JP2012518403A - 改変非細胞毒性プロテアーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
a.SNAREタンパク質を切断可能な非細胞毒性プロテアーゼと、
b.哺乳動物細胞のエンドソームの中から、エンドソーム膜を横切って、哺乳動物細胞のサイトゾル中に非細胞毒性プロテアーゼを転位可能な転位ドメインと、
c.第2プロテアーゼにより切断可能であるが非細胞毒性プロテアーゼにより切断可能でない第1破壊性切断部位と、
d.エンドサイトーシスを受けて、哺乳動物ニューロン内のエンドソーム中に組み込まれることが可能である、哺乳動物ニューロン上に存在する結合部位と結合するターゲティング部分(TM)と
を含むポリペプチドであって、
第2プロテアーゼによるその切断後に、上記のSNAREタンパク質を切断する能力の低下及び/又はエンドソーム膜を横切って上記の非細胞毒性プロテアーゼを転位させる能力の低下により測定可能な効力の低下を有し、
e.上記の第1破壊性切断部位が、上記のTM内にないことを条件とする
ポリペプチドを提供する。
A型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(Y1111〜L1296)
B型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(Y1098〜E1291)
C型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(Y1112〜E1291)
D型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(Y1099〜E1276)
E型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(Y1086〜K1252)
F型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(Y1106〜E1274)
G型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(Y1106〜E1297)
破傷風神経毒−アミノ酸残基(Y1128〜D1315)。
本発明のポリペプチドは、4つの主要な構成要素、すなわちTMと、非細胞毒性プロテアーゼと、転位ドメインと、破壊性プロテアーゼ切断部位とを含む。上記のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒などの非細胞毒性ホロトキシンと、外因性TMが存在する場合に、再ターゲティングされたキメラ(再ターゲティングされたプロテアーゼとしばしばよばれる)とを包含する。これらの分子の調製は、従来のものである。例えば、我々は、国際公開第94/21300号パンフレット;国際公開第96/33273号パンフレット;国際公開第98/07864号パンフレット;国際公開第00/10598号パンフレット;国際公開第01/21213号パンフレット;国際公開第06/059093号パンフレット;国際公開第00/62814号パンフレット;国際公開第00/04926号パンフレット;国際公開第93/15766号パンフレット;国際公開第00/61192号パンフレット;及び国際公開第99/58571号パンフレットを参照する。これらの公報の全ては、それらを参照することにより本明細書に組み込まれる。
NH2−[プロテアーゼ構成要素]−[転位構成要素]−[TM]−COOH
エンテロキナーゼ(DDDDK↓)
第Xa因子(IEGR↓/IDGR↓)
タバコエッチ病ウイルス(TEV、Tobacco Etch virus)(ENLYFQ↓G)
トロンビン(LVPR↓GS)
PreScission(LEVLFQ↓GP)。
好ましくはC末端及び/又はN末端タグとしてのHisタグ(例えば6×ヒスチジン)
好ましくはN末端タグとしてのマルトース結合タンパク質(MBP、maltose binding protein)タグ
好ましくはN末端タグとしてのグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST、glutathione-S-transferase)タグ
好ましくはN末端タグとしてのHis−MBPタグ
好ましくはN末端タグとしてのGST−MBPタグ
好ましくはN末端タグとしてのチオレドキシンタグ
好ましくはN末端タグとしてのキチン結合ドメイン(CBD、Chitin Binding Domain)タグ。
使用において、本発明は、ポリペプチドを、薬学的に許容される担体、賦形剤、アジュバント、噴射剤及び/又は塩から選択される少なくとも1つの構成要素と一緒に含む医薬組成物を採用する。
ターゲティング部分(TM)は、結合部位と機能的に相互作用して、本発明のポリペプチドと標的細胞の表面との間の物理的会合をもたらす任意の化学構造を意味する。TMとの用語は、標的細胞上の結合部位と結合可能な任意の分子(すなわち天然に存在する分子、又は化学的/物理的に改変されたそのバリアント)を包含し、この結合部位は、内在化されることが可能である(例えばエンドソーム形成)。このことは、受容体媒介飲食作用ともよばれる。TMは、エンドソーム膜転位機能を有してよく、この場合、別々のTMと転位ドメイン構成要素とが、本発明の物質中に存在する必要はない。上記の記載を通して、具体的なTMについて記載した。上記のTMについての言及は単に例示のためであり、本発明は、例示されるTMの基本的な結合(すなわちターゲティング)能力を保持するその全てのバリアント及び誘導体を包含する。
(i)プロテインAに基づくスカフォールド−アフィボディ(Nord, K. et al 1997 "Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain". Nat Biotechnol 15, 772-777);
(ii)リポカリンに基づくスカフォールド−アンチカリン(Skerra 2008 "Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities". FEBS J. 275:2677-83);
(iii)フィブロネクチンに基づくスカフォールド−アドネクチン(Dineen et al 2008 "The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer". BMC Cancer 8:352);
(iv)アビマー(Silverman et al 2005 "Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains". Nat Biotechnol 23:1556-61);
(v)アンキリンに基づくスカフォールド−ダルピン(darpin)(Zahnd et al 2006 "Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins". J Biol Chem. 281:35167-75);及び
(vi)センチリン(centyrin)スカフォールド−CDRと相似するループを有するIgドメインとの著しい構造的相同性を有するタンパク質折り畳みに基づく。Igドメインは、ヒトタンパク質における共通したモジュールであり、代替スカフォールドタンパク質として広く用いられている。上記のそれぞれの「スカフォールド」出版物は、それらを参照することにより(その全体が)本明細書に組み込まれる。
β−Nal=β−ナフチルアラニン
β−Pal=β−ピリジルアラニン
hArg(Bu)=N−グアニジノ−(ブチル)−ホモアルギニン
hArg(Et)2=N,N’−グアニジノ−(ジメチル)−ホモアルギニン
hArg(CH2CF3)2=N,N’−グアニジノ−ビス−(2,2,2,−トリフルオロエチル)−ホモアルギニン
hArg(CH3,ヘキシル)=N,N’−グアニジノ−(メチル,ヘキシル)−ホモアルギニン
