувальний карман протеази і-ланцюга ВоМТ/А визначається 60 амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і
Б) заміну амінокислотного залишку, розташованого у другому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0189/0192 П5МАР-23; де вказаний другий зв'язувальний карман протеази -ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 029 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІО МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 029 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1).
У іншому варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування 0189/0192 П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій у щонайменше двох різних зв'язувальних карманах І -ланцюга
ВоОМТ/А, як описано тут (наприклад, всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування
РІ82/0178 НЗМАР-23 і всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування К186 пПЗМАР- 23, як визначено вище). Такі мутанти зазвичай демонструють як мінімум 2,5-кратне збільшення ефективності розщеплення ПЗ5МАР-23 (порівняно з Е148У-модифікованим І -ланцюгом ВОоМТ/А - див. 1-й стовпець даних, представлений на Фіг. 18. Приклади таких модифікованих ГІ -ланцюгів
ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом
ВОоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮО МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, О29А і 51430.
Таким чином, в іншому варіанті здійснення даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ВОоМТ/А, яка розщеплює людський ЗМАР-23 (ПЗМАР-23) і має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО) ІЮ МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування Р182/0178 НЗМАР-23; де вказаний перший зв'язувальний карман протеази і-ланцюга ВоМТ/А визначається
Зо амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і
Б) заміну амінокислотного залишку, розташованого у другому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0189/0192 пПЗ5МАР-23; де вказаний другий зв'язувальний карман протеази -ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 029 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІО МО: 1); і с) заміну амінокислотного залишку, розташованого в п'ятому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К186 НЗ5МАР-23; де вказаний п'ятий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 5143 І -ланцюга ВоОМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮО МО: 1); 9) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 029 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5143 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
У іншому варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування 0189/0192 на П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій у щонайменше двох різних зв'язувальних карманах
ІЇ-ланцюга ВоМТ/А (наприклад, всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування
РІ82/0178 НЗМАР-23 і всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування К185 П5МАР-23, як визначено вище). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 3,0-кратне, переважно щонайменше 3,4-кратне збільшення ефективності розщеплення П5МАР-23 (порівняно з Е148У- модифікованим І -ланцюгом ВоМтТ/А) - див. 1-й стовпець даних, представлений для багатокарманних мутантів на Фіг. 18. Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу БЕО ІЮ МО: 1) включають: 60 модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміни Е148У, О29А і (3050.
Таким чином, в іншому варіанті здійснення даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ВОоМТ/А, яка розщеплює людський ЗМАР-23 (ПЗМАР-23) і має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО) ІЮ МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування Р1ТІ82/0178 П5МАР-23; де вказаний перший зв'язувальний карман протеази і-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і
Б) заміну амінокислотного залишку, розташованого у другому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0189/0192 пПЗ5МАР-23; де вказаний другий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 029 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІО МО: 1); і с) заміну амінокислотного залишку, розташованого в четвертому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К185 ПЗМАР-23; де вказаний четвертий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 305 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); 9) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 029 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5305 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1).
Як додаткову технічну ознаку або альтернативну технічну ознаку даний винахід включає мутанти І-ланцюга ВоМТ/А, що містять одну або більше мутацій у визначеному тут кармані І - ланцюга ВоМТ/А. Як приклад, модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, який
Зо розщеплює людський ЗМАР-23 (П5МАР-23), має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮ МО: 1), яка включає: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в шостому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
К206 п5МАР-23;
Б) де вказаний шостий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотними залишками У251, 1256, М258, І 367 і Е369 | -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО
ІО МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У251 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1); і/або і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату, аспартату, глутаміну, гліцину, аланіну і аргініну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 1256 І-ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і/або ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з серину, аланіну, проліну, лейцину і глутамату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази | - ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку М258 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1); і/або їм. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну і гліцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку І 367 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і/або м. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з гліцину, серину і лейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку ЕЗ369 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1).
Як додаткову технічну ознаку або альтернативну технічну ознаку даний винахід включає мутанти І-ланцюга ВоМТ/А, що містять одну або більше мутацій у визначеному тут кармані 1 - ланцюга ВоМТ А. Як приклад, модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, який розщеплює людський ЗМАР-23 (П5МАР-23), має модифіковану амінокислотну послідовність 60 порівняно з Ї-ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮ МО: 1), яка включає:
а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в шостому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
К206 п5МАР-23;
Б) де вказаний шостий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотними залишками У251, 1256, М258, І 367 і Е369 | -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО
ІО МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У251 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і/або і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глютаміну та аргініну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку І 256 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і/або ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з серину, лейцину і глутамату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку М258 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і/або їм. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну і гліцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку І 367 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і/або м. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з гліцину, серину і лейцину в положенні в амінокислотній послідовності модифікованої протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку ЕЗ369 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1).
Не обмежуючи себе будь-якою теорією, заявник вважає, що визначений вище зв'язувальний карман І-ланцюга ВоМТ/А впливає на важливий фермент-субстратний зв'язок з положенням (53) послідовності розпізнавання П5МАР-23.
Як додаткову технічну ознаку або альтернативну технічну ознаку даний винахід включає мутанти І-ланцюга ВоМТ/А, що містять одну або більше мутацій у визначеному тут кармані І - ланцюга ВоМТ/А. Як приклад, модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, який розщеплює людський ЗМАР-23 (П5МАР-23), має модифіковану амінокислотну послідовність
Зо порівняно з Ї-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1), яка включає: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в шостому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
К206 п5МАР-23;
Б) де вказаний шостий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотними залишками У251, 1256, М258, І 367 і Е369 | -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО
ІО МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У251 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і/або і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глютаміну і аргініну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 1 256 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО:1); і/або ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з серину, лейцину і глутамату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку М258 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і/або їм. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну і гліцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку І 367 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і/або м. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з гліцину, серину і лейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку ЕЗ369 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1).
Модифікований І -ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування К20б6 ПЗМАР-23, може містити одну або більше замін амінокислотних залишків порівняно з І -ланцюгами ВоМТ/А дикого типу, описаними тут раніше. Як ілюстрація, модифікований І-ланцюг ВоОМТ/А даного винаходу може мати одну мутацію амінокислотного залишку (в межах зв'язувального кармана для сайту зв'язування К206 ПЗМАР-23), наприклад, мутант, що відповідає амінокислотному залишку У251 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1). Аналогічно, модифікований І -ланцюг ВоМТ/А даного винаходу може містити більше ніж бо одну мутацію (в межах зв'язувального кармана для сайту зв'язування К206 ПЗМАР-23),
наприклад, мутанти, що відповідають амінокислотним залишкам У251 і 1256 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1).
Модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, що містить мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування К206 ПЗМАР-23, зазвичай демонструє більше ніж 1,595 розщеплення ПЗМАР-23 (96 при 1 мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль
ПЗМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних на Фіг. ТА. Для довідки: І -ланцюг ВоМТ/А дикого типу (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 1) демонструє менше ніж 0,5 906 розщеплення ПЗ5МАР-23 (95 при 1 мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТт/А; 20 мкмоль П5МАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних, представлений на Фіг. ТА. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВоОМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО 10
МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 2510; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Х251Е; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну І 2560.
У одному варіанті здійснення модифіковані І/-ланцюги ВоМТ/А даного винаходу демонструють щонайменше З 96 розщеплення П5МАР-23 (96 при 1 мкмоль модифікованого І - ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль пП5МАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних, представлений на фіг. ТА.
Приклади таких модифікованих і-ланцюгів ВоОоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕБО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Х251Е.
Додаткові приклади модифікованих мутантів І-ланцюга ВоМТ/А, що мають мутацію зв'язувального кармана для К206 П5МАР-23 (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮО МО: 1), включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну М2450; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну І 256Е;
Зо модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну І 2560; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну І 2560); модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну І 256А; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну М2584А; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну М258Р; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну М2581 ; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну І 256Е і М258Р; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну І 2560 і М258Р; модифікований І -ланцюг ВОоОМТ/А, що містить заміну І 256А і М2581; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну І 2565 і М2581.
У переважному варіанті здійснення модифікований І -ланцюг ВоОМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування К206 пП5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій в одному або більше різних зв'язувальних карманах І-ланцюга
ВоМТ/А, як описано тут (наприклад, всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування
РІ82/0178 НЗМАР-23, як визначено вище). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 0,5-кратне зниження ефективності розщеплення П5МАР-23 (порівняно з Е148У-модифікованим
Ї-ланцюгом ВоМТ/А) або, іншими словами щонайменше в 4,0-кратне збільшення ефективності розщеплення П5МАРІЗ (порівняно з І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу) - див. 1-й стовпець даних, представлений для багатокарманних мутантів на Фіг. 18, або щонайменше 5 95 розщеплення
ПЗМАР-23 (95 при 1 мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль пПЗМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2- й стовпець даних на Фіг. 18. Переважні приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу БЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміни Е148У і 2510; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміни Е148У і12560; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміни Е148У і М251Е.
Таким чином, в іншому варіанті здійснення даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ВОоМТ/А, яка розщеплює людський ЗМАР-23 (ПЗМАР-23) і має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1), яка бо включає:
а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування Р1ТІ82/0178 П5МАР-23; де вказаний перший зв'язувальний карман протеази і-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і
Б) заміну амінокислотного залишку, розташованого в п'ятому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К206 П5МАР-23; де вказаний п'ятий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком У251 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У251 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
У іншому варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВОоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування К206 пП5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій у щонайменше трьох різних зв'язувальних карманах І-ланцюга
ВоОМТ/А, як описано тут (наприклад, в зв'язувальному кармані для сайту зв'язування Р1І82/0178
НЗМАР-23, в зв'язувальному кармані для сайту зв'язування К186 пП5МАР-23 і в зв'язувальному кармані для сайту зв'язування 0189/0192, як визначено вище). Такі мутанти, як правило, демонструють як мінімум 1,3-кратне збільшення ефективності розщеплення пПЗМАР-23 (порівняно з Е148У-модифікованим і-ланцюгом ВоМтТ/А) - див. 1-й стовпець даних, представлений для багатокарманних мутантів на Фіг. 18. Приклади таких модифікованих І - ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І - ланцюгом ВоМТ/А дикого типу БЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміни Е148У, 51430, 029А і Х251Е.
Таким чином, в іншому варіанті здійснення даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ВОоМТ/А, яка розщеплює людський ЗМАР-23 (ПЗМАР-23) і має модифіковану
Зо амінокислотну послідовність порівняно з ІЇ-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування Р1ТІ82/0178 П5МАР-23; де вказаний перший зв'язувальний карман протеази і-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1); і
Б) заміну амінокислотного залишку, розташованого в п'ятому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К186 НЗ5МАР-23; де вказаний п'ятий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 5143 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і с) заміну амінокислотного залишку, розташованого у другому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0189/0192 пПЗ5МАР-23; де вказаний другий зв'язувальний карман протеази -ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком О25А І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЕС ІЮ МО: 1); і
Я) заміну амінокислотного залишку, розташованого в шостому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К206 ПЗМАР-23; де вказаний шостий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком У251 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); е) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5143 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 029 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і їм. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає 60 амінокислотному залишку У251 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
Як додаткову технічну ознаку або альтернативну технічну ознаку даний винахід включає мутанти І-ланцюга ВоМТ/А, що містять одну або більше мутацій у визначеному тут кармані І - ланцюга ВоМТ/А. Як приклад, модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, який розщеплює людський ЗМАР-23 (П5МАР-23), має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮ МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в третьому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування І198 П5МАР-23;
Б) де вказаний третій зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком К166 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з валіну, фенілаланіну, лейцину і ізолейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази | - ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку К166 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1).
Не обмежуючи себе будь-якою теорією, заявник вважає, що визначений вище зв'язувальний карман І-ланцюга ВоОМТ/А може забезпечити стабілізуючу гідрофобну взаємодію між 1198 в
ПЗМАР-23 і амінокислотою 166 ВоМТ/А.
Модифіковані І-ланцюги ВоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування І198 П5МАР-23, зазвичай демонструють більше ніж 9 95 розщеплення ПЗМАР-23 (96 при 1 мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль
ПЗМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних, представлений на Фіг. ТА. Для довідки: І -ланцюг ВОМТ/А дикого типу (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 1) демонструє менше ніж 0,5 96 розщеплення ПЗМАР-23 (Фо при 1 мкмоль модифікованого І -ланцюга ВоМТт/А; 20 мкмоль П5МАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних, представлений на Фіг. ТА. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВоОМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮ
МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну К16бУ;
Зо модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну К166Е; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну К1661; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну К1661.
У одному варіанті здійснення модифіковані І -ланцюги ВоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування 1198 П5МАР-23, зазвичай демонструють більше ніж 40 95 розщеплення ПЗМАР-23 (95 при 1 мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль П5МАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних, представлений на Фіг. ТА. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну К166Е; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну К1661.
У додатковому варіанті здійснення модифіковані І-ланцюги ВОоМТ/А даного винаходу, що містять мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування І198 П5МАР-23, зазвичай демонструють більше ніж 60 96 розщеплення П5МАР-23 (96 при 1 мкмоль модифікованого І - ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль ПЗМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних, представлений на фіг. ТА.
Приклади таких модифікованих і-ланцюгів ВоОоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕО ІО МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну К166бР.
У переважному варіанті здійснення модифікований І -ланцюг ВоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування І198 П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій в одному або більше різних зв'язувальних карманах І-ланцюга
ВоМТ/А, як описано тут (наприклад, в щонайменше двох різних зв'язувальних карманах І- ланцюга ВоМТ/А, таких як зв'язувальний карман для сайту зв'язування Р1І82/0178 ПЗ5МАР-23 і зв'язувальний карман для сайту зв'язування К185 або К186 пЗ5МАР-23). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 40 95 розщеплення П5МАР-23 (95 при 1 мкмоль модифікованого І - ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль пП5МАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних, представлений на фіг. 18. бо Приклади таких модифікованих І!-ланцюгів ВоОоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ам) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу БЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміни Е148У, К166Е і 53050; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміни Е148У, К166М і 53050; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміни Е148У, 51430 і К166БЕ.
Таким чином, в іншому варіанті здійснення даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ВОоМТ/А, яка розщеплює людський ЗМАР-23 (ПЗМАР-23) і має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з ІЇ-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування Р1ТІ82/0178 П5МАР-23; де вказаний перший зв'язувальний карман протеази і-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і
Б) заміну амінокислотного залишку, розташованого в третьому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування І198 П5МАР-23; де вказаний третій зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком К166 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і с) заміну амінокислотного залишку, розташованого в четвертому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К185 Н5МАР-23; де вказаний четвертий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 305 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); 9) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з валіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку К166 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає
Зо амінокислотному залишку 5305 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1).
У іншому варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування І198 П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій у щонайменше двох різних зв'язувальних карманах І -ланцюга ВОМТ/А (наприклад, всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 ПЗМАР-23 і всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування КІ85 або К186 ПЗМАР-23). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 15 95 розщеплення П5МАР-23 (95 при 10 нмоль модифікованого І-ланцюга ВоМтТ/А; 20 мкмоль ПеМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних", представлений на Фіг. 18. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВоОМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮ
МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, К166БЕ і 53050; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 51430 і К166БЕ.
У одному варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВОоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування І198 П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій у щонайменше трьох різних зв'язувальних карманах І -ланцюга ВоМТ/А (наприклад, в зв'язувальному кармані для сайту зв'язування Р182/0178 пПЗМАР-23, в зв'язувальному кармані для сайту зв'язування 0189/0192 ПЗ5МАРЗЗ і в зв'язувальному кармані для сайту зв'язування К185 П5МАР-23, як визначено вище). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 60 956 розщеплення ПЗМАР-23 (95 при 1 мкмоль модифікованого І - ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль пП5МАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних, представлений на фіг. 18.
