ES2895853T3 - Neurotoxina botulínica modificada - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B- HC), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a sustituciones en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191C y E1191Y, en donde el dominio de unión al receptor modificado posee 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo salvaje de referencia de SEQ ID NO: 5, y en donde el polipéptido muestra mejor unión a Syt II humana en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones por sustitución.

Description

DESCRIPCIÓN

Neurotoxina botulínica modificada

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de las neurotoxinas modificadas y a su uso para el tratamiento de trastornos médicos y/o estéticos.

Antecedentes de la invención

Las neurotoxinas botulínicas son una familia de toxinas bacterianas, que incluye siete serotipos principales (NTBo/A-G)1. Estas toxinas actúan bloqueando la liberación de neurotransmisores desde las neuronas, paralizando así a animales y seres humanos. En los últimos años, las NTBo se han utilizado ampliamente para tratar una lista creciente de afecciones médicas: las inyecciones locales de cantidades mínimas de toxinas pueden atenuar la actividad neuronal en regiones específicas, lo que puede ser beneficioso en muchas afecciones médicas, así como con fines cosméticos2-4.

NTBo/A y NTBo/B son las únicas dos NTBo que actualmente están aprobadas por la FDA para su uso en seres humanos2-4. Estas son toxinas purificadas a partir de bacterias sin ninguna modificación de secuencia (definidas como de tipo salvaje, WT). A medida que crece la aplicación de NTBo, se ha informado sobre sus limitaciones y efectos adversos. La principal limitación es la generación de anticuerpos neutralizantes en los pacientes, lo que hace que el tratamiento futuro sea poco eficaz5. La interrupción del uso de NTBo a menudo deja a los pacientes sin otras formas eficaces de tratar/aliviar sus trastornos. La posibilidad de respuestas de anticuerpos está directamente relacionada tanto con las dosis de toxina como con la frecuencia de inyección5. Por lo tanto, esta limitación se produce principalmente en el tratamiento de espasmos musculares, que implica dosis relativamente altas de toxinas. De manera consistente, no se han observado respuestas de anticuerpos en aplicaciones cosméticas, que utilizan dosis de toxinas extremadamente bajas5.

Los principales efectos adversos también se asocian a menudo con el tratamiento de espasmos musculares, pero no con aplicaciones cosméticas. Esto se debe a que los efectos adversos se deben en gran medida a la difusión de toxinas a otras regiones del organismo y la posibilidad de difusión de toxinas está directamente relacionada con las dosis inyectadas. Los efectos adversos van desde eventos transitorios no graves tales como ptosis y diplopía hasta eventos potencialmente mortales, incluso la muerte67. En una carta de petición presentada en 2008 por el Dr. Sidney Wolfe a la FDA, se han documentado un total de 180 eventos adversos graves, incluidas 16 muertes. Como resultado, la FDA ahora requiere la "advertencia de recuadro negro" en todos los productos de NTBo, destacando el riesgo de propagación de toxinas, siguiendo advertencias similares emitidas por la Unión Europea.

Debido a que tanto la generación de anticuerpos neutralizantes como la difusión de la toxina están directamente relacionadas con las dosis inyectadas, es muy deseable reducir las dosis de toxina (mientras se mantienen los mismos niveles de actividad de la toxina), lo que significa que se debe mejorar la eficacia de las moléculas de toxina individuales. Tales NTBo modificadas con una mejor especificidad por las neuronas también reducirán cualquier efecto potencial inespecífico debido a la entrada no específica en otros tipos de células.

Las NTBo se dirigen a las neuronas y entran en ellas uniéndose a sus receptores específicos a través de sus dominios de unión al receptor, que están bien definidos en la bibliografía (NTB^o-H^c, Figura 1A, B)1. La unión del receptor dicta la eficacia y especificidad de las NTBo para reconocer neuronas. La mejora de la capacidad de unión al receptor de las NTBo aumentará su eficacia y especificidad por las neuronas diana. Se han identificado los receptores para la mayoría de las NTBo (Fig. 1C). NTBo/B, D-C y G comparten dos proteínas de vesículas sinápticas homólogas, sinaptotagmina I y II (Syt I/II) como sus receptores8-13, mientras que NTBo/A, E, D y F utilizan otra proteína de vesícula sináptica, SV2914-18. Además de los receptores de proteínas, todas las NTBo requieren gangliósidos co-receptores de lípidos (Fig. 1D), que son abundantes sobre las superficies neuronales19. Entre las dos isoformas de Syt, Syt II tiene una afinidad de unión aproximadamente 10 veces mayor para NTBo/B que Syt I y también es la isoforma dominante expresada en los terminales de los nervios motores, que son las neuronas diana de las NTBo (Fig. 2A)2021. Por lo tanto, Syt II se considera el principal receptor de toxinas para NTBo/B, D-C y G, mientras que Syt I es un receptor de toxinas minoritario en los terminales de los nervios motores. Este es el caso de los roedores y probablemente de la mayoría de los mamíferos.

Se puede argumentar que las NTBo ya tienen una alta especificidad por las neuronas y preguntarse si es posible mejorar aún más su unión a las neuronas. La respuesta es un "Sí" para los seres humanos, al menos en parte a la luz del reciente descubrimiento de que la Syt II humana tienen una enorme disminución de la unión y la función como receptor de NTBo/B debido a un cambio de aminoácido único en Syt II de roedor (rata/ratón) dentro del sitio de unión de la toxina1322. Este es un cambio de fenilalanina (F) a leucina (L) en la posición 54 (secuencia Syt II de ratón) (Fig. 2B). Los alineamientos de secuencias han revelado que la fenilalanina en esta posición está altamente conservada tanto en Syt I como en Syt II en vertebrados, incluidos ornitorrincos, peces, roedores y monos23. Sólo la Syt II humana y de chimpancé contiene leucina en esta posición. Como resultado de este cambio de resto, la Syt II humana y de chimpancé tienen una enorme disminución de la unión a NTBo/B, D-C y G (Fig. 2C) y es significativamente menos eficaz para mediar la entrada de NTBo/B (Fig. 2D), en comparación con la Syt II de ratón.

Dado que la Syt I humana y de chimpancé todavía contienen fenilalanina en la misma posición y se pueden unir a NTBo/B, D-C y G (Fig. 2E), el receptor de alta afinidad para NTBo/B, D-C y G en los seres humanos está restringido al receptor Syt I minoritario. Estos hallazgos proporcionan una explicación de las observaciones clínicas de que se necesita una dosis mucho más alta de NTBo/B que de NTBo/A (que se une a un receptor diferente) para lograr los mismos niveles de efectos terapéuticos en los pacientes2425. Anteriormente, estas observaciones se atribuían a otras razones, tales como el porcentaje de neurotoxina activa en las preparaciones utilizadas. Las observaciones recientes de tales diferencias de unión de NTBo/B a Syt II humana frente a Syt II de otras especies sugieren que pueden estar implicados en la unión a Syt II humana diferentes restos de NTBo/B. Como tal, la modificación de la secuencia de NTBo/B que se espera que afecte la unión a SytII de roedor puede tener efectos impredecibles sobre la unión de NTBo/B a Syt II humana.

Por tanto, existe una gran necesidad de mejorar la unión de NTBo/B al receptor Syt II humano, como una forma de aumentar su eficacia y especificidad para dirigirse a neuronas humanas y disminuir las dosis de toxina necesarias en aplicaciones terapéuticas.

El documento WO 2013/180799 A1 se refiere a polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) con un dominio de unión al receptor modificado de botulinum Clostridial de serotipo B (B-Hc), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución específicas en el serotipo B, cepa 1.

Compendio de la invención

Un aspecto de la invención se refiere a un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial de serotipo B (B-H^c), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a sustituciones en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191C y E1191Y. El dominio de unión al receptor modificado posee 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo salvaje de referencia de SEQ ID NO: 5, y en donde el polipéptido muestra una mejor unión a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones por sustitución.

Otro aspecto de la invención se refiere a un polipéptido de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende un dominio proteasa; un sitio de escisión de proteasa; un dominio de translocación; y un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial de serotipo B (B-H^c), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a sustituciones en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191C y E1191Y. El dominio de unión al receptor modificado posee 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo salvaje de referencia de SEQ ID NO: 5, y en donde el polipéptido de NTBo muestra una mejor unión a Syt II humana en comparación con una molécula idéntica que carece de las una o más mutaciones por sustitución.

En realizaciones de la invención, el polipéptido o polipéptido de NTBo como se describió anteriormente, pueden ser una molécula quimérica que comprende una primera porción que es el dominio de unión al receptor modificado conectado a una segunda porción.

Otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos anteriormente. Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos anteriormente. Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que comprende el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos anteriormente, o el vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que expresa cualquiera de los polipéptidos de NTBo, polipéptidos o moléculas quiméricas descritos anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo), polipéptidos o moléculas quiméricas descritos anteriormente. En una realización de cualquiera de las composiciones farmacéuticas, la composición farmacéutica comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir cualquiera de los polipéptidos o polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) descritos anteriormente, comprendiendo el método las etapas de cultivar la célula que expresa el polipéptido o polipéptido de NTBo en las condiciones en las que dicho polipéptido o polipéptido de NTBo es producido.

Otro aspecto de la invención se refiere a cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) o las composiciones farmacéuticas, o las moléculas quiméricas, o los polipéptidos descritos anteriormente para su uso en medicina.

Otro aspecto de la invención se refiere a cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo), o las composiciones farmacéuticas, o las moléculas quiméricas, o los polipéptidos descritos anteriormente, para su uso en el tratamiento de una afección asociada con actividad neuronal no deseada, en donde la afección se selecciona del grupo formado por disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno de párpados, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica, anismo, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos de músculos, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos de la secreción, dolor por espasmos musculares, dolor de cabeza, migraña, y afecciones dermatologicas.

También se describe en la presente memoria un polipéptido de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende un dominio proteasa, un sitio de escisión de proteasa, un dominio de translocación y un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-Hc), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionadas del grupo que consiste en E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P y combinaciones de las mismas. En una realización, (B-H^c) modificado comprende una mutación por sustitución correspondiente a una mutación por sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionada del grupo que consiste en E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C e Y1183P. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el (B-H^c) comprende la mutación por sustitución correspondiente a E1191C en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el (B-Hc) modificado comprende la mutación por sustitución correspondiente a E1191V en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el (B-HC) modificado comprende dos mutaciones por sustitución.

También se describe en la presente memoria un polipéptido de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende un dominio proteasa, un sitio de escisión de proteasa, un dominio de translocación y un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-Hc), que comprende dos o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L y E1191Y. En una realización, otra de las mutaciones por sustitución corresponde a S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F o S1199L en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W, E1191M y W1178Q, E1191C y S1199W; E1191C y S1199Y, E1191C y W1178Q, E1191Q y S1199W, E1191V y S1199W, E1191V y S1199Y, o E1191V y W1178Q, en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W en serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191Q y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el (BH^c) modificado comprende tres mutaciones por sustitución. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución están en posiciones que corresponden a E1191, Y1183 y S1199 o a E1191, S1199 y W1178 de serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución corresponden a E1191M, S1199W y W1178Q de serotipo B, cepa 1.

También se describe en la presente memoria un polipéptido de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende un dominio proteasa, un sitio de escisión de proteasa, un dominio de translocación y un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-Hc), que comprende una mutación por sustitución en una posición correspondiente a S1199 o S1201 de serotipo B, cepa 1.

En una realización de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el B-HC modificado es de la cepa 1. En una realización de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el dominio proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de proteasa son del serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C, D, E, F, G y combinaciones de los mismos. En una realización de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el dominio proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de proteasa son de serotipo B, cepa 1. En una realización de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el dominio proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de proteasa son del serotipo A, cepa 1. En una realización de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el B-Hc modificado no es de la cepa B4.

Asimismo se describe en la presente memoria un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de Botulinum clostridial (B-H^c) que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionadas del grupo formado por E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, y combinaciones de las mismas. En una realización, el (B-H^c) modificado comprende dos mutaciones por sustitución.

Asimismo se describe en la presente memoria un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de Botulinum clostridial (B-H^c) que comprende dos o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L y E1191Y. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, una de las mutaciones por sustitución corresponde a S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F o S1199L en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W, E1191M y W1178Q, E1191C y S1199W; E1191C y S1199Y, E1191C y W1178Q, E1191Q y S1199W, E1191V y S1199W, E1191V y S1199Y, o E1191V y W1178Q, en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W en serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y W1178Q en el serotipo B, cepa. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191Q y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria el (BH^c) modificado comprende tres mutaciones por sustitución. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución están en posiciones que corresponden a E1191, Y1183 y S1199 o a E1191, S1199 y W1178 de serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución corresponden a E1191M, S1199W y W1178Q de serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el BH^c modificado es de la cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el B-Hc modificado no es de la cepa 4. En una realización, el B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8.

Asimismo se describe en la presente memoria una molécula quimérica que comprende una primera porción que es un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-H^c) conectado a una segunda porción, en donde el B-HC modificado comprende una o más mutaciones por sustitución seleccionadas del grupo que consiste en E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P y combinaciones de las mismas. En una realización, el B-H^c modificado comprende dos mutaciones por sustitución.

Asimismo se describe en la presente memoria una molécula quimérica que comprende una primera porción que es un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-H^c) conectado a una segunda porción, en donde el B-H^c modificado comprende dos o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L y E1191Y. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, una de las mutaciones por sustitución corresponde a S1199W, S1199E, S1199H, S11199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F o S1199L en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W, E1191M y W1178Q, E1191C y S1199W; E1191C y S1199Y, E1191C y W1178Q, E1191Q y S1199W, E1191V y S1199W, E1191V y S1199Y, o E1191V y W1178Q, en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191Q y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, el (BHC) modificado comprende tres mutaciones por sustitución. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución están en posiciones que corresponden a E1191, Y1183 y S1199 o a E1191, S1199 y W1178 de serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución corresponden a E1191M, S1199^w y W1178Q de serotipo B, cepa 1.

En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, el B-H^c modificado es de la cepa 1. En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, el B-Hc modificado no es de la cepa 4. En una realización, el B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8.

En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, la primera porción y la segunda porción están conectadas covalentemente. En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, la primera porción y la segunda porción están conectadas de forma no covalente. En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, la segunda porción se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido corto y una proteína. En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, la segunda porción es una molécula bioactiva. En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, la segunda porción es un fármaco polipeptídico o no polipeptídico terapéutico.

La divulgación se refiere adicionalmente a cualquiera de los polipéptidos de NTBo, polipéptidos o moléculas quiméricas descritos en la presente memoria que muestra una unión significativamente mejorada del B-Hc modificado a SytII humana y/o una unión significativamente reducida de B-Hc modificado a Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación o las mutaciones por sustitución.

La divulgación se refiere adicionalmente a cualquiera de los polipéptidos de NTBo, polipéptidos o moléculas quiméricas descritos en la presente memoria en donde la mutación por sustitución produce una unión significativamente mejorada a SytII humana y/o una unión significativamente mejorada a SytI humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación o las mutaciones por sustitución.

Asimismo se describe en la presente memoria un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos en la presente memoria. Asimismo se describe en la presente memoria un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos en la presente memoria. Asimismo se describe en la presente memoria una célula que comprende el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos en la presente memoria, o el vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico.

Asimismo se describe en la presente memoria una célula que expresa cualquiera de los polipéptidos de NTBo, polipéptidos o moléculas quiméricas descritos en la presente memoria.

Asimismo se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) descritos en la presente memoria.

Asimismo se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria.

Asimismo se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria.

Asimismo se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos o vectores de ácido nucleico descritos en la presente memoria.

En una realización de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria, la composición farmacéutica comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Asimismo se describe en la presente memoria un kit que comprende cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria y las instrucciones para la administración terapéutica de la composición farmacéutica.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para producir cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) descritos en la presente memoria, comprendiendo el método las etapas de cultivar la célula que expresa el polipéptido de NTBo en condiciones en las que se produce dicho polipéptido de NTBo. En una realización, el método comprende adicionalmente una o más de las etapas de recuperación del polipéptido de NTBo del cultivo, purificación del polipéptido de NTBo, activación del polipéptido de NTBo y/o formulación del polipéptido de NTBo.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para tratar una afección asociada con actividad neuronal no deseada que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de NTBo descrito en la presente memoria a un sujeto para que contacte de ese modo con una o más neuronas que presentan actividad neuronal no deseada, para tratar así la afección. En una disposición descrita, la afección se selecciona del grupo que consiste en disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica (es decir, todas las enfermedades que implican incontinencia urinaria, tales como p. ej. hiperactividad neurogénica del detrusor o vejiga hiperactiva idiopática), anismo, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos de músculos, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos secretores, dolor por espasmos musculares, dolor neuropático, dolor inflamatorio, dolor de cabeza (tal como p. ej., migraña), picazón (prurito), acné y afecciones dermatológicas o estéticas/cosméticas.

Otra disposición descrita se refiere a cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) o las composiciones farmacéuticas, o las moléculas quiméricas, o los polipéptidos descritos en la presente memoria para su uso en medicina.

