JP2016509997A - 骨粗鬆症を抑制するための治療 - Google Patents

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Abstract

本発明は、骨粗鬆症の抑制又は治療に用いるポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、腸クロム親和性細胞内のSNAREタンパク質を切断することが可能な非細胞傷害性プロテアーゼと、前記SNAREタンパク質を発現する腸クロム親和性細胞内のエンドソームへエンドサイトーシスにより取り込まれることが可能な、腸クロム親和性細胞上の結合部位と結合可能なターゲティング部分(TM)と、エンドソーム内からエンドソーム膜を介して腸クロム親和性細胞のサイトゾル内へ前記プロテアーゼをトランスロケートさせることが可能な転位置ドメインと、を含む。但し、前記ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒(ホロトキシン)分子ではない。

Description

本発明は、骨粗鬆症を抑制又は治療するための方法及び組成物を提供する。
骨粗鬆症は、骨の構造の劣化をもたらす低骨質量の疾患である。この劣化は、僅かな外傷により骨折が生じ得るほどまで骨を弱らせる場合があり、生活の質を悪化させ、余命を減少させる恐れがある。骨粗鬆症では、骨塩量(bone mineral density, BMD)が低下し、骨の微小構造が劣化し、骨内のタンパク質の量及び種類が変化する。
骨組織は、主にコラーゲンとリン酸カルシウムにより構成され、新しい骨を生成する造骨細胞と、骨を破壊する破骨細胞とが仲介するプロセスにおいて、絶えず分解及び再合成される(即ち、骨リモデリング)。これらの細胞の活動は、サイトカイン及び成長因子により調節される。骨粗鬆症の全てのケースにおいて基盤となるメカニズムは、骨吸収と骨形成との間の不均衡である。骨の再形成及び再吸収のパターンは、患者毎に変化する場合が多いため、この問題には幾つかの異なる要因があると考えられる。細胞成長に影響する重要な化学物質(エストロゲン、テストステロン、副甲状腺ホルモン、及びビタミンD等)と細胞増殖に影響する血液因子とが、このプロセスに関与している。これらの要因の何れかにおけるレベルの変化は、骨粗鬆症の発生の一因となる可能性がある。
近年、腸由来セロトニン(gut-derived serotonin, GDS)が骨リモデリングの方向付けに関与することが判明している。人体の全セロトニンの略90％は、腸クロム親和性細胞と呼ばれる、腸内の専門の内分泌細胞により合成される。腸クロム親和性細胞から放出されると、GDSは、血清中を循環する。腸由来セロトニン(GDS)は、骨吸収に影響しない、造骨細胞の増殖及び骨形成の強力な阻害物質である。したがって、GDSレベルを改変することは、骨リモデリングにおけるバランスを変更する潜在的な手段であり、そのため、骨粗鬆症を抑制又は治療するための手段をもたらす。
世界全体で、50歳を超える女性の3人に1人は、骨粗鬆症により骨折し(この数は60歳超では2人に1人に増加する)、50歳を超える男性の5人に1人は、骨粗鬆症により骨折する(60歳超では3人に1人に増加する)。世界保健機関(WHO)によれば、骨粗鬆症は、心血管疾患に次いで2番目の世界的な医療問題である。骨粗鬆症は、増加中の高齢者人口に影響を与えるため、医療制度にとって更に大きな負担となる。
現在、骨粗鬆症の治療には、ダイエット及び運動といった生活様式の変更と、カルシウム、ビタミンD、ビスホスホネート、ホルモン補充療法を含む薬物療法とが含まれる。しかしながら、既存の治療には、有害な副作用が伴う。したがって、当該技術分野において、骨粗鬆症を抑制又は治療するための新規の医薬品に対する必要性が依然として存在する。
本発明は、上述した問題の1つ以上を解消するものであり、こうした必要性に対処する。
WO 94/21300 WO 96/33273 WO 98/07864 WO 00/10598 WO 01/21213 WO 06/059093 WO 00/62814 WO 00/04926 WO 93/15766 WO 00/61192 WO 99/58571
本発明は、対象者(例えば、患者)における骨粗鬆症の抑制又は治療に用いる融合タンパク質を提供することにより上述した問題の1つ以上に対処し、前記融合タンパク質は、
(i)腸クロム親和性細胞内のSNAREタンパク質を切断することが可能な非細胞傷害性プロテアーゼと、
(ii)前記SNAREタンパク質を発現する腸クロム親和性細胞内のエンドソームへエンドサイトーシスにより取り込まれることが可能な、腸クロム親和性細胞上の結合部位と結合可能なターゲティング部分(Targeting Moiety, TM)と、
(iii)エンドソーム内からエンドソーム膜を介して腸クロム親和性細胞のサイトゾル内へ前記プロテアーゼをトランスロケートさせることが可能な転位置ドメインと、を含み、
但し、ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒(ホロトキシン)分子ではない。
第1の態様は、また、骨粗鬆症を抑制又は治療するための対応する方法を含み、前記方法は、本発明のポリペプチドの治療上有効量を患者に投与することを含む。
本発明のポリペプチドは、天然に存在するクロストリジウム神経毒分子(クロストリジウムホロトキシンとしても知られる)ではない。クロストリジウムホロトキシンは、知られている中で最も致死性の高い神経毒の1つであり、そのため、治療用分子として大きな制限を有する。更に、骨粗鬆症の抑制において、クロストリジウムホロトキシンは、望ましくないオフサイト標的化、即ち、非セロトニン分泌細胞の標的化を伴う。
使用時、本発明のポリペプチドは、腸クロム親和性細胞に結合する。その後、転位置成分は、プロテアーゼ成分を腸クロム親和性細胞のサイトゾルへ輸送する。最後に、内部に入ると、プロテアーゼは、腸クロム親和性細胞のサイトゾルに存在するSNAREタンパク質を切断することにより、腸クロム親和性細胞の開口放出融合プロセス(exocytic fusion process)を阻害する。したがって、腸クロム親和性細胞の開口放出融合装置(exocytic fusion apparatus)を不活性化することにより、本発明のポリペプチドは、その細胞からのセロトニンの分泌を阻害する。したがって、本発明のポリペプチドは、血清セロトニンのレベルを減少させることにより、骨粗鬆症を抑制又は治療することができる。
本発明のポリペプチドは、特異的な標的細胞、即ち、腸クロム親和性細胞からのセロトニンの分泌を阻害する潜在能力を有する点において、他の治療に勝る明確な利点をもたらす。対照的に、他の提案された治療剤は、セロトニンの合成の非特異的な遮断、又はセロトニンの効果を仲介するセロトニン受容体に対するアンタゴニストの使用を試みることにより、血清セロトニンレベルを低減しようとしている。しかしながら、本発明は、生成部位からのセロトニン分泌を特異的に遮断する手段を提供する。
本発明の主な標的細胞は、腸クロム親和性細胞である。腸クロム親和性細胞は、十二指腸に存在し、血清セロトニンの供給源となる。
本発明の融合タンパク質は、一般に、対応する「遊離」TM(即ち、単離TM自体)と比較して、標的細胞に対する結合親和性の減少(100分の1までの範囲)を示す。しかしながら、この観測結果にもかかわらず、本発明の融合タンパク質は、驚くべきことに、良好な有効性を示す。これは、2つの主要な特徴に起因すると考えられる。第1に、非細胞傷害性プロテアーゼ成分は、触媒作用を引き起こすため、こうした幾つかの分子の治療効果は、標的細胞内で急速に増幅される。第2に、標的細胞上に存在する受容体は、治療物質が入るための入口の役割を果たせばよく、必ずしもリガンド-受容体仲介薬理反応を達成するために必要なレベルまで刺激する必要はない。したがって、本発明の融合タンパク質は、他の種類の治療分子(こうした治療分子は、一般に高いマイクログラムからミリグラム(更には、最大数百ミリグラム)の量で投与される)に採用されるであろう投与量に比べ、低い投与量で投与してよく、。対照的に、本発明の融合タンパク質は、通常は少なくとも10分の1、より好ましくは100分の1という大幅に低い投与量で投与し得る。
非細胞傷害性プロテアーゼ
本発明のTSIポリペプチドの生物活性成分は、非細胞傷害性プロテアーゼである。したがって、標的細胞のサイトゾルに送達されると、非細胞傷害性プロテアーゼ成分は、所望の標的細胞内でのSNARE切断をもたらす。SNAREタンパク質は、哺乳類の標的細胞内の分泌プロセスにとって必須成分であるため、そのタンパク分解性の不活性化は、標的細胞からの分泌を阻害/抑制する。
非細胞傷害性プロテアーゼは、細胞を殺さない、独立したクラスの分子であり、代わりにタンパク質合成以外の細胞プロセスを阻害することにより機能する。非細胞傷害性プロテアーゼは、様々な高等生物(例えば、植物及び動物)により生産され、こうした高等生物の例には、ブラジルサソリがある。加えて、非細胞傷害性プロテアーゼは、様々な微生物、特にクロストリジウム種及びナイセリア種等のバクテリアにより生産される。
クロストリジウム神経毒は、非細胞傷害性毒素分子の主要なグループであり、ジスルフィド結合により互いに連結された2本のポリペプチド鎖を含む。2本の鎖は、略100kDaの分子質量を有するものが重鎖(H鎖)、略50kDaの分子質量を有するものが軽鎖(L鎖)と呼ばれる。プロテアーゼ機能を有し、開口放出過程に関与する小胞及び/又は形質膜関連(SNARE)タンパク質(例えば、シナプトブレビン、シンタキシン、SNAP、及び/又はVAMP)に対する基質特異性を示すものはL鎖である。これらの基質は、細胞の分泌機構にとって重要な成分である。
ナイセリア種、特にN.gonorrhoeae種は、機能的に類似する非細胞傷害性毒素分子を生産する。こうした非細胞傷害性プロテアーゼの例には、IgAプロテアーゼがある(WO99/58571参照)。同様のIgAプロテアーゼは、Streptococcus pneumoniae等の連鎖球菌により生産される。
したがって、一実施形態において、本発明の非細胞傷害性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒プロテアーゼ又はIgAプロテアーゼにし得る(例えば、WO99/032272参照)。非細胞傷害性プロテアーゼの他の例は、ブラジルサソリTityus serrulatusの毒に由来するもの等のサソリ毒プロテアーゼ、又はプロテアーゼアンタレアーゼ(antarease)である(例えば、WO2011/022357参照)。
ターゲティング部分(TM)
本発明のターゲティング部分(TM)成分は、本発明のポリペプチドを腸クロム親和性細胞に結合させる成分である。TMは、好ましくは、ペプチドである。TMは、一般に、最大50個のアミノ酸残基、例えば、最大40個のアミノ酸残基、又は最大30個のアミノ酸残基、又は最大20個のアミノ酸残基を含む。
上述したように、血清セロトニンレベルの上昇は、骨質量の低下を引き起こし、骨粗鬆症につながることが判明している。十二指腸の腸クロム親和性細胞は、血清セロトニンの供給源である。
使用時、本発明のポリペプチドは、腸クロム親和性細胞に結合する。その後、転位置成分は、プロテアーゼ成分を腸クロム親和性細胞のサイトゾルへ輸送する。最後に、内部に入ると、プロテアーゼは、腸クロム親和性細胞のサイトゾルに存在するSNAREタンパク質を切断することにより、腸クロム親和性細胞の開口放出融合プロセスを阻害する。したがって、腸クロム親和性細胞の開口放出融合装置を不活性化することにより、本発明のポリペプチドは、その細胞からのセロトニンの分泌を阻害する。したがって、本発明のポリペプチドは、血清セロトニンのレベルを減少させることにより、骨粗鬆症を抑制又は治療することができる。
TMは、腸クロム親和性細胞上の結合部位に結合することにより、他の細胞と比較して、この種の標的細胞に対するポリペプチドの選択性を提供する。これに関連して、本発明の好適なTMの実施形態は、抗体(例えば、モノクローナル抗体、Fab、F(ab)'2、Fv、ScFv等の抗体断片、及び抗体ドメインペプチド)と、以下に特定した受容体に結合する結合スキャフォールドとを含む。したがって、本発明のポリペプチドは、問題の標的細胞又は受容体との特異的結合を達成するように設計された、市販の抗体又は結合スキャフォールドを含み得る。或いは、好適なTMは、サイトカイン、成長因子、神経ペプチド、及びレクチン等のペプチドリガンドを含む。
本発明のTMは、腸クロム親和性細胞上の受容体と結合する。一例として、本発明のポリペプチドのTMは、IL13受容体(例えば、IL13Rα1)、ソマトスタチン受容体(例えば、SSTR2又はSSTR5)、VPAC受容体(例えば、VPAC1又はVPAC2)、TGFβI受容体(例えば、TGFβRI又はTGFβRII)、タキキニン受容体(例えば、TAC1又はTAC2)、ガンマアミノ酪酸(GABA)受容体(例えば、GABAA受容体、特にα6又はβ2)、表皮成長因子(EGF)受容体(例えば、EGFR)、線維芽細胞成長因子受容体(例えば、FGFr2)、又はペプチドYY(PYY)受容体(例えば、神経ペプチドY受容体Y1又はY2)を含む群から選択される腸クロム親和性細胞上の受容体に結合する。これら全ての受容体は、腸クロム親和性細胞上で発現される。