Приклади таких модифікованих і-ланцюгів ВоОоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕБО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміни Е148У, 029А, К166М і 53050; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміни Е148У, 029А, К166БЕ і 53050.
Таким чином, в іншому варіанті здійснення даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга ВОоМТ/А, яка розщеплює людський ЗМАР-23 (ПЗМАР-23) і має модифіковану 60 амінокислотну послідовність порівняно з І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО) ІЮ МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування Р1ТІ82/0178 П5МАР-23; де вказаний перший зв'язувальний карман протеазу іІ-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і
Б) заміну амінокислотного залишку, розташованого в третьому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування І198 П5МАР-23; де вказаний третій зв'язувальний карман протеази І/-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком К166 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і с) заміну амінокислотного залишку, розташованого у другому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0189/0192 П5МАР-23; де вказаний другий зв'язувальний карман протеази -ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком О25А І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЕС ІЮ МО: 1); і а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в четвертому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К185 П5МАР-23; де вказаний четвертий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 305 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); е) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з валіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку К166 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1); і ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 029 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і їм. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає
Зо амінокислотному залишку 5305 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1).
У іншому варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВОоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування І198 на П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій у щонайменше трьох різних зв'язувальних карманах І -ланцюга
ВоМТ/А (наприклад, всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178
ПЗМАР-23, всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування 0189/0192 ПЗ5МАРЗЗ і всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування К1І85 ПЗМАР-23). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 1095 розщеплення ПЗМАР-23 (95 при 10 нмоль модифікованого І-ланцюга ВоМтТ/А; 20 мкмоль ПеМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних", представлений на Фіг. 18. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО 10
МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, О29А, К166БЕ і (53050.
Додаткові приклади модифікованих мутантів І-ланцюга ВоМТ/А, що мають мутацію зв'язувального кармана для 1198 П5МАР-23, (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу ЗЕО ІЮО МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, 029А, К166Е, У251Е і 53050.
У одному варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВОоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування І198 П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій в одному або більше різних зв'язувальних карманах І -ланцюга ВоОМТ/А (наприклад, всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 ПЗМАР-23 або всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування К1І85 П5МАР-23, як визначено вище).
Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше З 96 розщеплення ПОМАР-23 (96 при 10 нмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТтТ/А; 20 мкмоль ПЗМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних", представлений на Фіг. 18. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВОМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО 10
МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У їі К166Е; бо модифікований І -ланцюг ВОоОМТ/А, що містить заміну 53050 і К166бР.
У іншому варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування І198 П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій в одному або більше різних зв'язувальних карманах І -ланцюга ВОМТ/А (наприклад, всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р182/0178 ПЗМАР-23 або всередині зв'язувального кармана для сайту зв'язування К185 ПЗМАР-23). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 5595 розщеплення ПЗМАР-23 (95 при 10 нмоль модифікованого І-ланцюга ВоМтТ/А; 20 мкмоль ПеМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних", представлений на Фіг. 18. Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВоОМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу ЗЕО 10
МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У їі К166БЕ.
Як додаткову технічну ознаку або альтернативну технічну ознаку даний винахід включає мутанти І-ланцюга ВоМТ/А, що містять одну або більше мутацій у визначеному тут кармані І - ланцюга ВоМТ/А. Як приклад, модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, який розщеплює людський ЗМАР-23 (П5МАР-23), має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮ МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в сьомому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0210 НЗ5МАР-23;
Б) де вказаний сьомий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 5254 І -ланцюга ВоОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. наприклад, амінокислотний залишок аланіну в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5254 І -ланцюга
ВоОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
Не обмежуючи себе будь-якою теорією, заявник вважає, що визначений вище зв'язувальний карман І-ланцюга ВоОМТ/А може забезпечувати водневий зв'язок із сайтом зв'язування 0210
ПЗМАР-23. Крім того, заявник вважає, що модифікація вказаного зв'язувального кармана (як визначено тут) виключає утворення водневого зв'язку між 0210 ПЗМАР-23 і амінокислотою 254
Зо ВоМТ/А. Вважається, що це, в свою чергу, генерує С-кінцевий продукт розщеплення П5МАР-23 в формі групи, що краще "відходить" і, таким чином, підвищується швидкість розщеплення
ПЗМАР-23.
Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕБО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну 5254А.
У одному варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВОоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування 0210 П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій в одному або більше різних зв'язувальних карманах І-ланцюга
ВоМТ/А, як описано тут (наприклад, всередині щонайменше двох або трьох різних зв'язувальних карманів І -ланцюга ВоМТ/А, таких як зв'язувальний карман для сайту зв'язування Р182/0178
ПЗМАР-23 і зв'язувальний карман для для сайту зв'язування 1198 П5МАР-23 їі, необов'язково, зв'язувальний карман для сайту зв'язування К185 РПЗ5МАР23). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 10 95 розщеплення П5МАР-23 (95 при 10 нмоль модифікованого І - ланцюга ВоМтТ/А; 20 мкмоль ПЗМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних", представлений на фіг. 18.
Приклади таких модифікованих І -ланцюгів ВОМТ/А включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, К166БЕ і 5254А; модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, К166Е, 5254А і 53050.
У переважному варіанті здійснення модифікований І -ланцюг ВоОМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування 0210 П5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій в одному або більше різних зв'язувальних карманах І-ланцюга
ВоОМТ/А, як описано тут (наприклад, всередині щонайменше трьох різних зв'язувальних карманів
Ї -ланцюга ВоМТ/А, таких як зв'язувальний карман для сайту зв'язування Р182/0178 П5МАР-23, зв'язувальний карман для сайту зв'язування І198 П5МАР-23, і зв'язувальний карман для сайту зв'язування К185 пП5ЗМАР23). Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше 25 95 розщеплення ПеЗМАР-23 (956 при 10 нмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль
ПЗМАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних"", представлений на Фіг. 18. Приклади таких модифікованих бо Ї -ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І -
ланцюгом ВоМТ/А дикого типу БЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У, К166Е, 5254А і 53050.
Як додаткову технічну ознаку або альтернативну технічну ознаку даний винахід включає мутанти І-ланцюга ВоМТ/А, що містять одну або більше мутацій у визначеному тут кармані І - ланцюга ВоМТ/А. Як приклад, модифікований І-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу, який розщеплює людський ЗМАР-23 (П5МАР-23), має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВОоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮ МО: 1), яка включає: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого у восьмому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0168 ПЗМАР-23;
Б) де вказаний восьмий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком КЗ340 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. наприклад, амінокислотний залишок гістидину в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку КЗ340 І -ланцюга
ВоОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
Не обмежуючи себе будь-якою теорією, заявник вважає, що визначений вище зв'язувальний карман І-ланцюга ВоМТ/А може забезпечити сольовий місток між 0168 П5МАР-23 і амінокислотою 340 ВоМТ/А.
Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТ/А (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТтТ/А дикого типу 5ЕБО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну КЗ4ОН.
У одному варіанті здійснення модифікований І-ланцюг ВОоМТ даного винаходу, що має мутацію зв'язувального кармана для сайту зв'язування Р1Т82/0178 ПЗ5МАР-23, може додатково містити одну або більше мутацій у зв'язувальному кармані І -ланцюга ВоМТ/А сайту зв'язування р168 п5МАР-23. Такі мутанти зазвичай демонструють щонайменше З 95 розщеплення ПЗМАР- 23 (06 при 1 мкмоль модифікованого І-ланцюга ВоМТ/А; 20 мкмоль П5МАР-23; переважно інкубованих при температурі приблизно 37 "С протягом приблизно 1 години) - див. 2-й стовпець даних, представлений на Фіг. 18В. Приклади таких модифікованих І-ланцюгів ВоМТ/А
Зо (позначуваних за амінокислотною заміною(ами) порівняно з відповідним І-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу БЕО ІЮ МО: 1) включають: модифікований І -ланцюг ВОМТ/А, що містить заміну Е148У ї КЗ4ОН.
Модифікована протеаза І -ланцюга ВоМТ/А, як описано вище, може містити амінокислотну послідовність, що має щонайменше 70 95, наприклад щонайменше 80 95, або щонайменше 85 95, або щонайменше 90 95, або щонайменше 95 95, або щонайменше 97 95 або щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95, ідентичності за послідовністю з І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1). Модифікована амінокислотна послідовність І-ланцюга ВоМТ/А має менше ніж 100 95 ідентичності за послідовністю з І -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 1). Як зазначалося раніше, зазначення в цьому описі модифікованої протеази І!-ланцюга
ВоМТ/А включає її функціональні фрагменти, тобто фрагменти вказаної протеази, які розщеплюють пПЗМАР-23. Наприклад, модифікована протеаза І-ланцюга ВоМТ/А даного винаходу містить щонайменше 300 (наприклад щонайменше 350, або щонайменше 400 або щонайменше 410) амінокислот. Наприклад, вісім М-кінцевих амінокислот і/або карбоксильний кінець (наприклад, останні 32 амінокислоти) протеази І -ланцюга ботулінічного нейротоксину не є необхідними для протеолітичної активності.
Модифікований І -ланцюг ВОоМТ/А даного винаходу може бути пегильований для збільшення стабільності, наприклад, тривалості дії протеазного компонента. Пегилювання переважно включає додавання ПЕГ до М-кінця І-ланцюга. Як приклад, М-кінець І-ланцюга може бути подовжений одним або більше амінокислотними (наприклад, цистеїновими) залишками. Один або більше з вказаних амінокислотних залишків можуть мати свою власну молекулу ПЕГ, приєднану (наприклад, ковалентно зв'язану) до неї. Приклад цієї технології описаний в
Міжнародній патентній заявці УМО2007/104567, зміст якої повністю включений в даний винахід шляхом посилання.
Модифікований ІіІ-ланцюг ВоМТ/А даного винаходу може включати додавання (або видалення) "повторних сайтів модифікації" - див. патентні документи М/02002/040506,
О57223577 і МО2005/068494, кожний з яких повністю включений в даний винахід шляхом посилання. Додаткова присутність або відсутність (порівняно з Ї-ланцюгом ВоМТ дикого типу) таких сайтів змінює біологічну стійкість (наприклад, біологічний час напівжиття) модифікованого
Ї ланцюга даного винаходу. бо У другому аспекті даний винахід стосується конструкції нуклеїнової кислоти, що включає,
або нуклеїнової кислоти, що складається з послідовності, яка кодує модифікований І -ланцюг
ВоМТ/А, як описано тут. Вказана послідовність нуклеїнової кислоти може переважно кодувати засіб доставки Т5І, як додатково описано нижче. Конструкція нуклеїнової кислоти даного винаходу може включати звичайні регуляторні елементи, такі як промотор і/або термінатор.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується конструкції нуклеїнової кислоти в формі бактеріальної плазміди або вірусного вектора. Вказана конструкція нуклеїнової кислоти необов'язково може бути оптимізованою за кодонами для оптимізації експресії (наприклад, рекомбінантної експресії) в бажаній клітині-хазяїні (наприклад, Е.соїЇ).
У одному варіанті здійснення конструкція нуклеїнової кислоти, що кодує модифікований | - ланцюг ВоМТ/А, як описано тут, може бути використана для введення в клітину-мішень, що становить інтерес, наприклад, з терапевтичною або косметичною метою. З цією метою вказану конструкцію нуклеїнової кислоти можна, як правило, оптимізувати за допомогою загальноприйнятої методології для доставки в (з подальшою експресією всередині) клітину- мішень, переважно клітину людини. Клітина-мішень переважно являє собою клітину, що не є нейроном.
У третьому аспект даний винахід стосується засобу доставки для модифікованого |І- ланцюга ВоМТ/А, тим самим полегшуючи проходження модифікованого І-ланцюга ВоМТ/А в клітину-мішень, що становить інтерес. Відповідно до цього аспекту даний винахід зокрема стосується засобу доставки, що містить: а) модифіковану протеазу І -ланцюга ВоМТ/А даного винаходу або конструкцію нуклеїнової кислоти, що включає або що складається з послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує модифікований І -ланцюг ВоМТ/А даного винаходу; і р) засіб для доставки вказаної модифікованої протеази І-ланцюга ВоМТ/А або вказаної конструкції нуклеїнової кислоти в клітину-мішень.
Переважні засоби для такої доставки включають будь-який загальноприйнятий засіб доставки, відомий в даній галузі техніки, такий як ліпосоми, біолистичні частки, пептиди, що проникають в клітини, вектори для перенесення генів тощо.
Одним з особливо переважних способів доставки, який найбільше підходить для використання з даним винаходом, є розроблена заявником технологія націленої секреції
Зо інгібіторів (ТЗІ). Основні способи, що використовуються для створення ТЗІ, добре документовані і на даний час вважаються традиційними (|див., наприклад, Міжнародні патентні заявки УУО98/07864, М/О2006/059113, УуО2009/150469, М/О2010/020811, М/О2009/150470,
УМО2010/094905, УМО2012/156743|, кожна з яких повністю включена в даний винахід шляхом посилання). Технологія Т5І грунтується на механізмі доставки, який імітує ті ж основні етапи, які використовує клостридіальний нейротоксин, коли він інтоксикує клітину-хазяїна (тобто зв'язування з клітиною-мішенню, утворення ендосом, транслокація І-ланцюга в цитозоль, протеолітичне розщеплення білка 5МАКЕ за допомогою І-ланцюга). Засоби доставки Т5І грунтуються на простій структурі клостридіального нейротоксину, що має три основних компоненти: 1) І-ланцюг клостридіального нейротоксину; 2) Націлюючий фрагмент (НФ), щоб направляти засіб доставки до вибраної клітини-мішені.
Як правило, нативний зв'язувальний домен клостридіального нейротоксину (Нсс), може бути замінений лігандом для забезпечення вибіркового зв'язування засобу доставки з бажаною клітиною-мішенню, відмінною від нативної клітини-мішені вказаного Нсс. У переважному варіанті здійснення винаходу можна використати більше ніж один НФ (необов'язково включаючи зв'язувальний домен клостридіального нейротоксину);
З) транслокаційний пептид (наприклад, домен транслокації Нм клостридіального нейротоксину) для забезпечення доставки І -ланцюга клостридіального нейротоксину в клітину- мішень, де вона може потім виявити свою протеолітичну дію (тобто розщеплення білка ЗМАКЕ).
Таким чином, в переважному варіанті здійснення винаходу засіб Б) засобу доставки даного винаходу може включати: - ) Націлюючий фрагмент (НФ), який зв'язує засіб доставки з клітиною-мішенню. Вказаний націлюючий фрагмент може являти собою або нативний зв'язувальний домен клостридіального нейротоксину (НСС), або, більш переважно, ліганд, що забезпечує зв'язування з клітиною- мішенню, відмінною від нативної клітини-мішені вказаного Нсс; і і) транслокаційний пептид, який транслокує модифіковану протеазу І-ланцюга ВоМТ/А даного винаходу в клітину-мішень, переважно в цитозоль вказаної клітини.
Засіб доставки даного винаходу, як правило, включає один або більше націлюючих фрагментів (НФ). Зазначення НфФ включає будь-яку структуру (зазвичай пептид), яка бо функціонально взаємодіє із сайтом (наприклад, рецептором або акцептором), викликаючи фізичну асоціацію між модифікованою протеазою І-ланцюга ВоМТ/А даного винаходу і поверхнею клітини-мішені ссавця (наприклад, клітини людини). Сайт переважно являє собою сайт, здатний до інтерналізації (наприклад, утворення ендосом), що також називається рецептор-опосередкованим ендоцитозом. НФ може мати функцію транслокації ендосомальної мембрани, і в цьому випадку не треба використовувати окремі компоненти НФ і домен транслокації.