Lys(Me)=Ne−メチルリジン
Lys(iPr)=Ne−イソプロピルリジン
AmPhe=アミノメチルフェニルアラニン
AChxAla=アミノシクロヘキシルアラニン
Abu=α−アミノ酪酸
Tpo=4−チアプロリン
MeLeu=N−メチルロイシン
Orn=オルニチン
Nle−ノルロイシン
Nva=ノルバリン
Trp(Br)=5−ブロモ−トリプトファン
Trp(F)=5−フルオロ−トリプトファン
Trp(NO2)=5−ニトロ−トリプトファン
Gaba=γ−アミノ酪酸
Bmp=J−メルカプトプロピオニル
Ac=アセチル
Pen−ペンシラミン
A型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(1〜448)
B型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(1〜440)
C型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(1〜441)
D型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(1〜445)
E型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(1〜422)
F型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(1〜439)
G型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(1〜441)
破傷風神経毒−アミノ酸残基(1〜457)
IgAプロテアーゼ−アミノ酸残基(1〜959)*
*Pohlner, J. et al. (1987). Nature 325, pp. 458-462(これは、それを参照することにより本明細書に組み込まれる)。
A型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(M1〜K448)
B型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(M1〜K441)
C型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(M1〜K449)
D型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(M1〜R445)
E型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(M1〜R422)
F型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(M1〜K439)
G型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(M1〜K446)
破傷風神経毒−アミノ酸残基(M1〜A457)
A型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(449〜871)
B型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(441〜858)
C型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(442〜866)
D型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(446〜862)
E型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(423〜845)
F型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(440〜864)
G型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(442〜863)
破傷風神経毒−アミノ酸残基(458〜879)
A型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(A449〜K871)
B型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(A442〜S858)
C型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(T450〜N866)
D型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(D446〜N862)
E型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(K423〜K845)
F型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(A440〜K864)
G型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(S447〜S863)
破傷風神経毒−アミノ酸残基(S458〜V879)
A型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(872〜1110)
B型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(859〜1097)
C型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(867〜1111)
D型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(863〜1098)
E型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(846〜1085)
F型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(865〜1105)
G型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(864〜1105)
破傷風神経毒−アミノ酸残基(880〜1127)
A型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(874〜1110)
B型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(861〜1097)
C型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(869〜1111)
D型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(865〜1098)
E型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(848〜1085)
F型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(867〜1105)
G型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(866〜1105)
破傷風神経毒−アミノ酸残基(882〜1127)
A型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(449〜1110)
B型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(442〜1097)
C型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(450〜1111)
