TW202237176A - 疼痛及發炎性失調之治療 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種於治療疼痛或發炎性失調中使用的多肽，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。亦提供對應的治療方法及用途。
Description
本發明係關於使用於療法中的多肽，例如，用於治療疼痛或發炎性失調之多肽之用途。
梭狀芽孢桿菌(
Clostridia)屬中的細菌產生強效且特異性的蛋白質毒素，其可毒害彼等被遞送至之神經元及其它細胞。此種梭狀芽孢桿菌毒素之例包括由破傷風桿菌(C.
tetani) (TeNT)及肉毒桿菌(C.
botulinum) (BoNT)血清型A-G及X(參見WO 2018/009903 A2)所產生的神經毒素、以及由巴氏梭狀芽孢桿菌(C.
baratii)及酪酸梭狀芽孢桿菌(C.
butyricum)所產生者。破傷風及肉毒桿菌毒素兩者係藉由抑制受影響之神經元的功能而作用，特別是神經傳導物質的釋放。而肉毒桿菌毒素作用於神經肌肉會合處並在周圍神經系統中抑制膽鹼性傳導(cholinergic transmission)，破傷風毒素則作用於中樞神經系統。
自然界中，梭狀芽孢桿菌神經毒素係以單鏈多肽的方式被合成，其係藉由蛋白酶切割事件進行轉譯後修飾，而形成藉由雙硫鍵連結在一起的兩條多肽鏈。切割發生於特定切割位(cleavage site)，通常稱為活化位(activation site)，其位於提供鏈間(inter-chain)雙硫鍵之半胱胺酸殘基之間。此雙鏈形式為此毒素之活性形式。此兩鏈被稱為重鏈(H鏈)，其具有約100 kDa之分子量；及輕鏈(L鏈)，其具有約50kDa之分子量。此H鏈包含N端轉移組件(translocation component) (H
N域)及C端靶向組件(targeting component) (H
C域)。此切割位係位於L鏈及轉移域組件之間。於H
C域結合至其目標神經元且所結合的毒素經由胞內體(endosome)內化至細胞中後，H
N域將L鏈轉移通過胞內體膜並進入胞質液內，且L鏈提供一種蛋白酶功能(亦已知為非細胞毒性(non-cytotoxic)蛋白酶)。
非細胞毒性蛋白酶係藉由將已知為SNARE蛋白(例如，SNAP-25、VAMP、或突觸融合蛋白(Syntaxin))之細胞內運輸蛋白進行蛋白酶切割而作用。首字母縮略詞SNARE衍生自可溶性NSF固著受體(
Soluble
NSF
Attachment
Receptor)一詞，其中NSF意指N-乙基馬來醯亞胺敏感性因子(
N-ethylmaleimide-
Sensitive
Factor)。SNARE蛋白對於細胞內囊泡融合為不可或缺的，因此對於自細胞經由囊泡運輸之分子分泌為不可或缺的。此蛋白酶功能為鋅依賴型內肽酶活性且展現對SNARE蛋白之高受質特異性。因此，一旦被遞送至所欲標的細胞，此非細胞毒性蛋白酶能夠抑制自標的細胞的細胞分泌。梭狀芽孢桿菌神經毒素之L鏈蛋白酶係切割SNARE蛋白之非細胞毒性蛋白酶。
鑒於SNARE蛋白之普遍存在的性質，梭狀芽孢桿菌神經毒素諸如肉毒桿菌毒素已被成功地運用在廣泛的療法中。
梭狀芽孢桿菌神經毒素已知有一些最強效的毒素。舉例而言，肉毒桿菌神經毒素視其血清型而定，對於小鼠具有範圍從0.5至5 ng/kg之半數致死劑量(LD
50)值。因此，該毒素之使用並非没有風險。咸信毒素從投予部位擴散並進入周圍組織或全身循環為梭狀芽孢桿菌神經毒素治療之不希望的副作用的原因，於極端情況下可能危及生命。當以高的劑量、濃度及/或注射量使用梭狀芽孢桿菌神經毒素時，此可為一特別值得關注的問題。對於商業化的BoNT/A療法已報導的不良反應，包括衰弱、廣義肌肉無力、複視、上瞼下垂、吞嚥困難、發聲障礙(dysphonia)、構音障礙(dysarthria)、尿失禁、及呼吸困難。吞嚥及呼吸困難可能危及生命，且已報導死亡與毒素效應的擴散有關。
本發明克服上述問題之一或多者。
[發明概要]
本發明人等發現非催化活性的(catalytically inactive)梭狀芽孢桿菌神經毒素在治療疼痛為有效的。此發現特別令人驚訝，因為咸信導致SNARE蛋白切割的催化活性係潛在於梭狀芽孢桿菌神經毒素療法中必要的作用機制。因此，本發明之多肽避免與傳統的催化活性(catalytically active)的梭狀芽孢桿菌神經毒素療法有關的毒性副作用且有助於較安全的(實質上無毒性的)治療。有利地，當與傳統的催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素治療比較時，本發明之多肽能以較大的量來投劑。此外，本發明之多肽之減少的毒性使得在整個產品生命週期中易於製造及處理並消除醫生進行為了於對象避免毒性之複雜的(例如，個性化)投劑方案計算的需求。
同樣令人驚訝地，本發明人等發現非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素在治療發炎性失調為有效的。
【圖式簡單説明】
現僅藉由例示的方式，參考下列圖式及實施例描述本發明之具體實施例。
圖1顯示投予BoNT/A或BoNT/A(0)的人類神經元細胞中之SNAP25切割%。
圖2顯示投予BoNT/A或BoNT/A(0)的大鼠神經元細胞中之SNAP25切割%。
圖3(A)顯示藉由尾巴而被懸吊的小鼠之特徵的驚嚇反應。(B)顯示用於趾外展分數(Digit Abduction Score) (DAS)分析的評分。
圖4(A)呈示使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠(220-250 g)的慢性神經病變性疼痛之慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury) (CCI)模式之研究的實驗示意圖。指出BoNT/A(0) (60 pg/kg i.pl.投予)、BoNT/A (30 pg/kg足底(i.pl.)投予)、BoNT/A (60 pg/kg i.pl.投予)、媒液(明膠磷酸鹽緩衝液(Gelatine Phosphate Buffer (GPB)) i.pl.投予-陰性對照)或加巴噴丁(gabapentin) (100 mg/kg p.o.投予-陽性對照)投予前及投予後之日(D)。投予發生於第0日(D0)且CCI手術於第-14日進行。vF表示於所指示日進行馮・弗雷試驗(von Frey test)。(B)顯示如(A)中所述投予的動物隨著時間推移之同側腳掌(即，投予對照組成物、BoNT/A或BoNT/A(0)的腳掌)的機械敏感性(經由馮・弗雷試驗測量)。(C)顯示如(A)中所述投予的動物隨著時間推移之對側腳掌(即，未投予對照組成物、BoNT/A或BoNT/A(0)的腳掌)的機械敏感性(經由馮・弗雷試驗測量)。(D)顯示如(A)中所述投予的大鼠隨著時間推移之體重變化。
圖5(A)呈示使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠中急性奧沙利鉑(oxaliplatin)誘導的神經病變性疼痛的模式之研究的實驗示意圖。於第0日(D0)投予奧沙利鉑(10 mg/kg腹膜內(i.p.)投予)及BoNT/A(0) (1000 pg/kg i.pl.投予)、BoNT/A (50 pg/kg i.pl.投予)、BoNT/A (100 pg/kg i.pl.投予)、BoNT/A (160 pg/kg i.pl.投予)、或媒液(GPB i.pl.投予-陰性對照)。作為奧沙利鉑處理的另一陰性對照，一大鼠的子集係投予5%葡萄糖i.p.及GBP (i.pl.投予)。於D3試驗之前1h投予度洛西汀(duloxetine) (100 mg/kg p.o.投予-陽性對照)。顯示投予後日數及小時。PI表示於所指示日進行腳掌浸液(冷)測試。(B)顯示如(A)中所述投予的動物隨著時間推移之同側腳掌(即，投予對照組成物、BoNT/A或BoNT/A(0)的腳掌)的冷敏感性(經由腳掌浸液試驗測量)。(C)顯示如(A)中所述投予的動物隨著時間推移之對側腳掌(即，未投予對照組成物、BoNT/A或BoNT/A(0)的腳掌)的冷敏感性(經由腳掌浸液試驗測量)。
圖6(A)呈示使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠(180-210 g)的慢性奧沙利鉑誘導的神經病變性疼痛模式之研究的實驗示意圖。於第-2日(D-2)投予奧沙利鉑。於第0日(D0)投予BoNT/A(0) (100 pg/kg i.pl.投予)、BoNT/A (100 pg/kg i.pl.投予)、或媒液(GPB i.pl.投予-陰性對照)。於第3日投予普瑞巴林(pregabalin) (30 mg/kg p.o.投予-陽性對照)。顯示投予前及投予後之日。vF及CP分別表示於所指示日進行馮・弗雷及冷板試驗。(B)顯示如(A)中所述投予的動物隨著時間推移之同側腳掌(即，投予對照組成物、BoNT/A或BoNT/A(0)的腳掌)的機械敏感性(經由馮・弗雷試驗測量)。(C)顯示如(A)中所述投予的動物隨著時間推移之對側腳掌(即，未投予對照組成物、BoNT/A或BoNT/A(0)的腳掌)的機械敏感性(經由馮・弗雷試驗測量)。(D)顯示如(A)中所述投予的動物隨著時間推移之熱敏感性(經由冷板試驗測量)。
圖7(A)呈示使用成年雄性Wistar大鼠(180-210 g)於急性紫外線B(UV-B)曬傷誘導的發炎性疼痛模式之研究的實驗示意圖。於第0日(D0)投予BoNT/A(0) (100 pg/kg i.pl.投予)、BoNT/A (100 pg/kg i.pl.投予)、或媒液(GPB i.pl.投予-陰性對照)。於D3讀出之前1h投予吲哚美辛(indomethacin) (5 mg/kg p.o.投予-陽性對照)。於第1日(D1)將大鼠暴露於UV-B (500 mJ/cm
2)。vF表示於所指示日進行馮・弗雷試驗。(B)顯示如(A)中所述投予的動物之機械敏感性(經由馮・弗雷試驗測量)。