一実施形態において、TMは、IL13受容体リガンド(例えば、IL13)、ソマトスタチン受容体リガンド(例えば、ソマトスタチン)、VPAC受容体リガンド、TGFβI受容体リガンド(例えば、TGFβI)、タキキニン受容体リガンド(例えば、P物質)、ガンマアミノ酪酸(GABA)受容体リガンド、表皮成長因子(EGF)受容体リガンド(例えば、EGF、TGFα、ヘパリン結合EGF様成長因子(HB-EGF)、アンフィレグリン(AR)、ベタセルリン(BTC)、エピレグリン(EPR)、又はエピジェン)、線維芽細胞成長因子受容体リガンド(例えば、FGF)又はペプチドYY(PYY)受容体リガンド(例えば、ペプチドYY)と、その短縮型及びペプチド類似体とから選択される。
一実施形態において、本発明のポリペプチドのTMは、IL13Rα1、SSTR2、SSTR5、VPAC1、VPAC2、TGFβRI、TGFβRII、TAC1、TAC2、GABAA受容体α6、GABAA受容体β2、EGFR、FGFr2、神経ペプチドY受容体Y1、又は神経ペプチドY受容体Y2を含む群から選択される腸クロム親和性細胞上の受容体に結合する。これら全ての受容体は、腸クロム親和性細胞上で発現される。
一実施形態において、TMは、IL13ペプチド、ソマトスタチンペプチド、VPACペプチド、TGFβIペプチド、P物質ペプチド、EGFペプチド、TGFαペプチド、ヘパリン結合EGF様成長因子(HB-EGF)ペプチド、アンフィレグリン(AR)ペプチド、ベタセルリン(BTC)ペプチド、エピレグリン(EPR)ペプチド、エピジェンペプチド、線維芽細胞成長因子(FGF)ペプチド、又はペプチドYYと、その短縮型及びペプチド類似体とから選択される。
一実施形態において、本発明のポリペプチドのTMは、IL13受容体、好ましくはIL13Rα1と結合する。こうしたTMの適切な例には、全長IL13ペプチド(例えば、IL13146)等のIL13ペプチドと、その短縮型又はペプチド類似体とが含まれる。
一実施形態において、本発明のポリペプチドのTMは、ソマトスタチン(SST)受容体である。一例として、適切なTMは、SSTペプチド及びコルチスタチン(CST)ペプチドと、D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2(BIM23052)、D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-D-Nal-NH2(BIM23056)、又はc[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2(BIM-23268)等のそのペプチド類似体とを含む。他の例には、SSTペプチドST-14及びSST-28と、オクトレオチド、ランレオチド、BIM23027、バプレオチド、セグリチド、及びSOM230等のペプチド及びペプチド類似体とが含まれる。これらのTMは、SST受容体、特にSSTR2及びSSTR5受容体に対する結合に好適なTMである。
一実施形態において、本発明のTMは、VPAC受容体、好ましくはVPAC1又はVPAC2と結合する。こうしたTMの適切な例には、PACAP(1-27)、又は、そのペプチド類似体の短縮型(類似体TP3805、類似体[Arg15,20,21Leu17]-PACAP-Gly-Lys-Arg-NH2、及び類似体R3P66[HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRY]を含む)が含まれる。こうしたTMの他の適切な例には、VIP-1及びVIP-2ペプチド、例えば、VIP(1-28)、又は、そのペプチド類似体の短縮型(VIP類似体TP3939、TP4200、TP3982を含む)が含まれる。これらのTMは、VPAC1に対する選択的結合を示す。或いは、例えば、mROM等、VPAC2に対する選択的結合を示すTMを利用し得る(出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部としたYu et al., Peptides 27(6) p1359-66 (2006)参照)。
一実施形態において、本発明のTMは、TGFβI受容体、好ましくはTGFβRI又はTGFβRIIに結合する。こうしたTMの適切な例には、TGFβペプチド、好ましくはTGFβIペプチドと、その短縮型又はペプチド類似体とが含まれる。
一実施形態において、本発明のTMは、タキキニン受容体、好ましくはTAC1又はTAC2に結合する。こうしたTMの適切な例には、P物質と、[pGlu5,MePhe8,Sar9]-SP5-11(D1Me-C7)、エレドイシン関連ペプチド(ERP)、及び(D-pro4、D-trp7,9)SP(4-11)を含む、その短縮型又はペプチド類似体とが含まれる。TSIをタキキニン受容体に結合させる他の適切なTMは、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたWO2011/020114に詳細に記載されている。
一実施形態において、本発明のTMは、ガンマアミノ酪酸(GABA)受容体、好ましくはGABA受容体α6又はβ2に結合する。こうしたTMの適切な例には、ガンマアミノ酪酸(GABA)、ジアゼパム結合阻害タンパク質(diazepam binding inhibitor, DBI)ペプチド、ベンゾジアゼピン、GABA類似体、DBI類似体が含まれる。
一実施形態において、本発明のTMは、表皮成長因子(EGF)受容体、好ましくはEGFRに結合する。こうしたTMの適切な例には、表皮成長因子(EGF)、TGFα、ヘパリン結合EGF様成長因子(HB-EGF)、アンフィレグリン(AR)、ベタセルリン(betacellulin, BTC)、エピレグリン(epiregulin, EPR)、又はエピジェンと、LONG(登録商標)EGF(TGFαに14アミノ酸N末端伸長ペプチドを加えた組換え類似体)を含む、その短縮型又はペプチド類似体とが含まれる。
一実施形態において、本発明のTMは、線維芽細胞成長因子受容体、好ましくはFGFr2に結合する。こうしたTMの適切な例には、線維芽細胞成長因子受容体リガンドFGFと、PG-FGF-1(FGFのプロテオグリカン(PG)コアタンパク質との融合物)、塩基性FGF([Val112])塩基性FGF(106-146)NH2)を含む、その短縮型及びペプチド類似体とが含まれる。線維芽細胞成長因子受容体に結合する他の適切なTMは、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたUS6294,359に詳細に記載されている。
一実施形態において、本発明のTMは、ペプチドYY(PYY)受容体、好ましくは神経ペプチドY受容体Y1又はY2に結合する。こうしたTMの適切な例には、ペプチドYYと、PYY(22-36)(BIM-43004)、PYY(1-36)、PYY(9-36)、PYY(14-36)、PYY(22-36)、PYY(27-36)を含む、その短縮型及びペプチド類似体とが含まれる。
好適な実施形態において、TMは、IL13受容体、好ましくはIL13Rα1に結合し、更に、TMがIL13ペプチド又はその短縮型若しくはペプチド類似体であることも好適となる。
転位置ドメイン
本発明の転位置成分は、標的細胞のサイトゾル内でプロテアーゼ活性の機能発現が生じるように、非細胞傷害性プロテアーゼ(又はその断片)の標的細胞内への転位置を可能にする。転位置成分は、好ましくは、低pH条件下で脂質膜(例えば、エンドソーム膜)にイオン透過性の孔を形成することができる。転位置成分は、微生物タンパク質源、例えば細菌又はウイルスタンパク質源から取得し得る。したがって、一実施形態において、転位置成分は、細菌毒素等の酵素の転位置ドメインを含むか、又はこれにより構成される。他の実施形態において、転位置ドメインは、ウイルスタンパク質の転位置ドメインを含むか、又はこれにより構成される。一実施形態において、本発明の転位置成分は、クロストリジウム神経毒のH鎖、又はクロストリジウム神経毒のHNドメイン(又はその転位置断片)等のその断片を含むか、又はこれにより構成される。
ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドは、3つの主成分として、「生物活性」(即ち、非細胞傷害性プロテアーゼ)、TM、及び転位置ドメインを含む。こうした融合タンパク質の調製に関連する一般的な技術は、再標的化毒素技術と呼ばれる場合が多い。例示として、WO94/21300、WO96/33273、WO98/07864、WO00/10598、WO01/21213、WO06/059093、WO00/62814、WO00/04926、WO93/15766、WO00/61192、及びWO99/58571を挙げる。これらの公報は全て、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とする。
更に詳しくは、本発明のTM成分は、本発明のプロテアーゼ成分又は転位置成分と融合させ得る。前記融合は、好ましくは共有結合、例えば直接共有結合又はスペーサー/リンカー分子を介したものとなる。プロテアーゼ成分及び転位置成分は、好ましくは、共有結合、例えば直接共有結合又はスペーサー/リンカー分子を介したものにより共に結合される。適切なスペーサー/リンカー分子は、当該技術分野において周知であり、一般には、5乃至40、好ましくは10乃至30アミノ酸残基長のアミノ酸に基づく配列を含む。
使用時、ポリペプチドは、二本鎖構造を有し、プロテアーゼ成分及び転位置成分は、好ましくはジスルフィド結合により互いに結合されている。
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の従来の化学的コンジュゲート手法により調製し得る。一例として、Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press、及びWong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press、Nagy et al., PNAS 95 p1794-99 (1998)が挙げられる。合成TMを本発明のポリペプチドに結合させる更に詳細な方法は、例えば、EP0257742に記載される。上述したコンジュゲートの出版物は、出典を明記することにより本願明細書の一部とする。
或いは、ポリペプチドは、単一ポリペプチド融合タンパク質の組換え調製により調製し得る(例えば、WO98/07864参照)。この手法は、天然のクロストリジウム神経毒(即ち、ホロトキシン)が調製される生体内バクテリア機構に基づいており、次の「簡略化された」構造配置を有する融合タンパク質が生じる。
NH2-[プロテアーゼ成分]-[転位置成分]-[TM]-COOH
WO98/07864によれば、TMは、融合タンパク質のC末端側に配置される。融合タンパク質は、その後、プロテアーゼ成分と転位置成分との間の部位において切断するプロテアーゼによる処理により活性化される。これにより、一の単一ポリペプチド鎖としてプロテアーゼ成分を、これに(ジスルフィド架橋を介して)共有結合した他の単一ポリペプチド鎖として転位置成分及びTMを含む、二本鎖タンパク質が生成される。
或いは、WO06/059093によれば、融合タンパク質のTM成分は、直線状の融合タンパク質配列の中央側で、プロテアーゼ切断部位と転位置成分との間に位置する。これにより、TMが転位置ドメインに結合された状態(即ち、天然のクロストリジウムホロトキシンにより生じる状態)が確保されるが、この場合、2つの成分は天然のホロトキシンに対して順序が逆になる。その後のプロテアーゼ切断部位での切断により、TMのN末端部分が露出され、二本鎖ポリペプチド融合タンパク質が提供される。
他の代替方法は、融合タンパク質のTM成分の「スプリットリガンド」提示である。この場合、TM成分は、リガンドとして機能し、遊離N末端ドメイン及び遊離C末端ドメインの両方を有する。したがって、TMは、ターゲティング部分のN末端部分と結合部位のドメインとの間の相互作用を介して、標的細胞上の結合部位(例えば、受容体又はアクセプタ)と相互作用することができる。或いは、TMは、ターゲティング部分のC末端部分と、結合部位のドメインとの間の相互作用が可能である。又は、TMは、ターゲティング部分のN末端部分が結合部位のドメインと相互作用すると共に、ターゲティング部分のC末端部分が結合部位のドメインと相互作用する二重相互作用が可能である。後者の実施形態では、TMのN及びC末端部分は、結合部位の同じ又は異なるドメインに結合してよく、及び/又は異なる結合部位上のドメインに結合してよい。この配置に関する詳細な情報は、出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部としたWO2012/156743において確認し得る。
上述したプロテアーゼ切断配列(群)は、部位特異的突然変異誘発等の従来の手段により、DNAにおいて導入し得る(及び/又は任意の本来の切断配列を除去し得る)。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングは、手作業で、或いはコンピュータソフトウェア(例えば、DNASTAR、Inc.のMapDrawプログラム)を用いて実行し得る。任意のプロテアーゼ切断部位を利用してよいが(即ち、クロストリジウム又は非クロストリジウム)、以下が好適となる。
Figure 2016509997
