CN115925835A

CN115925835A - 工程改造的肉毒杆菌神经毒素

Info

Publication number: CN115925835A
Application number: CN202210985546.1A
Authority: CN
Inventors: 董民; 彭立胜; 陶亮
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2023-04-07
Also published as: US20180080016A1; WO2016154534A1; CN107548402B; PT3274364T; HK1249119A1; EP3981783A1; HK1248737A1; US11268080B2; TWI725963B; EP3274364B1; RU2746736C2; CN107548402A; RU2017134357A; DK3274364T3; TW201639877A; EP3274364A1; HUE057258T2; US20220154160A1; ES2895853T3; PL3274364T3

Abstract

本文公开了一种具有经修饰的受体结合结构域(HC)的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，所述经修饰的受体结合结构域具有改变所述BoNT与受体的结合的一个或多个氨基酸突变。还公开了特定的突变和突变组合。还公开了分离的经修饰的HC、包含所述经修饰的HC的多肽、嵌合分子、药物组合物及其制备和使用方法。另外公开了鉴定另外的此类经修饰的受体结合结构域的方法。

Description

工程改造的肉毒杆菌神经毒素

本申请是申请日为2016年03月25日、发明名称为“工程改造的肉毒杆菌神经毒素”的申请号为201680025744.6的专利申请的分案申请。

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2015年3月26日提交的美国临时申请序列号62/138,818的权益，该临时申请的内容以引用方式整体并入本文。

政府支持

本发明根据国家卫生研究院(National Institute of Health)所授予的 NIHNCRR RR000168在政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及经修饰的神经毒素及其用于治疗医学和/或美学病症的用途的领域。

发明背景

肉毒杆菌神经毒素是一种细菌毒素，其包括七种主要血清型 (BoNT/A-G)¹。这些毒素通过以下方式来发挥作用：阻断神经递质自神经元释放，由此麻痹动物和人。近年来，BoNT已广泛用于治疗愈来愈多的医学病状：局部注射微量毒素可减弱靶向区域中的神经元活性，这可有益于许多医学病状且有益于美容目的^2-4。

BoNT/A和BoNT/B是当前经FDA批准用于人的仅有的两种 BoNT^2-4。这些是纯化自细菌且未进行任何序列修饰的毒素(定义为野生型WT)。随着BoNT的应用愈加广泛，已报道其局限性和不良反应。主要局限性在于患者会生成中和抗体，这致使此后的治疗无效⁵。终止使用BoNT常常导致患者并无其他有效方式来治疗/减轻其病症。抗体反应的可能性与毒素剂量和注射频率直接相关⁵。因此，这种局限性主要发生于治疗肌肉痉挛(其涉及相对较高剂量的毒素)时。与之一致的是，在美容应用(其使用极低毒素剂量)中尚未观察到抗体反应⁵。

主要不良反应常常还与治疗肌肉痉挛有关，但与美容应用无关。这是因为不良反应主要是由于毒素向身体的其他区域扩散且毒素扩散的可能性与注射剂量直接相关。不良反应的范围从短暂非严重事件 (例如下垂和复视)到危及生命的事件，甚至死亡^6,7。在2008年由 Sidney Wolfe博士提交至FDA的陈情信件中，总共记载180例严重不良事件(包括16例死亡)。因此，在欧盟颁布类似警示后，FDA现要求对所有BoNT产品作出“黑框警告(Blackbox warning)”，以突显毒素的扩散的风险。

因为生成中和抗体和毒素扩散都与注射剂量直接相关，所以非常期望降低毒素剂量(同时维持相同水平的毒素活性)，这意味着必须增强单个毒素分子的效能。对神经元具有改良特异性的此类经修饰的 BoNT还减少由非特异性进入其他细胞类型中所致的任何潜在脱靶效应。

BoNT通过经由其受体结合结构域结合其特异性受体来靶向并进入神经元，这在文献中是明确的(BoNT-H_C，图1A、1B)¹。受体结合影响BoNT识别神经元的效能和特异性。提高BoNT的受体结合能力将增强其靶向神经元的效能和特异性。已鉴定了大部分BoNT的受体(图1C)。BoNT/B、D-C和G共享两种同源突触小泡蛋白-突触结合蛋白I和II(Syt I/II)作为其受体^8-13，而BoNT/A、E、D和F使用另一突触小泡蛋白SV2 ^9,14-18。除蛋白质受体外，所有BoNT都需要脂质共受体神经节苷脂(图1D)，其大量存在于神经元表面上¹⁹。在两种 Syt同种型中，Syt II对BoNT/B的结合亲和力比Syt I高约10倍且还是表达于运动神经末端(其为BoNT的靶向神经元)的主要同种型(图 2A)^20,21。因此，Syt II被视为BoNT/B、D-C和G的主要毒素受体，而Syt I是运动神经末端处的次要毒素受体。在啮齿类动物中和可能在大部分哺乳动物中是这种情况。

有人可能会争辩BoNT已经对神经元具有高特异性，并质疑有可能进一步改良其对神经元的结合吗？关于人的答案是“是”，这至少部分地鉴于以下最新发现：由于在毒素结合位点内与啮齿类动物(大鼠/ 小鼠)Syt II相比的独特氨基酸变化，人Syt II大大减弱了作为BoNT/B 的受体的结合和功能^13,22。这是在54位处自苯丙氨酸(F)变化为亮氨酸(L)(小鼠Syt II序列)(图2B)。序列比对已揭示，该位置处的苯丙氨酸在脊椎动物(包括鸭嘴兽、鱼、啮齿类动物和猴)的Syt I和Syt II 中高度保守²³。仅人和黑猩猩的Syt II在该位置处含有亮氨酸。由于该残基变化，与小鼠Syt II相比，人和黑猩猩Syt II大大减弱了与 BoNT/B、D-C和G的结合(图2C)且以显著较小效率介导BoNT/B的进入(图2D)。因为人和黑猩猩Syt I仍在相同位置处含有苯丙氨酸并且可结合BoNT/B、D-C和G，所以人中的BoNT/B、D-C和 G的高亲和力受体受限于次要受体Syt I。该发现可阐释以下临床观察结果：需要远高于BoNT/A(其结合不同受体)的剂量的BoNT/B以在患者中实现相同水平的治疗效果^24,25。以前，这些观察结果归因于其他原因，例如所用制剂中的活性神经毒素的百分比。其他物种中 BoNT/B对人Syt II与Syt II的此类结合差异的最新观察结果表明， BoNT/B的不同残基可参与与人Syt II的结合。因此，预计会影响与啮齿类动物SytII结合的BoNT/B的序列修饰可对BoNT/B与人Syt II 的结合具有不可预知的作用。

因此，亟需改良BoNT/B与人受体Syt II的结合，作为增加其对靶人神经元的效能和特异性且降低治疗应用中所需的毒素剂量的方式。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶裂解位点、移位结构域和肉毒梭菌(Clostridial botulinum)血清型B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)，该经修饰的受体结合结构域包含对应于血清型B菌株1中的选自以下的取代突变的一个或多个取代突变：E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、 Y1183P及其组合。在一个实施方案中，经修饰的(B-H_c)包含一个对应于血清型B菌株1中的选自以下的取代突变的取代突变：E1191C、 E1191V、E1191L、E1191Y、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、 W1178A、W1178S、Y1183C和Y1183P。在本文所描述多肽的一个实施方案中，经修饰的(B-H_c)包含对应于血清型B菌株1中的E1191C 的取代突变。在本文所描述多肽的一个实施方案中，经修饰的(B-H_c)包含对应于血清型B菌株1中的E1191V的取代突变。在本文所描述多肽的一个实施方案中，经修饰的(B-H_c)包含两个取代突变。

本发明的另一个方面涉及一种肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶裂解位点、移位结构域和肉毒梭菌血清型 B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)，该经修饰的受体结合结构域包含对应于血清型B菌株1中的取代突变的两个或更多个取代突变，其中一个取代突变选自：E1191Q、E1191M、E1191C、E1191V、E1191L 和E1191Y。在一个实施方案中，另一取代突变对应于血清型B菌株 1中的S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、W1178Y、W1178Q、 W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、S1199F或S1199L。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1 中的E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、E1191C和S1199W、 E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q和S1199W、E1191V 和S1199W、E1191V和S1199Y或E1191V和W1178Q。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的 E1191M和S1199W。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和W1178Q。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的 E1191C和S1199W。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和S1199Y。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的 E1191C和W1178Q。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191Q和S1199W。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的 E1191V和S1199W。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和S1199Y。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的 E1191V和W1178Q。在本文所描述多肽的一个实施方案中，经修饰的(B-H_c)包含三个取代突变。在本文所描述多肽的一个实施方案中，三个取代突变在对应于血清型B菌株1的E1191、Y1183和S1199或 E1191、S1199和W1178的位置处。在本文所描述多肽的一个实施方案中，三个取代突变对应于血清型B菌株1的E1191M、S1199W和 W1178Q。

本发明的另一个方面涉及一种肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含蛋白酶结构域、蛋白酶裂解位点、移位结构域和肉毒梭菌血清型 B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)，该经修饰的受体结合结构域在对应于血清型B菌株1的S1199或S1201的位置处包含取代突变。

在本文所描述任一多肽的一个实施方案中，经修饰的B-H_c来自菌株1。在本文所描述任一多肽的一个实施方案中，蛋白酶结构域、移位结构域和蛋白酶裂解位点来自选自以下的血清型：A、B、C、D、 E、F、G及其组合。在本文所描述任一多肽的一个实施方案中，蛋白酶结构域、移位结构域和蛋白酶裂解位点来自血清型B菌株1。在本文所描述任一多肽的一个实施方案中，蛋白酶结构域、移位结构域和蛋白酶裂解位点来自血清型A菌株1。在本文所描述任一多肽的一个实施方案中，经修饰的B-Hc并非来自菌株B4。

本发明的另一个方面涉及包含肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)的多肽，该经修饰的受体结合结构域包含对应于血清型B菌株1中的选自以下的取代突变的一个或多个取代突变： E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合。在一个实施方案中，经修饰的(B-H_c)包含两个取代突变。

本发明的另一个方面涉及包含肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)的多肽，该经修饰的受体结合结构域包含对应于血清型B菌株1中的取代突变的两个或更多个取代突变，其中一个取代突变选自：E1191Q、E1191M、E1191C、E1191V、E1191L和E1191Y。在本文所描述多肽的一个实施方案中，一个取代突变对应于血清型B 菌株1中的S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、W1178Y、W1178Q、 W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、S1199F或S1199L。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1 中的E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、E1191C和S1199W、 E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q和S1199W、E1191V 和S1199W、E1191V和S1199Y或E1191V和W1178Q。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的 E1191M和S1199W。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和W1178Q。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的 E1191C和S1199W。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和S1199Y。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株中的 E1191C和W1178Q。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191Q和S1199W。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和S1199W。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和S1199Y。在本文所描述多肽的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的 E1191V和W1178Q。在本文所描述多肽的一个实施方案中，经修饰的(B-H_c)包含三个取代突变。在本文所描述多肽的一个实施方案中，三个取代突变在对应于血清型B菌株1的E1191、Y1183和S1199或 E1191、S1199和W1178的位置处。在本文所描述多肽的一个实施方案中，三个取代突变对应于血清型B菌株1的E1191M、S1199W和W1178Q。在本文所描述多肽的一个实施方案中，经修饰的B-H_c来自菌株1。在本文所描述多肽的一个实施方案中，经修饰的B-H_c并非来自菌株4。在一个实施方案中，经修饰的B-H_c并非来自菌株3、7或 8。

本发明的另一个方面涉及一种嵌合分子，其包含连接至第二部分的第一部分(其为肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域 (B-H_c))，其中经修饰的B-H_c包含一个或多个选自以下的取代突变： E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合。在一个实施方案中，经修饰的B-H_c包含两个取代突变。

本发明的另一个方面涉及一种嵌合分子，其包含连接至第二部分的第一部分(其为肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域 (B-H_c))，其中经修饰的B-H_c包含对应于血清型B菌株1中的取代突变的两个或更多个取代突变，其中一个取代突变选自：E1191Q、E1191M、E1191C、E1191V、E1191L和E1191Y。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，一个取代突变对应于血清型B菌株1中的 S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、W1178Y、W1178Q、W1178A、 W1178S、Y1183C、Y1183P、S1199F或S1199L。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的 E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、E1191C和S1199W、E1191C 和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1199Y或E1191V和W1178Q。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1 中的E1191M和S1199W。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和W1178Q。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B 菌株1中的E1191C和S1199W。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和S1199Y。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和W1178Q。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191Q和S1199W。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和S1199W。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的 E1191V和S1199Y。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和W1178Q。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，经修饰的(B-H_c)包含三个取代突变。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，三个取代突变在对应于血清型B菌株1的E1191、Y1183和S1199或E1191、S1199和W1178 的位置处。在本文所描述嵌合分子的一个实施方案中，三个取代突变对应于血清型B菌株1的E1191M、S1199W和W1178Q。

在本文所描述任一嵌合分子的一个实施方案中，经修饰的B-H_c来自菌株1。在本文所描述任一嵌合分子的一个实施方案中，经修饰的B-H_c并非来自菌株4。在一个实施方案中，经修饰的B-H_c并非来自菌株3、7或8。

在本文所描述任一嵌合分子的一个实施方案中，第一部分和第二部分共价连接。在本文所描述任一嵌合分子的一个实施方案中，第一部分和第二部分非共价连接。在本文所描述任一嵌合分子的一个实施方案中，第二部分选自：小分子、核酸、短多肽和蛋白质。在本文所描述任一嵌合分子的一个实施方案中，第二部分是生物活性分子。在本文所描述任一嵌合分子的一个实施方案中，第二部分是治疗性多肽或非多肽药物。

本发明的方面另外涉及本文所描述的BoNT多肽、多肽或嵌合分子中的任一种，与缺乏取代突变的相同分子相比，其表现出经修饰的 B-H_c与人SytII的显著增强的结合和/或经修饰的B-H_c与人Syt I的显著降低的结合。

本发明的方面另外涉及本文所描述的BoNT多肽、多肽或嵌合分子中的任一种，其中与缺乏取代突变的相同分子相比，该取代突变产生与人SytII的显著增强的结合/或与人Syt I的显著增强的结合。

本发明的另一个方面涉及一种核酸，其包含编码本文所描述的 BoNT多肽、多肽或嵌合分子的核苷酸序列。本发明的另一个方面涉及一种核酸载体，其包含含有编码本文所描述的BoNT多肽、多肽或嵌合分子的核苷酸序列的核酸。本发明的另一个方面涉及一种细胞，其包含含有列编码本文所描述的BoNT多肽、多肽或嵌合分子的核苷酸序的核酸或包含所述核酸的核酸载体。

本发明的另一个方面涉及表达本文所描述的BoNT多肽、多肽或嵌合分子中的任一种的细胞。

本发明的另一个方面涉及包含本文所描述的任一肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽的药物组合物。

本发明的另一个方面涉及包含本文所描述的任一多肽的药物组合物。

本发明的另一个方面涉及包含本文所描述的任一嵌合分子的药物组合物。

本发明的另一个方面涉及包含本文所描述的任一核酸或核酸载体的药物组合物。

在本文所描述的任一药物组合物的一个实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

本发明的另一个方面涉及一种试剂盒，其包含本文所描述的任一药物组合物和用于治疗性施用药物组合物的说明书。

本发明的另一个方面涉及产生本文所描述的任一肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽的方法，该方法包括以下步骤：在其中产生所述 BoNT多肽的条件下培养表达BoNT多肽的细胞。在一个实施方案中，该方法还包括以下步骤中的一个或多个：从培养物回收BoNT多肽，纯化BoNT多肽，活化BoNT多肽，和/或配制BoNT多肽。

本发明的另一个方面涉及用于治疗与不期望的神经元活性相关的病状的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所描述的 BoNT多肽从而接触一个或多个神经元的表现出的不期望的神经元活性，以此治疗该病状。在一个实施方案中，该病状选自：痉挛性发音困难、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌发音困难、舌肌张力障碍、颈部肌张力障碍、局部手肌张力障碍、睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑病症、脑性麻痹、局部痉挛和其他发音障碍、痉挛性结肠炎、神经性膀胱障碍(即所有涉及尿失禁的疾病，例如神经性逼尿肌过动或特发性膀胱过动)、肛门痉挛、肢体痉挛、抽搐、颤抖、磨牙、肛裂、弛缓不能、吞咽困难和其他肌肉张力病症和其他特征在于肌群的不随意运动的病症、流泪、多汗症、过度流涎、胃肠道分泌过多、分泌病症、由肌肉痉挛引起的疼痛、神经病性疼痛、发炎性疼痛、头痛(例如偏头痛)、发痒(搔痒)、痤疮和皮肤病学或美学/美容病状。

本发明的另一个方面涉及用于医学中的本文所描述的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽或药物组合物或嵌合分子或多肽中的任一种。

本发明的另一个方面涉及用于治疗与不期望的神经元活性相关的病状的本文所描述肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽或药物组合物或嵌合分子或多肽中的任一种。

本发明的另一个方面涉及鉴定肉毒杆菌神经毒素中结合受体的经修饰的受体结合结构域的方法，其包括在双杂合测定中使经修饰的受体结合结构域与细菌腺苷酸环化酶的T18亚基表达为第一融合蛋白，以及在双杂合测定中使受体与细菌腺苷酸环化酶的T25亚基表达为第二融合蛋白，分析表达第一融合蛋白和第二融合蛋白两者的克隆大肠杆菌集落的超过阴性对照的阳性指标的存在，以及将由表现出所述阳性指标的集落所表达的经修饰的受体结合结构域鉴定为结合至所述受体。在一个实施方案中，阳性指标是显色。在本文所描述的方法的一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：针对弱阳性对照分析集落的阳性指标，以及进一步将由表现出高于弱阳性对照的阳性指标的集落所表达的经修饰的受体结合结构域鉴定为以高亲和力结合至受体。在本文所描述的方法的一个实施方案中，使用各自在相应集落中表达的经修饰的受体结合结构域的文库来实施该方法。在本文所描述的方法的一个实施方案中，受体是人。在本文所描述的方法的一个实施方案中，经修饰的受体结合结构域包含一个或多个取代突变，其中一个取代突变对应于血清型B菌株1中的选自以下的突变： E1191M、E1191 Q、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、 S1199E、S1199H、S1199F、S1199L、W1178Y、W1178Q、W1178A、 W1178S、Y1183C、Y1183P和S1199Y。