D型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(446〜1098)
E型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(423〜1085)
F型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(440〜1105)
G型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基(447〜1105)
破傷風神経毒−アミノ酸残基(458〜1127)
それらに限定されないが、全体法、局限法及び例えばセグメントアプローチ法などのハイブリッド法を含む多様な配列アラインメント法のいずれを用いても、パーセント同一性を決定できる。パーセント同一性を決定するためのプロトコルは、当業者の範囲内の慣例の手順である。全体法は、分子の最初から最後までの配列を整列させて、個別の残基対のスコアを加算し、ギャップペナルティを課すことにより最適アラインメントを決定する。非限定的な方法は、例えばCLUSTAL W(例えばJulie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照されたい)、及び反復精密化(例えばOsamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)を参照されたい)を含む。局限法は、入力配列の全てが共有する1又は2以上の保存されたモチーフを同定することにより配列を整列させる。非限定的な方法は、例えばマッチボックス(例えばEric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992)を参照されたい)、ギブスサンプリング(例えばC. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)を参照されたい)、Align−M(例えばIvo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)を参照されたい)を含む。
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A 4
R -1 5
N -2 0 6
D -2 -2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
E -1 0 0 2 -4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
(同一マッチの合計数)/[長いほうの配列の長さ+2つの配列を整列させるために長いほうの配列に導入したギャップの数]×100
塩基性:アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性:グルタミン酸
アスパラギン酸
極性:グルタミン
アスパラギン
疎水性:ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族:フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型:グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン
実施例2−本発明のポリペプチドを循環性プロテアーゼにまず曝露し、哺乳動物細胞に曝露した場合の該ポリペプチドの評価。
実施例3−本発明のポリペプチドの触媒活性の評価。
実施例4−本発明のポリペプチドの転位能力の評価。
実施例5−LC中に第Xa因子認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例6−LC中に第Xa因子認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質の精製。
実施例7−LC中に第Xa因子認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質におけるプロテアーゼ感受性の増進の証明。
実施例8−LC中にトロンビン認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例9−LC中にトロンビン認識部位を組み込んだLHA−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例10−LC中にフューリン認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例11−HNドメイン中に第Xa因子認識部位を組み込んだLHA−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例12−LCドメイン中にADAM17認識部位を組み込んだLHA−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例13−LCドメイン中にADAM17認識部位を組み込んだ組換えBoNT/Aタンパク質の創出。
実施例14−HN中にフューリン認識部位を組み込んだ組換えBoNT/Aタンパク質の創出。
実施例15−ジストニア(痙攣性斜頚)を患う患者の治療。
実施例16−眼瞼痙攣を患う患者の治療。
実施例17−LC中の210位に第Xa因子認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例18−LC中の195位にトロンビン認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例19−LC中の210位にトロンビン認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例20−HNの742位にてHNドメイン中に第Xa因子認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例21−HNの750位にてHNドメイン中に第Xa因子認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例22−HNの750位にてHNドメイン中にトロンビン認識部位を組み込んだLHC−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例23−HNの798位にてHNドメイン中に第Xa因子認識部位を組み込んだLHD−VIPrキメラタンパク質の創出。
実施例24−LCドメイン中にトロンビン認識部位を組み込んだLHA−EGFキメラタンパク質の創出。
実施例25−LC中に第Xa因子認識部位を組み込むように工学的に操作された精製LHC−EGFキメラタンパク質の特異的切断の証明。
実施例26−HN中に第Xa因子認識部位を組み込むように工学的に操作された精製LHC−EGFキメラタンパク質の特異的切断の証明。
実施例27−LC中にトロンビン認識部位を組み込むように工学的に操作された精製LHC−EGFキメラタンパク質の特異的切断の証明。
実施例28−LC中にトロンビン認識部位を組み込むように工学的に操作された精製LHA−EGFキメラタンパク質の特異的切断の証明。
実施例29−L(FXa)HC−EGFのLCドメイン中に第Xa因子プロテアーゼ切断部位を組み込むように工学的に作製されたタンパク質のインビトロ細胞活性の低減の証明。
実施例30−L(Thr)HA−EGFのLCドメイン中にトロンビンプロテアーゼ切断部位を組み込むように工学的に作製されたタンパク質のインビトロ細胞活性の低減の証明。
実施例31−LC中にトロンビン認識部位を組み込んだ組換えBoNT/Aタンパク質の創出。
実施例32−LC中に第Xa因子認識部位を組み込んだ組換えBoNT/Aタンパク質の創出。
実施例33−HN中に第Xa因子認識部位を組み込んだ組換えBoNT/Aタンパク質の創出。