圖8顯示投予媒液、催化活性的嵌合BoNT/XB (0.3 ng/kg，n=10)、催化活性的嵌合BoNT/XB (30 ng/kg，n=10)、非催化活性的嵌合BoNT/XB(0) (0.3 ng/kg，n=10)、非催化活性的嵌合BoNT/XB(0) (30 ng/kg，n=10)、BoNT/A (160 pg/kg，n=10)或吲哚美辛(10 mg/kg，n=9)的小鼠之機械敏感性(經由馮・弗雷試驗測量)。於未治療的動物(基線)、投予BoNT或媒液後2日且完全弗氏佐劑(Complete Freund’s adjuvant) (CFA)投予之前(第0日CFA，第2日)、以及CFA投予後1日(第1日CFA，第3日)顯示敏感性。**P＜0.1，***P＜0.01(重複測量二因子變異數分析(two-way ANOVA)後，相對於媒液的鄧奈特氏多重比較(Dunnett's multiple comparison))。
[發明詳細說明]
於一態樣，本發明提供一種於治療疼痛中使用的多肽(例如，鎮痛性多肽)，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，L鏈為非催化活性的。
於一相關態樣，提供一種治療疼痛之方法，該方法包含對於對象投予多肽(例如，鎮痛性多肽)，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
於另一相關態樣，本發明提供一種多肽(例如，鎮痛性多肽)於製造用於治療疼痛的醫藥中之用途，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
本發明之多肽較佳具有鎮痛性。換言之，本發明之多肽較佳為鎮痛性多肽。
較佳地，本發明之多肽既非促進神經元生長亦非神經元修復以治療疼痛。換言之，較佳地，該多肽並非藉由下列任一手段來治療疼痛：藉由促進神經元生長、藉由促進神經元修復、或藉由促進神經元生長及修復。
於一態樣，本發明提供一種於治療發炎性失調中使用的多肽，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
於一相關態樣，提供一種治療發炎性失調之方法，該方法包含對於對象投予多肽，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
於另一相關態樣，本發明提供一種多肽於製造用於治療發炎性失調之醫藥中之用途，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
本發明之多肽可具有抗發炎性。換言之，本發明之多肽可為抗發炎性多肽。
如本文所述將多肽用於治療發炎性失調，該多肽可包含肉毒桿菌神經毒素血清型X(BoNT/X) L鏈、BoNT/X H
N域、及/或BoNT/X H
C域，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。例如，該多肽可為包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域、以及源自不同(即，非BoNT/X)梭狀芽孢桿菌神經毒素的受體結合域(H
C域)之嵌合肉毒桿菌神經毒素(BoNT)。如此，於一態樣，本發明提供一種於治療發炎性失調中使用的多肽，其中該多肽包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域、以及源自不同(即，非BoNT/X)梭狀芽孢桿菌神經毒素的受體結合域(H
C域)(較佳為BoNT/B H
c域)。亦提供相應的治療方法及用途。
較佳地，本發明之多肽既非促進神經元生長亦非神經元修復以治療發炎性病況。換言之，較佳地，該多肽並未藉由下列任一手段來治療發炎性病況：藉由促進神經元生長、藉由促進神經元修復、或藉由促進神經元生長及修復。
術語「促進神經元生長及/或神經元修復」涵蓋神經元生長及/或神經元修復速率增加。術語「神經元生長及/或神經元修復」涵蓋受損傷的神經元迴路的重建，因而回復神經元網絡或群體中的活性及/或神經元溝通。因此，本文使用之術語「神經元修復」涵蓋特定神經元之修復以及神經元迴路的修復。該術語亦涵蓋神經元可塑性。本文使用之術語「神經元可塑性」涵蓋軸突出芽、樹突出芽、神經新生(例如，新神經元的產生)、成熟、分化、及/或突觸可塑性(例如，包括突觸強度、活性、解剖結構及/或連接性的改變)。術語「促進神經元生長及/或神經元修復」亦涵蓋促進功能性突觸(例如，位於或靠近損傷部位)的建立。本文使用之術語「神經元生長」涵蓋神經元任何部分的生長，包括軸突及/或樹突的生長。該術語涵蓋神經突長度、神經突數目(例如，每個細胞的神經突數目)之增加、及/或自神經元的細胞體或細胞膜突出的長度及/或數目的增加，例如，神經元之軸突生長及/或軸突出芽，例如，於對象中的神經元。該軸突生長可促進神經元之間的連結及/或化學溝通。
較佳地，本發明之多肽不促進神經免疫反應以治療疼痛或發炎性失調。於此上下文中神經免疫反應涵蓋小神經膠質細胞的反應。因此，於一具體實施例，本發明之多肽並未促進小神經膠質細胞的反應以治療疼痛或發炎性病況。
於一較佳具體實施例，疼痛並非與腦失調有關、或由其所引起的疼痛。於另一較佳具體實施例，發炎性失調並非發炎性腦失調。於此上下文所使用的術語「腦失調」可與「腦疾病」互換。於此上下文所使用之「腦失調」涵蓋源於大腦內部或外部的失調，包括與造成腦組織損傷的身體傷害有關的失調。於此上下文中涵蓋的腦失調之例包括下列之任一者(或多者)：創傷性腦損傷、癌症(例如，腦腫瘤)、感染性疾病(例如，腦炎、腦膜炎、腦膿瘍、及腦炎)、中風、神經退化性失調(例如，阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、帕金森氏症相關的失調、運動神經元疾病(例如，肌肉萎縮性脊髓側索硬化症)、普里昂疾病(prion disease)、杭丁頓氏症(Huntington’s disease)、脊髓小腦性失調症(spinocerebellar ataxia)、運動失調症、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、及額顳葉退化症(frontotemporal lobar degeneration))、腦動脈瘤、多發性硬化症、缺氧性損傷、毒性損傷及代謝性損傷。腦失調可由下列引起：創傷性腦損傷、癌症、感染性疾病(例如，腦炎、腦膜炎、腦膿瘍、及腦炎)、中風、神經退化性失調(例如，阿茲海默症、帕金森氏症、帕金森氏症相關的失調、運動神經元疾病(例如，肌肉萎縮性脊髓側索硬化症)、普里昂疾病、杭丁頓氏症、脊髓小腦性失調症、運動失調症、哈勒沃登-施帕茨病、額顳葉退化症)、腦動脈瘤、多發性硬化症、缺氧性損傷、毒性損傷及/或代謝性損傷。
活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈具有非細胞毒性蛋白酶活性。具體而言，活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈具有內肽酶活性且能夠在目標細胞中切割胞吐融合構造的蛋白質。胞吐融合構造的蛋白質較佳為SNARE蛋白，如SNAP-25、突觸小泡蛋白(synaptobrevin)/VAMP、或突觸融合蛋白。
本文中關於梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈而使用之術語「非催化活性的」意指該L鏈實質上無展現非細胞毒性蛋白酶活性，較佳地，本文中關於梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈而使用之術語「非催化活性的」意指該L鏈無展現非細胞毒性蛋白酶活性。於一具體實施例，非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈為不切割目標細胞中胞吐融合構造之蛋白質者。術語「實質上無非細胞毒性蛋白酶活性」意指梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈具有少於催化活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈之非細胞毒性蛋白酶活性的5%，例如少於催化活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈之非細胞毒性蛋白酶活性的2%、1%或較佳少於0.1%。非細胞毒性蛋白酶活性可藉由下述而於活體外確定：將試驗梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈與SNARE蛋白一起培養，並比較當與於相同條件下由催化活性梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈所切割的SNARE蛋白的量比較時，由試驗梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈所切割的SNARE蛋白的量。可使用常規技術，如SDS-PAGE及西方印漬術(Western blotting)以定量所切割的SNARE蛋白的量。適合的活體外分析述於WO 2019/145577 A1，其藉由引用併入本文中。
基於細胞且為活體內的試驗亦可用於確定包含L鏈及功能性細胞結合與轉移域之梭狀芽孢桿菌神經毒素是否具有非細胞毒性蛋白酶活性。如趾外展分數(DAS)分析、背根神經節(DRG)分析、脊髓神經元(SCN)分析、及小鼠膈神經半側橫膈膜(phrenic nerve hemidiaphragm) (PNHD)分析在本技術領域中為常規分析。用於確定非細胞毒性蛋白酶活性之適合的分析可為述於Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001或Donald
et al(2018), Pharmacol Res Perspect, e00446, 1-14之一者，其藉由引用併入本文中。
