CN105102066A - 抑制骨质疏松的治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于抑制或治疗骨质疏松症的多肽，其中该多肽包含：非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶能够裂解肠嗜铬细胞中的SNARE蛋白；能够结合肠嗜铬细胞上的结合位点的靶向部分(TM)，所述结合位点能够进行胞吞作用以并入肠嗜铬细胞内的内体，且其中所述肠嗜铬细胞表达所述SNARE蛋白；和能够使所述蛋白酶从内体内易位、通过内体膜并且进入肠嗜铬细胞胞液的易位结构域；条件是所述多肽不是梭菌神经毒素(全毒素)分子。

Description

抑制骨质疏松的治疗剂
本发明提供用于抑制或治疗骨质疏松症的方法和组合物。
骨质疏松症是导致骨结构退化的低骨量疾病。这种退化可以将骨衰弱至几乎无创伤骨折这样的程度，导致生活质量差且预期寿命可能减少。在骨质疏松症中，骨矿物质密度(BMD)下降，骨微结构恶化和骨中蛋白质的量和种类改变。
主要由胶原蛋白和磷酸钙组成的骨组织在成骨细胞和破骨细胞介导的过程中发生不断的破坏和再合成(即骨重建)，成骨细胞产生新骨，而破骨细胞破坏骨。这些细胞的活性由大量细胞因子和生长因子调节。在所有骨质疏松症病例中基本机制在于骨质吸收与骨形成之间失衡。因为重整和再吸收骨的模式因患者与患者的不同而改变，所以认为几个不同因素导致了这一问题。影响细胞生长的重要化学物质(例如雌激素、睾酮、甲状旁腺素和维生素D)和血液因子牵涉该过程。任意这些因素水平的改变可以在骨质疏松症发生中起作用。
近来，已经确定，肠源性5-羟色胺(GDS)在指导骨重建中起作用。约90％的人体总5-羟色胺由肠中称作肠嗜铬细胞的专门内分泌细胞合成。一旦从肠嗜铬细胞中释放，则GDS在血清中循环。肠源性5-羟色胺(GDS)是成骨细胞增殖和骨形成的强有力抑制剂，其不影响骨质吸收。因此，改变GDS水平是改变骨重建中平衡的潜在方式，由此提供用于抑制或治疗骨质疏松症的方式。
总体而言，在50个人中的3位女性中有1位将因骨质疏松症而患有骨折(这一数字增加至在60个人中的2位女性中有1位)，而50个人中的5位男性中有1位将因骨质疏松症而患有骨折(这一数字增加至在60个中的3位男性中有1位)。根据世界卫生组织(WorldHealthOrganization)(WHO)的通告，骨质疏松症仅次于心血管疾病而成为全球健康问题。由于骨质疏松症影响正在增长中的中老年人群，所以它将给卫生保健系统提供了更大的负担。
目前用于骨质疏松症的治疗方法包括生活方式改变，例如膳食和锻炼，以及药物，包括钙、维生素D、二膦酸盐和激素替代疗法。然而，现存的治疗方法与不良副作用相关。因此，本领域中仍然需要用于抑制或治疗骨质疏松症的新药剂。
本发明解决了这一需求，其解决了上述的一个或多个问题。
发明概述
本发明通过提供用于抑制或治疗受试者(例如患者)的骨质疏松症的融合蛋白解决了上述的一个或多个问题，所述融合蛋白包含：
(i)非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶能够裂解肠嗜铬细胞中的SNARE蛋白；
(ii)能够结合到肠嗜铬细胞上的结合位点的靶向部分(TM)，所述结合位点能够进行胞吞作用以并入肠嗜铬细胞内的内体，且其中所述肠嗜铬细胞表达所述SNARE蛋白；和
(iii)能够使所述蛋白酶从内体内易位、通过内体膜并且进入肠嗜铬细胞胞液(cytosol)的易位结构域；
条件是所述多肽不是梭菌神经毒素(全毒素)分子。
第一个方面还包括用于抑制或治疗骨质疏松症的相应方法，该方法包含对患者施用治疗有效量的本发明的多肽。
发明详述
本发明的多肽不是天然存在的梭菌神经毒素分子(也称作梭菌全毒素)。梭菌全毒素是已知对人最致命性的神经毒素之一，且照此作为治疗分子存在明显限制。此外，在抑制骨质疏松症的环境中，梭菌全毒素与不期望的脱靶向位点相关，即靶向非-5-羟色胺分泌细胞。
在应用中，本发明的多肽结合肠嗜铬细胞。此后，易位成分实现蛋白酶成分转运入肠嗜铬细胞的胞液。最终，一旦在内部，则蛋白酶通过裂解存在于肠嗜铬细胞胞液中的SNARE蛋白抑制肠嗜铬细胞的细胞外融合过程。因此，通过使肠嗜铬细胞的细胞外融合器失活，本发明的多肽抑制5-羟色胺从其中分泌。因此，本发明的多肽降低血清5-羟色胺水平且由此能够抑制或治疗骨质疏松症。
本发明的多肽类提供超过其它治疗剂的显著优点在于它们具有抑制5-羟色胺从特异性靶细胞即肠嗜铬细胞中分泌的潜能。相反，其它提出的治疗剂寻求通过尝试非特异性阻断5-羟色胺合成或使用介导5-羟色胺作用的5-羟色胺受体的拮抗剂来降低血清5-羟色胺水平。然而，本发明提供特异性阻断5-羟色胺从其产生位点分泌的方式。
本发明的主要靶细胞是肠嗜铬细胞。肠嗜铬细胞位于十二指肠中并且是血清5-羟色胺来源。
本发明的融合蛋白在与相应‘游离’TM(即分离的TM本身)比较时一般显示对靶细胞减少的结合亲和力(在至多100-倍的区间内)。然而，尽管存在这一观察结果，但是本发明的融合蛋白令人意外地显示良好的效能。这可以归因于两个主要特征。首先，非细胞毒性蛋白酶成分是催化的–因此，几种这样的分子的治疗作用在靶细胞内被快速放大。其次，存在于靶细胞上的受体仅需要作为治疗剂进入的入口起作用，而不一定被刺激至实现配体-受体介导的药理学响应所需的水平。因此，可以以低于用于其它类型治疗分子所使用的剂量，其典型地以高微克至毫克(甚至高至几百毫克)用量施用，施用本发明的融合蛋白。相反，本发明的融合蛋白可以以远低于其的剂量施用，典型地至少低于其10-倍，且更典型地低于其100-倍。
非细胞毒性蛋白酶
本发明的TSI多肽类的生物活性成分是非细胞毒性蛋白酶。因此，一旦递送入靶细胞的胞液，则非细胞毒性蛋白酶成分在需要的靶细胞内实现SNARE裂解。由于SNARE蛋白是哺乳动物靶细胞内分泌过程的必需成分，所以其蛋白水解失活抑制/压制从所述靶细胞中分泌。
非细胞毒性蛋白酶是不杀伤细胞的离散类分子；反而它们通过抑制蛋白质合成以外的细胞过程起作用。非细胞毒性蛋白酶由各种高级生物体产生(例如植物和动物)–这样的高级生物体的实例是巴西全蝎。此外，非细胞毒性蛋白酶由各种微生物产生，特别是细菌，例如梭菌属(Clostridiumsp.)和奈瑟球菌属(Neisseriasp.)。
梭菌神经毒素代表主要的一组非细胞毒性分子，且包含两个通过二硫键彼此连接的多肽链。两个链中具有约100kDa分子量的称作重链(H-链)和具有约50kDa分子量的称作轻链(L-链)。L-链具有蛋白酶功能且显示对囊泡和/或牵涉细胞外过程的质膜相关(SNARE)蛋白(例如突触泡蛋白、突触融合蛋白、SNAP和/或VAMP)具有高度底物特异性。这些底物是细胞分泌器的重要成分。
最特别地来自淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)种类的奈瑟球菌属产生功能类似的非细胞毒性的毒素分子。这样的非细胞毒性蛋白酶的实例是IgA蛋白酶(参见WO99/58571)。类似的IgA蛋白酶由链球菌属(streptococci)、例如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)产生。
因此，在一个实施方案中，本发明的非细胞毒性蛋白酶可以是梭菌神经毒素蛋白酶或IgA蛋白酶(参见，例如WO99/032272)。非细胞毒性蛋白酶的另一个实例是蝎子毒液蛋白酶，例如来自巴西全蝎巴西钳蝎(Tityusserrulatus)的毒液的那些或蛋白酶antarease(参见，例如WO2011/022357)。
靶向部分(TM)
现在转到本发明的靶向部分(TM)成分。这种成分使本发明的多肽结合肠嗜铬细胞。TM优选是肽。TM典型地包含最多50个氨基酸残基，例如最多40个氨基酸残基或最多30个氨基酸残基或最大20个氨基酸残基。
如上所述，已经确定，血清5-羟色胺水平升高导致骨量减少，从而造成骨质疏松症。十二指肠的肠嗜铬细胞是血清5-羟色胺的来源。
在应用中，本发明的多肽结合肠嗜铬细胞。此后，易位成分将蛋白酶成分转运入肠嗜铬细胞的胞液。最终，一旦在内部，则蛋白酶通过裂解存在于肠嗜铬细胞胞液中的SNARE蛋白抑制肠嗜铬细胞的细胞外融合过程。因此，通过使肠嗜铬细胞的细胞外融合器失活，本发明的多肽抑制5-羟色胺从其中分泌。因此，本发明的多肽降低血清5-羟色胺水平且由此能够抑制或治疗骨质疏松症。
TM结合肠嗜铬细胞上的结合位点，由此提供所述多肽对这一种类的靶细胞超过其它细胞的选择性。在这方面，本发明优选的TM实施方案包括抗体(例如单克隆抗体、抗体片段例如Fab、F(ab)’2、Fv、ScFv等和抗体结构域肽类)和结合如下鉴定的受体的结合骨架。因此，本发明的多肽类可以包括商购抗体或结合骨架，它们被设计以实现对所述靶细胞或受体的特异性结合。或者，优选的TMs包括肽配体，例如细胞因子、生长因子、神经肽类和外源凝集素类。
本发明的TM结合肠嗜铬细胞上的受体。作为实例，本发明多肽的TM结合肠嗜铬细胞上的下组受体，其选自：IL13受体(例如IL13Rα1)；生长抑素受体(例如SSTR2或SSTR5)；VPAC受体(例如VPAC1或VPAC2)；TGFβI受体(例如TGFβRI或TGFβRII)；速激肽受体(例如TAC1或TAC2)；γ-氨基丁酸(GABA)受体(例如GABAA受体，特别是α6或β2)；表皮生长因子(EGF)受体(例如EGFR)；成纤维细胞生长因子受体(例如FGFr2)；或肽YY(PYY)受体(例如神经肽Y受体Y1或Y2)。所有这些受体均在肠嗜铬细胞上被表达。
在一个实施方案中，TM选自：IL13受体配体(例如IL13)；生长抑素受体配体(例如生长抑素)；VPAC受体配体；TGFβI受体配体(例如TGFβI)；速激肽受体配体(例如物质P)；γ-氨基丁酸(GABA)受体配体；表皮生长因子(EGF)受体配体(例如EFG；TGFα、肝素结合EGF-样生长因子(HB-EGF)、双调蛋白(AR)、β细胞生长因子(BTC)、表皮调节素(EPR)或epigen)；成纤维细胞生长因子受体配体(例如FGF)；或肽YY(PYY)受体配体(例如肽YY)；及其截短物和肽类似物。
在一个实施方案中，本发明多肽的TM结合肠嗜铬细胞上的下组受体，其选自：IL13Rα1、SSTR2、SSTR5、VPAC1、VPAC2、TGFβRI、TGFβRII、TAC1、TAC2、GABAA受体α6、GABAA受体β2、EGFR、FGFr2、神经肽Y受体Y1或神经肽Y受体Y2。所有这些受体均在肠嗜铬细胞上被表达。
在一个实施方案中，TM选自：IL13肽,生长抑素肽、VPAC肽、TGFβI肽、物质P肽、EGF肽、TGFα肽、肝素结合EGF-样生长因子(HB-EGF)肽、双调蛋白(AR)肽、β细胞生长因子(BTC)肽、表皮调节素(EPR)肽、epigen肽、成纤维细胞生长因子(FGF)肽或肽YY；及其截短物和肽类似物。