実施例34−LC中にトロンビン認識部位を組み込んだ組換えBoNT/Eタンパク質の創出。
実施例35−HN中に第Xa因子認識部位を組み込んだ組換えBoNT/Eタンパク質の創出。
実施例36−LC中にトロンビン認識部位を組み込んだLHE−VIPrキメラタンパク質の創出。
実施例37−HN中に第Xa因子認識部位を組み込んだLHE−VIPrキメラタンパク質の創出。
実施例38−LC中に第Xa因子認識部位を組み込んだLHE−VIPrキメラタンパク質の創出。
実施例39−LIN, et al.(国際公開第02/044199号パンフレット)に記載される特性を有する改変クロストリジウム神経毒(LHN)によるSNAREタンパク質の切断。
配列番号1 LHC−EGFのDNA配列
配列番号2 LHC−EGFのタンパク質配列
配列番号3 L(#FXa)HC−EGFのDNA配列
配列番号4 L(#FXa)HC−EGFのタンパク質配列
配列番号5 L(#Thr)HC−EGFのDNA配列
配列番号6 L(#Thr)HC−EGFのタンパク質配列
配列番号7 LHA−EGFのDNA配列
配列番号8 LHA−EGFのタンパク質配列
配列番号9 L(#Thr)HA−EGFのDNA配列
配列番号10 L(#Thr)HA−EGFのタンパク質配列
配列番号11 L(#フューリン)HC−EGFのDNA配列
配列番号12 L(#フューリン)HC−EGFのタンパク質配列
配列番号13 LH(#FXa)A−EGFのDNA配列
配列番号14 LH(#FXa)A−EGFのタンパク質配列
配列番号15 L(#ADAM17)HA−EGFのDNA配列
配列番号16 L(#ADAM17)HA−EGFのタンパク質配列
配列番号17 LHA−HC/AのDNA配列
配列番号18 LHA−HC/Aのタンパク質配列
配列番号19 L(#ADAM17)HA−HC/AのDNA配列
配列番号20 L(#ADAM17)HA−HC/Aのタンパク質配列
配列番号21 L(#フューリン)HA−HC/AのDNA配列
配列番号22 L(#フューリン)HA−HC/Aのタンパク質配列
配列番号23 L(#FXa)HC−EGF(SXN1975)のDNA配列
配列番号24 L(#FXa)HC−EGF(SXN1975)のタンパク質配列
配列番号25 L(#Thr)HC−EGF(SXN1931)のタンパク質配列
配列番号26 L(#Thr)HC−EGF(SXN1932)のタンパク質配列
配列番号27 LH(#FXa)C−EGF(SXN1937)のタンパク質配列
配列番号28 LH(#FXa)C−EGF(SXN1938)のタンパク質配列
配列番号29 LH(#Thr)C−EGF(SXN1939)のタンパク質配列
配列番号30 LH(#FXa)D−VIPr(SXN1930)のタンパク質配列
配列番号31 L(#Thr)HA−EGF(SXN1974)のタンパク質配列
配列番号32 L(#Thr)HA−HC/Aのタンパク質配列
配列番号33 L(#FXa)HA−HC/Aのタンパク質配列
配列番号34 LH(FXa)A−HC/Aのタンパク質配列
配列番号35 L(#Thr)HE−HC/Eのタンパク質配列
配列番号36 LH(#FXa)E−HC/Eのタンパク質配列
配列番号37 L(#Thr)HE−VIPrのタンパク質配列
配列番号38 LH(#FXa)E−VIPrのタンパク質配列
配列番号39 L(#FXa)HE−VIPr(K228Dでの変異)のタンパク質配列
[実施例]
実施例13に従って創出した精製タンパク質を、哺乳動物筋細胞(冠血管平滑筋初代培養又はHSkMC(150−05f)細胞(ECACCから入手可能))の存在下でインキュベートする。並行して、第2ポリペプチド(同じ破壊性切断部位を欠くこと以外は第1ポリペプチドと同一)を、同じ被検細胞タイプの存在下で同一条件下にてインキュベートする。
本発明の実施例5に従って調製した第1ポリペプチド(配列番号4)を取り、まずポリペプチドを循環性プロテアーゼ(例えば第Xa因子、トロンビン)にインビトロで曝露して、標的細胞の存在下でインキュベートする。並行して、第2ポリペプチド(配列番号2;プロテアーゼ切断部位を欠くこと以外は第1ポリペプチドと同一)を、第1ポリペプチドと同じ様式でインキュベートする。
第1ポリペプチド(配列番号10;本発明の実施例9に従って調製)を、インビトロで、ポリペプチドのプロテアーゼドメインに導入された破壊性切断部位にてポリペプチドを切断するプロテアーゼ(トロンビン)の存在下でインキュベートする。並行して、第2ポリペプチド(配列番号8:プロテアーゼ切断部位を欠くこと以外は第1ポリペプチドと同一)を、同じプロテアーゼの存在下にて同一様式でインキュベートする。
第1ポリペプチド(本発明による)を、転位(例えばHN)ドメインに導入された破壊性切断部位にてポリペプチドを切断するプロテアーゼの存在下でインキュベートする。並行して、第2ポリペプチド(プロテアーゼ切断部位を欠くこと以外は第1ポリペプチドと同一)を、同じプロテアーゼの存在下にて同一様式でインキュベートする。
BoNT/CのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号2)を、第Xa因子についての基本形の認識部位(IEGR)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、LCドメイン中に配列210GEGR213が同定された。LC/Cの3次構造内のペプチドの位置は、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)を手引きとして用いるLC/A中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LC/A等価ペプチド配列が、LCの表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
実施例17で創出したORFを、大腸菌発現ベクター(動員欠損を確実にするように改変されたpET(Novagen社製)ベクター)にクローニングし、大腸菌宿主株、最も一般的にはBL21を形質転換した。ベクターを改変して、LHC−EGF ORFのN末端にてヒスチジンタグの発現を含めた。
実施例6の精製キメラタンパク質を、プロテアーゼの存在下でのその安定性について、実施例2及び3に概説した方法を用いて評価する。まとめると、LHC−EGFキメラタンパク質を、一連の濃度の第Xa因子プロテアーゼ(例えばNew England Biolabs社製、#P8010Lから得る)に、インビトロにて1〜120分の期間にわたって曝露する。タンパク質分解を、第Xa因子の特異的阻害物質(例えばダンシル−glu−gly−arg−クロロメチルケトン(CALBIOCHEM社製、#251700))の添加により終結させる。さらなる第Xa因子部位を含まないLHC−EGFの対照タンパク質キメラを用いて、LC活性に対するプロテアーゼの影響(実施例3を用いる)、及び標的細胞に曝露した場合のキメラの機能性(実施例2を用い、且つ胚性脊髄ニューロン(eSCN)におけるシンタキシン切断を測定する)を比較する。