付加的なプロテアーゼ切断部位には、非細胞傷害性プロテアーゼ、例えばクロストリジウム神経毒により切断される認識配列が含まれる。これらには、クロストリジウム神経毒等の非細胞傷害性プロテアーゼにより切断されるSNARE(例えば、SNAP-25、シンタキシン、VAMP)タンパク質認識部位が含まれる。特定の例は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたUS2007/0166332に記載されている。
更に、プロテアーゼ切断部位という用語には、自己切断配列であるインテインが含まれる。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変化させることで制御可能となる。上述した「活性化」切断部位は、本発明のポリペプチドに導入するべき「破壊的」切断部位(後述)としても利用し得る。
好適な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、N末端及び/又はC末端に位置する1つ以上の精製タグを含み得る。任意の精製タグを利用し得るが、以下が好適となる。
Hisタグ(例えば、6×ヒスチジン)(SEQ ID NO:7)、好ましくはC末端及び/又はN末端タグとして
MBPタグ(マルトース結合タンパク質)、好ましくはN末端タグとして
GSTタグ(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、好ましくはN末端タグとして
His-MBPタグ、好ましくはN末端タグとして
GST-MBPタグ、好ましくはN末端タグとして
チオレドキシンタグ、好ましくはN末端タグとして
CBDタグ(キチン結合ドメイン)、好ましくはN末端タグとして
1つ以上のペプチドスペーサー/リンカー分子が、融合タンパク質に含まれ得る。例えば、ペプチドスペーサーは、精製タグと融合タンパク質分子の残りの部分との間において利用し得る。
本発明は、更に、上述した融合タンパク質をコードするDNA配列を提供する。本発明の好適な態様において、DNA配列は、DNAベクターの一部として調製され、ベクターは、プロモーター及びターミネーターを含む。
好適な実施形態において、ベクターは、以下から選択されるプロモーターを有する。
Figure 2016509997
本発明のDNAコンストラクトは、好ましくは、インシリコで設計され、その後、従来のDNA合成手法により合成される。
上述したDNA配列情報は、利用すべき最終的な宿主細胞(例えば、E.coli)発現系によるコドンバイアスに合致するように随意に改変される。
DNA骨格は、好ましくは、転写及び翻訳時に第2のペプチドコード配列によりコードされるプロテアーゼ切断部位に対応するアミノ酸配列を生成する、任意の固有の核酸配列についてスクリーニングされる。このスクリーニングは、手作業で、或いはコンピュータソフトウェア(例えば、DNASTAR、Inc.のMapDrawプログラム)を用いて実行し得る。
本明細書において使用される「抑制」及び「治療」に対する言及は、対象者に治療的な恩恵を与えることを意味する。これは、例えば、骨粗鬆症を予防するため、又はその重篤度を軽減するために、本明細書に定めた融合タンパク質を投与することを含む。
本発明の他の態様は、骨粗鬆症を予防又は抑制する方法を提供し、前記方法は、
(i)腸クロム親和性細胞内のSNAREタンパク質を切断することが可能な非細胞傷害性プロテアーゼと、
(ii)前記SNAREタンパク質を発現する腸クロム親和性細胞内のエンドソームへエンドサイトーシスにより取り込まれることが可能な、腸クロム親和性細胞上の結合部位と結合可能なターゲティング部分(TM)と、
(iii)エンドソーム内からエンドソーム膜を介して腸クロム親和性細胞のサイトゾル内へ前記プロテアーゼをトランスロケートさせることが可能な転位置ドメインと、
を含む融合タンパク質の治療上有効量を前記対象者に対して投与することを含み、
但し、ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒(ホロトキシン)分子ではない。
本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質がオフサイト位置に移動し得る場合に(局所的なプロテアーゼにより)切断されやすい破壊的プロテアーゼ切断部位を含み得る。このアプローチは、オフサイト標的化のリスクを最小化するのに役立つ。したがって、本発明の融合タンパク質は、例えば、それぞれ出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたWO2010/094905及びWO2002/44199に記載の1つ以上の破壊的切断部位を含むように設計し得る。
ポリペプチドの送達
使用時、本発明は、ポリペプチドを含む医薬組成物を、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、アジュバント、噴霧剤、及び/又は塩から選択される少なくとも1つの成分と共に利用し得る。
本発明のポリペプチドは、経口、非経口、持続注入、移植、吸入、又は局所投与用に製剤化し得る。注射に適した組成物は、溶液、懸濁液、又は乳液、或いは使用前に適切なビヒクルに溶解又は懸濁させる乾燥粉末の形態にし得る。
局所送達手段は、経口又は胃内送達を含む。これに関して、腸溶性カプセル、又はマイクロスフェア等の他の微粒子系における処方を用いることができる。腹腔鏡手術による十二指腸への局所投与も可能である。局所投与の他の例には、(接着パッチを介した)経皮送達を含み得る。
投与の好適な経路は、全身、経口、腹腔鏡、及び/又は局所注射から選択される。
注射用の処方の場合、投与部位での保持を補助するため、或いは投与部位からのポリペプチドの除去を低減するため、医薬的活性物質が随意に含まれる。こうした医薬的活性物質の一例は、アドレナリン等の血管収縮剤である。こうした処方は、投与に続くポリペプチドの滞留時間を増加させ、これにより効果を増大及び/又は強化するという利点を有する。
本発明のポリペプチド投与の投与量の範囲は、所望の治療効果を発生させるものとなる。必要な投与量の範囲は、ポリペプチド又は組成物の正確な性質、投与経路、処方の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、範囲、又は重篤度、存在する場合は禁忌、及び主治医の判断により変化することは理解されよう。こうした投与量レベルの変化は、最適化のための標準となる経験的なルーチンを用いて調整することができる。
適切な1日投与量(患者の体重1kg当たり)は、0.0001乃至1mg/kg、好ましくは0.0001乃至0.5mg/kg、より好ましくは0.002乃至0.5mg/kg、特に好ましくは0.004乃至0.5mg/kgの範囲となる。単位投与量は、1マイクログラム未満乃至30mgで変化し得るが、一般には1用量当たり0.01乃至1mgの範囲となり、毎日、或いは好ましくは、毎週又は6ヶ月毎等の更に少ない頻度で投与し得る。
特に好適な投与方式は、1倍用量として2.5ngのポリペプチドに基づく。これに関連して、好適な投与量は、1倍乃至100倍(即ち、2.5乃至250ng)となる。
流体の剤形は、一般には、ポリペプチドとパイロジェンフリーの無菌ビヒクルとを利用して調製される。ポリペプチドは、使用されるビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクルに溶解又は懸濁させることができる。溶液の調製においては、ポリペプチドをビヒクルに溶解可能であり、溶液は、必要な場合には塩化ナトリウムの添加により等張性とし、無菌手法を用いた細菌濾過器による濾過により滅菌後、適切な無菌バイアル又はアンプルに充填して密封する。或いは、溶液安定性が十分である場合、密封容器内の溶液を、オートクレーブにより滅菌し得る。緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤、又は殺菌剤、懸濁化剤又は乳化剤、及び/又は局所麻酔剤等の添加剤をビヒクルに溶解し得るという利点を有する。
使用前に適切なビヒクルに溶解又は懸濁させる乾燥粉末は、事前に滅菌した材料を無菌区域において無菌手法を用いて無菌容器に充填することにより調製し得る。或いは、材料は、無菌区域において無菌手法を用いて適切な容器内に溶解させ得る。その後、製品を凍結乾燥させ、容器を無菌状態で密封する。
筋肉内、皮下、又は皮内注射に適した非経口懸濁物は、無菌成分を無菌ビヒクルに溶解ではなく懸濁させる点と、滅菌が濾過により達成できない点とを除き、実質的に同じ方法で調製される。成分は、無菌状態で単離してよく、或いは、単離後、例えば、ガンマ照射により滅菌してもよい。
懸濁化剤、例えば、ポリビニルピロリドンが組成物(群)に含まれ、成分の均一な分布を促進するという利点を有する。
本発明による投与は、微粒子カプセル化、ウイルス送達系、又は高圧エアロゾル衝突を含む様々な送達手法を利用し得る。
定義
ターゲティング部分(TM)は、結合部位と機能的に相互作用して、本発明のポリペプチドと標的細胞の表面との間の物理的結合を発生させる任意の化学構造を意味する。本発明に関して、標的細胞は、腸クロム親和性細胞である。TMという用語は、受容体仲介エンドサイトーシスとも呼ばれる内部移行(例えば、エンドソーム形成)が可能な、標的細胞上にある結合部位に結合することができる任意の分子(即ち、天然に存在する分子又は化学的/物理的に改変された変異体)を包含する。TMは、エンドソーム膜転位置機能を有してよく、この場合、別個のTM及び転位置ドメイン成分が本発明の剤に存在する必要はない。これまでの説明では、特定のTMを説明してきた。前記TMへの言及は、単なる例示であり、本発明は、例示したTMの基本的な結合(即ち、標的化)能力を保持する、その全ての変異体及び誘導体を含む。
本発明によるTMは、抗体(例えば、抗体断片)及び結合スキャフォールド、特に、標的細胞との(例えば、特異的な)結合を目的として設計された市販の抗体/断片及びスキャフォールドを含む。
タンパク質スキャフォールドは、本発明のTMとしてそれぞれ利用し得る、scFv、Fab分子、dAb(単一ドメイン抗体)、ラクダ類抗体、ダイアボディ、及びミニボディといった治療的なモノクローナル抗体及び誘導体の拡大中のレパートリを補完する、新世代の普遍的な結合の枠組みを表すものである。スキャフォールド系は、新規のスキャフォールドの形成又は公知のタンパク質結合ドメインの改変を介して、公知のタンパク質認識ドメインを形成又は改変する。こうしたスキャフォールドは、限定では無いが以下を含む。
(i)タンパク質Aに基づくスキャフォールド-アフィボディ(affibodies)((Nord, K. et al 1997 “Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain". Nat Biotechnol 15, 772-777)、
(ii)リポカリンに基づくキャフォールド-アンチカリン(anticalins)(Skerra 2008 “Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities". FEBS J. 275:2677-83)、
(iii) フィブロネクチンに基づくスキャフォールド-アドネクチン(adnectin)(Dineen et al 2008 “The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer". BMC Cancer 8:352)、
(iv)アビマ(avimers)(Silverman et al 2005 “Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains". Nat Biotechnol 23:1556-61)、
(v)アンキリンに基づくスキャフォールド-ダーピン(darpins)(Zahnd et al 2006 “Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins". J Biol Chem. 281:35167-75)、及び
(vi)センチリン(centyrin)スキャフォールド-CDRに類似するループを有するIgドメインとの有意な構造的相同性を有するタンパク質フォールドに基づく。Igドメインは、ヒトタンパク質における共通モジュールであり、代替スキャフォールドタンパク質として広く用いられている。上述した「スキャフォールド」の出版物は、それぞれ出典を明記することによりその開示内容(全体)を本願明細書の一部とする。
結合スキャフォールドは、特異的細胞表面タンパク質、受容体、又は糖類等の他の細胞表面エピトープとの相互作用を介して、特定の細胞型を標的とするために用いることができる。このような改変スカフォールドは、本発明の組換え非細胞傷害性プロテアーゼに基づくポリペプチド上に位置するように操作することができる。
本発明のTMは、問題となる腸クロム親和性標的細胞と結合する(好ましくは特異的に結合する)。「特異的に結合する」という用語は、好ましくは、特定のTMが、標的細胞と106M-1以上、好ましくは107M-1以上、より好ましくは108M-1以上、最も好ましくは109M-1以上の結合親和性(Ka)で結合することを意味する。「特異的に結合する」という用語は、更に、特定のTMが、特定の受容体、IL13受容体(例えば、IL13Rα1)、ソマトスタチン受容体(例えば、SSTR2又はSSTR5)、VPAC受容体(例えば、VPAC1又はVPAC2)、TGFβI受容体(例えば、TGFβRI又はTGFβRII)、タキキニン受容体(例えば、TAC1又はTAC2)、ガンマアミノ酪酸(GABA)受容体(例えば、GABAA受容体、特にα6又はβ2)、表皮成長因子(EGF)受容体(例えば、EGFR)、線維芽細胞成長因子受容体(例えば、FGFr2)、又はペプチドYY(PYY)受容体(例えば、神経ペプチドY受容体Y1又はY2)と、106M-1以上、好ましくは107M-1以上、より好ましくは108M-1以上、最も好ましくは109M-1以上の結合親和性(Ka)で結合することを意味する。