附图简述

图1A-图1D(对于背景的公开数据)示出了BoNT如何靶向神经元的示意性模型(图1A)、其整体蛋白质结构(图1B)、所鉴定受体列表(图 1C)和BoNT/B结合其受体Syt和神经节苷脂的结构模型(图1D)。(图 1A)BoNT作用的示意图：BoNT通过以下过程来识别神经元：结合其特异性受体(步骤1)，经由受体介导的胞吞作用进入神经元(步骤2)， BoNT的轻链然后移位穿过内体膜进入胞质溶胶中(步骤3)，其中这些轻链用作蛋白酶来裂解靶宿主蛋白(步骤4)。图1A是改编自Arnon,S. 等人,JAMA,285:1059,2001 ²⁴。(图1B)BoNT是由经由二硫键连接的轻链和重链构成。重链可进一步分成两个结构域：移位结构域(H_N) 和受体结合结构域(H_C)。这些功能结构域可在不同BoNT之间转换。例如，可使用BoNT/B-H_c代替BoNT/A-H_C来生成嵌合毒素。(图1C) 所鉴定毒素受体的列表。(图1D)示出了细胞表面上BoNT/B与其蛋白质受体Syt(I/II)以及其脂质共受体神经节苷脂的结合的结构模型。图 1D是改编自Chai等人,Nature,444:1096,2006³¹。

图2A-图2D示出了自公开文献改编的先前数据，其表明人Syt II 并非BoNT/B、D-C和G的有效受体。(A)人Syt II与小鼠/大鼠Syt II 的不同之处在于毒素结合位点内的单个残基(在小鼠Syt II中为残基 54，在人Syt II中为残基51)。(所示SytII(小鼠)是SEQ IDNO:1)。(图 2B)将谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记的重组小鼠Syt II 1-87(m-Syt II)和模拟人Syt II(F54L，在此处和下文中称为h-Syt II以简化文本)的小鼠 Syt II 1-87突变体固定于谷胱甘肽-琼脂糖珠粒上，且用于在存在或不存在神经节苷脂(Gangl)下下拉(pulldown)BoNT/B、BoNT/D-C或 BoNT/G。所有三种毒素在下拉测定(pull-down assay)中都结合m-Syt II 1-87，但并不结合h-Syt II。(图2C)经培养的大鼠海马体神经元仅表达Syt I，但不表达Syt II ⁸。因此，基因敲低(KD)的Syt I生成不含内源性毒素受体的神经元。然后在Syt I KD海马体神经元中表达全长 m-Syt II和h-Syt II，且将这些神经元暴露于BoNT/B(20nM，5min暴露，24小时孵育)或BoNT/D-C(0.3nM，5min暴露，6小时孵育)或 BoNT/G(40nM，5min暴露，24小时孵育)。发现h-Syt II介导BoNT/B、 BoNT/D-C和BoNT/G进入Syt I KD神经元的有效性显著小于野生型小鼠Syt II，如通过毒素底物小突触泡蛋白(Syb)的裂解程度所证实。 (图2D)如图C中所描述，使用大鼠Syt I 1-83和人Syt I 1-80下拉 BoNT/B、BoNT/D-C和BoNT/G。对于所有三种毒素而言，人Syt I 与大鼠Syt I介导类似程度的毒素结合。该图是改编自最新公开：Peng 等人,J.Cell Science,2012 ¹³。

图3A-图3B示出了位于BoNT/B-H_c上的Syt II结合界面中的残基，其为用于定点诱变以改变结合亲和力的候选者。(图3A)此处示出了BoNT/B-H_c与小鼠Syt II之间的结合界面的近视图。BoNT/B-H_c中有助于结合的残基以粗体标记，而Syt II中的残基并非粗体。SytII 中位于中央且以略大字体大小示出的残基F54在人Syt II中变为残基 L。(图3B)BoNT/B中形成BoNT/B中的Syt II结合结构域的结合袋 (binding pocket)的19个关键残基的列表。这些残基是用于定点诱变的候选者。

图4A-图4B是用于筛选BoNT/B-H_c突变体结合人Syt II的能力的细菌腺苷酸环化酶双杂交(BACTH)系统的图解说明。(图4A)使用在所选位点处含有随机三核苷酸(NNN)的引物通过PCR扩增来生成在所选位置处涵盖所有20种不同氨基酸的BoNT/B-H_c突变体库。针对图3B中所选择的所有19种残基生成总共19个不同的库。(图 4B)BACTH系统的示意性图解说明。简而言之，将细菌腺苷酸环化酶分裂成两个结构域，其命名为T25和T18。T25融合至含有毒素结合位点的人Syt II(残基1-87)，而T18融合至如图4A中所描述生成的 BoNT/B-H_c。这两种融合蛋白编码于两种单独质粒上且共转化至相同细菌中。突变BoNT/B-H_c与人Syt II的结合使得T25和T18结构域在细菌中结合在一起，这样恢复了细菌腺苷酸环化酶的活性。这使得在细菌中产生cAMP，其活化CAP蛋白质且触发编码β-半乳糖苷酶的报告基因lacZ的表达。β-半乳糖苷酶的活性在X-gal板上产生可容易地鉴定的蓝色集落。然后可自蓝色集落提取编码BoNT/B-H_c的质粒并测序以鉴定BoNT/B-H_c中的特异性突变。

图5A-图5B是汇总来自BoNT/B-H_c突变体的BACTH筛选的结果的表。(图5A)每个BoNT/B-H_c突变体库中的总集落和融合至T18 且与融合至T25的人Syt II在细菌中共表达的蓝色集落数的列表。基于Clark-Carbon方程式，总集落数需要大于380以实现在单个位置涵盖所有20种可能氨基酸的99.8％的可能性。4个位置产生大量蓝色集落(在平板接种68小时后)。(图5B)提取来自图5A中所鉴定的蓝色集落的质粒并测序以确定在BoNT/B-H_c中的指示位置处引入的特异性残基。列出了所鉴定的残基。应注意，蓝色集落进一步分成“深蓝色集落”(其发现于BoNT/B-H_c的位置1191处)和“浅蓝色集落”(其发现于位置1183、1199和1178处)。术语“深蓝色集落”与“浅蓝色集落”是由实验者基于集落蓝色之间的差异人工判断。

图6A-图6B示出了指示在BACTH测定中指定BoNT/B-H_c突变体与人Syt II之间的相互作用的半定量测量的实验结果。(图6A)自表达与T25融合的人Syt II和与T18融合的指定BoNT/B-H_c突变体的细菌的裂解物测量β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶的活性可能反映人 Syt II与BoNT/B-H_c之间的相互作用的强度。WT BoNT/B-H_c用作对照。将残基E1191交换为M、C、V或Q会得到β-半乳糖苷酶的最强表达。E1191至S/A/T/N、Y1183至C/P、S1199至W/E/Y/H、W1178 至Y/Q/S的残基交换显示出相互作用的轻微增加。N＝6个样品/组。(图 6B)通过下拉测定测定指定BoNT/B-H_c突变体与小鼠Syt II(m-Syt II) 或人Syt II(h-Syt II)的结合，其结合位点展示于图2A中。将残基E1191 交换为M、C、V或Q还显示与h-Syt II的最强结合。

图7A-图7B示出了筛选除E1191位外可增强h-Syt II结合的次级突变的实验结果。(图7A)通过将E1191M分别与图5B中在位置 S1199/Y1183/W1178处鉴定的所有其他10种残基变化组合来产生双重突变。通过下拉测定测定这些双重突变结合h-Syt II的能力。使用*指示对h-Syt II显示出较强结合的突变体(图7B)。所提出的用于可增强BoNT/B与人Syt II之间的亲和力的组合的突变列示于表中。

图8A-图8B示出了指定BoNT/B-H_c与h-Syt II之间的结合亲和力的定量测量。(图8A)通过生物膜干涉测定测量GST标记的h-Syt II 与His标记的WT BoNT/B-H_c和E1191M/S1199Y的结合。简而言之，向抗GST生物传感器中装载GST-h-Syt II。将经装载生物传感器与 1μM BoNT/B-H_c蛋白质一起孵育以用于量测缔合动力学，随后进行洗涤步骤以测量解离动力学。示出了代表性缔合和解离曲线。(图8B) 如A图中所描述，通过生物膜干涉测定测量指定BoNT/B-H_c与Syt II 之间的结合亲和力。自缔合和解离曲线的非线性拟合计算动力学参数 (k_on和k_off)和整体结合亲和力(K_D)。WT BoNT/B-H_c与h-Syt II的结合太弱以致不能可靠测定，其中估计K_D超过检测限值(>20μM)，而大部分双重和三重突变体显示出在0.59μM至4.30μM范围内明显增加的结合亲和力。

图9A-图9C示出了指示所选BoNT/B-H_c突变体与人Syt I具有增强的结合的实验结果。(图9A)将WT BoNT/B-H_c和E1191M突变体纯化为His6标记的重组蛋白并与GST标记的固定h-Syt I(1-80)在存在或不存在共受体神经节苷脂(Gangl)下一起孵育。WT BoNT/B-H_c与h-Syt I的结合需要存在共受体神经节苷脂，从而指示WT BoNT/B-H_c与h-Syt之间的相互作用相对较弱。E1191M突变体可在并无神经节苷脂下结合至h-Syt I，从而对h-Syt I显示出提高的结合亲和力。(图 9B)如图8A中所描述，通过生物膜干涉术测量WT和指定突变体BoNT/B-H_c与h-Syt I的结合。(图9C)如图8B中所描述测量并计算 WT BoNT/B-H_c、BoNT/B-H_c(E1191M/S1199Y)(“B H_cMY”)和 BoNT/B-H_c(E1191V/S1199Y)(“B H_cVY”)对h-Syt I的动力学参数(k_on和k_off)和整体亲和力(K_D)。不能可靠测定WT BoNT/B-H_c(B H_Cwt)与 h-Syt I的结合，且估计的KD超过检测限值(>20μM)。BoNT/B-H_c (E1191M/S1199Y、B H_C、MY)和BoNT/B-H_c(E1191V/S1199Y、B H_CVY) 显示出明显增加的结合亲和力，其中K_D分别为2.9μM和5.82μM。

图10A-图10B是原位免疫染色分析的照片，该分析指示H_CB_MY对表达h-Syt II的人源化神经元显示出稳健结合。(图10A)通过敲低内源性Syt I且在经培养的大鼠皮质神经元中表达全长h-Syt II来产生人源化神经元。表达全长m-Syt II或m-Syt II(F54L)的神经元用作另外对照。将该神经元暴露于WT H_CB，随后进行免疫染色分析。经由融合至H_CB的HA标签检测结合的H_CB。将突触蛋白标记为用于突触前末端的标记物。WT H_CB结合至WT神经元的突触，但并不结合 Syt I KD神经元。经由慢病毒转导来表达全长m-Syt II会恢复H_CB的结合，而表达全长m-Syt II(F54L)或全长h-Syt II则不能拯救结合。(图 10B)Syt I KD还消除H_CB_MY与神经元的结合。通过表达全长m-Syt II、 m-Syt II(F54L)和h-Syt II来恢复结合。

图11A-图11C是指示BoNT/B _MY对于阻断人源化神经元中的神经传递展示出增强效能的实验结果。(图11A)如图11A中所描述来产生人源化神经元。将这些神经元暴露于一定浓度梯度的全长WT BoNT/B或BoNT/B_MY中24小时。收获细胞裂解物且进行免疫印迹分析。β-微管蛋白用作内部装载对照。在相同浓度下由BoNT/B_MY裂解的VAMP2多于WT BoNT/B，表明BoNT/B_MY较WT BoNT/B更有效地进入神经元中。将人源化神经元暴露于一定浓度梯度的WTBoNT/B或BoNT/B_MY中24小时且然后通过全细胞膜片钳方式记录 mIPSC活性。(图11B)示出了在30pM毒素下的代表性mIPSC记录。 (图11C)绘示mIPSC活性与毒素浓度，其标准化至未暴露于任何毒素的神经元。半最大抑制浓度(IC₅₀)为89pM(对于WT BoNT/B)和 7.8pM(对于BoNT/B_MY)，从而证实增强的与人受体结合使得功能水平下的毒素在神经元中的效能有所增加。

图12是BoNT/B-H_c(菌株1；BoNT/B1 Okra菌株)的氨基酸序列。 BoNT/B菌株1的残基857-1291，GenBank：AB232927.1。(SEQ ID NO:2)。

图13是编码BoNT/B-H_c(菌株B1，Okra菌株)(BoNT/B菌株1 的残基857-1291，基于GenBank：AB232927.1)的核酸序列，其已优化以便在大肠杆菌中表达。(SEQ ID NO:3)

图14示出了肉毒梭菌血清型A的氨基酸序列(1296a.a.)。(SEQ ID NO:4)

图15示出了肉毒梭菌血清型B的氨基酸序列(1291a.a.)。(SEQ ID NO:5)

图16示出了肉毒梭菌血清型C1的氨基酸序列(1291a.a.)。(SEQ ID NO:6)

图17示出了肉毒梭菌血清型D的氨基酸序列(1276a.a.)。(SEQ ID NO:7)

图18示出了肉毒梭菌血清型E的氨基酸序列(1252a.a.)。(SEQ ID NO:8)

图19示出了肉毒梭菌血清型F的氨基酸序列(1274a.a.)。(SEQ ID NO:9)

图20示出了肉毒梭菌血清型G的氨基酸序列(1297a.a.)。(SEQ ID NO:10)

图21示出了肉毒梭菌血清型B菌株Eklund 17B(BoNT/B4)的氨基酸序列(SEQ IDNO:11)Genbank参考编号：EF051570.1。

具体实施方式

本发明方面涉及包含肉毒梭菌的经修饰的受体结合结构域(例如血清型B(B-H_c))的多肽和编码该多肽的核酸的生成，且更具体而言涉及经由并入经修饰的受体结合结构域来改良人受体结合的肉毒梭菌神经毒素(BoNT)多肽和编码该多肽的核酸。由这些发现，可通过利用本文所鉴定的经修饰的受体结合结构域来产生新一代治疗剂BoNT，其较当前利用的WT BoNT对人靶神经元具有改良的效能和特异性。

定义

如本文中所使用，术语“结合亲和力”意指分子结合活性对于特定受体系统的强度。一般而言，高结合亲和力源自结合结构域与其受体系统之间的较大分子间力，而低结合亲和力涉及配体与其受体之间的较小分子间力。高结合亲和力涉及结合结构域在其受体结合位点处的滞留时间长于低结合亲和力的情形。因此，具有高结合亲和力的分子意指最大程度地占据受体系统的结合位点且触发生理学反应所需的该分子的浓度较低。相反，低结合亲和力意指需要相对较高浓度的分子方使最大程度地占据受体系统的受体结合位点且实现最大生理学反应。因此，本发明的肉毒杆菌神经毒素(其因高结合亲和力而具有增加的结合活性)容许施用减小剂量的毒素，由此减少或预防与向非靶向区中的毒素分散有关的不良副作用。

通常用于测量结合亲和力的一个参数定义为结合K_D。因将K_D定义为解离常数(k_off)与缔合常数(k_on)之间的比率，因此K_D值愈低，则结合亲和力愈高。

如本文中所使用，在用于描述本发明的肉毒梭菌神经毒素分子或其BoNT/B-H_c结合片段对特异性受体(例如人Syt II或人Syt I)的结合亲和力时，术语“显著增强的结合”是指与非取代分子形式相比对特异性受体的结合亲和力发生大幅增加(例如增加野生型分子的结合亲和力的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在一个实施方案中，经取代分子的增强的结合显示为结合亲和力大于非取代分子(例如含有天然BoNT H_C分子的神经毒素)的结合亲和力一个数量级或更多。换句话讲，经取代分子的K_D低于非取代分子的K_D一个数量级或更多。在一个实施方案中，增强的结合显示为结合亲和力显著高于(例如1.5×、2.0×、2.5×、3.0×等)非取代分子的结合亲和力。换句话讲，经取代分子的K_D显著低于(例如1.5×、2.0×、2.5×、3.0×等)非取代分子的K_D。在一个实施方案中，所显示的增强的结合在约 0.59μM至5.82μM K_D范围内。在一个实施方案中，所显示的增强的结合在约0.59μM至4.3μM K_D范围内。在一个实施方案中，增强的结合显示为K_D≤5.82μM。在一个实施方案中，增强的结合显示为 K_D≤4.30μM。在一个实施方案中，增强的结合显示为K_D≤2.9μM。在一个实施方案中，增强的结合显示为K_D约为0.59μM。

在一个实施方案中，经取代分子对于人Syt II的K_D≤10μM，优选地≤9、8、7、6、5、4、3或2μM，更优选地≤1或0.6μM。在一个实施方案中，经取代分子对于人Syt I的K_D≤10μM，优选地≤9、8、7、 6、5、4μM，更优选地≤3μM。在一个实施方案中，经取代分子对于人Syt II的K_D≤7μM且经取代分子对于人Syt I的K_D≤6μM。在优选实施方案中，经取代分子对于人SytII的K_D≤1μM且经取代分子对于人Syt I的K_D≤3μM。

在一个实施方案中，增强的结合使得在不存在共受体神经节苷脂下产生可检测的人Syt I结合，如通过本文所描述的实验所例示。

在用于描述通过本文所描述的点突变产生的BoNT/B-H_c结合片段的结合亲和力时，术语“显著增强的结合”或“显著降低的结合”是指经修饰的结合结构域(例如表达为分离的片段或在较大多肽的情况下) 对特异性受体(例如人Syt II或人Syt I)的结合亲和力分别有所增加或降低，如上文刚刚所论述。

如本文中使用时，在用于描述本发明的肉毒杆菌神经毒素分子或其结合片段(例如BoNT/B-H_c)对特异性受体(例如人Syt I或人Syt II) 的结合亲和力时，术语“显著降低的结合”是指与非取代分子形式相比对特异性受体的结合亲和力发生大幅降低(例如降低野生型分子的结合亲和力的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在一个实施方案中，经取代分子的降低的结合使得结合亲和力小于非取代神经毒素(例如含有天然BoNT H_C分子的神经毒素)的结合亲和力一个数量级或更多。换句话讲，经取代分子的K_D高于非取代神经毒素的K_D一个数量级或更多。在一个实施方案中，经取代分子的降低的结合使得结合亲和力显著低于(例如1.5×、2.0×、2.5×、3.0×等) 非取代分子的结合亲和力。换句话讲，经取代分子的K_D显著高于(例如1.5×、2.0×、2.5×、3.0×等)非取代分子的K_D。在一个实施方案中，显著降低的结合使得在不存在共受体神经节苷脂下丧失与人Syt I的可检测的结合。