非催化活性的L鏈可具有不活化該催化活性的一或多個突變。如此，催化活性L鏈(例如，如本文所述)可被修飾以導入不活化L鏈之催化活性的一或多個突變。例如，非催化活性的L鏈可包含活性位殘基的突變。突變可為取代或刪除，然而較佳為取代，尤其是以化學上相似的胺基酸的取代。麩胺酸可被麩醯胺酸取代、組胺酸可被酪胺酸取代、精胺酸可被麩醯胺酸取代、及/或酪胺酸可被苯丙胺酸取代。或者，任何殘基可被丙胺酸取代。
非催化活性的BoNT/A L鏈可包含於H223、E224、H227、E262、R363、及/或Y366的突變，較佳為至少於E224及H227。較佳地，非催化活性的BoNT/A L鏈可包含於E224以麩醯胺酸之取代(E224Q)及於H227以酪胺酸之取代(H227Y)。位置編號對應SEQ ID NO：60之胺基酸位置且可藉由將多肽與SEQ ID NO：60比對而確定。由於SEQ ID NO：60之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：60包括甲硫胺酸的情形，位置編號將如上定義(例如，His223將為SEQ ID NO：60之His223)。或者，於該甲硫胺酸不存在於SEQ ID NO：60的情形，胺基酸殘基編號應以-1修改(例如，His223將為SEQ ID NO：60之His222)。當本文所述的其它多肽序列的位置1的甲硫胺酸存在/不存在時，適用類似的考量，且所屬技術領域中具有通常知識者將使用本技術領域常規技術而容易決定正確的胺基酸殘基編號。
非催化活性的BoNT/B L鏈於E231及/或H234可包含突變，較佳為E231及H234。較佳地，非催化活性的BoNT/B L鏈包含於E231以麩醯胺酸之取代(E231Q)及於H234以酪胺酸之取代(H234Y)。位置編號對應SEQ ID NO：52之胺基酸位置且可藉由將多肽與SEQ ID NO：52比對而確定。由於SEQ ID NO：52之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。
非催化活性的BoNT/C L鏈可包含於H229、E230及/或H233的突變，較佳為H229、E230及H233。較佳地，非催化活性的BoNT/C L鏈包含於H229以甘胺酸之取代(H229G)、於E230以蘇胺酸之取代(E230T)、及於H233以天冬醯胺酸之取代(H233N)。位置編號對應SEQ ID NO：53之胺基酸位置且可藉由將多肽與SEQ ID NO：53比對而確定。由於SEQ ID NO：53之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。
非催化活性的BoNT/D L鏈可包含於H229、E230、H233及/或H236的突變，較佳為至少於E230及H236。較佳地，非催化活性的BoNT/D L鏈包含至少於E230以麩醯胺酸之取代(E230Q)及於H236以酪胺酸之取代(H236Y)。位置編號對應SEQ ID NO：54之胺基酸位置且可藉由將多肽與SEQ ID NO：54比對而確定。由於SEQ ID NO：54之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。
非催化活性的BoNT/E L鏈可包含於E213及/或H216的突變，較佳為於E213及H216。較佳地，非催化活性的BoNT/E L鏈包含於E213以麩醯胺酸之取代(E213Q)及H216以酪胺酸之取代(H216Y)。位置編號對應SEQ ID NO：55之胺基酸位置且可藉由將多肽與SEQ ID NO：55比對而確定。由於SEQ ID NO：55之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。
非催化活性的BoNT/F L鏈可包含於E228及/或H231的突變，較佳為於E228及H231。較佳地，非催化活性的BoNT/F L鏈包含於E228以麩醯胺酸之取代(E228Q)及H231以酪胺酸之取代(H231Y)。位置編號對應SEQ ID NO：56之胺基酸位置且可藉由將多肽與SEQ ID NO：56比對而確定。由於SEQ ID NO：56之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。
非催化活性的BoNT/G L鏈可包含於E231及/或H234的突變，較佳為於E231及H234。較佳地，非催化活性的BoNT/G L鏈包含於E231以麩醯胺酸之取代(E231Q)及H234以酪胺酸之取代(H234Y)。位置編號對應SEQ ID NO：57之胺基酸位置且可藉由將多肽與SEQ ID NO：57比對而確定。由於SEQ ID NO：57之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。
非催化活性的BoNT/X L鏈可包含於E228及/或H231的突變，較佳為於E228及H231。較佳地，非催化活性的BoNT/X L鏈包含於E228以麩醯胺酸之取代(E228Q)及H231以酪胺酸之取代(H231Y)。位置編號對應SEQ ID NO：59之胺基酸位置且可藉由將多肽與SEQ ID NO：59比對而確定。由於SEQ ID NO：59之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。
非催化活性的TeNT L鏈可包含於E234、R372、及/或Y375的突變，較佳為於至少R372及Y375(例如，於E234、R372、及Y375)。較佳地，非催化活性的TeNT L鏈包含於R372以麩醯胺酸或丙胺酸之取代(R372Q或R372A)，更佳為以丙胺酸；及於Y375以苯丙胺酸之取代(Y375F)。位置編號對應SEQ ID NO：58之胺基酸位置且可藉由將多肽與SEQ ID NO：58比對而確定。由於SEQ ID NO：58之位置1的甲硫胺酸殘基的存在為非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。
本發明之多肽可包含全長梭狀芽孢桿菌神經毒素(其但書為L鏈為非催化活性的)或不具有非細胞毒性蛋白酶活性之梭狀芽孢桿菌神經毒素之片段(例如，H
N域及/或H
C域)。換言之，本發明之多肽不具有非細胞毒性的蛋白酶活性。
術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」涵蓋由肉毒桿菌(肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C
1、D、E、F、G、及X)、破傷風桿菌(破傷風神經毒素)、酪酸梭狀芽孢桿菌(肉毒桿菌神經毒素血清型E)、及巴氏梭狀芽孢桿菌(肉毒桿菌神經毒素血清型F)所產生的毒素。BoNT/A參考序列如SEQ ID NO：51所示。BoNT/B參考序列如SEQ ID NO：52所示。BoNT/C參考序列如SEQ ID NO：53所示。BoNT/D參考序列如SEQ ID NO：54所示。BoNT/E參考序列如SEQ ID NO：55所示。BoNT/F參考序列如SEQ ID NO：56所示。BoNT/G參考序列如SEQ ID NO：57所示。TeNT參考序列如SEQ ID NO：58所示。BoNT/X參考序列如SEQ ID NO：59所示。術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」亦可涵蓋新發現的由非梭狀芽孢桿菌微生物所表現的肉毒桿菌神經毒素蛋白家族成員，諸如：腸球菌(Enterococcus)編碼的毒素，其與BoNT/X序列具有最接近的序列同一性；稻魏斯氏菌(
Weissella oryzae)編碼的毒素，稱為BoNT/Wo (NCBI Ref Seq：WP_027699549.1)，其於W89-W90切割VAMP2；糞腸球菌(
Enterococcus faecium)編碼的毒素(GenBank：OTO22244.1)，其切割VAMP2及SNAP25；及皮氏金黃桿菌(
Chryseobacterium pipero)編碼的毒素(NCBI Ref.Seq：WP_034687872.1)。
如此，梭狀芽孢桿菌神經毒素可選自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、及TeNT(破傷風神經毒素)。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素為肉毒桿菌神經毒素，如選自下列之肉毒桿菌神經毒素：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、及BoNT/X。例如，梭狀芽孢桿菌神經毒素H
N域可為源自BoNT A、B、C
1、D、E、F、G、X或TeNT之H
N域。相似地，L鏈可為源自BoNT A、B、C
1、D、E、F、G、X或TeNT之L鏈，其但書為該L鏈為非催化活性的(例如，已被修飾使其為非催化活性的)。更佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素為BoNT/A。
如上所討論，(全長)梭狀芽孢桿菌神經毒素由兩多肽鏈形成：具有約100 kDa之分子量之重鏈(H鏈)、及具有約50 kDa之分子量之輕鏈(L鏈)。H鏈包含C端靶向組件(受體結合域或H
C域)及N端轉移組件(H
N域)。肉毒桿菌神經毒素(BoNT)係由肉毒桿菌以大蛋白質複合物的形式所產生，由BoNT本身與一些輔助蛋白複合而組成。目前有八種不同類型的肉毒桿菌神經毒素，即：肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、及X，其全部均具有相似的結構及作用模式。可基於藉由特異性中和抗血清的不活化來區分不同的BoNT血清型，此種藉由血清型的分類與胺基酸層級的序列同一性百分比相關。指定血清型之BoNT蛋白係基於胺基酸序列同一性百分比而被進一步分成不同亞型。