本明細書においてTMへの言及は、問題の標的細胞と結合する能力を保持するその断片及び変異体を包含する。一例として、変異体は、参照TM(例えば、TMを定義する、本明細書に記載の任意のSEQ ID NO)との少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも97又は少なくとも99％のアミノ酸配列相同性を有し得る。したがって、変異体は、アミノ酸の1つ以上の類似体(例えば非天然アミノ酸)又は置換結合を含み得る。更に、例えば、断片という用語は、TMとの関係において用いられる場合、参照TMの少なくとも10個、好ましくは少なくとも20個、より好ましくは少なくとも30個、最も好ましくは少なくとも40個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。断片という用語は、上述した変異体にも関連する。したがって、一例として、本発明の断片は、少なくとも10個、20個、30個、又は40個のアミノ酸を有するペプチド配列を含んでよく、当該ペプチド配列は、参照ペプチドの対応する(連続する)アミノ酸のペプチド配列に対して少なくとも80％の配列相同性を有する。
TMと選択された標的細胞との結合を確認することは、日常的に行われる。例えば、問題となる標的細胞を表す組織又は細胞を、過剰な非標識TMの存在下で、標識(例えばトリチウム標識)TMに曝露する単純な放射性変位実験を利用し得る。このような実験において、非特異的結合と特異的結合との相対的な割合を評価することにより、TMが標的細胞に結合することを確認し得る。アッセイは、1つ以上の結合アンタゴニストを随意に含んでよく、アッセイは、更に、TM結合の消失を観察することを含んでもよい。この種の実験の例は、Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311, In Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Pressにおいて確認することができる。
本発明に関連して、ペプチドTMへの言及は、対応する「参照」TMと同じ受容体にペプチド類似体が結合する限り、そのペプチド類似体を包含する。前記類似体は、以下のような合成残基を含み得る。
β-Nal=β-ナフチルアラニン
β-Pal=β-ピリジルアラニン
hArg(Bu)=N-グアニジノ-(ブチル)-ホモアルギニン
hArg(Et)2=N,N'-グアニジノ-(ジメチル)-ホモアルギニン
hArg(CH2CF3)2=N,N'-グアニジノ-ビス-(2,2,2,-トリフルオロエチル)-ホモアルギニン
hArg(CH3,ヘキシル)=N,N'-グアニジノ-(メチル,ヘキシル)-ホモアルギニン
Lys(Me)=Ne-メチルリシン
Lys(iPr)=Ne-イソプロピルリシン
AmPhe=アミノメチルフェニルアラニン
AChxAla=アミノシクロヘキシルアラニン
Abu=α-アミノ酪酸
Tpo=4-チアプロリン
MeLeu=N-メチルロイシン
Orn=オルニチン
Nle-ノルロイシン
Nva=ノルバリン
Trp(Br)=5-ブロモ-トリプトファン
Trp(F)=5-フルオロ-トリプトファン
Trp(N02)=5-ニトロ-トリプトファン
Gaba=γ-アミノ酪酸
Bmp=J-メルカプトプロピオニル
Ac=アセチル
Pen-ペニシラミン
本発明の融合タンパク質(本明細書においてポリペプチドとも呼ぶ)は、クロストリジウム神経毒の機能的HC又はHCCドメインが欠如していてもよい。一実施形態において、ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒ホロトキシンの50個のC末端アミノ酸が欠如している。他の実施形態において、ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒ホロトキシンの最後の100、150、200、250、又は300個のC末端アミノ酸残基が欠如している。或いは、突然変異誘発によりHC結合活性を無効化又は低減してよく、一例として、便宜上BoNT/Aを参照すると、ガングリオシド結合ポケットにおける1個又は2個のアミノ酸残基突然変異(W1266がL及びY1267がF)の改変により、HC領域は、その受容体結合機能を失う。類似の突然変異は、非血清型Aクロストリジウムペプチド成分、例えば、突然変異を有するボツリヌスB(W1262がL及びY1263がF)又はボツリヌスE(W1224がL及びY1225がF)に基づくコンストラクトに対して行われてもよい。活性部位に対する他の突然変異により、例えば、A型ボツリヌス毒素におけるY1267S及び他のクロストリジウム神経毒における対応する保存性の高い残基等で、Hc受容体結合活性が同様に除去される。この突然変異及び他の突然変異の詳細は、出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部としたRummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634)に記載されている。
天然クロストリジウム神経毒のHCペプチドは、略400乃至440個のアミノ酸残基を含み、それぞれ略25kDaの2つの機能的に別個のドメイン、即ち、N末端領域(一般にHCNペプチド又はドメインと呼ばれる)及びC末端領域(一般にHCCペプチド又はドメインと呼ばれる)からなる。更に、C末端領域(HCC)は、C末端の160乃至200個のアミノ酸残基により構成され、クロストリジウム神経毒の、その自然細胞受容体、即ち、神経筋接合部の神経終末に対する結合に関与することが十分に立証されている。したがって、本明細書の全体を通して、天然のクロストリジウム神経毒が結合する細胞表面受容体に対して重鎖が結合できないように機能的重鎖HCペプチド(又はドメイン)が欠如したクロストリジウム重鎖への言及は、単にクロストリジウム重鎖に機能的HCCペプチドが欠如していることを意味する。換言すれば、HCCペプチド領域は、一部又は全体が除去、又は他の形で(例えば、従来の化学処理又はタンパク質分解処理により)改変され、神経筋接合部の神経終末に対するその天然の結合能力が不活性化されている。
したがって、一実施形態において、本発明のクロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒のC末端ペプチド部分(HCC)が欠如しており、したがって、天然のクロストリジウム神経毒のHC結合機能が欠如している。一例として、一実施形態において、C末端伸長クロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒重鎖のC末端の40個のアミノ酸残基、又はC末端の60個のアミノ酸残基、又はC末端の80個のアミノ酸残基、又はC末端の100個のアミノ酸残基、又はC末端の120個のアミノ酸残基、又はC末端の140個のアミノ酸残基、又はC末端の150個のアミノ酸残基、又はC末端の160個のアミノ酸残基が欠如している。他の実施形態において、本発明のクロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒のC末端ペプチド部分(HCC)全体が欠如しているため、天然クロストリジウム神経毒のHC結合機能が欠如している。一例として、一実施形態において、クロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒重鎖のC末端の165個のアミノ酸残基、又はC末端の170個のアミノ酸残基、又はC末端の175個のアミノ酸残基、又はC末端の180個のアミノ酸残基、又はC末端の185個のアミノ酸残基、又はC末端の190個のアミノ酸残基、又はC末端の195個のアミノ酸残基が欠如している。他の例として、本発明のクロストリジウムHNペプチドには、以下からなる群から選択されるクロストリジウムHCC参照配列が欠如している。
A型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(Y1111-L1296)
B型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(Y1098-E1291)
C型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(Y1112-E1291)
D型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(Y1099-E1276)
E型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(Y1086-K1252)
F型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(Y1106-E1274)
G型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基(Y1106-E1297)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基(Y1128-D1315)
上述した参照配列は、目安と考えるべきであり、下位血清型により僅かな変動が生じ得る。
本発明のプロテアーゼは、真核細胞内の開口放出融合装置の1つ以上のタンパク質を切断可能な全ての非細胞傷害性プロテアーゼを包含する。
本発明のプロテアーゼは、好ましくは細菌プロテアーゼ(又はその断片)である。より好ましくは、細菌プロテアーゼは、クロストリジウム又はナイセリア/連鎖球菌属から選択される(例えば、クロストリジウムL鎖、又は好ましくはN.gonorrhoeae又はS.pneumoniae由来のナイセリアIgAプロテアーゼ)。非細胞傷害性プロテアーゼの他の例には、ブラジルサソリTityus serrulatusの毒に由来するもの等のサソリ毒プロテアーゼ、又はプロテアーゼアンタレアーゼである。
本発明は、更に、変異型非細胞傷害性プロテアーゼ(即ち、天然に存在するプロテアーゼ分子の変異体)を、その変異体プロテアーゼが必要なプロテアーゼ活性を依然として示す限りは含む。一例として、変異体は、参照プロテアーゼ配列との少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％、又は少なくとも98％のアミノ酸配列相同性を有し得る。したがって、変異体という用語は、エンドペプチダーゼ活性が増進(又は減少)した非細胞傷害性プロテアーゼを含み、これについては、特に、BoNT/A変異体Q161A、E54A、及びK165LのKcat/Kmの増加が挙げられ、出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部としたAhmed, S.A. (2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8を参照されたい。断片という用語は、プロテアーゼに関して用いる場合、一般には、参照プロテアーゼの少なくとも150個、好ましくは少なくとも200個、より好ましくは少なくとも250個、最も好ましくは少なくとも300個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。TM「断片」成分(上述)と同様に、本発明のプロテアーゼ「断片」は、参照配列に基づく変異型プロテアーゼの断片を包含する。
本発明のプロテアーゼは、好ましくはセリン又はメタロプロテアーゼ活性(例えば、エンドペプチダーゼ活性)を示す。プロテアーゼは、好ましくはSNAREタンパク質(例えば、SNAP-25、シナプトブレビン/VAMP、又はシンタキシン)に対して特異的である。
特に、神経毒のプロテアーゼドメイン、例えば、細菌神経毒のプロテアーゼドメインが挙げられる。したがって、本発明には、天然に存在する神経毒ドメインと、前記天然に存在する神経毒を組換えにより調製したものとの使用が含まれる。
神経毒の例は、クロストリジウム属により生成されるものであり、クロストリジウム神経毒という用語は、C.tetani(TeNT)、及びC.botulinum(BoNT)血清型A-Gにより生産される神経毒と、C.baratii及びC.butyricumにより生産される近縁のBoNT様神経毒とを包含する。上述した略語は、本明細書全体を通して使用する。例えば、BoNT/Aという命名法は、神経毒の供給源をBoNT(血清型A)として示す。対応する命名法は、他のBoNT血清型にも当てはまる。