如本文中所使用，术语“肉毒杆菌神经毒素”意指可执行整体细胞机制的任一多肽，凭借这一机制肉毒梭菌毒素进入神经元中且抑制神经递质释放。此机制涵盖肉毒梭菌毒素与低或高亲和力受体复合物的结合、毒素的内化、毒素轻链至细胞质的移位和肉毒梭菌毒素底物的酶修饰。术语“多肽”和“蛋白质”可在本文中互换使用且是指肉毒梭菌神经毒素分子和其片段。

如本文中所使用，术语“经修饰的受体结合结构域”或“经修饰的 H_C”促进包含其的肉毒梭菌神经毒素分子结合至位于靶细胞表面上的肉毒梭菌神经毒素受体。此类分子通常是经由基因重组技术产生。经修饰的H_C对位于靶细胞表面上的肉毒梭菌神经毒素受体具有结合活性。如本文中所使用，术语“结合活性”意指，一个分子经由至少一种分子间或分子内力(包括但不限于共价键、离子键、金属键、氢键、疏水相互作用、范德瓦尔斯相互作用(van der Waals interaction)等或其任一组合)直接或间接接触另一分子。“结合(bound和bind)”被视为与结合(binding)相当的术语。

如本文中所使用，术语“肉毒梭菌毒素蛋白酶结构域”意指可执行中毒过程的酶靶标修饰步骤的肉毒梭菌毒素结构域。因此，肉毒梭菌毒素蛋白酶结构域特异性靶向肉毒梭菌毒素底物且涵盖肉毒梭菌毒素底物(例如SNARE蛋白质(例如SNAP-25底物)、VAMP底物和突触融合蛋白(Syntaxin)底物)的蛋白水解裂解。

肉毒梭菌毒素蛋白酶结构域的非限制性实例提供于表1和2中。

如本文中所使用，术语“肉毒梭菌毒素移位结构域”或“H_N”意指可执行中毒过程中介导肉毒梭菌毒素轻链移位的移位步骤的肉毒梭菌毒素结构域。因此，H_N促进肉梭状毒杆菌毒素轻链移动穿过膜且涵盖使肉毒梭菌毒素轻链移动穿过膜细胞内小泡进入细胞的细胞质中。H_N的非限制性实例包括BoNT/A H_N、BoNT/B H_N、BoNT/C1 H_N、 BoNT/D H_N、BoNT/E H_N、BoNT/F H_N和BoNT/G H_N，其氨基酸序列提供于表1和图12、14-20中。

如本文中所使用，术语“肉毒梭菌受体结合结构域”与“H_C结构域”同义且意指可执行中毒过程的细胞结合步骤(包括(例如)肉毒梭菌毒素与位于靶细胞的质膜表面上的肉毒梭菌毒素特异性受体系统的结合)的任一天然肉毒梭菌受体结合结构域。设想可通过(例如)使用经修饰的(例如增强的)H_C结构域代替整个肉毒梭菌H_C结构域来实现代替结合活性。

如本文中所使用，术语“肉毒梭菌毒素靶细胞”意指一种细胞，其是天然肉毒梭菌毒素能够使其中毒的天然细胞，包括但不限于运动神经元；感觉神经元；自主神经元，例如交感神经元和副交感神经元；非肽能神经元，例如胆碱能神经元、肾上腺素能神经元、去甲肾上腺素能神经元、5-羟色胺能神经元、GABA能神经元；和肽能神经元，例如P物质神经元、降钙素基因相关肽神经元、血管活性肠肽神经元、神经肽Y神经元、胆囊收缩素神经元。

“分离的”意指材料以不同程度独立于通常伴随其的组分(如以其原始状态所发现者)。“分离的”表示在一定程度上与原始来源或环境 (例如与侧翼DNA或与DNA的天然来源或与侧翼氨基酸)分开。

术语“纯化的”用于指物质(例如多肽)相对于制剂的其他组分(例如其他多肽)“基本上纯的”。其可以是指多肽相对于其他组分至少约 50％、60％、70％或75％，优选地至少约85％，更优选地至少约90％和最优选地至少约95％纯。换句话讲，关于多肽的术语“大体上纯的”或“基本上纯化的”是指制剂含有少于约20％，更优选地少于约15％、 10％、8％、7％，最优选地少于约5％、4％、3％、2％、1％或小于1％的一种或多种其他组分(例如其他多肽或细胞组分)。

本文所用的术语“保守的”或“保守性取代突变”是指如下突变：将氨基酸取代为另一具有类似性质的氨基酸，使得肽化学领域的技术人员预计多肽的二级结构、化学性质和/或亲水性质基本上不变。过去，以下类别的氨基酸彼此取代作为保守改变：(1)ala、pro、gly、glu、asp、 gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、try、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、 phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。其他通常接受的保守性取代列示于以下：

残基	保守性取代	残基	保守性取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu，Val

未提及具体氨基酸的术语“取代突变”可包括除通常发现于该位置处的野生型残基外的任一氨基酸。此类取代可以是用非极性(疏水) 氨基酸进行置换，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸。取代可以是用极性(亲水)氨基酸进行置换，例如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。取代可以是用带电荷的氨基酸(例如带负电荷的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)和带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸))进行置换。

本文所描述的取代突变通常将是用不同的天然氨基酸残基进行置换，但在一些情形下还可取代非天然氨基酸残基。非天然氨基酸，如本文中使用该术语时，是天然出现或以化学方式合成的非蛋白(即非蛋白质编码的)氨基酸。实例包括但不限于β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-取代丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、直链核心氨基酸、二氨基酸、 D-氨基酸和N-甲基氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸可经取代或未经取代。经取代的氨基酸或取代基可为卤化芳香族或脂肪族氨基酸、疏水侧链上的卤化脂肪族或芳香族修饰或脂肪族或芳香族修饰。

术语“治疗有效量”是指在向患有病状的典型受试者施用时足以实现病状的一种或多种症状在治疗上显著减轻的量。症状在治疗上显著减轻与对照或未治疗的受试者相比为(例如)约10％、约20％、约 30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％或更高。

术语“治疗”是指治疗性处理，其中目标是消除或减轻症状。有益或期望的临床结果包括但不限于消除症状、缓和症状、减弱病状程度、病状状态稳定(即不恶化)、延迟或减缓病状进展。

如本文中所使用，“受试者”是指人或动物。通常，动物是脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包含黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(例如恒河猴)。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科类(例如家猫)、犬科类(例如狗、狐狸、狼)、鸟类(例如鸡、鸸鹋、驼鸟)和鱼(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。患者或受试者包括前述种类的任一亚组(例如所有上述种类)，但不包括一个或多个类或物种(例如人、灵长类动物或啮齿类动物)。在本文所描述的方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可为雄性或雌性。受试者可为完全发育的受试者(例如成人)或正进行发育过程的受试者(例如儿童、婴儿或胎儿)。

优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可为人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人外的哺乳动物可有利地用作代表与不期望的神经元活性有关的病症的动物模型的受试者。另外，本文所描述的方法和组合物可用于治疗家养动物和 /或宠物。

实施方案

据观察，BoNT/B因其不能结合人Syt II而在人中具有较小特异性和功效，这可阐释需要相对高于BoNT/A的剂量。较高BoNT/B剂量对应于触发抗体反应和发生严重副作用的机会有所增加。因此，BoNT/B与人受体Syt II的改良结合(这增加了其对靶人神经元的效能和特异性)应使得治疗应用中所使用的毒素剂量的量有所减小。

本发明的方面源自以下发现：修饰BoNT/B-H_c的蛋白质序列会改变含有受体结合结构域的片段与人Syt II受体的结合。已鉴定出增强结合，由此生成以高亲和力结合人SytII的结构域的特异性修饰。在全长BoNT蛋白的情况下时，经修饰的BoNT/B-H_c保留这些结合性质。将具有增强的结合的经修饰的受体结合结构域并入包含其他 BoNT结构域的分子中由此生成具有类似增强的受体结合的全长 BoNT分子。因此，生成以高亲和力结合至人SytII的新形式BoNT。具有显著增强的结合的BoNT可用于类似疗法中，但其剂量低于当前可用的BoNT分子，由此提供更安全的治疗方法。

BoNT多肽(包括本文所描述的全长BoNT多肽和BoNT多肽片段或结构域(例如经修饰的BoNT/H_C))和编码其的核酸分子明确涵盖于本发明中。可通过本领域已知的重组DNA程序生成这些多肽和核酸分子。此类多肽通常称为“重组多肽”或“重组核酸”。

肉毒杆菌神经毒素蛋白

本发明的一个方面涉及本文所描述的包含经修饰的受体结合结构域(例如肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域)的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)蛋白。BoNT蛋白进一步包含蛋白酶结构域、移位结构域和蛋白酶裂解位点。通常，这些结构域以蛋白酶结构域、蛋白酶裂解位点、移位结构域和经修饰的受体结合结构域的直链氨基-至-羧基单一多肽顺序进行排列。然而，各种结构域的不同排列预计会适当地发挥作用。在一个实施方案中，经修饰的受体结合结构域包含一个或多个显著增强与人Syt I受体和/或人Syt II受体的结合的取代突变。

BoNT蛋白可进一步包含可用于纯化分子的结构域，例如六组氨酸标签(His6)或表位标签(例如血球凝集素(HA)标签)(YPYDVPDYA (SEQ ID NO:12))。已知各种此类结构域且在本领域中用于此类目的。

BoNT具有图1B中所展示的整体结构。BoNT包含三个结构域，每一结构域具有特定且独立的功能：蛋白酶结构域(也称为轻链)、移位结构域(H_N)和受体结合结构域(H_C)。已显示，肉毒梭菌神经毒素的各种菌株的结构域在很大程度上可互换(如以引用方式并入本文中的美国专利8,052,979中通过天然嵌合毒素(例如BoNT/CD)所证实，其由BoNT/C的轻链和H_N、BoNT/D的H_C构成³⁴)。蛋白质可为单链形式或双链形式。双链形式由位于蛋白酶结构域与移位结构域之间的蛋白酶裂解位点的天然蛋白酶加工产生。在蛋白酶加工后，因存在二硫键使蛋白质维持双链形式。

肉毒梭菌的菌株产生7种抗原上不同类型的肉毒杆菌毒素，其已通过探究人(BoNT/A、/B、/E和/F)、动物(BoNT/C1和/D)中的肉毒中毒爆发来加以鉴定，或自土壤分离(BoNT/G)。虽然所有7种BoNT 血清型皆具有类似结构和药理学性质，但各自还显示异质细菌学特征。肉毒梭菌菌株的基因多样性详细描述于Hill等人(Journal of Bacteriology，第189卷，第3期，第818-832页(2007))³⁵中，该文献的内容以引用方式并入本文中。在一个实施方案中，本发明BoNT具有全部是相同血清型(A、B、C、D、E、F或G)的结构域。在一个实施方案中，相同血清型的那些结构域中的一个或多个关于其菌株和/ 或亚型有所不同。

来自各种肉毒梭菌血清型/菌株的毒素共有相同功能结构域组织和整体结构架构。肉毒梭菌毒素各自翻译为大约150kDa的单链多肽，随后通过蛋白水解分裂在二硫化物环内由天然蛋白酶(例如内源性肉毒梭菌毒素蛋白酶或在环境中产生的天然蛋白酶)裂解。这种翻译后加工得到包含大约50kDa轻链(LC)和大约100kDa重链(HC)(其通过单个二硫键和非共价相互作用保持在一起)的双链分子。每一成熟双链分子包含三个功能不同的结构域：1)蛋白水解结构域，其位于LC 中且包括含有锌依赖性肽链内切酶活性且特异性靶向神经递质释放装置的核心组分的金属蛋白酶区域；2)移位结构域(H_N)，其含于HC 的氨基半末端内且促进LC自细胞内小泡向靶细胞的细胞质中的释放；和3)结合结构域，其发现于HC的羧基半末端内且决定了毒素对位于靶细胞表面处的受体复合物的结合活性和结合特异性。各种血清型/菌株的毒素内的特异性结构域的位置提供于表1中：

表1

得自各种血清型/菌株的肉毒梭菌毒素结构域

毒素的完整氨基酸序列提供于图14-21中。

这三种功能结构域的结合、移位和蛋白酶活性都是毒性所需的。不论血清型或亚型为何，肉毒梭菌毒素进入神经元中且抑制神经递质释放的整体细胞中毒机制类似。不期望受限于理论，中毒机制涉及至少以下4个步骤：1)受体结合，2)复合物内化，3)轻链移位，和4)蛋白酶靶修饰。在肉毒梭菌毒素的H_C结构域结合至位于靶细胞的质膜表面上的毒素特异性受体时，该过程就会被引发。受体复合物的结合特异性可视为部分地通过神经节苷脂和蛋白质受体的特定组合来实现。在结合后，毒素/受体复合物通过胞吞作用进行内化且将内化小泡分选至特定细胞内途径。通过酸化小泡腔室来触发移位步骤。在移位后，毒素的轻链肽链内切酶自细胞内小泡释放至胞质溶胶中，在此其特异性靶向称为神经递质释放装置的核心组分的三种蛋白质(小泡相关膜蛋白(VAMP)/小突触泡蛋白、25kDa突触相关蛋白质(SNAP-25) 和突触融合蛋白)中的一种。这些核心组分为神经末端处的突触小泡停泊和融合所需且构成可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着型蛋白质-受体(SNARE)家族的成员。BoNT/A和BoNT/E裂解羧基-末端区域中的SNAP-25，从而分别释放9或26个氨基酸的区段，且 BoNT/C1还裂解靠近羧基末端的SNAP-25。肉毒杆菌血清型BoNT/B、 BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G和破伤风毒素作用于VAMP的保守中心部分上且将VAMP的氨基末端部分释放至胞质溶胶中。BoNT/C1 裂解靠近胞质溶胶质膜表面的单一位点处的突触融合蛋白。突触SNARE的选择性蛋白水解会使得在体内阻断由肉毒梭菌毒素引起的神经递质释放。肉毒梭菌毒素的SNARE蛋白质靶标为各种非神经元类型中的胞吐作用所共有；在这些细胞中，如在神经元中一样，轻链肽酶活性抑制胞吐作用，例如参见Yann Humeau等人,How Botulinumand Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release,82(5) Biochimie.427-446(2000)；Kathryn Turton等人,Botulinum and Tetanus Neurotoxins:Structure,Function and Therapeutic Utility,27(11)Trends Biochem.Sci.552-558.(2002)；Giovanna Lalli等人,The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins inNeurons,11(9)Trends Microbiol. 431-437,(2003)。

结构域和嵌合神经毒素

本发明的肉毒杆菌神经毒素包含经修饰的受体结合结构域(H_C)。经修饰的受体结合结构域对一种或多种通常由一种或多种肉毒梭菌毒素菌株结合和利用的人受体(例如SytII、SytI)表现出显著增强的结合。经修饰的受体结合结构域可为任一血清型(A、B、C、D、E、F 或G)、菌株或亚型(如本文所描述)。此结构域可为与BoNT内的一个或多个其他结构域为相同或不同的血清型、菌株/亚型。特定经修饰的受体结合结构域的实例提供于本文中。本发明还涵盖本文所描述的分离的经修饰的受体结合结构域多肽以及编码其的分离的核酸分子。在一个实施方案中，H_C为血清型B。在一个实施方案中，H_C为血清型A。

本发明的肉毒杆菌神经毒素还包含蛋白酶结构域，其在本领域中也称为轻链变体。轻链变体可为天然轻链变体，例如肉毒梭菌毒素轻链同种型和肉毒梭菌毒素轻链亚型；或非天然肉毒梭菌毒素轻链变体，例如保守性取代肉毒梭菌毒素轻链变体。蛋白酶结构域可为任一血清型(A、B、C、D、E、F或G)、菌株或亚型(如本文所描述)。此结构域可为与BoNT内的一个或多个其他结构域为相同或不同的血清型、菌株/亚型。在一个实施方案中，蛋白酶结构域为血清型B。在一个实施方案中，蛋白酶结构域为血清型A。

本发明的肉毒杆菌神经毒素还包含毒素移位结构域(H_N)。毒素移位结构域可为任一血清型(A、B、C、D、E、F或G)、菌株或亚型(如本文所描述)。此结构域可为与BoNT内的一个或多个其他结构域为相同或不同的血清型、菌株/亚型。在一个实施方案中，H_N为血清型 B。在一个实施方案中，H_N为血清型A。

本文所描述的各种结构域(例如H_N、H_C或蛋白酶结构域)包括但不限于天然变体(例如同种型和亚型)、非天然变体(例如保守性取代突变)。非天然变体是指与参考序列的相应区域(例如来自表1或图14、 16-23)具有至少一种氨基酸变化的结构域且可以与该参考序列的相应区域的同一性百分比形式进行描述。

那些本领域的技术人员应认识到，肉毒梭菌毒素的每一血清型中可存在在其氨基酸序列方面和同样在编码这些蛋白质的核酸方面略有不同的天然肉毒梭菌结构域变体。设想用于生成本发明BoNT的天然肉毒梭菌毒素结构域(例如轻链、H_N或H_C)变体可以基本上与天然肉毒梭菌结构域变体所基于的参考肉毒梭菌毒素结构域相同的方式来发挥作用，且可在本发明的任一个方面中代替参考肉毒梭菌毒素结构域。

天然肉毒梭菌毒素结构域变体的非限制性实例是肉毒梭菌毒素结构域同种型，例如BoNT/A结构域同种型、BoNT/B结构域同种型、 BoNT/C1结构域同种型、BoNT/D结构域同种型、BoNT/E结构域同种型、BoNT/F结构域同种型和BoNT/G结构域同种型。肉毒梭菌毒素结构域同种型可以基本上与肉毒梭菌毒素结构域同种型所基于的参考肉毒梭菌毒素结构域相同的方式发挥作用，且可在本发明的任一个方面中代替参考肉毒梭菌毒素结构域。