Otra disposición descrita se refiere a cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo), o las composiciones farmacéuticas, o las moléculas quiméricas, o los polipéptidos descritos en la presente memoria, para su uso en el tratamiento de una afección asociada con actividad neuronal no deseada.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para identificar un dominio de unión al receptor modificado de la neurotoxina botulínica para la unión a un receptor que comprende expresar el dominio de unión al receptor modificado como una primera proteína de fusión con la subunidad T18 de la adenilato ciclasa bacteriana en un ensayo de 2 híbridos, y expresar el receptor como una segunda proteína de fusión con la subunidad T25 de la adenilato ciclasa bacteriana en el ensayo de 2 híbridos, analizar una colonia de E. coli clonal que expresa tanto la primera como la segunda proteínas de fusión para detectar la presencia de una indicación positiva por encima de un control negativo, e identificar el dominio de unión al receptor modificado expresado por la colonia que presenta la indicación positiva como unión al receptor. En una realización, la indicación positiva es el desarrollo de color. En una realización de los métodos descritos en la presente memoria, el método comprende adicionalmente la etapa de analizar la colonia para la indicación positiva frente a un control débilmente positivo e identificar adicionalmente el dominio de unión al receptor modificado expresado por la colonia que muestra la indicación positiva por encima del control débilmente positivo como unión al receptor con alta afinidad. En una realización de los métodos descritos en la presente memoria, el método se realiza con una biblioteca de dominios de unión al receptor modificados, cada uno de los cuales se expresa dentro de las respectivas colonias. En una realización de los métodos descritos en la presente memoria, el receptor es humano. En una realización de los métodos descritos en la presente memoria, el dominio de unión al receptor modificado comprende una o más mutaciones por sustitución, en donde una de las mutaciones por sustitución corresponde a una mutación en el serotipo B, cepa 1, seleccionada del grupo que consiste en: E1191M, E1191Q, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199F, S1199L W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P y S1199Y.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A - Figura 1D (datos publicados para antecedentes) muestran modelos esquemáticos de cómo las NTBo se dirigen a las neuronas (Figura 1A), su estructura proteica general (Figura 1B), una lista de receptores identificados (Figura 1C) y el modelo estructural para NTBo/B que se une a sus receptores Syt y gangliósidos (Figura 1D). (Figura 1A) Una vista esquemática de las acciones de NTBo: las NTBo reconocen las neuronas al unirse a sus receptores específicos (etapa 1), entran en las neuronas a través de la endocitosis mediada por receptores (etapa 2), las cadenas ligeras de las NTBo se translocan a continuación a través de las membranas endosomales hacia el citosol (etapa 3), donde estas cadenas ligeras actúan como proteasas para escindir las proteínas diana del anfitrión (etapa 4). La Figura 1A está adaptada de Arnon, S. et al, JAMA, 285:1059, 200124. (Figura 1B) Las NTBo se componen de una cadena ligera y una cadena pesada, conectadas mediante un enlace disulfuro. La cadena pesada se puede dividir adicionalmente en dos dominios: el dominio de translocación (HN) y el dominio de unión al receptor (HC). Estos dominios funcionales se pueden cambiar entre diferentes NTBo. Por ejemplo, se puede utilizar NTBo/B-Hc para reemplazar NTBo/A-Hc para generar toxinas quiméricas. (Figura 1C) Una lista de receptores de toxinas identificados. (Figura 1D) Un modelo estructural que muestra la unión de NTBo/B a su receptor de proteína, Syt (I/II), así como a su co-receptor de lípidos, gangliósidos, sobre la superficie celular. La identificación de la Figura 1D está adaptada de Chai et al., Nature, 444:1096, 200631.

La Figura 2A - Figura 2D muestran datos anteriores adaptados de la bibliografía publicada que indica que Syt II humana no es un receptor eficaz para NTBo/B, D-C y G. (A) Syt II humana se diferencia de Syt II de ratón/rata en un solo resto dentro del sitio de unión de la toxina (resto 54 en Syt II de ratón, 51 en Syt II humana). (La SytII (ratón) que se muestra es SEQ ID NO: 1 y la SytII (humana) que se muestra es SEQ ID NO: 14). (Figura 2^b ) Syt II de ratón recombinante 1-87 (m-Syt II) etiquetada con glutatión S-transferasa (GST) y un mutante de Syt II 1-87 de ratón que imita Syt II humana (F54^l , aquí y posteriormente designada h-Syt II para simplificar el texto) fueron inmovilizadas sobre cuentas de glutatión-sefarosa, y se utilizaron para precipitar NTBo/B, NTBo/D-C o NTBo/G, con o sin la presencia de gangliósido (Gangl). Las tres toxinas se unen a m-Syt II 1-87, pero no a h-Syt II en los ensayos de precipitación. (Figura 2C) Las neuronas del hipocampo de rata cultivadas solo expresan Syt I pero no Syt II8. Por lo tanto, modificar Syt I para reducir su expresión (KD) genera neuronas sin receptores de toxinas endógenas. A continuación, se expresaron m-Syt II y h-Syt II de longitud completa en neuronas del hipocampo Syt I KD, y estas neuronas se expusieron a NTBo/B (20 nM, exposición de 5 min, incubación de 24 horas) o NTBo/D-C (0,3 nM, 5 min de exposición, 6 horas de incubación) o NTBo/G (40 nM, 5 min de exposición, 24 horas de incubación). Se encontró que h-Syt II era significativamente menos eficaz para mediar la entrada de NTBo/B, NTBo/D-C y NTBo/G en las neuronas con Syt I KD en comparación con Syt II de ratón de tipo salvaje, como lo demuestran los grados de escisión del sustrato de la toxina sinaptobrevina (Syb). (Figura 2D) Se utilizaron Syt I 1-83 de rata y Syt I 1-80 humana para precipitar NTBo/B, NTBo/D-C y NTBo/G, como se describe en el panel C. Syt I humana medió niveles de unión a toxina similares a los de Syt I de rata para las tres toxinas. Esta figura está adaptada de la publicación reciente de los autores de la presente invención: Peng et al., J. Cell Science, 201213.

La Figura 3A - Figura 3B muestran los restos ubicados en la interfaz de unión de Syt II sobre NTB^o/B-H^c, que son candidatos para la mutagénesis dirigida al sitio para modificar la afinidad de unión. (Figura 3A) Aquí se muestra una vista de primer plano de la interfaz de unión entre NTBoB-Hc y Syt II de ratón. Los restos en NTBoB-Hc que contribuyen a la unión están marcados en negrita, mientras que los restos en Syt II no están en negrita. El resto F54 en Syt II, en el medio y mostrado en un tamaño de letra ligeramente mayor, cambia al resto L en Syt II humana. (Figura 3B) Una lista de 19 restos clave en NTBo/B que forman el bolsillo de unión del dominio de unión de Syt II en NTBo/B. Estos restos son candidatos para la mutagénesis dirigida al sitio.

La Figura 4A - Figura 4B son ilustraciones del sistema de dos híbridos de adenilato ciclasa bacteriana (BACTH) que se utiliza para escrutar mutantes de NTBoB-Hc para determinar su capacidad para unirse a Syt II humana. (Figura 4A) Se genera una reserva de mutantes de NTBoB-Hc que cubren los 20 aminoácidos diferentes en la posición seleccionada mediante amplificación por PCR con cebadores que contienen trinucleótidos aleatorios (NNN) en el sitio seleccionado. Se generaron un total de 19 reservas distintas para los 19 restos seleccionados en la Figura 3B. (Figura 4B) Una ilustración esquemática del sistema BACTH. Brevemente, la adenilato ciclasa bacteriana se divide en dos dominios, denominados T25 y T18. T25 se fusiona con Syt II humana (restos 1-87) que contiene el sitio de unión de la toxina, mientras que T18 se fusiona con NTBoB-Hc generada como se describe en la Figura 4A. Estas dos proteínas de fusión se codifican en dos plásmidos separados y se transforman conjuntamente en la misma bacteria. La unión de NTBoB-Hc mutada a Syt II humana reúne los dominios T25 y T18 en bacterias, lo que restaura la actividad de la adenilato ciclasa bacteriana. Esto conduce a la producción de AMPc en bacterias, lo que activa la proteína CAP y desencadena la expresión del gen informador lacZ que codifica la p-galactosidasa. La actividad de la p-galactosidasa conduce a colonias de color azul sobre las placas de X-gal que pueden identificarse fácilmente. Los plásmidos que codifican NTBoB-Hc se pueden extraer a continuación de las colonias de color azul y se pueden secuenciar para identificar las mutaciones específicas en NTBoB-Hc.

La Figura 5A - Figura 5B son tablas que resumen los resultados del escrutinio BACTH de los mutantes de NTBoB-H^c. (Figura 5A) Lista de colonias totales y número de colonias de color azul para cada reserva de mutantes de NTBoB-Hc fusionados con T18, expresados conjuntamente en bacterias con Syt II humana fusionada con T25. Según la ecuación de Clark-Carbon, el número total de colonias debe ser superior a 380 para lograr 99,8% de posibilidad de cubrir los 20 aminoácidos posibles en una sola posición. cuatro posiciones dieron como resultado un número significativo de colonias de color azul (68 horas después del cultivo en placa). (Figura 5B) Los plásmidos de las colonias de color azul identificadas en la Figura 5A se extrajeron y secuenciaron para determinar el resto específico introducido en la posición indicada en NTBo/B-Hc. Se enumeran los restos identificados. Es de destacar que las colonias de color azul se dividieron adicionalmente en "colonias de color azul oscuro", que se encontraron con la posición 1191 de NTBo/B-Hc y "colonias de color azul claro", que se encontraron con las posiciones 1183, 1199 y 1178. El experimentador juzgó artificialmente el término "colonias de color azul oscuro" frente a "colonias de color azul claro" basándose en las diferencias entre el color azul de las colonias.

La Figura 6A - Figura 6B muestran resultados experimentales que indican la medición semicuantitativa de las interacciones entre los mutantes de NTBoB-Hc indicados con Syt II humana en el ensayo BACTH. (Figura 6A) La actividad p-galactosidasa se midió a partir de productos lisados de bacterias que expresan tanto Syt II humana fusionada con T25 como los mutantes de NTBoB-Hc indicados fusionados con T18. La actividad p-galactosidasa probablemente refleja la fuerza de las interacciones entre Syt II humana y NTBo/B-Hc. WT NTBoB-Hc sirvió como control. El intercambio de los restos E1191 por M, C, V o Q proporcionó la expresión más fuerte de p-galactosidasa. El intercambio de los restos E1191 por S/A/T/N, Y1183 por C/P, S1199 por W/E/Y/H, W1178 por Y/Q/S mostró ligeros aumentos de las interacciones. N = 6 muestras/grupo. (Figura 6B) La unión de los mutantes de NTBoB-Hc indicados a Syt II de ratón (m-Syt II) o Syt II humana (h-Syt II), cuyos sitios de unión se muestran en la Figura 2A, se sometió a ensayo mediante un ensayo de precipitación. El intercambio de los restos E1191 por M, C, V o Q también mostró la unión más fuerte a h-Syt II.

La Figura 7A - Figura 7B muestran los resultados experimentales del escrutinio de mutaciones secundarias además de la posición E1191 que pueden potenciar la unión a h-Syt II. (Figura 7A) Se crearon mutaciones dobles combinando E1191M con los otros diez cambios de restos identificados en la Figura 5B en las posiciones S1199/Y1183/W1178, respectivamente. Estas dobles mutaciones se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para unirse a h-Syt II mediante un ensayo de precipitación. Los mutantes que muestran una fuerte unión a h-Syt II se indican con un * (Figura 7B). Las mutaciones propuestas para la combinación que pueden mejorar la afinidad entre NTBo/B y Syt II humana se enumeran en la tabla.

La Figura 8A - Figura 8B muestran la medición cuantitativa de la afinidad de unión entre la NTBoB-HC indicada y h-Syt II. (Figura 8A) Se midió la unión de h-Syt II etiquetada con GST a WT NTB^oB-H^c etiquetada con His y E1191M/S1199Y mediante un ensayo de interferometría de biocapa. Brevemente, se cargaron biosensores anti-GST con GST-h-Syt II. Los biosensores cargados se incubaron con proteínas NTBoB-Hc 1 pM para medir la cinética de asociación, seguido de etapas de lavado para medir la cinética de disociación. Se muestran las curvas representativas de asociación y disociación. (Figura 8B) Las afinidades de unión entre la NTBo/B-Hc indicada y Syt II se midieron mediante un ensayo de interferometría de biocapa como se describe en el panel A. Se calcularon los parámetros cinéticos (kon y koff) y las afinidades de unión generales (Kd) a partir de un ajuste no lineal de curvas de asociación y disociación. La unión de WT NTBoB-Hc a h-Syt II es demasiado débil para ser determinada de manera confiable, con una estimación de K^d más allá del límite de detección (> 20 pM), mientras que la mayoría de los mutantes dobles y triples mostraron un drástico aumento de la afinidad de unión en el intervalo de 0,59 a 4,30 pM.

La Figura 9A - Figura 9C muestran resultados experimentales que indican que los mutantes de NTBo/B-Hc seleccionados tienen una mejor unión a Syt I humana. (Figura 9A) Se purificaron WT NTBoB-Hc y el mutante E1191M como proteínas recombinantes etiquetadas con His6 ("His6" divulgada como SEQ ID NO: 13) y se incubaron con h-Syt I (1-80) etiquetada con GST inmovilizada, con o sin la presencia de gangliósidos co-receptores (Gangl). La unión de WT NTBo/B-Hc a h-Syt I requiere la presencia de gangliósidos co-receptores, lo que indica interacciones relativamente débiles entre WT NTBoB-Hc y h-Syt. El mutante E1191M puede unirse a h-Syt I sin gangliósidos, mostrando una mejor afinidad de unión a h-Syt I. (Figura 9B) Se midió la unión de NTBoB-Hc WT y mutante indicado a h-Syt I mediante interferometría de biocapa como se describe en la Figura 8A. (Figura 9^c ) Los parámetros cinéticos (kon y koff) y las afinidades generales (Kd) para WT NTBo/B-Hc, NTBoB-Hc (E1191M/S1199Y) ("B Hc MY") y NTBoB-Hc (E1191V/S1199Y) ("B Hc VY") a h-Syt I se midieron y se calcularon como se describe en la Figura 8B. La unión de WT NTBoB-Hc (B Hc wt) a h-Syt I no se puede determinar de manera confiable, con una KD estimada por encima del límite de detección (> 20 pM). NTBoB-Hc (E1191M/S1199Y, B Hc, MY) y NTBoB-Hc (E1191V/S1199Y, B Hc VY) mostraron un aumento drástico de la afinidad de unión, con una K^d a 2,9 pM y 5,82 pM, respectivamente.

La Figura 10A - Figura 10B son fotografías del análisis de inmunotinción in situ que indican que H^cB^my mostró una unión robusta a las neuronas humanizadas que expresaban h-Syt II. (Figura 10A) Se crearon neuronas humanizadas modificando Syt I endógena para reducir su expresión y expresando h-Syt II de longitud completa en neuronas corticales de rata cultivadas. Las neuronas que expresan m-Syt II o m-Syt II (F54L) de longitud completa sirvieron como controles adicionales. Estas neuronas fueron expuestas a WT HcB, seguido de análisis de inmunotinción. El HcB unido se detectó a través de una etiqueta HA fusionada a HcB. La sinapsina se marcó como marcador de terminales presinápticos. WT HcB se unió a las sinapsis de las neuronas WT pero no a las neuronas Syt I KD. La expresión de m-Syt II de longitud completa mediante transducción lentiviral restauró la unión de HcB, mientras que la expresión de m-Syt II de longitud completa (F54L) o h-Syt II de longitud completa no logró rescatar la unión. (Figura 10B) Syt I KD también abolió la unión de H^cB^my a las neuronas. La unión se rescató mediante la expresión de m-Syt II, m-Syt II (F54L) y h-Syt II de longitud completa.

La Figura 11A - Figura 11c son resultados experimentales que indican que NTBo/Bmy mostró una mayor eficacia en el bloqueo de la neurotransmisión en neuronas humanizadas. (Figura 11 A) Se crearon neuronas humanizadas como se describe en la Figura 11A. Estas neuronas se expusieron a un gradiente de concentraciones de WT NTBo/B o NTBo/BMY de longitud completa durante 24 horas. Los productos lisados celulares se recogieron y se sometieron a análisis de inmunotransferencia. La p-tubulina sirvió como control de carga interno. Se escindió más VAMP2 por NTBo/Bmi que por WT NTBo/B a las mismas concentraciones, lo que indica que NTBo/Bmy entró en las neuronas de manera más eficiente que WT NTBo/B. Las neuronas humanizadas se expusieron a un gradiente de concentraciones de WT NTBo/B o NTB^o/B^my durante 24 horas y después se registró la actividad de mIPSc mediante un enfoque de pinzamiento zonal de células completas. (Figura 11B) muestra registros de mIPSc representativos con toxinas 30 pM. (Figura 11^c ) representa las actividades de mIPSc frente a las concentraciones de toxina, normalizadas a neuronas que no estuvieron expuestas a ninguna toxina. La concentración inhibidora semimáxima (c Isü) es 89 pM para WT NTBo/B y 7,8 pM para NTBo/Bmy, lo que demuestra que la mejor unión a los receptores humanos dio como resultado una mayor eficacia de la toxina a niveles funcionales en las neuronas.

La Figura 12 es la secuencia de aminoácidos de NTBo/B-Hc (cepa 1; cepa NTBo/B1 Okra). Restos 857-1291 de NTBo/B, cepa 1, GenBank: AB232927.1. (SEQ ID NO: 2).

La Figura 13 es la secuencia de ácido nucleico que codifica los restos 857-1291 de NTBo/B-Hc (cepa B1, cepa Okra) de NTBo/B, cepa B1, basada en GenBank: AB232927.1), que se ha optimizado para la expresión en E. coli. (SEQ ID NO: 3)

La Figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos de c. botulinum serotipo A (1296 a.a.). (SEQ ID NO: 4) La Figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo B (1291 a.a.). (SEQ ID NO: 5) La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo C1 (1291 a.a.). (SEQ ID NO: 6) La Figura 17 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo D (1276 a.a.). (SEQ ID NO: 7) La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo E (1252 a.a.). (SEQ ID NO: 8)

La Figura 19 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo F (1274 a.a.). (SEQ ID NO: 9)

La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo G (1297 a.a.). (SEQ ID NO: 10) La Figura 21 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo B, Cepa Eklund 17B (NTBo/B4) (SEQ ID NO: 11) Genbank Ref: EF051570.1.

Descripción detallada de la invención

Los aspectos de la invención se refieren a la generación de polipéptidos y ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, que comprenden un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial (serotipo B (B-H^c)), y más particularmente al polipéptido de la neurotoxina de C. botulinum (NTBo) que presenta mejor unión a sus receptores humanos mediante la incorporación de un dominio de unión al receptor modificado, y ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. A partir de estos hallazgos, se puede crear una nueva generación de NTBo terapéuticas utilizando el dominio de unión al receptor modificado identificado en la presente memoria, con mejor eficacia y especificidad para dirigirse a neuronas humanas que las WT NTBo actualmente utilizadas.

Definiciones

Como se emplea en la presente memoria, el término "afinidad de unión" significa qué tan fuerte es la actividad de unión de una molécula para un sistema receptor particular. En general, una alta afinidad de unión resulta de una mayor fuerza intermolecular entre un dominio de unión y su sistema receptor, mientras que una baja afinidad de unión implica menos fuerza intermolecular entre el ligando y su receptor. La alta afinidad de unión implica un tiempo de residencia más largo para el dominio de unión en su sitio de unión al receptor que en el caso de una baja afinidad de unión. Como tal, una molécula con una alta afinidad de unión significa que se requiere una concentración más baja de esa molécula para ocupar al máximo los sitios de unión de un sistema receptor y desencadenar una respuesta fisiológica. Por el contrario, una afinidad de unión baja significa que se requiere una concentración relativamente alta de una molécula antes de que los sitios de unión al receptor de un sistema receptor estén ocupados al máximo y se logre la respuesta fisiológica máxima. Por tanto, una neurotoxina botulínica de la presente invención con una mayor actividad de unión debido a una afinidad de unión alta permitirá la administración de menores dosis de la toxina, reduciendo o previniendo así los efectos secundarios no deseados asociados con la dispersión de la toxina a zonas no elegidas como diana.

