EA045463B1

EA045463B1 - Расщепляющие ненейронный snare ботулинические нейротоксины

Info

Publication number: EA045463B1
Application number: EA202091296
Authority: EA
Inventors: Томас Бинц; Стефан Сикорра
Original assignee: Ипсен Биофарм Лимитед
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2023-11-28

Description

Введение

Настоящее изобретение относится к модифицированной протеазе ботулинического нейротоксина, обладающей способностью расщеплять ненейронный белок SNARE, и к ее применению для подавления нежелательной секреции из клетки млекопитающего путем расщепления указанного ненейронного белка SNARE в указанной клетке млекопитающего.

Токсины обычно подразделяются на один из двух классов, а именно цитотоксические токсины (например, растительный токсин, такой как рицин), которые убивают их естественные клетки-мишени, и нецитотоксические токсины (например, ботулинические нейротоксины), которые не убивают их естественные клетки-мишени. Нецитотоксические токсины оказывают свое воздействие на клетку-мишень, ингибируя клеточный процесс, отличный от синтеза белка.

Протеазы ботулинического нейротоксина действуют путем протеолитического расщепления внутриклеточных транспортных белков, известных как белки SNARE (например, SNAP-25, VAMP или синтаксин). Сокращение SNARE происходит от термина растворимый рецептор белка присоединения NSF, где NSF означает чувствительный к N-этилмалеимиду фактор. Белки SNARE - это большое супер семейство белков. Важной функцией белков SNARE является опосредование экзоцитоза молекул нейромедиаторов к постсинаптическому соединению. Поэтому белки SNARE являются неотъемлемой частью секреции молекул посредством везикулярного транспорта из клетки.

Clostridium botulinum продуцирует семь (от A до G) различных нейротоксинов (BoNT), которые дифференцированы серологически по отсутствию антисывороточной перекрестной нейтрализации серотипа. BoNT вызывают нейрон-специфичный атонический паралич путем воздействия на нейроны и расщепления нейрон-специфичных белков SNARE.

BoNT имеют полипептидную цепь 150 кДа, содержащую тяжелую цепь 100 кДа и легкую цепь 50 кДа, связанные дисульфидной связью. BoNT организованы в три функциональных домена: N-концевая протеолитическая легкая цепь (L-цепь); и C-концевая тяжелая цепь (H-цепь), последняя состоит из транслокационного домена (H_N) и C-концевого нейрон-связывающего домена (H_C). Токсический эффект BoNT (нервная интоксикация) осуществляется по трехэтапному механизму действия. Сначала, часть H_Cсвязывается с холинергической нервной клеткой и интернализируется путем опосредованного рецептором эндоцитоза. Затем, часть H_N транслоцирует L-цепь через эндосомальную мембрану в цитозоль нервной клетки. И наконец, L-цепь связывается и расщепляет нейронный белок SNARE в цитозоле, тем самым подавляя высвобождение нейромедиатора из нервной клетки и приводя к интоксикации нервной клетки.

Семь серотипов BoNT расщепляют специфичные остатки в одном из трех белков SNARE:

серотипы B, D, F и G расщепляют VAMP-2;

серотипы A и E расщепляют SNAP-25; и серотип C расщепляет SNAP-25 и синтаксин Ia.

В то время как нативные BoNT способны нацеливаться и расщеплять нейронные изоформы SNARE, такие как VAMP-2, SNAP-25 и синтаксин-1a, указанные протеазы оказывают незначительное или вовсе не оказывают расщепляющего действия на большинство ненейронных белков SNARE. Эта субстратная специфичность в отношении нейронных SNARE согласуется и понимается как отражение природной специфичности связывания нервных клеток, демонстрируемой BoNT. Например, BoNT/A расщепляет человеческий SNAP-25, но не его человеческие ненейронные изоформы.

Еще в 1989 году Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA США) одобрило BoNT/A для лечения косоглазия, блефароспазма и гемифациального спазма, а затем для лечения шейной дистонии, косметического применения, для устранения глабеллярных морщин лица и подмышечного гипергидроза. Эффективность BoNT/A при дистонии и других расстройствах, связанных с непроизвольной активностью скелетных мышц, в сочетании с удовлетворительным профилем безопасности, подтолкнула медиков к его эмпирическому/не по назначению применению при разнообразных выделениях, а также при болях и косметических расстройствах.

Клиническое применение BoNT сфокусировано на расстройствах, связанных с нервно-мышечной активностью. Совсем недавно пионерное исследование, проведенное компанией Syntaxin Ltd, позволило разработать перенаправленные BoNT, которые связываются с уникальной группой нейронов (например, ноцицептивными афферентами - см. Международную патентную заявку WO 96/33273, содержание которой полностью включено в настоящее изобретение) и/или с клетками, которые не являются нейронами, (например, клетками эпителия дыхательных путей - см. Международную патентную заявку WO 00/10598, содержание которой полностью включено в настоящее изобретение). Эта технология, известная как технология направленного ингибирования секреции (TSI), включает в себя замену нативного связывающего домена BoNT другим нацеливающим фрагментом (например, фактором роста или другой сигнальной молекулой), и она открыла двери для новых основанных на использовании BoNT методов лечения и видов терапии.

Однако избирательное расщепление нейрон-специфичных белков SNARE с помощью BoNT ограничило разработку новых методов лечения в этих ненейронных системах. Считается, что нейронные и ненейронные белки SNARE одинаково важны для процесса слияния внутриклеточных везикул и, следо- 1 045463 вательно, для секреции молекул посредством транспорта везикул из клетки. Соответственно, применение традиционных терапевтических средств на основе BoNT для инактивации секреции, управляемой нейронным белком SNARE, не будет направлено на какую-либо соответствующую клеточную секрецию, управляемую ненейронными SNARE.

Соответственно, существует потребность в сконструированной протеазе L-цепи BoNT, которая эффективно расщепляет ненейронный белок SNARE.

Настоящее изобретение решает одну или более из вышеуказанных проблем путем создания сконструированной протеазы L-цепи BoNT/A, которая расщепляет изоформу белка SNARE, которая в основном экспрессируется в клетках, не являющихся нейронами, а именно в SNAP-23 человека (hSNAP-23). Настоящее изобретение, таким образом, относится к новому классу нецитотоксичного терапевтического агента.

Подробное описание изобретения

Если здесь не указано иное, то научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, которые обычно понимают специалисты в данной области техники. Кроме того, если из контекста не следует иное то, используемые здесь номенклатуры и методики культивирования клеток и тканей являются хорошо известными и широко используемыми в данной области техники.

Тем не менее, что касается использования различных терминов в настоящем описании, то более конкретно применимы следующие определения.

Термины, употребленные в единственном числе, включают в себя значение множественного числа, такое как один или более или по меньшей мере, один, если контекст не требует иного.

Используемый здесь термин протеаза означает фермент, который способен гидролитически расщеплять белки и/или пептиды. В контексте настоящего изобретения указанная протеаза, в частности, представляет собой протеазу легкой цепи (L-цепь) ботулинического нейротоксина (BoNT), то есть протеазу (также называемую протеолитическим доменом), полученную из ботулинического нейротоксина, в частности из ботулинического нейротоксина A (BoNT/A). Как хорошо известно специалисту в данной области техники, легкая цепь ботулинического нейротоксина обладает функцией протеазы (также известной как нецитотоксическая функция протеазы) и обычно имеет молекулярную массу примерно 50 кДа. Такие нецитотоксические протеазы обычно действуют путем протеолитического расщепления внутриклеточных транспортных белков, известных как белки SNARE (например, SNAP-25, VAMP или синтаксин) - см. Gerald K (2002) Cell and Molecular Biology (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. Встречающаяся в природе (т.е. дикого типа) L-цепь BoNT/A в частности способна эффективно расщеплять SNAP-25, но только в незначительной степени способна расщеплять hSNAP-23, как дополнительно объяснено ниже. В противоположность этому, протеаза L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, как более подробно описано ниже, отличается от встречающейся в природе L-цепи BoNT/A тем, что она обладает улучшенной способностью расщеплять hSNAP-23 и упоминается здесь как модифицированная L-цепь BoNT/A, которая расщепляет hSNAP-23.

Способность расщеплять hSNAP23 может быть подтверждена с помощью обычного анализа, такого как анализ, описанный в примере 2 ниже. Используемый здесь термин расщепление hSNAP-23 более конкретно означает, что модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения демонстрирует улучшенное расщепление hSNAP-23 по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1). Для этой цели может быть использован любой простой сравнительный анализ, такой как анализ hSNAP-23, описанный в примере 2. L-цепь BoNT/A дикого типа способна только в незначительной степени (т.е. на уровне фона) расщеплять hSNAP-23.

Таким образом, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения обладает одним или более (предпочтительно двумя) из следующих свойств:

a) более 0,2% (например, более 0,5%, предпочтительно, более 1%, более предпочтительно, более 5%) расщепления hSNAP-23 в бесклеточном анализе (1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубируют при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. пример 2, фиг. 1; и/или

b) Km менее чем 225 (например, менее чем 200, предпочтительно менее чем 150) мкмоль в бесклеточном анализе (1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубируют при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. пример 2, фиг. 1; и/или

c) Kcat (1/мин) менее 0,2 (например, менее 0,18, предпочтительно менее 0,1) в бесклеточном анализе (1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубируют при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. пример 2, фиг. 1.

Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A настоящего изобретения может необязательно расщеплять не только hSNAP-23, но также SNAP-25. Расщепление SNAP-25 может быть подтверждено с помощью обычного анализа, такого как анализ, описанный в примере 3 ниже. В соответствии с этим необязательным вариантом осуществления изобретения используемый здесь термин расщепление SNAP-25 означает, что модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения предпочтительно демонстрирует, по меньшей мере, 0,5%, по меньшей мере, 1%, по меньшей мере, 2%, предпочтительно, по меньшей

- 2 045463 мере, 3%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 10% расщепления SNAP-25 по сравнению с Lцепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1). Для этой цели может быть использован любой простой сравнительный анализ, такой как анализ SNAP-25, описанный в примере 3.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A настоящего изобретения расщепляет hSNAP-23, но не расщепляет SNAP-25, такой как hSNAP25.

Используемый здесь термин SNAP-23 (ассоциированный с синаптосомами белок 23) обозначает белок SNARE, который способен связываться с различными другими белками SNARE и с высокой аффинностью образовывать с этими белками комплекс в клетке, предпочтительно в нервной клетке, тем самым регулируя слияние внутриклеточной мембраны в указанной клетке. Термин hSNAP-23 более конкретно относится к человеческому SNAP-23 и предпочтительно к белку, имеющему последовательность SEQ ID NO: 2.

Используемый здесь термин SNAP-25 (ассоциированный с синаптосомами белок 25) обозначает белок SNARE, который способен связываться с различными другими белками SNARE и с высокой аффинностью образовывать с этими белками комплекс в клетке, предпочтительно в нервной клетке, тем самым регулируя слияние внутриклеточной мембраны в указанной клетке. Термин hSNAP-25 более конкретно относится к человеческому SNAP-25 и предпочтительно к белку, имеющему последовательность SEQ ID NO: 3.

Термины модификация, замена или мутация могут использоваться здесь взаимозаменяемо и относятся к изменению в аминокислотной последовательности по сравнению с последовательностью эталонного белка, то есть в настоящем изобретении по сравнению с последовательностью L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1). Аминокислотная последовательность, показанная здесь как SEQ ID NO: 1, имеет длину 438 аминокислотных остатков и заканчивается K438. Понятно, что K438 является первым аминокислотным остатком лизина в петле активации и наиболее вероятно представляет Cконцевой конец L-цепи после протеолитического расщепления петли активации. Таким образом, SEQ ID NO: 1 представляет собой (естественно) активированную форму L-цепи BoNT/A дикого типа. В связи с этим до протеолитической активации L-цепь BoNT/A дикого типа обычно имеет длину ~448 аминокислотных остатков, и включает в себя короткое C-концевое удлинение аминокислотных остатков петли активации.

Как дополнительно объясняется ниже, настоящее изобретение раскрывает идентификацию критических аминокислотных положений в L-цепи BoNT/A дикого типа, которые требуют рациональной замены другим аминокислотным остатком, чтобы сделать L-цепь BoNT/A способной к расщеплению hSNAP-23. В этой связи, введение аминокислотной замены (то есть мутации) может быть осуществлено посредством вставки, делеции или замены аминокислоты и предпочтительно путем замены аминокислоты. Способы, позволяющие вводить такую мутацию, известны специалисту в данной области техники. Например, возможно ввести мутацию путем случайного или направленного мутагенеза, с помощью ПЦР с использованием вырожденных праймеров, например, в нуклеотидной последовательности, кодирующей эталонный белок. Указанные методы, в частности, описаны в Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012, и обновления 2014), и в Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2012).

Аминокислотная замена происходит в одном или более связывающих карманах L-цепи относительно L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1). Используемый здесь термин связывающий карман означает область L-цепи BoNT/A, которая содержит одну или более аминокислот, которые являются точками контакта (например, через водородную связь, солевой мостик и/или гидрофобный контакт) для связывания с соответствующим сайтом связывания hSNAP-23, и/или которые обеспечивают пространство для размещения других аминокислотных остатков субстрата (например, путем модификации, такой как замещение), способных связывать hSNAP-23. Используемый здесь термин связывание с означает подходящий для связывания и составляет часть научного обоснования заявителя для настоящего изобретения - указанное обоснование не является существенным техническим признаком настоящего изобретения. Например, связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяемый аминокислотными остатками E148, T307, A308 и Y312 SEQ ID NO: 1, относится к области протеазы L-цепи BoNT/A, содержащей аминокислоты E148, T307, A308 и/или Y312, и/или их мутанты, как описано в настоящем изобретении, которые, как полагает заявитель, участвуют в связывании с предсказанным сайтом связывания на hSNAP-23 (например, с сайтом связывания P182/D178 hSNAP-23).