天然肉毒梭菌毒素结构域变体的另一非限制性实例是肉毒梭菌毒素结构域亚型，例如来自亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、 BoNT/A4、BoNT/A5的结构域；来自亚型BoNT/B1、BoNT/B2、 BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7的结构域；来自亚型BoNT/C1-1、BoNT/C1-2、BoNT/D-C的结构域；来自亚型 BoNT/E1、BoNT/E2、BoNT/E3、BoNT/E4、BoNT/E5、BoNT/E6、 BoNT/E7、BoNT/E8的结构域；和来自亚型BoNT/F1、BoNT/F2、 BoNT/F3、BoNT/F4、BoNT/F5、BoNT/F6、BoNT/F7的结构域。肉毒梭菌毒素结构域亚型可以基本上与肉毒梭菌毒素结构域亚型所基于的参考肉毒梭菌毒素结构域相同的方式发挥作用，且可在本发明的任一个方面中代替参考肉毒梭菌毒素结构域。

如本文中所使用，术语“非天然变体”(例如肉毒梭菌毒素轻链变体H_C和H_N)意指借助于人操作产生的肉毒梭菌结构域，包括但不限于通过基因工程改造使用随机诱变或合理设计产生的结构域和通过化学合成产生的肉毒梭菌结构域。非天然肉毒梭菌结构域变体的非限制性实例包括(例如)保守性肉毒梭菌结构域变体。如本文中所使用，术语“保守性肉毒梭菌结构域变体”意指至少一个氨基酸由具有至少一种类似于来自参考肉毒梭菌结构域序列的原始氨基酸的性质的另一氨基酸或氨基酸类似物取代的肉毒梭菌结构域(例如，表1和图12、 14-21)。该变体与参考结构域序列相比可具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个保守性氨基酸取代。性质的实例包括但不限于类似大小、形貌、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键结能力、氢键结能力、物理化学性质等或其任一组合。保守性肉毒梭菌结构域变体可以基本上与保守肉毒梭菌毒素结构域变体所基于的参考肉毒梭菌毒素结构域相同的方式发挥作用，且可在本发明的任一个方面中代替参考肉毒梭菌毒素结构域。

非天然肉毒梭菌毒素结构域变体可取代来自天然肉毒梭菌毒素结构域所基于的参考肉毒梭菌毒素结构域的一个或多个氨基酸(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)。非天然肉毒梭菌毒素结构域变体还可与天然肉毒梭菌结构域变体所基于的参考肉毒梭菌毒素结构域拥有95％或更高(例如96％、97％、98％或99％)的氨基酸同一性。

各种非天然肉毒梭菌神经毒素或其特异性结构域描述于国际专利公开WO95/32738、WO96/33273、WO98/07864和WO99/17806中，这些公开中的每一个以引用方式并入本文中。本文所描述的肉毒梭菌神经毒素或其特异性结构域通常将含有天然氨基酸残基，但在一些情形下还可存在非天然氨基酸残基。因此，所谓的“肽模拟物”和“肽类似物”(其可包括模拟特定氨基酸或肽的结构的非氨基酸化学结构)还可用于本发明的上下文内。通常将此类模拟物或类似物表征为表现出类似物理特征，例如大小、电荷或疏水性和发现于其天然肽对应体中的适当的空间定向。肽模拟化合物的一具体实例是其中一种或多种氨基酸之间的酰胺键由(例如)碳-碳键或其他非酰胺键置换的化合物，如在本领域中所众所周知(例如参见Sawyer,Peptide Based Drug Design, 第378-422页,ACS,Washington D.C.1995)。

在本发明的一个方面中，本发明的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)包含肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域(BoNT/B-H_c)。经修饰的BoNT/B-H_c包含一个或多个使得与人Syt I受体和/或人Syt II受体的结合显著增强的取代突变。在一个实施方案中，BoNT/B-H_c来自 BoNT/B1(GenBank登录编号：AB232927.1)。用作本发明中的参考模板的BoNT/B1-H_COkra菌株的氨基酸序列示于图12中。还设想自其他菌株和亚型通过取代对应于本文所描述B1中的指定位置的氨基酸来生成B-H_c，如生成并入B-H_c的较长分子(例如完整BoNT或包含经修饰的B-H_c的多肽)。此类分子也涵盖于本发明中。在一个实施方案中，本发明的BoNT或多肽包含并非来自称为Eklund菌株的BoNT/B4 菌株的经修饰的受体结合结构域(NCBI参考序列：YP_001893661.1， Genbank参考编号：EF051570.1)，如图21中所示。在一个实施方案中，经修饰的B-H_c并非来自菌株3、7或8。

毒素扩散且生成中和抗体是与(但不限于)BoNT/B有关的问题，正如也使用BoNT/A观察到。改良BoNT/A与其受体SV2的结合亲和力将减轻这些问题。因为BoNT/B与Syt I/II的结合亲和力远高于 BoNT/A与SV2的结合^14,20,26,27，所以还可使用能够结合人Syt II的经修饰的BoNT/B受体结合结构域(BoNT/B-H_C)代替BoNT/A-H_C来生成经修饰的嵌合BoNT/A，其可较WT BoNT/A对人神经元具有更高效能和特异性。^28 29 30

另外设想，可利用上文所描述的经修饰的H_C(例如BoNT/B-H_c) 代替所有其他BoNT血清型/菌株的H_C。因此，本发明的另一个方面是包含血清型(A、B、C、D、E、F或G)的经修饰的受体结合结构域 (H_C)的BoNT多肽，其与一种或多种具有不同血清型(A、B、C、D、 E、F或G)菌株或亚型的结构域进行连接由此产生嵌合神经毒素。充分确定每一BoNT的H_C区域且各自的H_C区域可在BoNT分子中进行交换(例如经由基因工程改造)。此类操作通常是由技术人员经由编码 BoNT/B-H_c的DNA与其他BoNT的轻链(LC)和移位结构域(H_N)或 H_N-LC的标准PCR融合来进行，这已在本领域中充分确立。另外，还可使用BoNT/B-H_c的C-末端部分(称为H_CC，其为每一BoNT中含有蛋白质受体和神经节苷脂的结合位点的区域)进行代替。所得嵌合毒素将能够经由结合至人Syt I/II来靶向人神经元。作为一非限制性实例，可使用经修饰的BoNT/B-H_c(或BoNT/B-H_CC)代替BoNT/A的 H_C(或H_CC)。本发明涵盖所得多肽。这些嵌合毒素较WTBoNT/A可具有靶向人神经元的更高效能和特异性。此类嵌合BoNT/A毒素可用于人中的治疗应用中且较WT BoNT/A提供显著改良。

本发明的一个方面涉及如本文所描述的分离的、纯化的经修饰的受体结合结构域多肽。在一个实施方案中，经修饰的受体结合结构域是BoNT/B-H_c(例如来自BoNT/B1)。在一个实施方案中，B-H_c是自 BoNT的不同菌株和/或亚型通过取代对应于本文所描述的B1中的指定位置的氨基酸生成。在一个实施方案中，H_C是亚型B2、B3、B4、 B5、B6或B7。在一个实施方案中，经修饰的受体结合结构域并非来自BoNT/B4(Eklund菌株)。在一个实施方案中，经修饰的B-H_C并非来自菌株3、7或8。

本发明涵盖含有如本文所描述具有氨基酸取代的经修饰的H_C(例如B-H_c)的突变全长BoNT，其用于人中的治疗应用中。在一个实施方案中，全长BoNT含有经修饰的H_C(例如B-H_c)，其在一个对应于 B1的位置E1191、S1199、Y1183和W1178的氨基酸残基的一个或其组合处具有氨基酸取代(例如选自表2所列的那些)。在一个实施方案中，BoNT含有具有如本文所描述的单一氨基酸取代的经修饰的 H_C(例如B-H_c)。在一个实施方案中，BoNT含有具有如本文所描述的两个氨基酸取代的经修饰的H_C(例如B-H_c)。在一个实施方案中，BoNT 含有具有如本文所描述的三个氨基酸取代的经修饰的H_C(例如B-H_c)。突变可以如本文针对BoNT/H_C所公开的相同方式进行(例如使用任一 BoNT/B亚型或任一血清型作为模板)。在一个实施方案中，突变全长 BoNT含有并非来自BoNT/B4(Eklund菌株)的经修饰的Hc。在一个实施方案中，经修饰的B-H_C并非来自菌株3、7或8。

所得BoNT毒素可与人Syt II具有显著增强的结合，且由此将较 WT BoNT对靶人神经元实现较高效能和特异性。所得突变体可另外维持与人SytI的类似结合，与人SytI具有显著增强的结合，或与人 SytI具有显著降低的结合。

多肽和嵌合多肽

本发明的另一个方面涉及包含经修饰的受体结合结构域(例如来自血清型A、B、C、D、E、F或G)的多肽。在一个实施方案中，在多肽的情况下，与在Hc中修饰的特定位置处具有WT氨基酸的类似多肽(野生型对应体)相比，经修饰的Hc与人Syt II和/或Syt I具有显著增强的结合。在一个实施方案中，经修饰的受体结合结构域是 BoNT/B-H_c(例如来自BoNT/B1)。在一个实施方案中，经修饰的H_c是自BoNT的不同血清型、菌株和/或亚型通过取代对应于本文所描述B1中的指定位置处的氨基酸所生成。在一个实施方案中，经修饰的H_C并非来自BoNT/B4(Eklund菌株)。在一个实施方案中，经修饰的B-H_C并非来自菌株3、7或8。在一个实施方案中，经修饰的受体结合结构域在BoNT/B-H_c的C-末端部分(称为H_CC，其为每一BoNT中含有蛋白质受体和神经节苷脂的结合位点的区域)中具有一个或多个修饰(氨基酸取代)。在一个实施方案中，所得多肽能够经由结合至人SytI/II来靶向人神经元。

包含经修饰的受体结合结构域的多肽可为受体结合结构域与另一功能多肽(例如双杂合系统中所利用的功能多肽(诱饵或捕获物，例如T18或T25或谷胱甘肽S转移酶(GST))的融合蛋白。这也可称为嵌合多肽分子。或者，其可为经修饰的受体结合结构域和用于鉴定目的和/或纯化目的的多肽标签(例如六组氨酸标签(His6)或表位标签(例如血球凝集素(HA)标签(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:12)))或GST)的融合物，许多已众所周知且在本领域中常用。融合物可在各自的功能结构域之间具有氨基酸序列段，其促进连接、用作裂解位点或保持独立构象和/或功能。在一个实施方案中，连接保持经修饰的受体结合结构域的功能。在一个实施方案中，连接掩蔽经修饰的受体结合结构域的功能。本发明的另一个方面涉及编码此类多肽中的任一个的核酸分子。

经修饰的BoNT/H_C(例如B-H_c)可以共价(例如作为融合蛋白)或非共价连接至其他物质(例如蛋白质、小分子、短多肽、核酸)。因此，本发明的另一个方面涉及一种嵌合分子，其包含是如本文所描述的肉毒杆菌(例如血清型B)的经修饰的受体结合结构域的第一部分，其连接至第二部分。分子的第二部分可为生物活性(或“生物学活性”)分子，例如治疗剂(例如多肽或非多肽药物，例如小分子或核酸)。分子的第一和第二部分的连接可为共价(例如呈融合蛋白形式)或非共价形式。此类连接的方法为本领域中已知且可易于由本领域的技术人员应用。本发明的嵌合分子的一种此类应用是作为递送工具来靶向人中的神经元。例如，经修饰的BoNT/H_C可连接至其他治疗剂，从而用作靶向媒介物以通过结合至人Syt I和/或Syt II来将治疗剂递送至人中的神经元。

受体结合结构域(Hc)的修饰

如本文中所论述，本发明涉及经修饰的Hc和包含经修饰的Hc 的多肽(例如BoNT或融合物或嵌合多肽)。可通过本领域的技术人员已知的各种方法来修饰用于生成本发明的这些各种多肽的H_C氨基酸序列。实例包括但不限于靶向诱变(定点诱变)或随机诱变已知用于结合Syt I/II的区域内的每个氨基酸残基。这些Syt结合区域通过涉及小鼠或大鼠Syt受体的先前研究充分确定^{1,29,36,31,32}，但尚未明确测定 BoNT/B-H_c与人Syt受体之间的相互作用。可使用BoNT/B的不同亚型或其他结合Syt I/II的血清型(D-C或G)作为模板通过生成本文针对 B1-H_C所描述的相应突变来产生相同或类似突变。拟突变的所选残基的相应位置可易于与B1亚型通过序列比对来鉴定。本发明涵盖所得多肽产物以及包含所述产物的多肽和编码所述多肽和产物的核酸分子。

用以产生经修饰的受体结合结构域的H_C的氨基酸序列修饰可为如下修饰：将单一残基突变为不同氨基酸(单位点取代)、同时突变多个残基(多位点取代)、缺失一个或多个残基(缺失)和插入一个或多个残基(插入)以及其组合。使蛋白质突变的方法为本领域中所熟知(例如编码BoNT/H_C序列的DNA上的靶向单一位点和多位点取代)。

在一个实施方案中，基于关于BoNT/B受体结合结构域²⁹和所报道的BoNT/B-Syt II结构(PDB ID:2NM1)^31,32的先前文献，修饰H_C中接触啮齿类动物Syt II或周围区域的一个或多个残基。这些包括但不限于对应于BoNT/B-B1的位置Y1181、P1197、A1196、F1204、F1194、P1117、W1178、Y1183、V1118、S1116、K1113、K1192、S1199、S1201、 E1191、E1245、Y1256、D1115、E1203的那些位置。在一个实施方案中，这些残基中的一个或多个经其他氨基酸系统性置换。还设想各种修饰的组合，包括但不限于两个或更多个所列举位置突变为任一种类的氨基酸(例如本文列举的那些)。

可通过组合这些所鉴定关键残基中的突变来生成多位点取代(例如2或3个)。此类多位点取代突变体可进一步增强与h-Syt II的结合且可进一步维持或增强与人Syt I的结合。在一个实施方案中，经修饰的H_C具有对应于血清型B菌株1的E1191的第一氨基酸取代且经Q、M、C、V、L或Y取代。在一个实施方案中，经修饰的H_C具有对应于血清型B菌株1的S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、 W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、S1199F 或S1199L的第二位点取代。在一个实施方案中，经修饰的H_C具有对应于血清型B菌株1的E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、 E1191C和S1199W、E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q 和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1199Y或E1191V和 W1178Q的多位点取代。

在一个实施方案中，经修饰的受体结合结构域在对应于血清型B 菌株1的Y1181、P1197、A1196、F1204、F1194、P1117、W1178、 Y1183、V1118、S1116、K1113、K1192、S1199、S1201、E1191、E1245、 D1115、E1203或Y1256的位置处包含取代突变。在一个实施方案中，取代突变是A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、 T、W、Y或V取代S。在一个实施方案中，该位置对应于血清型B 菌株1的S1199或S1201。在一个实施方案中，取代突变是W、E或 H。在一个实施方案中，取代突变是在S1199处且为W、E或H。在一个实施方案中，取代突变是在S1201处且为V。在一个实施方案中，该位置对应于W1178、Y1183或E1191。在一个实施方案中，该位置对应于W1178且取代突变是Y、Q、A或S。在一个实施方案中，该位置对应于Y1183且取代突变是C或P。在一个实施方案中，该位置对应于E1191且取代突变是C、V、L或Y。

还设想具有下面表2中所示的单一氨基酸取代突变的经修饰的 H_C，如同将其并入本文所描述的各种多肽中一样。

表2

E1191M	Y1183C	S1199E
					E1191Q	Y1183P	S1199H
E1191C	Y1183M	S1199Y	P1117S	A1196Y
					E1191V		S1199W	P1117M
E1191L	W1178Q	S1199F	P1117Y	Y1181M
					E1191Y	W1178Y	S1199L
E1191T	W1178A		V1118M
					E1191I	W1178S	S1201V

在一个实施方案中，H_C包含一个或多个对应于血清型B菌株1 的E1191C/V/L/Y(E1191C、E1191V、E1191L或E1191Y)、 S1199W/E/H(S1199W、S1199E或S1199H)、W1178Y/Q/A/S(W1178Y、 W1178Q、W1178A或W1178S)和/或Y1183C/P(Y1183C或Y1183P) 的突变(图3A、B)。

在一个实施方案中，H_C具有两个取代突变，其中一个是选自表2 的对应于1191位的取代突变。在一个实施方案中，与在指定位置处具有WT氨基酸的类似多肽(在本文中也称为野生型对应体)相比，Hc 对h-Syt II具有增强的结合。在一个实施方案中，与野生型对应体相比，所生成的突变体还与人Syt I维持或具有显著增强的结合。具体而言，突变是E1191C、E1191V、E1191L或E1191Y。更具体地，将对应于位置E1191C、E1191V、E1191L或E1191Y的突变与第二突变(例如本文描述的那些)进行组合以生成与在指定位置处具有WT氨基酸的类似多肽(在本文中也称为野生型对应体)相比对h-Syt II具有增强的结合的经修饰的H_C。在一个实施方案中，与野生型对应体相比，所生成的突变体还与人Syt I维持或具有显著增强的结合(图4A)。在一个实施方案中，第二突变是对应于表2中针对位置1183、1199、 1201、1178、1117或1181所示的取代的取代突变。在一个实施方案中，第二突变是S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、W1178Y、 W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、S1199F或S1199L。在一个实施方案中，H_C具有两个取代突变，其对应于表3中针对血清型B菌株1所示的那些：

表3

E1191M和S1199Y	E1191Q和S1199Y	E1191C和S1199Y
			E1191M和S1199W	E1191Q和S1199W	E1191C和S1199W
E1191M和S1199L	E1191Q和S1199L	E1191V和S1199Y
			E1191M和S1199Y	E1191Q和S1199Y	E1191V和S1199W
E1191M和S1199F	E1191Q和S1199F	E1191M和W1178Q
					E1191Q和W1178Q
		E1191C和W1178Q
					E1191V和W1178Q

在一个实施方案中，H_C具有三个取代突变，在本文中也称为三重突变。在三重突变的一个实施方案中，第一突变对应于血清型B 菌株1的E1191Q、E1191M、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、 S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、S1199F、S1199L、Y1183C、Y1183P、W1178Y、W1178Q、W1178A或W1178S。在一个实施方案中，第二突变对应于血清型B菌株1的E1191Q、E1191M、E1191C、 E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、S1199F、S1199L、Y1183C、Y1183P、W1178Y、W1178Q、W1178A 或W1178S(不包括用作第一突变的位置)。在一个实施方案中，第三取代对应于血清型B菌株1的E1191Q、E1191M、E1191C、E1191V、 E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、S1199F、S1199L、Y1183C、Y1183P、W1178Y、W1178Q、W1178A或W1178S(不包括用作第一和第二突变的位置)。在本发明的一个实施方案中，双重或三重突变在对应于E1191和W1178的两个位置处并不含有Q取代。