НФ даного винаходу зв'язується (наприклад, специфічно зв'язується) з вибраною клітиною- мішенню. Термін "специфічно зв'язується" переважно означає, що даний НФ зв'язується з клітиною-мішенню з афінністю зв'язування (Ка) 1056 М" або більше, наприклад, 107 М" або більше, 108 М" або більше або 109 М- або більше.
Те, що НФ зв'язується з вибраною клітиною-мішенню, підтверджується стандартним чином.
Наприклад, може бути використаний простий експеримент по радіоактивному зміщенню, в якому тканина або клітини, що представляє клітину-мішень, що цікавить, піддаються впливу міченого (наприклад, тритованого) НФ в присутності надлишку неміченого НФ. У такому експерименті можуть бути оцінені відносні пропорції неспецифічного і специфічного зв'язування, що дозволяє підтвердити, що НФф зв'язується з клітиною-мішенню. Необов'язково, аналіз може включати один або більше антагоністів зв'язування, і аналіз може додатково включати спостереження втрати зв'язування НФ. Приклади експериментів такого типу можна знайти в
ІНиїте, Е.С. (1990), Весеріог-Біпаїіпу 5іцдієв5, а ргіеї ошіпе, рр. 303-311, Іп Весеріог Біоспетівігу,
А Ргасіїса! Арргоасії, Еа. Е.С. Ниїте, Охіога Опімегейу Ргезві.
НФ даного винаходу переважно зв'язується з ненейронною клітиною-мішенню (наприклад, тучною клітиною та/або епітеліальною клітиною - див., наприклад, міжнародні патентні заявки
МУО00/10598 ії УМ/О01/21213, кожна з яких повністю включена в даний винахід шляхом посилання). При цьому вказаний НФ здатний направляти засіб доставки до вибраної ненейронної клітини-мішені, яка експресує небажаний фенотип ПЗМАР-23 (ії, необов'язково, небажаний фенотип 5МАР-25). Паралельно НФ даного винаходу може окремо зв'язуватися (наприклад, через той самий НФ або через другий НФ) з другою вибраною клітиною-мішенню, наприклад з другою ненейронною клітиною-мішенню або з нейронною клітиною-мішенню, яка експрессує небажаний фенотип П5МАР-23 і/або ЗМАР-25.
Відповідні НФ включають: ліганди до сайтів зв'язування рецепторів клітин ссавців, такі як цитокіни, фактори росту, нейропептиди, лектини й антитіла - цей термін включає моноклональні антитіла, одноланцюгові антитіла і фрагменти антитіл, такі як баб, Е(аб)у2, Ем, ЗсЕм тощо.
Як додатковий приклад, НФ включають пептид лептин, рецептор греліну, пептид соматостатин, пептид інсулінового фактора росту, пептид ЕГтОВ (наприклад, ЕСЕ), пептид МІР- глюкагон-сАЕ-секретин (наприклад, пептид РАСАР), пептид інтерлейкін (наприклад, пептид ІЇ- 1, 11-2, 1-6 або 1-10), пептид МОРЕ, пептид МЕСЕ, пептид бомбезин, пептид уротензин, пептид меланін-концентруючий гормон, пептид пролактоліберин, пептид Кіз5-1, пептид СКЕ, пептид
СНЕН, пептид речовини Р, пептид бета-2-адренорецептор, гастрин-вивільняючий пептид, пептид, зв'язаний з геном кальцитоніну, пептид фактора росту тромбоцитів, пептид фактора росту кератиноцитів, пептид фактора росту гепатоцитів, пептид ФНО-альфа, пептид ФНО-бета, передсердний натрійуретичний пептид і пептид інтегрин.
Засіб доставки даного винаходу зазвичай не має (функціонального) зв'язувального домену клостридіального нейротоксину (як НФ).
Альтернативно, засіб доставки даного винаходу може включати (функціональний) зв'язувальний домен клостридіального нейротоксину (як НФ). Зазначення зв'язувального домену клостридіального нейротоксину включає частину Нс (точніше, Нсс) клостридіального нейротоксину, а також її мутанти, які зберігають зв'язувальну здатність домену Нс (наприклад, здатність зв'язувати синаптосомальні мембрани щурів в звичайних аналізах зв'язування, таких як описано в |(Зпопе еї а. (1985) Єиг. 9. Віоспет. 151, 75-82.
Зв'язувальний домен/пептид Нс нативного клостридіального нейротоксину містить приблизно 400-440 амінокислотних залишків і складається з двох функціонально відмінних доменів приблизно по 25 кДа кожний, а саме - М-кінцевої ділянки (зазвичай званої пептидом або доменом Нем) і С-кінцевої ділянки (зазвичай званої пептидом або доменом Нсс). Саме С-кінцева ділянка (Нсс), яка утворена С-кінцевими амінокислотними залишками 160-200, відповідає за зв'язування клостридіального нейротоксину з нервовими закінченнями в нервово-м'язовому з'єднанні. Типові пептиди НСС включають:
Ботулінічний нейротоксин типу А - амінокислотні залишки (у1111-І 1296)
Ботулінічний нейротоксин типу В - амінокислотні залишки (у1098-Е1291)
Ботулінічний нейротоксин типу С - амінокислотні залишки (У1112-Е1291) бо Ботулінічний нейротоксин типу О - амінокислотні залишки (у1099-Е1276)
Ботулінічний нейротоксин типу Е - амінокислотні залишки (у1086-К1252)
Ботулінічний нейротоксин типу Е - амінокислотні залишки (у1106-Е1274)
Ботулінічний нейротоксин типу С - амінокислотні залишки (у1106-Е1297)
Правцевий нейротоксин - амінокислотні залишки (У1128-01315).
Вищезгадані еталонні послідовності потрібно розглядати як зразкові дані, оскільки можуть мати місце невеликі варіації залежно від субсеротипу.
Засіб доставки даного винаходу зазвичай включає транслокаційний пептид, який забезпечує транслокацію модифікованого І-ланцюга в цитозоль мішені. Чи має пептид необхідну транслокаційну функцію відповідно до даного винаходу, може бути підтверджено будь-яким з декількох загальноприйнятих аналізів. Наприклад, Зпопе С. (1987) описує аналіз іп міго з використанням ліпосом, які навантажують молекулою, що тестується. Наявність необхідної транслокаційной функції підтверджується вивільненням з ліпосом Ка і/або міченого НАД, які можна легко контролювати |див. попе С. (1987) Еиг. У. Віоспет; мої. 167(1): рр. 175-180). Ще один приклад можна знайти в Віаихієїп К. (1987), де описаний простий аналіз іп міїго з використанням плоских фосфоліпідних двошарових мембран. Мембрани навантажують молекулою, що тестується, і необхідну транслокаційну функцію підтверджують збільшенням провідності через вказані мембрани |див. Віацйхієвїп (1987) РЕВЗ І ей; мої. 226, по. 1: рр. 115- 120). Додаткова методика, що дозволяє оцінити злиття мембран і, таким чином, ідентифікувати транслокаційні домени, придатні для використання в даному винаході, описана в |Меїтоав іп
Епгутоїоду Мої 220 апа 221, Метрьгапе Ризіоп Тесппіднев, Рагіз А апа В, Асадетіс Ргез5 1993).
Транслокаційний домен може мати клостридіальне походження, таке як домен/частина Ним нейротоксину. Термін "домен Нк»" означає фрагмент Н-ланцюга клостридіального нейротоксину, приблизно еквівалентний амінокінцевій половині Н-ланцюга. Домен Нм клостридіального нейротоксину позбавлений природної функції зв'язування компонента Нс Н-ланцюга. Таким чином, домен Нм не здатний зв'язуватися із сайтом зв'язування на клітині-мішені, 3 якою зв'язується нативний клостридіальний нейротоксин (тобто холотоксин).
Приклади придатних (еталонних) транслокаційних доменів включають:
Ботулінічний нейротоксин типу А - амінокислотні залишки (449-871)
Ботулінічний нейротоксин типу В - амінокислотні залишки (441-858)
Зо Ботулінічний нейротоксин типу С - амінокислотні залишки (442-866)
Ботулінічний нейротоксин типу О - амінокислотні залишки (446-862)
Ботулінічний нейротоксин типу Е - амінокислотні залишки (423-845)
Ботулінічний нейротоксин типу Е - амінокислотні залишки (440-864)
Ботулінічний нейротоксин типу С - амінокислотні залишки (442-863)
Правцевий нейротоксин - амінокислотні залишки (458-879)
Дослідження показали, що повна довжина частини Нм важкого ланцюга клостридіального нейротоксину не є необхідною для транслокаційної активності. Таким чином, аспекти цього варіанта здійснення винаходу можуть включати ділянки Нм клостридіального токсину, що містять домен транслокації що має довжину, наприклад щонайменше 350 амінокислот, щонайменше 375 амінокислот, щонайменше 400 амінокислот і щонайменше 425 амінокислот.
Для отримання більш детальної інформації про генетичні основи отримання токсинів в
Сіозігідійт роїціїпит і С. теїапі, див. Непаегзоп еї аї (1997) іп Те Сіозігідіа: Моїесшаг Віоіоду апа
РашШодепезвіз5, Асадетіс ргевв.
Термін "Нк» включає частини Нм нейротоксину, що зустрічаються в природі, а також варіанти
Нм, що мають амінокислотні послідовності, які не зустрічаються в природі, за умови, що ці варіанти Нм зберігають вищезазначену функцію транслокації. Наприклад, частина Нм клостридіального нейротоксину включає різні амінокислотні послідовності, що мають щонайменше 70 95 (наприклад щонайменше 80 95 або щонайменше 8595, або щонайменше 90 95, або щонайменше 95 95, або щонайменше 97 95, або щонайменше 98 95, або щонайменше 99 95) ідентичності за послідовністю з частиною Нм клостридіального нейротоксину дикого типу, хоча за умови, що вони зберігають функцію транслокації.
Альтернативно, транслокаційний пептид може мати неклостридіальне походження, наприклад він може являти собою транслокаційний домен дифтерійного токсину (О.Кевеге еї аї.,
Ргос. Маїй!. Асад. сі. ОБА (1992) 89, 6202-6206; 5імепттанп еї аї!., у. Віої. Спет. (1993) 269, 22524- 22532; і Гопаоп, Е. (1992) Віоспет. Віорпу5. Асіа., 1112, рр.25-51|), транслокаційний домен екзотоксину типу А синьогнійної палички |Ргіог еї аї. Віоспетівшу (1992) 31, 3555-3559)|, транслокаційні домени токсину сибірської виразки ІВіапке еї аї. Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА (1996) 93, 8437-8442, різноманітні фузогенні або гідрофобні пептиди з функцією транслокації (РіапкК еї аІ. У. Віої. Снет. (1994) 269, 12918-12924; і УУМадпег еї а! (1992) РМА5, 89, рр.7934-79381| і бо амфіфільні пептиди (Мигаїа єї а! (1992) Віоспет., 31, рр.1986-19921І.
Зазначення транслокаційних пептидів неклостридіального нейротоксину включає фрагменти і варіанти амінокислотних послідовностей, що мають щонайменше 7095 (наприклад щонайменше 80 95 або щонайменше 85 95, або щонайменше 90 95, або щонайменше 95 95, або щонайменше 9795, або щонайменше 9895, або щонайменше 9995) ідентичності за послідовністю з відповідною неклостридіальною транслокаційною пептидною послідовністю дикого типу, хоча за умови, що цей варіант зберігає функцію транслокації. каційного домен
Зіметтап еї аї., 1994, 9. Віої!. сш Сет. 269, 22524-22532
Дифтерійний токсин 194-380 Копаоп Е., 1992, Віоспет.
Віорпуз. Асіа., 1113, 25-51
Ртіог єї аї., 1992, Віоспетівігу
Домен ІЇ екзотоксин 405-613 31, 3555-3559 синьогнійної палички Кінага є Равіап, 1994, Віосопі
Спет. 5, 532-538
Ріапк еї а!., 1994, 3. Віої. Снет. 269, 12918-12924
Гемаглютинін вірусу грипу СІ ЕСАІАСЕРІЕМСМ ЕС МІСТУ УС, | УМадпег єї а!., 1992, РМАБ, 89, і його варіанти 7934-7938
Мигаїа еї а!., 1992,
Віоспетівігу 31, 1986-1992 везикулярного стоматиту З19(2), 319-332 . . пе зЗеїйп еї аї!., 2003, у Міго! 77(11)
Глікопротеїн оболонки вірусу пеня Рісага-Мацгєац еї аї., 2003, у
Поліпептиди даного винаходу можуть додатково містити домен, що полегшує транслокацію.
Вказаний домен полегшує доставку нецитотоксичної протеази в цитозоль клітини-мішені і описаний, наприклад, в міжнародних патентних заявках УУОО8/008803 і УУОО8/008805, кожна з яких включена в даний винахід шляхом посилання.
Наприклад, придатні домени, які полегшують транс локацію, включають домен фузогенного пептиду оболонки вірусу, наприклад, придатні домени фузогенного пептиду включають домен фузогенного пептиду вірусу грипу (наприклад, домен фузогенного пептиду вірусу грипу А з 23 амінокислот), домен фузогенного пептиду альфавірус (наприклад, домен фузогенного пептиду вірусу лісу Семлікі з 26 амінокислот), домен фузогенного пептиду везикуловірусу (наприклад, домен фузогенного пептиду вірусу везикулярного стоматиту 3 21 амінокислоти), домен фузогенного пептиду респіраторного вірусу (наприклад, домен фузогенного пептиду вірусу
Сендай з 25 амінокислот), домен фузогенного пептиду морбілівірусу (наприклад, домен фузогенного пептиду вірусу чумки собак з 25 амінокислот), домен фузогенного пептиду авулавірусу (наприклад, домен фузогенного пептиду вірусу ньюкаслської хвороби з 25 амінокислот), домен фузогенного пептиду хеніпавірусу (наприклад, домен фузогенного пептиду вірусу Хендра з 25 амінокислот), домен фузогенного пептиду метапневмовірусу (наприклад, домен фузогенного пептиду метапневмовірусу людини з 25 амінокислот) або домен фузогенного пептиду спумавірусу, такий як домен фузогенного пептиду вірусу пінистості мавп; або їхні фрагменти або варіанти.
Як додатковий приклад, домен, який полегшуює транслокацію, може включати домен Нсм клостридіального нейротоксину або його фрагмент, або варіант (що має щонайменше 70 95 ідентичності за послідовністю з відповідною послідовністю дикого типу), хоча за умови, що він зберігає поліпшену функцію транслокації. Більш детально, домен, який полегшуює транслокацію, Нсм клостридіального токсину, може мати довжину щонайменше 200 амінокислот, щонайменше 225 амінокислот, щонайменше 250 амінокислот, щонайменше 275 амінокислот. У цьому відношенні, домен, який полегшуює транслокацію, Нсм клостридіального токсину, переважно має довжину не більше ніж 200 амінокислот, не більше ніж 225 амінокислот, не більше ніж 250 амінокислот або не більше ніж 275 амінокислот. Конкретні (еталонні)
приклади включають:
Ботулінічний нейротоксин типу А - амінокислотні залишки (872-1110)
Ботулінічний нейротоксин типу В - амінокислотні залишки (859-1097)
Ботулінічний нейротоксин типу С - амінокислотні залишки (867-1111)
Ботулінічний нейротоксин типу О - амінокислотні залишки (863-1098)
Ботулінічний нейротоксин типу Е - амінокислотні залишки (846-1085)
Ботулінічний нейротоксин типу Е - амінокислотні залишки (865-1105)
Ботулінічний нейротоксин типу С - амінокислотні залишки (864-1105)
Правцевий нейротоксин - амінокислотні залишки (880-1127).