BoNT/CのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号2)を、トロンビンについての基本形の認識部位(LVPRGS)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、LCドメイン中に配列194ISPRFM199が同定された。LC/Cの3次構造内のペプチドの位置は、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)を手引きとして用いるLC/A中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LC/A等価ペプチド配列が、LCの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/AのLHNフラグメントとEGF配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号8)を、トロンビンについての基本形の認識部位(GRG)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、LCドメイン中に配列103GRM105が同定された。LC/Aの3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのBoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LC/Aペプチド配列が、表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/CのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号2)を、フューリンについての基本形の認識部位(RXR▼K/R)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、LCドメイン中に配列210GEGR213が同定された。LC/Cの3次構造内のペプチドの位置は、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)を手引きとして用いるLC/A中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LC/A等価ペプチド配列が、LCの表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/AのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号8)を、第Xa因子についての基本形の認識部位(IEGR)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、HNドメイン中に配列562GKSR565が同定された。HN/Aの3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのBoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、HNペプチド配列が、表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/AのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号8)を、ADAM17についての基本形の認識部位(PLAQAVRSSS)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適する構造の領域(LCドメイン中の206PLLGAGKFAT215)が同定される。LCの3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのBoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LCペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。
エンテロキナーゼに特異的な工学的に操作された活性化プロテアーゼ部位を含有する組換えエンドペプチダーゼ活性BoNT/Aの1次配列(配列番号18)を、ADAM17についての基本形の認識部位(PLAQAVRSSS)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するBoNT構造の領域(LCドメイン中の206PLLGAGKFAT215)が同定される。LCの3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのBoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LCペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。
エンテロキナーゼに特異的な工学的に操作された活性化プロテアーゼ部位を含有する組換えエンドペプチダーゼ活性BoNT/Aの1次配列(配列番号18)を、フューリンについての基本形の認識部位(RXR▼K/R)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するHNドメイン内の配列563KSR565が同定された。HNドメインの3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのBoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、HNペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。
頚部筋系の痙攣性又は強直性の収縮により顕在化され、頭部の常同的な異常偏位を生じ、頤が片側に回転し、頭部が回転している側に向かって肩部が上昇している痙攣性斜頚を患う男性は、斜頚のために頚筋への治療上有効な量のBoNT/Aを用いて以前に処置されたが、中咽頭内へのプロテアーゼの拡散のために、嚥下障害を発現した。患者は、ジストニアの頚筋への、約300単位まで又はそれより多い本発明のポリペプチド(例えば第Xa因子プロテアーゼ感受性部位を含むように改変されたA型ボツリヌス毒素神経毒)の注射により、その後処置される。3〜7日後に、症状は実質的に緩和され、患者は、頭部及び肩部を正常な位置に少なくとも3カ月保持することができる。改変神経毒での処置の後に、患者は、嚥下障害を経験しない。改変A型ボツリヌス毒素を用いることにより、医師は、副作用の増加の恐れなく、治療を必要とする領域により多量の製品を注射できる。用量の増進は、作用の持続期間を増進し、よって、治療を改善する。
眼瞼痙攣を患う58歳の女性を、上眼瞼の外側瞼板前部眼輪筋及び下眼瞼の外側瞼板前部眼輪筋への、約1〜約5単位の本発明のポリペプチド(例えば実施例13に記載されるようなADAM17プロテアーゼ感受性部位を含むように改変されたA型ボツリヌス毒素神経毒)の注射により処置し、注射する量は、注射される筋肉のサイズ及び所望の筋肉麻痺の程度の両方に基づいて変動する。眼瞼痙攣の緩和は、約1〜約7日に生じる。改変A型ボツリヌス毒素を用いることにより、医師は、副作用の増加の恐れなく、治療を必要とする領域により多量の製品を注射できる。用量の増進は、作用の持続期間を増進し、よって、治療を改善する。
BoNT/CのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号2)を、第Xa因子についての基本形の認識部位(IEGR)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。第Xa因子部位の挿入部位は、LCドメイン内の1次配列210GEGRに同定される。LC/Cの3次構造内のペプチドの位置は、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)を手引きとして用いるLC/A中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LC/A等価ペプチド配列が、LCの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/CのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号2)を、トロンビンについての基本形の認識部位との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。トロンビン部位の挿入部位は、LCドメイン内の1次配列194ISPRFM199に同定される。