Un parámetro que se utiliza a menudo para medir la afinidad de unión se define como Kd de unión. Debido a que la K^d se define como la razón entre la constante de disociación (Koff) y la constante de asociación (Kon), cuanto menor sea el valor de KD, mayor será la afinidad de unión.

Como se emplea el término en la presente memoria, "unión significativamente mejorada" cuando se utiliza para describir la afinidad de unión de una molécula de neurotoxina de C. botulinum, o fragmento de unión de NTBo/B-Hc de la misma, de la presente invención a un receptor específico (p. ej., Syt II humana o Syt I humana), se refiere a un aumento en la afinidad de unión para un receptor específico que se incrementa sustancialmente (p. ej., en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la afinidad de unión de la molécula de tipo salvaje) en comparación con la versión no sustituida de la molécula. En una realización, la mejor unión de la molécula sustituida se demuestra por una afinidad de unión que tiene un orden de magnitud o más que la afinidad de unión de la molécula no sustituida (p. ej., la neurotoxina con una molécula de NTBo He de origen natural). Dicho de otra manera, la Kd de la molécula sustituida es un orden de magnitud o más menor que la K^d de la molécula no sustituida. En una realización, la mejor unión se demuestra por una afinidad de unión que es significativamente mayor (p. ej., 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X, etc.) que la afinidad de unión de la molécula no sustituida. Dicho de otra manera, la Kd de la molécula sustituida es significativamente menor (p. ej., 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X, etc.) que la K^d de la molécula no sustituida. En una realización, la mejor unión demostrada está en el intervalo de aproximadamente 0,59 pM a 5,82 pM de Kd. En una realización, la mejor unión demostrada está en el intervalo de aproximadamente 0,59 pM a 4,3 pM de K^d. En una realización, la mejor unión se demuestra por una K^d á 5,82 pM. En una realización, la mejor unión se demuestra por una Kd á 4,30 pM. En una realización, la mejor unión se demuestra por una Kd á 2,9 pM. En una realización, la mejor unión se demuestra por una K^d de aproximadamente 0,59 pM.

En una realización, la K^d de la molécula sustituida para Syt II humana es á 10 pM, preferiblemente á 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 pM, más preferiblemente á 1 o 0,6 pM. En una realización, la K^d de la molécula sustituida para Syt I humana es á 10 pM, preferiblemente á 9, 8, 7, 6, 5, 4 pM, más preferiblemente á 3 pM. En una realización, la K^d de la molécula sustituida para Syt II humana es á 7 pM y la Kd de la molécula sustituida para Syt I humana es á 6 pM. En una realización preferida, la K^d de la molécula sustituida para Syt II humana es á 1 pM y la K^d de la molécula sustituida por Syt I humana es < 3 pM.

En una realización, la mejor unión da como resultado una unión detectable a Syt I humana en ausencia de gangliósidos co-receptores, tal como se ilustra mediante los experimentos descritos en la presente memoria.

Los términos "unión significativamente mejorada" o "unión significativamente reducida" cuando se emplean para describir la afinidad de unión de un fragmento de unión de NTBoB-Hc producido por las mutaciones puntuales descritas en la presente memoria se refiere a un aumento o disminución, respectivamente, en la afinidad de unión del dominio de unión modificado (p. ej., expresado como un fragmento aislado o en el contexto del polipéptido más grande) a un receptor específico (p. ej., Syt II humana o Syt I humana) como se discutió directamente más arriba. Como se emplea el término en la presente memoria, "unión significativamente reducida" cuando se utiliza para describir la afinidad de unión de la molécula de neurotoxina botulínica o fragmento de unión de la misma (p. ej., NTBo/B-Hc), de la presente invención a un receptor específico (p. ej., Syt I humana o Syt II humana), se refiere a una disminución en la afinidad de unión para el receptor específico que está sustancialmente disminuida (p. ej., en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o el 90% de la afinidad de unión de la molécula de tipo salvaje) en comparación con la versión no sustituida de la molécula. En una realización, la disminución de la unión de la molécula sustituida da como resultado una afinidad de unión que es un orden de magnitud o más menor que la afinidad de unión de la neurotoxina no sustituida (p. ej., la neurotoxina con una molécula de NTBo Hc de origen natural). Dicho de otra manera, la K^d de la molécula sustituida es un orden de magnitud o más mayor que la K^d de la neurotoxina no sustituida. En una realización, la reducción de la unión de la molécula sustituida da como resultado una afinidad de unión que es significativamente menor (p. ej., 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X, etc.) que la afinidad de unión de la molécula no sustituida. Dicho de otra manera, la K^d de la molécula sustituida es significativamente mayor (p. ej., 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X, etc.) que la K^d de la molécula no sustituida. En una realización, la unión significativamente reducida da como resultado la pérdida de unión detectable a Syt I humana en ausencia de gangliósidos co-receptores.

Como se emplea en la presente memoria, el término "neurotoxina botulínica" significa cualquier polipéptido que pueda ejecutar el mecanismo celular general por el que una toxina de C. botulinum entra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores. Este mecanismo abarca la unión de una toxina de C. botulinum a un complejo receptor de baja o alta afinidad, la internalización de la toxina, la translocación de la cadena ligera de la toxina al citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de la toxina de C. botulinum. Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente memoria, en referencia a la molécula de neurotoxina de C. botulinum y fragmentos de la misma.

Un "dominio de unión al receptor modificado" o "H^c modificado", como se emplea el término en la presente memoria, facilita la unión de la molécula de neurotoxina de C. botulinum en la que está comprendida, a un receptor para la neurotoxina de C. botulinum ubicada en la superficie de una célula diana. Tal molécula se genera típicamente mediante tecnología de recombinación genética. El H^c modificado tiene una actividad de unión al receptor para la neurotoxina de C. botulinum ubicada en la superficie de una célula diana. Como se emplea en la presente memoria, el término "actividad de unión" significa que una molécula está en contacto directamente o indirectamente con otra molécula a través de al menos una fuerza intermolecular o intramolecular, que incluye, sin limitación, un enlace covalente, un enlace iónico, un enlace metálico, un enlace de hidrógeno, una interacción hidrófoba, una interacción de van der Waals y similares, o cualquier combinación de las mismas. "Unido" y "unir" se consideran términos para la unión.

Como se emplea en la presente memoria, el término "dominio proteasa de la toxina de C. botulinum" significa un dominio de la toxina de C. botulinum que puede ejecutar la etapa de modificación de la diana enzimática del proceso de intoxicación. Por lo tanto, un dominio proteasa de la toxina de C. botulinum se dirige específicamente a un sustrato de la toxina de C. botulinum y abarca la escisión proteolítica de un sustrato de la toxina de C. botulinum, tal como, p. ej., proteínas SNARE como un sustrato SNAP-25, un sustrato VAMP y un sustrato Sintaxina.

Los ejemplos no limitantes de dominios proteasa de la toxina de C. botulinum se proporcionan en las Tablas 1 y 2. Como se emplea en la presente memoria, el término "dominio de translocación de toxina de C. botulinum" o "Hⁿ" significa un dominio de la toxina de C. botulinum que puede ejecutar la etapa de translocación del proceso de intoxicación que media la translocación de la cadena ligera de la toxina de C. botulinum. Por lo tanto, un Hⁿ facilita el movimiento de una cadena ligera de la toxina de C. botulinum a través de una membrana y abarca el movimiento de una cadena ligera de la toxina de C. botulinum a través de la membrana en una vesícula intracelular al citoplasma de una célula. Los ejemplos no limitantes de Hⁿ incluyen una NTBo/A Hⁿ, una NTBo/B Hⁿ, una NTBo/C1 Hⁿ, una NTBo/D Hⁿ, una NTBo/E Hⁿ, una NTBo/F Hⁿ y una NTBo/G Hⁿ, cuyas secuencias de aminoácidos se proporcionan en la Tabla 1 y en las Figuras 12, 14-20.

Como se emplea en la presente memoria, el término "dominio de unión al receptor de C. botulinum" es sinónimo de "dominio H^c" y se refiere a cualquier dominio de unión al receptor de C. botulinum de origen natural que puede ejecutar la etapa de unión celular del proceso de intoxicación, que incluye, p. ej., la unión de la toxina de C. botulinum a un sistema receptor específico de la toxina de C. botulinum ubicado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Se prevé que el reemplazo de la actividad de unión se pueda lograr, p. ej., reemplazando la totalidad del dominio H^c de C. botulinum por un dominio H^c modificado (p. ej., mejorado).

Como se emplea en la presente memoria, el término "célula diana de la toxina de C. botulinum" significa una célula que es una célula de origen natural que puede ser intoxicada por la toxina de C. botulinum, incluidas, sin limitación, las neuronas motoras; neuronas sensoriales; neuronas autónomas; tales como, p. ej., neuronas simpáticas y neuronas parasimpáticas; neuronas no peptidérgicas, tales como, p. ej., neuronas colinérgicas, neuronas adrenérgicas, neuronas noradrenérgicas, neuronas serotoninérgicas, neuronas GABAérgicas; y neuronas peptidérgicas, tales como, p. ej., neuronas de Sustancia P, neuronas de Péptidos Relacionados con el Gen de Calcitonina, neuronas de péptidos intestinales vasoactivos, neuronas de Neuropéptido Y, neuronas de colecistoquinina.

Por "aislado" se entiende un material que está libre en diversos grados de los componentes que normalmente lo acompañan tal como se encuentra en su estado nativo. "Aislar" denota un grado de separación de la fuente original o los alrededores, p. ej. de ADN flanqueante o de la fuente natural del ADN, o de aminoácidos flanqueantes.

El término "purificado" se utiliza para referirse a una sustancia tal como un polipéptido que es "sustancialmente pura", con respecto a otros componentes de una preparación (p. ej., otros polipéptidos). Se puede referir a un polipéptido que es al menos aproximadamente 50%, 60%, 70% o 75%, preferiblemente al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95% puro, con respecto a otros componentes. Recapitulando, los términos "sustancialmente puro" o "esencialmente purificado", con respecto a un polipéptido, se refieren a una preparación que contiene menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 15%, 10%, 8%, 7%, más preferiblemente menos de aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos de 1% de uno o más de otros componentes (p. ej., otros polipéptidos o componentes celulares).

Los términos "conservativa" o "mutación por sustitución conservativa" como se emplean en la presente memoria se refieren a una mutación en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría una estructura secundaria, propiedades químicas y/o naturaleza hidropática del polipéptido sustancialmente sin cambios. Los siguientes grupos de aminoácidos se han sustituido históricamente entre sí como cambios conservativos: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, try, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Otras sustituciones conservativas comúnmente aceptadas se enumeran a continuación:

El término "mutación por sustitución" sin la referencia a un aminoácido específico, puede incluir cualquier aminoácido distinto del resto de tipo salvaje que normalmente se encuentra en esa posición. Tales sustituciones pueden consistir en el reemplazo por aminoácidos no polares (hidrófobos), tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano y prolina. Las sustituciones pueden consistir en el reemplazo por aminoácidos polares (hidrófilos) tales como serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Las sustituciones pueden consistir en el reemplazo por aminoácidos cargados eléctricamente, p. ej. aminoácidos cargados eléctricamente negativamente, tales como ácido aspártico y ácido glutámico, y aminoácidos cargados eléctricamente positivamente, tales como lisina, arginina e histidina.

Las mutaciones por sustitución descritas en la presente memoria consistirán típicamente en el reemplazo por un resto de aminoácido de origen natural diferente, pero en algunos casos también se pueden sustituir restos de aminoácido de origen no natural. Los aminoácidos no naturales, como se emplea el término en la presente memoria, son aminoácidos no proteinogénicos (es decir, no codificantes de proteínas) que se encuentran de forma natural o se sintetizan químicamente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, p-aminoácidos (p3 y p2), homoaminoácidos, derivados de prolina y ácido pirúvico, derivados de alanina sustituidos en posición 3, derivados de glicina, derivados de fenilalanina y tirosina de anillo sustituido, aminoácidos de núcleo lineal, diaminoácidos, D-aminoácidos y N-metil aminoácidos. En algunas realizaciones, el aminoácido puede estar sustituido o no sustituido. El aminoácido sustituido o sustituyente puede ser un aminoácido aromático o alifático halogenado, una modificación alifática o aromática halogenada en la cadena lateral hidrófoba o una modificación alifática o aromática.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es suficiente para efectuar una reducción terapéuticamente significativa en uno o más síntomas de la afección cuando se administra a un sujeto típico que tiene la afección. Una reducción terapéuticamente significativa de un síntoma es, p. ej. aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 100% o más en comparación con un sujeto de control o no tratado.

Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a un tratamiento terapéutico en donde el objetivo es eliminar o disminuir los síntomas. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, eliminación de síntomas, alivio de síntomas, disminución de la extensión de la afección, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la afección, retraso o ralentización de la progresión de la afección.

Como se emplea en la presente memoria, un "sujeto" se refiere a un ser humano o un animal. Por lo general, el animal es un vertebrado, tal como un primate, un roedor, un animal doméstico o un animal de caza. Los primates incluyen chimpancés, monos cinomolgos, monos araña y macacos, p. ej., Rhesus. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsteres. Los animales domésticos y de caza incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervos, bisontes, búfalos, especies felinas, p. ej., gato doméstico, especies caninas, p. ej., perro, zorro, lobo, especies de aves, p. ej., pollo, emú, avestruz y peces, p. ej., trucha, barbo y salmón. Paciente o sujeto incluye cualquier subconjunto de los anteriores, p. ej., todos los anteriores, pero excluyendo uno o más grupos o especies tales como seres humanos, primates o roedores. En ciertas realizaciones de los aspectos descritos en la presente memoria, el sujeto es un mamífero, p. ej., un primate, p. ej., un ser humano. Los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente en la presente memoria. Un sujeto puede ser hombre o mujer. Un sujeto puede ser un sujeto completamente desarrollado (p. ej., un adulto) o un sujeto que experimenta el proceso de desarrollo (p. ej., un niño, un bebé o un feto).

Preferiblemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un primate no humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo o una vaca, pero no se limita a estos ejemplos. Se pueden utilizar ventajosamente mamíferos distintos de los seres humanos como sujetos que representan modelos animales de trastornos asociados con actividad neuronal no deseada. Además, los métodos y composiciones descritos en la presente memoria se pueden utilizar para tratar animales domésticos y/o mascotas.

Realizaciones

La observación de que la NTBo/B es menos específica y potente en seres humanos debido a su incapacidad para unirse a Syt II humana, puede explicar por qué se requieren dosis comparativamente más altas que de la NTBo/A. Las dosis más altas de NTBo/B corresponden a mayores posibilidades de desencadenar respuestas de anticuerpos y de que se produzcan efectos secundarios graves. Por lo tanto, la mejor unión de NTBo/B al receptor Syt II humano, para aumentar su eficacia y especificidad para las neuronas humanas diana, debería permitir una reducción de la cantidad de las dosis de toxina utilizadas en aplicaciones terapéuticas.

Los aspectos de la invención surgen del hallazgo de que la modificación de la secuencia de proteínas de NTBoB-H^c modifica la unión del fragmento que contiene el dominio de unión al receptor al receptor Syt II humano. Se han identificado modificaciones específicas que mejoran la unión, generando así un dominio que se une a Syt II humana con alta afinidad. La NTBo/B-Hc modificada, cuando está en el contexto de una proteína NTBo de longitud completa, conserva estas propiedades de unión. La incorporación de un dominio de unión al receptor modificado con mejor unión, a una molécula que comprende los otros dominios de NTBo, genera por tanto una molécula de NTBo de longitud completa con una mejor unión al receptor de manera similar. Como tales, se generan nuevas versiones de NTBo con unión de alta afinidad a Syt II humana. La NTBo con una unión significativamente mejorada se puede utilizar en terapias similares, aunque a dosis más bajas que las moléculas de NTBo disponibles actualmente, proporcionando así métodos de tratamiento más seguros.

Los polipéptidos de NTBo, incluidos los polipéptidos de NTBo de longitud completa y los fragmentos o dominios de polipéptidos de NTBo descritos en la presente memoria (p. ej., la NTB^o/H^c modificada), y las moléculas de ácido nucleico que las codifican, están explícitamente incluidas en la invención. Estos polipéptidos y moléculas de ácido nucleico se pueden generar mediante procedimientos de ADN recombinante conocidos en la técnica. Tales polipéptidos se denominan típicamente "polipéptidos recombinantes" o "ácidos nucleicos recombinantes".

Proteína de neurotoxina botulínica

En la presente memoria se describe una proteína de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende un dominio de unión al receptor modificado (p. ej., de Botulinum clostridial serotipo B), como se describe en la presente memoria. La proteína NTBo comprende adicionalmente un dominio proteasa, un dominio de translocación y un sitio de escisión de proteasa. Típicamente, estos están dispuestos en un orden de polipéptido único de amino a carboxilo lineal de dominio proteasa, sitio de escisión de proteasa, dominio de translocación y dominio de unión al receptor modificado. Sin embargo, se espera que funcionen adecuadamente las diferentes disposiciones de los diversos dominios. En una realización, el dominio de unión al receptor modificado comprende una o más mutaciones por sustitución que conducen a una unión significativamente mejorada al receptor Syt I humano y/o al receptor Syt II humano.

La proteína NTBo puede comprender adicionalmente un dominio que es útil para la purificación de la molécula, tal como una etiqueta de hexahistidina (His6) (SEQ ID NO: 13), o una etiqueta epitópica, tal como una etiqueta de hemaglutinina (HA) (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)). Varios de estos dominios se conocen y se utilizan en la técnica para tales fines.

La NTBo tiene la estructura general que se muestra en la Figura 1B. La NTBo se compone de tres dominios, cada dominio tiene una función específica e independiente: un dominio proteasa (también denominado cadena ligera), un dominio de translocación (HN) y un dominio de unión al receptor (HC). Se ha demostrado que los dominios de las diversas cepas de neurotoxina de C. botulinum son en gran medida intercambiables (como lo demuestran las toxinas quiméricas naturales tales como la NTBo/CD, que se compone de la cadena ligera y Hn de NTBo/C, con e1Hc de NTBo/D34, en la Patente de Estados Unidos 8.052.979). La proteína puede estar en forma monocatenaria o en forma bicatenaria. La forma bicatenaria resulta del procesamiento por proteasa de origen natural de un sitio de escisión de proteasa ubicado entre el dominio proteasa y el dominio de translocación. La proteína se mantiene en forma bicatenaria después del procesamiento con la proteasa por la presencia de un enlace disulfuro.