在一个实施方案中，本发明多肽的TM结合IL13受体，优选IL13Rα1。这样的TMs适合的实例包括：IL13肽类，例如全长IL13肽(例如IL13146)及其截短物和肽类似物。
在一个实施方案中，本发明多肽的TM结合生长抑素(SST)受体。作为实例，适合的TMs包括：SST肽类和皮质抑制素(CST)-肽类及其肽类似物，例如D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2(BIM23052)、D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-D-Nal-NH2(BIM23056)或c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2(BIM-23268)。其它实例包括SST肽类SST-14和SST-28；以及肽和肽类似物，例如：奥曲肽、兰瑞肽、BIM23027、伐普肽、司格列肽和SOM230。这些TMs是优选结合SST受体、特别是结合SSTR2和SSTR5受体的TMs。
在一个实施方案中，本发明的TM结合VPAC受体，优选VPAC1或VPAC2。这样的TMs适合的实例包括PACAP(1-27)或其截短物或肽类似物，包括类似物TP3805、类似物[Arg15,20,21Leu17]-PACAP-Gly-Lys-Arg-NH2和类似物R3P66[HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRY]。这样的TMs适合的其它实例包括VIP-1和VIP-2肽类，例如VIP(1-28)或其截短物或肽类似物，包括VIP类似物TP3939、TP4200、TP3982。这些TMs显示选择性结合VPAC1。或者，可以使用选择性结合VPAC2的TM，例如mROM(参见Yu等人,Peptides27(6)p1359-66(2006)，将该文献引入本文参考)。
在一个实施方案中，本发明的TM结合TGFβI受体，优选TGFβRI或TGFβRII。这样的TMs适合的其它实例包括TGFβ肽类，优选TGFβI肽及其截短物或肽类似物。
在一个实施方案中，本发明的TM结合速激肽受体，优选TAC1或TAC2。这样的TMs的适合的实例包括物质P、其截短物或肽类似物，包括Glu5,MePhe8,Sar9]-SP5-11(D1Me-C7)、唾液腺十一肽相关肽(ERP)和(D-pro4,D-trp7,9)SP(4-11)。其它适合的使TSI结合速激肽受体的TMs详细描述在WO2011/020114中，将该文献完整地引入本文参考。
在一个实施方案中，本发明的TM结合γ-氨基丁酸(GABA)受体，优选GABA受体α6或β2。这样的TMs的适合的实例包括γ-氨基丁酸(GABA)、地西泮结合抑制剂(DBI)肽、苯二氮杂卓、GABA类似物、DBI类似物。
在一个实施方案中，本发明的TM结合表皮生长因子(EGF)受体，优选EGFR。这样的TMs的适合的实例括表皮生长因子(EGF)；TGFα、肝素结合EGF-样生长因子(HB-EGF)、双调蛋白(AR)、β细胞生长因子(BTC)、表皮调节素(EPR)或epigen及其截短物或肽类似物，包括EGF(TGFα+14氨基酸的N-末端伸展肽的重组类似物)。
在一个实施方案中，本发明的TM结合成纤维细胞生长因子受体，优选FGFr2。这样的TMs的适合的实例包括成纤维细胞生长因子受体配体FGF及其截短物或肽类似物，包括PG-FGF-1(FGF与蛋白聚糖(PG)核心蛋白的融合体)、碱性FGF([Val112])、碱性FGF(106-146)NH2)。其它适合的结合成纤维细胞生长因子受体的TMs详细描述在US6294,359中，将该文献完整的引入本文参考。
在一个实施方案中，本发明的TM结合肽YY(PYY)受体，优选神经肽Y受体Y1或Y2。这样的TMs的适合的实例包括肽YY及其截短物和肽类似物，包括PYY(22-36)(BIM-43004)、PYY(1-36)、PYY(9-36)、PYY(14-36)、PYY(22-36),PYY(27-36)。
在一个优选的实施方案中，TM结合IL13受体，优选IL13Rα1；还优选TM是IL13肽或其截短物或肽类似物。
易位结构域
本发明的易位成分能够使非细胞毒性蛋白酶(或其片段)易位入靶细胞，以便蛋白酶活性的功能表达发生在靶细胞胞液内。易位成分优选能够在低pH条件下在脂质膜(例如内体膜)内形成离子可渗透孔。所述易位成分可以得自微生物蛋白来源，例如细菌或病毒蛋白来源。因此，在一个实施方案中，所述易位成分包含酶的易位结构域或由其组成，例如细菌毒素。在另一个实施方案中，所述易位结构域包含病毒蛋白的易位结构域或由其组成。在一个实施方案中，本发明的易位成分可以包含梭菌神经毒素H-链或其片段例如梭菌神经毒素的HN结构域(或其易位片段)或由其组成。
多肽制备
本发明的多肽类包含3种主要成分：‘生物活性成分’(即非细胞毒性蛋白酶)；TM；和易位结构域。与制备这的融合蛋白相关的通用技术通常称作再定向毒素技术。作为示例。我们涉及：WO94/21300；WO96/33273；WO98/07864；WO00/10598；WO01/21213；WO06/059093；WO00/62814；WO00/04926；WO93/15766；WO00/61192；和WO99/58571。将所有这些公开文献引入本文参考。
更详细地，本发明的TM成分可以与本发明的蛋白酶成分或易位成分融合。所述融合优选通过共价键例如直接共价键或通过间隔基/连接分子进行。所述蛋白酶成分和易位成分优选通过共价键例如直接共价键或通过间隔基/连接分子彼此连接。适合的间隔基/连接分子是本领域众所周知的，且典型地包含基于氨基酸的5－40个、优选10－30个氨基酸残基长度的序列。
在应用中，所述多肽类具有双-链构型，其中蛋白酶成分和易位成分优选通过二硫键彼此连接。
本发明的多肽类可以通过本领域技术人员众所周知的常规化学缀合技术制备。作为实例，参照Hermanson,G.T.(1996),Bioconjugatetechniques,AcademicPress和Wong,S.S.(1991),Chemistryofproteinconjugationandcross-linking,CRCPress,Nagy等人,PNAS95p1794-99(1998)。易于连接合成TMs与本发明多肽的其它详细方法提供在例如EP0257742中。将上述举出的缀合出版物引入本文参考。
或者，可以通过单一多肽融合蛋白的重组制备方法制备多肽类(参见，例如WO98/07864)。这项技术基于体内细菌机制，通过该机制制备天然梭菌神经毒素(即全毒素)，且导致融合蛋白具有如下‘简化’的结构排列：
NH2-[蛋白酶成分]–[易位成分]–[TM]-COOH
根据WO98/07864，TM定向于融合蛋白的C-末端。然后通过用蛋白酶处理活化该融合蛋白，使其在蛋白酶成分与易位成分之间的位点上裂解。由此产生双-链蛋白，其包含蛋白酶成分作为单一多肽链，其与包含易位成分+TM的另一单一多肽链共价连接(通过二硫键)。
或者，根据WO06/059093，融合蛋白的TM成分面向蛋白酶裂解位点与易位成分之间的线性融合蛋白序列的中间定位。这确保TM连接至易位结构域(即，如使用天然梭菌全毒素发生的)，尽管在这种情况中，两种成分以相对天然全毒素的次序反向。随后在蛋白酶裂解位点上上裂解暴露TM的N-末端部分，并且提供双-链多肽融合蛋白。
另一种选择在于融合蛋白的TM成分的‘分裂配体’呈递。此处作为配体起作用的TM成分具有游离N-末端结构域和游离C-末端结构域。因此，TM能够通过靶向部分的N-末端部分与结合位点的结构域之间的相互作用与靶细胞上的结合位点(例如受体(receptor)或受体(oracceptor))发生相互作用。或者，TM能够在靶向部分与结合位点的结构域之间发生相互作用。或者，TM能够发生双重相互作用，其中靶向部分的N-末端部分与结合位点的结构域发生相互作用，且靶向部分的C-末端部分与结合位点的结构域发生相互作用。在这种后面的实施方案中，TM的N-和C-末端部分可以结合相同或不同的结合位点结构域，和/或可以结合不同结合位点上的结构域。有关这种排列的另外的信息可以在WO2012/156743中找到，将该文献引入本文参考。
可以通过常规方式例如定点诱变在DNA水平上导入上述举出的蛋白酶裂解序列(和/或除去任意固有的序列)。证实存在裂解序列的筛选可以手动进行或在计算机软件辅助下(例如DNASTAR,Inc.的MapDraw程序)进行。尽管可以使用任意蛋白酶裂解位点(即梭菌属或非梭菌属)，优选如下：
另外的蛋白酶裂解位点包括被非细胞毒性蛋白酶例如被梭菌神经毒素切割的识别序列。它们包括被非细胞毒性蛋白酶例如梭菌神经毒素裂解的SNARE(例如SNAP-25、突触融合蛋白、VAMP)蛋白识别序列。具体实例提供在US2007/0166332中，将该文献完整地引入本文参考。
术语蛋白酶裂解位点还包括内蛋白，其为自我裂解的序列。例如，可通过改变存在的还原剂的浓度控制自我剪接反应。还可以使用上述举出的‘活化’裂解位点作为‘毁坏性’裂解位点(下述)，如果一个被并入本发明的多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的融合蛋白可以包含一种或多种N-末端和/或C-末端定位的纯化标记。尽管可以使用任意纯化标记，但是优选如下标记：
His-标记(例如6×组氨酸)(SEQIDNO:7)，优选为C-末端和/或N-末端标记
MBP-标记(麦芽糖结合蛋白)，优选为N-末端标记
GST-标记(谷胱甘肽S-转移酶)，优选为N-末端标记
His-MBP-标记，优选为N-末端标记
GST-MBP-标记，优选为N-末端标记
硫氧还蛋白-标记，优选为N-末端标记
CBD-标记(壳多糖结合结构域)，优选为N-末端标记
在所述融合蛋白中可以包括一种或多种肽间隔物/连接分子。例如，可以在纯化标记与融合蛋白分子的其余部分之间使用肽间隔物。
本发明还提供编码上述举出的融合蛋白的DNA序列。在本发明的一个优选的方面中，将该DNA序列制备成DNA载体的部分，其中所述载体包含启动子和终止子。
在一个优选的实施方案中，所述载体具有选自如下的启动子：
优选通过计算机模拟(insilico)设计本发明的DNA构建体，且然后用通过常规DNA合成技术合成。
任选地根据将要使用的最终宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli))表达系统为偏性密码子(codon-biasing)改变上述举出的DNA序列信息。