在三重突变的一个实施方案中，一个突变是对应于表2中针对 E1191所示的取代的取代突变(例如E1191Q/M/C/V/L或Y)。第二突变可为对应于表2中针对S1199所示的取代的取代突变(例如 S1199W/E/H/Y/F或L)。第三突变可为对应于表2中针对W1178所示的取代的取代突变(例如W1178Y/Q/A或S)。或者，第三突变可为对应于表2中针对Y1183所示的取代的取代突变(例如Y1183C、 Y1183P)。在一个实施方案中，三重突变对应于 E1191M/S1199W/W1178Q。

核酸分子

本发明的另一个方面涉及一种分离的核酸分子，其包含编码本文所描述的多肽(例如本文所描述的经修饰的受体结合结构域或包含经修饰的受体结合结构域的多肽或包含经修饰的受体结合结构域的肉毒杆菌神经毒素)的核苷酸序列。在一个实施方案中，核酸分子包含图13中所示的核酸序列。此类核酸分子可由技术人员(例如)通过重组 DNA技术产生。期望的氨基酸取代突变是(例如)通过修饰编码DNA 来进行的。例如，通过使用以下所示的遗传密码使编码指定氨基酸的核酸密码子突变为期望的氨基酸来生成编码本文所描述多肽的核酸序列：

TTT

Phe

TCT

Ser

TAT

Tyr

TGT

Cys

TTC

Phe

TCC

Ser

TAC

Tyr

TGC

Cys

TTA

Leu

TCA

Ser

TGA

TTG

Leu

TCG

Ser

TGG

Trp

CTT

Leu

CCT

Pro

CAT

His

CGT

Arg

CTC

Leu

CCC

Pro

CAC

His

CGC

Arg

CTA

Leu

CCA

Pro

CAA

Gln

CGA

Arg

CTG

Leu

CCG

Pro

CAG

Gln

CGG

Arg

ATT

Ile

ACT

Thr

AAT

Asn

AGT

Ser

ATC

Ile

ACC

Thr

AAC

Asn

AGC

Ser

ATA

Ile

ACA

Thr

AAA

Lys

AGA

Arg

ATG

Met*

ACG

Thr

AAG

Lys

AGG

Arg

GTT

Val

GCT

Ala

GAT

Asp

GGT

Gly

GTC

Val

GCC

Ala

GAC

Asp

GGC

Gly

GTA

Val

GCA

Ala

GAA

Glu

GGA

Gly

GTG

Val

GCG

Ala

GAG

Glu

GGG

Gly

在一个实施方案中，将核酸序列优化以便在大肠杆菌中表达(例如基于GenBankAB232927.1的核酸序列，其相关部分示于图13中)。

本发明的另一个方面涉及包含本文所描述的核酸分子的核酸载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。此类表达载体在本文中称为表达构建体，且包含可操作连接至可用于在细胞或无细胞提取物中表达核酸分子的表达载体的本文所公开的核酸分子。可采用各种表达载体来表达编码本发明的肉毒梭菌神经毒素的核酸分子，包括但不限于病毒表达载体；原核表达载体；真核表达载体，例如酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体；和无细胞提取物表达载体。另外应理解，可用于实践这些方法的方面的表达载体可包括在组成型、组织特异性、细胞特异性或诱导型启动子元件、增强子元件或二者的控制下表达肉毒梭菌神经毒素的那些。表达载体以及充分确立的用于由此类表达载体制备和使用表达构建体的试剂和条件的非限制性实例易于自商业供应商获得，该商业供应商包括但不限于BDBiosciences-Clontech,Palo Alto,Calif.；BD Biosciences Pharmingen, San Diego,Calif.；Invitrogen,Inc,Carlsbad,Calif.；EMD Biosciences-Novagen,Madison,Wis.；QIAGEN,Inc.,Valencia,Calif.；和 Stratagene,La Jolla,Calif。适当表达载体的选择、制备和使用是本领域的技术人员所熟知和来自本文中的教示内容的常规程序。

细胞

本发明的另一个方面涉及包含本文所描述的核酸分子或表达构建体的细胞。该细胞可用于使核酸增殖或用于使核酸表达，或用于此二者。此类细胞包括但不限于原核细胞，包括但不限于需氧、微量需氧、嗜二氧化碳、兼性、厌氧、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞的菌株，例如衍生自(例如)以下的那些：大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气芽孢梭菌(Clostridia perfringens)、困难梭状芽孢杆菌(Clostridia difficile)、新月柄杆菌 (Caulobacter crescentus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、曼宁双球菌(Neisseria meningirulls)、脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；和真核细胞，包括但不限于酵母菌株，例如衍生自以下的那些：巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母 (Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)；昆虫细胞和衍生自昆虫的细胞系，例如衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇 (Drosophilamelanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)的那些；和哺乳动物细胞和衍生自哺乳动物细胞的细胞系，例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类动物和人的那些。可自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)、欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Culture)和德国微生物和细胞培养物保藏中心(GermanCollection of Microorganisms and Cell Culture)获得细胞。用于选择、制备和使用适当细胞系的特定方案的非限制性实例描述于 (例如)以下参考文献中：INSECT CELLCULTURE ENGINEERING (Mattheus F.A.Goosen等人编,Marcel Dekker,1993)；INSECTCELL CULTURES:FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J.M.Vlak 等人编,Kluwer AcademicPublishers,1996)；Maureen A.Harrison&Ian F.Rae,GENERAL TECHNIQUES OF CELLCULTURE(Cambridge University Press,1997)；CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORYPROCEDURES(Alan Doyle等人编,John Wiley and Sons,1998)；R.Ian Freshney,CULTUREOF ANIMAL CELLS:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss,第4版,2000)； ANIMALCELL CULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John R.W. Masters编,Oxford UniversityPress,第3版,2000)；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL,同上,(2001)；BASICCELL CULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis,Oxford Press, 第2版,2002)；和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,同上,(2004)。这些方案是本领域的技术人员所熟知和来自本文中的教示内容的常规程序。

细胞可用于表达核酸以由此生成所编码的多肽。因此，本发明的另一个方面是用于产生本文所描述的肉毒杆菌神经毒素蛋白、分离的 HC或包含经修饰的HC的多肽的方法。在表达构建体的情况下，通过培养内部具有编码多肽的核酸的宿主细胞来产生此类多肽。在适于产生BoNT多肽的条件下进行培养。可通过本领域中已知的方法从培养物回收、纯化并配制所表达的多肽。还可视需要通过本领域中已知的方法活化所表达的多肽。活化所表达的多肽的一种方法是通过蛋白酶裂解(或切割)成活性双链形式。此类方法可改编自本领域中已知的那些方法，例如如通过Peter F.Bonventre和Lloyd L.KLempe(J. Bacteriol1960,79(1):23以及Michaeal L.Dekleva和Bibhuti R. DasGupta(Biochemical andBiophysical Research Communicaitons 1989, 162:767-772)所公开。

药物组合物

本发明的另一个方面涉及包含本文所描述的肉毒梭菌神经毒素或嵌合分子的药物组合物。在一个实施方案中，本文所描述的多肽是包含药学上可接受的载体的组合物(在本文中称为药物组合物)中的活性成分。“药学上可接受的载体”意指用以混合靶向递送组合物和/或递送至受试者的任一药学上可接受的物质。本文所用的术语“药学上可接受的载体”意指涉及将主题药剂自身体的一个器官或部分携载或运输至身体的另一器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。每种载体必须在与组合物的其他成分相容的意义上“可接受”且与向受试者(例如人)的施用相容。此类组合物可经特定配制以用于经由许多途径(例如本文所描述的施用途径)中的一种或多种进行施用。还可将补充活性成分并入组合物中。在将本文所描述的药剂、配制物或药物组合物施用给受试者时，优选地施用治疗有效量。如本文中所使用，术语“治疗有效量”是指使得改善或补救病状的量。在一个实施方案中，药物组合物经配制用于通过注射施用。在一个实施方案中，药物组合物涉及封装于微球体中的肉毒杆菌神经毒素。在一个实施方案中，药物组合物涉及经配制用于经上皮递送的肉毒杆菌神经毒素。在一个实施方案中，药物组合物涉及经配制用于缓慢释放的肉毒杆菌神经毒素。

在一个实施方案中，本发明的肉毒杆菌神经毒素、多肽或嵌合分子是呈受控释放配方形式。此类组合物和用于施用的方法提供于美国专利公开第2007/0020295号中，该公开的内容以引用方式并入本文中。

可通过在发酵罐中使肉毒梭菌的培养物确立并生长且然后根据已知程序收获并纯化发酵混合物来获得肉毒杆菌神经毒素。所有肉毒杆菌毒素血清型最初合成为非活性的单链蛋白质形式，其必须通过蛋白酶裂解或切割以变得具有神经活性。产生肉毒杆菌毒素血清型A 和G的细菌菌株拥有内源性蛋白酶和血清型A和G可由此自细菌培养物主要以其活性形式回收。与之相比，肉毒杆菌毒素血清型C₁、D 和E是通过非蛋白水解菌株合成且由此通常在从培养物回收时未活化。血清型B和F是通过蛋白水解和非蛋白水解菌株产生且由此可呈活性或非活性形式回收。产生(例如)肉毒杆菌毒素B型血清型的蛋白水解菌株可仅裂解所产生毒素的一部分。切割与非切割分子的确切比例取决于孵育时间长度和培养温度。因此，某一百分比的制剂(例如肉毒杆菌毒素B型毒素)可为非活性的。在一个实施方案中，本发明的神经毒素处于活性状态。在一个实施方案中，神经毒素处于非活性状态。在一个实施方案中，设想活性和非活性神经毒素的组合。

试剂盒

本发明还涵盖包括本文所公开的BoNT或多肽(例如呈药物组合物形式)的试剂盒。该试剂盒可包括一种或多种包装于小瓶中的本文所描述的组合物。该试剂盒可进一步包括用于治疗性施用组合物的递送工具或器件和/或用于治疗性施用的说明书。该试剂盒可将其中的所有组分包装至所形成的容器中。

本发明的另一个方面涉及用于施用本文所描述的药物组合物的递送工具或器件，其预装载有药物组合物(例如用于单一应用)。此类器件可为用于递送组合物的注射器或微针器件。注射器可为预装载有有效量的组合物的一次性注射器。微针器件可包括一个或多个涂覆有本文所描述的组合物的微针，如美国专利公开2010/0196445中所描述的，该公开的内容整体并入本文中。

治疗方法

本发明还包括治疗通常使用神经毒素治疗的病状(例如骨骼肌病状、平滑肌病状、腺病状、神经肌肉病症、自主病症、疼痛或美学/ 美容病状)的方法。此类病状与不期望的神经元活性有关，如由技术人员所测定。该方法包括以下步骤：将治疗有效量的本文所描述的BoNT或多肽/嵌合分子(例如呈药物组合物形式)施用至哺乳动物中的适当位置以降低不期望的神经元活性，由此治疗病状。通过使有效量的组合物与表现出不期望活性的神经元接触的途径进行施用。

设想的通过本文所论述的方法进行治疗的具体病状包括但不限于痉挛性发音困难、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌发音困难、舌肌张力障碍、颈部肌张力障碍、局部手肌张力障碍、睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑病症、脑性麻痹、局部痉挛和其他发音障碍、痉挛性结肠炎、神经性膀胱障碍(即所有涉及尿失禁的疾病，例如神经性逼尿肌过动或特发性膀胱过动)、前列腺癌和其他癌症形式、肛门痉挛、肢体痉挛、抽搐、颤抖、磨牙、肛裂、弛缓不能、吞咽困难和其他肌肉张力病症和其他特征在于肌群的不随意运动的病症、流泪、多汗症、过度流涎、胃肠道分泌过多以及其他分泌病症、由肌肉痉挛引起的疼痛、神经病性疼痛、发炎性疼痛、头痛(例如偏头痛)、发痒(搔痒)、痤疮。另外，本发明可用于治疗皮肤病学或美学/美容病状，例如减少抬头纹、减少皮肤皱纹。本发明还可用于治疗运动损伤。

另外，可使用通常使用肉毒杆菌类型A实施的熟知技术施用经修饰的神经毒素以治疗其他神经肌肉病症。例如，本发明可用于治疗疼痛，例如头痛、由肌肉痉挛引起的疼痛和各种形式的炎症性疼痛。例如，Aoki美国专利第5,721,215号和Aoki美国专利第6,113,915号公开使用A型肉毒杆菌毒素治疗疼痛的方法。这两个专利的公开内容以引用方式整体并入本文中。

还可使用经修饰的神经毒素治疗自主神经系统病症。例如，腺机能障碍是自主神经系统病症。腺机能障碍包括出汗过多和过度流涎。呼吸机能障碍是自主神经系统病症的另一实例。呼吸机能障碍包括慢性阻塞性肺病和哮喘。Sanders等人在美国专利第5,766,605号中公开使用天然肉毒杆菌毒素治疗自主神经系统(例如治疗诸如出汗过多、过度流涎、哮喘等自主神经系统病症)的方法。Sander等人的公开内容以引用方式整体并入本文中。在一个实施方案中，可采用基本上类似于Sanders等人的方法，但使用经修饰的神经毒素来治疗自主神经系统病症(例如上文所论述的)。例如，可按足以使自主神经系统中控制鼻腔中的黏液分泌的胆碱能神经元退化的量将经修饰的神经毒素局部施加至哺乳动物的鼻腔。

可通过经修饰的神经毒素治疗的疼痛包括由肌肉紧张或痉挛引起的疼痛或与肌肉痉挛无关的疼痛。例如，Binder在美国专利第 5,714,468号中公开，可使用天然肉毒杆菌毒素(例如A型肉毒杆菌) 治疗由血管功能紊乱、肌肉紧张、神经痛和神经病变引起的头痛。Binder的公开内容以引用方式整体并入本文中。在一个实施方案中，可采用基本上类似于Binder的方法，但使用经修饰的神经毒素来治疗头痛，尤其是由血管功能紊乱、肌肉紧张、神经痛和神经病变引起的头痛。还可通过施用经修饰的神经毒素来治疗由肌肉痉挛引起的疼痛。例如，WO2006001676(Kang Ahn)公开使用肉毒杆菌神经毒素治疗由隐静脉神经卡压引起的膝关节疼痛的方法，WO2008059126 (Christine Favre等人)公开使用肉毒杆菌神经毒素治疗由化学疗法诱发的疼痛的方法，WO2008090287(Christine Favre等人)公开使用肉毒杆菌神经毒素治疗由抗HIV治疗诱发的疼痛的方法， WO2009130600(Christine Favre等人)公开使用肉毒杆菌神经毒素治疗与糖尿病性神经病变有关的疼痛的方法，且WO2007144493(Michel Auguet等人)公开使用肉毒杆菌神经毒素与鸦片剂衍生物的组合治疗疼痛的方法。WO2006001676、WO2008059126、WO2008090287、 WO2009130600、WO2007144493的公开内容以引用方式整体并入本文中。此外，可将经修饰的神经毒素施用给哺乳动物以治疗与肌肉病症(例如痉挛)无关的疼痛。在一广泛实施方案中，治疗非痉挛相关疼痛的本发明方法包括中心施用或周边施用经修饰的神经毒素。

还可通过将经修饰的神经毒素局部、周边施用至哺乳动物上的实际或感知的疼痛位置来缓和与肌肉痉挛无关的急性或慢性疼痛。在一个实施方案中，在疼痛位置处或附近(例如在切口处或附近)经皮下施用经修饰的神经毒素。在一些实施方案中，在疼痛位置处或附近(例如在哺乳动物上的受伤位置处或附近)经肌内施用经修饰的神经毒素。在一些实施方案中，将经修饰的神经毒素直接注射至哺乳动物的关节中以用于治疗或缓和由关节炎病状引起的疼痛。同样，将经修饰的神经毒素频繁重复注射或输注至周边疼痛位置处在本发明范围内

此类方法的施用途径为本领域中已知且可容易地由技术人员适用于本文所描述的方法(例如参见Harrison's Principles of Internal Medicine(1998)，由AnthonyFauci等人编辑，第14版，由McGraw Hill 出版)。通过非限制性实例，神经肌肉病症的治疗可包括将有效量的分子局部施用至肌肉或肌肉群的步骤，自主病症的治疗可包括将有效量的分子局部施用至一个或多个腺体的步骤，且疼痛的治疗可包括将有效量的分子施用疼痛部位的步骤。另外，疼痛的治疗可包括将有效量的经修饰的神经毒素施用至脊髓的步骤。

还设想，可利用本文所描述的经修饰的H_C(例如B-H_c)作为递送工具来靶向人中的神经元和表达人突触结合蛋白II的其他细胞类型。例如，共价或非共价连接至另一生物活性分子(例如治疗剂)以由此形成本文所描述的嵌合分子的经修饰的H_C可用作靶向媒介物以将生物活性分子递送至人中的神经元和表达人突触结合蛋白II的其他细胞类型(通过结合至人Syt I和/或Syt II)。因此，本发明的另一个方面涉及本文所描述的嵌合多肽分子将生物活性分子递送至人受试者中的神经元的用途。分子的第二部分可为生物活性分子，例如治疗剂(例如多肽或药物)。分子的第一和第二部分的连接可为共价(例如呈融合蛋白形式)或非共价形式。此类连接的方法为本领域中已知且可易于由技术人员应用。如本文所描述，通过使得多肽与表达经修饰的B-H_c所特异性结合的受体的神经元(靶神经元)接触的途径来施用嵌合多肽分子。

鉴定受体结合活性

本发明的另一个方面涉及用于鉴定经修饰的BoNT受体结合结构域结合受体(例如人Syt I或人Syt II或人SV2)的能力的方法。该方法利用双杂合测定系统且利用由受体和经修饰的Hc(分别融合(表达为融合蛋白)至用于双杂合测定中的各自“诱饵”和“捕获物”亚基)制得的融合蛋白(例如利用活化结构域和DNA结合结构域的Gal 4转录活化系统)。双杂合测定通常是在酵母(啤酒酵母)中进行，但类似测定系统还已研发用于其他单细胞生物体中(例如在大肠杆菌中)。那些系统是相当的。在一个实施方案中，使用细菌腺苷酸环化酶双杂合测定 (Karimova等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1998年5月12日；95(10): 5752–5756，其内容以引用方式并入本文中)。该系统使用T18和T25 作为诱饵和捕获，且可利用大肠杆菌BTH101细胞。