LC/Cの3次構造内のペプチドの位置は、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)を手引きとして用いるLC/A中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LC/A等価ペプチド配列が、LCの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/CのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号2)を、トロンビンについての基本形の認識部位との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。トロンビン部位の挿入部位は、LCドメイン内の1次配列210GEGRFSに同定される。LC/Cの3次構造内のペプチドの位置は、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)を手引きとして用いるLC/A中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LC/A等価ペプチド配列が、LCの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/CのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号2)を詳しく調査し、第Xa因子部位の挿入のための部位を、HNドメイン中の1次配列742IDLE755に同定する。HN/Cの3次構造内のペプチドの位置は、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)を手引きとして用いるHN/A中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、HN/A等価ペプチド配列が、HNの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/CのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号2)を詳しく調査し、第Xa因子部位の挿入のための部位を、HNドメイン中の1次配列750SGSD753に同定する。HN/Cの3次構造内のペプチドの位置は、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)を手引きとして用いるHN/A中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、HN/A等価ペプチド配列が、HNの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/CのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号2)を詳しく調査し、トロンビン部位の挿入のための部位を、HNドメイン中の1次配列750SGSD753に同定する。HN/Cの3次構造内のペプチドの位置は、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)を手引きとして用いるHN/A中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、HN/A等価ペプチド配列が、HNの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/DのLHNフラグメントと、ヒト血管作用性小腸ペプチドのアナログ(VIPr)の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列を詳しく調査し、第Xa因子部位の挿入のための部位を、HNドメイン中の1次配列798SGSDに同定する。HN/Dの3次構造内のペプチドの位置は、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)を手引きとして用いるHN/A中の相同ペプチド配列の位置の調査から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、HN/A等価ペプチド配列が、HNの表面付近にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/AのLHNフラグメントとヒト上皮成長因子配列の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列(配列番号8)を、トロンビンについての基本形の認識部位(GRG)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、LCドメイン中に配列103GRM105が同定された。LCの3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのBoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LCペプチド配列が、表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
LHC−EGFのLC中に第Xa因子認識部位を組み込んだ新規な分子を、実施例17に従って構築する。実施例6に記載するものと同様の方法を用いて、実施例17のタンパク質を発現させて精製する。方法は、AKTA Xpress精製システムでの使用のために適合させた。本質的に、清澄化した大腸菌可溶化液を、Xpressシステム上の5mlのHisTrap FF Crudeカラムにアプライした。プログラムを、10カラム容量の結合緩衝液(50mM Tris pH8.0、200mM NaCl)及び10カラム容量の結合緩衝液中の40mMイミダゾールでカラムを洗浄するように設定した(一緒に通過画分で回収した)。溶出は、5カラム容量の結合緩衝液中の250mMイミダゾールを用いた。タンパク質をループ中に回収し、システムを脱塩する準備ができるまで保持した(50mM Tris pH8.0、150mM NaCl中で)。脱塩されたタンパク質を、2ml 96ウェルプレート中に回収した。図3は、大腸菌からのLHC−EGFの精製を示す。
LHC−EGFのHN中に第Xa因子認識部位を組み込んだ新規な分子を、実施例20に従って構築し、LHC−EGFのHN中の異なる位置に第Xa因子認識部位を組み込んだ第2の新規な分子を、実施例21に従って構築する。実施例24に記載するものと同様の方法を用いて、実施例20及び21のタンパク質を発現させて精製する。図5は、大腸菌からの実施例20のLHC−EGFの精製を示し、図6は、大腸菌からの実施例21のLHC−EGFの精製を示す。
LHC−EGFのLC中にトロンビン認識部位を組み込んだ新規な分子を、実施例19に従って構築する。実施例25に記載するものと同様の方法を用いて、実施例19のタンパク質を発現させて精製する。図10は、大腸菌からのLHC−EGFの精製を示す。
LHA−EGFのLC中に第Xa因子認識部位を組み込んだ新規な分子を、実施例24に従って構築する。実施例25に記載するものと同様の方法を用いて、実施例24のタンパク質を発現させて精製する。図13は、大腸菌からのLHA−EGFの精製を示す。