优选筛选DNA主链的任意固有核酸序列，当转录和翻译时，其可以产生相当于由编码第二种肽的序列编码的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列。这种筛选可以手动进行或在计算机软件(例如DNASTAR,Inc.的MapDraw程序)的辅助下进行。
本文所涉及的“抑制”和“治疗”是指给受试者提供治疗有益性的方式。它包括，例如施用如本文所定义的融合蛋白以预防骨质疏松症或减轻骨质疏松症的严重性。
本发明的另一个方面提供预防或抑制骨质疏松症的方法，其中该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的融合蛋白，其包含：
(i)非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶能够裂解肠嗜铬细胞中的SNARE蛋白；
(ii)能够结合到肠嗜铬细胞上的结合位点的靶向部分(TM)，所述结合位点能够进行胞吞作用以并入肠嗜铬细胞内的内体，且其中所述肠嗜铬细胞表达所述SNARE蛋白；和
(iii)能够使所述蛋白酶从内体内易位、通过内体膜并且进入肠嗜铬细胞胞液的易位结构域；
条件是所述多肽不是梭菌神经毒素(全毒素)分子。
本发明的融合蛋白可以包括毁坏性蛋白酶裂解位点，其对融合蛋白可能迁移至非位点位置的情况中的裂解(被局部蛋白酶)敏感。这种方法有助于将脱离靶向位点的风险降至最低限度。因此，可以将本发明的融合蛋白设计成包括一个或多个毁坏性裂解位点，例如如WO2010/094905和WO2002/44199中所述–将这些对比文件各自完整地引入本文参考。
多肽递送
在应用中，本发明使用药物组合物，其包含多肽与至少一种选自药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐的成分。
本发明的多肽类可以配制为口服、胃肠外、连续输注、植入、吸入或局部应用。适合于注射的组合物可以是溶液、混悬液或乳剂形式，或在使用前溶于或混悬于适合的媒介物的干粉。
局部递送方式可以包括口服或胃递送。在这方面，可以使用包肠溶衣胶囊或其它颗粒系统例如微球形式的制剂。通过腹腔镜手术局部施用于十二指肠也是可能的。局部递送的其它实例还可以包括透皮递送(通过粘着贴剂)。
优选的施用途经选自：全身、口服、腹腔镜和/或限局性注射。
在注射用制剂的情况中，任选地包括药物活性物质以有助于使多肽保留在施用部位上或减少从施用部位除去多肽。这样的药物活性物质的一个实例是血管收缩剂，例如肾上腺素。这样的制剂赋予增加施用后多肽保留时间且由此增加和/或增强其效果的优点。
施用本发明多肽类的剂量范围是产生期望的治疗效果的那些。可以理解所需的剂量范围取决于多肽或组合物的性质、施用途经、制剂的性质、患者年龄、患者病症的性质、程度或严重性、禁忌证(如果有的话)和主治医师的判断。可以使用标准实验途经调整这些剂量水平的变化用于优化。
适合的每日剂量(/kg患者体重)是0.0001-1mg/kg，优选0.0001-0.5mg/kg，更优选0.002-0.5mg/kg，且特别是优选0.004-0.5mg/kg。单位剂量可以在低于1微克至30mg之间改变，但典型地在0.01至1mg/剂量区间，可以每日或优选以较低频率施用，例如每周施用或每6个月施用。
特别优选的施药方案基于2.5ng多肽作为1X剂量。在这方面，优选的剂量在1X–100X(即2.5-250ng)。
典型地使用所述多肽和无热原灭菌媒介物制备流体剂型。根据所用媒介物和浓度不同改变的多肽可以溶于或混悬于该媒介物。在制备溶液的过程中，可以将多肽溶于媒介物，如果必要，通过添加氯化钠使该溶液等渗并且使用无菌技术通过灭菌滤器灭菌，然后填充入适合的灭菌小瓶或安瓿并且密封。或者，如果溶液稳定性足够，则可以通过高压灭菌使在其密封容器中的溶液灭菌。可以将有利的添加剂例如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、助悬剂或乳化剂和/或局部麻醉剂溶于媒介物。
可以通过使用无菌技术在无菌区将预先灭菌的成分填充入无菌容器制备在使用前溶于或混悬于适合的媒介物的干粉。或者，可以使用无菌技术在无菌区将所述成分溶入适合的容器。然后将产品冷冻干燥并且无菌密封容器。
基本上按照相同方式制备适合于肌内、皮下或皮内注射的胃肠外混悬液，除外将无菌成分混悬于无菌媒介物而不是将其溶解且不能通过过滤进行灭菌。
可以以无菌状态分离所述成分，或者可以在分离后，例如通过γ射线照射将所述成分灭菌。
有利地，组合物中包括助悬剂，例如聚乙烯吡咯烷酮，以便有利于成分均匀分布。
本发明的施用可以利用各种递送技术，包括微粒包囊、病毒递药系统或高压气雾剂碰撞。
定义部分
靶向部分(TM)是指在功能上与结合位点发生相互作用以导致本发明多肽与靶细胞表面之间的物理结合的任意化学结构。在本发明的上下文中，靶细胞是肠嗜铬细胞。术语TM包括能够结合靶细胞上的结合位点的任意的分子(即天然存在的分子或其化学/物理学修饰的变体)，所述结合位点能够内化(例如内体形成)–也称作受体-介导的胞吞作用。TM可以具有内体膜易位功能，在这种情况中，无需分开的TM和易位结构域成分存在于本发明的活性剂中。在上述通篇描述中，描述了特定TMs。涉及的所述TMs仅是示例性的，且本发明包括其所有的变体和衍生物，它们保留了示例性TMs的基本结合(即靶向)能力。
本发明的TM包括抗体(例如抗体片段)和结合骨架；尤其是为结合(例如特异性)靶细胞目的设计的商购抗体/片段和骨架。
蛋白质骨架代表新一代补充治疗性单克隆抗体和衍生物例如scFvs、Fab分子、dAbs(单结构域抗体)、camelids、双体和minibodies的伸展的所有组成成分的通用结合构架，它们各自可以用作本发明的TM。骨架系统通过生成新的骨架或修饰已知蛋白质结合结构域生成或改变已知的蛋白质识别结构域。这样的骨架包括、但不限于：
(i)基于蛋白质A的骨架–亲合体(affibodies)(Nord,K.等人1997“Bindingproteinsselectedfromcombinatoriallibrariesofanalpha-helicalbacterialreceptordomain”.NatBiotechnol15,772–777)；
(ii)基于脂质运载蛋白的骨架–模拟抗体(anticalins)(Skerra2008“Alternativebindingproteins:anticalins-harnessingthestructuralplasticityofthelipocalinligandpockettoengineernovelbindingactivities”.FEBSJ.275:2677-83)；
(iii)基于纤连蛋白的骨架–adnectin(Dineen等人2008“TheAdnectinCT-322isanovelVEGFreceptor2inhibitorthatdecreasestumorburdeninanorthotopicmousemodelofpancreaticcancer”.BMCCancer8:352)；
(iv)avimers(Silverman等人2005“Multivalentavimerproteinsevolvedbyexonshufflingofafamilyofhumanreceptordomains”.NatBiotechnol23:1556-61)；
(v)基于固定蛋白的骨架–darpins(Zahnd等人2006“SelectionandcharacterizationofHer2binding-designedankyrinrepeatproteins”.JBiolChem.281:35167-75)；和
(vi)centyrin骨架–基于蛋白质折叠，其具有与带有类似于CDRs的环的Ig结构域的显著结构同源性。Ig结构域是人体蛋白质中常见的组件且已经广泛应用于可选的骨架蛋白。将上述‘骨架’出版物各自(以其完整的形式)引入本文参考。
结合骨架可以用于通过与特异性细胞表面蛋白、受体或其它细胞表面表位例如糖基发生相互作用靶向特定细胞类型。这样修饰的骨架可以被改造在本发明基于重组非细胞毒性蛋白酶的多肽类上。
本发明的TM结合(优选特异性结合)所述肠嗜铬靶细胞。术语“特异性结合”优选是指指定TM以具有106M-1或以上、优选107M-1或以上、更优选108M-1或以上且最优选109M-1或以上的结合亲和力(Ka)结合靶细胞。术语“特异性结合”还可以指指定TM以106M-1或以上、优选107M-1或以上、更优选108M-1或以上且最优选109M-1或以上的结合亲和力(Ka)结合指定受体、IL13受体(例如IL13Rα1)；生长抑素受体(例如SSTR2或SSTR5)；VPAC受体(例如VPAC1或VPAC2)；TGFβI受体(例如TGFβRI或TGFβRII)；速激肽受体(例如TAC1或TAC2)；γ-氨基丁酸(GABA)受体(例如GABAA受体，特别是α6或β2)；表皮生长因子(EGF)受体(例如EGFR)；成纤维细胞生长因子受体(例如FGFr2)；或肽YY(PYY)受体(例如神经肽Y受体Y1或Y2)。
本说明书中涉及的TM包括其片段和变体，它们保留结合到所述靶细胞的能力。作为实例，变体可以与所称TM(例如本说明书中出现的任意SEQIDNO，其定义一种TM)具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％且最优选至少97或至少99％的氨基酸序列同源性。因此，变体可以包括氨基酸的(例如非天然氨基酸)一种或多种类似物或取代键。此外，作为实例，术语片段在用于涉及TM时是指具有所称TM的至少10个、优选至少20个、更优选至少30个且最优选至少40个氨基酸残基的肽。术语片段还涉及上述举出的变体。因此，作为实例，本发明的片段可以包含具有至少10、20、30或40个氨基酸的肽序列，其中所述肽序列与所称肽的氨基酸的相应肽序列(连续)相比具有至少80％的序列同源性。
证实TM结合到所选择的靶细胞是常规的。例如，可以使用单纯放射性置换实验，其中使所述靶细胞的组织或细胞代表在过量未标记的TM的存在下暴露于标记的(例如氚标记的)TM。在这一实验中，可以评价非特异与特异结合的相对比例，由此能够证实TM结合靶细胞。任选地，试验可以包括一种或多种结合拮抗剂，且试验还可以包括观察TM结合的损失。这种类型的实验的实例可以在Hulme,E.C.(1990),Receptor-bindingstudies,概要,pp.303-311,InReceptorbiochemistry,PracticalApproach,Ed.E.C.Hulme,OxfordUniversityPress。