У четвертому аспекті даний винахід стосується способу розщеплення ПЗМАР-23, де вказаний спосіб включає приведення ПОМАР-23 в контакт з модифікованою протеазою |І- ланцюга ВоМТ/А, або з конструкцією нуклеїнової кислоти, або із засобом доставки, як описано тут, тим самим дозволяючи модифікованому І -ланцюгу ВОоМТ/А зв'язатися зі вказаним ПЗМАР- 23 з подальшим протеолітичним розщепленням ПЗМАР-23 модифікованою протеазою |І- ланцюга ВоМТ/А. У одному варіанті здійснення винаходу вказаний спосіб виконується іп міїго.
У одному варіанті здійснення винаходу вказаний спосіб розщеплення ПЗМАР-23 включає попередні етапи: 1) зв'язування засобу доставки з клітиною-мішенню за допомогою його націлюючого фрагмента (НФ); і 2) транслокацію модифікованого І -ланцюга ВоМТ/А в клітину-мішень, переважно в цитозоль вказаній клітині-мішені, за допомогою транслокаційного пептиду засобу доставки.
Переважно НФ зв'язується із сайтом на клітині-мішені (наприклад, з молекулою білка, цукру та/або ліпіду), причому вказаний сайт здатний до опосередкованого рецептором ендоцитозу, і засіб доставки потім інтерналізується клітиною-мішенню через утворення ендосоми. Після цього транслокаційний пептид засобу доставки може переміщувати модифікований І -ланцюг ВОМТ/А через ендосомальну мембрану і в цитозоль клітини-мішені.
У іншому аспекті даний винахід стосується модифікованої протеази І -ланцюга (ВоМТ/А), або конструкції нуклеїнової кислоти, або засобу доставки, як описано тут, для застосування в способі розщеплення ПЗМАРІЗ, як описано вище.
Зо У іншому аспекті даний винахід стосується описаної тут модифікованої протеази І -ланцюга (ВоМТ/А) для застосування в способі лікування, переважно способі лікування секреторного розладу.
Таким чином, в одному аспекті даний винахід стосується описаної тут протеази І -ланцюга
ВоОМТ/А, або описаної тут конструкції нуклеїнової кислоти, або описаного тут засобу доставки для застосування як лікарського засобу.
У таких аспектах вказана модифікована протеаза І -ланцюга ВоОМТ/А переважно міститься в
ВоМтТ, що додатково включає важкий ланцюг, тобто в повнорозмірному ВоМТт. Такі повнорозмірні ВОМТ зазвичай мають поліпептидний ланцюг масою 150 кДа, що містить важкий ланцюг масою 100 кДа і легкий ланцюг масою 50 кДа, зв'язані дисульфідним зв'язком, і організовані в три функціональних домени: М-кінцевий протеолітичний легкий ланцюг (Її - ланцюг); і С-кінцевий важкий ланцюг (Н-ланцюг), останній складається з транслокаційного домену (Н»к) і С-кінцевого нейрон-зв'язувального домену (Не).
Переважні секреторні розлади включають спастичність м'язів/гіперактивний рух м'язів (включаючи спастичність після інсульту, спастичність після пошкодження спинного мозку, спазми голови і шиї, повіки, піхви, кінцівок, щелеп їі голосових зв'язок), косоокість, гіпергідроз і важкий первинний пахвовий гіпергідроз.
Даний винахід буде краще зрозумілий в світлі наступних детальних прикладів. Проте, фахівцеві в даній галузі техніки зрозуміло, що цей детальний опис не є таким, що обмежує, і що можуть бути зроблені різні модифікації, заміни, відступи і зміни, які при цьому не вийдуть за межі обсягу винаходу.
Опис креслень
Фіг. 1 - Дані щодо розщеплення ПЗМАР-23 і ПНЗМАР25 для модифікованих протеаз І -ланцюга
ВоМТ/А даного винаходу. (А) дані для протеази І -ланцюга ВоМТ/А, що має мутації в одному зв'язувальному кармані, (В) дані для протеази І-ланцюга ВоМТ/А, що має мутації в декількох зв'язувальних карманах.
Фіг. 2 - Тоноване ЗО-зображення взаємодії протеази І -ланцюга ВОоМТ/А (контур) із сайтами зв'язування ЗМАР-25/23 (лінія візуалізації).
Амінокислотні послідовності
ЗЕО ІЮ МО: 1 - Легкий ланцюг ВоМТ/А дикого типу (амінокислотні залишки 1-438 Опіргої 60 А5НА 29)
МРЕУМКОЕМУКОРУМаМО1ТАМІКІРМАСОМОРУКАРКІНМКІМУМІРЕВОТЕТМРЕЕСОЇ МЕРРРЕАК
ОМРУБУМОБТМІ ЗТОМЕКОММІ КЕМТКІ ГЕВІМЗТОЇ САМІ ТОІУВИатРеЕмааЗТІОТЕЇКМІОТМСІМ
МІОРРОаБУВЗЕБЕЇ МР МІС РЗАВПОРЕСКЗЕеаНЕМІ М.ТАМамавтомІВЕ5РОЄТЕРСЕРЕЕБЗІ ЕМОТМР
ПП аАСКЕАТОРАМТІ АНЕГІНАСНВЇ МИ! АйІМРМАМЕКУМТМАММЕМЗаї ЕМЗЕЕЕГ АТРааНнорАКРІОЮ
З'ОЕМЕЕВІ УУУМКЕКОІА5ТІ МКАКБІМИа ТТАБІ ОУМКМУЕКЕКМ І ЗЕОТЗаКеЕЗМОКІ КЕОКІ МКМ
ГТЕІМТЕОМЕМКЕЕКМІ МАКТМІ МЕОКАМЕКІМІМРКУММ ТІМОСЕМ А!АМТ МІГ ААМЕМСОМ ГЕІММММЕТ
К-КМЕТас гЕЕУК І. СУВаИТпттекК
ЗЕО ІЮ МО: 2 - людський ЗБМАР2З
МОМ З5ЕБІООВАНОЇІТОЕЗІ ЕЗТАНВІЇ аг АТЕЗОВАСІКТІТМСОЄОКЕОЇМАЕєСГ ООІМКОМА
ЕТЕКТІ ТЕГ МКССаії СМСРСОМАТКМЕЕЗаКАУКТ ПУСРИасЕМЗРОМУУЗКОРЕаРУТМООЇ ООРТТ
СААБасСтУІкКВІТМОАВЕРЕМЕЕМ ТОМаБІ ОМ КОМА МО МЕ! ВАОМРОІКА! ТОКАЮТМАОВІОІАМ
АВАККПИЮ5
ЗЕО ІЮ МО: 3-5МАР25 людини і гризуна
МАЕВАОМАМЕГЕЕМОАВАРАВОЇ АРЕБІ ЕЗТАВМІ ОЇ МЕЕЗКОАСІВТІ ММІ ОБОСЕОГ ЕВІЕЕС
МООІМКОМКЕАЕКМІ ТОЇ аКЕСаї СМОРСМКІ КОЗВАУККАМаИММОраММАБОРАВУМОЕВЕОМА
ІЗССЕІАВУТМОАВЕМЕМОЕМГ ЕОМЗСПОИМІ АНМАГОМаИмМмеЕІЮТОМАОІЮВІМЕКАОЗМКТВІСЕАМ
ОВАТКМІ аа
ЗЕО ІЮО МО: 4 - Сайт ІдА-протеази Нівб мітка (штучна)
РРТРОаНННННН
ЗЕО І МО: 5 - мітка Тм/іп 5ігер Тад (штучна)
МАБМЗНРОРГЕКОСОВИсСОБИИСИЯЗМЗНРОГЕКОДИа5
ЗЕО І МО: 6-Нів6 мітка (штучна) анннннн
ЗЕО І МО: 7 - Сайт У-ІдА-протеази Нівб мітка (штучна)
МРРТРОаНННННН
ЗЕО ІО МО: 8-ВОоМТ/А1 дикого типу
МРЕУМКОЕМУКОРУМаМО1ТАМІКІРМАСОМОРУКАРКІНМКІМУМІРЕВОТЕТМРЕЕСОЇ МРРРЕАК
ОМРУБУМОБТМІ ЗТОМЕКОММІ КЕМТКІ ГЕВІМЗТОЇ САМІ ТЗІУВИатРеЕМаСИЗТІОТЕЇ КМІОТМСІМ
МІОРРОаБУВЗЕБЕЇ МР МІС РЗАВПОРЕСКЗЕеаНЕМІ М.ТАМамавтомІВЕ5РОЄТЕРСЕРЕЕБЗІ ЕМОТМР
ПП аАСКЕАТОРАМТІ АНЕГІНАСНВЇ МИ! АйІМРМАМЕКУМТМАММЕМЗаї ЕМЗЕЕЕГ АТРааНнорАКРІОЮ
ЗГОЕМЕРВІ УМУМКЕКОІАЗТІ МКАКБІМОа ТТ ТАБ ОММКММУЕКЕКМІ І ЗЕОТБаКеЕЗМОКІ КЕеОКІ КМ
ГТЕІМТЕОМЕМКЕЕКМІ МАКТМІ МЕОКАМЕКІМІМРКУММ ТІМ ОСТЕМІ АВМ ТМ ААМЕМСОМТЕІММММЕТ
ККМЕТагРЕРЕУК СУвИаптектТкКІ ОКамУМКкКАЇ МОЇ СІКУММУ/ ОС ЕЕЗРЗЕОМЕТМОЇ МКОЕЕІТ5О
ТМІЕААЕЕМІЗІ ОПОСММІ ТЕМЕОМЕРЕМІБІЕМІ Б5ОПСОЇ ЕІ МРМЕЕВЕРМаККМ ЕЕГ ОКУМТМЕНМІ В
АОЕБЕРЕНОаКЗАЇАЇ ТМЗУМЕАГ І МРОВУМУТЕЕЗБОМУККУМКАТЕААМН СМ МЕОЇ ММОЄТОЕТЕУ5
ТТОКІАОІТППРМІСРАСМСИММІ УКОБЕМаАПІЕЗСИАМІ ГГ ЕРІРЕІАІРМ СТЕАГ МЗМІАМКУ ТМОТІОМА
І З5КАМЕКУМУОЕМУКМІМ ТМУМІ АКУМТОІОЇ ТАККМКЕАГЕМОАЕАТКАПММОММОМ ТЕЕЕКММІМЕМІЮ
РІ З5КІ МЕБЗІМКАМІМІМКЕ МОСЗУБМІ ММЗМІРМИМКАГЕОБРАБІ КОАГ КМІМОМАСаТЛИОМоОВІ.
КОКУММТІ ЗТОІРЕОЇ ЗКУМОМОВИ ЗТЕТЕМІКМИІМТОІ МОСАМЕЗМНІИОЇ ЗАМАЗКІМІАЗКУМЕО РІ
ОКМОПОЇ ЕМЕЗЗКІЄМІ КМАЇМУМЗММЕМЕЗТЗЕМІВІРКМЕМБІБІСММЕМ ПІМСМЕММЗСОМ/КМУБІ МУ
СЕТ ООТОБІКОВУМЕКУЗОМІМІЗОМІМАУМЕМ ТТ ММАСММЗКІМІМИ АГ ООКРІЗМІ СМІНАЗММІ
МЕК расвОотТнеАМІММІКУЕМІ РОКЕМЕКЕІКОЇ МОМОБМЗСИЇ КОРМ Ирм оМОокРУММІ МІ МОРМК жмУруммуУагвамимМмІі кагРвазумттмімі Мм55І иваТаткРккмиАВамкомМммАММОВУМІМУММУКМКЕ
УВГАТМАБОАСМЕКІЇ ЗА ЕІРОМАМІ БОУМУМКеКМООСІТТМКОоКММ О0ММаИмосРІСИСЕНОЕММІ
АК МАМУ УМВОІЕВЗЗАТІ СУ ЕРІРУВОСУУСЕВРІ.
ЗЕО ІЮО МО: 9 - лінкер І Нм (штучна) увайт5кткбІ ркКаммкКА! МОЇ
ЗЕО ІЮО МО: 10 - сайт активації ентерокінази ророк
ЗЕО ІЮО МО: 11 - петля активації ВОМТ/А1 мраптектко5рорроОкМКАЇ МІ о
Приклади
Приклад 1 - Отримання модифікованих І -ланцюгів ВОМТ/А (ІС ВоМТ/А) даного винаходу
Плазміду рВМ3З, що кодує І -ланцюг ВоМТ/А дикого типу (амінокислоти 1-448, БЕО ІЮО МО: 1), отримували за допомогою ПЛР ії придатних олігонуклеотидних праймерів з використанням бактеріальної ДНК штаму 62А як матриці. ДНК, що кодує амінокислотну послідовність
РРТРОНННННН (5ЕО ІЮО МО: 4), вбудовували після кодона для амінокислоти АЇа-449. Штам
Е.соїї МІБрАЕРА (Оіадеп, Ніїдеп, Німеччина) трансфікували плазмідою рВМ3, що містить ІС
ВоОМТ/А дикого типу, або її мутанти, тобто мутанти протеази 5ЕО ІЮО МО: 1, як описано в даній бо заявці. Для кожного трансфікованого штаму Е.соїї одну бактеріальну колонію, вирощену протягом ночі в 5 мл середовища 2УТ, використали для інокуляції 500 мл середовища 2УТ.
Після того як культура досягла ОП 0,7 при довжині хвилі 600 нм, І-ланцюги ВоМТт/А отримували протягом 15 год. індукції з використанням 0,2 мМ ІРТО при температурі 21 76.
Бактерії збирали центрифугуванням і заморожували при температурі -20 "С протягом ночі.
Бактерії ресуспендували в лізуючому буфері (300 мМ Масі, 50 мМ фосфат, рН 8,0) з додаванням бензамидину, пепстатину А і РМ5Е в кінцевих концентраціях 5 мМ, 1 мкг/мл і 0,5
ММ відповідно, лізували ультразвуком, лізат очищували центрифугуванням протягом 30 хвилин при 29000 д, і Ї-ланцюг ВоМТ/А зв'язували з гранулами Мі2-ж-нітрилотриоцтової кислоти і агарози. Гранули промивали 20 об'ємами шару лізуючого буферу, що містить 10 мМ імідазолу, і елюювали І-ланцюг ВоМТ/А лізуючим буфером, що містить 100 мМ імідазолу. Фракції, що містять бажаний білок, піддавали діалізу проти буферу для аналізу токсину (150 мМ глутамат калію, 10 мМ Нере5-КОН, рн 7,2) і на останньому етапі очищений І -ланцюг, заморожували в рідкому азоті і зберігали при температурі -70 "С.
Приклад 2 - Безклітинний аналіз розщеплення ПЗМАР-23
Отримували плазміду ПЗ5МАР-23 (5БО 10 МО: 2) для експресії в Б.соїї і транскрипції/трансляції іп міго, рез-пеМАР-2ЗНІв6.
Вона кодує М-кінцеву злиту мітку Тм/іп зігер Тад (МАБМІЗНРОРГЕКОСО5БОСОБОСОБМУЗНРОБРЕКОАОБ5, 5ЕБЕО ІЮО МО: 5) ії С-кінцеву злиту мітку
Нізб (ЗНННННН, ЗЕО ІО МО: 6) після кодона карбокси-кінцевого серину 211.
Для отримання і очищення білка штам Е.соїї ВІ 21-0ЕЗ (5ігаїадепе Еигоре, Ебзаопегодгипа,
Німеччина) трансфікували плазмідою рз3-нЗМАР-23Нізб за тим самим протоколом, який детально описаний для протеази І-ланцюга ВоМТ/А в Прикладі 1. Однак білок, елюйований з гранул Мі2--нітрилотриоцтової кислоти і агарози, додатково очищували на гранулах стреп- тактин-агарози (ІВА І езсіепсе5, Геттінген, Німеччина) шляхом промивання 20 об'ємами шару 0,1 М Трис, рН 8,0 і елюювання 10 мМ дестхіобіотином в 0,1 М Трис, рН 8,0. Крім того, у всі буфери, що використовуються для очищення ПЗМАР-23, додавали 10 мМ р-меркаптоетанол.