经修饰的Hc在双杂合测定的大肠杆菌中表达为与T18的融合蛋白(称为第一融合蛋白)。在该方法中，受体(或其结合片段，例如h-Syt II a.a.1-87)在双杂合测定的大肠杆菌中与T25共表达为融合蛋白(称为第二融合蛋白)。该测定利用各个分子之间经由其各自融合实现的相互作用的阳性指标。一种可能的阳性指标是显色。使表达第一融合蛋白和第二融合蛋白的克隆大肠杆菌集落在含有适当选择性和报告培养基的固体培养基(例如氨苄青霉素、卡那霉素、X-gal和IPTG)上生长持续使得自阳性集落生成阳性指标(例如颜色产生)的时间量。使经修饰的结合结构域结合至受体片段将产生阳性指标(例如表达LacZ 基因且使得在生长于X-gal板上的集落中产生蓝色)。

在与适当对照(阳性和阴性)相比时，分析集落的此类阳性指标(例如显色)。可以目测方式或通过非人机器进行分析。使用不能产生可观阳性指标(例如LacZ表达)的适当阴性对照(例如缺乏测定系统的关键组分的克隆集落，例如具有在无融合下表达的诱饵和捕获物)。也可使用适当强阳性对照。在测定中用于人Syt II受体的强阳性对照的一个实例是在E1191处具有取代突变(M/C/V或Q)的B1-Hc。还可使用弱阳性对照来鉴定结合强度。在测定中用于人Syt II受体的弱阳性对照的一个实例是在W1178处具有取代突变(Q/Y/A或S)的B1-Hc。阳性指标(例如显色)的鉴定指示经修饰的Hc结合受体。强阳性指标 (例如强显色(例如高于弱阳性对照))的鉴定指示Hc以高亲和力结合受体。

测定中所使用的经修饰的Hc可为本文所公开的任一经修饰的 Hc。通过非限制性实例，经修饰的Hc可含有一个、两个或三个取代突变，例如本文中公开的那些。经修饰的Hc可为如本文所公开的任一血清型/菌株或亚型。

本文和下列实施例中所描述的实施方案仅用于阐释性目的，且本领域的技术人员所显而易见的各种修改或改变包括于本发明的范围内。

除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有需要，否则单数术语应包括复数形式且复数术语应包括单数形式。

应理解，本发明并不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等且因此可有所变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的而并非意欲限制本发明的范围，该范围仅由权利要求限定。

除在操作实施例中外或另外指示，所有表示本文所用成分或反应条件的量的数字均应理解为在所有情况下受术语“约”修饰。在用于描述本发明时，结合百分比的术语“约”意指±1％。

在一方面，本发明涉及对于本发明至关重要的本文所描述的组合物、方法及其各自组分，但还可开放性地包括未指定要素(不管必需与否)(“包含”)。在一些实施方案中，拟包括于对组合物、方法或其各自组分的描述的其他要素限于并不实质性影响本发明的基本和新颖特性的那些(“基本上由......组成”)。这同样适用于所描述的方法内的步骤以及其中的组合物和组分。在其他实施方案中，本文所描述的发明、组合物、方法及其各自组分意欲排除未被视为所述组分、组合物或方法的必需要素的任一要素(“由......组成”)。

出于描述和公开(例如)此类公开中所描述的可结合本发明使用的方法的目的，所鉴定的所有专利、专利申请和公开都以引用方式明确并入本文中。这些公开仅因为其公开内容先于本申请的申请日期而提供。这方面的任何内容都不得解释为承认由于先前发明或出于任何其他原因本发明无权先于此类公开内容。所有关于日期的陈述或关于这些文件的内容的表述都是基于申请者可获得的信息，且并不构成关于这些文件的日期或内容的准确性的任何承认。

背景和具体实施方式的参考文献

1.Schiavo，G.，Matteoli，M.&Montecucco，C.Neurotoxins affectingneuroexocytosis. Physiol Rev 80，717-766(2000).

2.Johnson，E.A.Clostridial toxins as therapeutic agents：benefits ofnature′s most toxic proteins.Annu Rev Microbiol 53，551-575(1999).

3.Aoki，K.R.Botulinum toxin：a successful therapeutic proteinCurr MedChem 11， 3085-3092(2004).

4.Montecucco，C.&Molgo，J.Botulinal neurotoxins：revival of an oldkiller.Curr Opin Pharmacol 5，274-279(2005).

5.Lange，O.，et al.Neutralizing antibodies and secondary therapyfailure after treatment with botulinum toxin type A：much ado about nothing？Clin Neuropharmacol 32，213-218 (2009).

6.Chapman，M.A.，Barron，R，Tanis，D.C.，Gill，C.E&Charles，P.D.Comparison ofbotulinum neurotoxin preparations for the treatment of cervical dystonia.ClinTher 29，1325- 1337(2007).

7.Cote，T.R.，Mohan，A.K.，Polder，J.A.，Walton，M.K.&Braun，M.M.Botulinumtoxin type A injections：adverse events reported to the US Food and DrugAdministration in therapeutic and cosmetic cases.J Am Acad Dermatol 53，407-415(2005).

8.Dong，M.，Tepp，W.H.，Liu，H.，Johnson，E.A.&Chapman，E.R.Mechanism ofbotulinum neurotoxin B and G entry into hippocampal neurons.J Cell Biol 179，1511-1522 (2007).

9.Peng，L.，Tepp，W.H.，Johnson，E.A.&Dong，M.Botulinum neurotoxin D usessynaptic vesicle protein SV2 and gangliosides as receptors.PLoS Pathog 7，el002008(2011).

10.Dong，M.，et al.Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinumneurotoxin B into cells.J Cell Biol 162，1293-1303(2003).

11.Nishiki，T.，et al.Identification of protein receptor forClostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes.J Biol Chem269，10498-10503(1994).

12.Rummel，A.，Karnath，T.，Henke，T.，Bigalke，H.&Binz，T.Synaptotagmins Iand II act as nerve cell receptors for botulinum neurotoxin G J Biol Chem279，30865-30870 (2004).

13.Peng，L.，et al.Botulinum neurotoxin D-C uses synaptotagmin I/II asreceptors and human synaptotagmin II is not an effective receptor for type B，D-C，and G toxins.J Cell Sci (2012).

14.Dong，M.，et al.SV2 is the protein receptor for botulinum neurotoxinA.Science 312， 592-596(2006).

15.Dong，M.，et al.Glycosylated SV2A and SV2B mediate the entry ofbotulinum neurotoxin E into neurons.Mol Biol Cell 19，5226-5237(2008).

16.Mahrhold，S.，Rummel，A.，Bigalke，H.，Davletov，B.&Binz，T.The synapticvesicle protein 2C mediates the uptake of botulinum neurotoxin A into phrenicnerves.FEBS Lett 580，2011-2014(2006).

17.Rummel，A.，et al.Botulinum neurotoxins C，E and F bind gangliosidesvia a conserved binding site prior to stimulation-dependent uptake withbotulinum neurotoxin F utilising the three isoforms of SV2 as secondreceptor.J Neurochem 110，1942-1954(2009).

18.Fu，Z.，Chen，C.，Barbieri，J.T.，Kim，J.J.&Baldwin，M.R.Glycosylated SV2and gangliosides as dual receptors for botulinum neurotoxin serotypeF.Biochemistry 48，5631- 5641(2009).

19.Montecucco，C.How do tetanus and botulinum toxins bind to neuronalmembranes？ TIBS，314-317(1986).

20.Nishiki，T.，et al.The high-affinity binding of Clostridiumbotulinum type B neurotoxin to synaptotagmin II associated with gangliosidesGT1b/GDla.FEBS Lett 378， 253-257(1996).

21.Pang，Z.P.，et al.Synaptotagmin-2 is essential for survival andcontributes to Ca2+ triggering of neurotransmitter release in central andneuromuscular synapses.J Neurosci 26， 13493-13504(2006).

22.Strotmeier，J.，Willjes，G.，Binz，T.&Rummel，A.Human synaptotagmin-IIis not a high affinity receptor for botulinum neurotoxin B and G：increasedtherapeutic dosage and immunogenicity.FEBS Lett 586，310-313(2012).

23.Craxton，M.A manual collection of Syt，Esyt，Rph3a，Rph3al，Doc2，andDblc2 genes from 46 metazoan genomes--an open access resource forneuroscience and evolutionary biology.BMC Genomics 11，37(2010).

24.Brin，M.F.，et al.Safety and efficacy of NeuroBloc(botulinum toxintype B)in type A-resistant cervical dystonia.Neurology 53，1431-1438(1999).

25.Pappert，E.J.&Germanson，T.Botulinum toxin type B vs.type A intoxin-naive patients with cervical dystonia：Randomizea，double-blind，noninferiority trial.Mov Disord 23，510-517(2008).

26.Wang，J.，et al.Longer-acting and highly potent chimaeric inhibitorsof excessive exocytosis created with domains from botulinum neurotoxin A andB.Biochem J 444，59-67 (2012).

27.Rummel，A.，Mahrhold，S.，Bigalke，H.&Binz，T.Exchange of the H(CC)domain mediating double receptor recognition improves the pharmacodynamicproperties of botulinum neurotoxin.FEBS J 278，4506-4515(2011).

28.Kozaki，S.，et al.Characterization of Clostridium botulinum type Bneurotoxin associated with infant botulism in japan.Ifect Immun 66，4811-4816(1998).

29.Ihara，H.，et al.Sequence of the gene for Clostridium botulinum typeB neurotoxin associated with infant botulism，expression of the C-terminalhalf of heavy chain and its binding activity.Biochim Biophys Acta 1625，19-26(2003).

30.Rummel，A.，Mahrhold，S.，Bigalke，H.&Binz，T.The HCC-domain ofbotulinum neurotoxins A and B exhibits a singular ganglioside binding sitedisplaying serotype specific carbohydrate interaction.Mol Microbiol 51，631-643(2004).

31.Chai，Q.，et al.Structural basis of cell surface receptorrecognition by botulinum neurotoxin B.Nature 444，1096-1100(2006).

32.Jin，R.，Rummel，A.，Binz，T.&Brunger，A.T.Botulinum neurotoxin Brecognizes its protein receptor with high affinity and specificity.Nature444，1092-l095(2006).

33.Arnon，S.S.，et al.Botulinum toxin as a biological weapon：medicaland public health management.Jama 285，1059-1070(2001).

34.Moriishi，K.，et al.Mosaic structures of neurotoxins produced fromClostridium botulinum types C and D organisms.Biochim Biophys Acta 1307，123-126(1996).

35.Hill，K.K.，et al.Genetic diversity among Botulinum Neurotoxin-producing clostridial strains.J Bacteriol 189，818-832(2007).

36.Lalli，G.，et al.Functional characterisation of tetanus andbotulinum neurotoxins binding domains.J Cell Sci 112(Pt 16)，2715-2724(1999).

本发明可如下列编号段落中的任一个中所定义。

1.一种肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含：

a)蛋白酶结构域；

b)蛋白酶裂解位点；

c)移位结构域；和

d)肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)，其包含对应于血清型B菌株1中的选自以下的取代突变的一个或多个取代突变：

E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、 W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合。

2.根据段落1所述的BoNT多肽，其中所述经修饰的(B-H_c)包含对应于血清型B菌株1中的选自以下的取代突变的一个取代突变： E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199E、S1199H、W1178Y、 W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C和Y1183P。

3.根据段落2所述的BoNT多肽，其中所述经修饰的(B-H_c)包含对应于血清型B菌株1中的E1191C的取代突变。

4.根据段落2所述的BoNT多肽，其中所述经修饰的(B-H_c)包含对应于血清型B菌株1中的E1191V的取代突变。

5.根据段落1所述的BoNT多肽，其中所述经修饰的(B-H_c)包含两个取代突变。

6.一种肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含：

a)蛋白酶结构域；

b)蛋白酶裂解位点；

c)移位结构域；和

d)肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)，其包含对应于血清型B菌株1中的取代突变的两个或更多个取代突变，其中所述取代突变中的一个选自：

E1191Q、E1191M、E1191C、E1191V、E1191L和E1191Y。

7.根据段落6所述的BoNT多肽，其中所述取代突变中的另一个对应于血清型B菌株1中的S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、 W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、S1199F 或S1199L。

8.根据段落5-7中任一段的BoNT多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、 E1191C和S1199W、E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q 和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1199Y或E1191V和 W1178Q。

9.根据段落5-8中任一段的BoNT多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和S1199W。

10.根据段落5-8中任一段的BoNT多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和W1178Q。

11.根据段落5-8中任一段的BoNT多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和S1199W。

12.根据段落5-8中任一段的BoNT多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和S1199Y。

13.根据段落5-8中任一段的BoNT多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和W1178Q。

14.根据段落5-8中任一段的BoNT多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191Q和S1199W。

15.根据段落5-8中任一段的BoNT多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和S1199W。

16.根据段落5-8中任一段的BoNT多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和S1199Y。

17.根据段落5-8中任一段的BoNT多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和W1178Q。

18.根据段落6所述的BoNT多肽，其中所述经修饰的(B-H_c)包含三个取代突变。

19.根据段落18所述的BoNT多肽，其中所述三个取代突变在对应于血清型B菌株1的E1191、Y1183和S1199或E1191、S1199 和W1178的位置处。

20.根据段落19所述的BoNT多肽，其中所述三个取代突变对应于血清型B菌株1的E1191M、S1199W和W1178Q。

21.一种肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含：

a)蛋白酶结构域；

b)蛋白酶裂解位点；

c)移位结构域；和

d)肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)，其在对应于血清型B菌株1的S1199或S1201的位置处包含取代突变。

22.根据段落1-21中任一段的BoNT多肽，其中所述经修饰的 B-H_c来自菌株1。

23.根据段落1-22中任一段的BoNT多肽，其中所述蛋白酶结构域、移位结构域和蛋白酶裂解位点来自选自以下的血清型：A、B、C、 D、E、F、G及其组合。

24.根据段落23所述的BoNT多肽，其中所述蛋白酶结构域、移位结构域和蛋白酶裂解位点来自血清型B菌株1。

25.根据段落23所述的BoNT多肽，其中所述蛋白酶结构域、移位结构域和蛋白酶裂解位点来自血清型A菌株1。

26.一种多肽，其包含肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)，所述经修饰的受体结合结构域包含对应于血清型B菌株 1中的选自以下的取代突变的一个或多个取代突变：

27.根据段落26的多肽，其中所述经修饰的(B-H_c)包含两个取代突变。

28.一种多肽，其包含肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)，所述经修饰的受体结合结构域包含对应于血清型B菌株 1中的取代突变的两个或更多个取代突变，其中所述取代突变中的一个选自：E1191Q、E1191M、E1191C、E1191V、E1191L和E1191Y。

29.根据段落26的多肽，其中所述取代突变中的一个对应于血清型B菌株1中的S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、W1178Y、 W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、S1199F或S1199L。

30.根据段落27-29中任一段的多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、 E1191C和S1199W、E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q 和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1199Y或E1191V和 W1178Q。

31.根据段落27-30中任一段的多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和S1199W。

32.根据段落27-30中任一段的多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和W1178Q。

33.根据段落27-30中任一段的多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和S1199W。

34.根据段落27-30中任一段的多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和S1199Y。

35.根据段落27-30中任一段的多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和W1178Q。

36.根据段落27-30中任一段的多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191Q和S1199W。

37.根据段落27-30中任一段的多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和S1199W。

38.根据段落27-30中任一段的多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和S1199Y。

39.根据段落27-30中任一段的多肽，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和W1178Q。

40.根据段落30的多肽，其中所述经修饰的(B-H_c)包含三个取代突变。

41.根据段落40的多肽，其中所述三个取代突变在对应于血清型B菌株1的E1191、Y1183和S1199或E1191、S1199和W1178的位置处。

42.根据段落41的多肽，其中所述三个取代突变对应于血清型B 菌株1的E1191M、S1199W和W1178Q。

43.根据段落26-42中任一段的多肽，其中所述经修饰的B-H_c来自菌株1。

44.一种嵌合分子，其包含第一部分，所述第一部分是连接至第二部分的肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)，其中所述经修饰的B-H_c包含选自以下的一个或多个取代突变：

45.根据段落44的嵌合分子，其中所述经修饰的B-H_c包含两个取代突变。

46.一种嵌合分子，其包含第一部分，所述第一部分是连接至第二部分的肉毒梭菌血清型B的经修饰的受体结合结构域(B-H_c)，其中所述经修饰的B-H_c包含对应于血清型B菌株1中的取代突变的两个或更多个取代突变，其中所述取代突变中的一个选自：

E1191Q、E1191M、E1191C、E1191V、E1191L和E1191Y。

47.根据段落46的嵌合分子，其中所述取代突变中的一个对应于血清型B菌株1中的S1199W、S1199E、S1199H、S1199Y、W1178Y、 W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、S1199F或S1199L。

48.根据段落45至47中任一段的嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和S1199W、E1191M和 W1178Q、E1191C和S1199W、E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、 E1191Q和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1199Y或E1191V 和W1178Q。

49.根据段落45-47中任一段的嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和S1199W。

50.根据段落45-47中任一段的嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191M和W1178Q。

51.根据段落45-47中任一段的嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和S1199W。

52.根据段落45-47中任一段的嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和S1199Y。

53.根据段落45-47中任一段的嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191C和W1178Q。

54.根据段落45-47中任一段的嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191Q和S1199W。

55.根据段落45-47中任一段的嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和S1199W。

56.根据段落45-47中任一段的嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和S1199Y。

57.根据段落45-47中任一段的嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于血清型B菌株1中的E1191V和W1178Q。

58.根据段落45或46中任一段的嵌合分子，其中所述经修饰的 (B-H_c)包含三个取代突变。

59.根据段落58的嵌合分子，其中所述三个取代突变在对应于血清型B菌株1的E1191、Y1183和S1199或E1191、S1199和W1178 的位置处。

60.根据段落59的嵌合分子，其中所述三个取代突变对应于血清型B菌株1的E1191M、S1199W和W1178Q。

61.根据段落44-60中任一段的嵌合分子，其中所述经修饰的 B-H_c来自菌株1。

62.根据段落44-61中任一段的嵌合分子，其中所述第一部分和所述第二部分共价连接。

63.根据段落46-61中任一段的嵌合分子，其中所述第一部分和所述第二部分非共价连接。

64.根据段落44-61中任一段的嵌合分子，其中所述第二部分选自：小分子、核酸、短多肽和蛋白质。

65.根据段落64的嵌合分子，其中所述第二部分是生物活性分子。

66.根据段落64或65的嵌合分子，其中所述第二部分是治疗性多肽或非多肽药物。

67.根据段落1-66中任一段的BoNT多肽、多肽或嵌合分子，其与缺乏所述取代突变的相同分子相比，表现出所述经修饰的B-H_c与人SytII的显著增强的结合和/或所述经修饰的B-H_c与人Syt I的显著降低的结合。