Используемый здесь термин сайт связывания относится к области hSNAP-23, которая содержит одну или более аминокислот, которые могут быть связаны соответствующим связывающим карманом Lцепи BoNT/A. Например, сайт связывания P182/D178 hSNAP-23 содержит аминокислоты P182 и/или D178 hSNAP-23. Используемый здесь термин сайт связывания просто означает гипотетический сайт связывания (как теоретически предсказано Заявителем) и является частью научного обоснования заявителя для настоящего изобретения - указанное обоснование не является существенным техническим признаком настоящего изобретения.

Идентичность по последовательности между аминокислотными или нуклеотидными последова- 3 045463 тельностями может быть определена путем сравнения положения в каждой из последовательностей, которые могут быть выровнены для целей сравнения. Когда положение в сравниваемых последовательностях занято одним и тем же нуклеотидом или аминокислотой, тогда последовательности в этом положении идентичны. Степень идентичности между аминокислотными последовательностями является функцией количества идентичных аминокислотных последовательностей, которые являются общими для этих последовательностей. Степень идентичности по последовательности между нуклеиновыми кислотами является функцией количества идентичных нуклеотидов в положениях, общих для этих последовательностей.

Чтобы определить процент идентичности по последовательности между двумя аминокислотными последовательностями или двумя последовательностями нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают для оптимального сравнения. Например, пробелы могут быть введены в последовательность первой аминокислотной последовательности или первой нуклеотидной последовательности для оптимального выравнивания со второй аминокислотной последовательностью или второй нуклеотидной последовательностью. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, молекулы в этой позиции считаются идентичными.

Процент (%) идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей. Следовательно, процент идентичности может быть рассчитан путем умножения количества идентичных положений на 100 и деления на длину выровненной области (перекрывающиеся положения), включая промежутки (только внутренние промежутки, а не промежутки на концах последовательности).

В этом сравнении последовательности могут быть одинаковой длины или могут иметь разную длину. Оценка идентичности учитывает только идеальные совпадения и не учитывает степень сходства аминокислот друг с другом.

В соответствии с настоящим изобретением оптимальное выравнивание последовательностей предпочтительно может проводиться с помощью алгоритма глобального выравнивания гомологии, если выравнивание выполняется с использованием последовательностей одинаковой или сходной длины, например, алгоритмом, описанным в Needleman and Wunsch (Journal of Molecular Biology; 1970, 48 (3): 44353), с помощью компьютерных реализаций этого алгоритма (например, с использованием программного обеспечения DNASTAR® Lasergene) или путем визуального осмотра. Альтернативно, если выравнивание выполняется с использованием последовательностей различной длины (например, аминокислотная последовательность легкой цепи настоящего изобретения сравнивается с полной аминокислотной последовательностью встречающегося в природе ботулинического нейротоксина), то в этом случае оптимальное выравнивание последовательностей может предпочтительно проводиться с помощью алгоритма локального выравнивания гомологии, такого как алгоритм, описанный в Smith and Waterson (Journal of Molecular Biology; 1981, 147: 195-197), с помощью компьютерных реализаций этого алгоритма (например, с использованием программного обеспечения DNASTAR® Lasergene) или путем визуального осмотра. Выбирается наилучшее выравнивание (т. е. приводящее к наибольшему проценту идентичности между сравниваемыми последовательностями), генерируемое различными методами. Примеры алгоритмов выравнивания на основе глобальной и локальной гомологии хорошо известны специалисту в данной области техники и включают в себя, без ограничения, ClustalV (глобальное выравнивание), ClustalW (локальное выравнивание) и BLAST (локальное выравнивание).

Специалист в данной области техники также легко поймет, что настоящее изобретение включает в себя модифицированные L-цепи BoNT/A, которые в значительной степени гомологичны и которые сохраняют способность расщеплять hSNAP-23, то есть функциональные варианты или гомологи. Эти функциональные варианты или гомологи могут быть охарактеризованы как имеющие одну или более аминокислотных мутаций (таких как делеция, добавление и/или замена аминокислот), отличных от раскрытых здесь в связи с расщеплением hSNAP-23, и которые незначительно влияют на укладку или протеазную активность, в частности расщепление hSNAP-23. Например, такие мутации включают в себя без ограничений консервативные замены, небольшие делеции (обычно от 1 до 30 аминокислот), небольшие амино- или карбокси-концевые удлинения (такие как амино-концевой остаток метионина), добавление небольшого линкерного пептида до примерно 20-25 остатков или аффинной метки.

Функциональные варианты или гомологи в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержат мутации минорной природы, такие как консервативные аминокислотные замены. Консервативные аминокислотные замены хорошо известны специалисту в данной области техники и включают в себя без ограничения:

Основные: аргинин, лизин, гистидин;

Кислотные: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота;

Полярные: глютамин, аспарагин;

Гидрофобные: лейцин, изолейцин, валин, метионин;

- 4 045463

Ароматические: фенилаланин, триптофан, тирозин;

Малые: глицин, аланин, серин, треонин.

В дополнение к 20 стандартным аминокислотам нестандартные аминокислоты (такие как 4гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и α-метилсерин) могут заменять аминокислотные остатки полипептидов настоящего изобретения. Ограниченное количество неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, и неприродных аминокислот могут быть заменены аминокислотными остатками клостридиального полипептида. Полипептиды настоящего изобретения также могут содержать неприродные аминокислотные остатки.

Не встречающиеся в природе аминокислоты включают в себя без ограничений транс-3метилпролин, 2,4-метанолполин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метил-треонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В данной области техники известно несколько способов включения не встречающихся в природе аминокислотных остатков в белки.

Замена аминокислоты может включать в себя замену аминокислоты, имеющей определенное физико-химическое свойство (например, гидрофобность), на аминокислоту, имеющую сходное или альтернативное свойство. Примеры таких замен приведены ниже:

Кислая аминокислота, замещенная нейтральной полярной аминокислотой;

Полярная аминокислота, замещенная неполярной аминокислотой;

Неполярная аминокислота, замещенная неполярной аминокислотой;

Неполярная аминокислота, замещенная полярной аминокислотой;

Полярная аминокислота, замещенная основной аминокислотой;

Неполярная аминокислота, замещенная кислой аминокислотой;

Неполярная аминокислота, замещенная полярной аминокислотой.

Соответственно, настоящее изобретение включает в себя L-цепь всех подтипов BoNT/A, такую как любая из L-цепей BoNT/A1-BoNT/A8, которая содержат одну или более мутаций, как описано здесь, для расщепления hSNAP-23. Указанная L-цепь BoNT/A может дополнительно содержать дополнительные мутации для создания ненативного сайта активации расщепления, такого как сайт расщепления энтерокиназы (SEQ ID NO: 10), протеазы PreScission, фактора Xa, тромбина, протеазы TEV и т.д.

Дополнительные определения приведены в описании.

Настоящее изобретение может быть описано следующим образом.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированной протеазе L-цепи ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеющей модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

a) по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка, расположенного в первом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания P182/D178 hSNAP-23;

b) где указанный первый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотными остатками E148, T307, A308 и Y312 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

c) и где указанная, по меньшей мере, одна замена аминокислотного остатка включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспарагина и тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из фенилаланина, изолейцина и лейцина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку T307 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из пролина, аспарагина, треонина и изолейцина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку A308 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iv) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из лизина, валина, метионина и лейцина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Y312 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Не ограничивая себя какой-либо теорией, заявитель полагает, что определенный выше связывающий карман L-цепи BoNT/A влияет на важную фермент-субстратную связь с последовательностью узнавания hSNAP-23.

Таким образом, настоящее изобретение основано на неожиданном открытии (например, неожиданном техническом эффекте), что целевые аминокислотные замены, как заявлено, позволяют получать Lцепь(и) BoNT/A с повышенной эффективностью расщепления hSNAP-23 (по сравнению с L-цепью BoNT дикого типа). Авторы настоящего изобретения не только успешно идентифицировали подходящие аминокислотные положения L-цепи BoNT/A, которые могут быть изменены (например, замещены) для увеличения эффективности расщепления hSNAP-23, но также идентифицировали точные аминокислотные

- 5 045463 замены, которые обеспечивают этот эффект.

a) по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка, расположенного в первом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания P182/D178 hSNAP-23;

b) где указанный первый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспарагина и тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к модифицированной протеазе L-цепи ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеющей модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа. (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из фенилаланина, изолейцина и лейцина в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку T307 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из пролина, аспарагина, треонина и изолейцина в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку A308 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из лизина, валина, метионина и лейцина в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Y312 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Модифицированная L-цепь BoNT/A может содержать одну аминокислотную замену (по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1 дикого типа). Модифицированная L-цепь BoNT/A может содержать две аминокислотные замены (по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1 дикого типа). Модифицированная L-цепь BoNT/A может содержать три аминокислотные замены (по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1 дикого типа). Модифицированная L-цепь BoNT/A может содержать четыре аминокислотные замены (по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1 дикого типа).

Модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, обычно демонстрируют, по меньшей мере, в 1,15 раза повышенную эффективность расщепление hSNAP-23 (по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа) - см. 1-й столбец данных на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y или E148N;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену T307I, A308P и Y312V;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену T307F, A308N и Y312L;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148N, T307I и A308P, Y312V;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, T307F, A308N и Y312L;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, T307I, A308P и Y312V;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, T307L, A308T и Y312M;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, T307L, A308I и Y312M.

В одном варианте осуществления модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, обычно демонстрируют, по меньшей мере, в 1,35 раза повышенную эффективность расщепление hSNAP-23 (по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа) - см. 1-й столбец данных на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148N, T307I, A308P и Y312V;

- 6 045463 модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, T307F, A308N и Y312L;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, T307I, A308P и Y312V; модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, T307L, A308T и Y312M; модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, T307L, A308I и Y312M.

В другом варианте осуществления модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, обычно демонстрируют, по меньшей мере, в 1,7 раза повышенную эффективность расщепление hSNAP-23 (по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа) - см. 1-й столбец данных на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену T307F;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену T307I;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену Y312K;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену Y312K, E148Y;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, T307L, A308T и Y312M.

В дополнительном варианте осуществления модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, могут демонстрировать, по меньшей мере, 2,0-кратное увеличение эффективности расщепления hSNAP-23 (по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа) - см. 1-й столбец данных на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

В дополнительном варианте осуществления модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, могут демонстрировать, по меньшей мере, 4,0-кратное увеличение эффективности расщепления hSNAP-23 (по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа) - см. 1-й столбец данных на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

В другом варианте осуществления модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, демонстрируют, по меньшей мере, 6,0, предпочтительно, по меньшей мере, 7,0, более предпочтительно, по меньшей мере, 8-кратное увеличение эффективности расщепления hSNAP-23 (по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа) - см. 1-й столбец данных на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y.

Модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, обычно демонстрируют более 1,5% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных на фиг. 1A. Для справки: L-цепь BoNT/A дикого типа (например, SEQ ID NO: 1) демонстрирует менее чем 0,5% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа). Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену Y312K и E148Y.

В одном варианте осуществления модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, со

- 7 045463 держащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, обычно демонстрируют более чем 2% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену Y312K.

В еще одном варианте осуществления модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, демонстрируют, по меньшей мере, повышенные 9% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной Lцепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных Lцепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y.

Дополнительные примеры модифицированных мутантов L-цепи BoNT/A, имеющих мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену A308L;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену A308V;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену A308I;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену A308P;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену A308N;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену A308T;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену Y312V;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену Y312M;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену Y312L.

Модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, может содержать одну или более замен аминокислотных остатков по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа, как определено здесь ранее. В качестве иллюстрации, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения может иметь одну мутацию аминокислотного остатка (в пределах связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP23, как определено выше), например, мутацию, соответствующую аминокислотному остатку E148 Lцепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1). Аналогично, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения может содержать более одной мутации аминокислотного остатка (в пределах связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, как определено выше), например мутации, соответствующие аминокислотным остаткам T307, A308 и Y312 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В предпочтительном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, имеющая одну или более мутаций связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, дополнительно содержит одну или более мутаций в одном или более различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A для hSNAP-23, как дополнительно описано ниже.

Указанные один или более различных связывающих кармана L-цепи BoNT/A для hSNAP-23 включают в себя второй связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания D189/D192 hSNAP-23; третий связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания I198 hSNAP-23; четвертый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания K185 hSNAP-23; пятый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания R186 hSNAP-23; шестой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания K206 hSNAP-23; седьмой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания D210 hSNAP-23; восьмой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания D168 hSNAP-23.

Альтернативно, согласно различным техническим признакам настоящего изобретения, модифицированная L-цепь BoNT/A может содержать одну или более мутаций внутри одного или более связывающих карманов L-цепи BoNT/A, отличных от связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP23, как определено выше.

Указанные связывающие карманы L-цепи BoNT/A для hSNAP-23 и соответствующие представляющие интерес мутации дополнительно описаны ниже.