傳統的(催化活性的)BoNT在胃腸道中吸收，且在進入全身循環後，結合至膽鹼性神經末梢的突觸前膜上並阻止其神經傳導物質乙醯膽鹼的釋放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F及BoNT/G切割突觸小泡蛋白/囊泡相關的膜蛋白(vesicle-associated membrane protein (VAMP))；BoNT/C1、BoNT/A及BoNT/E切割25 kDa之突觸小體相關蛋白(synaptosomal-associated protein) (SNAP-25)；及BoNT/C1切割突觸融合蛋白。BoNT/X已被發現切割SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、Ykt6、及突觸融合蛋白1。破傷風毒素係由破傷風桿菌以單一血清型產生。酪酸梭狀芽孢桿菌產生BoNT/E，而巴氏梭狀芽孢桿菌產生BoNT/F。
於一具體實施例，本發明之多肽可由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列所編碼：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49，其但書為當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。於一具體實施例，本發明之多肽可由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列所編碼：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、或49，其但書為當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。較佳地，本發明之多肽可由包含下列SEQ ID NO之任一者之核苷酸序列所編碼：1、7、9、11、13、15、17、21、25、29、33、37、41、43、45、47、或49。
於一具體實施例，本發明之多肽可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性的多肽序列：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、74、75或76，其但書為當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。於一具體實施例，本發明之多肽可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、74、75或76，其但書為當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。較佳地，本發明之多肽可包含下列SEQ ID NO之任一者的多肽序列：2、8、10、12、14、16、18、22、26、30、34、38、42、44、46、48、50、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、74、75或76。
於一具體實施例，本發明之多肽可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性的多肽序列的片段：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70，其但書為當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。於一具體實施例，本發明之多肽可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列的片段：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70，其但書為當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。較佳地，本發明之多肽可包含一包含下列SEQ ID NO之任一者的多肽序列的片段：2、10、12、14、16、18、26、34、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70，其但書為當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。該片段可為該SEQ ID No之非催化活性的L鏈、H
N域或H
C域。
較佳地，本發明之多肽包含(或由其組成)非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈。在本文中提及非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素亦涵蓋梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈之片段。梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈之≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50個胺基酸殘基。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈之片段具有梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈之至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200個胺基酸殘基。例如，梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈之20-400、50-300或100-200個胺基酸殘基。然而，較佳為提及非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素係指全長非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈。
L鏈參考序列之例包括：
A型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-448
B型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-440
C1型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-441
D型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-445
E型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-422
F型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-439
G型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基1-441
破傷風神經毒素：胺基酸殘基1-457
對於最近鑑定的BoNT/X，已報告L鏈對應於其胺基酸1-439，其中L鏈邊界可能變化約25個胺基酸(例如1-414或1-464)。
上述識別的參考序列應被視為指引，因為根據亞血清型可能發生輕微的變化。舉例而言，US 2007/0166332(於此藉由引用完整併入)引用些為不同的梭狀芽孢桿菌序列：
A型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K448
B型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K441
C1型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K449
D型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-R445
E型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-R422
F型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K439
G型肉毒桿菌神經毒素：胺基酸殘基M1-K446
破傷風神經毒素：胺基酸殘基M1-A457
於此描述適合的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈。
梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性的多肽序列：6、24、32、40、74或76，其但書為該L鏈為非催化活性的(例如，該L鏈已藉由修飾而不活化)。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列：6、24、32、40、74或76，其但書為該L鏈為非催化活性的(例如，該L鏈已藉由修飾而不活化)。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈包含(更佳由其組成)一包含下列SEQ ID NO之任一者的多肽序列：6、24、32或40，其已被修飾以使該L鏈為非催化活性的，例如SEQ ID NO：74或76。
梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈可為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列所編碼者：5、23、31或39，其但書為該L鏈為非催化活性的(例如，該L鏈已藉由修飾而不活化)。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列所編碼者：5、23、31或39，其但書為該L鏈為非催化活性的(例如，該L鏈已藉由修飾而不活化)。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈為由包含下列之SEQ ID NO之任一者之核苷酸序列所編碼者：5、23、31或39，其已被修飾以使該L鏈為非催化活性的。