BoNTは、知られている最も強力な毒素であり、マウスに対する半数致死量(LD50)の値は、血清型に応じて0.5乃至5ng/kgの範囲となる。BoNTは、胃腸管に吸収され、全身循環に入った後、コリン作動性神経終末のシナプス前膜に結合し、その神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を妨げる。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、及びBoNT/Gは、シナプトブレビン/小胞関連膜タンパク質(VAMP)を切断し、BoNT/C、BoNT/A、及びBoNT/Eは、25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP-25)を切断し、BoNT/Cは、シンタキシンを切断する。
BoNTは、約150kDaの二本鎖タンパク質である共通の構造を有し、約50kDaの軽鎖(L鎖)と単一ジスルフィド結合により共有結合した約100kDaの重鎖(H鎖)からなる。H鎖は、それぞれ約50kDaの2つのドメインからなる。C末端ドメイン(HC)は、高親和性ニューロン結合に必要であり、N末端ドメイン(HN)は、膜転位置に関与することが示唆されている。L鎖は、基質SNAREタンパク質の切断に関与する亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。
L鎖断片という用語は、神経毒のL鎖の成分を意味し、この断片は、メタロプロテアーゼ活性を示し、細胞のエキソサイトーシスに関与する小胞及び/又は形質膜関連タンパク質をタンパク分解性に切断することが可能である。
適切なプロテアーゼ(参照)配列の例は以下を含む。
A型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (1-448)
B型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (1-440)
C型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (1-441)
D型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (1-445)
E型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (1-422)
F型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (1-439)
G型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (1-441)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基 (1-457)
IgAプロテアーゼ - アミノ酸残基 (1-959)*
*出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部としたPohlner, J. et al. (1987). Nature 325, pp.458-462
上述した参照配列は、目安と考えるべきであり、下位血清型により僅かな変動が生じ得る。一例として、US2007/0166332(出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部とする)では、僅かに異なるクロストリジウム配列を引用している。
A型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (M1-K448)
B型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (M1-K441)
C型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (M1-K449)
D型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (M1-R445)
E型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (M1-R422)
F型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (M1-K439)
G型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (M1-K446)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基 (M1-A457)
軽鎖を含む様々なクロストリジウム毒素断片は、これらの軽鎖断片が神経伝達物質放出器官のコア成分を特異的に標的にすることが可能であり、これによりクロストリジウム毒素が基質をタンパク分解性に切断する全体的な細胞機構の達成に関与できる場合、本発明の態様において有用となり得る。クロストリジウム毒素の軽鎖は、略420乃至460アミノ酸長を有し、酵素ドメインを含む。研究により、酵素ドメインの酵素活性には、クロストリジウム毒素軽鎖の全長を必要としないことが分かっている。非限定的な例として、BoNT/A軽鎖の最初の8個のアミノ酸は、酵素活性に必要ではない。他の非限定的な例として、TeNT軽鎖の最初の8個のアミノ酸は、酵素活性に必要ではない。同様に、軽鎖のカルボキシル末端は、活性に必要ではない。非限定的な例として、BoNT/A軽鎖の最後の32個のアミノ酸(残基417乃至448)は、酵素活性に必要ではない。他の非限定的な例として、TeNT軽鎖の最後の31個のアミノ酸(残基427乃至457)は、酵素活性に必要ではない。したがって、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも350個のアミノ酸、少なくとも375個のアミノ酸、少なくとも400個のアミノ酸、少なくとも425個のアミノ酸、及び少なくとも450個のアミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含むことができる。この実施形態の他の態様は、例えば多くとも350個のアミノ酸、多くとも375個のアミノ酸、多くとも400個のアミノ酸、多くとも425個のアミノ酸、及び多くとも450個のアミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含むことができる。
適切な非細胞傷害性プロテアーゼの他の例は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたWO2007/106115に詳細に記載されている。
一実施形態において、非細胞傷害性プロテアーゼは、SNAP-23タンパク質等の非神経性SNAREタンパク質を切断する。一実施形態において、非細胞傷害性プロテアーゼは、SNAP-23を切断可能な改変ボツリヌス毒素L鎖である。こうした改変L鎖の例は、Chen and Barbieri, PNAS, vol. 106, no. 23, p9180-9184, 2009に記載されている。
一実施形態において、非細胞傷害性プロテアーゼは、BoNT/A、BoNT/C、又はBoNT/Eプロテアーゼであり、好適なSNAREモチーフは、SNAP(例えば、SNAP25)モチーフである。
他の実施形態において、非細胞傷害性プロテアーゼは、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、若しくはBoNT/G、又は破傷風神経毒(TeNT)プロテアーゼであり、好適なSNAREモチーフは、VAMPモチーフである。
他の実施形態において、非細胞傷害性プロテアーゼは、BoNT/C1プロテアーゼであり、好適なSNAREモチーフは、シンタキシンモチーフである。
本発明の非細胞傷害性プロテアーゼは、異なる切断部位配列を認識し、そのため僅かに異なる切断特異性を有する。
Figure 2016509997
他の例として、以下の認識配列及び切断部位を挙げる。
Figure 2016509997
Figure 2016509997
Figure 2016509997
本発明のポリペプチド、特にそのプロテアーゼ成分は、PEG化してよく、これにより、安定性、例えば、プロテアーゼ成分の作用の持続時間を増加させ得る。PEG化は、プロテアーゼがBoNT/A、B、又はC1プロテアーゼを含む場合に特に、好適となる。PEG化は、好ましくは、プロテアーゼ成分のN末端に対するPEGの追加を含む。一例として、プロテアーゼのN末端は、同一又は異なるものにしてよい1個以上のアミノ酸(例えば、システイン)残基により伸長し得る。1つ以上の前記アミノ酸残基は、それ自体に結合された(例えば、共有結合された)PEG分子を有し得る。この手法の例は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたWO2007/104567に記載されている。
転位置ドメインは、プロテアーゼ活性の機能発現が標的細胞のサイトゾル内で生じるように、プロテアーゼの標的細胞内への転位置を可能にする分子である。任意の分子(例えば、タンパク質又はペプチド)が本発明の必要な転位置機能を有するかは、従来の多数のアッセイの何れか1つにより確認し得る。
例えば、Shone C. (1987)は、リポソームを利用し、これを試験分子に曝露するインビトロアッセイを説明している。必要な転位置機能の存在は、容易に観測し得るK+及び/又は標識NADのリポソームからの放出により確認される[Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180参照]。
他の例は、Blaustein R. (1987)により、平面リン脂質二分子膜を利用する単純なインビトロアッセイが記載されている。膜を試験分子に曝露し、前記膜を介したコンダクタンスの増加により必要な転位置機能を確認する[Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120を参照]。
膜融合の評価を可能にし、これにより本発明での使用に適した転位置ドメインの同定を可能にする他の方法は、Methods in Enzymology Vol 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993に記載されている。
本発明は、更に、必要な転位置活性を変異型転位置ドメインが依然として示す限り、その変異型転位置ドメインを含む。一例として、変異体は、参照転位置ドメインに対して、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％、又は少なくとも98％のアミノ酸配列相同性を有し得る。断片という用語は、転位置ドメインに関して用いる場合、参照転位置ドメインの少なくとも20個、好ましくは少なくとも40個、より好ましくは少なくとも80個、最も好ましくは少なくとも100個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。クロストリジウム転位置ドメインの場合、断片は、好ましくは、参照転位置ドメイン(例えば、HNドメイン)の少なくとも100個、好ましくは少なくとも150個、より好ましくは少なくとも200個、最も好ましくは少なくとも250個のアミノ酸残基を有する。TM「断片」成分(上述)と同様に、本発明の転位置「断片」は、参照配列に基づく変異型転位置ドメインの断片を包含する。
転位置ドメインは、好ましくは、低pH条件下で脂質膜にイオン透過性の孔を形成することができる。エンドソーム膜内での孔形成可能なタンパク質分子のこうした部分のみを用いることが好ましいことが分かっている。
転位置ドメインは、微生物タンパク質源、特に細菌又はウイルスタンパク質源から取得し得る。そのため、一実施形態において、転位置ドメインは、細菌毒素又はウイルスタンパク質等の酵素の転位置ドメインである。
細菌毒素分子の特定のドメインが、こうした孔を形成可能であることは、十分に立証されている。ウイルスにより発現される膜融合タンパク質の特定の転位置ドメインが、こうした孔を形成可能であることも知られている。このようなドメインは、本発明において利用し得る。
転位置ドメインは、HNドメイン(又はその機能成分)等、クロストリジウムを起源とするものにし得る。HNは、H鎖のアミノ末端側の半分と略同等のクロストリジウム神経毒のH鎖の一部若しくは断片、又は完全なH鎖における、その断片に対応するドメインを意味する。これに関連して、HC細胞結合機能を除去することが望ましい場合、これは、HC又はHCCアミノ酸配列を(DNA合成レベル又はヌクレアーゼ若しくはプロテアーゼ処理による合成後のレベルで)欠失させることにより達成し得る。或いは、HC機能は、化学的又は生物学的処理により不活性化し得る。
適切な(参照)転位置ドメインの例は以下を含む。
A型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (449-871)
B型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (441-858)
C型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (442-866)
D型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (446-862)
E型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (423-845)
F型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (440-864)