Las cepas de Clostridium botulinum producen siete tipos antigénicamente distintos de toxinas botulínicas, que se han identificado mediante la investigación de brotes de botulismo en el hombre (NTBo/A, /B, /E y /F), animales (NTBo/C1 y /D) o aisladas del suelo (NTBo/G). Si bien los siete serotipos de NTBo tienen una estructura y propiedades farmacológicas similares, cada uno también muestra características bacteriológicas heterogéneas. La diversidad genética de las cepas de C. botulinum ha sido descrita en detalle por Hill et al. (Journal of Bacteriology, Vol. 189, Núm. 3, pág. 818-832 (2007))35. En una realización, la NTBo descrita en la presente memoria tiene dominios que son todos del mismo serotipo (A, B, C, D, E, F o G). En una realización, uno o más de esos dominios del mismo serotipo difieren en cuanto a su cepa y/o subtipo.

Las toxinas de los diversos serotipos/cepas de C. botulinum comparten la misma organización de dominios funcionales y la misma arquitectura estructural general. Las toxinas de C. botulinum se traducen cada una como un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que posteriormente se escinde mediante escisión proteolítica dentro de un bucle de disulfuro por una proteasa de origen natural, tal como, por ejemplo, una proteasa de la toxina de C. botulinum endógena o proteasas naturales producidas en el medio ambiente. Este procesamiento postraduccional produce una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa que se mantienen unidas por un solo enlace disulfuro e interacciones no covalentes. Cada molécula bicatenaria madura comprende tres dominios funcionalmente distintos: 1) un dominio proteolítico ubicado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad endopeptidasa dependiente de zinc que se dirige específicamente a los componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores; 2) un dominio de translocación contenido dentro de la mitad amino-terminal de la HC (Hn) que facilita la liberación de la LC de las vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión que se encuentra dentro de la mitad carboxilo-terminal de la HC que determina la actividad de unión y la especificidad de unión de la toxina al complejo receptor ubicado en la superficie de la célula diana. Las ubicaciones de los dominios específicos dentro de la toxina de varios serotipos/cepas se proporcionan en la Tabla 1:

TABLA 1

Las secuencias de aminoácidos completas de las toxinas se proporcionan en las Figuras 14-21.

La unión, la translocación y la actividad proteasa de estos tres dominios funcionales son todas necesarias para la toxicidad. El mecanismo general de intoxicación celular por el cual las toxinas de C. botulinum entran en una neurona e inhiben la liberación de neurotransmisores es similar, independientemente del serotipo o subtipo. Sin desear vincularse a ninguna teoría, el mecanismo de intoxicación implica al menos cuatro etapas: 1) unión al receptor, 2) internalización del complejo, 3) translocación de la cadena ligera y 4) modificación de la diana de la proteasa. El proceso se inicia cuando el dominio Hc de una toxina de C. botulinum se une a un receptor específico de la toxina ubicado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Se cree que la especificidad de unión de un complejo receptor se logra, en parte, mediante combinaciones específicas de gangliósidos y receptores de proteínas. Una vez unidos, los complejos de toxina/receptor se internalizan por endocitosis y las vesículas internalizadas se clasifican en rutas intracelulares específicas. La etapa de translocación se desencadena por la acidulación del compartimento de la vesícula. Una vez translocada, la endopeptidasa de cadena ligera de la toxina se libera desde la vesícula intracelular al citosol, donde se dirige específicamente a una de las tres proteínas conocidas como componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores (proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP)/sinaptobrevina, proteína asociada sinaptosomal de 25 kDa (SNAP-25) y Sintaxina). Estos componentes centrales son necesarios para el acoplamiento y la fusión de vesículas sinápticas en el terminal del nervio y constituyen miembros de la familia de receptores de proteínas de anclaje al factor sensible a N-etilmaleimida soluble (SNARE). NTBo/A y NTBo/E escinden SNAP-25 en la región carboxilo-terminal, liberando un segmento de nueve o veintiséis aminoácidos, respectivamente, y NTBo/C1 también escinde SNAP-25 cerca del extremo carboxilo terminal. Los serotipos de botulinum NTBo/B, NTBo/D, NTBo/F y NTBo/G, y la toxina del tétanos, actúan sobre la porción central conservada de VAMP y liberan la porción amino-terminal de VAMP al citosol. NTBo/C1 escinde la sintaxina en un solo sitio cerca de la superficie de la membrana plasmática citosólica. La proteólisis selectiva de las SNARE sinápticas explica el bloqueo de la liberación de neurotransmisores causado por las toxinas de C. botulinum in vivo. Las dianas de la proteína SNARE de las toxinas de C. botulinum son comunes a la exocitosis en una variedad de tipos no neuronales; en estas células, como en las neuronas, la actividad de la peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis, véanse, p. ej., Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431­ 437, (2003).

Dominios y neurotoxinas quiméricas

Las neurotoxinas botulínicas descritas en la presente memoria comprenden un dominio de unión al receptor modificado (HC). El dominio de unión al receptor modificado muestra una unión significativamente mejorada a uno o más receptores humanos típicamente unidos y utilizados por una o más cepas de toxinas de C. botulinum (p. ej., SytII, SytI). El dominio de unión al receptor modificado puede ser de cualquier serotipo (A, B, C, D, E, F o G), cepa o subtipo (como se describe en la presente memoria). Este puede ser el mismo o diferente serotipo, cepa/subtipo que uno o más de otros dominios dentro de la NTBo. Se proporcionan en la presente memoria ejemplos de dominios de unión a receptores modificados específicos. El polipéptido del dominio de unión al receptor modificado aislado descrito en la presente memoria también está incluido en la presente descripción, al igual que la molécula de ácido nucleico aislada por la que está codificado. En una realización, y según la invención, e1HC es del serotipo B. En una realización, el HC es del serotipo A.

La neurotoxina botulínica de la presente invención también comprende un dominio proteasa, también denominado en la técnica variante de cadena ligera. La variante de cadena ligera puede ser una variante de cadena ligera de origen natural, tal como, p. ej., isoformas de cadena ligera de toxina de C. botulinum y subtipos de cadenas ligeras de toxina de C. botulinum; o una variante de la cadena ligera de la toxina de C. botulinum de origen no natural, tal como, p. ej., variantes de la cadena ligera de la toxina de C. botulinum con una sustitución conservativa. El dominio proteasa puede ser de cualquier serotipo (A, B, C, D, E, F o G), cepa o subtipo (como se describe en la presente memoria). Este puede ser el mismo o diferente serotipo, cepa/subtipo que uno o más de otros dominios dentro de la NTBo. En una realización, el dominio proteasa es del serotipo B. En una realización, el dominio proteasa es del serotipo A.

La neurotoxina botulínica de la presente invención también comprende un dominio de translocación de la toxina (Hⁿ). El dominio de translocación de la toxina puede ser de cualquier serotipo (A, B, C, D, E, F o G), cepa o subtipo (como se describe en la presente memoria). Este puede ser el mismo o diferente serotipo, cepa/subtipo que uno o más de otros dominios dentro de la NTBo. En una realización, el Hⁿ es del serotipo B. En una realización, e1Hⁿ es del serotipo A.

Los diversos dominios descritos en la presente memoria (p. ej., Hⁿ, H^c, o dominio proteasa) incluyen, sin limitación, variantes de origen natural, tales como, p. ej., isoformas y subtipos; variantes de origen no natural, tales como, p. ej., mutaciones por sustitución conservativas. Variantes no naturales, se refiere a un dominio que tiene al menos un cambio de aminoácido de la región correspondiente de las secuencias de referencia (p. ej., de la Tabla 1 o las Figuras 14, 16-23) y se puede describir en porcentaje de identidad con la región correspondiente de esa secuencia de referencia.

Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada serotipo de toxina de C. botulinum puede haber variantes de dominio de C. botulinum de origen natural que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Una variante de dominio de toxina de C. botulinum de origen natural (p. ej., cadena ligera, Hⁿ o H^c) prevista para su uso en la generación de la NTBo de la presente invención puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa la variante del dominio de C. botulinum de origen natural y se puede sustituir por el dominio de toxina de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.

Un ejemplo no limitante de una variante del dominio de toxina de C. botulinum de origen natural es una isoforma de dominio de toxina de C. botulinum tal como, p. ej., una isoforma de dominio de NTBo/A, una isoforma de dominio de NTBo/B, una isoforma de dominio de NTBo/C1, una isoforma de dominio de NTBo/D, una isoforma de dominio de NTBo/E, una isoforma de dominio de NTBo/F, y una isoforma de dominio de NTBo/G. Una isoforma de dominio de toxina de C. botulinum puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa la isoforma del dominio de la toxina de C. botulinum, y se puede sustituir por el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.

Otro ejemplo no limitante de una variante del dominio de la toxina de C. botulinum de origen natural es un subtipo de dominio de toxina de C. botulinum tal como, p. ej., un dominio del subtipo NTBo/A1, NTBo/A2, NTBo/A3, NTBo/A4, NTBo/A5; un dominio del subtipo NTBo/B1, NTBo/B2, NTBo/B3, ⁿT^bo/B4, N^t B^o/B5, NTBo/B6, NTBo/B7; un dominio del subtipo NTBo/C1-1, NTBo/C1-2, NTBo/D-C; un dominio del subtipo NTBo/E1, NTBo/E2, NTBo/E3, NTBo/E4, NTBo/E5, NTBo/E6, NTBo/E7, NTBo/E8; y un dominio del subtipo NTBo/F1, NTBo/F2, NTBo/F3, NTBo/F4, NTBo/F5, NTBo/F6, NTBo/F7. Un subtipo de dominio de toxina de C. botulinum puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa el subtipo del dominio de toxina de C. botulinum y se puede sustituir por el dominio de toxina de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.

Como se emplea en la presente memoria, el término "variante de origen no natural" (p. ej., variante de cadena ligera de la toxina de C. botulinum, H^c y Hⁿ) significa un dominio de C. botulinum producido con la ayuda de manipulación humana, incluyendo, sin limitación, dominios producidos por ingeniería genética utilizando mutagénesis aleatoria o diseño racional y dominios de C. botulinum producidos por síntesis química. Los ejemplos no limitantes de variantes de dominio de C. botulinum de origen no natural incluyen, p. ej., variantes de dominio de C. botulinum conservativas. Como se emplea en la presente memoria, el término "variante del dominio de C. botulinum conservativa" significa un dominio de C. botulinum que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio de C. botulinum de referencia (p. ej., Tabla 1 y Figuras 12, 14-21). La variante puede tener una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos conservativas en comparación con la secuencia del dominio de referencia. Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño, topografía, carga, carácter hidrófobo, carácter hidrófilo, carácter lipófilo, capacidad de unión covalente, capacidad de unión por puentes de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica o similares, o cualquier combinación de las mismas. Una variante del dominio de C. botulinum conservativa puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa la variante del dominio de la toxina de C. botulinum conservativa y se puede sustituir por el dominio de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.

Una variante del dominio de la toxina de C. botulinum de origen no natural puede sustituir uno o más aminoácidos (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más) del dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia. Una variante del dominio de la toxina de C. botulinum de origen no natural de acuerdo con la invención también posee 95% o más (p. ej., 96%, 97%, 98% o 99%) de identidad de aminoácidos con el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa la variante del dominio de C. botulinum de origen natural.

Varias neurotoxinas de C. botulinum o dominios específicos de las mismas, se describen en las Publicaciones de Patentes Internacionales WO95/32738, WO96/33273, WO98/07864 y WO99/17806. La neurotoxina de C. botulinum o el dominio específico de la misma descritos en la presente memoria contendrán típicamente restos de aminoácidos de origen natural, pero en algunos casos también pueden estar presentes restos de aminoácidos de origen no natural. Por lo tanto, los denominados ''miméticos de péptidos" y "análogos de péptidos", que pueden incluir estructuras químicas que no son aminoácidos que imitan la estructura de un aminoácido o péptido particular, también se pueden utilizar en el contexto de la invención. Tales miméticos o análogos se caracterizan generalmente por mostrar características físicas similares tales como tamaño, carga o carácter hidrófobo, y la orientación espacial apropiada que se encuentra en sus contrapartes de péptidos naturales. Un ejemplo específico de un compuesto mimético de péptido es un compuesto en el que el enlace amida entre uno o más de los aminoácidos se reemplaza, por ejemplo, por un enlace carbono-carbono u otro enlace no amida, como es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo Sawyer, en Peptide Based Drug Design, pág. 378-422, ACS, Washington D.C. 1995).

La neurotoxina botulínica (NTBo) de la presente invención comprende un dominio de unión al receptor modificado de C. botulinum de serotipo B (NTBoB-Hc). El NTBo/B-Hc modificado comprende una o más mutaciones por sustitución que conducen a una unión significativamente mejorada al receptor Syt I humano y/o al receptor Syt II humano. En una realización, la NTBo/B-Hc es de NTBo/B1 (Número de acceso de GenBank: AB232927.1). La secuencia de aminoácidos de NTBo/B1-Hc cepa Okra, utilizada como molde de referencia en la presente invención, se muestra en la Figura 12. También se prevé la generación de B-H^c a partir de otras cepas y subtipos mediante la sustitución de los aminoácidos que corresponden a la posición o posiciones especificadas en B1 descritas en la presente memoria, al igual que la generación de moléculas más largas que incorporan B-Hc tal como NTBo completa o un polipéptido que comprende B-Hc modificado. Algunas de tales moléculas también están incluidas en la invención. En una realización, la NTBo o el polipéptido descrito en la presente memoria comprenden un dominio de unión al receptor modificado que no es una cepa de NTBo/B4 conocida tal como la cepa Eklund (Secuencia de referencia NCBI: YP_001893661.1, Ref. Genbank: EF051570.1), que se muestra en la Figura. 21. En una realización, B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8.

La difusión de toxinas y la generación de anticuerpos neutralizantes son un problema asociado pero no limitado a NTBo/B, ya que también se observan con NTBo/A. La mejora de la afinidad de unión de NTBo/A a su receptor SV2 aliviaría estos problemas. Debido a que la unión de NTBo/B a Syt I/II tiene una afinidad mucho mayor que la unión de NTBo/A a SV214,20,26,27, también se puede utilizar un dominio de unión al receptor de NTBo/B modificado (NTBoB-Hc) con la capacidad de unirse a Syt II humana para reemplazar NTBo/A-Hc para generar una NTBo/A quimérica modificada que pueda tener mayor eficacia y especificidad para las neuronas humanas que la NTBo/A WT.282930

Adicionalmente, se prevé que el H^c modificado descrito anteriormente (p. ej., NTBo/B-Hc) se pueda utilizar para reemplazar el H^c de todos los demás serotipos/cepas de NTBo. Como tal, también se describe en la presente memoria un polipéptido de NTBo que comprende un dominio de unión al receptor modificado (H^c) de serotipo (A, B, C, D, E, F o G), conectado a uno o más dominios de un serotipo diferente (A, B, C, D, E, F o G), cepa o subtipo para producir de ese modo una neurotoxina quimérica. La región Hc de cada NTBo está bien definida y las respectivas regiones Hc se pueden intercambiar en la molécula de NTBo (p. ej., mediante ingeniería genética). Tal manipulación la realiza habitualmente el médico experto mediante la fusión por PCR convencional de ADN que codifica NTBo/B-Hc con la cadena ligera (LC) y el dominio de translocación (Hn), o Hn-LC, de otras NTBo, que ha sido bien establecida en la técnica. Además, el reemplazo también se puede realizar utilizando la porción C-terminal de NTBoB-Hc (designado H^cc), que es la región que contiene el sitio de unión para los receptores de proteínas y los gangliósidos en cada NTBo. Las toxinas quiméricas resultantes tendrán la capacidad de dirigirse a neuronas humanas mediante la unión a Syt I/II humana. Como ejemplo no limitante, se puede utilizar NTBo/B-Hc modificado (o NTBo/B-Hcc) para reemplazar el Hc (o Hcc) de NTBo/A. Algunos de los polipéptidos resultantes están incluidos en la presente invención, como se describe en otra parte. Estas toxinas quiméricas pueden tener una mayor eficacia y especificidad en el direccionamiento a las neuronas humanas que WT NTBo/A. Tal toxina NTBo/A quimérica se puede utilizar para aplicaciones terapéuticas en seres humanos y ofrece mejoras significativas con respecto a WT NTBo/A.

Asimismo se describe en la presente memoria un polipéptido de dominio de unión al receptor modificado, aislado y purificado. En una realización, el dominio de unión al receptor modificado es NTBo/B-Hc (p. ej., de NTBo/B1). En una realización, el B-Hc se genera a partir de una cepa y/o subtipo diferentes de NTBo mediante la sustitución de los aminoácidos que corresponden a la posición o posiciones especificadas en B1 descritas en la presente memoria. En una realización, el H^c es del subtipo B2, B3, B4, B5, B6 o B7. En una realización, el dominio de unión al receptor modificado no es de NTBo/B4 (la cepa Eklund). En una realización, el B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8.

La presente descripción abarca la NTBo muíante de longitud completa que contiene un He modificado (p. ej., B-Hc) con sustituciones de aminoácidos como se describe en la presente memoria, para aplicaciones terapéuticas en seres humanos. En una realización, la NTBo de longitud completa contiene un He modificado (p. ej., B-Hc) con una sustitución de aminoácidos en uno o en una combinación de restos de aminoácidos correspondientes a la posición E1191, S1199, Y1183 y W1178 de B1 (p. ej., seleccionados entre los enumerados en la Tabla 2). En una realización, la NTBo contiene un He modificado (p. ej., B-H^c) con una sustitución de un solo aminoácido como se describe en la presente memoria. En una realización, la NTBo contiene un He modificado (p. ej., B-Hc) con dos sustituciones de aminoácidos como se describe en la presente memoria. En una realización, la NTBo contiene un He modificado (p. ej., B-H^c) con tres sustituciones de aminoácidos como se describe en la presente memoria. Las mutaciones se pueden realizar de la misma manera que se describe en la presente memoria para NTBo/He, (p. ej., utilizando uno cualquiera de los subtipos de NTBo/B o cualquier serotipo como molde). En una realización, la NTBo mutante de longitud completa contiene un Hc modificado que no es de NTBo/B4 (la cepa Eklund). En una realización, el B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8.

La toxina NTBo resultante puede tener una unión significativamente mejorada a la Syt II humana y, por lo tanto, alcanzará una mayor eficacia y especificidad para dirigirse a las neuronas humanas que la WT NTBo. El mutante resultante puede mantener adicionalmente una unión similar a Sytl humana, tener una unión significativamente mejorada a Sytl humana o tener una unión significativamente reducida a Sytl humana.