実施例25のタンパク質生成物を発現させて精製する。精製タンパク質を、FXaプロテアーゼに曝露した後に、インビトロ脊髄ニューロン(spinal cord neuron、SCN)アッセイにおいて評価する。SCNの調製は、十分に確立された技術であり、文献に記載されている[B.R. Ransom, E. Neale, M. Henkart, P.N. Bullock, P.G. Nelson, Mouse spinal cord in cell culture. I. Morphology and intrinsic neuronal electrophysiologic properties, J. Neurophysiol. 40 (1977) 1132-1150;S.C. Fitzgerald, A Dissection and Tissue Culture Manual of the Nervous System, Alan R. Liss Inc, New York, 1989]。被検タンパク質を、多様な濃度にて、培養培地中での希釈により調製する。SCNを、被検タンパク質に24時間曝露した後に培地を除去し、SDS−PAGE及びウェスタンブロッティングによる分析のための細胞材料を調製する。細胞タンパク質をNovex4〜20%Tris−グリシンポリアクリルアミドゲルで分離した後に、タンパク質をニトロセルロースに移し、その後、適切なSNAREタンパク質の存在について、商業的供給源から得た抗体を用いて調べる。この場合、抗体は、SNAREシンタキシンに特異的であった。
実施例24のタンパク質生成物を発現させて精製する。精製タンパク質を、トロンビンプロテアーゼに曝露した後に、インビトロ脊髄ニューロン(SCN)アッセイにおいて評価する。SCNの調製は、十分に確立された技術であり、文献に記載されている[B.R. Ransom, E. Neale, M. Henkart, P.N. Bullock, P.G. Nelson, Mouse spinal cord in cell culture. I. Morphology and intrinsic neuronal electrophysiologic properties, J. Neurophysiol. 40 (1977) 1132-1150;S.C. Fitzgerald, A Dissection and Tissue Culture Manual of the Nervous System, Alan R. Liss Inc, New York, 1989]。被検タンパク質を、多様な濃度にて、培養培地中での希釈により調製する。SCNを、被検タンパク質に24時間曝露した後に培地を除去し、SDS−PAGE及びウェスタンブロッティングによる分析のための細胞材料を調製する。細胞タンパク質をNovex4〜20%Tris−グリシンポリアクリルアミドゲルで分離した後に、タンパク質をニトロセルロースに移し、その後、適切なSNAREタンパク質の存在について、商業的供給源から得た抗体を用いて調べる。この場合、抗体は、SNARE SNAP−25に特異的であった。図17は、未処理L(Thr)HA−EGFと比較した、トロンビン処理L(Thr)HA−EGFによるSNAP−25切断を示す。
エンテロキナーゼに特異的な工学的に操作された活性化プロテアーゼ部位を含有する組換えエンドペプチダーゼ活性BoNT/Aの1次配列(配列番号18)を、トロンビンについての基本形の認識部位(GRG)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するLCドメイン内の配列103GRM105が同定された。HNドメインの3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのBoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、HNペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。
エンテロキナーゼに特異的な工学的に操作された活性化プロテアーゼ部位を含有する組換えエンドペプチダーゼ活性BoNT/Aの1次配列(配列番号18)を、第Xa因子についての基本形の認識部位(IEGR)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するLCドメイン内の配列IDSLが同定された。LCドメインの3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのBoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LCペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。
エンテロキナーゼに特異的な工学的に操作された活性化プロテアーゼ部位を含有する組換えエンドペプチダーゼ活性BoNT/Aの1次配列(配列番号18)を、第Xa因子についての基本形の認識部位(IEGR)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するHNドメイン内の配列562GKSR565が同定された。HNドメインの3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのBoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LCペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。
組換えエンドペプチダーゼ活性BoNT/Eの1次配列[ヌクレオチド受託番号AM695755;Uniprot番号A8Y867]を、トロンビンについての基本形の認識部位(LVPRGS)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、タンパク質工学に適するLCドメイン内の配列186FSPEYS191が同定された。HNドメイン中の3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのBoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばFirstGlance in Jmol(http://molvis.sdsc.edu/fgij/fg.htm?mol=3bta))を用いて、LCペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好である。
BoNT/Eの1次配列[ヌクレオチド受託番号AM695755;Uniprot番号A8Y867]を、第Xa因子認識ペプチドについての可能性のある挿入部位(IEGR)について詳しく調査する。BoNT/Eの1次配列の、BoNT/Aのものとの比較と、BoNT/AのX線結晶構造(pdb:3BTA)から予測されるHNドメインの3次構造内のペプチドの対応する位置とから、領域727TLEEが、IEGRへのタンパク質工学のために適すると結論付ける。
BoNT/EのLHNフラグメントと、ヒト血管作用性小腸ペプチドのアナログ(VIPr)の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列を、トロンビンについての基本形の認識部位(GRG)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。1次配列の単純な文字データ符号分析により、キメラのLCドメイン内に配列103GGI105が同定された。LC/Eの3次構造内のペプチドの位置は、手引きとしてのLC/EのX線結晶構造(pdb:1T3A)から予測する。無料で利用可能なソフトウェア(例えばJmol(http://www.rcsb.org/pdb/explore/jmol.do?structureId=1T3A&bionumber=1))を用いて、LCペプチド配列が表面上にあることを同定する。位置は、よって、プロテアーゼによる到達性が良好な領域である。
BoNT/EのLHNフラグメントと、血管作用性小腸ペプチドのアナログ(VIPr)の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列を、第Xa因子についての基本形の認識部位(IEGR)との類似性を有する一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。