考慮到治療疼痛的功效不需要輕鏈的催化活性，因此不包含L鏈(或僅包含L鏈的片段)的多肽可治療疼痛係可信的。基於類似的理由，不包含L鏈(或僅包含L鏈的片段)的多肽可治療發炎性病況係可信的。因此，於一具體實施例，該多肽可包含梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)。於一具體實施例，本發明之多肽不包含梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)兩者。
於一具體實施例，本發明之多肽包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈(H鏈)。該H鏈包含梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及受體結合域(H
C域)。在此上下文中提及梭狀芽孢桿菌神經毒素H鏈亦涵蓋梭狀芽孢桿菌神經毒素H鏈之片段。梭狀芽孢桿菌神經毒素H鏈之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素H鏈之≤800、≤700、≤600、≤500、≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50個胺基酸殘基。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經H鏈之片段具有梭狀芽孢桿菌神經毒素H鏈之至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200個胺基酸殘基。例如，梭狀芽孢桿菌神經H鏈之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經H鏈之20-800、30-600、40-400、50-300或100-200個胺基酸殘基。然而，較佳為提及H鏈係指全長H鏈。
於一具體實施例，本發明之多肽包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)。在此上下文中提及梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域亦涵蓋轉移域之片段。梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域之≤400、≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50個胺基酸殘基。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域之片段具有梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域之至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200個胺基酸殘基。例如，梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域之20-400、50-300或100-200個胺基酸殘基。然而，較佳為提及轉移域係指全長轉移域。
轉移域為梭狀芽孢桿菌神經毒素之H鏈的片段，約相當於H鏈胺基末端的一半、或者與完整-H鏈中該片段相對應的域。於一具體實施例，H鏈之H
C功能可藉由刪除H
C胺基酸序列(在DNA合成層級或在藉由核酸酶或蛋白酶處理的合成後層級)而去除。或者，H
C功能可藉由化學或生物處理而不活化。如此，於一些具體實施例，H鏈可為不能結合至天然梭狀芽孢桿菌神經毒素(即全毒素)所結合的目標細胞上的結合位。
適合的(參考)轉移域之例包括：
A型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(449-871)
B型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(441-858)
C型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(442-866)
D型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(446-862)
E型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(423-845)
F型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(440-864)
G型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(442-863)
破傷風神經毒素-胺基酸殘基(458-879)
上述識別的參考序列應被視為指引，因為根據亞血清型可能發生輕微的變化。舉例而言，US 2007/0166332(於此藉由引用該文而併入)引用些微不同的梭狀芽孢桿菌序列：
A型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(A449-K871)
B型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(A442-S858)
C型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(T450-N866)
D型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(D446-N862)
E型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(K423-K845)
F型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(A440-K864)
G型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(S447-S863)
破傷風神經毒素-胺基酸殘基(S458-V879)
於本發明的上下文中，包含轉移域的多種梭狀芽孢桿菌神經毒素H
N區域可用於本發明的態樣。來自梭狀芽孢桿菌神經毒素之重鏈的H
N區域為約410-430個胺基酸長且包含轉移域。研究已顯示來自梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈的H
N區域的全長對於轉移域的轉移活性並非必要。如此，此具體實施例的態樣可包括梭狀芽孢桿菌神經毒素H
N區域，其包含具有例如下列長度之轉移域：至少350個胺基酸、至少375個胺基酸、至少400個胺基酸、及至少425個胺基酸。此具體實施例的其它態樣可包括梭狀芽孢桿菌神經毒素H
N區域，其包含具有例如下列長度之轉移域：最多350個胺基酸、最多375個胺基酸、最多400個胺基酸、及最多425個胺基酸。
有關肉毒桿菌及破傷風桿菌中毒素產生的遺傳基礎的更多詳細內容，參見Henderson
et al(1997) in
The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press。
術語H
N涵蓋天然存在的神經毒素H
N部分、以及具有於自然界中不存在的胺基酸序列及/或合成的胺基酸殘基之經修飾的H
N部分。於一具體實施例，該經修飾的H
N部分仍展現上述轉移功能。
於一具體實施例，本發明之多肽包含(或由其組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)。於此上下文中提及梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)亦涵蓋梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)之片段。梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)之≤350、≤300、≤250、≤200、≤150、≤100或≤50個胺基酸殘基。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)之片段具有梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)之至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或200個胺基酸殘基。例如，梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)之片段可具有梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)之20-350、50-300或100-200個胺基酸殘基。然而，較佳為提及梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)係指全長的梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)。
梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)參考序列之例包括：
BoNT/A-N872-L1296
BoNT/B-E859-E1291
BoNT/C1-N867-E1291
BoNT/D-S863-E1276
BoNT/E-R846-K1252
BoNT/F-K865-E1274
BoNT/G-N864-E1297
TeNT-I880-D1315
對於最近鑑定的BoNT/X，已報告H
C域對應於其胺基酸893-1306，其中該域邊界可能變化約25個胺基酸(例如868-1306或918-1306)。
梭狀芽孢桿菌神經毒素H鏈(例如，H