Соответственно, в качестве дополнительного технического признака или в качестве альтернативного технического признака настоящее изобретение включает в себя мутанты L-цепи BoNT/A, содержащие одну или более мутаций в определенном здесь кармане L-цепи BoNT/A. В качестве примера, модифици- 8 045463 рованная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP23), имеет модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1) которая включает в себя:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в пятом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания R186 hSNAP-23;

b) где указанный пятый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

c) и где указанная замен аминокислотного остатка включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамина, глутамата и аспартата в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Не ограничивая себя какой-либо теорией, заявитель полагает, что определенный выше связывающий карман L-цепи BoNT/A обеспечивает стабилизирующий солевой мостик между остатками R186 на hSNAP-23 и S143 на BoNT/A.

Модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретению, содержащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания R186 hSNAP-23, как правило, имеют KM для hSNAP-23 менее чем 100 мкмоль, например, менее чем 95 мкмоль - 3-й столбец данных на фиг. 1A. Для справки: L-цепь BoNT/A дикого типа (например, SEQ ID NO: 1) имеет K_M для hSNAP-23 больше 150 мкмоль, например, больше 200 мкмоль. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену V304D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену V304E;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену G305D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену G305E;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену S143D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену S143E;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену S143Q;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену K166F.

В предпочтительном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания R186 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в пределах одного или более различных связывающих карманов L-цепи BoNT/A, как описано здесь (например, в связывающем кармане для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, как определено выше). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 0,5-кратное снижение эффективности расщепления hSNAP-23 (по сравнению с E148Yмодифицированной L-цепью BoNT/A) или, другими словами увеличенное, по меньшей мере, в 4,0 раза расщепление hSNAP-23 (по сравнению с L-цепью BoNT дикого типа) - см. 1-й столбец данных для многокарманных мутантов на фиг. 1B; или, по меньшей мере, 5% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y и S143E;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y и S143D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащая замену E148Y и S143Q.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модифицированной протеазе L-цепи BoNT/A, которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23) и имеет модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в первом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания P182/D178 hSNAP-23; где указанный первый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

b) замену аминокислотного остатка, расположенного в пятом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания R186 hSNAP-23; где указанный пятый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

c) и где указанная замена аминокислотного остатка включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата, в положении в моди-

- 9 045463 фицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к модифицированной протеазе L-цепи BoNT/A, которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23) и имеет модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в первом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания P182/D178 hSNAP-23; где указанный первый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

b) замену аминокислотного остатка, расположенного в пятом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания R186 hSNAP-23; где указанный пятый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания R186 hSNAP-23, дополнительно содержит одну или более мутаций в одном или более различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A, как описано здесь (например, в пределах связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, как определено выше). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 2,0-кратное увеличение эффекивности расщепления hSNAP-23 (по сравнению с модифицированной E148Y L-цепью BoNT/A) см. 1-й столбец данных для многокарманных мутантов на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей Lцепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, имеющую замену E148Y и S143E;

модифицированную L-цепь BoNT/A, имеющую замену E148Y и S143D.

В другом варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания R186 hSNAP-23, дополнительно содержит одну или более мутаций в одном или более различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A, как описано здесь (например, в пределах связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, как определено выше). Такие мутанты обычно демонстрируют как минимум 3,0-кратное увеличение эффективности расщепления hSNAP-23 (в процентах по сравнению с модифицированной E148Y L-цепью BoNT/A) - см. 1-й столбец данных для многокарманных мутантов на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, S143D.

В качестве дополнительного технического признака или альтернативного технического признака настоящее изобретение включает в себя мутанты L-цепи BoNT/A, содержащие одну или более мутаций в определенном здесь кармане L-цепи BoNT/A. Например, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеет модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), который содержит:

a) по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка, расположенного в четвертом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания K185 hSNAP-23;

b) где указанный четвертый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотными остатками V304 и G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку V304 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Не ограничивая себя какой-либо теорией, заявитель полагает, что определенный выше связывающий карман L-цепи BoNT/A обеспечивает стабилизирующий солевой мостик между остатком K185 на hSNAP-23 и BoNT/A.

- 10 045463

Модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего карманного для сайта связывания K185 hSNAP-23, обычно имеют KM для hSNAP-23 менее 100 мкмоль см. 3-й столбец данных на фиг. 1A. Для справки: L-цепь BoNT/A дикого типа (например, SEQ ID NO: 1) имеет KM для hSNAP-23 больше 150 мкмоль, например, больше 200 мкмоль. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену G305E.

Модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания K185 hSNAP-23, содержит одну или более замен аминокислотных остатков по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа, как определено здесь ранее. В качестве иллюстрации, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения может иметь одну мутацию аминокислотного остатка (в пределах связывающего кармана для сайта связывания K185 hSNAP-23, как определено выше), например, мутант, соответствующий аминокислотному остатку G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1). Аналогично, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения может содержать более одной мутации (в пределах связывающего кармана для сайта связывания K185 hSNAP-23, как определено выше), например, соответствующую аминокислотным остаткам V304 и G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В предпочтительном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания K185 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в пределах одного или более различных связывающих карманов L-цепи BoNT/A для hSNAP-23, как описано здесь (например, в пределах связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, как определено выше). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 2,0-кратное, предпочтительно, по меньшей мере, 2,5-кратное увеличение эффективности расщепления hSNAP-23 (по сравнению с E148Y-модифицированной L-цепью BoNT/A) - см. 1-й столбец данных для многокарманных мутантов на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных Lцепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, имеющую замену E148Y и G305D.

Таким образом, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к модифицированной протеазе L-цепи BoNT/A, которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23) и имеет модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая включает в себя:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в первом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания P182/D178 hSNAP-23; где указанный первый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

b) замену аминокислотного остатка, расположенного в четвертом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания K185 hSNAP-23; где указанный четвертый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Также, в качестве дополнительного технического признака или в качестве альтернативного технического признака настоящее изобретение включает в себя мутанты L-цепи BoNT/A, содержащие одну или более мутаций в определенном здесь кармане L-цепи BoNT/A. В качестве примера, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеет модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая включает в себя:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного во втором связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D189/D192 hSNAP-23;

b) где указанный второй связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток аланина в положении в модифицированной аминокислотной последова-

- 11 045463 тельности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Не ограничивая себя какой-либо теорией, заявитель полагает, что определенный выше связывающий карман L-цепи BoNT/A обеспечивает стабилизирующее взаимодействие между D189/D192 на hSNAP-23 и аминокислотой 29 BoNT/A или соседними аминокислотами.

Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, имеющую замену Q29A.

В предпочтительном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания D189/D192 hSNAP-23, дополнительно содержит одну или более мутаций в одном или более различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A как описано здесь (например, внутри связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, как определено выше). Такие мутанты обычно демонстрируют увеличение эффективности расщепления hSNAP-23, по меньшей мере, в 1,50 раза (по сравнению с E148Y-модифицированной Lцепью BoNT/A) - см. 1-й столбец данных, представленный для многокарманных мутантов на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, имеющую замену E148Y, Q29A.

Таким образом, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к модифицированной протеазе L-цепи BoNT/A, которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23) и имеет модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая включает в себя:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в первом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания P182/D178 hSNAP-23; где указанный первый связывающий карман протеазу L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

b) замену аминокислотного остатка, расположенного во втором связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D189/D192 hSNAP-23; где указанный второй связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания D189/D192 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в, по меньшей мере, двух разных связывающих карманах L-цепи BoNT/A, как описано здесь (например, внутри связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23 и внутри связывающего кармана для сайта связывания R186 hSNAP-23, как определено выше). Такие мутанты обычно демонстрируют как минимум 2,5-кратное увеличение эффективности расщепления hSNAP-23 (по сравнению с E148Y-модифицированной L-цепью BoNT/A - см. 1-й столбец данных, представленный на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, Q29A и S143D.

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в первом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания P182/D178 hSNAP-23; где указанный первый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

b) замену аминокислотного остатка, расположенного во втором связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D189/D192 hSNAP-23; где указанный второй связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

c) замену аминокислотного остатка, расположенного в пятом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания R186 hSNAP-23; где указанный пятый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком S143 L-цепи BoNT/A дикого

- 12 045463 типа (SEQ ID NO: 1);

d) и где указанная замена аминокислотного остатка включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания D189/D192 на hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в, по меньшей мере, двух разных связывающих карманах Lцепи BoNT/A (например, внутри связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23 и внутри связывающего кармана для сайта связывания K185 hSNAP-23, как определено выше). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 3,0-кратное, предпочтительно, по меньшей мере, 3,4кратное увеличение эффективности расщепления hSNAP-23 (по сравнению с E148Y-модифицированной L-цепью BoNT/A) - см. 1-й столбец данных, представленный для многокарманных мутантов на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замены E148Y, Q29A и G305D.

b) замену аминокислотного остатка, расположенного во втором связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D189/D192 hSNAP-23; где указанный второй связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

c) замену аминокислотного остатка, расположенного в четвертом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания K185 hSNAP-23; где указанный четвертый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В качестве дополнительного технического признака или альтернативного технического признака настоящее изобретение включает в себя мутанты L-цепи BoNT/A, содержащие одну или более мутаций в определенном здесь кармане L-цепи BoNT/A. В качестве примера, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеет модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая включает в себя:

a) по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка, расположенного в шестом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания K206 hSNAP-23;

b) где указанный шестой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотными остатками Y251, L256, V258, L367 и F369 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или

- 13 045463 ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата, аспартата, глутамина, глицина, аланина и аргинина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку L256 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из серина, аланина, пролина, лейцина и глутамата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы Lцепи, которое соответствует аминокислотному остатку V258 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iv) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина и глицина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку L367 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или

v) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, серина и лейцина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку F369 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В качестве дополнительного технического признака или альтернативного технического признака настоящее изобретение включает в себя мутанты L-цепи BoNT/A, содержащие одну или более мутаций в определенном здесь кармане L-цепи BoNT А. В качестве примера, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеет модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глютамина и аргинина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку L256 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1 ); и/или iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из серина, лейцина и глутамата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку V258 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iv) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина и глицина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку L367 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или

v) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, серина и лейцина в положении в аминокислотной последовательности модифицированной протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку F369 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Не ограничивая себя какой-либо теорией, заявитель полагает, что определенный выше связывающий карман L-цепи BoNT/A влияет на важную фермент-субстратную связь с положением (S3') последовательности узнавания hSNAP-23.

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глютамина и аргинина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку L256 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из серина, лейцина и глутамата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соот-

- 14 045463 ветствует аминокислотному остатку V258 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iv) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина и глицина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку L367 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или

Модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания K206 hSNAP-23, может содержать одну или более замен аминокислотных остатков по сравнению с L-цепями BoNT/A дикого типа, описанными здесь ранее. В качестве иллюстрации, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения может иметь одну мутацию аминокислотного остатка (в пределах связывающего кармана для сайта связывания K206 hSNAP-23), например, мутант, соответствующий аминокислотному остатку Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1). Аналогично, модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения может содержать более одной мутации (в пределах связывающего кармана для сайта связывания K206 hSNAP-23), например, мутанты, соответствующие аминокислотным остаткам Y251 и L256 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретению, содержащая мутацию связывающего карманного для сайта связывания K206 hSNAP-23, обычно демонстрирует более 1,5% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных на фиг. 1A. Для справки: L-цепь BoNT/A дикого типа (например, SEQ ID NO: 1) демонстрирует менее чем 0,5% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных, представленный на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену Y251D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену Y251E;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену L256D.

В одном варианте осуществления модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения демонстрируют по меньшей мере 3% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных, представленный на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену Y251E.

Дополнительные примеры модифицированных мутантов L-цепи BoNT/A, имеющих мутацию связывающего кармана для K206 hSNAP-23 (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену V245D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену L256E;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену L256G;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену L256Q;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену L256A;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену V258A;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену V258P;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену V258L;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену L256E и V258P;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену L256Q и V258P;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену L256A и V258L;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену L256G и V258L.

В предпочтительном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания K206 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в одном или более различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A, как описано здесь (например, внутри связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, как определено выше). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 0,5-кратное снижение эффективности расщепления hSNAP-23 (по сравнению с E148Y-модифицированной L-цепью BoNT/A) или, другими словами, по меньшей мере, в 4,0-кратное увеличение эффективности расщепления hSNAP23 (по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа) - см. 1-й столбец данных, представленный для многокарманных мутантов на фиг. 1B, или, по меньшей мере, 5% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных на фиг. 1B. Пред- 15 045463 почтительные примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замены E148Y и Y251D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замены E148Y и L256D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замены E148Y и Y251E.

Таким образом, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к модифицированной протеаза L-цепи BoNT/A, которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23) и имеет модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая включает в себя:

b) замену аминокислотного остатка, расположенного в пятом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания K206 hSNAP-23; где указанный пятый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретению, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания K206 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в, по меньшей мере, трех различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A, как описано здесь (например, в связывающем кармане для сайта связывания P182/D178 hSNAP23, в связывающем кармане для сайта связывания R186 hSNAP-23 и в связывающем кармане для сайта связывания D189/D192, как определено выше). Такие мутанты, как правило, демонстрируют как минимум 1,3-кратное увеличение эффективности расщепления hSNAP-23 (по сравнению с E148Yмодифицированной L-цепью BoNT/A) - см. 1-й столбец данных, представленный для многокарманных мутантов на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замены E148Y, S143D, Q29A и Y251E.

b) замену аминокислотного остатка, расположенного в пятом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания R186 hSNAP-23; где указанный пятый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

c) замену аминокислотного остатка, расположенного во втором связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D189/D192 hSNAP-23; где указанный второй связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком Q29A L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

d) замену аминокислотного остатка, расположенного в шестом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания K206 hSNAP-23; где указанный шестой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

e) и где указанная замена аминокислотного остатка включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокис-

- 16 045463 лотному остатку S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и iv) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в третьем связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания I198 hSNAP-23;

b) где указанный третий связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком K166 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из валина, фенилаланина, лейцина и изолейцина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку K166 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Не ограничивая себя какой-либо теорией, заявитель полагает, что определенный выше связывающий карман L-цепи BoNT/A может обеспечить стабилизирующее гидрофобное взаимодействие между I198 в hSNAP-23 и аминокислотой 166 BoNT/A.

Модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего кармана для сайта связывания I198 hSNAP-23, обычно демонстрируют более 9% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных, представленный на фиг. 1A. Для справки: L-цепь BoNT/A дикого типа (например, SEQ ID NO: 1) демонстрирует менее чем 0,5% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных, представленный на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену K166V;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену K166F;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену K166L;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену K166I.

В одном варианте осуществления модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего карманного для сайта связывания I198 hSNAP-23, обычно демонстрируют более 40% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных, представленный на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей Lцепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену K166L.

В дополнительном варианте осуществления модифицированные L-цепи BoNT/A настоящего изобретения, содержащие мутацию связывающего карманного для сайта связывания I198 hSNAP-23, обычно демонстрируют более 60% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных, представленный на фиг. 1A. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену K166F.

В предпочтительном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания I198 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в одном или более различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A, как описано здесь (например, в, по меньшей мере, двух различных связывающих карманах Lцепи BoNT/A, таких как связывающий карман для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23 и связывающий карман для сайта связывания K185 или R186 hSNAP-23). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 40% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20

- 17 045463 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных, представленный на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных

L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей Lцепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замены E148Y, K166F и G305D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замены E148Y, K166V и G305D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замены E148Y, S143D и K166F.

b) замену аминокислотного остатка, расположенного в третьем связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания I198 hSNAP-23; где указанный третий связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком K166 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

c) замену аминокислотного остатка, расположенного в четвертом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания K185 hSNAP-23; где указанный четвертый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из валина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку K166 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания I198 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в, по меньшей мере, двух разных связывающих карманах L-цепи BoNT/A (например, внутри связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23 и внутри связывающего кармана для сайта связывания K185 или R186 hSNAP-23). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 15% расщепления hSNAP-23 (% при 10 нмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных**, представленный на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, K166F и G305D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, S143D и K166F.

В одном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания I198 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в, по меньшей мере, трех разных связывающих карманах L-цепи BoNT/A (например, в связывающем кармане для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, в связывающем кармане для сайта связывания D189/D192 hSNAP23 и в связывающем кармане для сайта связывания K185 hSNAP-23, как определено выше). Такие мутанты обычно демонстрируют по меньшей мере 60% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных, представленный на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замены E148Y, Q29A, K166V и G305D;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замены E148Y, Q29A, K166F и G305D.

- 18 045463

а) замену аминокислотного остатка, расположенного в первом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания P182/D178 hSNAP-23; где указанный первый связывающий карман протеазу L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

c) замену аминокислотного остатка, расположенного во втором связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D189/D192 hSNAP-23; где указанный второй связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком Q29A L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и

d) замену аминокислотного остатка, расположенного в четвертом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания K185 hSNAP-23; где указанный четвертый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из валина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку K166 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и iv) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретению, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания I198 на hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в, по меньшей мере, трех разных связывающих карманах L-цепи BoNT/A (например, внутри связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, внутри связывающего кармана для сайта связывания D189/D192 hSNAP23 и внутри связывающего кармана для сайта связывания K185 hSNAP-23). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 10% расщепления hSNAP-23 (% при 10 нмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных**, представленный на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, Q29A, K166F и G305D.

Дополнительные примеры модифицированных мутантов L-цепи BoNT/A, имеющих мутацию связывающего кармана для I198 hSNAP-23, (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную Lцепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, Q29A, K166F, Y251E и G305D.

В одном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания I198 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в одном или более различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A (например, внутри связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23 или внутри связывающего кармана для сайта связывания K185 hSNAP-23, как определено выше). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 3% расщепления hSNAP-23 (% при 10 нмоль модифицированной Lцепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных**, представленный на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y и K166F;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену G305D и K166F.

В другом варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания I198 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в одном или более различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A (например, внутри связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23 или внутри связывающего кармана для сайта связывания K185 hSNAP-23). Такие мутанты обычно демонстрируют, по

- 19 045463 меньшей мере, 5% расщепления hSNAP-23 (% при 10 нмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных**, представленный на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей Lцепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y и K166F.

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в седьмом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D210 hSNAP-23;

b) где указанный седьмой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком S254 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i. например, аминокислотный остаток аланина в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку S254 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Не ограничивая себя какой-либо теорией, заявитель полагает, что определенный выше связывающий карман L-цепи BoNT/A может обеспечивать водородную связь с сайтом связывания D210 hSNAP23. Кроме того, заявитель полагает, что модификация указанного связывающего кармана (как определено здесь) исключает образование водородной связи между D210 hSNAP-23 и аминокислотой 254 BoNT/A. Считается, что это, в свою очередь, генерирует C-концевой продукт расщепления hSNAP-23 в форме лучше уходящей группы и, таким образом, повышается скорость расщепления hSNAP-23.

Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену S254A.

В одном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания D210 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в одном или более различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A, как описано здесь (например, внутри, по меньшей мере, двух или трех различных связывающих карманов L-цепи BoNT/A, таких как связывающий карман для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23 и связывающий карман для для сайта связывания I198 hSNAP-23 и, необязательно, связывающий карман для сайта связывания K185 hSNAP23). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 10% расщепления hSNAP-23 (% при 10 нмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных**, представленный на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A включают в себя:

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, K166F и S254A;

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, K166F, S254A и G305D.

В предпочтительном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящего изобретения, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания D210 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в одном или более различных связывающих карманах L-цепи BoNT/A, как описано здесь (например, внутри, по меньшей мере, трех различных связывающих карманов L-цепи BoNT/A, таких как связывающий карман для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, связывающий карман для сайта связывания I198 hSNAP-23, и связывающий карман для сайта связывания K185 hSNAP23). Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 25% расщепления hSNAP-23 (% при 10 нмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных**, представленный на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y, K166F, S254A и G305D.

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в восьмом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D168 hSNAP-23;

- 20 045463

b) где указанный восьмой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком K340 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) например, аминокислотный остаток гистидина в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку K340 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

Не ограничивая себя какой-либо теорией, заявитель полагает, что определенный выше связывающий карман L-цепи BoNT/A может обеспечить солевой мостик между D168 hSNAP-23 и аминокислотой 340 BoNT/A.

модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену K340H.

В одном варианте осуществления модифицированная L-цепь BoNT настоящему изобретению, имеющая мутацию связывающего кармана для сайта связывания P182/D178 hSNAP-23, может дополнительно содержать одну или более мутаций в связывающем кармане L-цепи BoNT/A сайта связывания D168 hSNAP-23. Такие мутанты обычно демонстрируют, по меньшей мере, 3% расщепления hSNAP-23 (% при 1 мкмоль модифицированной L-цепи BoNT/A; 20 мкмоль hSNAP-23; предпочтительно инкубированных при температуре примерно 37°C в течение примерно 1 часа) - см. 2-й столбец данных, представленный на фиг. 1B. Примеры таких модифицированных L-цепей BoNT/A (обозначаемых по аминокислотной замене(ам) по сравнению с соответствующей L-цепью BoNT/A дикого типа SEQ ID NO: 1) включают в себя: модифицированную L-цепь BoNT/A, содержащую замену E148Y и K340H.

Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A, как описано выше, может содержать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, например, по меньшей мере, 80%, или, по меньшей мере, 85%, или, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95%, или, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99%, идентичности по последовательности с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1). Модифицированная аминокислотная последовательность L-цепи BoNT/A имеет менее 100% идентичности по последовательности с L-цепью BoNT/A дикого типа (например, SEQ ID NO: 1). Как указывалось ранее, упоминание в этом описании модифицированной протеазы L-цепи BoNT/A включает в себя ее функциональные фрагменты, то есть фрагменты указанной протеазы, которые расщепляют hSNAP-23. Например, модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A настоящего изобретения содержит, по меньшей мере, 300 (например, по меньшей мере, 350, или, по меньшей мере, 400 или, по меньшей мере, 410) аминокислот. Например, восемь N-концевых аминокислот и/или карбоксильный конец (например, последние 32 аминокислоты) протеазы L-цепи ботулинического нейротоксина не являются необходимыми для протеолитической активности.

Модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения может быть пегилирована для увеличения стабильности, например, продолжительности действия протеазного компонента. Пегилирование предпочтительно включает в себя добавление ПЭГ к N-концу L-цепи. В качестве примера, N-конец Lцепи может быть удлинен одним или более аминокислотными (например, цистеиновыми) остатками. Один или более из указанных аминокислотных остатков могут иметь свою собственную молекулу ПЭГ, присоединенную (например, ковалентно связанную) к ней. Пример этой технологии описан в Международной патентной заявки WO 2007/104567, содержание которой полностью включено в настоящее изобретение путем ссылки.

Модифицированная L-цепь BoNT/A настоящего изобретения может включать в себя добавление (или удаление) вторичных сайтов модификации - см. патентные документы WO 2002/040506, US7223577 и WO 2005/068494, каждый из которых полностью включен в настоящее изобретение путем ссылки. Дополнительное присутствие или отсутствие (по сравнению с L-цепью BoNT дикого типа) таких сайтов изменяет биологическую стойкость (например, биологическое время полужизни) модифицированной L-цепи настоящего изобретения.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей в себя или состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует модифицированную L-цепь BoNT/A, как описано здесь. Указанная последовательность нуклеиновой кислоты может предпочтительно кодировать средство доставки TSI, как дополнительно описано ниже. Конструкция нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может включать в себя обычные регуляторные элементы, такие как промотор и/или терминатор.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты в форме бактериальной плазмиды или вирусного вектора. Указанная конструкция нуклеиновой кислоты необязательно может быть оптимизированной по кодонам для оптимизации экспрессии (например, рекомбинантной экспрессии) в желаемой клетке-хозяине (например, E.coli).

В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированную L-цепь BoNT/A, как описано здесь, может быть использована для введения в представляющую интерес клетку-мишень, например, с терапевтической или косметической целью. С этой целью указанную конструкцию нуклеиновой кислоты можно, как правило, оптимизировать с помощью общепринятой

- 21 045463 методологии для доставки в (с последующей экспрессией внутри) клетку-мишень, предпочтительно клетку человека. Клетка-мишень предпочтительно представляет собой клетку, не являющуюся нейроном.

В третьем аспект настоящее изобретение относится к средству доставки для модифицированной Lцепи BoNT/A, тем самым облегчая прохождение модифицированной L-цепи BoNT/A в представляющую интерес клетку-мишень. В соответствии с этим аспектом настоящее изобретение, в частности, относится к средству доставки, содержащему:

a) модифицированную протеазу L-цепи BoNT/A настоящего изобретения или конструкцию нуклеиновой кислоты, включающую в себя или состоящую из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированную L-цепь BoNT/A настоящего изобретения; и

b) средство для доставки указанной модифицированной протеазы L-цепи BoNT/A или указанной конструкции нуклеиновой кислоты в клетку-мишень.

Предпочтительные средства для такой доставки включают в себя любое общепринятое средство доставки, известное в данной области техники, такое как липосомы, биолистические частицы, проникающие в клетки пептиды, векторы для переноса генов и т.д.

Одним из особенно предпочтительных способов доставки, который наиболее подходит для использования с настоящим изобретением, является разработанная заявителем технология нацеленной секреции ингибиторов (TSI). Основные способы, используемые для создания TSI, хорошо документированы и в настоящее время считаются традиционными (см., например, Международные патентные заявки WO 98/07864, WO 2006/059113, WO 2009/150469, WO 2010/020811, WO 2009/150470, WO 2010/094905, WO 2012/156743, каждая из которых полностью включена в настоящее изобретение путем ссылки). Технология TSI основана на механизме доставки, который имитирует те же основные этапы, которые использует клостридиальный нейротоксин, когда он интоксицирует клетку-хозяина (т.е. связывание с клеткой-мишенью, образование эндосом, транслокация L-цепи в цитозоль, протеолитическое расщепление белка SNARE при помощи L-цепи). Средства доставки TSI основаны на простой структуре клостридиального нейротоксина, имеющей три основных компонента:

1) L-цепь клостридиального нейротоксина;

2) нацеливающий фрагмент (НФ), чтобы направлять средство доставки к выбранной клеткемишени. Как правило, нативный связывающий домен клостридиального нейротоксина (H_CC), может быть заменен лигандом для обеспечения избирательного связывания средства доставки с желаемой клеткоймишенью, отличной от нативной клетки-мишени указанного H_CC. В предпочтительном варианте осуществления изобретения можно использовать более одного НФ (необязательно включая связывающий домен клостридиального нейротоксина);

3) транслокационный пептид (например, домен транслокации H_N клостридиального нейротоксина) для обеспечения доставки L-цепи клостридиального нейротоксина в клетку-мишень, где она может затем проявить свое протеолитическое действие (то есть расщепление белка SNARE).