Polipéptidos y polipéptidos quiméricos

Asimismo se describe en la presente memoria un polipéptido que comprende el dominio de unión al receptor modificado (p. ej., del serotipo A, B, C, D, E, F o G). En una realización, e1Hc modificado, en el contexto del polipéptido, tiene una unión significativamente mejorada a Syt II y/o Syt I humanas, en comparación con el polipéptido análogo con aminoácidos WT en las posiciones específicas modificadas en e1Hc (la contraparte de tipo salvaje). En una realización, el dominio de unión al receptor modificado es NTBo/B-Hc (p. ej., de NTBoB1). En una realización, el He modificado se genera a partir de un serotipo, cepa y/o subtipo diferente de NTBo mediante la sustitución de los aminoácidos que corresponden a la posición o posiciones especificadas en B1 descritas en la presente memoria. En una realización, el Hc modificado no es de NTBo/B4 (la cepa Eklund). En una realización, el B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8. En una realización, el dominio de unión al receptor modificado tiene una o más modificaciones (sustituciones de aminoácidos) en la porción C-terminal de NTBoB-He (designado como Hcc), que es la región que contiene el sitio de unión para los receptores de proteínas y los gangliósidos en cada NTBo. En una realización, el polipéptido resultante tiene la capacidad de dirigirse a neuronas humanas mediante la unión a SytI/II humana.

El polipéptido que comprende el dominio de unión al receptor modificado puede ser una proteína de fusión del dominio de unión al receptor y otro polipéptido funcional (p. ej., un polipéptido funcional utilizado en un sistema de 2 híbridos (cebo o presa tal como T18 o T25, o glutatión S transferasa (GST)). Esto también se puede denominar molécula polipeptídica quimérica. Alternativamente, puede ser una fusión del dominio de unión al receptor modificado y una etiqueta polipeptídica con fines de identificación y/o fines de purificación (p. ej., una etiqueta de hexahistidina (His6) (SEQ ID NO: 13), o una etiqueta epitópica tal como una etiqueta de hemaglutinina (HA) (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)), o GST), muchas de las cuales son conocidas y se utilizan comúnmente en la técnica. La fusión puede tener un tramo de aminoácidos entre los respectivos dominios funcionales que facilita la conexión, sirve como un sitio de escisión o para preservar la conformación y/o función independientes. En una realización, la conexión conserva la función del dominio de unión al receptor modificado. En una realización la conexión enmascara la función del dominio de unión al receptor modificado. Otro aspecto de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de tales polipéptidos que están de acuerdo con la invención.

La NTBo/He modificada (p. ej., B-Hc) se puede conectar a otros agentes (p. ej., proteínas, moléculas pequeñas, polipéptidos cortos, ácidos nucleicos) covalentemente (p. ej., como una proteína de fusión) o no covalentemente. Como tal, otro aspecto de la invención se refiere a una molécula quimérica que comprende una primera porción que es un dominio de unión al receptor modificado de C. botulinum (p. ej., serotipo B) de acuerdo con la invención, como se describe en la presente memoria, unido a una segunda porción. La segunda porción de la molécula puede ser una molécula bioactiva (o "biológicamente activa") tal como un agente terapéutico (p. ej., un fármaco polipeptídico o no polipeptídico tal como una molécula pequeña o ácido nucleico). La conexión de la primera y segunda porciones de la molécula puede ser covalente (p. ej., en forma de una proteína de fusión) o no covalente. Los métodos de tal enlace son conocidos en la técnica y pueden ser aplicados fácilmente por el médico experto. Uno de tales usos de una molécula quimérica de la invención es como herramienta de suministro para el direccionamiento a neuronas en seres humanos. Por ejemplo, la NTBo/He modificada se puede unir a otros agentes terapéuticos, para que sirvan como vehículo de direccionamiento para suministrar los agentes terapéuticos a las neuronas en seres humanos mediante la unión a Syt I y/o Syt II humanas.

Modificaciones del dominio de unión al receptor (Hc)

Como se analiza en la presente memoria, la invención se refiere a un Hc modificado y polipéptidos que comprenden el Hc modificado (p. ej., NTBo o un polipéptido quimérico o de fusión). La modificación de la secuencia de aminoácidos de He utilizada para generar estos diversos polipéptidos de la invención se puede realizar mediante varios métodos conocidos por el médico experto. Los ejemplos incluyen, sin limitación, mutagénesis dirigida (mutagénesis dirigida al sitio) o mutagénesis aleatoria de cada resto de aminoácido dentro de la región conocida por unirse a Syt I/II. Estas regiones de unión a Syt están bien definidas por estudios previos relacionados con los receptores Syt de ratón o rata1-29’36’31’32 pero no se han determinado claramente para las interacciones entre NTBo/B-HC y receptores Syt humanos. Se pueden utilizar diferentes subtipos de NTBo/B, u otros serotipos que se unen a Syt I/II (D-C o G), como molde para crear mutaciones iguales o similares mediante la generación de las mutaciones correspondientes descritas en la presente memoria para B1-H^c. La posición correspondiente para los restos seleccionados que se van a mutar se puede identificar fácilmente mediante el alineamiento de secuencia con el subtipo B1. Algunos de los productos polipeptídicos resultantes están incluidos en la presente invención (como se describe en otra parte), al igual que los polipéptidos que comprenden dichos productos y las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos y productos.

Las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de H^c para producir el dominio de unión al receptor modificado pueden ser la mutación de un único resto a un aminoácido diferente (sustitución de un solo sitio), la mutación de varios restos al mismo tiempo (sustitución de varios sitios), la deleción de uno o más restos (deleción) y la inserción de uno o más restos (inserción), así como combinaciones de las mismas. Los métodos para la mutación de proteínas son bien conocidos en la técnica (p. ej., sustituciones dirigidas de un solo sitio y de múltiples sitios en el ADN que codifica la secuencia de NTBo/H^c).

En una realización, se modifican uno o más restos en H^c que contactan con Syt II de roedor o las regiones circundantes, según la bibliografía anterior sobre el dominio de unión al receptor de NTBo/B29 y la estructura de NTBo/B-Syt II referida (ID de PDB: 2NM1)3132. Estos incluyen, sin limitación, aquellas posiciones que corresponden a la posición Y1181, P1197, A1196, F1204, F1194, P1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, K1113, K1192, S1199, S1201, E1191, E1245, Y1256, D1115, E1203 de NTB^oB-B1. En una realización, uno o más de estos restos se reemplazan sistemáticamente por otros aminoácidos. También se prevén combinaciones de diversas modificaciones, que incluyen, sin limitación, mutaciones de dos o más posiciones enumeradas, a cualquier variedad de aminoácidos, tales como los enumerados en la presente memoria.

Se pueden generar sustituciones de múltiples sitios (p. ej., 2 o 3) combinando mutaciones en estos restos clave identificados. Tales mutantes por sustitución de múltiples sitios pueden tener una unión aún más mejorada a h-Syt II y pueden mantener o tener adicionalmente una mejor unión a Syt I humana. En una realización, e1H^c modificado tiene una primera sustitución de aminoácidos que corresponde a E1191 de serotipo B, cepa 1, sustituido por Q, M, C, V, L o Y. En una realización, el H^c modificado tiene una segunda sustitución de sitio que corresponde a S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F o S1199L de serotipo B, cepa 1. En una realización, el H^c tiene una sustitución de múltiples sitios que corresponde a E1191M y S1199W, E1191M y W1178Q, E1191C y S1199W, E1191C y S1199Y, E1191C y W1178Q, E1191Q y S1199W, E1191V y S1199W, E1191V y S1199Y, o E1191V y W1178Q, de serotipo B, cepa 1. En la invención, e1H^c modificado tiene una primera sustitución de aminoácidos que corresponde a E1191 de serotipo B, cepa 1, sustituido por C o Y.

En una realización, el dominio de unión al receptor modificado comprende una mutación por sustitución en una posición correspondiente a Y1181, P1197, A1196, F1204, F1194, P1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, K1113, K1192, S1199, S1201, E1191, E1245, D1115, E1203 o Y1256 de serotipo B, cepa 1. En una realización, la mutación por sustitución es A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y o V sustituidos por S. En una realización, la posición corresponde a S1199 o S1201 de serotipo B, cepa 1. En una realización, la mutación por sustitución es W, E o H. En una realización, la mutación por sustitución está en S1199, y es W, E o H. En una realización, la mutación por sustitución está en S1201 y es V. En una realización, las posiciones corresponden a W1178, Y1183 o E1191. En una realización, la posición corresponde a W1178 y la mutación por sustitución es Y, Q, A o S. En una realización, la posición corresponde a Y1183 y la mutación por sustitución es C o P. En una realización, la posición corresponde a E1191 y la mutación por sustitución es C, V, L o Y.

También se describe un H^c modificado con una mutación por sustitución de un solo aminoácido que se muestra a continuación en la Tabla 2, como su incorporación en los diversos polipéptidos descritos en la presente memoria.

Tabla 2

En una realización, el He comprende una o más mutaciones que corresponden a E1191C/V/L/Y (E1191C, E1191V, E1191L o E1191Y), S1199W/E/H (S1199W, S1199E o S1199H), W1178Y/Q/A/S (W1178Y, W1178Q, W1178A o W1178S) y/o Y1183C/P (Y1183C o Y1183P) de serotipo B, cepa 1 (Figura 3A, B).

En una realización, el HC tiene dos mutaciones por sustitución en donde una es una mutación por sustitución correspondiente a la posición 1191 seleccionada de la Tabla 2. En una realización, e1Hc tiene una mejor unión a h-Syt II en comparación con el polipéptido análogo que tiene aminoácidos WT en las posiciones especificadas (también denominado en la presente memoria contraparte de tipo salvaje). En una realización, el mutante generado también mantiene o tiene una unión significativamente mejorada a Syt I humana en comparación con la contraparte de tipo salvaje. En particular, la mutación es E1191C, E1191V, E1191L o E1191Y. Más particularmente, la mutación que corresponde a la posición E1191C, E1191V, E1191L o E1191Y se combina con una segunda mutación (p. ej., tales como las descritas en la presente memoria) para generar un H^c modificado que tiene una mejor unión a h-Syt II en comparación con el polipéptido análogo que tiene aminoácidos WT en las posiciones especificadas (también denominado aquí contraparte de tipo salvaje). En una realización, el mutante generado también mantiene o tiene una unión significativamente mejorada a Syt I humana en comparación con la contraparte de tipo salvaje (Figura 4A). En una realización, la segunda mutación es una mutación por sustitución correspondiente a una sustitución mostrada para la posición 1183, 1199, 1201, 1178, 1117 o 1181 en la Tabla 2. En una realización, la segunda mutación es S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F o S1199L. En una realización, el He tiene dos mutaciones por sustitución que corresponden a las mostradas para el serotipo B, cepa 1, en la Tabla 3:

Tabla 3

En una realización, el He tiene tres mutaciones por sustitución, también denominadas en la presente memoria mutación triple. En una realización de la mutación triple, la primera mutación corresponde a E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, W1178Q, W1178A o W1178S de serotipo B, cepa 1. En una realización, la segunda mutación corresponde a E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S de serotipo B, cepa 1 (excluida la posición que actúa como primera mutación). En una realización, la tercera sustitución corresponde a E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, W1178Q, W1178A o W1178S de serotipo B, cepa 1 (excluyendo las posiciones que actúan como primera y segunda mutaciones). En una realización descrita en la presente memoria, la mutación doble o triple no contiene una Q sustituida en ambas posiciones correspondientes a E1191 y W1178.

En una realización de la mutación triple, una mutación es una mutación por sustitución que corresponde a una sustitución mostrada para E1191 en la Tabla 2 (p. ej., E1191Q/M/C/V/L o Y). La segunda mutación puede ser una mutación por sustitución correspondiente a una sustitución mostrada para S1199 en la Tabla 2 (p. ej., S1199W/E/H/Y/F o L). La tercera mutación puede ser una mutación por sustitución correspondiente a una sustitución mostrada para W1178 en la Tabla 2 (p. ej., W1178Y/Q/A o S). Alternativamente, la tercera mutación puede ser una mutación por sustitución correspondiente a una sustitución mostrada para Y1183 en la Tabla 2 (p. ej., Y1183C, Y1183P). En una realización, la mutación triple corresponde a E1191M/S1199W/W1178Q.

Moléculas de ácido nucleico

Otro aspecto de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos descritos en la presente memoria según la invención (p. ej., dominio de unión al receptor modificado, o un polipéptido que comprende el dominio de unión al receptor modificado, o la neurotoxina botulínica que comprende el dominio de unión al receptor modificado, descrito en la presente memoria). En una realización, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 13. Tales moléculas de ácido nucleico pueden ser producidas por un médico experto, por ejemplo, mediante técnicas de ADN recombinante. La mutación por sustitución de aminoácidos deseada se realiza, por ejemplo, mediante modificación del ADN codificante. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos descritos en la presente memoria se generan mutando el codón de ácido nucleico que codifica el aminoácido especificado al aminoácido deseado utilizando el código genético que se muestra a continuación:

En una realización, la secuencia de ácido nucleico se optimiza para la expresión en E. coli (p. ej., la secuencia de ácido nucleico basada en GenBank AB232927.1, cuya porción relevante se muestra en la Figura 13).

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de ácido nucleico que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria según la invención. En una realización, el vector es un vector de expresión. Tal vector de expresión se denomina en la presente memoria construcción de expresión, y comprende una molécula de ácido nucleico divulgada en la presente memoria conectada operablemente al vector de expresión útil para expresar la molécula de ácido nucleico en una célula o extracto libre de células. Se puede emplear una amplia variedad de vectores de expresión para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una neurotoxina de C. botulinum de la presente invención que incluye, sin limitación, un vector de expresión viral; un vector de expresión procariótico; vectores de expresión eucarióticos, tales como, p. ej., un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto y un vector de expresión de mamífero; y un vector de expresión de extracto libre de células. Se entiende adicionalmente que los vectores de expresión útiles para poner en práctica aspectos de estos métodos pueden incluir aquellos que expresan la neurotoxina de C. botulinum bajo el control de un elemento promotor constitutivo, específico de tejido, específico de célula o inducible, elemento potenciador o ambos. Los ejemplos no limitantes de vectores de expresión, junto con los reactivos bien establecidos y las condiciones para preparar y utilizar una construcción de expresión a partir de tales vectores de expresión, están fácilmente disponibles de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, Calif.; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.; Invitrogen, Inc, Carlsbad, Calif.; EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wis.; QIAGEN, Inc., Valencia, Calif.; y Stratagene, La Jolla, Calif. La selección, elaboración y uso de un vector de expresión apropiado son procedimientos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

Células

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que comprende la molécula de ácido nucleico o la construcción de expresión descrita en la presente memoria según la invención. La célula puede ser para la propagación del ácido nucleico o para la expresión del ácido nucleico, o ambas. Tales células incluyen, sin limitación, células procarióticas que incluyen, sin limitación, cepas de células bacterianas aerobias, microaerófilas, capnófilas, anaerobias facultativas, gramnegativas y grampositivas tales como las derivadas, p. ej., de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens y Salmonella typhimurium; y células eucarióticas que incluyen, sin limitación, cepas de levadura, tales como, p. ej., las derivadas de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica; células de insecto y líneas celulares derivadas de insectos, tales como, p. ej., las derivadas de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster y Manduca sexta; y células de mamífero y líneas celulares derivadas de células de mamífero, tales como, p. ej., las derivadas de ratón, rata, hámster, súido, bóvido, équido, primate y ser humano. Las líneas celulares se pueden obtener de la Colección Americana de Cultivos Tipo, la Colección Europea de Cultivos Celulares y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares. Los ejemplos no limitantes de los protocolos específicos para seleccionar, elaborar y utilizar una línea celular apropiada se describen, por ejemplo, en INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F.A. Goosen et al. Eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL And APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4a ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3a ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, más arriba, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2a ed. 2002); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, más arriba, (2004). Estos protocolos son procedimientos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.

La célula puede estar destinada a la expresión del ácido nucleico para generar así el polipéptido codificado. Como tal, otro aspecto de la invención es un método para producir una proteína de neurotoxina botulínica, una HC aislada o un polipéptido que comprende una HC modificada, descrita en la presente memoria según la invención. Tales polipéptidos se producen cultivando la célula anfitriona que tiene en su interior un ácido nucleico que codifica el polipéptido, en el contexto de una construcción de expresión. El cultivo se realiza en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido de NTBo. El polipéptido expresado se puede recuperar del cultivo, purificar y formular mediante métodos conocidos en la técnica. El polipéptido expresado también se puede activar según sea necesario mediante métodos conocidos en la técnica. Un método para activar el polipéptido expresado es mediante escisión (o mella) por proteasas en una forma bicatenaria activa. Tales métodos se pueden adaptar de los conocidos en la técnica, por ejemplo, como describen Peter F. Bonventre y Lloyd L. KLempe (J. Bacteriol 1960, 79 (1): 23 y Michaeal L. Dekleva y Bibhuti R. DasGupta (Biochemical and Biophysical Research Communications 1989, 162: 767-772). Composiciones farmacéuticas

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina de C. botulinum, o molécula quimérica descrita en la presente memoria según la invención. En una realización, el polipéptido descrito en la presente memoria es un ingrediente activo en una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable (denominado en la presente memoria composición farmacéutica). Un "portador farmacéuticamente aceptable" significa cualquier medio farmacéuticamente aceptable para mezclar y/o suministrar la composición de suministro dirigida a un sujeto. El término "portador farmacéuticamente aceptable" como se emplea en la presente memoria significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptables, tal como una carga, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante líquido o sólido, implicado en el acarreo o transporte de los agentes en cuestión desde un órgano, o parte del organismo, a otro órgano o parte del organismo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición y compatible con la administración a un sujeto, por ejemplo, un ser humano. Tales composiciones se pueden formular específicamente para la administración mediante una o más de varias rutas, tales como las rutas de administración descritas en la presente memoria. También se pueden incorporar a las composiciones ingredientes activos complementarios. Cuando un agente, formulación o composición farmacéutica descritos en la presente memoria se administran a un sujeto, preferiblemente, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se emplea en la presente memoria, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que da como resultado una mejora o reparación de la afección. En una realización, la composición farmacéutica se formula para su administración mediante inyección. En una realización, la composición farmacéutica implica la neurotoxina botulínica encapsulada en microesferas. En una realización, la composición farmacéutica implica la neurotoxina botulínica formulada para el suministro transepitelial. En una realización, la composición farmacéutica implica la neurotoxina botulínica formulada para liberación lenta.