C域部分)可進一步包含轉移促進域(或其片段可為轉移促進域片段)。該域促進將L鏈遞送至目標細胞的胞質液中，並且例如已描述於WO 08/008803及WO 08/008805中，其各自藉由引用併入本文。
舉例而言，轉移促進域可包含梭狀芽孢桿菌神經毒素H
CN域或其片段或變異體。更詳細而言，梭狀芽孢桿菌神經毒素H
CN轉移促進域可具有至少200個胺基酸、至少225個胺基酸、至少250個胺基酸、至少275個胺基酸之長度。於此方面，梭狀芽孢桿菌神經毒素H
CN轉移促進域較佳具有最多200個胺基酸、最多225個胺基酸、最多250個胺基酸、或最多275個胺基酸之長度。特定(參考)例包括：
A型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(872-1110)
B型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(859-1097)
C型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(867-1111)
D型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(863-1098)
E型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(846-1085)
F型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(865-1105)
G型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(864-1105)
破傷風神經毒素-胺基酸殘基(880-1127)
上述序列位置根據血清型/亞型可能有些許變化，適合的(參考)梭狀芽孢桿菌神經毒素H
CN域的另外例子包括：
A型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(874-1110)
B型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(861-1097)
C型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(869-1111)
D型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(865-1098)
E型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(848-1085)
F型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(867-1105)
G型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(866-1105)
破傷風神經毒素-胺基酸殘基(882-1127)
於此描述適合的梭狀芽孢桿菌神經毒素H
C域。
梭狀芽孢桿菌神經毒素H
C域可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性的多肽序列：8、22、30、38、42、44、46、48或50。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素H
C域包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列：8、22、30、38、42、44、46、48或50。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素H
C域包含(更佳為由其組成)一包含下列SEQ ID NO之任一者的多肽序列：8、22、30、38、42、44、46、48或50。
梭狀芽孢桿菌神經毒素H
C域可為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列所編碼者：7、21、29、37、41、43、45、47或49。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素H
C域為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列所編碼者：7、21、29、37、41、43、45、47或49。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素H
C域為由包含下列之SEQ ID NO之任一者之核苷酸序列所編碼者：7、21、29、37、41、43、45、47或49。
任何上述促進域可與任何適用於本發明的前述轉移域肽組合。如此，舉例而言，非梭狀芽孢桿菌促進域可與非梭狀芽孢桿菌轉移域肽組合或與梭狀芽孢桿菌轉移域肽組合。或者，梭狀芽孢桿菌神經毒素H
CN轉移促進域可與非梭狀芽孢桿菌轉移域肽組合。或者，梭狀芽孢桿菌神經毒素H
CN促進域可與梭狀芽孢桿菌轉移域肽組合，其例包括：
A型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(449-1110)
B型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(442-1097)
C型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(450-1111)
D型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(446-1098)
E型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(423-1085)
F型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(440-1105)
G型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(447-1105)
破傷風神經毒素-胺基酸殘基(458-1127)
於一些具體實施例，本發明之肽可缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之功能性H
C域。於一具體實施例，該多肽較佳缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素全毒素之C端最後50個胺基酸。於另一具體實施例，該多肽較佳缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素全毒素之C端最後100個胺基酸殘基，較佳為最後150個，更佳為最後200個，特佳為最後250個，且最佳為最後300個。或者，H
C結合活性可通過誘變而被消除/降低-舉例而言，為了方便而提及BoNT/A，神經節苷脂結合袋(ganglioside binding pocket)中的一個或兩個胺基酸殘基突變(W1266突變為L及Y1267突變為F)之修飾造成H
C區域失去其受體結合功能。可對非血清型A型梭狀芽孢桿菌肽組件進行同功的突變，例如，基於具突變的B型肉毒桿菌(W1262突變為L及Y1263突變為F)或E型肉毒桿菌(W1224突變為L及Y1225突變為F)之構築體。活性位的其它突變達成H
C受體結合活性的相同消除，例如A型肉毒桿菌毒素中的Y1267S及其它梭狀芽孢桿菌神經毒素中對應的高度保留的殘基。此突變及其它突變的詳細內容描述於Rummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634)，其藉由引用而併入於此。
天然梭狀芽孢桿菌神經毒素之H
C肽包含約400-440個胺基酸殘基，且由兩個功能不同的域組成，每個域約25kDa，即N端區域(通常稱為H
CN肽或域)及C端區域(通常稱為H
CC肽或域)。此事實藉由下列公開文獻確認，其各者藉由引用完整併入本文：Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792；Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204；Halpern J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pp. 11188-11192；Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364；Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902；Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90；Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759；及Rummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643。此外，已有文獻充分證明C端區域(H
CC)，其構成C端160-200個胺基酸殘基，負責梭狀芽孢桿菌神經毒素與其天然細胞受體之結合，即與神經肌肉會合處的神經末梢之結合-此事實亦藉由上述公開文獻證實。如此，本說明書全文中，提及缺乏功能性重鏈H
C肽(或域)的梭狀芽孢桿菌重鏈，使得該重鏈無法與天然梭狀芽孢桿菌神經毒素結合的細胞表面受體結合，表示該梭狀芽孢桿菌重鏈僅缺少功能性H
CC肽。換言之，H
CC肽區域可被部分或全部刪除，或者經其它方式修飾(例如通過常規化學或蛋白水解處理)以降低其對神經肌肉會合處的神經末梢的天然結合能力。
如此，於一具體實施例，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素H
N肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之C端肽部分(H