G型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (442-863)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基 (458-879)
上述した参照配列は、目安と考えるべきであり、下位血清型により僅かな変動が生じ得る。一例として、US2007/0166332(出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部とする)では、僅かに異なるクロストリジウム配列を引用している。
A型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (A449-K871)
B型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (A442-S858)
C型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (T450-N866)
D型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (D446-N862)
E型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (K423-K845)
F型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (A440-K864)
G型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (S447-S863)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基 (S458-V879)
適切な転位置ドメインの他の例は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部としたWO2007/106115に詳細に記載されている。
本発明に関連して、転位置ドメインを含む様々なクロストリジウム毒素HN領域は、これらの活性断片が非細胞傷害性プロテアーゼ(例えば、クロストリジウムL鎖)の細胞内小胞から標的細胞の細胞質への放出を促進して、クロストリジウム毒素が基質をタンパク分解性に切断する全体的な細胞機構の達成に関与できる場合、本発明の態様において有用となり得る。クロストリジウム毒素の重鎖からのHN領域は、略410乃至430アミノ酸長を有し、転位置ドメインを含む。研究により、転位置ドメインの転位置活性には、クロストリジウム毒素重鎖のHN領域の全長を必要としないことが分かっている。したがって、本実施形態の態様は、例えば、少なくとも350個のアミノ酸、少なくとも375個のアミノ酸、少なくとも400個のアミノ酸、及び少なくとも425個のアミノ酸の長さを有する転位置ドメインを含むクロストリジウム毒素HN領域を含むことができる。本実施形態の他の態様は、例えば、多くとも350個のアミノ酸、多くとも375個のアミノ酸、多くとも400個のアミノ酸、及び多くとも425個のアミノ酸の長さを有する転位置ドメインを含むクロストリジウム毒素HN領域を含むことができる。
Clostridium botulinum及びC.tetaniにおける毒素生成の遺伝学的基礎に関する詳細については、The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press内のHenderson et al (1997)を参照されたい。
HNという用語は、天然に存在する神経毒HN部分を含むと共に、天然に存在しないアミノ酸配列及び/又は合成アミノ酸残基を有する改変HN部分を、その改変HN部分が上述した転位置機能を依然として示す限り包含する。
或いは、転位置ドメインは、非クロストリジウム起源のものとし得る。非クロストリジウム(参照)転位置ドメイン起源の例には、限定では無いが、ジフテリア毒素の転位置ドメイン[O=Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206、Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532、及びLondon, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51]、シュードモナス外毒素A型の転位置ドメイン[Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559]、炭疽毒素の転位置ドメイン[Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442]、転位置機能性の様々な融合性又は疎水性ペプチド[Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924、及び Wagner et al (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938]、及び両親媒性ペプチド[Murata et al (1992) Biochem., 31, pp.1986-1992]が含まれる。転位置ドメインは、天然に存在するタンパク質内に存在する転位置ドメインをそのまま反映してよく、或いは、転位置ドメインの転位置能力を破壊しない限りアミノ酸の変化を含み得る。
本発明での使用に適したウイルス(参照)転位置ドメインの特定の例は、ウイルス発現膜融合タンパク質の特定の転位置ドメインを含む。例えば、Wagner et al. (1992)およびMurata et al. (1992)は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素のN末端領域に由来する多数の融合性及び親水性ペプチドの転位置(即ち、膜融合および小胞形成)機能を記載している。所望の転位置活性を有することが知られている他のウイルス発現膜融合タンパク質は、セムリキ森林ウイルス(SFV)の融合性ペプチドの転位置ドメイン、水疱性口内炎ウイルス(VSV)糖タンパク質Gの転位置ドメイン、SERウイルスFタンパク質の転位置ドメイン、及び泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質の転位置ドメインである。ウイルスによりコードされたスパイクタンパク質、例えば、SFVのE1タンパク質及びVSVのGタンパク質のGタンパク質は、本発明に関連して特定の用途を有する。
表(下記)に列挙した(参照)転位置ドメインの使用は、それらの配列変異体の使用を含む。変異体は、その変異体が必要な転位置機能を保有する場合、1つ以上の保存的な核酸置換及び/又は核酸欠失若しくは挿入を含み得る。変異体は、その変異体が必要な転位置機能を保有する限り、1つ以上のアミノ酸置換及び/又はアミノ酸欠失若しくは挿入を含み得る。
Figure 2016509997
本発明のポリペプチドは、更に、転位置促進ドメインを含み得る。前記ドメインは、標的細胞のサイトゾルへの非細胞傷害性プロテアーゼの送達を促進し、例えば、出典を明記することによりその開示内容を本願明細書の一部としたWO08/008803及びWO08/008805に記載されている。
一例として、適切な転位置促進ドメインは、エンベロープウイルス融合性ペプチドドメインを含み、例えば、適切な融合性ペプチドドメインは、インフルエンザウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、23アミノ酸のA型インフルエンザウイルス融合性ペプチドドメイン)、アルファウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、26アミノ酸のセムリキ森林ウイルス融合性ペプチドドメイン)、ベシクロウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、21アミノ酸の水泡性口内炎ウイルス融合性ペプチドドメイン)、レスピロウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、25アミノ酸のセンダイウイルス融合性ペプチドドメイン)、モルビリウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、25アミノ酸のイヌジステンパウイルス融合性ペプチドドメイン)、アブラウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、25アミノ酸のニューカッスル病ウイルス融合性ペプチドドメイン)、ヘニパウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、25アミノ酸のヘンドラウイルス融合性ペプチドドメイン)、メタニューモウイルス融合性ペプチドドメイン(例えば、25アミノ酸のヒトメタニューモウイルス融合性ペプチドドメイン)、若しくはサル泡沫状ウイルス融合性ペプチドドメイン等のスプマウイルス融合性ペプチドドメイン、又はその断片若しくは変異体を含む。
他の例として、転位置促進ドメインは、クロストリジウム毒素HCNドメイン又はその断片若しくは変異体を含み得る。更に詳しくは、クロストリジウム毒素HCN転位置促進ドメインは、少なくとも200個のアミノ酸、少なくとも225個のアミノ酸、少なくとも250個のアミノ酸、少なくとも275個のアミノ酸の長さを有し得る。これに関連して、クロストリジウム毒素HCN転位置促進ドメインは、好ましくは、多くとも200個のアミノ酸、多くとも225個のアミノ酸、多くとも250個のアミノ酸、又は多くとも275個のアミノ酸の長さを有する。具体的な(参照)例は以下を含む。
A型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (872-1110)
B型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (859-1097)
C型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (867-1111)
D型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (863-1098)
E型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (846-1085)
F型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (865-1105)
G型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (864-1105)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基 (880-1127)
上述した配列位置は、血清型/サブタイプに応じて僅かに変化する場合があり、適切な(参照)クロストリジウム毒素HCNドメインの他の例は以下を含む。
A型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (874-1110)
B型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (861-1097)
C型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (869-1111)
D型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (865-1098)
E型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (848-1085)
F型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (867-1105)
G型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (866-1105)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基 (882-1127)
上述した促進ドメインは、何れも本発明での使用に適した上述の転位置ドメインペプチドの何れかと組み合わせてよい。したがって、一例として、非クロストリジウム促進ドメインは、非クロストリジウム転位置ドメインペプチド又はクロストリジウム転位置ドメインペプチドと組み合わせてよい。或いは、クロストリジウム毒素HCN転位置促進ドメインは、非クロストリジウム転位置ドメインペプチドと組み合わせてよい。或いは、クロストリジウム毒素HCN促進ドメインは、クロストリジウム転位置ドメインペプチドと組み合わせてよく、その例は以下を含む:
A型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (449-1110)
B型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (442-1097)
C型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (450-1111)
D型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (446-1098)
E型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (423-1085)