En una realización, la neurotoxina botulínica, polipéptido o molécula quimérica de la presente invención están en forma de una fórmula de liberación controlada. Tales composiciones y métodos de administración se proporcionan en la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2007/0020295.

La neurotoxina botulínica se puede obtener estableciendo y haciendo crecer cultivos de Clostridium botulinum en un fermentador y a continuación recolectando y purificando la mezcla fermentada de acuerdo con procedimientos conocidos. Todos los serotipos de toxina botulínica se sintetizan inicialmente como proteínas monocatenarias inactivas que deben ser escindidas o melladas por proteasas para volverse neuroactivas. Las cepas bacterianas que producen los serotipos A y G de la toxina botulínica poseen proteasas endógenas y, por lo tanto, los serotipos A y G se pueden recuperar de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. Por el contrario, los serotipos C1, D y E de toxina botulínica son sintetizados por cepas no proteolíticas y, por lo tanto, típicamente se desactivan cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F son producidos por cepas proteolíticas y no proteolíticas y, por lo tanto, se pueden recuperar en forma activa o inactiva. Las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de tipo B de toxina botulínica pueden escindir solo una porción de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas melladas con respecto a no melladas depende de la duración de la incubación y la temperatura del cultivo. Por tanto, un cierto porcentaje de una preparación, por ejemplo, de toxina botulínica de tipo B puede estar inactivo. En una realización, la neurotoxina de la presente invención se encuentra en un estado activo. En una realización, la neurotoxina está en un estado inactivo. En una realización, se prevé una combinación de neurotoxina activa e inactiva.

Kits

Asimismo se describe en la presente memoria un kit que comprende la NTBo o el polipéptido divulgado en la presente memoria (p. ej., en forma de una composición farmacéutica). El kit puede comprender una o más de las composiciones descritas en la presente memoria envasadas en un vial. El kit puede comprender adicionalmente una herramienta o dispositivo de suministro para la administración terapéutica de la composición y/o instrucciones para la administración terapéutica. El kit puede tener todos los componentes envasados en un recipiente formado.

Asimismo se describe en la presente memoria una herramienta o dispositivo de suministro para la administración de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria, precargados con la composición farmacéutica (p. ej., para un solo uso). Tales dispositivos pueden ser una jeringa o un dispositivo de microagujas para suministrar las composiciones. La jeringa puede ser una jeringa de un solo uso precargada con una cantidad eficaz de la composición. El dispositivo de microagujas puede comprender una o más microagujas recubiertas con la composición descrita en la presente memoria, tal como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos 2010/0196445, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria en su totalidad.

Métodos de tratamiento

Asimismo se describen en la presente memoria métodos para tratar una afección normalmente tratada con una neurotoxina (p. ej., afecciones del músculo esquelético, afecciones del músculo liso, afecciones glandulares, un trastorno neuromuscular, un trastorno del sistema nervioso autónomo, dolor o una afección estética/cosmética). Tales afecciones están asociadas con una actividad neuronal no deseada, según lo determine el médico experto. La presente invención incluye polipéptidos o polipéptidos de NTBo, o compuestos farmacéuticos descritos en la presente memoria según la invención, para su uso en medicina o para su uso en el tratamiento de afecciones asociadas con actividad neuronal no deseada, por ejemplo, utilizando un método descrito. El método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una NTBo o polipéptido/molécula quimérica descritos en la presente memoria (p. ej., en forma de una composición farmacéutica) en la ubicación apropiada en el mamífero para reducir la actividad neuronal no deseada, para tratar de ese modo la afección. La administración se realiza por una ruta que pone en contacto una cantidad eficaz de la composición con las neuronas que presentan la actividad no deseada.

Las afecciones específicas previstas para el tratamiento mediante los métodos descritos en la presente memoria incluyen, sin limitación, disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica (es decir, todas las enfermedades que implican incontinencia urinaria, tales como p. ej., hiperactividad neurogénica del detrusor o vejiga hiperactiva idiopática), cáncer de próstata y otras formas de cáncer, anismo, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas así como otros trastornos secretores, dolor por espasmos musculares, dolor neuropático, dolor inflamatorio, dolor de cabeza, tal como p. ej. migraña, picor (prurito), acné. Además, la presente invención se puede utilizar para tratar afecciones dermatológicas o estéticas/cosméticas, por ejemplo, reducción de los surcos de las cejas, reducción de las arrugas de la piel. La presente invención también se puede utilizar en el tratamiento de lesiones deportivas.

Además, la neurotoxina modificada se puede administrar para tratar otros trastornos neuromusculares utilizando técnicas bien conocidas que se realizan comúnmente con botulinum tipo A. Por ejemplo, la presente invención se puede utilizar para tratar el dolor, por ejemplo, dolor de cabeza, dolor por espasmos musculares y diversas formas de dolor inflamatorio. Por ejemplo, Aoki en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.721.215 y Aoki en la Patente de Estados Unidos Núm. 6.113.915 describe métodos de uso de toxina botulínica tipo A para tratar el dolor.

Los trastornos del sistema nervioso autónomo también se pueden tratar con una neurotoxina modificada. Por ejemplo, el mal funcionamiento de las glándulas es un trastorno del sistema nervioso autónomo. El mal funcionamiento de las glándulas incluye sudoración excesiva y salivación excesiva. El mal funcionamiento respiratorio es otro ejemplo de un trastorno del sistema nervioso autónomo. El mal funcionamiento respiratorio incluye enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma. Sanders et al. en la Patente de Estados Unidos Núm.

5.766.605 divulgan métodos para tratar el sistema nervioso autónomo; por ejemplo, el tratamiento de trastornos del sistema nervioso autónomo tales como sudoración excesiva, salivación excesiva, asma, etc., utilizando toxinas botulínicas existentes de forma natural. En una realización, se pueden emplear métodos sustancialmente similares a los de Sanders et al., pero utilizando una neurotoxina modificada, para tratar trastornos del sistema nervioso autónomo tales como los discutidos anteriormente. Por ejemplo, se puede aplicar localmente una neurotoxina modificada a la cavidad nasal del mamífero en una cantidad suficiente para degenerar las neuronas colinérgicas del sistema nervioso autónomo que controlan la secreción mucosa en la cavidad nasal.

El dolor que se puede tratar con una neurotoxina modificada incluye dolor causado por tensión muscular o espasmo, o dolor que no está asociado con espasmo muscular. Por ejemplo, Binder en la Patente de Estados Unidos Núm.

5.714.468 divulga que el dolor de cabeza causado por alteraciones vasculares, tensión muscular, neuralgia y neuropatía se puede tratar con una toxina botulínica de origen natural, por ejemplo Botulinum tipo A. En una realización, se pueden emplear métodos sustancialmente similares a los de Binder, pero utilizando una neurotoxina modificada, para tratar el dolor de cabeza, especialmente el causado por alteraciones vasculares, tensión muscular, neuralgia y neuropatía. El dolor causado por un espasmo muscular también se puede tratar mediante la administración de una neurotoxina modificada. Por ejemplo, el documento WO2006001676 (Kang Ahn) divulga métodos de uso de una neurotoxina botulínica para tratar el dolor en la articulación de la rodilla causado por atrapamiento del nervio safeno, el documento WO2008059126 (Christine Favre et al.) divulga métodos de uso de una neurotoxina botulínica para tratar el dolor inducido por quimioterapia,el documento WO2008090287 (Christine Favre et al.) divulga métodos de uso de una neurotoxina botulínica para tratar el dolor inducido por el tratamiento anti-VIH, el documento WO2009130600 (Christine Favre et al.) divulga métodos de uso de una neurotoxina botulínica para tratar el dolor asociado con la neuropatía diabética, y el documento WO2007144493 (Michel Auguet et al.) divulga métodos para utilizar una neurotoxina botulínica combinada con un derivado opiáceo para tratar el dolor. Además, se puede administrar una neurotoxina modificada a un mamífero para tratar el dolor que no está asociado con un trastorno muscular, tal como un espasmo. En una realización amplia, los métodos descritos o las composiciones para su uso según la presente invención para el tratamiento del dolor no relacionado con el espasmo incluyen la administración central o la administración periférica de la neurotoxina modificada.

Un dolor agudo o crónico que no está asociado con un espasmo muscular también se puede aliviar con una administración periférica local de la neurotoxina modificada para su uso según la presente invención en un lugar de dolor real o percibido en el mamífero. En una realización, la neurotoxina modificada se administra por vía subcutánea en o cerca del lugar del dolor, por ejemplo, en o cerca de un corte. En algunas realizaciones, la neurotoxina modificada se administra por vía intramuscular en o cerca del lugar del dolor, por ejemplo, en o cerca del lugar de un hematoma en el mamífero. En algunas realizaciones, la neurotoxina modificada se inyecta directamente en una articulación de un mamífero, para tratar o aliviar el dolor causado por afecciones artríticas. Asimismo, la inyección o infusión repetida y frecuente de la neurotoxina modificada en un lugar de dolor periférico está dentro del alcance de la presente descripción.

Las rutas de administración para tales métodos son conocidas en la técnica y se adaptan fácilmente a los métodos descritos en la presente memoria por el médico experto (p. ej., véase por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), editado por Anthony Fauci et al., 14a edición, publicado por McGraw Hill). A modo de ejemplo no limitante, el tratamiento de un trastorno neuromuscular puede comprender una etapa de administración local de una cantidad eficaz de la molécula a un músculo o grupo de músculos, el tratamiento de un trastorno autónomo puede comprender una etapa de administración local de una cantidad eficaz de la molécula a una glándula o glándulas, y el tratamiento del dolor puede comprender una etapa de administración de una cantidad eficaz de la molécula en el lugar del dolor. Además, el tratamiento del dolor puede comprender una etapa de administración de una cantidad eficaz de una neurotoxina modificada a la médula espinal.

También se prevé que el H^c modificado (p. ej., B-H^c) descrito en la presente memoria se pueda utilizar como una herramienta de suministro para el direccionamiento a neuronas y otros tipos de células que expresan sinaptotagmina II humana en seres humanos. Por ejemplo, el H^c modificado conectado a otra molécula bioactiva (p. ej., agente terapéutico) de forma covalente o no covalente para formar de ese modo una molécula quimérica descrita en la presente memoria, puede servir como vehículo de direccionamiento para suministrar la molécula bioactiva a las neuronas y otros tipos de células que expresan sinaptotagmina II humana en seres humanos mediante la unión a Syt I y/o Syt II humanas. Como tal, otra disposición descrita se refiere al uso de una molécula polipeptídica quimérica descrita en la presente memoria para suministrar la molécula bioactiva a una neurona en un sujeto humano. La segunda porción de la molécula puede ser una molécula bioactiva tal como un agente terapéutico (p. ej., un polipéptido o fármaco). La conexión de la primera y segunda porciones de la molécula puede ser covalente (p. ej., en forma de una proteína de fusión) o no covalente. Los métodos de tal conexión son conocidos en la técnica y pueden ser aplicados fácilmente por el médico experto. La molécula de polipéptido quimérico se administraría por una ruta que da como resultado el contacto del polipéptido con las neuronas que expresan el receptor al que se une específicamente el B-H^c modificado (la neurona diana), como se describe en la presente memoria.

Identificación de la actividad de unión al receptor

Asimismo se describe en la presente memoria un método para identificar un dominio de unión al receptor de NTBo modificado por su capacidad para unirse a un receptor (p. ej., una Syt I humana o Syt II humana o SV2 humano). El método utiliza el sistema de ensayo de 2 híbridos y utiliza proteínas de fusión elaboradas del receptor y de1H^c modificado respectivamente fusionadas (expresadas como proteínas de fusión) a las respectivas subunidades "cebo" y "presa" utilizadas en el ensayo de 2 híbridos (p. ej., sistema de activación de la transcripción Gal 4 que utiliza un dominio de activación y un dominio de unión a a DN). El ensayo de 2 híbridos se realiza típicamente en levadura (S. cerevisiae), pero se han desarrollado sistemas de ensayo similares para su uso en otros organismos unicelulares, así como en E. coli. Esos sistemas son igualmente comparables. En una realización, se utiliza el ensayo de 2 híbridos de adenilato ciclasa bacteriana (Karimova et al., Proc Natl Acad Sci USA. 12 de mayo de 1998; 95(10): 5752-5756). El sistema utiliza T18 y T25 como cebo y presa, y pueden utilizar células de E. coli BTH101.

El H^c modificado se expresa como una proteína de fusión con T18 (denominada primera proteína de fusión) en el ensayo de 2 híbridos de E. coli. En el método, el receptor (o un fragmento de unión del mismo, tal como h-Syt II aa 1-87) se expresa conjuntamente como una proteína de fusión con T25 (denominada segunda proteína de fusión) en el ensayo de 2 híbridos de E. coli. El ensayo utiliza un indicador de interacción positivo entre las moléculas respectivas a través de sus respectivas fusiones. Un posible indicador positivo es el desarrollo del color. Las colonias clonales de E. coli que expresan tanto la primera como la segunda proteínas de fusión se cultivan en medios sólidos que contienen los medios de información y selectivos apropiados (p. ej., ampicilina, kanamicina, X-gal e IPTG) durante un período de tiempo que permita la generación de una indicación positiva (p. ej., generación de color) a partir de colonias positivas. La unión del dominio de unión modificado al fragmento del receptor conducirá a la indicación positiva (p. ej., la expresión del gen LacZ y dará como resultado la generación de un color azul en las colonias cultivadas sobre placas de X-gal).

Las colonias se analizan para determinar tal indicación positiva (p. ej., desarrollo de color) cuando se comparan con los controles apropiados (positivos y negativos). El análisis puede ser visualmente o por medio de una máquina no humana. Se utiliza un control negativo apropiado que no produce una indicación positiva apreciable (p. ej., expresión de LacZ) (p. ej., una colonia clonal que carece de un componente clave del sistema de ensayo, por ejemplo tiene cebo y presa que se expresan sin una fusión). También se puede utilizar un control positivo fuerte apropiado. Un ejemplo de un control positivo fuerte para el receptor Syt II humano en el ensayo es un B1-Hc con una mutación por sustitución en E1191 (M/C/V o Q). También se puede utilizar un control débilmente positivo para identificar la fuerza de la unión. Un ejemplo de un control débilmente positivo para el receptor Syt II humano en el ensayo es un B1-Hc con una mutación por sustitución en W1178 (Q/Y/A o S). La identificación de la indicación positiva (p. ej., desarrollo de color) indica que el He modificado se une al receptor. La identificación de una indicación positiva fuerte, tal como un desarrollo de color fuerte (p. ej., por encima de un control positivo débil) indica que e1H^c se une al receptor con alta afinidad.

El He modificado utilizado en el ensayo puede ser cualquier He modificado divulgado en la presente memoria. A modo de ejemplo no limitante, el He modificado puede contener una, dos o tres mutaciones por sustitución tales como las divulgadas en la presente memoria. El He modificado puede ser de cualquier serotipo/cepa o subtipo como se divulga en la presente memoria.

Las realizaciones descritas aquí y en los siguientes ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos, y dentro del alcance de la invención se incluyen diversas modificaciones o cambios evidentes para los expertos en la técnica. A menos que se defina lo contrario en la presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados con relación a la presente solicitud tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Adicionalmente, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.

Se debe entender que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en la presente memoria y, como tales, pueden variar. La terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que está definida únicamente por las reivindicaciones.

Aparte de los ejemplos operativos, o cuando se indique de otro modo, se debe entender que todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en la presente memoria están modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" cuando se emplea para describir la presente invención, con relación a porcentajes significa ± 1%.

En un aspecto, la presente invención se refiere a las composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos descritos en la presente memoria, como esenciales para la invención, pero abiertos a la inclusión de elementos no especificados, esenciales o no ("que comprende"). En algunas realizaciones, otros elementos que se van a incluir en la descripción de la composición, método o componente respectivo de la misma se limitan a aquellos que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la invención ("que consiste esencialmente en"). Esto se aplica igualmente a las etapas dentro de un método descrito así como a las composiciones y componentes del mismo. En otras realizaciones, se pretende que las invenciones, composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos, descritos en la presente memoria, sean exclusivos de cualquier elemento no considerado un elemento esencial del componente, composición o método ("que consiste en").

Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones identificadas tienen el propósito de describir y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en tales publicaciones que se podrían utilizar con relación a la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este sentido se debe interpretar como una admisión de que los autores de la presente invención no tienen derecho a prefechar tal divulgación en virtud de una invención anterior o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones sobre la fecha o la representación sobre el contenido de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen ninguna admisión en cuanto a la exactitud de las fechas o el contenido de estos documentos.

Referencias de antecedentes y descripción detallada

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La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes adicionales.

Ejemplos

Identificación de mutaciones únicas que mejoran la unión de NTBo/B a h-Syt II

La estructura cocristalina de NTBo/B unida al dominio luminal Syt II de rata ha sido resuelta por dos estudios en 200625,26. La información estructural proporcionó una base sólida para que los autores de la presente invención se centraran en un número limitado de restos dentro de la interfase de unión para estudios de mutagénesis de diseño racional. La fenilalanina conservada en la posición 54 forma múltiples contactos hidrófobos con NTBo/B. Debido a que la leucina (en seres humanos) también es hidrófoba, es probable que la interrupción de la unión de NTBo/B se deba a las diferencias de tamaño/forma entre la fenilalanina y la leucina. La clave fue identificar posibles cambios en la región NTBo/B H^c que puedan adaptarse al cambio de fenilalanina a leucina.

Se examinaron todos los restos en NTBo/B que contribuyen a las interacciones entre NTBo/B y Syt II. Estos restos estaban bien definidos por la estructura cocristalina de NTBo/B-Syt II, incluidos K1113, D1115, S1116, P1117, V1118, W1178, Y1181, Y1183, E1191, K1192, F1194, A1196, P1197, S1199, S1201, E1203, F1204, E1245 e Y1256 (Fig.3), un total de 19 posiciones. La estrategia fue reemplazar primero sistemáticamente los restos en cada una de estas 19 posiciones por los demás 19 aminoácidos posibles y después someter a prueba la unión de estos NTBo/B-H^c mutados a h-Syt II. Por lo tanto, fue necesario generar y someter a prueba un total de 19 x 19 = 361 mutaciones puntuales únicas.