CC)的部分，因此缺少天然梭狀芽孢桿菌神經毒素之H
C結合功能。舉例而言，於一具體實施例，C端延長的梭狀芽孢桿菌H
N肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之C端40個胺基酸殘基、或C端60個胺基酸殘基、或C端80個胺基酸殘基、或C端100個胺基酸殘基、或C端120個胺基酸殘基、或C端140個胺基酸殘基、或C端150個胺基酸殘基、或C端160個胺基酸殘基。於另一具體實施例，本發明之梭狀芽孢桿菌H
N肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之完整C端肽部分(H
CC)，因此缺少天然梭狀芽孢桿菌神經毒素之H
C結合功能。舉例而言，於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌H
N肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈之C端165個胺基酸殘基、或C端170個胺基酸殘基、或C端175個胺基酸殘基、或C端180個胺基酸殘基、或C端185個胺基酸殘基、或C端190個胺基酸殘基、或C端195個胺基酸殘基。舉另外例而言，本發明之梭狀芽孢桿菌H
N肽缺少選自由下列所組成的群組之梭狀芽孢桿菌H
CC參考序列：
A型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(Y1111-L1296)
B型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(Y1098-E1291)
C型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(Y1112-E1291)
D型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(Y1099-E1276)
E型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(Y1086-K1252)
F型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(Y1106-E1274)
G型肉毒桿菌神經毒素-胺基酸殘基(Y1106-E1297)
破傷風神經毒素-胺基酸殘基(Y1128-D1315)。
上述識別的參考序列應被視為指引，因為根據亞血清型可能發生輕微的變化。
於其它具體實施例，H
C域之片段可包含如本文所述的H
CC肽。
本發明之多肽可包含非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)。例如，多肽可包含非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N)。
於此描述適合的包含非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及轉移域的多肽。
包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及轉移域的多肽可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性的多肽序列：4、20、28、36或75，其但書為該L鏈為非催化活性的(例如，該L鏈已藉由修飾而不活化)。於一包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及轉移域的多肽，包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列：4、20、28、36或75，其但書為該L鏈為非催化活性的(例如，該L鏈已藉由修飾而不活化)。較佳地，包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及轉移域的多肽，包含(更佳係由其所組成)一包含下列SEQ ID NO之任一者的多肽序列：4、20、28、36或75，其已被修飾以使L鏈為非催化活性的，如SEQ ID NO：75。
包含(或由其所組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及轉移域的多肽可為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列所編碼者：3、19、27或35，其但書為該L鏈為非催化活性的(例如，該L鏈已藉由修飾而不活化)。於一具體實施例，包含(或由其所組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及轉移域的多肽為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列所編碼者：3、19、27或35，其但書為該L鏈為非催化活性的(例如，該L鏈已藉由修飾而不活化)。較佳地，包含(或由其所組成)梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及轉移域的多肽為由包含下列之SEQ ID NO之任一者之核苷酸序列所編碼者：3、19、27或35，其已被修飾以使所編碼的L鏈為非催化活性的。
較佳地，該多肽包含非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)、及梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)。
於一具體實施例，本發明之多肽不包含梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C)或至少梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
CC)之C端部分。如此，於一具體實施例，本發明之多肽缺乏梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
CC)之C端部分。有利地，此種多肽缺乏內源性梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合能力，因此於投予該多肽的對象中可展現較少的脫靶效應(off-target effects)。
本發明之多肽可基本上由非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)所組成。例如，多肽可基本上由非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N)所組成。
較佳地，多肽基本上由非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)、及梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)所組成。
此上下文使用的術語「基本上由…所組成」意指多肽不包含另外的賦予該多肽額外功能性的一或多個胺基酸殘基，例如，當被投予至對象時。換言之，「基本上由」非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)「所組成」的多肽可包含另外的一或多個胺基酸殘基(對於彼等之非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域))但該一或多個另外的胺基酸殘基不賦予多肽額外的功能性，例如，當被投予至對象時。額外的功能性可包括酵素活性、結合活性及/或任何不拘的生理學活性。
本發明之多肽可由非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)所組成。例如，多肽可由非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N)所組成。
較佳地，多肽由非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H
N域)、及梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H
C域)所組成。
於一具體實施例，除了任何梭狀芽孢桿菌神經毒素序列之外，多肽亦可包含非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列，只要該非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列不擾亂多肽實現其治療效果(例如治療疼痛)的能力。較佳地，該非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列並非具有催化活性者，例如，酵素活性。於一具體實施例，本發明之多肽不包含催化活性域(例如，非梭狀芽孢桿菌催化活性域)。於一具體實施例，該非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列並非結合至細胞受體者。換言之，於一具體實施例，該非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列並非細胞受體之配體。細胞受體可為蛋白質的細胞受體，如膜主體蛋白。細胞受體之例可見於IUPHAR Guide to Pharmacology Database, version 2019.4, available at https://www. guidetopharmacology. org/download.jsp#db_reports。非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列可包括有助於純化的標籤，如His標籤。於一具體實施例，本發明之多肽不包含標識或用於添加標識的位點，如分選酶(sortase)受體或供體位。
於一較佳具體實施例，除了非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈、H