在本发明的上下文中，涉及的肽TM包括其肽类似物，只要该类似物结合与相应‘参比’TM相同的受体。所述类似物可以包括合成残基，例如：
β-Nal＝β-萘基丙氨酸
β-Pal＝β–吡啶基丙氨酸
hArg(Bu)＝N-胍基-(丁基)-高精氨酸
hArg(Et)2＝N,N'-胍基-(二甲基)-高精氨酸
hArg(CH2CF3)2＝N,N’-胍基-双-(2,2,2,-三氟乙基)-高精氨酸
hArg(CH3,己基)＝N,N’-胍基-(甲基,己基)-高精氨酸
Lys(Me)＝Ne-甲基赖氨酸
Lys(iPr)＝Ne-异丙基赖氨酸
AmPhe＝氨基甲基苯丙氨酸
AChxAla＝氨基环己基丙氨酸
Abu＝α-氨基丁酸
Tpo＝4-硫代脯氨酸
MeLeu＝N-甲基亮氨酸
Orn＝鸟氨酸
Nle-正亮氨酸
Nva＝正缬氨酸
Trp(Br)＝5-溴-色氨酸
Trp(F)＝5-氟-色氨酸
Trp(N02)＝5-硝基-色氨酸
Gaba＝γ-氨基丁酸
Bmp＝J-巯丙酰
Ac＝乙酰基
Pen-青霉胺
本发明的融合蛋白(本文也称作多肽类)可以缺乏梭菌神经毒素的功能性HC或HCC结构域。在一个实施方案中，所述多肽类缺乏梭菌神经毒素全毒素的最后50个C-末端氨基酸。在另一个实施方案中，所述多肽类缺乏梭菌神经毒素全毒素的最后100、150、200、250或300个C-末端氨基酸残基。或者，可以通过诱变消除/降低HC结合活性–作为实例，为便利起见涉及的BoNT/A，改变神经节苷脂结合袋中的一个或两个氨基残基突变(W1266－L和Y1267－F)导致HC区失去其受体结合功能。可以对非血清型A梭菌属肽成分进行类似突变，例如基于具有突变的肉毒菌毒素B(W1262－L和Y1263－F)或肉毒菌毒素E(W1224－L和Y1225－F)的构建体。对活性位点的其它突变实现了HC受体结合活性的相同消除，例如肉毒菌毒素型A毒素中的Y1267S和其它梭菌神经毒素中相应的高度保守的残基。这种和其它突变的细节描述在Rummel等人(2004)(MolecularMicrobiol.51:631-634)中，将该文献引入本文参考。
天然梭菌神经毒素的HC肽包含约400-440个氨基酸残基，且由各自约25kDa的两种功能不同的结构域组成，即N-末端区(通常称作HCN肽或结构域)和C-末端区(通常称作HCC肽或结构域)。此外，充分记录了构成C-末端160-200个氨基酸残基的C-末端区(HCC)负责使梭菌神经毒素结合其天然细胞受体，即结合神经肌肉接点上的神经末梢。因此，本说明书通篇涉及的梭菌属重-链缺乏功能性重链HC肽(或结构域)，使得该重-链不能结合天然梭菌神经毒素所结合的细胞表面受体，这意味着梭状芽胞杆菌重-链仅是缺乏功能性HCC肽。换句话说，HCC肽区域部分或完全缺失，否则被修饰(例如通过常规的化学或蛋白水解处理)，以使其对神经肌肉接点上的神经末梢的天然结合能力失活。
因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌属HN肽缺乏梭菌神经毒素的部分C-末端肽部分(HCC)且由此缺乏天然梭菌神经毒素的HC结合功能。作为实例，在一个实施方案中，C-末端延伸的梭菌属HN肽缺乏梭菌神经毒素重-链的C-末端40个氨基酸残基或C-末端60个氨基酸残基或C-末端80个氨基酸残基或C-末端100个氨基酸残基或C-末端120个氨基酸残基或C-末端140个氨基酸残基或C-末端150个氨基酸残基或C-末端160个氨基酸残基。在另一个实施方案中，本发明的梭菌属HN肽缺乏梭菌神经毒素的完整的C-末端肽部分(HCC)且由此缺乏天然梭菌神经毒素的HC结合功能。作为实例，在一个实施方案中，梭菌属HN肽缺乏梭菌神经毒素重-链的C-末端165个氨基酸残基或C-末端170个氨基酸残基或C-末端175个氨基酸残基或C-末端180个氨基酸残基或C-末端185个氨基酸残基或C-末端190个氨基酸残基或C-末端195个氨基酸残基。作为另一个实例，本发明的梭菌属HN肽缺乏梭菌属HCC参比序列，其选自：
肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基(Y1111-L1296)
肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基(Y1098-E1291)
肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基(Y1112-E1291)
肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基(Y1099-E1276)
肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基(Y1086-K1252)
肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1274)
肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1297)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(Y1128-D1315)
上述举出的参比序列应被视为指导，因为适度改变可以根据亚血清型进行。
本发明的蛋白酶包括所有非细胞毒性蛋白酶，它们能够裂解真核细胞中细胞外融合器的一种或多种蛋白质。
本发明的蛋白酶优选是细菌蛋白酶(或其片段)。更优选所述细菌蛋白酶选自梭菌属(Clostridium)或奈瑟球菌属(Neisseria)/链球菌属(Streptococcus)(例如梭菌属L-链或奈瑟球菌属IgA蛋白酶，其优选自淋病奈瑟氏球菌或肺炎链球菌)。另一个非细胞毒性蛋白酶的实例包括蝎子毒液蛋白酶，例如来自巴西全蝎巴西钳蝎的毒液的那些或蛋白酶antarease。
本发明还包括变体非细胞毒性蛋白酶(即天然存在的蛋白酶分子的变体)，只要该变体蛋白酶仍然显示必需的蛋白酶活性。作为实例，变体可以与参比蛋白酶序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％或至少98％的氨基酸序列同源性。因此，术语变体包括具有增强(或降低的)内肽酶活性的非细胞毒性蛋白酶–本文特别举出的是增加的BoNT/A突变体Q161A、E54A和K165L的Kcat/Km，参见Ahmed,S.A.(2008)ProteinJ.DOI10.1007/s10930-007-9118-8，将该文献引入本文参考。术语片段在涉及蛋白酶使用时典型地是指具有参比蛋白酶的至少150个、优选至少200个、更优选至少250且最优选至少300个氨基酸残基的肽。与TM‘片段’成分(上述)一样，本发明的蛋白酶‘片段’包括基于参比序列的变体蛋白酶的片段。
本发明的蛋白酶优选显示丝氨酸或金属蛋白酶活性(例如内肽酶活性)。所述蛋白酶优选对SNARE蛋白(例如SNAP-25、突触泡蛋白/VAMP或突触融合蛋白)具有特异性。
特别举出的是神经毒素蛋白酶结构域，例如细菌神经毒素的蛋白酶结构域。因此，本发明包括天然发生的神经毒素结构域以及所述天然发生神经毒素的重组制备形式的用途。
示例性神经毒素由梭菌属产生，且术语梭菌神经毒素包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素以及由巴氏梭菌(C.baratii)和拜氏梭菌(C.butyricum)产生的紧密相关的BoNT-样神经毒素。上述举出的缩写在本说明书中通篇使用。例如，命名BoNT/A表示神经毒素来源为BoNT(血清型A)。相应的命名适用于其它BoNT血清型。
BoNTs是已知最有效的毒素，其对小鼠的半数致死剂量(LD50)值为0.5－5ng/kg，视血清型的不同而定。BoNTs在胃肠道中吸收，且在进入全身循环之后，结合胆碱能神经末梢的突触前膜并且防止其神经递质乙酰胆碱释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G裂解突触泡蛋白/小泡缔合性膜蛋白(VAMP)；BoNT/C、BoNT/A和BoNT/E裂解25kDa的突触体-缔合性蛋白(SNAP-25)；且BoNT/C裂解突触融合蛋白。
BoNTs共有共同的结构，其为～150kDa的双-链蛋白，由通过单一二硫键共价连接～50kDa轻链(L-链)的～100kDa重链(H-链)组成。H-链由两个各自～50kDa的结构域组成。C-末端结构域(HC)是高度亲和神经元结合所需的，而N-末端结构域(HN)被提议牵涉膜易位。L-链是负责裂解底物SNARE蛋白的锌-依赖性金属蛋白酶。
术语L-链片段是指神经毒素的L-链成分，该片段显示金属蛋白酶活性且能够以蛋白水解方式裂解牵涉细胞胞吐作用的囊泡和/或质膜相关蛋白。
适合的蛋白酶(参比)序列的实例包括：
肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基(1-448)
肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基(1-440)
肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基(1-441)
肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基(1-445)
肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基(1-422)
肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基(1-439)
肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基(1-441)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(1-457)
IgA蛋白酶-氨基酸残基(1-959)*
*Pohlner,J.等人(1987).Nature325,pp.458-462，将该文献引入本文参考。
上述举出的参比序列应被视为指导，因为适度改变可以根据亚血清型进行。作为实例，US2007/0166332(引入本文参考)引述了适度不同的梭菌属序列：
肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基(M1-K448)
肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基(M1-K441)
肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基(M1-K449)
肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基(M1-R445)
肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基(M1-R422)
肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基(M1-K439)
肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基(M1-K446)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(M1-A457)
包含轻链的各种梭菌属毒素片段可以用于本发明的各方面，条件是这些轻链片段可以特异性地靶向神经递质释放器的核心成分且由此参与执行完整的细胞机制，借此梭菌属毒素以蛋白水解方式裂解底物。梭菌属毒素的轻链约为420-460个氨基酸长度且包含酶结构域。研究证实全长梭菌属毒素轻链并非酶结构域的酶活性所必需的。作为非限制性实例，BoNT/A轻链的前8个氨基酸并非酶活性所必需的。作为另一个非限制性实例，TeNT轻链的前8个氨基酸并非酶活性所必需的。同样，轻链的羧基末端并非活性所必需的。作为非限制性实例，BoNT/A轻链的最后32个氨基酸(残基417-448)并非活性所必需的，作为另一个非限制性实例，TeNT轻链的最后31个氨基酸(残基427-457)并非酶活性所必需的。因此，该实施方案的方面可以包括包含酶结构域的梭菌属毒素轻链，所述酶结构域具有例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸、至少425个氨基酸和至少450个氨基酸的长度。该实施方案的其它方面可以包括包含酶结构域的梭菌属毒素轻链，所述酶结构域具有例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸、至多425个氨基酸和至多450个氨基酸的长度。
适合的非细胞毒性蛋白酶的另外的实例详细描述在WO2007/106115中，将该文献完整地引入本文参考。
在一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶裂解非神经元SNARE蛋白，例如SNAP-23蛋白。在一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶是能够裂解SNAP-23的修饰的肉毒毒素L-链。这样的修饰的L-链的实例由Chen和Barbieri描述在PNAS,第106卷,第23期,p9180-9184,2009中。
在一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶是BoNT/A、BoNT/C或BoNT/E蛋白酶，且优选的SNARE基元(motif)是SNAP(例如SNAP25)基元。
在另一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶是BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F或BoNT/G或破伤风神经毒素(TeNT)蛋白酶，且优选的SNARE基元是VAMP基元。在另一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶是BoNT/C1蛋白酶，且优选的SNARE基元是突触融合蛋白基元。
本发明的非细胞毒性蛋白酶识别不同的裂解位点序列且由此具有适度不同的裂解特异性。
作为另一个实例，参照如下识别序列和裂解位点：
本发明的多肽类、尤其是其蛋白酶成分可以被聚乙二醇化–这可以有助于增加例如蛋白酶成分作用期限这样的稳定性。当蛋白酶包含BoNT/A、B或C1蛋白酶时，聚乙二醇化是特别优选的。聚乙二醇化优选包括将PEG添加至蛋白酶成分的N-末端。作为实例，蛋白酶的N-末端可以被一个或多个氨基酸(例如半胱氨酸)残基延伸，所述氨基酸残基可以相同或不同。所述氨基酸残基的一个或多个可以具有与之连接(例如共价连接)的其自身的PEG分子。这项技术的实例描述在WO2007/104567中，将该文献完整地引入本文参考。
易位结构域是能够使蛋白酶易位入靶细胞的分子，使得蛋白酶活性的功能性表达出现在靶细胞的胞液内。任意的分子(例如蛋白质或肽)是否具有本发明必需的易位功能，均可以通过众多常规测定法的任意一种证实。
例如，ShoneC.(1987)描述了使用用测试分子攻击的脂质体的体外测定法。必需易位功能的存在通过可以易于监测的K+和/或标记的NAD从脂质体中释放得以证实[参见ShoneC.(1987)Eur.J.Biochem；第167卷(1):pp.175-180]。
另一个实例由BlausteinR.(1987)提供，其描述使用平面磷脂双层膜的简单体外测定法。用测试分子攻击所述膜并且根据通过所述膜的导电性增加证实必需的易位功能[参见Blaustein(1987)FEBSLetts；第226卷,第1期:pp.115-120]。
适用于本发明的能够评价膜融合和由此的易位结构域鉴定的另外的方法由MethodsinEnzymology第220和221卷,MembraneFusionTechniques,第A和B部分,AcademicPress1993提供。
本发明还包括变体易位结构域，只要该变体结构域仍然显示必需的易位活性。作为实例，变体可以与参比易位结构域具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％或至少98％的氨基酸序列同源性。术语片段在涉及易位结构域使用时是指具有参比易位结构域的至少20个、优选至少40个、更优选至少80个且最优选至少100个氨基酸残基的肽。在梭菌属易位结构域的情况中，片段优选具有参比易位结构域的至少100个、优选至少150个、更优选至少200个且最优选至少250个氨基酸残基(例如HN结构域)。与TM‘片段’成分(上述)一样，本发明的易位‘片段’包括基于参比序列的变体易位结构域的片段。
易位结构域优选能够在低pH条件下在脂质膜中形成离子可渗透的孔。优选发现仅使用能够在内体膜内形成孔的蛋白质分子的那些部分。
易位结构域可以得自微生物蛋白质来源，特别是得自细菌或病毒蛋白来源。因此，在一个实施方案中，易位结构域是酶例如细菌毒素或病毒蛋白的易位结构域。
充分证明了的是细菌毒素分子的一些结构域能够形成这样的孔。还已知病毒表达的膜融合蛋白的一些易位结构域能够形成这样的孔。这样的结构域可以用于本发明。
易位结构域可以具有梭菌属来源，例如HN结构域(或其功能成分)。HN是指近似等同于半个H-链的氨基-末端的梭菌神经毒素的H-链的部分或片段或相当于完整H-链中的片段的结构域。在这方面，如果期望除去HC细胞结合功能，这可以通过使HC或HCC氨基酸序列缺失进行(在DNA合成水平或合成后水平上，通过核酸酶或蛋白酶处理)。或者，可以通过化学或生物学处理使HC功能失活。
适合的(参比)易位结构域的实例包括：
肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基(449-871)
肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基(441-858)
肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基(442-866)
肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基(446-862)
肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基(423-845)
肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基(440-864)
肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基(442-863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-879)
上述举出的参比序列应被视为指导原则，因为适度改变可以根据亚-血清型的不同发生。作为实例，US2007/0166332(将该文献引入本文参考)引述了适度不同的梭菌属序列：
肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基(A449-K871)
肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基(A442-S858)
肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基(T450-N866)
肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基(D446-N862)
肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基(K423-K845)
肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基(A440-K864)
肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基(S447-S863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(S458-V879)
适合的易位结构域的另外的实例详细描述在WO2007/106115中，将该文献完整地引入本文参考。
在本发明的上下文中，包含易位结构域的各种梭菌属毒素HN区可以用于本发明的各方面，条件是这些活性片段可以有利于非细胞毒性蛋白酶(例如梭菌属的L-链)从胞内囊泡中释放进入靶细胞的细胞质且由此参与执行全部细胞机制，借此梭菌属毒素以蛋白水解方式裂解底物。来自梭菌属毒素的重链的HN区约为410-430个氨基酸长度且包含易位结构域。研究证实来自梭菌属毒素重链的HN区的全长对于易位结构域的易位活性并非必要。因此，该实施方案的各方面可以包括梭菌属毒素HN区，其包含具有例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸和至少425个氨基酸长度的易位结构域。该实施方案的其它方面可以包括梭菌属毒素HN区，其包含具有例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸和至多425个氨基酸长度的易位结构域。