Se utilizó un sistema de dos híbridos de adenilato ciclasa bacteriana (BACTH) para generar estas 361 mutaciones y someter a prueba su unión a h-Syt II como se describe en la Fig. 4. Brevemente, se subclonó NTBo/B-Hc de tipo salvaje (WT) en un vector en marco con el fragmento dividido (T18) de la adenilato ciclasa bacteriana. Esta construcción de fusión T18-NTBo/B-Hc se amplificó mediante PCR con cebadores que albergaban trinucleótidos aleatorios (NNN) en la posición seleccionada en NTBo/B-Hc (Fig. 4A). Esto generó una reserva de construcciones que codificaban los 20 aminoácidos diferentes en el sitio seleccionado. Esta reserva de construcciones se co­ transformaron a continuación en bacterias (E. colicepa BTH101), junto con una construcción que expresaba h-Syt II (1-87) fusionada con la otra mitad de la adenilato ciclasa bacteriana dividida (T25). La unión de una NTBo/B-Hc mutante a h-Syt II unió T18 y T25 y recuperó la actividad de la adenilato ciclasa, lo que condujo a la expresión del gen lacZ y dio como resultado colonias de color azul en las placas de X-gel (Fig. 4B). Las mutaciones específicas introducidas en NTBo/B-Hc se identificaron extrayendo y secuenciando las construcciones de estas colonias de color azul.

Utilizando este método BACTH, se escrutaron los 19 sitios seleccionados en NTBo/B-Hc. El número de colonias totales y de colonias de color azul para cada sitio se enumeran en la Figura 5A. Se contaron más de 380 colonias totales para cada posición. El número total de colonias determinó la posibilidad de cubrir los 20 aminoácidos en el sitio de mutación seleccionado. Esto se calculó mediante la ecuación de Clark-Carbon: P = 1-(1-f)N, donde f refleja el número de restos posibles (f = 1/20 aquí ya que hay 20 aminoácidos diferentes), y N es el número total de colonias. Con un número mínimo de 380 colonias, la probabilidad de cubrir los 20 aminoácidos en una posición es de 99,8%. Por lo tanto, es probable que se hayan cubierto los 20 restos posibles una vez que el número de colonias en las placas supere las 380.

Como se muestra en la Figura 5A, se encontró que cuatro posiciones dieron como resultado colonias de color azul, incluyendo E1191 (22,7%), W11178 (7,8%), Y1183 (4,0%) y S1199 (5,1%). Entre estas cuatro posiciones, E1191 tuvo los niveles más altos de colonias de color azul. Además, las colonias de color azul de E1191 también mostraron un color azul más oscuro en comparación con los otros tres sitios, lo que sugirió que la interacción entre NTBo/B-Hc y h-Syt II podría ser más fuerte con mutaciones E1191. Se extrajeron los plásmidos y se secuenciaron a partir de estas colonias de color azul. Los restos identificados en cada sitio se enumeran en la Figura 5B: E1191M/C/V/Q/L/Y, Y1183/C/P, S1199W/E/Y/H, W1178Y/Q/A/S.

Las interacciones entre Syt II humana y los mutantes identificados se verificaron adicionalmente midiendo los niveles de p-galactosidasa producida en bacterias, que eran proporcionales al nivel total de actividad de adenilato ciclasa reconstituida por interacciones entre T18-NTBo/B-H^c y T25-h-Syt II. Cuatro mutaciones en los sitios E1191, E1191M/C/V/Q, mostraron la actividad p-galactosidasa más fuerte entre todas las mutaciones probadas (Figura 6A), lo que sugiere que el reemplazo de E1191 por uno de estos cuatro restos mejoraba significativamente la unión de T18-NTBo/B-Hc a T25-h-Syt II.

Unión de NTBo/B-Hc mutante a h-Syt II se analizó adicionalmente utilizando un ensayo de precipitación como un enfoque alternativo (Figura 6B). Brevemente, el dominio luminal Syt II de ratón marcado con GST (m-Syt II) y el dominio luminal Syt II humano (h-Syt II) se inmovilizaron sobre cuentas de GST y se utilizaron para precipitar la NTBo/B-Hc mutante expresada en bacterias. La unión de NTBo/B-Hc a Syt II etiquetada con GST se detectó mediante análisis de inmunotransferencia, detectando la etiqueta HA fusionada con NTBo/B-H^c. Como se muestra en la Figura 6B, E1191M/C/V/Q dio como resultado niveles significativos de unión a h-Syt II, lo que fue compatible con el hallazgo de que estas cuatro mutaciones también mostraban la actividad p-galactosidasa más fuerte (Figura 6A). En conjunto, estos resultados indicaron que E1191M/C/V/Q son cuatro mutaciones primarias que adquieren la capacidad de unirse a h-Syt II de forma robusta.

Las mutaciones combinacionales en HCB mejoraron adicionalmente su unión a h-Syt II

A continuación se exploró si la unión de NTBo/B-Hc E1191M/C/V/Q a h-Syt II se podía mejorar adicionalmente mediante la inclusión de una mutación secundaria en un sitio diferente. Los sitios 1183, 1199 y 1178 fueron enfocados como candidatos para los sitios de mutación secundaria, ya que estos eran los únicos tres sitios que también dieron como resultado colonias de color azul (Figura 5). Utilizando E1191M como mutaciones primarias, se generaron mutaciones dobles combinando E1191M con todos los otros 10 cambios de restos identificados en el escrutinio mediante BACTH en los sitios 1183, 1199 y 1178 como se indica en la Figura 5B. Estas 10 mutaciones dobles se analizaron para determinar su capacidad para unirse a h-Syt II en ensayos de precipitación como se indica en la Figura 7A. T res de ellos, E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y y E1191M/W1178Q, dieron como resultado una unión significativa a h-Syt II (Figura 7A). Estos resultados sugirieron que la inclusión de S1199W/Y y W1178Q como sitio de mutación secundaria mejoraba adicionalmente la unión de NTBo/B-Hc E1191M/C/V/Q a h-Syt II. En conjunto, estos datos indicaron que hay cuatro opciones de mutación primaria en el sitio E1191 (M/C/V/Q) y tres opciones de sitios de mutación secundaria (S1199W/Y y W1178Q) (Figura 7B), y que una combinación de una mutación primaria con una mutación secundaria puede mejorar adicionalmente la unión a h-Syt II.

La combinación de E1191M con Y1183C/P redujo realmente la unión a h-Syt II (Figura 7A). La interfase de unión a Syt II de NTBo/B se compone de dos bolsas hidrófobas como se informó anteriormente. E1191 e Y1183 se encuentran en la misma bolsa, mientras que S1199 y W1178 se encuentran en otra. Debido a que E1191 está espacialmente cerca de Y1183, puede producirse un conflicto estructural potencial al mutar ambos, lo que puede explicar por qué las mutaciones dobles en estas dos posiciones redujeron la unión a h-Syt II.

Se prosiguió la determinación y comparación de las afinidades de unión entre NTBo/B-Hc mutado y h-Syt II cuantitativamente, con el objetivo de seleccionar las mutaciones dobles con la mejor afinidad de unión. La afinidad de unión (K^d) se determinó utilizando un ensayo de interferometría de biocapa bien establecido (Figura 8A). Brevemente, las proteínas Syt etiquetadas con GST se inmovilizaron en una sonda. La sonda se expuso primero a NTBo/B-Hc purificada a diferentes concentraciones (fase de asociación, Figura 8A), seguido de etapas de lavado (fase de disociación, Figura 8A). La unión de NTBo/B-Hc a Syt etiquetada con GST aumenta el peso/tamaño molecular total en la sonda, lo que da como resultado un cambio en la reflexión de la luz en la sonda que se puede detectar y analizar. Los parámetros de unión tales como la constante de asociación (Kon), constante de disociación (Koff) y afinidad de unión aparente (KD) se pueden calcular a partir de la curva de asociación y disociación detectada como se indica en la Figura 8A.

Utilizando este ensayo, todas las combinaciones de cuatro mutaciones primarias (E1191M/C/Q/V) se caracterizaron sistemáticamente con tres mutaciones secundarias (S1199W/Y, W1178Q). Además, también se generó y analizó una mutación triple, E1191M/S1199W/W1178Q. La unión de WT NTBo/B-Hc a Syt II de ratón (m-Syt II) se midió como un control positivo, que mostró una K^d de unión en 0,13 |uM (Figura 8B). Como era de esperar, la unión de WT NTBo/B-HC a h-Syt II era demasiado débil para ser determinada de manera confiable, con una KD estimada por encima del límite de detección (> 20 |uM). Una sola mutación primaria E1191M produjo una K^d unión en 6,7 |uM, una mejora significativa con respecto a WT NTBo/B-Hc. Las mutaciones dobles que combinaron un sitio de mutación primaria con sitios de mutación secundaria mejoraron adicionalmente la afinidad de unión hasta 0,59 |uM (E1191V/S1199Y). Como era de esperar, la mayoría de las mutaciones dobles mejoraron la afinidad de unión a h-Syt II, con una K^d entre 0,59 |uM y 4,3 |uM. E1191Q/W1178Q fue el único que no se unió a h-Syt II. Se desconoce el motivo, pero es posible que esta mutación doble haya inducido cambios conformacionales inesperados de la proteína. La mutación triple E1191M/S1199W/W1178Q mostró casi la misma afinidad de unión que la mutación doble E1191M/S1199W, lo que sugiere que la adición del tercer sitio de mutación puede no mejorar adicionalmente la afinidad de unión. En conjunto, estos datos confirmaron que todas las mutaciones dobles entre E1191M/C/Q/V y S1199W/Y, W1178Q, con la excepción de E11191Q/W1178Q, dieron como resultado una NTBo/B-Hc muíante que podía unirse a h-Syt II de forma robusta.

Los mutantes de HCB mostraron una mejor unión a h-Syt I

Además de Syt II, Syt I también funciona como receptor para NTBo/B. Para lograr la unión más alta posible a las neuronas humanas, los mutantes de NTBo/B modificados no deberían afectar a la unión a Syt I humana. Idealmente, pueden incluso aumentar la unión a Syt I. De hecho, se encontró que E1191M mejoraba significativamente la unión de NTBo/BHc a h-Syt I, ya que se pudo detectar una unión robusta sin la presencia de los gangliósidos del correceptor de lípidos (Figura 9A). La afinidad de unión entre las mutaciones dobles seleccionadas y h-Syt I se midió utilizando un ensayo de interferometría de biocapa. Como se muestra en la Figura 9B, C, las mutaciones dobles E1191M/S1199Y (B-Hc MY) y E1191V/S1199Y (B-Hc VY) muestran una K^d a 2,9 pM y 5,82 pM, respectivamente, mientras que la unión de WT NTBo/B-HC a h-Syt I era demasiado débil para ser determinada de manera confiable, con una estimación de K^d por encima del límite de detección (> 20 pM).

H^cB^my se une a h-Syt II sobre las superficies neuronales

A continuación los autores de la presente invención examinaron si el mutante H^cB^mi podía unirse a h-Syt II en superficies neuronales fisiológicamente relevantes. con este fin, los autores de la presente invención utilizaron neuronas corticales de rata cultivadas como modelo neuronal, que expresa Syt I pero no Syt II (Dong et al., The Journal of cell biology 179(7): 1511-1522 (2007)). Por lo tanto, la modificación para reducir la expresión de Syt I generó neuronas sin receptores endógenos. La expresión de h-Syt II de longitud completa en estas neuronas Syt I KD creó neuronas "humanizadas" con solo h-Syt Il como receptor de toxina, como describieron anteriormente los autores de la presente invención (Peng et al., J cell Sci. 125: 3233-42(2012)). como se esperaba, WT HcB se unió fuertemente a las neuronas de rata y la unión se abolió después de la modificación para reducir la expresión de Syt I endógena. La expresión de mSyt II de longitud completa, pero no la de h-Syt II ni la de m-Syt II que contenía la mutación F54L, restauró la unión de WT HcB (Figura 10A). Por el contrario, H^cB^my mostró una unión robusta a las neuronas que expresaban m-Syt II, h-Syt II o m-Syt II (F54L), lo que demuestra que H^cB^my logra la capacidad mejorada de unirse a h-Syt II sobre superficies neuronales (Figura 10B).

El mutante NTBo/B mostró una mayor eficacia para bloquear la neurotransmisión en neuronas humanizadas Para abordar la cuestión clave de si la mejor unión a h-Syt II se traduce en una mejor eficacia a niveles funcionales en neuronas, los autores de la presente invención produjeron WT NTBo/B de longitud completa y la toxina mutante que contenía mutaciones puntuales E1191M/S1199Y (NTBo/B^my) recombinantemente en E. coli. Las neuronas humanizadas se expusieron a un gradiente de toxinas WT o NTB^o/B^my. La escisión de VAMP2 se examinó mediante análisis de inmunotransferencia. como se muestra en la Figura 11A, se escindió más VAMP2 en las neuronas expuestas a NTBo/BMY en comparación con las neuronas expuestas a WT NTBo/B a cada concentración de toxina sometida a prueba, lo que indica que NTBo/BMY se dirigía a las neuronas e ingresaba de manera más eficiente que la toxina WT.

A continuación, los autores de la presente invención controlaron la liberación de neurotransmisores mediante el registro de corrientes postsinápticas inhibidoras en miniatura (mIPSc) utilizando un registro de pinzamiento zonal de células completas. La frecuencia de las mIPSc refleja la actividad de liberación de neurotransmisores en una población de neuronas. La entrada de NTBo/B en los terminales presinápticos bloquea la liberación de neurotransmisor, lo que reduce la frecuencia de las mIPSc (Figura 11B). Las neuronas humanizadas se expusieron a un gradiente de WT NTBo/B o NTBo/B^my. como se muestra en la Figura 11c, NTBo/B^my mostró una potencia muy mejorada, con una concentración inhibidora semimáxima (c I^sü) ~11 veces menor que la toxina WT: NTBo/B^my puede lograr el mismo nivel de bloqueo en la liberación de neurotransmisores con concentraciones de toxina 11 veces más bajas en comparación con la toxina WT. Estos datos demostraron que la mejor unión a los receptores humanos dio como resultado una mayor eficacia de la toxina a niveles funcionales en las neuronas.

El método BAcTH se utilizó para escrutar todas las posibles mutaciones individuales en los 19 restos clave en NTBo/B-Hc que forman el bolsillo de unión para Syt II. Se identificaron cuatro posiciones que se pueden mutar para aumentar la afinidad de unión a h-Syt II, con el sitio E1191 como sitio primario y S1199, W1178 e Y1183 como sitios de mutación secundaria. Se crearon y sometieron a prueba mutaciones dobles que combinaban los sitios de mutación primaria y secundaria, y se demostró que la combinación de E1191M/c/V/Q con S1199Y/W o W1178Q produce mutaciones dobles con fuerte afinidad de unión a h-Syt II y h-Syt I

Discusión

combinando el diseño racional basado en la estructura co-cristalina disponible del complejo NTBo/B-Syt II con el método BAcTH que satura todas las posibles mutaciones puntuales individuales en cada uno de los restos diana seleccionados, se identificó una serie de mutaciones puntuales en NTBo/B que se puede unir a h-Syt II. Estas mutaciones puntuales se examinaron más a fondo en combinaciones, revelando mutantes dobles que lograron una unión de alta afinidad a h-Syt II. Es importante destacar que la NTBo/B de longitud completa que contiene la mutación diseñada mostró una potencia ~11 veces mayor que la WT NTBo/B en las neuronas humanizadas, lo que demuestra que la mejor unión a los receptores de toxinas se traduce en una mayor potencia a niveles funcionales en las neuronas.

Materiales y métodos

Materiales y construcciones. Los siguientes anticuerpos se adquirieron de los proveedores indicados: Sinapsina I (Clon 46.1, Synaptic Systems), VAMP2 (Clon 69.1, Synaptic Systems), HA (16B12, Covance) y p-tubulina III (ab18207, Abcam). Los gangliósidos cerebrales mixtos bovinos se adquirieron de Matreya LLC (Pleasant Gap, PA) y se reconstituyeron en solución salina tamponada con Tris (TBS: Tris 20 mM, NaCl 150 mM) como se describió previamente (Peng et al., PLoS pathogens 7(3):e1002008 (2011)). Se optimizaron los codones del ADNc que codificaba H^cB (resto 857-1291, Genbank: ACA46990.1) para la expresión en E. coli y se sintetizó por Genscript Inc. (New Brunswick, NJ). Los siguientes ADNc fueron generosamente proporcionados por los grupos indicados: Syt I de rata (T.C. Sudhof, Palo Alto, CA), Syt II de ratón (M. Fukuda, Ibaraki, Japón), Syt I humana (R.B. Sutton, Lubbock, TX). El ADN que codificaba HcB se subclonó en el vector pET28a, con una etiqueta His6 (SEQ ID NO: 13) y una etiqueta HA (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)) fusionadas a su extremo N-terminal. Las mutaciones en H^cB se generaron mediante PCR usando el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio (Agilent Technologies, CA). Los fragmentos Syt I/II etiquetados con GST y el mutante Syt II F54L se describieron previamente (Dong M et al. The Journal of cell biology 162(7): 1293-1303 (2003); Peng et al., J Cell Sci. 125: 3233-42 (2012); Dong M et al. Science 312 (5773):592-596 (2006)).

BACTH (ensayo de dos híbridos de adenilato ciclasa bacteriana): El ensayo BACTH se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Euromedex). Se seleccionaron dos plásmidos compatibles, pUT18C y pKT25 para el escrutinio. El dominio luminal H-Syt II (restos 1-80) se clonó en pKT25 para generar pKT25-h-Syt II. Se clonó HCB en pUT18C para producir T18-HCB. Se crearon bibliotecas de mutantes de HCB con cebadores que contenían tripletes de nucleótidos aleatorios (NNN) en las posiciones designadas. Cada biblioteca se transformó conjuntamente con el plásmido pKT25-h-Syt II en la cepa indicadora de E. coli BTH101 por electroporación y se escrutó en placas de agar LB que contenían 100 pg/ml de Ampicilina, 50 pg/ml de Kanamicina, IPTG 0,5 mM y 40 pg/ml de X-Gal. Las placas se incubaron a 30°C durante 64 horas. Los plásmidos se extrajeron de las colonias de color azul y se secuenciaron. El número total de colonias determinó la posibilidad de cubrir los 20 aminoácidos en el sitio de mutación seleccionado. Esto se calculó mediante la ecuación de Clark-Carbon: P = 1-(1-f)N, donde f refleja el número de restos posibles (f = 1/20 aquí ya que hay 20 aminoácidos diferentes), y N es el número total de colonias. Con un número mínimo de 380 colonias en los ensayos, la probabilidad de cubrir los 20 aminoácidos en cada posición es >99,8%.