Потім радіоактивно мічений ЯЗМАР-23 отримували шляхом транскрипції/трансляції іп міїго з використанням ре3-поМАР-2ЗНІ56, системи лізату ретикулоцитів ТМТ, зв'язаної з Т7 (Рготеда) і
ІЗ55І метіоніну (370 кБк/мкл, 237 ТБк/ммоль; Нагітапп Апаїуїіс, Брауншвейг, Німеччина) згідно з
Зо інструкцією виробника.
Безклітинний аналіз розщеплення П5МАР-23 включав рекомбінантний ПОМАР-23 в кінцевій концентрації 20 мкмоль плюс 1 мкл суміші для транскрипції/трансляції, що складається з міченого ІЗ55| метіоніном ПОМАР-23 і кожного модифікованого або дикого типу І-ланцюга
ВоМТ/А, в кінцевих концентраціях 1 мкмоль або 10 нмоль, які інкубували протягом 60 хв. при температурі 37 "С в загальному об'ємі 10 мкл буферу для аналізу токсинів. Реакції зупиняли додаванням однакового об'єму двократного буферу для зразка (120 мМ Тріс-НОСЇ (рН 6,75), 10 95 (об./06.) В-меркаптоетанол, 4 95 (06б./06.) ДСН, 20 95 (мас./об.) гліцерин і 0,014 95 (мас./об.) бромфеноловий синій). Після інкубації протягом 30 хвилин при температурі 37 "С кожний зразок аналізували з допомогою ДСН-ПААГ з використанням 1595 трис-гліцинових гелів (співвідношення акриламід/біс-акриламід: 73,5:1).
Гелі висушували і візуалізували радіоактивно мічений білок з використанням фосфоіміджера
ЕГА-9000 (Рції Рпою Ріт, Со., Ца., Токіо, Японія). Кількісне визначення радіоактивно міченого білка і продуктів його розщеплення проводили за допомогою програмного забезпечення
Мийідацде 3.2 (Еції Рпоїо Ейт). Для визначення кінетичних параметрів ферменту І-ланцюга
ВоМТ/А дикого типу і його мутантів концентрацію субстрату варіювали від 5 до 100 мкМ з використанням НЗМАР-23, що продукується в Е.соїї. До кожної з різних концентрацій субстрату додавали 1 мкл радіоактивно міченого ПЗМАР-23, отриманого шляхом транскрипції/трансляції іп міїго. Інкубацію проводили в кінцевому об'ємі 25 мкл буферу для аналізу токсинів. Після 2 і 4 хв. інкубації при температурі 37 "С відбирали аліквоти по 10 мкл і ферментативну реакцію зупиняли, змішуючи з 10 мкл заздалегідь охолодженого двократного буферу для зразків ДСН-
ПААГ. Відсоток розщеплення визначали по перетворенню радіоактивно міченого субстрату, як детально описано вище, і використали для розрахунку початкової швидкості гідролізу субстрату. Значення Кт, Ксаї і Мтах розраховували методом нелінійної регресії з використанням програми СгарпРаа Ргізт 4.03 (сгарпРайд 5ойпмаге Іпс., Дієго, США).
Отримані дані показані на Фіг. 1.
Приклад З - Безклітинний аналіз розщеплення ПЗМАР-25
Плазміда рВМ10 для експресії НЗМАР-25 (ЗЕО ІЮ МО: 3) в Е.соїї була описана в Віп? еї аї. ()
Віої Снпет., 1994; 269: 1617-20). Після кодона для карбокси-кінцевого гліцину-206 йде ДНК, що кодує амінокислотну послідовність МРРТРОНННННН (5ЕБО ІС МО: 7). Плазміду для бо транскрипції/трансляції іп мійго, реМАР-25Нізб, згодом отримували шляхом субклонування фрагмента ЕсокКіІ-За!! рвВМм10 у відповідно розщеплену плазміду роР7З (Рготеда, Мапппеїт,
Німеччина).
Для отримання білка і очищення 5МАР-25 штам БЕ.соїї МІ5рКЕР4 (Оіадеп, Ніїдеп,
Німеччина) трансфікували плазмідою рВМ1О0 по тому ж самому протоколу, який детально описаний для протеази І -ланцюга ВоМТ/А в Прикладі 1.
Радіоактивно мічений ЗМАР-25 отримували шляхом транскрипції/трансляції іп міо з використанням раеМмАР-25НІ56, системи лізату ретикулоцитів ТМТ, пов'язаної з 5Рб6 (Рготеда) і
ІЗ55І метіоніну (370 кБк/мкл, 237 ТБк/ммоль; Нагітапп Апаїуїс, Брауншвейг, Німеччина) згідно з інструкцією виробника.
Аналіз розщеплення П5МАР25 проводили так само, як описано для П5МАР-23 в Прикладі 2.
Отримані дані показані на Фіг. 1.
Приклад 4 - Отримання доменів І Нм, що містять модифікований легкий ланцюг А (ВоМТ/А
І С) даного винаходу
У цьому прикладі описується конструювання транслокаційних доменів Нм, що містять модифікований легкий ланцюг А (ВоМТ/А ГГ С), що виявляє активність розщеплення П5МАР2З відповідно до даного винаходу. Такі домени Нм можна використати для створення сімейств засобів доставки Т5І, додаючи відповідні націлюючі фрагменти.
У короткому викладі, для кожного мутанта ВоМТ/А С даного винаходу спочатку конструювали клонуючі вектори шляхом хімічного синтезу ДНК (СепеАгії, ТпегторРі5Ппег), яка кодує вказаний мутант ВоМТ/А ІС і яка оптимізована для експресії в БЕ.соїї, цю ДНК субклонували у вектор рСеКа4 (Іпмігодеп). Паралельно клонуючий вектор для домену Нм ВоМТ/А конструювали аналогічно шляхом хімічного синтезу кодон-оптимізованої ДНК, що кодує домен
НмА (що відповідає амінокислотним залишкам 449-872 5ЕО ІЮО МО: 8, реєстраційний номер в базі даних ОпіргоїкВ А5НІ29), і субклонували в стандартний вектор, такий як вектор рСК4 (Іпмігодеп). Клонуючий вектор для лінкер Нм також конструювали шляхом хімічного синтезу кодон-оптимізованої ДНК, що кодує вказаний лінкер, і субклонували в стандартний вектор, такий як вектор рСКа4 (Іпмігодеп). Зокрема, лінкер Нм МАСИТ5КТК5І ОКОаИМУМКАЇ МОГ. (ЗЕО 10
МО: 9), придатний для серотипу ВоМТт/ (це міждоменна поліпептидна ділянка, яка існує між цистеїнами дисульфідного містка між І С і доменом Нм ВоМТ/А) використали для конструювання
Зо лінкерного вектора І Нм. Також можуть бути створені альтернативні лінкерні конструкції І Нм: насправді, як добре відомо фахівцеві в даній галузі техніки, для отримання сайту розщеплення конкретної протеази, можна або використати нативну сприйнятливість до протеолізу протеазою
ГузС, або вставити сайт активації ентерокінази (наприклад, ООЮОК, 5ЕО ІЮО МО: 10) в петлю активації для отримання послідовності, такої як МОСИІТЗКтК5рОООкКМКкКАЇМСО (ЕС ІЮ МО: 11), або в цю петлю активації може бути вставлений сайт протеази для будь-якої іншої протеази, добре відомої в даній галузі техніки, такої як Ргебсібзвіоп, фактор Ха, тромбін, протеаза ТЕМ тощо.
Потім домени І Нм збирали шляхом клонування в модифікований експресійний вектор рЕТ (Момадеп) за 2 основні етапи. ДНК, що кодує кожну з модифікованих С ВоМТ/А даного винаходу, вбудовували перед ДНК, що кодує лінкер І Нм, причому вказаний лінкер знаходився далі перед ДНК, що кодує домен Нм/А.
Приклад 5 - Отримання засобів доставки Т5І, що зв'язуються з ненейронною клітиною відповідно до даного винаходу
У цьому прикладі описується конструювання засобів доставки Т5І шляхом додавання придаттного націлюючого фрагмента (в цьому випадку, людського НКР) до кожного С- кінцевого кінця доменів І Нм, що містять модифікований легкий ланцюг А даного винаходу, як описано вище в Прикладі 2. Для цього між напрямною групою і доменом ІН» вводили гнучкий лінкер.
У короткому викладі, клонуючі вектори лінкер-ьс-зНКР конструювали шляхом хімічного синтезу кодон-оптимізованої ДНК, що кодує гнучкий лінкер, злитий в рамці з націльоючим фрагментом ПОНЕР, і субклонували у вектор рСКаА (Іпмігодеп).
Потім конструкції Т5І збирали шляхом клонування ДНК, що кодує лінкер-пОНЕР, в кожний з експресійних векторів рЕТ, що містять домени І Нм, описані в Прикладі 2, таким чином, щоб лінкер-АПОНЕР зливався в рамці з С-кінцевим кінцем кожного домену І Нм.
Для експресії білка кожного носія Т5І 100 мл модифікованого середовища Теїтіїс Вгоїйп (ТВ), що містить 0,2 95 глюкозаміну і 30 мкг/мл канаміцину, інкубували в колбі на 250 мл з однією бактеріальною колонією (Е.соїї ВІ 21 (ОЕЗ), трансфікованою Т5І. Кожну культуру вирощували при температурі 37 "С і 225 об./хв. протягом 16 годин з подальшим внесенням 10 мл нічної культури в 1 л модифікованого середовища ТВ, що містить 0,2 95 глюкозаміну і 30 мкг/мл бо канаміцину, в колбі об'ємом 2 л. Потім отриману культуру вирощували при температурі 37 "С до
Зо досягнення приблизного значення ОП 0,5 при довжині хвилі 600 нм, після чого температуру знижували до 16 "С. Через 1 годину кожну культуру індукували 1 мМ ІРТО і додатково вирощували при температурі 16 "С протягом ще 16 год. Бактерії збирали центрифугуванням і заморожували при температурі -20 "С протягом ночі).
Подальше очищення кожного експресованного Т5І проводили наступним чином.
Бактерії розморожували і осад клітин обробляли ультразвуком для лізису клітин. Після центрифугування супернатант завантажували в хелатну колонку з 0,1 М МізоОх, урівноважену 50
ММ НЕРЕЗ5, рН 7,2, 200 мМ Масі. Промивання колонки проводили буфером, що містить 40-100
ММ імідазолу (ступінчастий градієнт), для елюювання непов'язаного білка, і буфером, що містить 200 мМ імідазолу, для елюювання білка Т5І. Фракції, що містять бажаний білок (Т51І), потім піддавали діалізу проти буферу, що містить 50 мМ НЕРЕФ5, рН 7,2, 200 мМ Масі. Потім до 1 мг очищеного Т5І додавали протеазу (в цьому випадку Гузс) у відповідній кількості для його активації (тобто так, щоб Т5І утворював ди-ланцюг, здатний зв'язуватися з СНЕР, транслокувати легкий ланцюг в цитоплазму і каталітично розщеплювати ПЗМАР23). Потім отриману суміш додатково очищували, завантажуючи її в хелатну колонку з 0,1 М МізО4, урівноважену 50 мМ НЕРЕЗ, рн 7,2, 200 мМ Масі. Колонку спочатку промивали 50 мМ НЕРЕЗ5, рН 7,2, 200 мМ Масі, потім буфером, що містить 40-100 мМ імідазолу, для елюювання неспецифічно зв'язаного білка, і буфером, що містить 200 мМ імідазолу, для елюювання активованого Т5І. Фракції, що містять бажаний активований білок (Т5І), згодом піддавали діалізу проти буферу, що містить 50 мМ НЕРЕЗ, рН 7,2, 150 мМ Масі. Діалізований білок потім концентрували до приблизно 2 мг/мл, аліквотували і на останньому етапі заморожували при температурі -80 70.