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения средство b) средства доставки настоящего изобретения может содержать:

i) нацеливающий фрагмент (НФ), который связывает средство доставки с клеткой-мишенью. Указанный нацеливающий фрагмент может представлять собой или нативный связывающий домен клостридиального нейротоксина (H_CC), или, более предпочтительно, лиганд, обеспечивающий связывание с клеткой-мишенью, отличной от нативной клетки-мишени указанного H_CC; и ii) транслокационный пептид, который транслоцирует модифицированную протеазу L-цепи BoNT/A настоящего изобретения в клетку-мишень, предпочтительно в цитозоль указанной клетки.

Средство доставки настоящего изобретения, как правило, включает в себя один или более Нацеливающий фрагмент (НФ). Упоминание НФ включает в себя любую структуру (обычно пептид), которая функционально взаимодействует с сайтом (например, рецептором или акцептором), вызывая физическую ассоциацию между модифицированной протеазой L-цепи BoNT/A настоящего изобретения и поверхностью клетки-мишени млекопитающего (например, клетки человека). Сайт предпочтительно представляет собой сайт, способный к интернализации (например, образованию эндосом), также называемой рецептор-опосредованным эндоцитозом. НФ может обладать функцией транслокации эндосомальной мембраны, и в этом случае не нужно использовать отдельные компоненты НФ и домен транслокации.

НФ настоящего изобретения связывается (например, специфично связывается) с выбранной клеткой-мишенью. Термин специфично связывается предпочтительно означает, что данный НФ связывается с клеткой-мишенью с аффинностью связывания (Ка) 106 М^-1 или более, например, 10⁷ М^-1 или более, 10⁸ М^-1 или более или 109 М^-1 или более.

То, что НФ связывается с выбранной клеткой-мишенью, подтверждается стандартным образом. Например, может быть использован простой эксперимент по радиоактивному смещению, в котором ткань или клетки, представляющие интересующую клетку-мишень, подвергаются воздействию меченого (например, тритированного) НФ в присутствии избытка немеченого НФ. В таком эксперименте могут быть оценены относительные пропорции неспецифичного и специфичного связывания, что позволяет подтвердить, что НФ связывается с клеткой-мишенью. Необязательно, анализ может включать в себя один

- 22 045463 или более антагонистов связывания, и анализ может дополнительно включать в себя наблюдение потери связывания НФ. Примеры экспериментов такого типа можно найти в Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311, In Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford

University Press.

НФ настоящего изобретения предпочтительно связывается с ненейронной клеткой-мишенью (например, тучной клеткой и/или эпителиальной клеткой - см., например, Международные патентные заявки WO 00/10598 и WO 01/21213, каждая из которых полностью включена в настоящее изобретение путем ссылки). При этом указанный НФ способен направлять средство доставки к выбранной ненейронной клетке-мишени, которая экспрессирует нежелательный фенотип hSNAP-23 (и, необязательно, нежелательный фенотип SNAP-25). Параллельно НФ настоящего изобретения может отдельно связываться (например, через тот же НФ или через второй НФ) со второй выбранной клеткой-мишенью, например со второй ненейронной клеткой-мишенью или с нейронной клеткой-мишенью, экспрессирующей нежелательный фенотип hSNAP-23 и/или SNAP-25.

Подходящие НФ включают в себя: лиганды к сайтам связывания рецепторов клеток млекопитающих, такие как цитокины, факторы роста, нейропептиды, лектины и антитела - этот термин включает в себя моноклональные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, F(ab)'2, Fv, ScFv и т.д.

В качестве дополнительного примера, НФ включают в себя пептид лептин, рецептор грелина, пептид соматостатин, пептид инсулинового фактора роста, пептид ErbB (например, EGF), пептид VIPглюкагон-GRF-секретин (например, пептид PACAP), пептид интерлейкин (например, пептид IL-1, IL-2, IL-6 или IL-10), пептид NGF, пептид VEGF, пептид бомбезин, пептид уротензин, пептид меланинконцентрирующий гормон, пептид пролактолиберин, пептид KiSS-1, пептид CRF, пептид GHRH, пептид вещества P, пептид бета-2-адренорецептор, гастрин-высвобождающий пептид, пептид, связанный с геном кальцитонина, пептид фактора роста тромбоцитов, пептид фактора роста кератиноцитов, пептид фактора роста гепатоцитов, пептид ФНО-альфа, пептид ФНО-бета, предсердный натрийуретический пептид и пептид интегрин.

Средство доставки настоящего изобретения обычно не имеет (функционального) связывающего домена клостридиального нейротоксина (в качестве НФ).

Альтернативно, средство доставки настоящего изобретения может включать в себя (функциональный) связывающий домен клостридиального нейротоксина (в качестве НФ). Упоминание связывающего домена клостридиального нейротоксина включает в себя часть H_C (точнее, H_CC) клостридиального нейротоксина, а также ее мутанты, которые сохраняют связывающую способность домена H_C (например, способность связывать синаптосомальные мембраны крыс в обычных анализах связывания, таких как описано в Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82.

Связывающий домен/пептид HC нативного клостридиального нейротоксина содержит приблизительно 400-440 аминокислотных остатков и состоит из двух функционально отличных доменов приблизительно по 25 кДа каждый, а именно N-концевой области (обычно называемой пептидом или доменом H_CN) и C-концевой области (обычно называемой пептидом или доменом H_CC)- Именно C-концевая область (H_CC), которая образована C-концевыми аминокислотными остатками 160-200, отвечает за связывание клостридиального нейротоксина с нервными окончаниями в нервно-мышечном соединении. Типичные пептиды H_CC включают в себя:

ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (Y1111-L1296);

ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (Y1098-E1291);

ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (Y1112-E1291);

ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (Y1099-E1276);

ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (Y1086-K1252);

ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (Y1106-E1274);

ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (Y1106-E1297);

столбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (Y1128-D1315).

Вышеуказанные эталонные последовательности следует рассматривать как примерные данные, так как могут иметь место небольшие вариации в зависимости от субсеротипа.

Средство доставки настоящего изобретения обычно включает в себя транслокационный пептид, который обеспечивает транслокацию модифицированной L-цепи в цитозоль мишени. Обладает ли пептид необходимой транслокационной функцией в соответствии с настоящим изобретением, может быть подтверждено любым из нескольких общепринятых анализов. Например, Shone C. (1987) описывает анализ in vitro с использованием липосом, которые нагружают тестируемой молекулой. Наличие необходимой транслокационной функции подтверждается высвобождением из липосом K+ и/или меченого НАД, которые можно легко контролировать [см. Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180]. Еще один пример можно найти в Blaustein R. (1987), где описан простой анализ in vitro с использованием плоских фосфолипидных двухслойных мембран. Мембраны нагружают тестируемой молекулой, и необходимую транслокационную функцию подтверждают увеличением проводимости через указанные мембраны [см. Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120]. Дополнительная методика, позво- 23 045463 ляющая оценить слияние мембран и, таким образом, идентифицировать транслокационные домены, подходящие для использования в настоящем изобретении, описана в Methods in Enzymology Vol 220 and 221,

Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993.

Транслокационный домен может иметь клостридиальное происхождение, такое как домен/часть H_Nнейротоксина. Термин домен H_N означает фрагмент H-цепи клостридиального нейротоксина, приблизительно эквивалентный аминоконцевой половине H-цепи. Домен H_N клостридиального нейротоксина лишен естественной функции связывания компонента H_C H-цепи. Таким образом, домен H_N не способен связываться с сайтом связывания на клетке-мишени, с которой связывается нативный клостридиальный нейротоксин (то есть холотоксин).

Примеры подходящих (эталонных) транслокационных доменов включают в себя:

ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (449-871);

ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (441-858);

ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (442-866);

ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (446-862);

ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (423-845);

ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (440-864);

ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (442-863);

столбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (458-879).

Исследования показали, что полная длина части H_N тяжелой цепи клостридиального нейротоксина не является необходимой для транслокационной активности. Таким образом, аспекты этого варианта осуществления изобретения могут включать в себя области HN клостридиального токсина, содержащие домен транслокации, имеющий длину, например, по меньшей мере, 350 аминокислот, по меньшей мере, 375 аминокислот, по меньшей мере, 400 аминокислот и, по меньшей мере, 425 аминокислот. Для получения более подробной информации о генетических основах получения токсинов в Clostridium botulinum и C. tetani, см. Henderson et al (1997) in The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press.

Термин H_N включает в себя встречающиеся в природе части H_N нейротоксина, а также варианты H_N, имеющие аминокислотные последовательности, которые не встречаются в природе, при условии, что эти варианты H_N сохраняют вышеупомянутую функцию транслокации. Например, часть H_N клостридиального нейротоксина включает в себя различные аминокислотные последовательности, обладающие, по меньшей мере, 70% (например, по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере, 85% или, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% или, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99%) идентичности по последовательности с частью HN клостридиального нейротоксина дикого типа, хотя при условии, что они сохраняют функцию транслокации.

Альтернативно, транслокационный пептид может иметь неклостридиальное происхождение, например он может представлять собой транслокационный домен дифтерийного токсина [O.Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; и London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51], транслокационный домен экзотоксина типа A синегнойной палочки [Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], транслокационные домены токсина сибирской язвы [Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442], разнообразные фузогенные или гидрофобные пептиды с функцией транслокации [Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; и Wagner et al (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938] и амфифильные пептиды [Murata et al (1992) Biochem., 31, pp.1986-1992].

Упоминание транслокационных пептидов неклостридиального нейротоксина включает в себя фрагменты и варианты аминокислотных последовательностей, имеющих, по меньшей мере, 70% (например, по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере, 85% или, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% или, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99%) идентичности по последовательности с соответствующей неклостридиальной транслокационной пептидной последовательностью дикого типа, хотя при условии, что этот вариант сохраняет функцию транслокации.

- 24 045463

Источник транслокационного домена	Аминокислотные остатки	Ссылки
Дифтерийный токсин	194-380	Silverman et al., 1994, J. Biol. Chern. 269, 2252422532 London E., 1992, Biochem. Biophys. Acta., 1113, 25-51
Домен II экзотоксина синегнойной палочки	405-613	Prior et al., 1992, Biochemistry 31, 3555-3559 Kihara & Pastan, 1994, Bioconj Chem. 5, 532-538
Гемагглютинин вируса гриппа	GLFGAIAGFIENGWEGMIDG WYG, и его варианты	Plank et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924 Wagner et al., 1992, PNAS, 89, 7934-7938 Murata et al., 1992,
Фузогенный белок вируса леса Семлики Гликопротеин G вируса везикулярного стоматита Белок F SER вируса	Транслокационный домен 118-139 Транслокационный домен	Biochemistry 31, 1986-1992 Kielian et al., 1996, J Cell Biol. 134(4), 863-872 Yao et al., 2003, Virology 310(2),319-332 Seth et al., 2003, J Virol 77(11)6520-6527
Гликопротеин оболочки вируса пенистости	Транслокационный домен	Picard-Maureau et al., 2003, J Virol. 77(8), 47224730

Полипептиды настоящего изобретения могут дополнительно содержать домен, облегчающий транслокацию. Указанный домен облегчает доставку нецитотоксической протеазы в цитозоль клеткимишени и описан, например, в Международных патентных заявках WO08/008803 и WO08/008805, каждая из которых включена в настоящее изобретение путем ссылки.

Например, подходящие облегчающие транслокацию домены включают в себя домен фузогенного пептида оболочки вируса, например, подходящие домены фузогенного пептида включают в себя домен фузогенного пептида вируса гриппа (например, домен фузогенного пептида вируса гриппа A из 23 аминокислот), домен фузогенного пептида альфавирус (например, домен фузогенного пептида вируса леса Семлики из 26 аминокислот), домен фузогенного пептида везикуловируса (например, домен фузогенного пептида вируса везикулярного стоматита из 21 аминокислоты), домен фузогенного пептида респираторного вируса (например, домен фузогенного пептида вируса Сендай из 25 аминокислот), домен фузогенного пептида морбиливируса (например, домен фузогенного пептида вируса чумки собак из 25 аминокислот), домен фузогенного пептида авулавируса (например, домен фузогенного пептида вируса ньюкаслской болезни из 25 аминокислот), домен фузогенного пептида хенипавируса (например, домен фузогенного пептида вируса Хендра из 25 аминокислот), домен фузогенного пептида метапневмовируса (например, домен фузогенного пептида метапневмовируса человека из 25 аминокислот) или домен фузогенного пептида спумавируса, такой как домен фузогенного пептида вируса пенистости обезьян; или их фрагменты или варианты.

В качестве дополнительного примера, облегчающий транслокацию домен может включать в себя домен H_CN клостридиального нейротоксина или его фрагмент или вариант (имеющий по меньшей мере 70% идентичности по последовательности с соответствующей последовательностью дикого типа), хотя при условии, что он сохраняет улучшенная функция транслокации. Более подробно, облегчающий транслокацию домен H_CN клостридиального токсина, может иметь длину, по меньшей мере, 200 аминокислот, по меньшей мере, 225 аминокислот, по меньшей мере, 250 аминокислот, по меньшей мере, 275 аминокислот. В этом отношении, облегчающий транслокацию домен H_CN клостридиального токсина,

- 25 045463 предпочтительно имеет длину не более 200 аминокислот, не более 225 аминокислот, не более 250 аминокислот или не более 275 аминокислот. Конкретные (эталонные) примеры включают в себя:

ботулинический нейротоксин типа A - аминокислотные остатки (872-1110);

ботулинический нейротоксин типа B - аминокислотные остатки (859-1097);

ботулинический нейротоксин типа C - аминокислотные остатки (867-1111);

ботулинический нейротоксин типа D - аминокислотные остатки (863-1098);

ботулинический нейротоксин типа E - аминокислотные остатки (846-1085);

ботулинический нейротоксин типа F - аминокислотные остатки (865-1105);

ботулинический нейротоксин типа G - аминокислотные остатки (864-1105);

столбнячный нейротоксин - аминокислотные остатки (880-1127).