对于有关肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)和破伤风梭菌(C.tetani)中的毒素产生的遗传基础的另外的详细内容，我们参考Henderson等人(1997)的TheClostridia:MolecularBiologyandPathogenesis,Academicpress(学术出版社)。
术语HN包括天然存在的神经毒素HN蛋白质和具有天然不存在的氨基酸序列和/或合成氨基酸残基的修饰的HN部分，只要修饰的HN部分仍然显示上述的易位功能。
或者，易位结构域可以具有非梭菌属来源。非梭菌属(参比)易位结构域来源的实例包括、但不限于白喉毒素的易位结构域[O＝Keefe等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89,6202-6206；Silverman等人,J.Biol.Chem.(1993)269,22524-22532；andLondon,E.(1992)Biochem.Biophys.Acta.,1112,pp.25-51]、假单胞菌外毒素A型易位结构域[Prior等人Biochemistry(1992)31,3555-3559]、炭疽毒素的易位结构域[Blanke等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93,8437-8442]、易位功能的各种融合或疏水性肽类[Plank等人J.Biol.Chem.(1994)269,12918-12924；和Wagner等人(1992)PNAS,89,pp.7934-7938]和两亲肽类[Murata等人(1992)Biochem.,31,pp.1986-1992]。易位结构域可以反映以天然存在蛋白质形式存在的易位结构域或可以包括氨基酸变化形式，只要这些变化形式不会破坏易位结构域的易位能力即可。
适用于本发明的病毒(参比)易位结构域的具体实例包括病毒表达的膜融合蛋白的一些易位结构域。例如，Wagner等人(1992)和Murata等人(1992)描述了来源于流感病毒血细胞凝集素的N-末端区的许多融合和两亲肽类的易位(即膜融合和囊泡化)功能。已知具有需要的易位活性的其它病毒表达的膜融合蛋白是西门利克森林病毒(SFV)融合肽的易位结构域、水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的易位结构域、SER病毒F蛋白的易位结构域和泡沫病毒包膜糖蛋白的易位结构域。病毒编码的Aspike蛋白在本发明上下文中具有特别的应用，例如SFV的E1蛋白和VSV的G蛋白的G蛋白。
表(下)中列出的(参比)易位结构域的用途包括其序列变体的用途。变体可以包含一种或多种保守核酸取代和/或核酸缺失或插入，条件是该变体具有必需的易位功能。变体还可以包含一种或多种氨基酸取代和/或氨基酸缺失或插入，只要该变体具有必需的易位功能。
本发明的多肽类还可以包含有利于易位的结构域。所述结构域有利于将非细胞毒性蛋白酶递送入靶细胞的胞液并且描述在例如WO08/008803和WO08/008805中，将这些文献各自引入本文参考。
作为实例，适合的有利于易位的结构域包括包膜病毒融合肽结构域，例如适合的融合肽结构域包括流感病毒属A型融合肽结构域(例如23个氨基酸的流感病毒A型融合肽结构域)、甲病毒属(alphavirus)融合肽结构域(例如26个氨基酸的西门利克森林病毒融合肽结构域)、水疱病毒属(vesiculovirus)融合肽结构域(例如21个氨基酸的水疱性口炎病毒融合肽结构域)、呼吸系病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的仙台病毒融合肽结构域)、麻疹病毒属(morbiliivirus)融合肽结构域(例如25个氨基酸的犬瘟热病毒融合肽结构域)、禽副黏液病毒属(avulavirus)融合肽结构域(例如25个氨基酸的新城疫病毒融合肽结构域)、亨尼波病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的亨德拉病毒融合肽结构域)、偏肺病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的人类偏肺病毒融合肽结构域)或泡沫病毒属(spumavirus)融合肽结构域，例如猴泡沫病毒融合肽结构域；或其片段或变体。
作为另一个实例，有利于易位的结构域可以包括梭菌属毒素HCN结构域或其片段或变体。更具体地，有利于梭菌属毒素HCN易位的结构域可以具有至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸的长度。在这方面，有利于梭菌属毒素HCN易位的结构域优选具有至多200个氨基酸、至多225个氨基酸、至多250个氨基酸或至多275个氨基酸的长度。具体(参比)实例包括：
肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基(872-1110)
肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基(859-1097)
肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基(867-1111)
肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基(863-1098)
肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基(846-1085)
肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基(865-1105)
肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基(864-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(880-1127)
上述序列位置根据血清型/亚型的不同可以有微小变化，且适合的(参比)梭菌属毒素HCN结构域的另外的实例包括：
肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基(874-1110)
肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基(861-1097)
肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基(869-1111)
肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基(865-1098)
肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基(848-1085)
肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基(867-1105)
肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基(866-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(882-1127)
任意上述有利的结构域可以与任意上述适用于本发明的易位结构域肽类组合。因此，作为实例，非梭菌属有利性结构域可以与非梭菌属易位结构域肽或与梭菌属易位结构域肽组合。或者，有利于梭菌属毒素HCN易位的结构域可以与非梭菌属易位结构域肽组合。或者。有利于梭菌属毒素HCN的结构域可以组合或与梭菌属易位结构域肽组合，其实例包括：
肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基(449-1110)
肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基(442-1097)
肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基(450-1111)
肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基(446-1098)
肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基(423-1085)
肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基(440-1105)
肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基(447-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-1127)
序列同源性
任意各种序列对比方法可以用于测定同一性百分比，包括、但不限于通用方法、局限性方法和杂交方法，例如，片段接近法。用于测定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规方法。通用方法从分子的开始到结束对比序列并且通过合计各残基对的评分并且通过利用空位罚分确定最佳排列。非限制性方法包括，例如，CLUSTALW，参见，例如，JulieD.Thompson等人,CLUSTALW:ImprovingtheSensitivityofProgressiveMultipleSequenceAlignmentThroughSequenceWeighting,Position-SpecificGapPenaltiesandWeightMatrixChoice,22(22)NucleicAcidsResearch4673-4680(1994)；和反复精制，参见，例如，OsamuGotoh,SignificantImprovementinAccuracyofMultipleProtein.SequenceAlignmentsbyIterativeRefinementasAssessedbyReferencetoStructuralAlignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局限性方法通过鉴定一个或多个被所有输入序列共有的保守基元进行序列对比。非限制性方法包括，例如，Match-box，参见，例如，EricDepiereuxandErnestFeytmans,Match-Box:AFundamentallyNewAlgorithmfortheSimultaneousAlignmentofSeveralProteinSequences,8(5)CABIOS501-509(1992)；Gibbs采样，参见，例如，C.E.Lawrence等人,DetectingSubtleSequenceSignals:AGibbsSamplingStrategyforMultipleAlignment,262(5131)Science208-214(1993)；Align-M，参见，例如，IvoVanWaIIe等人,Align-M-ANewAlgorithmforMultipleAlignmentofHighlyDivergentSequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。