Ensayo de B-galactosidasa: Se inocularon células de E. coli BTH101 con proteínas de interés expresadas en medio LB líquido que contenía ampicilina, kanamicina e IPTG (0,5 mM). El cultivo se hizo crecer durante la noche a 37°C para alcanzar la fase estacionaria. La DO600 del cultivo desarrollado durante la noche se registró antes de la recolección. Se centrifugó un mililitro del cultivo desarrollado durante la noche, y los sedimentos celulares se lavaron dos veces con PBS y se suspendieron en un volumen igual de tampón Z (Na2HPO460 mM, Na2HPO440 mM, KCl 10 mM, MgSO41 mM y ditiotreitol [DTT] 20 mM). Se diluyeron cien microlitros de células bacterianas resuspendidas en 1 ml de tampón Z (factor de dilución [FD] = 10). Posteriormente, se añadieron 100 ml de cloroformo y 50 ml de SDS al 0,1% y se mezclaron bien para permeabilizar las células. A continuación se transfirieron 250 microlitros de la mezcla a un nuevo tubo de Microcentrífuga y se llevaron a 28°C, se añadieron 50 ml de o-nitrofenil-p-galactósido precalentado (4 mg/ml en tampón Z) y la mezcla se incubó a 28°C hasta que se desarrolló un color amarillo. La reacción se detuvo mediante la adición de 200 ml de Na2CO3 1 M. Se registraron la A420 y el período de tiempo preciso de la reacción en minutos (T). La actividad p-galactosidasa se definió como (1000 x A420 x FD)/(T x DO600) en unidades Miller.

Expresión y purificación de proteínas: Se expresaron WT y mutantes de NTBo/B-Hc como proteínas recombinantes etiquetadas con His6 ("His6" divulgada como SEQ ID NO: 13) en E. coli. Los fragmentos y mutantes de Syt I/II se expresaron como proteínas recombinantes etiquetadas con GST en E. coli. Tanto proteínas de fusión con GST como las de fusión con His6 ("His6" divulgada como SEQ ID NO: 13) se purificaron como se describió previamente9, con la temperatura de inducción a 20°C durante la noche con IPTG 0,25 mM.

Ensayos de precipitación de GST: Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos de precipitación. La primera serie se utilizó para escrutar la unión de la NTBo/B-Hc mutante a Syt II de ratón (m-Syt II) etiquetada con GST y una Syt II de ratón mutante (F54L) que imita la secuencia Syt II humana (designada como h-Syt II). Brevemente, se centrifugaron 6 ml de E. coli que expresaba NTBo/B H^c, se resuspendieron en 800 pl de TBS, se sometieron a sonicación y a continuación, se incubaron con Triton X-100 al 2% durante 1 hora a 4°C. Después, las muestras se centrifugaron a velocidad máxima durante 15 min en una microcentrífuga a 4°C. Los sobrenadantes se recogieron y se utilizaron para ensayos de precipitación incubando con 10 pg de proteínas Syt inmovilizadas sobre cuentas de glutatión-Sefarosa (GE bioscience, Piscataway, NJ) a 4°C durante 1 hora. Las muestras se lavaron tres veces en tampón de lavado (TBS con Triton X-100 al 0,5%) y se analizaron mediante inmunotransferencia de NTBo/B-Hc utilizando el anticuerpo anti-HA. Para mutantes con mejor unión a h-Syt II, se llevaron a cabo ensayos de precipitación adicionales purificando estos mutantes de NTBo/B-Hc como proteínas etiquetadas con His6 ("His6" divulgada como SEQ ID NO: 13) como se describió anteriormente9. A continuación, se llevaron a cabo ensayos de precipitación utilizando fragmentos de Syt inmovilizados en 100 pl de tampón TBS más Triton X-100 al 0,5%, con o sin gangliósidos (60 pg/ml), durante 1 hora a 4°C. Las cuentas se lavaron tres veces utilizando tampón TBS más Triton X-100 al 0,5%. El diez por ciento de los materiales unidos se sometió a SDS-PAGE seguido del análisis de inmunotransferencia.

Ensayo de interferometría de biocapa. Las afinidades de unión entre las variantes H^cB y Syt I/Syt II se midieron mediante ensayo BLI con el sistema Blitz (ForteBio). Brevemente, Syt I o Syt II etiquetadas con GST (20 pg/ml) se inmovilizaron sobre biosensores Anti-GST Dip and Read™ (ForteBio) y se equilibraron con tampón PBS. A continuación, los biosensores se expusieron a concentraciones seriadas de H^cB, seguido de lavado con PBS. Las afinidades de unión (K^d) se calcularon utilizando el soporte lógico del sistema Blitz siguiendo las instrucciones del fabricante (ForteBio).

Cultivo de neuronas, lentivirus y ensayo de entrada/unión de toxinas. Se prepararon neuronas corticales de rata a partir de embriones E18-19 como se describió anteriormente (Peng et al. PLoS Pathogens 7(3):e1002008 (2011)). Las construcciones para la expresión de Syt I KD, mSyt II y h-Syt II en neuronas se describieron previamente (Peng et al., J Cell Sci. 125: 3233-42 (2012)). Se añadieron lentivirus a cultivos de neuronas en DIV5 (días in vitro), y se llevaron a cabo experimentos de unión/entrada de toxinas en DIV12-14. Las toxinas se diluyeron en tampón con alto contenido de K+ (NaCl 87 mM, KCl 56 mM, KH2PO41,5 mM, Na2HPÜ48 mM, MgCl20,5 mM, y CaCl 1 mM) y se precalentaron a 37°C. Las neuronas se expusieron a los tampones que contenían las toxinas anteriores durante 5 minutos a 37°C seguido de lavado con PBS. Estas neuronas se sometieron a análisis de inmunotinción o se incubaron en medio libre de toxinas durante 24 horas adicionales, seguido de análisis de inmunotinción.

Registro de mIPSC. Se realizaron registros de pinzamiento zonal de células completas a partir de neuronas corticales cultivadas en DIV 14-18 (DIV 14-18). La solución de la pipeta contenía (en mM): CsCl 135, HEPES 10, EGTA 1, Na-GTP 1, Mg-ATP 4 y QX-314 10 (pH 7,4, ajustado con CsOH). La resistencia de las pipetas llenas de solución intracelular varió entre 4 y 5 Mü. Después de la formación de la configuración de células completas y el equilibrio de la solución de pipeta intracelular, la resistencia en serie se ajustó a 10 Mü. Las corrientes sinápticas se controlaron con un amplificador EPC-10/2 (HEKA) a un potencial de retención de -70 mV. La solución del baño contenía (en mM): NaCl 140, KCl 5, CaCl 2, MgCl2 1, HEPES 10, glucosa 10 (pH 7,4, ajustado con NaOH). Las corrientes postsinápticas inhibidoras espontáneas (sIPSC) y las corrientes postsinápticas inhibidoras evocadas (eIPSC) se inhibieron farmacológicamente mediante la adición de bloqueadores del receptor de AMPA y NMDA CNQX y APV a la solución de baño extracelular. Se controlaron las corrientes postsinápticas inhibidoras en miniatura espontáneas (mIPSC) en presencia de tetrodotoxina (TTX) para bloquear los potenciales de acción. Los datos se analizaron utilizando Clampfit 10 (Molecular Devices), el soporte lógico Origin8 (Mocrocal Inc.), el soporte lógico MiniAnalysis (Synaptosoft) e Igor (Wavemetrics). El análisis estadístico se realizó con la prueba t de Student (* P <0,01). Todos los datos mostrados son medias ± E.T.M.

Conclusión

Los resultados presentados anteriormente indican nuevos métodos y composiciones para mejorar la unión de NTBo/B a sus receptores humanos, y proporcionan una forma de crear nuevas generaciones de NTBo terapéuticas, utilizando el dominio de unión al receptor modificado creado en la presente invención, con una mejor eficacia y especificidad para neuronas humanas diana que las WT NTBo actualmente utilizadas.

Estos esfuerzos muestran que la modificación de la secuencia de proteínas de NTBo/B-Hc puede crear nuevas versiones que pueden unir Syt II humana con alta afinidad. La modificación de la secuencia de proteínas de NTBo/B-H^c se puede realizar mediante mutagénesis dirigida (mutagénesis dirigida al sitio) o mutagénesis aleatoria de cada resto de aminoácido dentro de la región conocida por unirse a Syt I/II. Estas regiones de unión a Syt están bien definidas por estudios estructurales de cocristales previos2526. Por ejemplo, se compone de los restos 1078-1291 en la secuencia de NTBo/B1 (número de acceso de GenBank: P10844). Aunque estos estudios se realizaron utilizando la secuencia de NTBo/B1, todos los subtipos de NTBo/B se pueden utilizar como molde para recrear las mismas mutaciones o mutaciones similares como se describe aquí. Aunque la posición exacta de los restos seleccionados puede no ser idéntica en diferentes subtipos de NTBo/B, los restos análogos en los diferentes subtipos de NTBo/B se pueden identificarse fácilmente (p. ej., mediante alineación de secuencia cuando no están exactamente en la misma posición).

Se estudiaron específicamente todos los restos en la interfase de unión a Syt II de NTBo/B según la estructura del complejo NTBo/B-Syt II informada (ID de PDB: 2NM1), incluidos K1113, D1115, S1116, P1117, V1118, W1178, Y1181, Y1183, E1191, K1192, F1194, A1196, P1197, S1199, S1201, E1203, F1204, E1245 e Y1256, como se enumera en la Figura 3B.

La mutagénesis es una técnica de laboratorio común para crear productos proteicos modificados mediante ingeniería genética. Se encuentran disponibles varios métodos para introducir mutaciones, incluida la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis aleatoria, la mutagénesis combinatoria y la mutagénesis por inserción. Se aplicaron mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis aleatoria para introducir mutaciones en la secuencia de NTBo/B-HC. La mutagénesis aleatoria es una herramienta poderosa para crear bibliotecas mutantes para su escrutinio. Mediante el uso de cebadores de PCR con nucleótidos dopados, se creó una reserva de mutantes que contenía sustituciones de los 19 aminoácidos restantes en las posiciones enumeradas en la Figura 3B. A continuación, se realizó el escrutinio utilizando el sistema BACTH como se ilustra en la Figura 4.

Se identificó que los restos en las posiciones 1191, 1178, 1183 y 1199 eran importantes para que las mutaciones por sustitución generaran mutantes de NTB^o/B-H^c con mejor unión a Syt II humana. Las sustituciones específicas fueron E1191M/C/V/Q/L/Y, Y1183C/P, S1199Y/W/E/H, W1178Y/Q/A/S (Figura 5A, B).

Ensayos cuantitativos adicionales revelaron que cambiar el resto E1991 a M/C/V/Q dio como resultado la unión más fuerte a h-Syt II, según lo medido por la actividad p-galactosidasa (Figura 6A) y ensayos de precipitación (Figura 6B). Por lo tanto, se identificó E1191 como el sitio principal para introducir mutaciones que mejoran la unión a h-Syt II, y las mutaciones por sustitución de E1191/M/C/V/Q se identificaron como mutaciones primarias.

Se utilizó E1191M como la mutación primaria para explorar si la adición de una mutación secundaria puede mejorar adicionalmente la unión a h-Syt II (Figura 7A). Debido a que las mutaciones por sustitución Y1183C/P, S1199Y/W/E/H y W1178Y/Q/A/S dieron como resultado colonias de color "azul claro" en el escrutinio con BACTH (Figura 5B), estos sitios se seleccionaron como el sitio de mutación secundaria potencial. Se generaron y probaron mutaciones dobles que combinaban E1191M con estas posibles mutaciones secundarias. Se encontró que tres mutaciones, S1199W, S1199Y y W1178Q mejoraban la unión a h-Syt II, cuando se combinaban con la mutación primaria en E1191M en ensayos de precipitación (Figura 7A, B). Estas tres mutaciones por sustitución se seleccionaron como mutaciones secundarias.

Se llevaron a cabo ensayos cuantitativos adicionales para determinar la afinidad de unión entre mutantes de NTBo/B-Hc y h-Syt II, utilizando un ensayo de interferometría de biocapa como se describe en la Figura 8A. Las mutaciones dobles, una de las mutaciones primarias (M1191M/C/Q/V) y la otra de las mutaciones secundarias (S1199W/Y, W1178Q), se midieron para determinar sus afinidades de unión a h-Syt II (Figura 8B). Los resultados mostraron que las siguientes mutaciones dobles: E1191M/C/Q/V combinada con S1199W/Y y E1191M/C/V combinada con W1178Q tienen afinidades de unión significativamente mejoradas para h-Syt II (Figura 8B). Por tanto, estas once combinaciones dobles se identificaron como mutaciones en NTBo/B-HC que mejoran al máximo la unión a h-Syt II.

Se encontró que los mutantes de NTBo/B-HC modificados mediante ingeniería genética no solo mejoraban la unión a Syt II humana, sino también a Syt I humana. Se utilizaron E1191M/S1199Y y E1191V/S1199Y para mostrar que estos mutantes presentaban capacidades de unión a Syt I humana significativamente mejoradas, así como en comparación con WT NTBo/B-HC (Figura 9).

Los mutantes de NTBo/B-HC modificados pueden contener sustituciones de aminoácidos en uno o en una combinación de los restos de aminoácido E1191, Y1183, W1178 y S1199, tales como E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y, E1191M/W1178Q, E1191C/S1199W, E1191C/S1199Y, E1191C/W1178Q, E1191Q/S1199W, E1191Q/S1199Y, E1191V/S1199W, E1191V/S1199Y y E1191V/W1178Q.

También se probaron las mutaciones triples seleccionadas mediante la combinación de mutaciones en los sitios E1191/S1199/W1178 y se encontró que tenían una afinidad de unión similar a la de la doble mutación en los sitios E1191/S1199. Por ejemplo, E1191M/S1199W/W1178Q tiene una afinidad de unión similar a E1191M/S1199W (Figura 8B). Por lo tanto, las mutaciones triples exhibieron la mejor afinidad de unión de las mutaciones dobles, aunque no parecieron ofrecer una ventaja significativa sobre las mutaciones dobles con respecto al aumento de la afinidad de unión.

Estos resultados indican que los polipéptidos que contienen NTBo/B-Hc con secuencia de aminoácidos modificada relacionada con la secuencia de WT NTBo/B-HC, en donde la NTBo/B-HC modificada tiene una capacidad mejorada para unirse a Syt I y II humanas en comparación con WT NTBo/B-HC y se puede preparar y utilizar terapéuticamente. Los polipéptidos pueden estar, por ejemplo, en forma de mutantes de NTBo/B de longitud completa, mutantes de NTBo/B truncados o proteínas recombinadas que contienen las mismas sustituciones de aminoácidos dentro del dominio de unión al receptor (NTBo/B-HC), como se describió anteriormente, y también, subtipos de NTBo/B con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes. Además, el subtipo de NTBo/B se puede modificar para unirse a h-Syt II reemplazando los restos dentro de su dominio de unión al receptor que son diferentes de NTBo/B1.

Los mutantes de NTBo/B de longitud completa abarcados contienen sustituciones de aminoácidos en uno o en una combinación (p. ej., 2 o 3) de los restos de aminoácidos E1191, Y1183, W1178 y S1199 tal como E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y, E1191M/W1178Q, E1191C/S1199W, E1191C/S1199Y, E1191C/W1178Q, E1191Q/S1199W, E1191Q/S1199Y, E1191V/S1199W, E1191V/S1199Y y E1191V/W1178Q. Las mutaciones se pueden realizar de la misma manera que se describe anteriormente para NTBo/B-HC, utilizando cualquiera de los subtipos de NTBo/B como molde. Estas toxinas NTBo/B mutadas obtienen una mejor unión tanto a Syt II humana como a Syt I humana, por lo tanto, alcanzarán una mayor eficacia y especificidad para las neuronas humanas diana que WT NTBo/B. Referencias para la sección de ejemplos

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-H^c), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a sustituciones en el serotipo B, cepa 1. en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191C y E1191Y, en donde el dominio de unión al receptor modificado posee 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo salvaje de referencia de SEQ ID NO: 5, y en donde el polipéptido muestra mejor unión a Syt II humana en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones por sustitución.

2. Un polipéptido de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende:

a) un dominio proteasa;

b) un sitio de escisión de proteasa;

c) un dominio de translocación; y

d) un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-H^c), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a sustituciones en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo formado por E1191C y E1191Y,

en donde el dominio de unión al receptor modificado posee 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo salvaje de referencia de SEQ ID NO: 5, y en donde el polipéptido de NTBo muestra una mejor unión a Syt II humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la una o más mutaciones por sustitución.

3. El polipéptido de NTBo de la reivindicación 2, en donde el dominio proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de proteasa son del serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C, D, E, F, G y combinaciones de los mismos, preferiblemente en donde el dominio proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de proteasa son de serotipo B, cepa 1 o del serotipo A, cepa 1.

4. El polipéptido o polipéptido de NTBo según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el dominio de unión al receptor modificado corresponde a los restos 1078-1291 de SEQ ID NO: 5 o los restos 859-1291 de SEQ ID NO: 5.

5. El polipéptido o polipéptido de NTBo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el dominio de unión al receptor modificado comprende:

i) dos mutaciones por sustitución; o

ii) dos mutaciones por sustitución correspondientes a:

E1191C y S1199W;

E1191CyS1199Y;o

E1191C y W1178Q.

6. El polipéptido o polipéptido de NTBo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el dominio de unión al receptor modificado comprende tres mutaciones por sustitución.

7. El polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6 que es una molécula quimérica que comprende una primera porción que es el dominio de unión al receptor modificado conectado a una segunda porción.

8. El polipéptido o polipéptido de NTBo de la reivindicación 7, en donde:

la primera porción y la segunda porción están conectadas covalentemente o no covalentemente; y la segunda porción se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido corto y una proteína, preferiblemente en donde la segunda porción es una molécula bioactiva, un fármaco polipéptido o no polipeptídico terapéutico.

9. Un ácido nucleico, preferiblemente un vector de ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9 o que expresa el polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1 -8.

11. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o el ácido nucleico de la reivindicación 9, opcionalmente en donde la composición farmacéutica comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Un método para producir un polipéptido o polipéptido de NTBo, comprendiendo el método las etapas de cultivar la célula de la reivindicación 10 en condiciones en donde se produce dicho polipéptido o polipéptido de NTBo.

13. El método de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente uno o más de las siguientes etapas:

- recuperar el polipéptido o polipéptido de NTBo del cultivo,

- purificar el polipéptido o polipéptido de NTBo,

- activar el polipéptido o polipéptido de NTBo, y/o

- formular el polipéptido o polipéptido de NTBo.

14. El polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para su uso en medicina.

15. El polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para su uso en el tratamiento de una afección asociada con actividad neuronal no deseada, en donde la afección se selecciona del grupo que consiste en disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica, anismo, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos secretores, dolor por espasmos musculares, dolor de cabeza, migraña y afecciones dermatológicas.