Клаузула 1. Модифікована протеаза І-ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка розщеплює людський ЗМАР-23 (Н5МАР-23), що має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮ МО: 1), яка містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
РІ82/0178 НЗМАР-23;
Зо Б) де вказаний перший зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотними залишками Е148, 7307, АЗОВ і 312 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспарагіну і тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і/або і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з фенілаланіну, ізолейцину і лейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 1307 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1); і/або ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з проліну, аспарагіну, треоніну та ізолейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І - ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку АЗО8 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1); і/або їм. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з лізину, валіну, метіоніну і лейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У312 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1). 2. Модифікована протеаза І -ланцюга ВОоМТ/А за п. 1, що додатково містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого у другому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К186 ПЗМАР-23;
Б) де вказаний другий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 5143 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутаміну, глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5143 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1). 3. Модифікована протеаза І -ланцюга ВоМТ/А за п. 1 або п. 2, що додатково містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в третьому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
К1І85 п5МАР-23; бо Б) де вказаний третій зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотними залишками УЗ304 і 5305 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У304 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і/або і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5305 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1). 4. Модифікована протеаза І-ланцюга ВоМТ/А за будь-яким з попередніх пунктів, що додатково містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в четвертому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0189/0192 П5МАР-23;
БЮ) де вказаний четвертий зв'язувальний карман протеази І -ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 029 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІО МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 029 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1). 5. Модифікована протеаза І-ланцюга ВоМТ/А за будь-яким з попередніх пунктів, що додатково містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в п'ятому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
К206 п5МАР-23;
Б) де вказаний п'ятий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком У251, 1256, М258, І 367 і Е369 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І-ланцюга, яке відповідає
Зо амінокислотному залишку У251 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і/або і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату, аспартату, глютаміну, гліцину, аланіну і аргініну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку І 256 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і/або ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з серину, аланіну, проліну, лейцину і глутамату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази | - ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку М258 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1); і/або їм. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну і гліцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку І 367 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і/або м. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з гліцину, серину і лейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку ЕЗ369 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1). 6. Модифікована протеаза І-ланцюга ВоМТ/А за будь-яким з попередніх пунктів, що додатково містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в шостому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування І198 П5МАР-23;
Б) де вказаний шостий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком К166 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з валіну, фенілаланіну, лейцину і ізолейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І - ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку К166 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1). 7. Модифікована протеаза І-ланцюга ВоМТ/А за будь-яким з попередніх пунктів, що додатково містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в сьомому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0210 ПЗМАР-23; бо Б) де вказаний зв'язувальний сьомий карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 5254 І -ланцюга ВоОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5254 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1). 8. Модифікована протеаза І-ланцюга ВоМТ/А за будь-яким з попередніх пунктів, що додатково містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого у восьмому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0168 ПЗМАР-23;
Б) де вказаний восьмий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком КЗ340 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з гістидину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку КЗ340 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1). 9. Модифікована протеаза І-ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка розщеплює людський ЗМАР-23 (Н5МАР-23), що має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (5БЕО ІО МО: 1), яка містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в четвертому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0189/0192 П5МАР-23;
БЮ) де вказаний четвертий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 029 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІО МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 029 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1). 10. Модифікована протеаза І-ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка розщеплює людський 5МАР-23 (Н5МАР-23), що має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮО МО: 1), яка містить:
Зо а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в шостому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 1198 П5МАР-23;
Б) де вказаний шостий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком К166 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з валіну, фенілаланіну, лейцину і ізолейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази | - ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку К166 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1). 11. Модифікована протеаза І-ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка розщеплює людський ЗМАР-23 (Н5МАР-23), що має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮО МО: 1), яка містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в п'ятому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування
К206 п5МАР-23;
Б) де вказаний п'ятий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотними залишками У251, 1256, М258, І 367 і Е369 | -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО
ІО МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У251 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); і/або і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аспартату, глутаміну, гліцину, аланіну та аргініну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази
І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 1256 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО
ІО МО: 1); і/або ії. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з серину, аланіну, проліну, лейцину і глутамату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази | - ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку М258 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ
МО: 1); і/або бо їм. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну і гліцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку І 367 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); і/або м. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з гліцину, серину і лейцину, в положенні в амінокислотній послідовності модифікованої протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку ЕЗ369 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1). 12. Модифікована протеаза І-ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка розщеплює людський ЗМАР-23 (Н5МАР-23), що має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІЮО МО: 1), яка містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в сьомому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0210 ПЗМАР-23;
Б) де вказаний сьомий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 5254 І -ланцюга ВоМТт/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5254 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1). 13. Модифікована протеаза І-ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка розщеплює людський ЗМАР-23 (Н5МАР-23), що має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з Ї-ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (5БЕО ІО МО: 1), яка містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого у восьмому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0168 ПЗМАР-23;
Б) де вказаний восьмий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком КЗ340 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає: і. амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з гістидину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку КЗ340 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1). 14. Модифікована протеаза І -ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А) за будь-яким з пп. 9-13, що додатково містить щонайменше одну заміну амінокислотного залишку,
Зо розташованого в іншому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, де вказана заміна амінокислотного залишку і вказаний інший зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначаються технічними ознаками, переліченими в будь-якому з пп. 1-13. 15. Конструкція нуклеїнової кислоти, що включає або що складається з послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує модифіковану протеазу І-ланцюга ВоМТ/А, за будь-яким з попередніх пунктів. 16. Засіб доставки, що містить: а) модифіковану протеазу І-ланцюга ВоМТ/А, за будь-яким з пп. 1-14, або конструкцію нуклеїнової кислоти за п. 15; і р) засіб для доставки вказаної модифікованої протеази І-ланцюга ВоМТ/А або вказаної конструкції нуклеїнової кислоти в клітину-«мішень, переважно в клітину-мішень, що не є нейроном. 17. Засіб доставки за п. 16, де засіб б) для доставки вказаної модифікованої протеази І - ланцюга ВоМТ/А в клітину-мішень містить: ї) націлюючий фрагмент, який зв'язує засіб доставки з клітиною-мішенню; і ї) транслокаційний пептид, який транслокує модифіковану протеазу І -ланцюга ВОМТ/А або конструкцію нуклеїнової кислоти в клітину-мішень, переважно в клітину-мішень, що не є нейроном. 18. Спосіб розщеплення ПОМАР-23, що включає приведення ПОМАР-23 в контакт з протеазою І -ланцюга (ВоМТ/А) за будь-яким з пп. 1-14, або з конструкцією нуклеїнової кислоти
БО за п. 15. або зі засобом доставки за п. 16 або п.17. 19. Протеаза І-ланцюга (ВоМТ/А) за будь-яким з пп. 1-14, або конструкція нуклеїнової кислоти за п. 15, або засіб доставки за п. 16 або п.17, для застосування в способі за п. 18.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» ІРБЕМ ВІОРНАВМ ГІМІТЕО «1205» БОТУЛІНІЧНІ НЕЙРОТОКСИНИ, ЯКІ РОЗЩЕПЛЮЮТЬ НЕНЕЙРОННИЙ 5МАВЕ -130» РАВЗ82МО «1605 11 «170» Патентна версія 3.5 «-2105 1 «2115 438 «212» Білок «213» Сіовайт роїшіпит «4005 1
Меї Рго РнНе Маї Авп Гуз СІп Ре Авп Туг Гуз Авр Рго Маї Авп Спу 1 5 10 15 маї Азр Іе Аа Туг Пе Гуз Пе Рго Авп Аа Сіу Сіп Меї ап Рго 20 25 Зо маї Гуз Аа РНе Гуз Пе Нів Авп Гуз Іе Тр Ма! Пе Рго См Агд
Зо
Азр Тпиг Рпе Тнг Авп Рго Спи Спи Спіу Авр Гей Авп Рго Рго Рго Си 60
З5
Ага Гуз Сп Маї Рго Маї Зег Туг Туг Азр Зег Тниг Туг І єи Зег ТНг 65 70 75 80 40 Ар Азп Си І уз Авр Авп Туг І еи ув Спу Маї ТНг Гуз Гей Рне Спи 85 90 95
Ага Пе Туг 5ег Тиг Авр І єи Стпу Ага Меї І єи Геи ТНг Зег Пе Маї 45 100 105 110
Аго Саму Пе Рго Рпе Ттр Сіу Спу Зег ТНг Пе Азр Тниг Сім Гей Гуз 115 120 125 50 ма! Ме Авр Тиг Азп Суз Пе Авп Маї Пе Сип Рго Авр Спу 5ег Туг 130 135 140 55
Ага бег Спи Си І еи Авп І єи Ма! Пе Пе Спіу Рго 5ег Аа А5вр Пе 145 150 155 160 60 Пе Сп Рне Сіи Суз І уз бег РНеє Су Ніз Спи Ма! Гей Авп І єи ТНг
165 170 175
Аг Авзп сапу Туг Спу Зег ТНг Сп Туг Пе Аго Ре 5ег Рго Азр Ре 180 185 190
Тиг Ре ау Рпе Сім Спи Бе" ГГ еи Сі Маї Авр Тнг Авп Рго Г еи І єи 195 200 205
Сіу Аїа Сту Гуз Ре Аа Тиг Ар Рго Аїа Маї Тнг Г еи Айа Ні Спи 210 215 220
Ї еи Пе Ні Аа Сту Ні Ага ГІ еи Туг Спу Пе Аа Пе Авп Рго Авп 225 230 235 240
Агу Маї Рне Гуз Маї Азп Тнг Авп Аа Туг Туг Сіи Меї Зег Спу Гей 245 250 255
Спм Маї Зег Рнє Сім Спи І еи Ага ТАг Рне Сіу Су Ніз Авр Аїпа ГГ уз 260 265 270
РНе Пе Ар 5ег І еи Сип Сім Авп См РНе Ага І єи Туг Туг Туг Авп 275 280 285
Зо
Гуз РНе Гуз Азр Іе Аа 5ег ТНг І ей Авп І уз Аа І уз 5ег Пе Маї 290 295 з00
З5
Спу ТАг Тнг Аа 5ег І еи Сп Ту Меї Гуз Азп Маї Рне Гуз Си І ув 305 310 315 з20
Туп ее єи Зег Сі Авр ТНг бЗег Спу Гуз РНе 5ег Маї Азвр Гуз І еи 325 330 335
Гуз Рпе Авр Гуз Геи Туг Гуз Меї І еи Тнг Сім Пе Туг Тиг Сім Авр 340 345 350
Авп Ре Маї Гуз Рпе Рне Гуз Ма! І еи Авп Ага Гуз Тпг Туг І ей Авп 355 36о 365
Рпе Азр Гуз Аа Маї РНе Гуз Пе Авп Пе Маї Рго Гуз Маї Ап Туг 370 375 380
Ти Пе Туг Авр Сіу Ре Авп Гей Агу Авп ТНг Авп Гей Айа Аа Авп 385 390 395 400 60 Рпе Авп ау Сип Авп ТАг Спи Пе Авзп Азп Меї Авп Рне Тнг Гуз І єи
Зб
405 до 415
Гуз Азп Ре Тнпг Су І єи Рпе Сім РНе Туг Гуз Геи ГГ еи Суз Маї Ага 420 425 430
Су Пе Пе Тнг 5ег ГГ ув 435 -2105 2 «2115 211 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «-4005 2
Меї Азвр Авп Геи Зег 5ег Си Спи Пе Сп Сп Ага Аа Ні Сп Пе 201 5 10 15
Тиг Авр Спи Зег І еи Сім Зег ТАг Аг Ага Пе І єи Спу Гей Аа Пе
Зо 25 сій Зег Сп Авр Аїа Сту Пе Гуз ТНиг Пе Тиг Меї Геи Авр Спи Сп
Зо
Гуз Сім Сп Гей Авп Агу Пе Спи Сім Спу І еи Авр Сп Пе Авп Гуз 60 35 Авр Меї Аг Сіи ТАг Спи Гуз ТНг І еи Тиг Си Гей Авп Гу Сув Суб 65 70 75 80
СПУ Ї єи Суз Ма! Суз Рго Суз Азп Агу ТНг Гуз Авп Рне Сіи бег Спу 40 85 90 95
Гуз АІа Туг Гуз Тит Тиг Ттр Сіу Авр Сіу Спу Спи Авп 5ег Рго Сувз 100 105 110 45