因此，通过常规方法测定序列同一性百分比。参见，例如，Altschul等人,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986以及Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-19,1992。简言之，对两种氨基酸序列进行序列对比，使用空位开放罚分10、空位伸展罚分1和如下所示的Henikoff和Henikoff(同上)的"blosum62"评分矩阵(通过标准单字母密码指示氨基酸)以优化序列对比评分。
用于测定序列同一性的序列对比评分
然后将同一性百分比计算如下：
基本上同源的多肽类的特征为具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些改变优选具有：最小的属性，即保守氨基酸取代(参见下文)且其它取代不会显著地影响所述多肽的折叠或活性；小的缺失，典型地1－约30个氨基酸；和小的氨基-或羧基-末端延伸，例如氨基-末端甲硫氨酸残基、至多约20-25个残基的小的连接肽或亲合标记。
保守氨基酸取代
碱性:精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性:谷氨酸
天冬氨酸
极性:谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性:亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳族:苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小:甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
除20个标准氨基酸外，非标准氨基酸(例如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α–甲基丝氨酸)可以用于取代本发明多肽类的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、未被遗传密码编码的氨基酸和非天氨基酸可以用于取代梭菌属多肽氨酸残基。本发明的多肽类还可以包括非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸包括、但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟基乙基高半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌可酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然存在的氨基酸残基并入蛋白质的几种方法是本领域公知的。例如，可以使用体外系统，其中使用化学氨基酰化抑制剂tRNAs抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域公知的。在包含大肠杆菌(E.coli)S30提取物和商购酶和其它试剂的无细胞系统中进行包含无义突变的质粒的转录和翻译。通过色谱法纯化蛋白质。参见，例如，Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等人,MethodsEnzymol.202:301,1991；Chung等人,Science259:806-9,1993；andChung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10145-9,1993)。在第二种方法中，在爪蟾卵中通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制剂tRNAs进行翻译(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中，在没有将被替代的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)的存在下和在有期望的非天然存在的氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的存在下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸并入所述多肽以替代其天然对应物。参见，Koide等人,Biochem.33:7470-6,1994。可以通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化成非天然存在的种类。可以将化学修饰与定点诱变组合以进一步扩展取代范围(Wynn和Richards,ProteinSci.2:395-403,1993)。
有限数量的非保守氨基酸、不被遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以用于取代本发明多肽的氨基酸残基。
可以根据本领域公知的方法鉴定本发明多肽类中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells,Science244:1081-5,1989)。还可以通过对结构进行物理分析确定生物相互作用位点，正如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记这样的技术结合推定接触位点氨基酸突变所测定的。参见，例如，deVos等人,Science255:306-12,1992；Smith等人,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver等人,FEBSLett.309:59-64,1992。还可以根据与本发明多肽类的相关成分(例如易位或蛋白酶成分)的同源性分析推断必需氨基酸的身份。
可以使用已知的诱变和筛选方法、例如由Reidhaar-Olson和Sauer(Science241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-6,1989)公开的那些方法进行和测试多氨基酸取代。简言之，这些作者公开了用于同时随机选择多肽中的一个或多个位置、选择功能性多肽且然后对诱变的多肽类进行测序的方法，以便确定每个位置上的可取代的范围。可以使用的其它方法包括噬菌体展示(例如,Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner等人,美国专利US5,223,409；Huse,WIPO公开号WO92/06204)和区定向诱变(Derbyshire等人,Gene46:145,1986；Ner等人,DNA7:127,1988)。
可以使用已知的诱变和筛选方法、例如由Reidhaar-Olson和Sauer(Science241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-6,1989)公开的那些方法进行和测试多氨基酸取代。简言之，这些作者公开了用于同时随机选择多肽中的一个或多个位置、选择功能性多肽且然后对诱变的多肽类进行测序的方法，以便确定每个位置上的可取代的范围。可以使用的其它方法包括噬菌体展示(例如,Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner等人,美国专利US5,223,409；Huse,WIPO公开号WO92/06204)和区定向诱变(Derbyshire等人,Gene46:145,1986；Ner等人,DNA7:127,1988).。
在一个实施方案中，TM基本上不结合VIP受体和/或CRH受体。
在一个实施方案中，TM不是PACAP(1-38)或VIP肽或CRH肽。
如下是附图简述，其示例本发明的方面和/或实施方案。
实施例
制备施用于患有骨质疏松症的患者的多肽，提供用于抑制或治疗骨质疏松症的方法。如本发明中定义的，制备的多肽的靶向部分(TM)成分(特异性地)结合存在于肠嗜铬细胞上的受体。此后，易位成分促使多肽的非细胞毒性蛋白酶成分转运，一旦在肠嗜铬细胞内部，则其抑制5-羟色胺从其中分泌。因此，所述多肽降低血清5-羟色胺水平，从而能够抑制或治疗骨质疏松症。
实施例1
具有弯腰体位的经绝后60岁女性患者患有归因于多重脊椎骨折的虚弱性慢性痛。其配偶近期去世，且她奋力独立地自我护理。在激素替代疗法(HRT)后，她经历明显的体重增长和导致的活动减少。通过皮下注射0.025mg/kg本发明包含IL13146肽配体的多肽治疗(在6个月期限内每周注射)。抑制5-羟色胺释放导致骨强度增加和人体姿式显著改善。该患者报告有效的疼痛缓解且无进一步的脆性骨折。
实施例2
60岁男性患者报告慢性背痛并且呈现典型Dowager驼背(Dowager’shump)重症。该患者作为农夫工作，但因其恶化的病情而不能照料其农场3个月以上。通过腹腔镜十二指肠注射(每6个月注射1次的方案)施用0.07mg/kg本发明包含皮质抑制素(CST)-肽类似物(D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-THr-Phe-TH-NH2[BIM-23268])的多肽的胃肠外混悬液。在治疗的第一个月内就报告了阳性结果，包括背痛减轻。
实施例3
具有骨质疏松症家族史的87岁女性患者在在2个月期限内在其肋骨上患有5次骨折，并且在其腕关节上发生1次骨折。这些骨折对其身体健康和生活质量具有显著影响。通过静脉内施用0.09mg/kg的本发明包含TP3805肽的多肽的每周剂量。在治疗期的自始至终患者医生未报告其他骨折。
实施例4