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу расщепления hSNAP-23, где указанный способ включает в себя приведение hSNAP-23 в контакт с модифицированной протеазой L-цепи BoNT/A, или с конструкцией нуклеиновой кислоты, или со средством доставки, как описано здесь, тем самым позволяя модифицированной L-цепи BoNT/A связаться с указанный hSNAP-23 с последующим протеолитическим расщеплением hSNAP-23 модифицированной протеазой L-цепи BoNT/A. В одном варианте осуществления изобретения указанный способ выполняется in vitro.

В одном варианте осуществления изобретения указанный способ расщепления hSNAP-23 включает в себя предварительные этапы:

1) связывание средства доставки с клеткой-мишенью при помощи его нацеливающего фрагмента (НФ); и

2) транслокация модифицированной L-цепи BoNT/A в клетку-мишень, предпочтительно в цитозоль указанной клетки-мишени, при помощи транслокационного пептида средства доставки.

Предпочтительно НФ связывается с сайтом на клетке-мишени (например, с молекулой белка, сахара и/или липида), причем указанный сайт способен к опосредованному рецептором эндоцитозу, и средство доставки затем интернализируется клеткой-мишенью через образование эндосомы. После этого транслокационный пептид средства доставки может перемещать модифицированную L-цепь BoNT/A через эндосомальную мембрану и в цитозоль клетки-мишени.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированной протеазе L-цепи (BoNT/A), или к конструкции нуклеиновой кислоты, или к средству доставки, как описано здесь, для применения в способе расщепления hSNAP23, как описано выше.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к описанной здесь модифицированной протеазе L-цепи (BoNT/A) для применения в способе лечения, предпочтительно способе лечения секреторного расстройства.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к описанной здесь протеазе Lцепи BoNT/A, или описанной здесь конструкции нуклеиновой кислоты, или описанному здесь средству доставки для применения в качестве лекарственного средства.

В таких аспектах указанная модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A предпочтительно содержится в BoNT, дополнительно включающем в себя тяжелую цепь, то есть в полноразмерном BoNT. Такие полноразмерные BoNT обычно имеют полипептидную цепь массой 150 кДа, содержащую тяжелую цепь массой 100 кДа и легкую цепь массой 50 кДа, связанные дисульфидной связью, и организованы в три функциональных домена: N-концевую протеолитическую легкую цепь (L-цепь); и C-концевую тяжелую цепь (H-цепь), последняя состоит из транслокационного домена (H_N) и C-концевого нейронсвязывающего домена (H_C).

Предпочтительные секреторные расстройства включают в себя спастичность мышц/гиперактивное движение мышц (включая спастичность после инсульта, спастичность после повреждения спинного мозга, спазмы головы и шеи, века, влагалища, конечностей, челюстей и голосовых связок), косоглазие, гипергидроз и тяжелые первичный подмышечный гипергидроз.

Настоящее изобретение будет лучше понято в свете следующих подробных примеров. Тем не менее, специалисту в данной области техники понятно, что это подробное описание не является ограничивающим, и что могут быть сделаны различные модификации, замены, отступления и изменения, которые при этом не выходят за пределы объема изобретения.

Описание чертежей

Фиг. 1 - данные по расщеплению hSNAP-23 и hSNAP25 для модифицированных протеаз L-цепи BoNT/A настоящего изобретения. (A) данные для протеазы L-цепи BoNT/A, имеющей мутации в одном связывающем кармане, (B) данные для протеазы L-цепи BoNT/A, имеющей мутации в нескольких связывающих карманах.

Фиг. 2 - тонированное 3D-изображение взаимодействия протеазы L-цепи BoNT/A (контур) с сайтами связывания SNAP-25/23 (линия визуализации).

- 26 045463

Аминокислотные последовательности

SEQ ID NO: 1 - Легкая цепь BoNT/A дикого типа (аминокислотные остатки 1-438 Uniprot A5HZZ9)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPE EGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGI PFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTR NGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAIN PNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTL NKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFV KFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFT KLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSK

SEQ ГО NO: 2 - человеческий SNAP23

MDNLSSEEIQQRAHQITDESLESTRRILGLAIESQDAGIKTITMLDEQKEQLNRIEE GLDQINKDMRETEKTLTELNKCCGLCVCPCNRTKNFESGKAYKTTWGDGGENSPCNVV SKQPGPVTNGQLQQPTTGAASGGYIKRITNDAREDEMEENLTQVGSILGNLKDMALNIG NEIDAQNPQIKRITDKADTNRDRIDIANARAKKLIDS

SEQ ГО NO: 3 - SNAP25 человека и грызуна

MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQ GEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQD GVVASQPARVVDEREQMATSGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGTTGNLRHMALDMG NEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG

SEQ ГО NO: 4 - Сайт IgA-протеазы His6 метка (искусственная)

PPTPGHHHHHH

SEQ ГО NO: 5 - метка Twin Strep Tag (искусственная)

MASWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEKGAGS

SEQ ID NO: 6 - His6 метка (искусственная)

GHHHHHH

SEQ ID NO: 7 - Сайт V-IgA-протеазы His6 метка (искусственная)

VPPTPGHHHHHH

SEQ ID NO: 8 - BoNT/Al дикого типа

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPE EGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGI PFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTR NGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAIN PNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTL NKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFV KFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFT KLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTND LNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFP NGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNK ATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALI FSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWL AKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESIN KAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRL KDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINI GSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEY TIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNR LNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEI KDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPR GSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQ AGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNI AKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

SEQ ID NO: 9 - линкер LHn (искусственная)

- 27 045463

VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL

SEQ ID NO: 10 - сайт активации энтерокиназы

DDDDK

SEQ ID NO: 11 - петля активации BoNT/ΑΙ

VDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQ

Примеры

Пример 1 - получение модифицированных L-цепей BoNT/A (LC BoNT/A) настоящего изобретения.

Плазмиду pBN3, кодирующую L-цепь BoNT/A дикого типа (аминокислоты 1-448, SEQ ID NO: 1), получали при помощи ПЦР и подходящих олигонуклеотидных праймеров с использованием бактериальной ДНК штамма 62A в качестве матрицы. ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность PPTPGHHHHHH (SEQ ID NO: 4), встраивали после кодона для аминокислоты Ala-449. Штамм E.coli M15pREP4 (Qiagen, Hilden, Германия) трансфицировали плазмидой pBN3, содержащей LC BoNT/A дикого типа, или ее мутанты, то есть мутанты протеазы SEQ ID NO: 1, как описано в настоящей заявке. Для каждого трансфицированного штамма E.coli одну бактериальную колонию, выращенную в течение ночи в 5 мл среды 2YT, использовали для инокуляции 500 мл среды 2YT.

После того как культура достигла ОП 0,7 при длине волны 600 нм, L-цепи BoNT/A получали в течение 15 ч индукции с использованием 0,2 мМ IPTG при температуре 21°C. Бактерии собирали центрифугированием и замораживали при температуре -20°C в течение ночи. Бактерии ресуспендировали в лизирующем буфере (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфат, pH 8,0) с добавлением бензамидина, пепстатина A и PMSF в конечных концентрациях 5 мМ, 1 мкг/мл и 0,5 мМ соответственно, лизировали ультразвуком, лизат очищают центрифугированием в течение 30 минут при 29000 g, и L-цепь BoNT/A связывали с гранулами М2+-нитрилотриуксусной кислоты и агарозы. Гранулы промывали 20 объемами слоя лизирующего буфера, содержащего 10 мМ имидазола, и элюировали L-цепь BoNT/A лизирующим буфером, содержащим 100 мМ имидазола. Фракции, содержащие желаемый белок, подвергали диализу против буфера для анализа токсина (150 мМ глутамат калия, 10 мМ Hepes-KOH, pH 7,2) и на последнем этапе очищенную L-цепь, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70°C.

Пример 2 - бесклеточный анализ расщепления hSNAP-23.

Получали плазмиду hSNAP-23 (SEQ ID NO: 2) для экспрессии в E.coli и транскрипции/трансляции in vitro, pS3-hSNAP-23His6.

Она кодирует N-концевую слитую метку Twin Strep Tag (MASWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEKGAGS, SEQ ID NO: 5) и C-концевую слитую метку His6 (GHHHHHH, SEQ ID NO: 6) после кодона карбокси-концевого серина 211.

Для получения и очистки белка штамм E.coli BL21-DE3 (Stratagene Europe, Ebsdorfergrund, Германия) трансфицировали плазмидой pS3-hSNAP-23His6 по тому же протокол, который подробно описан для протеазы L-цепи BoNT/A в примере 1. Однако белок, элюированный из гранул M2+нитрилотриуксусной кислоты и агарозы, дополнительно очищали на гранулах стреп-тактин-агарозы (IBM Lifesciences, Геттинген, Германия) путем промывания 20 объемами слоя 0,1 М Трис, pH 8,0 и элюирования 10 мМ дестхиобиотином в 0,1 М Трис, pH 8,0. Кроме того, во все буферы, используемые для очистки hSNAP-23, добавляли 10 мМ Р-меркаптоэтанол.

Затем радиоактивно меченый hSNAP-23 получали путем транскрипции/трансляции in vitro с использованием pS3-hSNAP-23His6, системы лизата ретикулоцитов TNT, связанной с T7 (Promega) и [35S] метионина (370 кБк/мкл, >37 ТБк/ммоль; Hartmann Analytic, Брауншвейг, Германия) согласно инструкции производителя.

Бесклеточный анализ расщепления hSNAP-23 включал в себя рекомбинантный hSNAP-23 в конечной концентрации 20 мкмоль плюс 1 мкл смеси для транскрипции/трансляции, состоящей из меченого [35S] метионином hSNAP-23 и каждой модифицированной или дикого типа L-цепи BoNT/A, в конечных концентрациях 1 мкмоль или 10 нмоль, которые инкубировали в течение 60 мин при температуре 37°C в общем объеме 10 мкл буфера для анализа токсинов. Реакции останавливали добавлением равного объема двукратного буфера для образца [120 мМ Трис-HCl (pH 6,75), 10% (об./об.) β-меркаптоэтанол, 4% (об./об.) ДСН, 20% (мас./об.) глицерин и 0,014% (мас./об.) бромфеноловый синий]. После инкубации в течение 30 минут при температуре 37°C каждый образец анализировали с помощью ДСН-ПААГ с использованием 15% трис-глициновых гелей (соотношение акриламид/бис-акриламид: 73,5:1).

Гели высушивали и визуализировали радиоактивно меченный белок с использованием фосфоимиджера FLA-9000 (Fuji Photo Film, Co., Ltd., Токио, Япония). Количественное определение радиоактивно меченного белка и продуктов его расщепления проводили с помощью программного обеспечения Multigauge 3.2 (Fuji Photo Film). Для определения кинетических параметров фермента L-цепи BoNT/A дикого типа и ее мутантов концентрацию субстрата варьировали от 5 до 100 мкМ с использованием hSNAP-23, продуцируемого в E.coli. К каждой из различных концентраций субстрата добавляли 1 мкл радиоактивно меченного hSNAP-23, полученного путем транскрипции/трансляции in vitro. Инкубацию проводили в конечном объеме 25 мкл буфера для анализа токсинов. После 2 и 4 мин инкубации при температуре 37°C отбирали аликвоты по 10 мкл и ферментативную реакцию останавливали, смешивая с 10

- 28 045463 мкл предварительно охлажденного двукратного буфера для образцов ДСН-ПААГ. Процент расщепления определяли по превращению радиоактивно меченого субстрата, как подробно описано выше, и использовали для расчета начальной скорости гидролиза субстрата. Значения Km, Kcat и Vmax рассчитывали методом нелинейной регрессией с использованием программы GraphPad Prism 4.03 (GraphPad Software

Inc., Сан-Диего, США).

Полученные данные показаны на фиг. 1.

Пример 3 - бесклеточный анализ расщепления hSNAP-25.

Плазмида pBNIO для экспрессии hSNAP-25 (SEQ ID NO: 3) в E.coli была описана в Binz et al. (J Biol Chem., 1994; 269: 1617-20). После кодона для карбокси-концевого глицина-206 следует ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность VPPTPGHHHHHH (SEQ ID NO: 7). Плазмиду для транскрипции/трансляции in vitro, pSNAP-25His6, впоследствии получали путем субклонирования фрагмента EcoRI-SalI pBNIO в соответственно расщепленную плазмиду pSP73 (Promega, Mannheim, Германия).

Для получения белка и очистки SNAP-25 штамм E.coli M15pREP4 (Qiagen, Hilden, Германия) трансфицировали плазмидой pBNIO по тому же протокол, который подробно описан для протеазы Lцепи BoNT/A в примере 1.

Радиоактивно меченый SNAP-25 получали путем транскрипции/трансляции in vitro с использованием pSNAP-25His6, системы лизата ретикулоцитов TNT, связанной с SP6 (Promega) и [35S] метионина (370 кБк/мкл, >37 ТБк/ммоль; Hartmann Analytic, Брауншвейг, Германия) согласно инструкции производителя.

Анализ расщепления hSNAP25 проводили точно так же, как описано для hSNAP-23 в примере 2.

Полученные данные показаны на фиг. 1.

Пример 4 - получение доменов LH_N, содержащих модифицированную легкую цепь A (BoNT/A LC) настоящего изобретения.

В этом примере описывается конструирование транслокационных доменов LH_N, содержащих модифицированную легкую цепь A (BoNT/A LC), проявляющую активность расщепления hSNAP23 в соответствии с настоящим изобретением. Такие домены LH_N можно использовать для создания семейств средств доставки TSI, добавляя соответствующие нацеливающие фрагменты.