F型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (440-1105)
G型ボツリヌス神経毒 - アミノ酸残基 (447-1105)
破傷風神経毒 - アミノ酸残基 (458-1127)
配列相同性
同一性百分率は、限定では無く、グローバル法、ローカル法、及び、例えばセグメントアプローチ法等のハイブリッド法を含む様々な配列アラインメント方法の何れかを用いて決定することができる。同一性百分率を決定するためのプロトコルは、当業者の範囲内の日常の手順である。グローバル法は、配列を分子の最初から最後まで整列させ、個々の残基対のスコアを合計すると共に、ギャップペナルティを与えることにより、最善のアラインメントを決定する。非限定的な方法には、例えば、CLUSTAL W(例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)参照)及び反復改良(例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)参照)が含まれる。ローカル法は、入力配列の全てが共有する1つ以上の保存モチーフを同定することにより配列を整列させる。非限定的な方法には、例えば、Match-box(例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)参照)、ギブスサンプリング(例えば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131 ) Science 208-214 (1993)参照)、Align-M(例えば、Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)参照)が含まれる。
したがって、配列同一性百分率は、従来の方法により決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。簡単に言うと、ギャップ開始ペナルティとして10、ギャップ伸長ペナルティとして1、及び以下に示すようなHenikoff and Henikoff(前掲)の「blosum62」スコア行列(アミノ酸を標準の1文字コードで示す)を用いてアラインメントスコアを最適化するように2つのアミノ酸配列を整列させる。
Figure 2016509997
次に同一性百分率を以下のように計算する。
Figure 2016509997
実質的に相同なポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有することを特徴とする。こうした変化は、好ましくは軽微な性質のものであり、即ち、保存的アミノ酸置換(下記参照)及びポリペプチドの折り畳み又は活性に著しく影響しない他の置換、一般には1乃至約30個のアミノ酸の僅かな欠失、及びアミノ末端メチオニン残基、約20乃至25残基までの小さなリンカーペプチド、若しくはアフィニティタグ等の僅かなアミノ又はカルボキシル末端伸長である。
Figure 2016509997
20種類の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸(例えば4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリジン、2-アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα-メチルセリン)により、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換し得る。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸により、クロストリジウムポリペプチドアミノ酸残基を置換し得る。本発明のポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことができる
天然に存在しないアミノ酸は、限定では無く、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノ-プロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-スレオニン、メチル-スレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ-システイン、ニトロ-グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、及び4-フルオロフェニルアラニンを含む。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むために、当該技術分野において幾つかの方法が知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサtRNAを用いてナンセンス変異を抑制したインビトロ系を利用することができる。アミノ酸及びアミノアシル化tRNAを合成するための方法は、当該技術分野において公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E.coli S30抽出物と、市販の酵素及び他の試薬とを含む無細胞系において実施される。タンパク質は、クロマトグラフィにより精製する。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991、 Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991、 Chung et al., Science 259:806-9, 1993、及びChung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993を参照されたい。第2の方法において、翻訳は、アフリカツメガエル卵母細胞において、変異mRNA及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサtRNAのマイクロインジェクションにより実施される(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996)。第3の方法では、大腸菌細胞を、置換対象の天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)が存在せず、所望の天然に存在しないアミノ酸(群)(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、又は4-フルオロフェニルアラニン)が存在する状態で培養する。天然に存在しないアミノ酸は、自然状態での対応物の代わりにポリペプチドに取り込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾により、天然に存在しない種に変換することができる。化学修飾は、部位特異的突然変異誘発と組み合わせて、置換の範囲を更に拡大することができる(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。
限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び非天然アミノ酸により、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換し得る。
本発明のポリペプチド内の必須のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発等、当該技術分野において公知の手順により同定することができる(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989)。生物学的相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性標識のような手法により決定されるような構造の物理解析により、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と組み合わせて決定することもできる。例えば、de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992を参照されたい。必須のアミノ酸の同定は、本発明のポリペプチドの関連成分(例えば、転位置又はプロテアーゼ成分)との相同性の解析から推測することもできる。
多重アミノ酸置換を、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)により開示されるもの等、公知の突然変異誘発及びスクリーニング方法を用いて実施及び試験することができる。簡単に言うと、これらの執筆者は、ポリペプチド内の2つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、その後、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して、各位置で許容される置換の範囲を決定する方法を開示している。使用可能な他の方法には、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991、Ladnerらの米国特許第5,223,409号、HuseのWIPO公開番号WO92/06204)と、領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)とが含まれる。
多重アミノ酸置換を、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)により開示されるもの等、公知の突然変異誘発及びスクリーニング方法を用いて実施及び試験することができる。簡単に言うと、これらの執筆者は、ポリペプチド内の2つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、その後、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して、各位置で許容される置換の範囲を決定する方法を開示している。使用可能な他の方法には、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991、Ladnerらの米国特許第5,223,409号、HuseのWIPO公開番号WO92/06204)と、領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)とが含まれる。
一実施形態において、TMは、VIP受容体及び/又はCRH受容体と実質的に結合しない。
一実施形態において、TMは、PACAP(1-38)若しくはVIPペプチド、又はCRHペプチドではない。
次に、本発明の態様及び/又は実施形態を例示する各図を簡単に説明する。
ポリペプチドを、骨粗鬆症の患者に投与するために調製し、骨粗鬆症の抑制又は治療のための方法を提供する。本発明において定義されるように、調製したポリペプチドのターゲティング部分(TM)成分は、腸クロム親和性細胞上に存在する受容体に(特異的に)結合する。その後、転位置成分により、ポリペプチドの非細胞傷害性プロテアーゼ成分が輸送され、腸クロム親和性細胞内部に入ると、その細胞からのセロトニン分泌を阻害する。したがって、ポリペプチドは、血清セロトニンのレベルを低下させ、骨粗鬆症を抑制又は治療することができる。
実施例1
閉経後の60歳の前屈姿勢の女性患者は、多発性の脊椎骨折に起因する消耗性の慢性疼痛を有する。配偶者が最近亡くなり、自分自身の面倒をみることに苦労している。ホルモン補充療法(HRT)後、体重が著しく増加し、結果的に移動することが少なくなる。治療は、IL13146ペプチドリガンドを含む本発明のポリペプチド0.025mg/kgを皮下注射することで行う(6ヶ月間に亘り毎週注射)。セロトニン放出の阻害が、骨強度の増加と、姿勢の顕著な改善につながる。患者は、疼痛が有効に緩和され、脆弱性による骨折が以後生じていないことを報告する。
実施例2
60歳の男性患者は、慢性的な背部痛を訴え、古典的な老人性円背の重症例を示す。患者は、農業に従事しているが、状態の悪化から3ヶ月に亘り農場の世話ができずにいる。コルチスタチン(CST)ペプチド類似体(D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-THr-Phe-TH-NH2[BIM-23268])を含む本発明のポリペプチド0.07mg/kgの非経口懸濁物を、腹腔鏡下での十二指腸注入により投与する(6ヶ月の注入計画)。背部痛の減少を含む肯定的な結果が、治療から1ヶ月以内に報告される。
実施例3
骨粗鬆症の家族歴を有する87歳の女性患者は、2ヶ月間に、肋骨を5回、手首を1回骨折している。骨折は、身体の健康及び生活の質に大きな影響を与えている。TP3805ペプチドを含む本発明のポリペプチドを、毎週0.09mg/kgの投与量で静脈内投与する。以後、治療期間に亘り、患者の医師から骨折は報告されない。
実施例4
30歳の女性喘息患者は、吸入グルココルチコイド薬プレドニゾン(7.5mg)を服用している。重篤な喘息状態に対する第2選択治療として、長期(25年超)に亘り投薬を受けている。最近、患者は、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症の症状(クッシング症候群に類似)の可能性を示し、ジムでの軽い衝撃の転倒後、手首を折る。担当医師は、TGFβ1を含む本発明のポリペプチド0.015mg/kgの月毎の静脈注射による投与を処方する。以後、6ヶ月の治療中、患者は、骨折を報告しない。