68.根据段落1-66中任一段的BoNT多肽、多肽或嵌合分子，其中与缺乏所述取代突变的相同分子相比，所述取代突变产生与人SytII 的显著增强的结合和/或与人Syt I的显著增强的结合。

69.一种核酸，其包含编码根据段落1-68中任一段的多肽或嵌合分子的核苷酸序列。

70.一种核酸载体，其包含根据段落69的核酸。

71.一种细胞，其包含根据段落70的核酸载体或根据段落69的核酸。

72.一种细胞，其表达根据段落1-68中任一段的多肽或嵌合分子

73.一种药物组合物，其包含根据段落1-25、67或68中任一段的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽或根据段落44-66中任一段的嵌合分子或根据段落70的核酸载体或根据段落69的核酸。

74.根据段落73的药物组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。

75.一种试剂盒，其包括根据段落73或74的药物组合物和用于治疗性施用所述药物组合物的说明书。

76.一种产生肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽的方法，所述方法包括在其中产生所述BoNT多肽的条件下培养根据段落72的细胞的步骤。

77.根据段落76的方法，其还包括下列步骤中的一个或多个：

-从培养物回收BoNT多肽，

-纯化BoNT多肽，

-活化BoNT多肽，和/或

-配制BoNT多肽。

78.一种用于治疗与不期望的神经元活性相关的病状的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据段落1-25、67或68中任一段的 BoNT多肽，从而接触表现出不期望的神经元活性的一个或多个神经元，以此治疗所述病状。

79.根据段落78的方法，其中所述病状选自：痉挛性发音困难、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌发音困难、舌肌张力障碍、颈部肌张力障碍、局部手肌张力障碍、睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑病症、脑性麻痹、局部痉挛和其他发音障碍、痉挛性结肠炎、神经性膀胱障碍、肛门痉挛、肢体痉挛、抽搐、颤抖、磨牙、肛裂、弛缓不能、吞咽困难和其他肌肉张力病症和其他特征在于肌群的不随意运动的病症、流泪、多汗症、过度流涎、胃肠道分泌过多、分泌病症、由肌肉痉挛引起的疼痛、头痛、偏头痛和皮肤病学或美学/美容病状。

80.根据段落1-25、67或68中任一段的肉毒杆菌神经毒素(BoNT) 多肽、根据段落73或74中任一段的药物组合物或根据段落44-66中任一段的嵌合分子或根据段落26-43中任一段的多肽，其用于医学中。

81.根据段落1-25、67或68中任一段的肉毒杆菌神经毒素(BoNT) 多肽、根据段落73或74中任一段的药物组合物或根据段落44-66中任一段的嵌合分子或根据段落67-43中任一段的多肽，其用于治疗与不期望的神经元活性相关的病状。

82.一种用于鉴定肉毒杆菌神经毒素中结合受体的经修饰的受体结合结构域的方法，其包括：

a)在双杂合测定中将所述经修饰的受体结合结构域与细菌腺苷酸环化酶的T18亚基表达为第一融合蛋白，以及在所述双杂合测定中使所述受体与细菌腺苷酸环化酶的T25亚基表达为第二融合蛋白；

b)分析表达所述第一融合蛋白和第二融合蛋白两者的克隆大肠杆菌(E.coli)集落的超过阴性对照的阳性指标的存在；以及

c)将由表现出所述阳性指标的所述集落所表达的所述经修饰的受体结合结构域鉴定为结合至所述受体。

83.根据段落82的方法，其中所述阳性指标是显色。

84.根据段落82-83中任一段的方法，其还包括以下步骤：针对弱阳性对照分析所述集落的阳性指标，以及进一步将由表现出高于所述弱阳性对照的所述集落所表达的所述经修饰的受体结合结构域鉴定为以高亲和力结合至所述受体。

85.根据段落82-84的方法，其使用经修饰的受体结合结构域的文库来实施，所述结构域各自在相应集落中表达。

86.根据段落82-85中任一段的方法，其中所述受体是人。

87.根据段落82-86中任一段的方法，其中所述经修饰的受体结合结构域包含一个或多个取代突变，其中所述取代突变中的一个对应于血清型B菌株1中的选自以下的突变：E1191M、E1191 Q、E1191C、 E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、S1199F、S1199L、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P 和S1199Y。

通过下列实施例来进一步阐释本发明，该实施例不应解释为进一步限制。

实施例

增强BoNT/B与h-Syt II的结合的单一突变的鉴定

在2006年，通过两种研究来解析BoNT/B结合至大鼠Syt II管腔结构域的共晶体结构^25,26。结构信息提供可靠根据来着眼于结合界面内有限数量的残基来用于合理设计诱变研究。54位处的保守苯丙氨酸与BoNT/B形成多个疏水性接触。因亮氨酸(在人中)也是疏水性的，BoNT/B结合很可能因苯丙氨酸与亮氨酸之间的大小/形状差异而遭到破坏。关键在于鉴定BoNT/B H_C区域中可适应由苯丙氨酸至亮氨酸的变化的可能变化。

检验BoNT/B中有助于BoNT/B与Syt II之间的相互作用的所有残基。这些残基由BoNT/B-Syt II共晶体结构充分确定，包括K1113、D1115、S1116、P1117、V1118、W1178、Y1181、Y1183、E1191、 K1192、F1194、A1196、P1197、S1199、S1201、E1203、F1204、E1245 和Y1256(图3)总共19个位置。策略是首先系统地使用所有其他19 种可能氨基酸置换这19个位置中的每一处的残基且然后测试这些突变BoNT/B-H_c与h-Syt II的结合。因此，总共需要生成且测试 19×19＝361个单点突变。

使用细菌腺苷酸环化酶双杂合系统(BACTH)来生成这361个突变并测试其与h-SytII的结合，如图4中所描述。简而言之，使用细菌腺苷酸环化酶的分裂片段(T18)将野生型(WT)BoNT/B-H_c框内亚克隆至载体中。使用在BoNT/B-H_c中的所选位置处带有随机三-核苷酸(NNN)的引物通过PCR来扩增该T18-BoNT/B-H_c融合构建体(图4A)。这样生成在所选位点处编码所有20种不同氨基酸的构建体库。然后将该构建体库与表达h-Syt II(1-87)且与分裂细菌腺苷酸环化酶的另一半(T25)融合的构建体一起共转化至细菌(大肠杆菌菌株BTH101)中。突变体BoNT/B-H_c与h-Syt II的结合使得T18和T25结合在一起并恢复腺苷酸环化酶的活性，这使得可表达lacZ基因且在X-凝胶板上产生蓝色集落(图4B)。通过自这些蓝色集落提取构建体并对其测序来鉴定引入BoNT/B-H_c中的特异性突变。

使用这种BACTH方法，在BoNT/B-H_c中筛选所有19个所选位点。每一位点的总集落和蓝色集落的数量列于图5A中。对每一位置计数大于380个总集落。总集落数量决定了在所选突变位点处涵盖所有20种氨基酸的可能性。这是通过Clark-Carbon方程式来计算的： P＝1-(1-f)^N，其中f反映了可能残基的数量(在此处f＝1/20，这是因为存在20种不同氨基酸)，且N是总集落数。在集落最小数量为380时，在某一位置处涵盖所有20种氨基酸的机率为99.8％。因此，在板上的集落数超过380时，很可能涵盖所有20种可能残基。。

如图5A中所示，发现有4个位置产生蓝色集落，包括E1191 (22.7％)、W11178(7.8％)、Y1183(4.0％)和S1199(5.1％)。在这4个位置中，E1191具有最高含量的蓝色集落。另外，来自E1191的蓝色集落还显示其蓝色深于其他三个位点，这表明在使用E1191突变时BoNT/B-H_c与h-Syt II之间的相互作用可较强。自该这些蓝色集落提取质粒并对其测序。每一位点处所鉴定的残基列于图5B中： E1191M/C/V/Q/L/Y、Y1183/C/P、S1199W/E/Y/H、W1178Y/Q/A/S。

通过测量细菌中所产生的β-半乳糖苷酶的水平来进一步验证人 Syt II与那些所鉴定的突变体之间的相互作用，该水平与通过 T18-BoNT/B-H_c与T25-h-Syt II之间的相互作用重构的腺苷酸环化酶活性的总水平成正比。E1191位点处的4种突变E1191M/C/V/Q在测试的所有突变中显示出最强β-半乳糖苷酶活性(图6A)，从而表明用这4种残基中的一种置换E1191显著增强T18-BoNT/B-H_c与 T25-h-Syt II的结合。

使用下拉测定作为替代方法来进一步分析突变BoNT/B-H_c与 h-Syt II的结合(图6B)。简而言之，将GST标记的小鼠Syt II管腔结构域(m-Syt II)和人Syt II管腔结构域(h-Syt II)固定于GST珠粒上且用于下拉表达于细菌中的突变BoNT/B-H_c。经由免疫印迹分析检测 BoNT/B-H_c与GST标记的Syt II的结合，从而检测融合至BoNT/B-H_c的HA标签。如图6B中所示，E1191M/C/V/Q产生显著水平的h-Syt II结合，这与这4种突变也展示最强的β-半乳糖苷酶活性的发现一致 (图6A)。总而言之，这些结果表明，E1191M/C/V/Q是获得稳健结合 h-Syt II的能力的4种一级突变。

HCB中的组合突变进一步增强其与h-Syt II的结合

然后探究BoNT/B-H_cE1191M/C/V/Q与h-Syt II的结合是否可进一步通过在不同位点处包含次级突变来增强。1183、1199和1178位点作为用于次级突变位点的候选者而受到关注，这是因为这些位点是还产生蓝色集落的仅有三个位点(图5)。使用E1191M作为一级突变，组合E1191M与在BACTH筛选中在1183、1199和1178位点处所鉴定的所有其他10个残基改变以生成双重突变，如图5B中所指示。在下拉测定中分析这10个双重突变结合h-Syt II的能力，如图7A中所指示。其中的三种E1191M/S1199W、E1191M/S1199Y和 E1191M/W1178Q产生与h-Syt II的显著结合(图7A)。这些结果表明，包括S1199W/Y和W1178Q作为次级突变位点将进一步增强 BoNT/B-H_cE1191M/C/V/Q与h-Syt II的结合。总而言之，这些数据指示，在E1191位点处存在一级突变的4种选择(M/C/V/Q)且次级突变位点存在三种选择(S1199W/Y和W1178Q)(图7B)，且一级突变与次级突变的组合可进一步增强与h-Syt II的结合。

组合E1191M与Y1183C/P实际上减少与h-Syt II的结合(图7A)。 BoNT/B的Syt II结合界面是由两个疏水袋构成，如先前所报道。E1191 和Y1183位于同一袋中，而S1199和W1178位于另一袋中。因E1191 在空间上邻近Y1183，所以在两者都发生突变时，可发生潜在结构冲突，这可阐释这两个位置处的双重突变减少与h-Syt II的结合的原因。

寻求以定量方式测定并比较突变BoNT/B-H_c与h-Syt II之间的结合亲和力，旨在选择具有最佳结合亲和力的双重突变。使用充分确立的生物膜干涉术测定来测定结合亲和力(K_D)(图8A)。简而言之，将 GST标记的Syt蛋白质固定于探针上。首先探针暴露于不同浓度下的纯化BoNT/B-H_c(缔合期，图8A)，随后进行洗涤步骤(解离期，图8A)。 BoNT/B-H_c与GST标记的Syt的结合增加了探针上的总分子量/大小，这在探针处产生可检测和分析的光反射位移。可由所检测的缔合和解离曲线计算结合参数(例如缔合常数(k_on)、解离常数(k_off)和表观结合亲和力(K_D))，如图8A中所指示。

使用这种测定，使用三种次级突变(S1199W/Y、W1178Q)系统性表征4种一级突变(E1191M/C/Q/V)的所有组合。另外，还生成并分析三重突变E1191M/S1199W/W1178Q。测量WTBoNT/B-H_c与小鼠 Syt II(m-Syt II)的结合作为阳性对照，这显示结合K_D为0.13μM(图8B)。如所预计，WT BoNT/B-H_c与h-Syt II的结合太弱以致难以可靠测定，其中估计K_D超过检测限值(>20μM)。单一一级突变E1191M产生6.7μM的结合K_D，这是相对于WT BoNT/B-H_c的显著改良。组合一级突变位点与次级突变位点的双重突变进一步将结合亲和力提高至高达0.59μM(E1191V/S1199Y)。如所预计，大部分双重突变会提高对h-Syt II的结合亲和力，其中K_D介于0.59μM与4.3μM之间。 E1191Q/W1178Q是并不结合h-Syt II的唯一一个。原因尚未知晓，但可能在于这种双重突变可诱导蛋白质的意外构象变化。三重突变 E1191M/S1199W/W1178Q与双重突变E1191M/S1199W显示几乎相同的结合亲和力，从而表明添加第三突变位点可能不会进一步提高结合亲和力。总而言之，这些数据证实，E1191M/C/Q/V与S1199W/Y、W1178Q之间的所有双重突变(除E11191Q/W1178Q外)都产生可稳健结合h-Syt II的突变BoNT/B-H_c。

HCB突变体与h-Syt I显示增强的结合

除Syt II外，Syt I还用作BoNT/B的受体。为实现与人神经元的最高可能结合，经修饰的BoNT/B突变体不应影响与人Syt I的结合。理想地，其甚至可增加与Syt I的结合。实际上，发现E1191M显著增强BoNT/B-H_c与h-Syt I的结合，这是因为可在并不存在脂质共受体神经节苷脂下检测到稳健结合(图9A)。使用生物膜干涉术测定测量所选双重突变与h-Syt I之间的结合亲和力。如图9B、C中所示，双重突变E1191M/S1199Y(B-H_cMY)和E1191V/S1199Y(B-H_cVY)展示 K_D分别为2.9μM和5.82μM，而WT BoNT/B-H_c与h-Syt I的结合太弱以致不能可靠测定，其中估计K_D超过检测限值(>20μM)。

HCBMY结合至神经元表面上的h-Syt II

接下来检验H_CB_MY突变体是否可结合至生理学相关神经元表面上的h-Syt II。为此，利用所培养的表达Syt I但并不表达Syt II的大鼠皮质神经元作为神经元模型(Dong等人，The Journal of cell biology 179(7)：1511-1522(2007))。因此，敲低Syt I会生成不含内源性受体的神经元。在这些Syt I KD神经元中表达全长h-Syt II会产生仅h-Syt II作为毒素受体的“人源化”神经元，如先前所描述(Peng等人，J Cell Sci.125：3233-42(2012))。如所预计，WT H_CB强烈结合至大鼠神经元且该结合在敲低内源性Syt I之后消除。表达全长m-Syt II而非h-Syt II或含有F54L突变的m-Syt II会恢复WT H_CB的结合(图10A)。与之相比，H_CB_MY对表达m-Syt II、h-Syt II或m-Syt II(F54L)的神经元显示出稳健结合，从而证实H_CB_MY结合神经元表面上的h-Syt II的能力有所增强(图10B)。

BoNT/B突变体展示增强阻断人源化神经元中的神经传递的效能

为解决与h-Syt II增强的结合是否会转变为神经元中功能水平下提高的效能的关键问题，在大肠杆菌中以重组方式产生全长WT BoNT/B和含有E1191M/S1199Y点突变的突变毒素(BoNT/B_MY)。使人源化神经元暴露于一定梯度的WT或BoNT/B_MY毒素。通过免疫印迹分析检验VAMP2的裂解。如图11A中所示，在每一所测试毒素浓度下，与暴露于WT BoNT/B的神经元相比，在暴露于BoNT/B_MY的神经元中有较多VAMP2发生裂解，从而指示BoNT/B_MY较WT毒素更有效地靶向并进入神经元。

接下来，通过使用全细胞膜片钳记录来记录小抑制性突触后电流 (mIPSC)以监测神经递质释放。mIPSC的频率反映了神经元群体中的神经递质释放的活性。BoNT/B进入突触前末端会阻断神经递质的释放，由此减小mIPSC的频率(图11B)。将人源化神经元暴露于一定梯度的WT BoNT/B或BoNT/B_MY。如图11C中所示，BoNT/B_MY显示大大增强的功效，其中半最大抑制浓度(IC₅₀)约低于WT毒素11倍： BoNT/B_MY可对神经递质释放实现相同阻断水平，其中毒素浓度低于 WT毒素11倍。这些数据证实，与人受体结合增强使得功能水平下的毒素在神经元中的效能有所增加。

使用BACTH方法来筛选在BoNT/B-H_c中形成对于Syt II的结合袋的所有19种关键残基处的所有可能单一突变。鉴定出4个可发生突变以增加对h-Syt II的结合亲和力的位置，其中E1191位点作为一级位点，且S1199、W1178和Y1183作为次级突变位点。产生并测试组合一级和次级突变位点的双重突变，且显示组合E1191M/C/V/Q与 S1199Y/W或W1178Q会产生对h-Syt II和h-Syt I具有强结合亲和力的双重突变。

论述

通过组合原理设计(基于BoNT/B-Syt II复合物的可用共晶体结构) 与BACTH方法(其占用每一所选靶残基处的所有可能单一点突变)，鉴定BoNT/B中可结合h-Syt II的一系列点突变。在组合中进一步检验这些点突变，从而揭示获得对h-Syt II的高亲和力结合的双重突变体。重要的是，含有所设计的突变的全长BoNT/B显示对人源化神经元的功效高于WT BoNT/B约11倍，从而证实对毒素受体增强的结合转变为在神经元中功能水平下的较高功效。