В кратком изложении, для каждого мутанта BoNT/A LC настоящего изобретения сначала конструировали клонирующие векторы путем химического синтеза ДНК (GeneArt, ThermoFisher), которая кодирует указанный мутант BoNT/A LC и которая оптимизирована для экспрессии в E.coli, эту ДНК субклонировали в вектор pCR4 (Invitrogen). Параллельно клонирующий вектор для домена H_N BoNT/A конструировали аналогичным образом путем химического синтеза кодон-оптимизированной ДНК, кодирующей домен H_N/A (соответствующий аминокислотным остаткам 449-872 SEQ ID NO: 8, регистрационный номер в базе данных UniprotKB A5HZZ9), и субклонировали в стандартный вектор, такой как вектор pCR4 (Invitrogen). Клонирующий вектор для линкера LHN также конструировали путем химического синтеза кодон-оптимизированной ДНК, кодирующей указанный линкер, и субклонировали в стандартный вектор, такой как вектор pCR4 (Invitrogen). В частности, линкер LH_N VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL (SEQ ID NO: 9), подходящий для серотипа BoNT/ (это междоменная полипептидная область, которая существует между цистеинами дисульфидного мостика между LC и доменом H_N BoNT/A) использовали для конструирования линкерного вектора LH_N. Также могут быть созданы альтернативные линкерные конструкции LH_N: в действительности, как хорошо известно специалисту в данной области техники, для получения сайта расщепления конкретной протеазы, можно или использовать нативную восприимчивость к протеолизу протеазой LysC, или вставить сайт активации энтерокиназы (например, DDDDK, SEQ ID NO: 10) в петлю активации для получения последовательности, такой как VDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQ (SEQ ID NO: 11), или в эту петлю активации может быть вставлен сайта протеазы для любой другой протеазы, хорошо известной в данной области техники, такой как PreScission, фактор Xa, тромбин, протеаза TEV и т.д.

Затем домены LHN собирали путем клонирования в модифицированный экспрессионный вектор pET (Novagen) в 2 основных этапа. ДНК, кодирующую каждую из модифицированных LC BoNT/A настоящего изобретения, встраивали перед ДНК, кодирующей линкер LH_N, причем указанный линкер находился далее перед ДНК, кодирующей домен H_N/A.

Пример 5 - получение средств доставки TSI, связывающихся с ненейронной клеткой в соответствии с настоящим изобретением.

В этом примере описывается конструирование средств доставки TSI путем добавления подходящего нацеливающего фрагмента (в данном случае, человеческого GHRP) к каждому C-концевому концу доменов LHN, содержащих модифицированную легкую цепь А настоящего изобретения, как описано выше в примере 2. Для этого между направляющей группой и доменом LHN вводили гибкий линкер.

В кратком изложении, клонирующие векторы линкер-hGHRP конструировали путем химического синтеза кодон-оптимизированной ДНК, кодирующей гибкий линкер, слитый в рамке с нацеливающим фрагментом hGHRP, и субклонировли в вектор pCR4 (Invitrogen).

Затем конструкции TSI собирали путем клонирования ДНК, кодирующей линкер-hGHRP, в каждый из экспрессионных векторов pET, содержащих домены LH_N, описанные в примере 2, таким образом, что- 29 045463 бы линкер-hGHRP сливался в рамке с C-концевым концом каждого домена LHN.

Для экспрессии белка каждого носителя TSI 100 мл модифицированной среды Terrific Broth (TB), содержащей 0,2% глюкозамина и 30 мкг/мл канамицина, инкубировали в колбе на 250 мл с одной бактериальной колонией (E.coli BL21 (DE3), трансфицированной TSI. Каждую культуру выращивали при температуре 37°C и 225 об/мин в течение 16 часов с последующим внесением 10 мл ночной культуры в 1 л модифицированной среды TB, содержащей 0,2% глюкозамина и 30 мкг/мл канамицина, в колбе объемом 2 л. Затем полученную культуру выращивали при температуре 37°C до достижения приблизительного значения ОП 0,5 при длине волны 600 нм, после чего температуру снижали до 16°C. Через 1 час каждую культуру индуцировали 1 мМ IPTG и дополнительно выращивали при температуре 16°C в течение еще 16 ч. Бактерии собирали центрифугированием и замораживали при температуре -20°C в течение ночи.

Последующую очистку каждого экспрессированного TSI проводили следующим образом.

Бактерии размораживали и осадок клеток обрабатывали ультразвуком для лизиса клеток. После центрифугирования супернатант загружали в хелатную колонку с 0,1 М NiSO₄, уравновешенную 50 мМ HEPES, pH 7,2, 200 мМ NaCl. Промывку колонки проводили буфером, содержащим 40-100 мМ имидазола (ступенчатый градиент), для элюирования несвязанного белка, и буфером, содержащим 200 мМ имидазола, для элюирования белка TSI. Фракции, содержащие желаемый белок (TSI), затем подвергали диализу против буфера, содержащего 50 мМ HEPES, pH 7,2, 200 мМ NaCl. Затем к 1 мг очищенного TSI добавляли протеазу (в данном случае LysC) в соответствующем количестве для его активации (то есть так, чтобы TSI образовывал ди-цепь, способную связываться с GHRP, транслоцировать легкую цепь в цитоплазму и каталитически расщеплять hSNAP23). Затем полученную смесь дополнительно очищали, загружая ее в хелатную колонку с 0,1 М NiSO4, уравновешенную 50 мМ HEPES, pH 7,2, 200 мМ NaCl. Колонку сначала промывали 50 мМ HEPES, pH 7,2, 200 мМ NaCl, затем буфером, содержащим 40-100 мМ имидазола, для элюирования неспецифично связанного белка, и буфером, содержащим 200 мМ имидазола, для элюирования активированного TSI. Фракции, содержащие желаемый активированный белок (TSI), впоследствии подвергали диализу против буфера, содержащего 50 мМ HEPES, pH 7,2, 150 мМ NaCl. Диализированный белок затем концентрировали до примерно 2 мг/мл, аликвотировали и на последнем этапе замораживали при температуре -80°C.

Клаузула.

1. Модифицированная протеаза L-цепи ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеющая модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

2. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по п.1, дополнительно содержащая:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного во втором связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания R186 hSNAP-23;

b) где указанный второй связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамина, глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

3. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по п.1 или п.2, дополнительно содержащая:

a) по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка, расположенного в третьем связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания K185 hSNAP-23;

b) где указанный третий связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокис-

- 30 045463 лотными остатками V304 и G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

4. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в четвертом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D189/D192 hSNAP-23;

b) где указанный четвертый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

5. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая:

a) по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка, расположенного в пятом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания K206 hSNAP-23;

b) где указанный пятый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком Y251, L256, V258, L367 и F369 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата, аспартата, глютамина, глицина, аланина и аргинина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку L256 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из серина, аланина, пролина, лейцина и глутамата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы Lцепи, которое соответствует аминокислотному остатку V258 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iv) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина и глицина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку L367 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или

6. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в шестом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания I198 hSNAP-23;

b) где указанный шестой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A, определяется аминокислотным остатком K166 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO:

1);

7. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая:

b) где указанный связывающий седьмой карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком S254 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислот-

- 31 045463 ному остатку S254 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

8. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из гистидина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку K340 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

9. Модифицированная протеаза L-цепи ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеющая модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

10. Модифицированная протеаза L-цепи ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеющая модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

b) где указанный шестой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком K166 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

11. Модифицированная протеаза L-цепи ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеющая модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

b) где указанный пятый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотными остатками Y251, L256, V258, L367 и F369 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или ii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аспартата, глутамина, глицина, аланина и аргинина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку L256 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iii) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из серина, аланина, пролина, лейцина и глутамата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы Lцепи, которое соответствует аминокислотному остатку V258 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или iv) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина и глицина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку L367 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1); и/или

v) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глицина, серина и лейцина, в положении в аминокислотной последовательности модифицированной протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку F369 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

12. Модифицированная протеаза L-цепи ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеющая модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в седьмом связывающем кармане протеазы L-

- 32 045463 цепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D210 hSNAP-23;

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку S254 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).

13. Модифицированная протеаза L-цепи ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), которая расщепляет человеческий SNAP-23 (hSNAP-23), имеющая модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

14. Модифицированная протеаза L-цепи ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) по любому из п.п.9-13, дополнительно содержащая, по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка, расположенного в другом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A, где указанная замена аминокислотного остатка и указанный другой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяются техническими признаками, перечисленными в любом из п.п.1-13.

15. Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая в себя или состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированную протеазу L-цепи BoNT/A, по любому из предшествующих пунктов.

16. Средство доставки, содержащее:

a) модифицированную протеазу L-цепи BoNT/A, по любому из пп.1-14, или конструкцию нуклеиновой кислоты по п.15; и

b) средство для доставки указанной модифицированной протеазы L-цепи BoNT/A или указанной конструкции нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, предпочтительно в клетку-мишень, не являющуюся нейроном.

17. Средство доставки по п.16, где средство b) для доставки указанной модифицированной протеазы L-цепи BoNT/A в клетку-мишень содержит:

i) нацеливающий фрагмент, который связывает средство доставки с клеткой-мишенью; и ii) транслокационный пептид, который транслоцирует модифицированную протеазу L-цепи BoNT/A или конструкцию нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, предпочтительно в клетку-мишень, не являющуюся нейроном.

18. Способ расщепления hSNAP-23, включающий в себя приведение hSNAP-23 в контакт с протеазой L-цепи (BoNT/A) по любому из пп.1-14, или с конструкцией нуклеиновой кислоты по п.15, или со средством доставки по п.16 или 17.

19. Протеаза L-цепи (BoNT/A) по любому из пп.1-14, или конструкция нуклеиновой кислоты по п.15, или средство доставки по п.16 или 17, для применения в способе по п.18.

Список последовательностей <110> IPSEN BIOPHARM LIMITED <12 0> РАСЩЕПЛЯЮЩИЕ НЕНЕЙРОННЫЙ SNARE БОТУЛИНИЧЕСКИЕ НЕЙРОТОКСИНЫ <130> P48382WO <160>11 < 170> Патентная версия 3.5 < 210>1 < 211>438 < 212> Белок < 213> Clostridium botulinum < 400>1

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

- 33 045463

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn

25

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile 35 40

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp

55

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp 65 70

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly

90

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met

100 105

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr

115 120

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile

130 135

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile 145 150

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His

165 170

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile

180 185

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val

195 200

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala

210 215

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly

225 230

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr

245 250

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe

260 265

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe

275 280

Gly Gln Met Gln Pro 30

Val Ile Pro Glu Arg 45

Asn Pro Pro Pro Glu 60

Thr Tyr Leu Ser Thr 80

Thr Lys Leu Phe Glu 95

Leu Thr Ser Ile Val

110

Asp Thr Glu Leu Lys 125

Pro Asp Gly Ser Tyr 140

Pro Ser Ala Asp Ile

160

Val Leu Asn Leu Thr

175

Phe Ser Pro Asp Phe 190

Thr Asn Pro Leu Leu

205

Thr Leu Ala His Glu 220

Ala Ile Asn Pro Asn

240

Glu Met Ser Gly Leu

255

Gly His Asp Ala Lys

270

Leu Tyr Tyr Tyr Asn

285

- 34 045463

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu

290 295

Asn Lys Ala Lys Ser Ile

300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln

305 310

Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu

315

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr 325

Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys

330 335

Lys Phe Asp Lys

340

Asn Phe Val Lys

355

Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu 345 350

Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala

385 390 395

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val

420 425 430

Val

Lys 320

Leu

Asp

Asn

Tyr

Asn 400

Leu

Arg

Gly Ile Ile Thr Ser Lys 435 <210>2 <211>211 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400>2

Met Asp Asn Leu Ser Ser Glu 15

Glu Ile Gln Gln Arg Ala His Gln

15

Thr Asp Glu Ser Leu Glu Ser 20

Thr Arg Arg Ile Leu Gly Leu Ala

30

Glu Ser Gln Asp Ala Gly Ile 35

Lys Thr Ile Thr Met Leu Asp Glu 40 45

Lys Glu Gln Leu Asn Arg Ile

55

Glu Glu Gly Leu Asp Gln Ile Asn 60

Asp Met Arg Glu Thr Glu Lys

70

Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys 85

Thr Leu Thr Glu Leu Asn Lys Cys 75

Asn Arg Thr Lys Asn Phe Glu Ser 90 95

Ile

Gln

Lys

Cys 80

Gly

- 35 045463

Lys Ala Tyr Lys Thr Thr Trp Gly Asp Gly

100 105

Asn Val Val Ser Lys Gln Pro Gly Pro Val

115 120

Gln Pro Thr Thr Gly Ala Ala Ser Gly Gly

130 135

Asn Asp Ala Arg Glu Asp Glu Met Glu Glu 145 150

Ser Ile Leu Gly Asn Leu Lys Asp Met Ala

165 170

Ile Asp Ala Gln Asn Pro Gln Ile Lys Arg

180 185

Thr Asn Arg Asp Arg Ile Asp Ile Ala Asn

195 200

Ile Asp Ser

210 <210>3 <211>206 <212> Белок <213> Homo sapiens <400>3

Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu

510

Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu

25

Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala

40

Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu 50 55

Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala 65 70

Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys

90

Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly

100 105

Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp

115 120

Glu Asn Ser Pro Cys 110

Asn Gly Gln Leu Gln 125

Ile Lys Arg Ile Thr 140

Leu Thr Gln Val Gly

160

Asn Ile Gly Asn Glu

175

Thr Asp Lys Ala Asp 190

Arg Ala Lys Lys Leu 205

Glu Glu Met Gln Arg

Ser Thr Arg Arg Met 30

Ile Arg Thr Leu Val 45

Ile Glu Glu Gly Met 60

Lys Asn Leu Thr Asp 80

Cys Asn Lys Leu Lys

Asn Gln Asp Gly Val 110

Arg Glu Gln Met Ala 125

- 36 045463

Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr

130 135

Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser

145 150

Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu

165 170

Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp

180 185

Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met

195 200 <210> 4 <211> 11 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Сайт IgA-протеазы His6 метка < 400> 4