Азп Маї Маї Зег Гуз СіІп Рго Сіу Рго Маї Тниг Авп Сіу Спіп Г еи Сп 115 120 125 50
Сіп Рго ТАг ТНг Стпу Аа Аа бег Сіу Спу Туг Пе Гуз Аго Пе ТНг 130 135 140 55 Авп Азр Аа Агу Сім Авр Спи Меї Спи Спіш Авп Гей ТАг Сп Ма! Спу 145 150 155 160 зег Пе Г еи Спу Авп І єи Гуз Авр Меї Аа Геи Авп Пе Спу Авп Спи бо 165 170 175
Пе Ар Аїа Сп Авп Рго Сіп Пе Гуз Аго Пе Тнг Авр Гуз Аа Авр 180 185 190
ТАг Авп Агу Азр Ага Іе Азр Іе Аа Авп Аїа Аг Аа І уз Гуз І еи 195 200 205
Пе Азр 5ег 210 -2105» З «2115» 206 «212» Білок «213» Ното зарієп5 «400» З
Меї Аїа Спи Азвр Аїа Азр Меї Ага Азп Си І и Сіи СТИ Меї Сип Агу 1 5 10 15
Аг Аа Ар Сп ГІ еи Аа Ар Си 5ег Ї еи Спи Бег ТАг Агу Агу Меї 20 25 Зо
Ге Сп Ї еи Ма! Спи СПи Бег Гуз Авр Аїа Сіу Пе Аго Тнг І єи Маї
Меї І еи Ар Сім Стіп СПу Спи сп Гей Спи Аг Пе Спи сти спу Меї 35 50 55 60
Азр Сп Пе Авп Гуз Авр Меї Гуз Спи Аа Спи Гув Авп І ви Тиг Ав5р 65 70 75 80 40
Ї еи Сіу Гуз Рнеє Суз Су І єи Суз Маї Суз Рго Суз Авп І уз І еи І уз 85 90 95 45 зЗег Зег Авр Аа Туг Гуз Гуз Аа Ттр Сіу Авп Авп Сп Авр Су Маї 100 105 110
Маї Аа 5ег СіІп Рго Аа Аг Маї Маї Азр Спи Агу Спи Сіп Меї Аа 115 120 125
Пе Бег Спу Спу Ре Іе Аго Ага Маї Тниг Авп Азр Аїа Агу Си Авп 130 135 140
Сім Меї Азр Сім Авп ГГ еи Си Сп Маї бег Спу Пе Пе Спу Авп І єи 145 150 155 160 60
Зв
Ага Нів Меї Аїа І єи Азр Меї Сіу Авп Си Пе Авр Тнг Сп Авп Ага 165 170 175
Сіп Пе Азр Ага ЇІе Меї Сім Гуз Аа Авр 5ег Авп Гуз Тнг Ага ІПе 180 185 190
Авр Сім Ада Авп ап Аго Аа ТАг Гуз Меї І еи Спу Зег Спу 195 200 205 «-210» 4 «2115 11 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Сайт ІдА-протеази Нізб мітка «400» 4
Рго Рго Тнг Рго Су Нів Нів Ні Ні Нів Нів 1 5 10 «2105» 5 «-2115 35
Зо «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» мітка Гміп 5 гер Тад «4005» 5
Меї Аїа 5ег Тгр 5ег Ні Рго СіІп РНе Си Гуз Спіу Спу Сіу бег Спу 1 5 10 15
Спіу Спу Зег Сіу Спу Спу Зег Тр Зег Ні Рго Сіп РНе Си І ув Спу 20 25 Зо
Аа Стпу 5ег 35 «2105 6 «2115 7 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Нівб мітка «-4005» 6 60 ау Ні Нів Ні Нів Нів Ніб
1 5 -2105 7 «-2115 12 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «г2З» Сайт М-ІДА-протеази Нівб мітка «4005 7
Маї Рго Рго Тнг Рго Су Нів Нів Нів Нів Ні Нів 15. 1 5 10 «210» 8 «2115 1296 «212» Білок «2135» Сіовігідіит роїшіїпит «-4005» 8
Меї Рго РнНе Маї Авп Гуз СІп Ре Авп Туг Гуз Авр Рго Маї Авп Спу 1 5 10 15 маї Азр Іе Аа Туг Пе Гуз Пе Рго Авп Аа Спу Сіп Меї Сп Рго 20 25 Зо маї Гуз Аа РНе Гуз Пе Нів Авп Гуз Іе Тр Ма! Пе Рго См Агд
З5
Азр Тпиг Рпе Тнг Авп Рго Спи Спи Спіу Авр І еи Авп Рго Рго Рго Сі бо 40
Ага Гуз Сп Маї Рго Маї Зег Туг Туг Азр Зег Тниг Туг І єи Зег ТНг 65 70 75 80 45 Ар Азп Си І уз Авр Авп Туг І єи І уз Спіу Ма! ТНг Гуз Гей Рне Си 85 90 95
Ага Пе Туг 5ег Тиг Авр І єи Стпу Ага Меї І єи Геи ТНг Зег Пе Маї 50 100 105 110
Аго Саму Пе Рго РНе Тгтр Спу Спіу бег ТНг Пе Азр Тиг Спи Гей Гуз 115 120 125 55 ма! Ме Авр Тиг Азп Суз Пе Авп Маї Пе Сип Рго Авр Спу 5ег Туг 130 135 140 60
Ага бег Спи Си І еи Авп І єи Маї Пе Пе Спіу Рго 5ег Аа Авр Іе 145 150 155 160
Пе Сп Рне Сіи Суз І уз бег РНеє Су Ніз Спи Ма! Гей Авп І єи ТНг 165 170 175
Аг Авзп сапу Туг Спу Зег ТНг Сп Туг Пе Аго Ре 5ег Рго Азр Ре 180 185 190
Тиг Ре ау Рпе Сім Спи Бе" ГГ еи Сі Маї Авр Тнг Авп Рго Г еи І єи 195 200 205
Сіу Аїа Сту Гуз Ре Аа Тиг Ар Рго Аїа Маї Тнг Г еи Айа Ні Спи 210 215 220
Ї еи Пе Ні Аа Сту Ні Ага ГІ еи Туг Спу Пе Аа Пе Авп Рго Авп 225 230 235 240
Агу Маї РНе Гуз Маї Азп Тнг Авп Аа Туг Туг Сіи Меї Зег Спу Гей 245 250 255
Спм Маї Зег Рнє Сім Спи І еи Ага ТАг Рне Сіу Су Ніз Авр Аїпа ГГ уз 260 265 270
РНе Пе Ар 5ег І еи Сип Сім Авп См РНе Ага І єи Туг Туг Туг Авп 275 280 285
Гуз РНне Гуз Азвр Іе Аа 5ег ТНг І ей Авп І уз Аа І уз 5ег Пе Маї 290 295 00
Спу ТАг Тнг Аа 5ег І еи Сп Ту Меї Гуз Азп Маї Рне Гуз Си І ув 305 310 315 з20
Тупец єи Зег Сі Авр ТНг бЗег Спу Гуз РнНе 5ег Маї Авр І уз І еи 325 330 335
Гуз Рпе Авр Гуз Геи Туг Гуз Меї І еи Тнг Сім Пе Туг Тиг Сім Авр 340 345 350
Авп Ре Маї Гуз Рпе Рне Гуз Ма! І еи Авп Ага Гуз Тк Туг Гей Авп 355 360 365
Рпе Азр Гуз Аа Маї РНе Гуз Пе Авп Пе Маї Рго Гуз Маї Ап Туг 370 375 380 бо
Ти Пе Туг Авр Сіу Ре Авп Гей Агу Авп Тниг Авп ГГ еи Айа Аа Авп 385 390 395 400
Рпе Авп ау Сип Авп ТАг Спи Пе Авзп Азп Меї Авп Рне Тнг Гуз І єи 405 до 415
Гуз Азп РНе Тнг Су І єи РНе Спи РнНе Туг Гуз І єи І єи Суз Маї Ага 420 425 430
СПУ Пе Пе Тиг бег Гуз ТНг Гуз Зег І ви Авр І уз СПу Туг Авп ГГ ув 435 440 445
Аа Гей Азп Авр Геи Суз Іе Гуз Маї Авп Авп Тр Авр Геи Рпе Рпе 450 455 460 зЗег Рго 5ег СІи Авр Авп Рпе ТНг Азп Авр Геи Авп І уз Спу Спи Спи 465 470 475 480
Пе Тиг Зег А5р ТНг Авп Іе Спи Аїа Аа Спи Спи Авп Пе зе" І еи 485 490 495
Азр Геи Пе Сп Сп Туг Туг Геи ТНг Рпе Авп Рне Авр Авп Си Рго 500 505 510
Сім Авп Пе 5ег Пе Спи Авп І єи бег 5ег Авр Пе Пе Спіу Стій Ї єи 515 520 525
З5
СіІШ Ї еи Меї Рго Авп Іе Сім Агу РНе Рго Авп ау Гуз Гув Туг Спи 530 535 540
Ї еи Авр Гуз Туг ТНиг Меї Рне Ніз Туг І єи Агу Аа Сіп Спи Ре Спи 545 550 555 560
Ніз Спу Гуз Зег Агу Пе Ага І еи Тиг Азп Зег Маї Авп Спи Аа І еи 565 570 575
Ї еи Авп Рго 5ег Ага Маї Туг ТНиг Рне РнНе 5ег 5ег Авр Туг Маї Гуз 580 585 590
Гуз Маї Авп Гуз Аа Тнг Сім Аа Аа Меї Рне Геи Сту Тр Ма! Сі 595 600 605
Сіп Г еи Маї Туг Азр Ріє Тнг Авр Сім Тнг бег СП Маї Зег ТАг ТНг 610 615 620 60
Азр Гуз Пе Аа Азр Пе Тнг Пе Пе Пе Рго Туг Пе Спу Рго Аа 625 630 635 640
Гей Авп Пе Стпу Азп Меї І єм Туг Гуз Азр Авр Ре Маї су Аа І єи 645 650 655
Пе Ре Зег Сіу Аа Маї Іе Геи І ви СП Ре Пе Рго Сім Пе Аа 660 665 670
Пе Ро Маї І єи Спу Тнг Рнеє Аа І єи Маї Зег Туг Пе Аа Авп І уз 675 680 685 ма! І еи Тнг Маї Сп Тнг Пе Авр Авп Аа І єи 5ег І ув Агу Азп Сім 690 695 700
Гуз Ттр Авр Си Маї Туг Гуз Туг Пе Маї Тниг Авп Ттр ГІ єи Аа Гуз 705 710 715 720
Маї Авп Тпг Сп Пе Авр Геи ІІе Ага Гуз Гуз Меї Гуз Спи Ага І еи 725 730 735
Сім Авп Сп Айа Сім Аа ТНг Гуз Аїйа Пе Пе Авп Туг Сп Туг Авп 740 745 750
Сіп Тук Тк Спи Спи Спи Гув Авп Авп Пе Авп Ре Авп Пе Авр Ар 755 760 765
З5
Ї еи Зег Зег Гуз І єи Азп Сім 5ег Пе Авп Гуз Аа Меї Пе Авп Пе 770 775 780
Авп Гуз РНе І еи Авп Сп Сув Зег Маї Зег Туг І еи Меї Авп 5ег Меї 785 790 795 800
Пе Рго Туг Спу Маї Гуз Агу І єи СПм Ар РНе Ар Аа 5ег І єи Гуз 805 810 815
Азр Аа І єи І єи Гуз Тут Пе Туг А5р Авп Аго Сіу ТНг Гей Пе Спу 820 825 830
Сіп Маї Авр Ага Г єи Гуз Азвр Гуз Маї Азп Авп ТНг І єи 5ег Тиг Авр 835 840 845
Пе Рго Ріє Сп І єи Зег Гуз Туг Ма! Азр Авп ап Аг І єи І єи Зег 850 855 860 60
Тиг Рпе Тнг Сім Туг Пе Гуз Авп Пе Пе Авп Тнг 5ег Пе Геи Авп 865 870 875 880
Гей Агу Туг Си Бег Авп Ніз І єи Пе Авр ГІ еи 5ег Аго Туг Аа 5ег 885 890 895
Гуз Пе Авп Пе Спіу Зег Гуз Маї А5п Рне Ар Рго Іе Авр Гуз Авп 900 905 910
Сіп Пе Сп Гей Рне Авп І єи Сім 5ег 5ег І уз Пе Сіш Ма! Пе І еи 915 920 925
Гуз Авп Аїа Пе Маї Туг Авп Зег Меї Туг Сім Авп Рне 5ег ТАг Зег 930 935 940
Ре Ттр Іе Ага Іе Рго Гуз Туг Рне Авп Зег Пе Зег І ви Авп Авп 945 950 955 960
Си Туг Тиг Пе Пе Азп Сувз Меї Сім Авп Авп 5ег Спу Тгр Гуз Маї 965 970 975 зегІ ви Авп Туг Сіу Спи Пе Пе Тгтр ТНг Гей Сіп Авр Тиг Сп Спи 980 985 990
Пе Гуз Сіп Агоу Маї Ма! Рипе Гуз Туг Зег Сіп Меї Пе Авп Пе Зег 995 1000 1005
З5
Ар Туг Пе Авп Аго9 Тр Пе РнНе Маї Тк Пе ТНг Авп Авп Ага 1010 1015 1020
Їеи Авп Авп 5ег І уз Пе Туг Пе Авп Сіпу Аго Гей Пе Авр Сіп 1025 1030 1035
Гуз Рго Пе бег Азп Гей Спіу Авп Пе Нів Аіа бег Авп Авп ЇІе 1040 1045 1050
Меї Рне Гуз І еи Авр Спу Суз Ага Ар ТНг Ніз Аг9 Тут Пе Тр 1055 1060 1065
Пе Гуз Туг Рне Авп І еи Рпє Авр уз Сіи ей Азп. Спи Гуз Спи 1070 1075 1080
Пе Гу5 Авр І єи Туг Азр Ап ап Зег Авп Бег Сіу Пе Геи Гув 1085 1090 1095 60
Азр Рпе Ттр ау Ар ТугіІ єи ап Туг Авр Гуз Рго Туг Туг Меї 1100 1105 1110
Ї еи Азп І єи Туг Азр Рго Авп Гуз Туг Ма! Азр Ма! Азп Авп Маї 1115 1120 1125
Спіу Пе Аго Сіпу Туг Меї Туг Геи Гуз Спу Рго Ага аСіу бег Ма! 1130 1135 1140
Меї Тиг Тнг Авп Пе Тугі єи Авп Зег Зегі єи Туг Ага СпіуУ ТНг 1145 1150 1155
Гуз Рне Пе Пе Гуз Гуз Туг Аа Зег Сіу Азп Гуз Авр Авзп Пе 1160 1165 1170 ма! Ага Авп Авп Азр Аг Ма! Туг Пе Азп Маї Ма! Маї Гуз Ав5п 1175 1180 1185
Гуз Сім Туг Ага І єи Аа Тиг Авп Аа 5ег Сп Аа Сіу Ма! Спи 1190 1195 1200
Гуз Пе Геи 5ег Аа І єи Спи Пе Рго Авр Ма! Спу Авп Геи Бег 1205 1210 1215
Сіп Ма! Маї Ма! Меї Гуз Зег Гуз Авп Авр Сп Сіу Пе Тиг Авп 1220 1225 1230
З5
Гуз Сувз Гуз Меї Авп І ви Сіп Авр Авп Авп ау Азп Авр Іе Спу 1235 1240 1245
РПпе Пе Су Ріє Нів Сіп Рпе Авп Азп ЇІе Аа Гуз І єи Маї Аа 1250 1255 1260 зе Авп Тгр Туг Азп Агу Сіп Пе Спи Агд бег Зег Агу ТНг І еи 1265 1270 1275
Сіу Суз Зег Ттр Си РНе Пе Рго Маї Азр Азр Сіу Ттр Сіу Сі 1280 1285 1290
Ага Ріо І еи 1295 «210» 9 «2115 23 «212» Білок 60 213» Штучна послідовність
«223» лінкер ГНМ «4005» 9 маї Ага Спу Пе Пе ТАг Зег Гуз ТНг Гуз Зег І ви Авр Гуз Стпу Туг 1 5 10 15
Авп І уз Аа І еи Авп Авр І єи 20 -2105 10 «2115 5 «212» Білок «213» Ното зарієп5 -4005 10
Ар Ар Ар Азр І уз 1 5 «2105 11 «2115» 23 «212» Білок 213» Штучна послідовність «220» «223» Модифікована петля активації ВОМТ/А1 «4005 11 маї Азр Сту Пе Пе ТНиг Зег Гуз ТНг Гуз Зег Авр Авр Авр Авр І ув 1 5 10 15
Авп І уз Ада І еи Авп І єи Сп
Claims (10)
1. Модифікована протеаза І -ланцюга ботулінічного нейротоксину А (ВоМТ/А), яка демонструє збільшене розщеплення людського ЗМАР-23 (Н5МАР-23) порівняно з Ї -ланцюгом ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 1) ї має модифіковану амінокислотну послідовність порівняно з І-ланцюгом ВоОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1), яка містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в першому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування РІ82/0178 НЗМАР-23; Б) де вказаний перший зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком Е148 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає амінокислотний залишок тирозину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку Е148 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1).
2. Модифікована протеаза І -ланцюга ВОоМТ/А за п. 1, що додатково містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого у другому зв'язувальному кармані протеази 60 І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0189/0192 НЗМАР-23;
Б) де вказаний другий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 029 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (5ЕО ІО МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає () амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 029 І -ланцюга ВоМТ А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1).
3. Модифікована протеаза І -ланцюга ВоМТ/А за п. 1 або 2, що додатково містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в третьому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 1198 ПЗМАР-23; Б) де вказаний третій зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком К166 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає () амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з валіну, лейцину та ізолейцину, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку К166 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
4. Модифікована протеаза І -ланцюга ВоМТ/А за будь-яким з пп. 1-3, що додатково містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в четвертому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К1І85 п5МАР-23; Б) де вказаний четвертий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 305 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає () амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5305 І -ланцюга ВОМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1).
5. Модифікована протеаза І -ланцюга ВОоМТ/А за будь-яким з пп. 1-4, що додатково містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в п'ятому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К186 ПЗМАР-23; Б) де вказаний п'ятий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається Зо амінокислотним залишком 5143 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає () амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутаміну, глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І -ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5143 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
6. Модифікована протеаза І -ланцюга ВоМТ/А за будь-яким з пп. 1-5, що додатково містить: а) щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, розташованого в шостому зв'язувальному кармані протеази І-ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування К206 п5МАР-23; Б) де вказаний шостий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком У251 І -ланцюга ВОоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана щонайменше одна заміна амінокислотного залишку включає () амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з глутамату і аспартату, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку У251 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
7. Модифікована протеаза І -ланцюга ВОоМТ/А за будь-яким з пп. 1-6, що додатково містить: а) заміну амінокислотного залишку, розташованого в сьомому зв'язувальному кармані протеази І -ланцюга ВоМТ/А, для зв'язування із сайтом зв'язування 0210 ПЗМАР-23; Б) де вказаний сьомий зв'язувальний карман протеази І-ланцюга ВоМТ/А визначається амінокислотним залишком 5254 | -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 1); с) і де вказана заміна амінокислотного залишку включає () амінокислотний залишок, вибраний з групи, яка складається з аланіну, в положенні в модифікованій амінокислотній послідовності протеази І/-ланцюга, яке відповідає амінокислотному залишку 5254 І -ланцюга ВоМТ/А дикого типу (ЗЕО ІО МО: 1).
8. Конструкція нуклеїнової кислоти, що включає або складається з послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує модифіковану протеазу І -ланцюга ВОоМТ/А за будь-яким з пп. 1-7.
9. Спосіб /л уко розщеплення П5МАР-23, що включає приведення ПЗМАР-23 в контакт з протеазою І -ланцюга (ВОоМТ/А) за будь-яким з пп. 1-7.
10. Протеаза І -ланцюга (ВоМТ/А) за будь-яким з пп. 1-7 для застосування як лікарського засобу.
башт Кратнютьо зе | | Ву Н си» СКЗ 3, ї ян Твен : ї Т жтивуж ; : ! ї ЗОН. | розщепленні ! ї рознтя. : їв па ант кгултеат у -й ле і вх ях плют : іш дек х зв'язува- Точкові мутації ебектннн. я ОМАР К сь ББ5МАВО. : ї Як тех сх я ЗО ЕЕВЕ. бере св Ба Її КЕ. ЇЇ вин ВК оо ння 0 жіЄСуА днкого Бсвра в ЯбпронімкМм о Лео Бе (приб 5 ' | я ен тА ОО КМ Пі МІСТА Н ї 7 а Стук і б роли і ни ад МАР ТВНу) ММ | зо мюМ. ТТБ жа І АЖ ЯК росу су ! пост я ту
! . дяка 00 Пе АРІЯЬ і Верх : ІНН Я Ї : '
ї о. тод я І я їз З века Її шко ї жах жу ї - Бідсутні й СА дих типую! МІЮ 0 ОБ ЗВ Ви 0яНш : Кт ї Е кокер ї ОРІОН Е АЗОВ і і св В: ї М се Кук : хукай. іч і Її ж же ії ще Т жд І ОРІВЯНКУК 0 ЕВ ОК ЩЕ Вже 0 БО їж : ПОВІЯ МІВ 0 век Я 18 ! ї і : : Косюоюююююююю фо ооо ооо ою ОРІ СЕЗ | і їБ : : : : енжжттт тут юр Дт Ек данні.