BoNT/EのLHNフラグメント(変異基質認識ドメイン(K228D)を組み込んだ)と、ヒト血管作用性小腸ペプチドのアナログ(VIPr)の遺伝子融合により構築されたキメラタンパク質の1次配列を、タンパク質の表面上に露出され、第Xa因子についての基本形の認識部位(IEGR)と類似するように工学的に操作できる一連のアミノ酸の存在について詳しく調査する。
胚性脊髄ニューロンを、E15 Sprague Dawleyラットからの解剖により調製し、解離させた後にMatrigel被覆96ウェルプレートに、ウェル当たり125,000細胞にて培地(重炭酸ナトリウムで緩衝したMEM、5%不活化ウマ血清、0.6%D−グルコース、2%N1培地補充物、40ng/mlコルチコステロン、20ng/mlトリヨードチロニン)中で培養した。
Claims (13)
- a.SNAREタンパク質を切断可能な非細胞毒性プロテアーゼと、
b.哺乳動物細胞のエンドソームの中から、エンドソーム膜を横切って、前記哺乳動物細胞のサイトゾル中に前記非細胞毒性プロテアーゼを転位可能な転位ドメインと、
c.第2プロテアーゼにより切断可能であるが前記非細胞毒性プロテアーゼにより切断可能でない第1破壊性切断部位と、
d.エンドサイトーシスを受けて、神経筋接合部の神経細胞内のエンドソーム中に組み込まれることが可能である、前記神経細胞上の結合部位と結合するターゲティング部分(TM)と
を含むポリペプチドであって、
前記第2プロテアーゼによる前記第1破壊性切断部位の切断後に、(例えば、前記SNAREタンパク質を切断する能力の低下及び/又は前記非細胞毒性プロテアーゼを転位させる能力の低下により測定可能な)効力の低下を有し、
e.前記第1破壊性切断部位が前記TM内にないことを条件とする
ポリペプチド。 - 破壊性切断部位が、循環性プロテアーゼ、好ましくは、血清プロテアーゼ又は血液凝固カスケードのプロテアーゼなどの細胞外プロテアーゼ;組織関連プロテアーゼ、好ましくは、筋肉のマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)などのMMP;或いは細胞内プロテアーゼ、好ましくは標的細胞に存在しないプロテアーゼから選択されるプロテアーゼにより切断される、請求項1に記載のポリペプチド。
- プロテアーゼが、トロンビン、第Xa因子、ADAM17、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ(HAT)、ACE(ペプチジルジペプチダーゼA)、エラスターゼ、フューリン、グランザイム、カスパーゼ、好ましくはカスパーゼ1〜10のうちの1つ、マトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)、TACE、アダマライシン、セラライシン、アスタシン、凝固第VIIa因子、凝固第IXa因子、凝固第XIa因子、凝固第XIIa因子、カリクレイン、プロテインC又はMBP関連セリンプロテアーゼである、請求項2に記載のポリペプチド。
- 非細胞毒性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒L鎖、若しくはSNAREタンパク質を切断可能なそのフラグメントを含むか、又は前記非細胞毒性プロテアーゼがIgAプロテアーゼ、若しくはSNAREタンパク質を切断可能なそのフラグメントを含む、請求項1〜3のいずれかに記載のポリペプチド。
- 非細胞毒性プロテアーゼ構成要素に存在する少なくとも1つの第1破壊性切断部位、及び/又は転位ドメインに存在する少なくとも1つの第1破壊性切断部位を含む、請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチド。
- 転位ドメインが、クロストリジウム神経毒転位ドメインを含む、請求項1〜5のいずれかに記載のポリペプチド。
- TMが、クロストリジウム神経毒のHCドメイン若しくはHCCドメイン、又はニューロンと結合可能なそのフラグメントを含むか、或いは
前記TMが、グルカゴン様ホルモン、ニューロホルモン、神経調節性サイトカイン、ニューロトロフィン、成長因子、軸索ガイダンスシグナル伝達分子、糖結合性タンパク質、ニューレキシンと選択的に結合するリガンド、ニューレキシン2αのリガンド、ニューレキシン2βのリガンド、ニューレキシン3αのリガンド、ニューレキシン3βのリガンド、WNT、Ng−CAM(LI)、NCAM、N−カドヘリン、VIPペプチドなどのPACAPペプチド、アグリン−MUSK、基底膜ポリペプチド、及び前記ポリペプチドのいずれかのバリアント;毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリコホリンA(GPA)、白血病抑制因子(LIF)、インターロイキン(IL)、オノスタチンM、カルジオトロフィン1(CT−1)、カルジオトロフィン様サイトカイン(CLC)、ニューロロイキン、VEGF、インスリン様成長因子(IGF)、上皮成長因子(EGF)、及び前記神経調節性サイトカインのいずれかのバリアントなどの神経調節性サイトカインから選択されるペプチドを含む、請求項1〜6のいずれかに記載のポリペプチド。 - 破壊性切断部位での切断の後に、SNAREタンパク質を切断する能力が低減している、請求項1〜7のいずれかに記載のポリペプチド。
- 配列番号4、6、10、12、14、16、20、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38又は39から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜9のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 配列番号3、5、9、11、13、15、19、21又は23から選択される核酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項10に記載の核酸。
- 斜視、眼瞼痙攣、藪睨、ジストニア(例えば痙攣性ジストニア、顎口腔ジストニア、限局性ジストニア、遅発性ジストニア、喉頭ジストニア、四肢ジストニア)、斜頚(例えば痙攣性斜頚)、(SNAREの下方制御又は不活性化による)細胞/筋肉の無能力化により利益を受ける美化療法(美容)の用途、眼球運動の神経筋異常又は疾患(例えば共動斜視、上下斜視、外側直筋麻痺、眼振、甲状腺不全性筋疾患)、書痙、眼瞼痙攣、歯ぎしり、ウィルソン病、振戦、チック、分節性ミオクローヌス;攣縮、慢性多発性硬化症による痙攣、異常膀胱制御をもたらす痙攣、アニムス、背部攣縮、筋肉のこり、筋収縮性頭痛、挙筋骨盤症候群、二分脊椎症、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病及び吃音症から選択される異常又は疾患を抑制するのに用いるための、請求項1〜9のいずれかに記載のポリペプチド。
- 斜視、眼瞼痙攣、藪睨、ジストニア(例えば痙攣性ジストニア、顎口腔ジストニア、限局性ジストニア、遅発性ジストニア、喉頭ジストニア、四肢ジストニア)、斜頚(例えば痙攣性斜頚)、(SNAREの下方制御又は不活性化による)細胞/筋肉の無能力化により利益を受ける美化療法(美容)の用途、眼球運動の神経筋異常又は疾患(例えば共動斜視、上下斜視、外側直筋麻痺、眼振、甲状腺不全性筋疾患)、書痙、眼瞼痙攣、歯ぎしり、ウィルソン病、振戦、チック、分節性ミオクローヌス;攣縮、慢性多発性硬化症による痙攣、異常膀胱制御をもたらす痙攣、アニムス、背部攣縮、筋肉のこり、筋収縮性頭痛、挙筋骨盤症候群、二分脊椎症、遅発性ジスキネジア、パーキンソン病及び吃音症から選択される異常又は疾患を抑制するための方法であって、
請求項1〜9のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を患者に投与するステップを含む方法。
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