Pro Pro Thr Pro Gly His His His His His 1 5 10 <210> 5 <211> 35 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> метка Twin Strep Tag < 400> 5

Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

5 10

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Ser His

25

Asp Ala Arg Glu Asn 140

Ile Ile Gly Asn Leu

160

Asp Thr Gln Asn Arg

175

Asn Lys Thr Arg Ile 190

Gly Ser Gly

205

Gly Gly Gly Ser Gly

Gln Phe Glu Lys Gly 30

Ala Gly Ser <210> 6 <211> 7 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> His6 метка <400> 6

Gly His His His His His His

5

- 37 045463 <210> 7 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сайт V-IgA-протеазы His6 метка <400>7

Val Pro Pro Thr Pro Gly His His His His His His

510 <210>8 <211>1296 <212> Белок <213> Clostridium botulinum <400> 8

Met Pro Phe

Val Asp Ile

Val Asn Lys 5

Gln Phe Asn

Tyr Lys Asp 10

Pro Val Asn

Val Lys Ala

Asp Thr Phe 50

Ala Lys Gln 65

Asp Asn Glu

Arg Ile Tyr

Arg Gly Ile

115

Val Ile Asp

130

Arg Ser Glu 145

Ile Gln Phe

Arg Asn Gly

Ala Tyr Ile 20

Lys Ile Pro 25

Asn Ala Gly

Gln Met Gln

Phe Lys Ile

His Asn Lys 40

Ile Trp Val

Ile Pro Glu 45

Thr Asn Pro

Glu Glu Gly 55

Asp Leu Asn

Pro Pro Pro

Val Pro Val

Lys Asp Asn 85

Ser Thr Asp 100

Pro Phe Trp

Thr Asn Cys

Glu Leu Asn

150

Glu Cys Lys 165

Tyr Gly Ser 180

Ser Tyr Tyr

Tyr Leu Lys

Leu Gly Arg

105

Gly Gly Ser

120

Ile Asn Val 135

Leu Val Ile

Ser Phe Gly

Thr Gln Tyr

185

Asp Ser Thr 75

Gly Val Thr 90

Met Leu Leu

Thr Ile Asp

Ile Gln Pro

140

Ile Gly Pro

155

His Glu Val 170

Ile Arg Phe

Tyr Leu Ser

Lys Leu Phe 95

Thr Ser Ile

110

Thr Glu Leu 125

Asp Gly Ser

Ser Ala Asp

Leu Asn Leu

175

Ser Pro Asp

190

Gly

Pro

Arg

Glu

Thr 80

Glu

Val

Lys

Tyr

Ile 160

Thr

Phe

- 38 045463

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val

195 200

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala

210 215

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly

225 230

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr

245 250

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe

260 265

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe

275 280

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn

290 295

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys

305 310

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys

325 330

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr

340 345

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn

355 360

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile

370 375

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn

385 390

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn

405 410

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr

420 425

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu

435 440

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn

450 455

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp

Thr Asn Pro Leu Leu

205

Thr Leu Ala His Glu 220

Ala Ile Asn Pro Asn

240

Glu Met Ser Gly Leu

255

Gly His Asp Ala Lys

270

Leu Tyr Tyr Tyr Asn

285

Ala Lys Ser Ile Val 300

Val Phe Lys Glu Lys

320

Ser Val Asp Lys Leu

335

Ile Tyr Thr Glu Asp

350

Lys Thr Tyr Leu Asn

365

Pro Lys Val Asn Tyr 380

Asn Leu Ala Ala Asn

400

Asn Phe Thr Lys Leu

415

Leu Leu Cys Val Arg 430

Lys Gly Tyr Asn Lys

445

Trp Asp Leu Phe Phe 460

Asn Lys Gly Glu Glu

- 39 045463

465

Ile

Asp

Glu

Leu 545

His

Leu

Lys

Gln

Asp 625

Leu

Ile

Val

Lys 705

Val

Glu

470

475

480

Thr Ser Asp Thr Asn

485

Leu Ile Gln Gln Tyr 500

Asn Ile Ser Ile Glu

515

Leu Met Pro Asn Ile 530

Asp Lys Tyr Thr Met

550

Gly Lys Ser Arg Ile

565

Asn Pro Ser Arg Val 580

Val Asn Lys Ala Thr

595

Leu Val Tyr Asp Phe 610

Lys Ile Ala Asp Ile

630

Asn Ile Gly Asn Met

645

Phe Ser Gly Ala Val 660

Pro Val Leu Gly Thr

675

Leu Thr Val Gln Thr 690

Trp Asp Glu Val Tyr

710

Asn Thr Gln Ile Asp

725

Asn Gln Ala Glu Ala

740

Ile Glu Ala Ala Glu

490

Tyr Leu Thr Phe Asn

505

Asn Leu Ser Ser Asp 520

Glu Arg Phe Pro Asn 535

Phe His Tyr Leu Arg

555

Ala Leu Thr Asn Ser

570

Tyr Thr Phe Phe Ser

585

Glu Ala Ala Met Phe

600

Thr Asp Glu Thr Ser 615

Thr Ile Ile Ile Pro

635

Leu Tyr Lys Asp Asp

650

Ile Leu Leu Glu Phe

665

Phe Ala Leu Val Ser

680

Ile Asp Asn Ala Leu 695

Lys Tyr Ile Val Thr

715

Leu Ile Arg Lys Lys

730

Thr Lys Ala Ile Ile 745

Glu Asn Ile Ser Leu

495

Phe Asp Asn Glu Pro 510

Ile Ile Gly Gln Leu

525

Gly Lys Lys Tyr Glu 540

Ala Gln Glu Phe Glu

560

Val Asn Glu Ala Leu

575

Ser Asp Tyr Val Lys 590

Leu Gly Trp Val Glu 605

Glu Val Ser Thr Thr 620

Tyr Ile Gly Pro Ala

640

Phe Val Gly Ala Leu

655

Ile Pro Glu Ile Ala

670

Tyr Ile Ala Asn Lys 685

Ser Lys Arg Asn Glu 700

Asn Trp Leu Ala Lys

720

Met Lys Glu Ala Leu

735

Asn Tyr Gln Tyr Asn 750

- 40 045463

Gln

Leu

Asn 785

Ile

Asp

Gln

Ile

Thr 865

Leu

Lys

Gln

Lys

Phe 945

Glu

Ser

Ile

Asp

Leu

Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

790 795 800

Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

870 875 880

Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

950 955 960

Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Lys Gln Arg Val Val

995

Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

1000 1005

Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

- 41 045463

1025

1030

1035

Lys

Pro 1040

Ile

Ser

Asn

Leu

Gly 1045

Asn

Ile

His

Ala

Ser 1050

Asn

Ile

Met

Phe 1055

Lys

Leu

Asp

Gly

Cys 1060

Arg

Asp

Thr

His

Arg 1065

Tyr

Ile

Trp

Ile

Lys 1070

Tyr

Phe

Asn

Leu

Phe 1075

Asp

Lys

Glu

Leu

Asn 1080

Glu

Lys

Glu

Ile

Lys 1085

Asp

Leu

Tyr

Asp

Asn 1090

Gln

Ser

Asn

Ser

Gly 1095

Ile

Leu

Lys

Asp

Phe 1100

Trp

Gly

Asp

Tyr

Leu 1105

Gln

Tyr

Asp

Lys

Pro 1110

Tyr

Met

Leu

Asn 1115

Leu

Tyr

Asp

Pro

Asn 1120

Lys

Tyr

Val

Asp

Val 1125

Asn

Val

Gly

Ile 1130

Arg

Gly

Tyr

Met

Tyr 1135

Leu

Lys

Gly

Pro

Arg 1140

Gly

Ser

Val

Met

Thr 1145

Thr

Asn

Ile

Tyr

Leu 1150

Asn

Ser

Leu

Tyr 1155

Arg

Gly

Thr

Lys

Phe 1160

Ile

Lys

Tyr 1165

Ala

Ser

Gly

Asn

Lys 1170

Asp

Asn

Ile

Val

Arg 1175

Asn

Asp

Arg

Val 1180

Tyr

Ile

Asn

Val

Val 1185

Val

Lys

Asn

Lys

Glu 1190

Tyr

Arg

Leu

Ala

Thr 1195

Asn

Ala

Ser

Gln

Ala 1200

Gly

Val

Glu

Lys

Ile 1205

Leu

Ser

Ala

Leu

Glu 1210

Ile

Pro

Asp

Val

Gly 1215

Asn

Leu

Ser

Gln

Val 1220

Val

Met

Lys

Ser 1225

Lys

Asn

Asp

Gln

Gly 1230

Ile

Thr

Asn

Lys

Cys 1235

Lys

Met

Asn

Leu

Gln 1240

Asp

Asn

Gly

Asn 1245

Asp

Ile

Gly

Phe

Ile 1250

Gly

Phe

His

Gln

Phe 1255

Asn

Ile

Ala

Lys 1260

Leu

Val

Ala

Ser

Asn 1265

Trp

Tyr

Asn

Arg

Gln 1270

Ile

Glu

Arg

Ser

Ser 1275

Arg

Thr

Leu

Gly

Cys 1280

Ser

Trp

Glu

Phe

Ile 1285

Pro

Val

Asp

Gly 1290

Trp

Gly

Glu

-

Claims

Arg Pro Leu 1295 <210> 9 <211> 23 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> линкер LHN <400>9

Val Arg Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr

1 5 1015

Asn Lys Ala Leu Asn Asp Leu <210>10 <211>5 < 212> Белок < 213> Homo sapiens <400>10

Asp Asp Asp Asp Lys 15 <210>11 <211>23 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

<223>

Модифицированная петля активации BoNT/A1 <400> 11

Val Asp Gly Ile 1

Ile Thr Ser Lys Thr Lys

Ser Asp Asp Asp Asp Lys

Asn Lys Ala Leu Asn Leu Gln

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Модифицированная протеаза L-цепи ботулинического нейротоксина A (BoNT/A), которая демонстрирует расщепление человеческого SNAP-23 (hSNAP-23) с повышенной эффективностью по сравнению с L-цепью BoNT дикого типа (SEQ ID NO: 1), имеющая модифицированную аминокислотную последовательность по сравнению с L-цепью BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая содержит:

a) по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка, расположенного в первом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A для связывания с сайтом связывания P182/D178 hSNAP-23;

b) где указанный первый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

c) и где указанная, по меньшей мере, одна замена аминокислотного остатка включает аминокислоту тирозин в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку E148 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).
2. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по п.1, дополнительно содержащая:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного во втором связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D189/D192 hSNAP-23;

b) где указанный второй связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокис-

- 43 045463 лотным остатком Q29 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

c) и где указанная замена аминокислотного остатка включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Q29 L-цепи BoNT А дикого типа (SEQ ID NO: 1).
3. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по п.1 или 2, дополнительно содержащая:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в третьем связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания I198 hSNAP-23;

b) где указанный третий связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком K166 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

c) и где указанная замена аминокислотного остатка включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из фенилаланина и валина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку K166 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).
4. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая:

a) по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка, расположенного в четвертом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания K185 hSNAP-23;

b) где указанный четвертый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

c) и где указанная, по меньшей мере, одна замена аминокислотного остатка включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку G305 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).
5. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в пятом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания R186 hSNAP-23;

b) где указанный пятый связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

c) и где указанная замена аминокислотного остатка включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамина, глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку S143 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).
6. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая:

a) по меньшей мере, одну замену аминокислотного остатка, расположенного в шестом связывающем кармане протеазы L-цепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания K206 hSNAP-23;

b) где указанный шестой связывающий карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

c) и где указанная, по меньшей мере, одна замена аминокислотного остатка включает в себя:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутамата и аспартата, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку Y251 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).
7. Модифицированная протеаза L-цепи BoNT/A по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая:

a) замену аминокислотного остатка, расположенного в седьмом связывающем кармане протеазы Lцепи BoNT/A, для связывания с сайтом связывания D210 hSNAP-23;

b) где указанный связывающий седьмой карман протеазы L-цепи BoNT/A определяется аминокислотным остатком S254 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1);

c) и где указанная замена аминокислотного остатка включает:

i) аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, в положении в модифицированной аминокислотной последовательности протеазы L-цепи, которое соответствует аминокислотному остатку S254 L-цепи BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 1).
8. Вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированную протеазу L-цепи BoNT/A по любому из предшествующих пунктов.
9. Средство доставки, содержащее:

a) модифицированную протеазу L-цепи BoNT/A по любому из пп.1-7 или вектор по п.8; и

b) средство для доставки указанной модифицированной протеазы L-цепи BoNT/A или указанного вектора в клетку-мишень, где средство b) для доставки указанной модифицированной протеазы L-цепи BoNT/A в клетку-мишень содержит:

i) нацеливающий фрагмент, который связывает средство доставки с клеткой-мишенью; и

-