: ї. 1 рев : ї ї 1 т ї ОВІВОЯМ а тА | а | | : : ові жк і ше : : І яв Я : : ди 5 В в 1 же я су ! Коасж 1 Ї Ії І ПОВІЯ Урок КОХ і Ще : : ї : Ех КЕ КІТ ї ОЗ й Я Лк з Б і - г ! ї : І ї РІВНЯ З БА, АЗК, СУХУ Б і ; : З : : су бу Топдо ев ж райо що Її я у і ї І ї І ПОРІВНУ СТАР, АСОМ ЗЕ НЕ | ; : ї Ї ОБІВІИЛМВ БаВМ, ТК АЗОщК, М в і ! : : : І ож, є Ж хода ЕК Ей пд ок ії ка ї 1 І Ії ї ГРЕЖАИОМТЯ ЕЛЯБУ, ГДК, АХОБ, ВІ ОН ! ! ї : ї ОБІНаЙЯТЯВ ОО БРЯАБТ, ГО АЗОВ, УІЯМ 045 | : : : : ПОРІЗІВ ЕМЕХ, Та, яЗОН КОМ Уа і : : : : Цуаннт ух нюдеуухМУХХХКНММУУААЖ МАКУХА МКК МУМНМ МУХИ ХМЖ ММК ММК ММК ММК МХЖНМ МКМ МНН і З тодож пря опргюке р меру 14 ! ї : т І ОВЕН ОО ЕЛеВУ, ТО АБО ВОМ В | ! ї : ї ПО КЕяе ма ! ! ОБ ОЛЯ: : ПБЕйх ОНА і Е СБК ООН: : Ки зо5о | же 0 53. Дуууччччумчу уч уч уч уч уч у уч уч уч уч уч у У у у у у у у У У У У У У ф УУ У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У У УМ ку у у У У У У У У У УМ ДУ у у ух у у у у учня ї ск е ї о - ! : їж. 1 2 я т ї КВ ЗБЕ і ! ОБ бла : КУТ у УТ КО Коток фу фу о ут лет "ВІВ ее і Е ОБЖ ОК с: БІіЖ З Ї КИ ДУ У У У БО ДО тт фут о форт тт т і ВІде БІ ! | БТ бля я и : Ук че ! ї ї ох - І С т ї ОВІВЄ ЕТ | | ж НА. ї Її ; | ее ї ії ! т т сія КНУ і і і я ї : ше Кв сі ' | : Ви : Н 5 Її аж І а: ! 3 : ї соя ї С цеВ І КМ ЩО | : ї : БК 1 : Для ноти тт т тя т т тт т т тт т т тт т т т тт т тт Кт т т тя тт нт тт т тт т т тт т т тя тт тт тт тт тт т тт т ятки ттятянтт ЇХ ризкуи ї оф М Н ке ї І Ії уж ті ї ЕН ЕН е Е ГО : : І ЖЖ : ПК СаБЕО і ож і : я : СЕ же ! ії ай х : її : нн и и
: 2. Ї си ек | Н ЇХ жсула ж ї коре т ї КВ БВ Е, УещВР | | ОІВ. ї
Фіг. 1А
ДТ МУКУ КУ У у : і її Мети а ОІВ, І І Іа ожив тетвт о:
ооо. Кратнють Серозшепло | оЗерозшщепя. : пайнно Гачков: о льш. БММАРО х ні | о БУМАРОІВ о. ооомутації 0 о совюлли. 1 0 00 Кк. 0 Ко. МЕН О НМ ЗВ'яЯЗЖВАННЯ ух о ВВЕ ее БАС : ті СбА ликото ЯМА мем ОІВКМІ пові. а ОМАР у о йюрвно ОБМАРО ОО СН : ЗБ ок, ! тку РОМ. с жде ню Кт І : вежах : тнх) ОС ЦОША- гезодрній. | ОВБМАРІОМ о БМЯУ) яМІСА| | : в - х ЕТ МА М АКА ДА А РІВНІВ о КІЯВуУ зе С? Бак 06 Ве ОВЕН 000 ЕШЕКаме 005 066 овіжноїтя наяв о БаяяУ, а 00000 ОВІЖУОБ, КІВ ЕМЕЖОНеО 0262540 се ОРІВРАОКУВ,МЯВ 0 БІЯНХ, КНР ; ОВ ! | зво : ОЕІВЕК 0 БЕКОНА ОВіІББОЮТВ КІОв БІЗВУ, та53В ЩЕ мае ї ВМ КВ тн І РІЯОІ7В, О ЕаБУ, Оа5А 513 9.55 8 с щмка 177 дві : Іа Здмяз, Я | | : : Ви тт фен ннитттнттнетенннннннннннннннннннннннннннннтфенннннннннннннннфнтенннненнннннннннннннннннт ВІВ УН НОВ, ЕХ, КЛБОЕ, : іде | | «Во а : ків "єзо8о ! | : ОВІБОУВІТВ ВУХ, ОВМЕЖ ЯББУ,. 00000000 ЯЯ 000000 с кідв еко | : | . кишниш нини ЕТ ОКО ВІМОМоХ жає : : : | . : ок : : | | . : ВІВ, ОББЯВХ поОА КІВОК, ся 1 34 яви ! Вівеймяг, аа 0 3050 ! : : | . : Гео рання пп пп пп попку п око пкт п пкт поп тпопннн пп пп пк тпоппкпоп пкт оп попоппкпопопн поп топоп нку нпоп пн тпоппнтопопннтотн ПРІЖОИЗаТВ КОЮ 0 вав, З з5БЮ : ще: ! | | : ВІВ ИВ, КВ 1 ЕЗаВХ, ТЗБ3Е | З : | 135 : МДФ тека чування дя МЕ тенти ТД УК ТИ ОРІДОУВІТВ, ІНВ, БІДЯУ, ЗІЗ КІБАК сіре : | нкі ОРІШОЯОТІВ, МОЮ, | БТАНЖ КЕОБК, ЗЕД із Зак Я. ро ! : : : | | : ВІЗИТІВ КІВ ЕЗЯВХ, КНР, | (вад бю Оля : іще, БАЗО о 5г54А, НІВ : : ! ! | : ВІДАВ ВЯЯК | ЕЗа8ХУ, ЗО : За : | Мі ПРІЯВ ОІВ. ЮА 1 ЕН, КН | яв ' | . :
Фіг. 1
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18153941 | 2018-01-29 | ||
| PCT/EP2019/052146 WO2019145577A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-01-29 | Non-neuronal snare-cleaving botulinum neurotoxins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA128185C2 true UA128185C2 (uk) | 2024-05-01 |
Family
ID=61231041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA202003732A UA128185C2 (uk) | 2018-01-29 | 2019-01-29 | Ботулінічний нейротоксин, який розщеплює ненейронний snare |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11634460B2 (uk) |
| EP (1) | EP3746463A1 (uk) |
| JP (2) | JP7229247B2 (uk) |
| KR (1) | KR20200115479A (uk) |
| CN (1) | CN111406066B (uk) |
| AU (2) | AU2019211190B2 (uk) |
| BR (1) | BR112020006827A2 (uk) |
| CA (2) | CA3083083A1 (uk) |
| EA (1) | EA202091296A1 (uk) |
| MX (1) | MX2020007596A (uk) |
| SA (1) | SA520411802B1 (uk) |
| SG (1) | SG11202003671VA (uk) |
| TW (2) | TWI822723B (uk) |
| UA (1) | UA128185C2 (uk) |
| WO (1) | WO2019145577A1 (uk) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201900621D0 (en) | 2019-01-16 | 2019-03-06 | Ipsen Biopharm Ltd | Labelled polypeptides |
| GB201914034D0 (en) | 2019-09-30 | 2019-11-13 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of neurological disorders |
| KR102520625B1 (ko) | 2019-10-18 | 2023-04-12 | 펜랜드 파운데이션 | 치료에 사용하기 위한 보톨리늄 독소 |
| US10960061B1 (en) | 2019-10-18 | 2021-03-30 | Penland Foundation | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using botulinum toxin |
| US10967052B1 (en) | 2019-10-18 | 2021-04-06 | Penland Foundation | Treatment of dyslexia using botulinum toxin |
| US11241479B2 (en) | 2019-10-18 | 2022-02-08 | Penland Foundation | Treatment methods using botulinum toxins |
| WO2022046768A1 (en) * | 2020-08-26 | 2022-03-03 | The Regents Of The University Of California | Botulinum neurotoxin proteins and methods to engineer and generate same |
| GB202100566D0 (en) | 2021-01-15 | 2021-03-03 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of brain damage |
| JP2024513191A (ja) | 2021-03-30 | 2024-03-22 | イプセン バイオファーム リミテッド | 疼痛及び炎症性障害の処置 |
| KR20230155007A (ko) | 2021-03-30 | 2023-11-09 | 입센 바이오팜 리미티드 | 통증 ＆ 염증성 장애의 치료를 위한 촉매 불활성 클로스트리디움 신경독소 |
| WO2023287728A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-19 | Penland Foundation | Treatment of diabetes and chronic pancreatitis using botulinum toxin |
| WO2023287729A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-19 | Penland Foundation | Treatment of acute and chronic kidney disease |
| GB202116795D0 (en) | 2021-11-22 | 2022-01-05 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of visceral pain |
| WO2023089343A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Ipsen Biopharm Limited | Treatment of pain |
| GB202214232D0 (en) | 2022-09-28 | 2022-11-09 | Ispen Biopharm Ltd | Clostridial neurotoxins comprising an activating exogenous protease cleavage site |
| GB202214229D0 (en) | 2022-09-28 | 2022-11-09 | Ipsen Biopharm Ltd | Clostridial neurotoxins comprising an activating endosomal protease cleavage site |
| WO2024069191A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Ipsen Biopharm Limited | Clostridial neurotoxin for use in a treatment of bladder pain syndrome |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9508204D0 (en) | 1995-04-21 | 1995-06-07 | Speywood Lab Ltd | A novel agent able to modify peripheral afferent function |
| GB9617671D0 (en) | 1996-08-23 | 1996-10-02 | Microbiological Res Authority | Recombinant toxin fragments |
| GB9922554D0 (en) | 1999-09-23 | 1999-11-24 | Microbiological Res Authority | Inhibition of secretion from non-neuronal cells |
| US7491799B2 (en) | 2000-07-21 | 2009-02-17 | Allergan, Inc. | Modified botulinum neurotoxins |
| US20020127247A1 (en) | 2000-11-17 | 2002-09-12 | Allergen Sales, Inc. | Modified clostridial neurotoxins with altered biological persistence |
| US7223577B2 (en) | 2000-11-17 | 2007-05-29 | Allergan, Inc. | Post-translational modifications and Clostridial neurotoxins |
| GB0426397D0 (en) | 2004-12-01 | 2005-01-05 | Health Prot Agency | Fusion proteins |
| EP1834962A1 (de) | 2006-03-15 | 2007-09-19 | Biotecon Therapeutics GmbH | PEGyliertes mutiertes Clostridium botulinum Toxin |
| EP2038298A2 (en) | 2006-07-11 | 2009-03-25 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for clostridial toxin target cells |
| EP2038299A2 (en) | 2006-07-11 | 2009-03-25 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for non-clostridial toxin target cells |
| US20110171191A1 (en) | 2008-06-12 | 2011-07-14 | Syntaxin Limited | Suppression of neuroendocrine diseases |
| US10240138B2 (en) | 2008-06-12 | 2019-03-26 | Ipsen Bioinnovation Limited | Polypeptides that bind to and inhibit secretion from growth hormone secreting cells |
| GB0815264D0 (en) | 2008-08-21 | 2008-09-24 | Syntaxin Ltd | Non-cytotoxic proteins |
| US8492109B2 (en) * | 2009-01-20 | 2013-07-23 | Trustees Of Tufts College | Methods for the delivery of toxins or enzymatically active portions thereof |
| GB0903006D0 (en) | 2009-02-23 | 2009-04-08 | Syntaxin Ltd | Modified non-cytotoxic proteases |
| EP2419128B1 (en) | 2009-04-14 | 2018-06-06 | Medical College of Wisconsin, Inc. | Engineered botulinum neurotoxin |
| US8853360B2 (en) * | 2010-06-23 | 2014-10-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Engineered botulinum neurotoxin C1 with selective substrate specificity |
| GB201108108D0 (en) | 2011-05-16 | 2011-06-29 | Syntaxin Ltd | Therapeutic fusion proteins |
| GB201219602D0 (en) * | 2012-10-31 | 2012-12-12 | Syntaxin Ltd | Recombinant clostridium botulinum neurotoxins |
| CN114875014A (zh) * | 2014-08-12 | 2022-08-09 | 拜奥麦迪逊公司 | 具有修饰的轻链特异性的肉毒杆菌神经毒素及其生产方法 |
| JP2018525021A (ja) | 2015-08-27 | 2018-09-06 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | 疼痛の治療を目的とする組成物及び方法 |
-
2019
- 2019-01-29 MX MX2020007596A patent/MX2020007596A/es unknown
- 2019-01-29 CA CA3083083A patent/CA3083083A1/en active Pending
- 2019-01-29 US US16/754,844 patent/US11634460B2/en active Active
- 2019-01-29 KR KR1020207018521A patent/KR20200115479A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-01-29 WO PCT/EP2019/052146 patent/WO2019145577A1/en active Application Filing
- 2019-01-29 CA CA3220194A patent/CA3220194A1/en active Pending
- 2019-01-29 CN CN201980006010.7A patent/CN111406066B/zh active Active
- 2019-01-29 TW TW108102571A patent/TWI822723B/zh active
- 2019-01-29 UA UAA202003732A patent/UA128185C2/uk unknown
- 2019-01-29 EP EP19701378.2A patent/EP3746463A1/en active Pending
- 2019-01-29 BR BR112020006827-6A patent/BR112020006827A2/pt unknown
- 2019-01-29 AU AU2019211190A patent/AU2019211190B2/en active Active
- 2019-01-29 EA EA202091296A patent/EA202091296A1/ru unknown
- 2019-01-29 JP JP2020530630A patent/JP7229247B2/ja active Active
- 2019-01-29 TW TW112146037A patent/TW202413639A/zh unknown
- 2019-01-29 SG SG11202003671VA patent/SG11202003671VA/en unknown
-
2020
- 2020-04-20 SA SA520411802A patent/SA520411802B1/ar unknown
-
2021
- 2021-10-08 AU AU2021245226A patent/AU2021245226B2/en active Active
-
2023
- 2023-02-14 JP JP2023020549A patent/JP7549687B2/ja active Active
- 2023-03-15 US US18/184,627 patent/US20230312661A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023058652A (ja) | 2023-04-25 |
| WO2019145577A1 (en) | 2019-08-01 |
| MX2020007596A (es) | 2020-09-03 |
| TW202413639A (zh) | 2024-04-01 |
| US20200239528A1 (en) | 2020-07-30 |
| AU2019211190A1 (en) | 2020-04-23 |
| JP2021514176A (ja) | 2021-06-10 |
| AU2021245226A1 (en) | 2021-11-04 |
| SG11202003671VA (en) | 2020-08-28 |
| TWI822723B (zh) | 2023-11-21 |
| CA3083083A1 (en) | 2019-08-01 |
| US20230312661A1 (en) | 2023-10-05 |
| TW201940698A (zh) | 2019-10-16 |
| AU2019211190B2 (en) | 2021-07-08 |
| BR112020006827A2 (pt) | 2020-10-06 |
| CN111406066A (zh) | 2020-07-10 |
| JP7229247B2 (ja) | 2023-02-27 |
| KR20200115479A (ko) | 2020-10-07 |
| EA202091296A1 (ru) | 2020-10-23 |
| EP3746463A1 (en) | 2020-12-09 |
| JP7549687B2 (ja) | 2024-09-11 |
| US11634460B2 (en) | 2023-04-25 |
| SA520411802B1 (ar) | 2023-11-19 |
| AU2021245226B2 (en) | 2024-02-29 |
| CA3220194A1 (en) | 2019-08-01 |
| CN111406066B (zh) | 2024-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA128185C2 (uk) | Ботулінічний нейротоксин, який розщеплює ненейронний snare | |
| US12037369B2 (en) | Cationic neurotoxins | |
| AU2019348732B2 (en) | Clostridial neurotoxins comprising an exogenous activation loop | |
| US10648045B2 (en) | Chimeric polypeptides | |
| US20240327472A1 (en) | Modified clostridial neurotoxins | |
| US20240175001A1 (en) | Clostridial Neurotoxins Comprising an Exogenous Activation Loop | |
| EA045463B1 (ru) | Расщепляющие ненейронный snare ботулинические нейротоксины | |
| WO2024069176A1 (en) | Clostridial neurotoxins comprising an activating exogenous protease cleavage site | |
| WO2024069175A1 (en) | Clostridial neurotoxins comprising an activating endosomal protease cleavage site | |
| EA047022B1 (ru) | Клостридиальные нейротоксины, содержащие экзогенную петлю активации |