材料和方法

材料和构建体。下列抗体是购自指定供应商：突触蛋白I(克隆46.1, SynapticSystems)、VAMP2(克隆69.1,Synaptic Systems)、HA(16B12, Covance)和β-微管蛋白III(ab18207,Abcam)。牛混合脑神经节苷脂是购自Matreya LLC(Pleasant Gap,PA)且在Tris-缓冲盐水(TBS:20mM Tris,150mM NaCl)中复水，如先前所描述(Peng等人,PLoS pathogens7(3):e1002008(2011))。将编码H_CB的cDNA(残基857-1291,Genbank: ACA46990.1)进行密码子优化以便进行大肠杆菌表达且由Genscript Inc.合成(New Brunswick,NJ)。下列cDNA由指定团体慷慨提供：大鼠Syt I(T.C.Sudhof,Palo Alto,CA)、小鼠Syt II(M.Fukuda,Ibaraki, Japan)、人Syt I(R.B.Sutton,Lubbock,TX)。将编码H_CB的DNA亚克隆至pET28a载体中，其中His6标签和HA标签(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:12))均融合至其N-末端。经由PCR使用定点诱变试剂盒 (Agilent Technologies,CA)生成H_CB中的突变。先前已描述GST标记的Syt I/II片段和Syt II F54L突变体(Dong M等人,The Journal of cell biology 162(7):1293-1303(2003)；Peng等人,J Cell Sci.125: 3233-42(2012)；Dong M等人,Science312(5773):592-596(2006))。

BACTH(细菌腺苷酸环化酶双杂合测定)：根据制造商说明 (Euromedex)来进行BACTH测定。选择两种相容质粒pUT18C和 pKT25进行筛选。将H-Syt II管腔结构域(残基1-80)克隆至pKT25中以生成pKT25-h-Syt II。在pUT18C中克隆HCB以用于产生T18-HCB。使用在指定位置处含有随机核苷酸三连体(NNN)的引物产生HCB突变体文库。通过电穿孔使用pKT25-h-Syt II质粒将每个文库共转化至大肠杆菌指示菌株BTH101中且在含有100μg/ml氨苄青霉素、 50μg/ml卡那霉素、0.5mM IPTG和40μg/ml X-Gal的LB琼脂板上筛选。将板在30℃下孵育64小时。自蓝色集落提取质粒并对其测序。总集落数量决定了在所选突变位点处涵盖所有20种氨基酸的可能性。这是通过Clark-Carbon方程式来计算的：P＝1-(1-f)^N，其中f反映了可能残基的数量(在此处f＝1/20，这是因为存在20种不同氨基酸)，且N是总集落数。测定中集落最小数量为380时，在每一位置处涵盖所有20种氨基酸的机率>99.8％。

β-半乳糖苷酶测定：将含有表达的所关注蛋白质的大肠杆菌 BTH101细胞接种至含有氨苄青霉素、卡那霉素和IPTG(0.5mM)的液体LB培养基中。使培养液在37℃下过夜生长以达到静止期。在收获之前记录过夜生长培养液的OD₆₀₀。离心一毫升过夜生长的培养液，且使用PBS将细胞沉淀洗涤两次并悬浮于等体积Z缓冲液(60mM Na2HPO4、40mM Na₂HPO₄、10mMKCl、1mM MgSO₄和20mM二硫苏糖醇[DTT])中。将100毫升再悬浮细菌细胞稀释于1ml Z缓冲液中(稀释因子[DF]＝10)。然后，添加100ml氯仿和50ml 0.1％SDS且充分混合以使细胞渗透化。然后将250毫升混合物转移至新的微量离心管中且达到28℃，添加50ml预升温邻硝基苯基-β-半乳糖苷(4mg/ml，存于Z缓冲液中)，且将混合物在28℃下孵育直至产生黄色为止。通过添加200ml 1M Na₂CO₃来终止反应。记录A₄₂₀和反应精确时间段(以分钟表示，T)。将β-半乳糖苷酶活性定义为 (1000×A₄₂₀×DF)/(T×OD ₆₀₀)且单位为米勒(Miller)。

蛋白质表达和纯化：使BoNT/B-H_c的WT和突变体在大肠杆菌中表达为His₆标记的重组蛋白。使Syt I/II片段和突变体在大肠杆菌中表达为GST标记的重组蛋白。如先前所描述⁹，使用20℃的诱导温度过夜和0.25mM IPTG纯化GST-融合和His₆-融合蛋白。

GST下拉测定：实施两类下拉测定。使用第一系列来筛选突变 BoNT/B-H_c与GST标记的小鼠Syt II(m-Syt II)和模拟人Syt II序列的突变小鼠Syt II(F54L)(称为h-SytII)的结合。简而言之，离心6ml表达BoNT/B H_C的大肠杆菌，再悬浮于800μl TBS中，超声处理，然后与2％Triton X-100一起在4℃下孵育1小时。然后将试样在4℃和最大速度下于微量离心机中离心15分钟。收集上清液且通过与10μg固定于谷胱甘肽-琼脂糖珠粒(GEbioscience,Piscataway,NJ)上的Syt蛋白质一起在4℃下孵育1小时来用于下拉测定。将试样在洗涤缓冲液 (TBS，含有0.5％Triton X-100)中洗涤三次，且使用抗HA抗体通过免疫印迹BoNT/B-H_c来进行分析。对于对h-Syt II具有增强的结合的突变体而言，如先前所描述⁹，通过将这些BoNT/B-H_c突变体纯化为 His6标记的蛋白质来实施进一步下拉测定。然后使用固定Syt片段在 4℃下于100μl TBS缓冲液+0.5％Triton X-100中使用或不使用神经节苷脂(60μg/ml)实施下拉测定1小时。使用TBS缓冲+0.5％Triton X-100 将珠粒洗涤三次。遵循免疫印迹分析对10％的结合材料实施 SDS-PAGE。

生物膜干涉术测定。通过BLI测定使用Blitz系统(ForteBio)测量 H_CB变体与SytI/Syt II之间的结合亲和力。简而言之，将GST标记的Syt I或Syt II(20μg/ml)固定于Dipand Read^TM Anti-GST生物传感器 (ForteBio)上且使用PBS缓冲液平衡。然后将生物传感器暴露于连续浓度的H_CB，随后使用PBS洗涤。使用Blitz系统软件遵循制造商说明(ForteBio)来计算结合亲和力(K_D)。

神经元培养、慢病毒和毒素结合/进入测定。如先前所描述自 E18-19胚胎制备大鼠皮质神经元(Peng等人,PLoS pathogens 7(3):e1002008(2011))。先前已描述用于神经元中的Syt I KD、mSyt II 和h-Syt II表达的构建体(Peng等人,J Cell Sci.125:3233-42(2012))。将慢病毒在DIV5(活体外天数)时添加至神经元培养液中，且在 DIV12-14时实施毒素结合/进入实验。将毒素稀释于高K⁺缓冲液 (87mM NaCl、56mM KCl、1.5mM KH₂PO₄、8mMNa₂HPO₄、0.5mM MgCl₂和1mM CaCl)中且预升温至37℃。将神经元在37℃下暴露于上述含毒素的缓冲液中5分钟，随后使用PBS洗涤。对这些神经元实施免疫染色分析，或在无毒素培养基中再孵育24小时，随后实施免疫印迹分析。

mIPSC记录。自DIV 14-18培养的皮质神经元(DIV 14-18)获得全细胞膜片钳记录。移液管溶液含有(以mM表示)：135 CsCl、10 HEPES、 1 EGTA、1 Na-GTP、4 Mg-ATP和10 QX-314(pH 7.4，使用CsOH调节)。填充有细胞内溶液的移液管的电阻在4MΩ与5MΩ之间变化。在形成全细胞构型且平衡细胞内移液管溶液之后，将串联电阻调节至 10MΩ。使用EPC-10/2放大器(HEKA)在-70mV保持电位下监测突触电流。浴溶液含有(以mM表示)：140 NaCl、5KCl、2 CaCl、1 MgCl2、 10 HEPES、10葡萄糖(pH 7.4，使用NaOH调节)。通过将AMPA和 NMDA受体阻断剂CNQX和APV添加至细胞外浴溶液中来以药理学方式抑制自发性抑制性突触后电流(sIPSC)和诱发性抑制性突触后电流(eIPSC)。在河豚毒素(TTX，用以阻断动作电位)存在下监测自发性小抑制性突触后电流(mIPSC)。使用Clampfit 10(Molecular Devices)、Origin8软件(Mocrocal Inc.)、MiniAnalysis软件(Synaptosoft)和 Igor(Wavemetrics)分析数据。使用学生t检验实施统计学分析 (*P<0.01)。所有数据均示为平均值±S.E.M.s.。

结论

上文所呈现的结果指示新方法和组合物会改良BoNT/B与其人受体的结合，且提供通过利用本发明中所产生的经修饰的受体结合结构域来产生新一代治疗性BoNT的方式，该新一代治疗性BoNT较当前利用的WT BoNT对靶人神经元具有改良的效能和特异性。

这些成果显示，修饰BoNT/B-H_c的蛋白质序列可产生可以高亲和力结合人Syt II的新形式。可通过靶向诱变(定点诱变)或随机诱变已知结合Syt I/II的区域内的每个氨基酸残基来修饰BoNT/B-H_c蛋白质序列。这些Syt结合区域已通过先前共晶体结构研究充分确定^25,26。例如，其由BoNT/B1序列中的残基1078-1291构成(GenBank登录编号：P10844)。尽管这些研究是使用BoNT/B1序列进行的，但可使用 BoNT/B的所有亚型作为模板来重新产生与本文所描述相同或类似的突变。尽管所选残基的确切位置在不同BoNT/B亚型中可以不是相同的，但可容易地鉴定(例如在并不在确切相同的位置时通过序列比对) 不同BoNT/B亚型中的类似残基。

具体而言，研究的是基于所报道的BoNT/B-Syt II复合物结构 (PDB ID：2NM1)的BoNT/B的Syt II结合界面中的所有残基，包括 K1113、D1115、S1116、P1117、V1118、W1178、Y1181、Y1183、 E1191、K1192、F1194、A1196、P1197、S1199、S1201、E1203、F1204、 E1245和Y1256，如图3B中所列。

诱变是产生工程改造的蛋白质产物的常用实验室技术。可使用引入突变的若干方法，包括定点诱变、随机诱变、组合诱变和插入诱变。应用定点诱变和随机诱变以将突变引入BoNT/B-H_c序列中。随机诱变是产生用于筛选的突变体文库的强力工具。通过使用具有掺杂核苷酸的PCR引物，产生在图3B所列位置处含有所有其他19种氨基酸的取代的突变体库。然后使用BACTH系统进行筛选，如图4中所图示。

将位置1191、1178、1183和1199处的残基鉴定为对于生成具有增强的人Syt II结合的BoNT/B-H_c突变体的取代突变较为重要。特异性取代是E1191M/C/V/Q/L/Y、Y1183C/P、S1199Y/W/E/H、 W1178Y/Q/A/S(图5A、B)。

其他定量测定揭示，将残基E1991变为M/C/V/Q会对h-Syt II 产生最强结合，如通过β-半乳糖苷酶活性(图6A)和下拉测定(图6B) 所测量。因此，将E1191鉴定为引入增强与h-Syt II结合的突变的一级位点，且将E1191/M/C/V/Q的取代突变鉴定为一级突变。

使用E1191M作为一级突变来探究添加次级突变是否可进一步增强与h-Syt II的结合(图7A)。因为在BACTH筛选(图5B)中 Y1183C/P、S1199Y/W/E/H和W1178Y/Q/A/S取代突变产生“浅蓝色”集落，所以选择这些位点作为潜在次级突变位点。生成并测试组合 E1191M与这些潜在次级突变的双重突变。发现在下拉测定中在与 E1191M处的一级突变组合时，三种突变S1199W、S1199Y和W1178Q 会增强与h-Syt II的结合(图7A、B)。选择这三个取代突变作为次级突变。

使用如图8A中所描述的生物膜干涉术测定实施其他定量测定以测定BoNT/B-H_c突变体与h-Syt II之间的结合亲和力。测量双重突变 (一种来自一级突变(M1191M/C/Q/V)且另一种来自次级突变 (S1199W/Y、W1178Q))对h-Syt II的结合亲和力(图8B)。结果显示，下列双重突变：E1191M/C/Q/V与S1199W/Y的组合和E1191M/C/V 与W1178Q的组合显著增强对h-Syt II的结合亲和力(图8B)。由此将这11种双重组合鉴定为BoNT/B-H_c中最大程度增强与h-Syt II的结合的突变。

发现工程改造的BoNT/B-H_c突变体不仅增强与人Syt II的结合，而且还增强与人Syt I的结合。使用E1191M/S1199Y和 E1191V/S1199Y显示，这些突变体与WT BoNT/B-H_c相比还显示出显著增强的与人Syt I结合的能力(图9)。

经修饰的BoNT/B-H_c突变体可在氨基酸残基E1191、Y1183、W1 178和S1199中的一个或组合(例如E1191M/S1199W、E1191M/S1199 Y、E1191M/W1178Q、E1191C/S1199W、E1191C/S1199Y、E1191C/ W1178Q、E1191Q/S1199W、E1191Q/S1199Y、E1191V/S1199W、E1 191V/S1199Y和E1191V/W1178Q)处含有氨基酸取代。

还测试所选三重突变(通过组合E1191/S1199/W1178位点处的突变产生)且发现其与E1191/S1199位点处的双重突变具有类似结合亲和力。例如，E1191M/S1199W/W1178Q与E1191M/S1199W具有类似结合亲和力(图8B)。因此，三重突变表现出双重突变的增强的结合亲和力，尽管其似乎并未较双重突变关于增加的结合亲和力提供显著优点。

这些结果指示，可制备并在治疗上使用含有具有与WT BoNT/B-H_c的序列相关的经修饰氨基酸序列的BoNT/B-H_c的多肽，其中经修饰的BoNT/B-H_c与WT BoNT/B-H_c相比具有改良的结合人Syt I和II的能力。多肽可(例如)呈以下形式：全长BoNT/B突变体、截短BoNT/B突变体或如上文描述在受体结合结构域(BoNT/B-H_c)内含有相同氨基酸取代的重组蛋白以及在相应位置处具有氨基酸取代的 BoNT/B亚型。另外，可通过置换受体结合结构域内不同于BoNT/B1 的残基来修饰BoNT/B亚型以结合h-Syt II。

所涵盖的全长BoNT/B突变体在氨基酸残基E1191、Y1183、W1 178和S1199中的一个或组合(例如2或3种)，例如E1191M/S1199W、 E1191M/S1199Y、E1191M/W1178Q、E1191C/S1199W、E1191C/S119 9Y、E1191C/W1178Q、E1191Q/S1199W、E1191Q/S1199Y、E1191V/S1199W、E1191V/S1199Y和E1191V/W1178Q处含有氨基酸取代。突变可以与上文针对BoNT/B-H_c所公开的相同方式使用任一BoNT/ B亚型作为模板来进行。这些突变BoNT/B毒素增强了与人Syt II和人Syt I两者的结合，由此较WT BoNT/B对靶人神经元实现较高效能和特异性。

实例部分的参考文献

3.Aoki，K.R.Botulinum toxin：a successful therapeutic protein.Curr MedChem 11， 3085-3092(2004).

5.Lange，O.，et al.Neutralizing antibodies and secondary therapyfailure after treatment with botulinum toxin type A：much ado about nothing？Clin Neuropharmacol 32， 213-218(2009).

6.Chapman，M.A.，Barran，R.，Tanis，D.C.，Gill，C.E.&Charles，P.D.Comparisonof botulinum neurotoxin preparations for the treatment of cervicaldystonia.Clin Ther 29，1325-1337(2007).

8.Dong，M.，Tepp，W.H.，Liu，H.，Johnson，E.A.&Chapman，E.R.Mechanism ofbotulinum neurotoxin B and G entry into hippocampal neurons.J Cell Biol 179，1511- 1522(2007).

9.Peng，L.，Tepp，W.H.，Johnson，E.A.&Dong，M.Botulinum neurotoxin D usessynaptic vesicle protein SV2 and gangliosides as receptors.PLoS Pathog 7，e1002008 (2011).

12.Rummel，A.，Karnath，T.，Henke，T.，Bigalke，H.&Binz，T.Synaptotagmins Iand II act as nerve cell receptors for botulinum neurotoxin G.JBiol Chem 279，30865- 30870(2004).

13.Peng，L.，et al.Botulinum neurotoxin D-C uses synaptotagmin I/II asreceptors and human synaptotagmin II is not an effective receptor for type B，D-C，and G toxins.J Cell Sci(2012).

14.Montecucco，C.How do tetanus and botulinum toxins bind to neuronalmembranes？ TIBS，314-317(1986).

15.Nishiki，T.，et al.The high-affinity binding of Clostridiumbotulinum type B neurotoxin to synaptotagmin II associated with gangliosidesGT1b/GD1a.FEBS Lett 378，253-257(1996).

16.Pang，Z.P.，et al.Synaptotagmin-2 is essential for survival andcontributes to Ca2+ triggering of neurotransmitter release in central andneuromuscular synapses.J Neurosci 26，13493-13504(2006).

17.Strotmeier，J.，Willjes，G.，Binz，T.&Rummel，A.Human synaptotagmin-IIis not a high affinity receptor for botulinam neurotoxin B and G：increasedtherapeutic dosage and immunogenicity.FEBS Lett 586，310-313(2012).

18.Craxton，M.A manual collection of Syt，Esyt，Rph3a，Rph3al，Doc2，andDblc2 genes from 46 metazoan genomes--an open access resource forneuroscience and evolutionary biology.BMC Genomics 11，37(2010).

19.Brin，M.F.，et al.Safety and efficacy of NeuroBloc(botulinum toxintype B)in type A-resistant cervical dystonia.Neurology 53，1431-1438(1999).

20.Pappert，E.J.&Germanson，T.Botulinum toxin type B vs.type A intoxin-naive patients with cervical dystonia：Randomized，double-blind，noninferiority trial.Mov Disord23，510-517(2008).

21.Wang，J.，et al.Longer-acting and highly potent chimaeric inhibitorsof excessive exocytosis created with domains from botulinum neurotoxin A andB.Biochem J 444， 59-67(2012).

22.Rummel，A.，Mahrhold，S.，Bigalke，H.&Binz，T.Exchange ofthe H(CC)domainmediating double receptor recognition improves the pharmacodynamic propertiesof botulinum neurotoxin.FEBS J 278，4506-4515(2011).

23.Dong，M.，et al.SV2 is the protein receptor for botulinum neurotoxinA.Science 312， 592-596(2006).

24.Arnon，S.S.，et al.Botulinum toxin as a biological weapon：medicaland public health management.Jama 285，1059-1070(2001).

25.Jin，R.，Rummel，A.，Binz，T.&Brunger，A.T.Botulinum neurotoxin Brecognizes its protein receptor with high affinity and specificity.Nature444，1092-1095(2006).

26.Chai，Q.，et al.Structural basis of cell surface receptorrecognition by botulinum neurotoxin B.Nature 444，1096-1100(2006).