実施例5
65歳の女性患者は、ガーデニング中の転倒に続き、手首を2カ所骨折している。患者は、ラトビア北部から10年前に移住したことを明らかにしており、佝僂病の病歴を有する。患者は、ビタミンD及びカルシウム補給剤に加えて、ウロコルチンを含む本発明のポリペプチド0.05mg/kgの毎月の静脈注射を処方された。患者は、回復速度の改善を報告すると共に、治療後3ヶ月間に、更なる骨の損傷を報告しない。
実施例6
神経性食欲不振症の16歳の女性患者は、階段を降りる途中で転落する。患者は、肋骨3ヵ所と両手首を骨折している。患者の月経周期は、この疾患の後期では一般的な無月経として知られる状態で既に停止している。その後の典型として骨粗鬆症が生じ、骨密度が低下する。患者は、P物質を含む本発明のポリペプチドのカプセル剤0.1mg/kgの毎月の経口投与を処方された。患者は、治療後、状態の改善を報告する。
実施例7
77歳の乳糖不耐症の男性患者は、犬の散歩中に転倒する。患者は、両手首を骨折し、急性痛を有する。従来のX線走査により、骨密度が低いことが明らかとなり、骨粗鬆症と診断される。臨床医は、GABA受容体α6に結合して血中への腸セロトニンの分泌を阻害するターゲティング部分を含む本発明のポリペプチド0.001mg/kg(8週間毎の局所腹腔鏡注入)を処方する。2ヶ月後、臨床医は、骨の強化を示唆する良好な経過を報告する。
実施例8
88歳の女性患者は、3年間に亘り骨粗鬆症を患い、手首、肋骨、及び脚部に複数の骨折を生じている。診断後、患者は、老人介護施設への予期せぬ入居を含め、全体的な生活の質の低下を感じている。患者は、エピレグリンを含む本発明のポリペプチド0.07mg/kgの毎月の注射による骨粗鬆症の治療を受ける。6ヶ月の治療プログラム中、患者は、更なる骨折/骨の損傷を報告しない。
実施例9
重度の関節リウマチを有する59歳の男性患者は、その後、膝関節周囲の滑膜の炎症により骨粗鬆症を発症している。炎症により、膝の骨に損傷が生じると共に、X線走査において骨密度の低下が確認され、膝の骨折を繰り返している。患者の医師は、3ヶ月毎に腹腔鏡下での十二指腸注入により投与される、PF-FGF-1を含む本発明のポリペプチド0.1mg/kgを処方する。治療後1ヶ月、患者は、更なる骨折を報告しない。
実施例10
94歳の骨粗鬆症を有する男性患者は、手首及び腰に多数の骨折を有する。患者の状態及び年齢での外科手術により治療は推奨されない。しかしながら、本発明のポリペプチドの経皮送達による骨粗鬆症の治療又は抑制は、患者に同様の危険因子を与えない。患者は、接着パッチを皮膚の表面に与薬し、2週間に亘りパッチからの遅延拡散によりポリペプチドを送達して治療する。経皮パッチは、12週間毎に交換し、更なる骨折は報告されない。
動物モデルの実施例
本発明のポリペプチドを、低骨質量症、即ち骨粗鬆症に対する治療として、卵巣摘出した齧歯動物を用いて試験する。臨床的に閉経後の女性に見られるように、この疾患モデルは、骨形成の増加よりも高い骨吸収の増加を示す。
実施例11
偽手術又は卵巣摘出を施した6週齢の雌のC57BL6/Jマウスに、卵巣摘出後1日目乃至28日目に1日体重1kg当たり1乃至250mgの範囲の用量で本発明のポリペプチドを一日一回摂食させる。
その結果は、1日体重1kg当たり250、100、更には10mgのポリペプチドで治療されたマウスは、対照の卵巣摘出マウスよりも高い骨質量を有し、マウスにおける卵巣摘出誘発性骨粗鬆症の発症を予防可能であることを示す。
実施例12
本発明のポリペプチドにより既存の卵巣摘出誘発性骨減少症からの回復も可能であるかを確認するために、偽手術又は卵巣摘出を施した6週齢のマウスを、2週間のみ治療せずに放置した後、4週間に亘りポリペプチドを毎日投与し(1日体重1kg当たり250mg)治療する。対照の卵巣摘出マウスは、骨吸収パラメータの増加に続いて、予期された骨減少症を発症する。これらのパラメータは、ポリペプチド治療を施した卵巣摘出マウスにおいても増加するが、しかしながら、これらのマウスでは、骨形成パラメータの増加が、骨質量を正常化させるような大きさのものとなる。血清セロトニン濃度は、80％減少するが、脳内セロトニン含有量は、ポリペプチド治療マウスでは影響を受けなかった。
実施例13
実施例12を繰り返すが、但し、6週齢卵巣摘出マウスを6週間治療せずに放置後、1日体重1kg当たり25、100、又は250mgの本発明のポリペプチドにより、その後6週間治療する。ポリペプチドは、骨形成パラメータを増加させることにより、骨質量に対する卵巣摘出の有害な影響を逆転させ、偽手術マウスにおいて見られたものと同様のレベル(1日体重1kg当たり25mg)又は、これより高いレベル(1日体重1kg当たり100又は250mg)まで増加させる。この骨質量の増加は、脊椎骨及び長骨に影響し、非卵巣摘出マウスにおいても存在する。治療群の何れにおいても、骨の長さ又は幅は変化していない。これらの結果は、ポリペプチドにより、骨同化機構を介して、マウスの卵巣摘出誘発性骨粗鬆症からの回復が、低用量(1日体重1kg当たり25mg)で、卵巣摘出から時間経過後に与えた場合でも可能であることを立証している。
実施例14
骨交替速度の増加を伴う骨の減少及びエストロゲンにより予防可能な特異的海綿状骨減少症等、エストロゲン欠乏症の成人骨格の幾つかの主要な特徴を再現することから、ラットを、閉経後骨粗鬆症の齧歯類モデルとして選択する。同様に、副甲状腺ホルモン(PTH)の簡潔注射を、任意の新しい骨同化剤との比較を行う基準とする。
そのため、12週齢の卵巣摘出ラットを、3又は12週間以上治療せずに放置し、重度の骨減少症を発生させる。その後、偽手術又は卵巣提出ラットを、4週間に亘り、比較的高用量のPTH(1日体重1kg当たり80μg、皮下)10又は量を増加させた本発明のポリペプチド(1日体重1kg当たり25、100、又は250mg、経口)により治療する。
脊椎骨の分析は、卵巣摘出から3週間後か12週間後かに関わらず、ポリペプチドが、ラットにおける卵巣摘出誘発性骨減少症を完全に回復させ、用いた最低用量(1日体重1kg当たり25mg)であっても有効であることを示す。
実施例15
未治療、PTH治療、ポリペプチド治療の卵巣摘出ラット由来の大腿骨及び脊椎骨試料に対して三点曲げ試験及び圧縮性解析を行い、骨質の2つの代替値として最大負荷及び剛性を決定することにより、骨質を評価する。両パラメータは、卵巣摘出後に低下し、PTH及び本発明のポリペプチド(1日体重1kg当たり250mg)での治療により偽手術ラットで見られる値まで回復する。したがって、ポリペプチドの毎日の経口投与により、ラットにおける骨の損失及び構造上の劣化を、用量依存的に回復させることができる。
単離した初代ヒト胃腺からのセロトニン放出による、本発明の融合タンパク質による阻害の測定
実施例16
胃腺は、Wroblewski et al. (2003) J. Cell Sci., 116, 3017-3026に記載の幽門洞粘膜の内視鏡ピンチ生検により単離する。生検組織は、カミソリの刃を用いて略2mm2の小片に切断する。組織切片を37℃に温めたハンクス平衡塩類溶液(HBSS)により3回洗浄し、5％CO2/95％O2による37℃でのガス処理及び毎分100サイクルでの振盪を継続しつつ、HBSS中の1mMジチオトレイトール(DTT)5mlにおいて15分間インキュベートする。次に、HBSS(37℃)を3回交換して組織を洗浄し、5mlのHBSS中の0.5mg.ml-1コラゲナーゼA中において30分間インキュベートして酵素的に解離させた後、HBSSにおいて再び洗浄し(37℃、3回)、更に30分間、コラゲナーゼ消化を行う(5ml、0.5mg.ml-1)。この段階で、広口ピペットを用いて組織を粉砕し、大きな組織断片を45秒間、重力で沈降させる。その後、上清を取り出し、清潔な氷冷ユニバーサルチューブに移送する。チューブを強く振り、更に胃腺を遊離させ、氷上で45分間沈殿させる。破片を含む上清を慎重に取り除き、廃棄する。単離された腺を含む残部を穏やかに混ぜ、組織培養プレートの各ウェルに均等に分割する。1人の患者の生検からの腺を、6ウェル細胞培養プレートの2つのウェルに分割し、セロトニン放出を調べる。
初代ヒト胃腺は、ダルベッコ改変イーグル培地/ハムF-12混合培地(DMEM/F-12)に10％(v/v)FBS、1％(v/v)抗生物質-抗真菌溶液、1％(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、及び1％(v/v)L-グルタミン溶液(200mM)を添加したものにおいて、37℃で、5％CO2/95％O2の加湿雰囲気中で培養する。腺は、単離後一晩付着させ、培地は毎日交換する
腺は、本発明の融合タンパク質と一晩プレインキュベート後、セロトニン分泌の阻害を評価する。セロトニン分泌を刺激するため、Ca2+(0.5-10mM)を10分間37℃で初代ヒト胃腺に添加する。対照の腺は、Ca2+の代わりに1mM EGTAにより処理する。刺激は、氷温の培地で急冷することにより終了させる。セロトニンと、その代謝産物である5-ヒドロキシインドール酢酸とを、組織と培地との両方から抽出し、逆相HPLCにより電気化学検出を用いて測定する。分泌されたセロトニンの量(培地に存在するものとして定義)を組織のセロトニン含有量に対して基準化する。Ca2+誘発性のセロトニン分泌を評価するため、対照培地の基準化セロトニン含有量を、刺激した細胞由来の培地におけるものから減算する。融合タンパク質による分泌阻害百分率は、次のように計算する:
(本発明の融合タンパク質により一晩前処理しない腺からの分泌)-(本発明の融合タンパク質により一晩前処理した腺からの分泌)/(本発明の融合タンパク質により一晩前処理しない腺からの分泌)×100。

Claims (10)

  1. 骨粗鬆症の抑制又は治療に用いるポリペプチドであって、
    (i)腸クロム親和性細胞内のSNAREタンパク質を切断することが可能な非細胞傷害性プロテアーゼと、
    (ii)前記SNAREタンパク質を発現する腸クロム親和性細胞内のエンドソームへエンドサイトーシスにより取り込まれることが可能な、腸クロム親和性細胞上の結合部位と結合可能なターゲティング部分(TM)と、
    (iii)エンドソーム内からエンドソーム膜を横断して腸クロム親和性細胞のサイトゾル内へ前記プロテアーゼを転位置させることが可能な転位置ドメインと、を含み、
    但し、クロストリジウム神経毒(ホロトキシン)分子ではないポリペプチド。
  2. 前記TMは、IL13受容体(例えば、IL13Rα1)、ソマトスタチン受容体(例えば、SSTR2又はSSTR5)、VPAC受容体(例えば、VPAC1又はVPAC2)、TGFβI受容体(例えば、TGFβRI又はTGFβRII)、タキキニン受容体(例えば、TAC1又はTAC2)、ガンマアミノ酪酸(GABA)受容体(例えば、GABAA受容体、特にα6又はβ2)、表皮成長因子(EGF)受容体(例えば、EGFR)、線維芽細胞成長因子受容体(例えば、FGFr2)、及びペプチドYY(PYY)受容体(例えば、神経ペプチドY受容体Y1又はY2)を含む群から選択される受容体に結合する、請求項1記載の用途のポリペプチド。
  3. 前記TMは、IL13Rα1、SSTR2、SSTR5、VPAC1、VPAC2、TGFβRI、TGFβRII、TAC1、TAC2、GABAA受容体α6、GABAA受容体β2、EGFR、FGFr2、神経ペプチドY受容体Y1、及び神経ペプチドY受容体Y2を含む群から選択される受容体に結合する、請求項1又は2記載の用途のポリペプチド。
  4. 前記TMは、IL13ペプチド、ソマトスタチンペプチド、TGFβIペプチド、P物質ペプチド、ジアゼパム結合阻害タンパク質(DBI)ペプチド、EGFペプチド、TGFαペプチド、ヘパリン結合EGF様成長因子(HB-EGF)ペプチド、アンフィレグリン(AR)ペプチド、ベタセルリン(BTC)ペプチド、エピレグリン(EPR)ペプチド、エピジェンペプチド、線維芽細胞成長因子(FGF)ペプチド、及びペプチドYY、又はその短縮型若しくはペプチド類似体からなる群から選択される、先行請求項の何れかに記載の用途のポリペプチド。
  5. 前記TMは、前記IL13受容体に結合する、先行請求項の何れかに記載の用途のポリペプチド。
  6. 前記TMは、IL13ペプチド又はその短縮型若しくはペプチド類似体に結合する、先行請求項の何れかに記載の用途のポリペプチド。
  7. 前記非細胞傷害性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒L鎖又はIgAプロテアーゼを含む、先行請求項の何れかに記載の用途のポリペプチド。
  8. 前記転位置ドメインは、クロストリジウム神経毒転位置ドメインを含む、先行請求項の何れかに記載の用途のポリペプチド。
  9. 先行請求項の何れかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
  10. 患者の骨粗鬆症を抑制又は治療する方法であって、先行請求項の何れかに記載のポリペプチド又は核酸の有効量を前記患者に投与することを含む方法。
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