30岁哮喘女性患者接受吸入糖皮质激素药物泼尼松(7.5mg)。她已经接受该药物延长期限(超过25年)作为其严重哮喘病症的第二线治疗药物。近来，该患者显示可能是糖皮质激素诱发的骨质疏松症症状(类似于库欣综合征)，且在健身房中轻度撞击摔倒后其腕关节断裂。她的临床医师开据处方，每个月剂量为0.015mg/kg的本发明包含TGFβ1的多肽，通过静脉内注射。在治疗的6个月期间，该患者报告无进一步的骨断裂。
实施例5
65岁女性患者报告在庭园维护时跌到后在其腕关节中诱2处骨折。该患者公开她10年前从北方的拉脱维亚移民，并且具有软骨病医学史。除维生素D和钙补剂外，该患者还被开据处方，每个月静脉内注射0.05mg/kg的本发明包含尿皮素的多肽。该患者报告恢复速率改善，且在治疗3个月后无进一步骨损伤。
实施例6
具有神经性厌食的16岁女性患者因其跌下楼梯而跌到。该患者的3根肋骨和2条腕关节断裂。患者的月经周期在称作闭经的情况中已经停止，这在该病的后期阶段常见。典型的经过一段时间后继续发生骨质疏松症，其中骨密度降低。该患者被开据处方，每个月口服剂量为0.1mg/kg的本发明包含物质P的多肽的包囊制剂。该患者报告在治疗后其病情改善。
实施例7
77岁乳糖不耐受男性患者在溜狗时跌到。该患者的2条腕关节断裂且发生急性痛。常规放射摄影扫描显示骨密度稀疏，且该患者被诊断为骨质疏松症。临床医师开据处方0.001mg/kg(每8周局部腹腔镜注射)本发明包含靶向部分的多肽，所述靶向部分结合GABA受体α6并且抑制肠5-羟色胺分泌入血液。2个月后，临床医师报告进展良好，这启示骨强化。
实施例8
88岁女性患者患有骨质疏松症3年，并且忍耐了在其腕关节、肋骨和腿中的多重骨折。自诊断以来，该患者已经经历了总体生活质量下降，包括使人难受的进入中老年护理设施。针对她的骨质疏松症，该患者被给予治疗，即每个月注射0.07mg/kg的本发明包含表皮调节素的多肽。在6个月治疗计划期间，该患者未报告进一步的骨折/损伤。
实施例9
具有严重类风湿性关节炎的59岁男性患者随后因其膝关节周围的滑膜炎症而发生骨质疏松症。炎症导致对膝盖骨损伤，在放射摄影扫描中观察到低骨密度和复发性膝骨折。该患者的临床医师开据处方0.1mg/kg的本发明包含PF-FGF-1的多肽，每3个月通过腹腔镜十二指肠注射施用。治疗1个月后，该患者报告无进一步骨折。
实施例10
具有骨质疏松症的94岁男性患者在其腕关节和髋中发生多处骨折，在其病情下通过手术治疗，但是在老龄下不建议。然而，通过透皮递送本发明多肽治疗或抑制骨质疏松症不会给该患者带来同样的风险因素。通过在其皮肤上施用粘着贴剂治疗患者，通过在2周期间从贴剂中缓慢扩散递送所述多肽。每隔12周替换1次透皮贴剂，且未报告进一步骨折。
动物模型实施例
将本发明的多肽类作为低骨量疾病即骨质疏松症的治疗方法进行测试，通过使用卵巢切除的啮齿动物来进行。正如临床上在绝经后女性中观察到的，这种疾病模型显示出比骨形成增加更高的骨质吸收增加。
实施例11
在卵巢切除术后从第1天到第28天给模拟手术或卵巢切除的6周龄雌性C57BL6/J小鼠每日1次饲喂1－250mg/kg体重/天的本发明多肽。
结果显示用250、100乃至10mg/kg体重/天的所述多肽治疗的小鼠具有高于对照组卵巢切除的小鼠的骨量，且可以预防小鼠的卵巢切除术诱发的骨质疏松症发生。
实施例12
为了确定本发明的多肽是否还可以营救现存的卵巢切除术诱发的骨质减少，用每日剂量的多肽(250mg/kg体重/天)将保持仅2周无治疗的模拟手术的或卵巢切除的6周龄小鼠治疗4周。对照卵巢切除的小鼠发生预期的骨质吸收参数增加继发的骨质减少。这些参数在多肽治疗的卵巢切除的小鼠中也增加；然而，在这些小鼠中，骨形成参数的增加具有正常化其骨量这样的增幅。血清5-羟色胺浓度降低80％，但脑5-羟色胺含量在多肽治疗的小鼠中未受影响。
实施例13
重复实施例12，但将6周龄卵巢切除的小鼠保持不治疗6周，然后用25、100或250mg/kg体重/天本发明的多肽将它们再治疗6周。所述多肽通过增加骨形成参数逆转卵巢切除术对骨量的有害作用并且将其水平增加至类似于(25mg/kg体重/天)或高于(100或250mg/kg体重/天)在模拟手术的小注观察到的结果。这种骨量的增加影响椎骨和长骨并且还存在于非卵巢切除的小鼠中。在任何治疗组中均不存在骨长度或宽度的改变。这些结果确立所述多肽甚至在低剂量(25mg/kg体重/天)给予和卵巢切除术后晚期给予时可以通过骨合成代谢机制挽救小鼠的卵巢切除术诱发的骨质疏松症。
实施例14
大鼠为选择的经绝后骨质疏松的啮齿动物模型，因为它复制了雌二醇缺乏成年人骨骼的几个关键特征，例如骨丢失伴随骨更新率增加和特异性雌二醇可预防的网眼状的骨质减少。同样，间歇注射甲状旁腺素(PTH)是必须比较任何新骨同化激素类药的标准。
因此，将卵巢切除的12周龄大鼠保持不治疗另外3或12周，使得它们发生严重的骨质减少。然后用相对高剂量的PTH(80μg/kg体重/天，皮下)10或增加量的本发明多肽(25、100或250mg/kg体重/天，口服)将模拟手术或临床切除的大鼠治疗4周。
椎骨分析显示所述多肽完全挽救了卵巢切除诱发的大鼠的骨质减少，与是将其在卵巢切除术后3周还是12周给药无关，且它甚至在以所用的最低剂量(25mg/kg体重/天)时也是有效的。
实施例15
通过使来自未治疗的、PTH-治疗的和多肽-治疗的卵巢切除大鼠的股骨和椎骨样品进行3-点弯曲试验和压缩分析测定最大载量和硬度，即两种骨质量替代者，来评价骨质量。两种参数在卵巢切除术后均减小且恢复至在模拟手术的大鼠中观察到的用PTH和本发明的多肽(250mg/kg体重/天)治疗的值。因此，每日口服施用所述多肽可以以剂量依赖性方式恢复大鼠的骨丢失和结构退化。
5-羟色胺从分离的人初级胃腺中释放以测定使用本发明的融合蛋白的抑制作用
实施例16
胃腺分离自幽门窦粘膜层的内镜下夹活检，如Wroblewski等人(2003)J.CellSci.,116,3017-3026所述。使用保险刀片将所述活检组织切成约2mm2的小片。用温至37℃的Hank平衡盐溶(HBSS)将组织切片洗涤3次，并且在5ml1mM二硫苏糖醇(DTT)的HBSS溶液中温育15分钟，在37℃用5％CO2/95％O2连续气体处理且以100个循环/分钟振摇。然后用3次改变的HBSS(37℃)洗涤组织，通过在5ml0.5mg.ml-1胶原酶A的HBSS溶液中温育30分钟、然后再用HBSS洗涤(37℃,3次)并且进一步进行30-分钟胶原酶消化(5ml,0.5mg.ml-1)进行酶解离。在此阶段，使用宽嘴吸量管研磨组织并且让较大组织片段在重力下沉降45秒。然后取出上清液并且转入澄清冰冷却的通用试管。剧烈振摇试管以释放另外的胃腺并且保持在冰上沉降45分钟。谨慎地取出包含碎片的上清液并且弃去。缓慢地混合包含分离的腺体的剩余物并且等分入组织培养板的每个孔中。在6-孔细胞培养板的2个孔之间分开来自1位个体患者的活检的腺体，用于5-羟色胺释放研究。
在37oC下、在5％CO2/95％O2加湿气体中在补充10％v/vFBS、1％v/v抗生素-抗真菌溶液、1％v/v青霉素-链霉素溶液和1％v/vL-谷氨酰胺溶液(200mM)的Dulbecco改进的Eagle培养基营养物混合物F-12Ham(DMEM/F-12)中培养初级人胃腺。在分离后使腺体粘着过夜并且每日改变培养基。
将腺体与本发明的融合蛋白一起预温育过夜，然后评价对5-羟色胺分泌的抑制作用。为了刺激5-羟色胺分泌，在37℃，将Ca2+(0.5–10mM)加入到初级人胃腺中10分钟。用1mMEGTA而不是Ca2+处理对照腺体。通过用冰冷培养基快速冷却终止刺激。从组织和培养基中提取5-羟色胺及其代谢物5-羟基吲哚乙酸，并且通过反相HPLC与电化学检测测定。将分泌的5-羟色胺的量(定义为存在于培养基中的)校准成组织5-羟色胺含量。为了评估Ca2+-诱导的5-羟色胺分泌，从来自进行刺激的细胞的培养基中的含量扣除对照培养基的校准的5-羟色胺含量。将本发明的融合蛋白对分泌的抑制百分比计算如下：(来自未用本发明融合蛋白预处理过夜的腺体的分泌物)-(来自用本发明融合蛋白预处理过夜的腺体的分泌物)/(来自未用本发明融合蛋白预处理过夜的腺体的分泌物)x100。

Claims (10)

1.一种多肽，用于抑制或治疗骨质疏松症，其中该多肽包含：
(i)非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶能够裂解肠嗜铬细胞中的SNARE蛋白；
(ii)能够结合到肠嗜铬细胞上的结合位点的靶向部分(TM)，所述结合位点能够进行胞吞作用以并入肠嗜铬细胞内的内体，且其中所述肠嗜铬细胞表达所述SNARE蛋白；和
(iii)能够使所述蛋白酶从内体内易位、通过内体膜并且进入肠嗜铬细胞胞液的易位结构域；
条件是所述多肽不是梭菌神经毒素(全毒素)分子。
2.用于权利要求1的用途的多肽，其中TM结合选自如下的受体：IL13受体(例如IL13Rα1)；生长抑素受体(例如SSTR2orSSTR5)；VPAC受体(例如VPAC1或VPAC2)；TGFβI受体(例如TGFβRI或TGFβRII)；速激肽受体(例如TAC1或TAC2)；γ-氨基丁酸(GABA)受体(例如GABAA受体，特别是α6或β2)；表皮生长因子(EGF)受体(例如EGFR)；成纤维细胞生长因子受体(例如FGFr2)；和肽YY(PYY)受体(例如神经肽Y受体Y1或Y2)。
3.用于权利要求1或2的用途的多肽，其中TM结合选自如下的受体：IL13Rα1、SSTR2、SSTR5、VPAC1、VPAC2、TGFβRI、TGFβRII、TAC1、TAC2、GABAA受体α6、GABAA受体β2、EGFR、FGFr2、神经肽Y受体Y1和神经肽Y受体Y2。
4.用于上述权利要求任一项的用途的多肽，其中TM选自：IL13肽、生长抑素肽、TGFβI肽、物质P肽、地西泮结合抑制剂(DBI)肽、EGF肽、TGFα肽、肝素结合EGF-样生长因子(HB-EGF)肽、双调蛋白(AR)肽、β细胞生长因子(BTC)肽、表皮调节素(EPR)肽、epigen肽、成纤维细胞生长因子(FGF)肽和肽YY或其截短物或肽类似物。
5.用于上述权利要求任一项的用途的多肽，其中TM结合IL13受体。
6.用于上述权利要求任一项的用途的多肽，其中TM是IL13肽或其截短或肽类似物。
7.用于上述权利要求任一项的用途的多肽，其中非细胞毒性蛋白酶包含梭菌神经毒素L-链或IgA蛋白酶。
8.用于上述权利要求任一项的用途的多肽，其中所述易位结构域包含梭菌神经毒素易位结构域。
9.编码上述权利要求任一项的多肽的核酸。
10.抑制或治疗患者的骨质疏松症的方法，包括对该患者施用有效量的上述权利要求任一项的多肽或核酸。
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