N域及/或H
C域之外，本發明之多肽不包含治療或診斷劑(例如，核酸、蛋白質、肽或小分子治療或診斷劑)。例如，於一具體實施例，該多肽可不包含共價或非共價聯結的治療或診斷劑。如此，本發明之多肽較佳係不作為另外的治療或診斷劑的遞送載體而作用。
本發明之多肽可包含(或由其組成)經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素或其衍生物、或經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素片段或衍生片段，包括但不限於下述者，其但書為存在的任何L鏈均為非催化活性的。經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素或衍生物(或經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素片段或衍生片段)可含有與梭狀芽孢桿菌神經毒素(或梭狀芽孢桿菌神經毒素片段)之天然的(未經修飾的)形式相比而經修飾的一或多個胺基酸；或可含有不存在於梭狀芽孢桿菌神經毒素(或梭狀芽孢桿菌神經毒素片段)之天然的(未經修飾的)形式中的一或多個插入的胺基酸。舉例而言，相對於天然(未經修飾的)梭狀芽孢桿菌神經毒素序列(或梭狀芽孢桿菌神經毒素片段)，經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素(或梭狀芽孢桿菌神經毒素片段)可於一或多個域具有經修飾的胺基酸序列。此種修飾可修飾毒素(或毒素片段)的功能方面。如此，於一具體實施例，本發明之多肽為或包含經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素、或經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素衍生物、或梭狀芽孢桿菌神經毒素衍生物、或經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素片段或衍生片段(例如，非催化活性的L鏈、H
N域及/或H
C域)，其但書為任何存在的L鏈為非催化活性的。
本發明之多肽可包含(或由其組成)經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素或梭狀芽孢桿菌神經毒素片段(例如，H
C域)，其於重鏈之胺基酸序列(如經修飾的H
C域)具有一或多個修飾，其中該經修飾的重鏈係以高於或低於天然(未經修飾的)梭狀芽孢桿菌神經毒素或梭狀芽孢桿菌神經毒素片段的結合親和性而結合至目標神經細胞，其但書為任何存在的L鏈為非催化活性的。於H
C域的此種修飾可包括修飾H
C域的神經節苷脂結合位中的殘基或蛋白質(SV2或突觸結合蛋白(synaptotagmin))結合位中的殘基，其改變與目標神經細胞的神經節苷脂受體及/或該蛋白質受體的結合。此等經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素之例被描述於WO 2006/027207及WO 2006/114308中，藉由引用將兩者全文併入本文。
經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素(或梭狀芽孢桿菌神經毒素片段)可為包含一或多個修飾者，當與缺乏該一或多個修飾的等效未經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素(或梭狀芽孢桿菌神經毒素片段)相比，該修飾提高梭狀芽孢桿菌神經毒素之等電點，其但書為任何存在的L鏈為非催化活性的。適合的經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素(其但書為任何存在的L鏈已被修飾為非催化活性的)被描述於下文及WO 2015/004461 A1及WO 2016/110662 A1，其藉由引用併入本文。示例的序列包括本文所述SEQ ID NO：42及62。
於一具體實施例，本發明之多肽可包含經修飾的BoNT/A或其片段(例如，BoNT/A H
C域或其片段)。經修飾的BoNT/A或其片段可為包含位於選自下列之一或多個胺基酸殘基的修飾者：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277。
當與SEQ ID NO：2所示的非催化活性的BoNT/A相比，該修飾可為一修飾，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：2比對而確定。由於SEQ ID NO：2(以及對應本文所述經修飾的BoNT/A多肽或其片段的SEQ ID NO)之位於位置1的甲硫胺酸殘基的存在係非必需的，當確定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：2包括甲硫胺酸的情形，位置編號將如上定義(例如，ASN 886將為SEQ ID NO：2之ASN 886)。或者，於該甲硫胺酸不存在於SEQ ID NO：2的情形，胺基酸殘基編號應以-1修改(例如，ASN 886將為SEQ ID NO：2之ASN 885)。當本文所述的其它多肽序列的位置1的甲硫胺酸存在/不存在時，適用類似的考量，且所屬技術領域中具有通常知識者將使用本技術領域常規技術而容易決定正確的胺基酸殘基編號。
可使用本文所述的用於確定序列同源性及/或序列同一性%的任何方法來進行本文所述的用於確定胺基酸殘基編號的比對。
上面指出用於修飾的胺基酸殘基係表面暴露的胺基酸殘基。
經修飾的BoNT/A或其片段可包含位於選自下列的一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274及THR 1277。
當使用於經修飾的BoNT/A或其片段的上下文時，術語「一或多個胺基酸殘基」較佳意指所指胺基酸殘基之至少2、3、4、5、6或7個。如此，經修飾的BoNT/A或其片段可包含至少2、3、4、5、6或7(較佳為7)個位於所指胺基酸殘基的修飾。經修飾的BoNT/A或其片段可包含1-30、3-20、或5-10個胺基酸修飾。更佳地，當使用於經修飾的BoNT/A或其片段的上下文時，術語「一或多個胺基酸殘基」意指所有之所指胺基酸殘基。
較佳地，除了位於所指胺基酸殘基的一或多個胺基酸修飾之外，當與SEQ ID NO：2相比時，經修飾的BoNT/A或其片段不含有任何進一步的胺基酸修飾。
該修飾可選自：
i.以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；
ii.以不帶電的胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；
iii.以鹼性胺基酸殘基取代不帶電的表面暴露的胺基酸殘基；
iv.鹼性胺基酸殘基之插入；及
v.酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
如上所指之修飾造成經修飾的BoNT/A或其片段當與對應的未經修飾的BoNT/A或其片段比較時，具有增加的正表面電荷及提高的等電點。
等電點(pI)為指定蛋白質之特性。如本技術領域中所熟知，蛋白質係由特定的胺基酸(當於蛋白質中時亦稱為胺基酸殘基)序列製得。二十種標準組之各胺基酸具有不同的側鏈(或R基團)，意指在蛋白質中各胺基酸殘基顯示不同的化學性質，諸如電荷及疏水性。此等性質可受周遭化學環境的影響，諸如溫度及pH。蛋白質之整體化學特性將取決於此等各種因子的總和。
某些胺基酸殘基(如下詳述)具有可顯示取決於周圍pH的電荷之可離子化側鏈。在指定的pH下，此種側鏈是否帶電荷取決於相關的可離子化部分的pKa，其中pKa為來自共軛鹼之特定質子的酸解離常數(Ka)之負對數。
例如，酸性殘基諸如天冬胺酸及麩胺酸，具有pKa值約為4.1(精確pKa值可取決於溫度、離子強度及可離子化基團的微環境)之側鏈羧酸基。如此，此等側鏈於pH 7.4(通常稱為「生理pH」)呈現負電荷。於低pH值，此等側鏈將變成被質子化並喪失其電荷。
相反地，鹼性殘基諸如離胺酸及精胺酸，具有pKa值約為10-12之含氮側鏈基團。因此，此等側鏈於pH 7.4呈現正電荷。於高pH值，此等側鏈將變成被去質子化並喪失其電荷。
因此蛋白質分子之整體(淨)電荷取決於存在於蛋白質中的酸性及鹼性殘基之數目(及其表面暴露程度)及周遭pH。改變周遭pH會改變蛋白質之整體電荷。因此，對於每一種蛋白質有一指定pH，其正及負電荷的數目相等且此蛋白質顯示無總淨電荷。此點已知為等電點(pI)。等電點為蛋白質生物化學中的一標準概念，其為本技術領域中具有通常知識者所熟知。
因此等電點(pI)被定義為蛋白質顯示淨電荷為零之pH值。pI的提高意指蛋白質顯示淨電荷為零需要較高pH值。如此，pI的提高代表於指定pH下，蛋白質之淨正電荷增加。相反地，pI的降低意指蛋白質顯示淨電荷為零所需的pH值較低。如此，pI的降低代表於指定pH下，蛋白質之淨正電荷減少。
在本技術領域本技術領域中測定蛋白質之pI的方法為已知，且為本技術領域中具有通常知識者所熟悉。舉例而言，蛋白質之pI可由存在於蛋白質中之各胺基酸之平均pKa值來計算(「計算的pI」)。此種計算可使用本技術領域中已知的電腦程式進行，如來自ExPASy的Compute pI/MW Tool(https：//web.expasy.org/ compute_pi/)，其為依據本發明計算pI的較佳方法。不同分子之間的pI值之比較應使用相同計算技術/程式進行。
在適當情況下，蛋白質之計算的pI可使用等電聚焦之技術而實驗性地確認(「觀察的pI」)。此技術使用電泳來將蛋白質依據其pI的而分離。等電聚焦一般使用具有固定化pH梯度的凝膠來進行。當施加電場時，蛋白質移動通過pH梯度直到其到達其具零淨電荷的pH，此點即為蛋白質的pI。藉由等電聚焦所提供的結果一般於性質上為相對低的解析，因此本發明人等咸信藉由計算的pI(如上述)所提供的結果更為適用。
除非另有陳述，本說明全文中「pI」意指「計算的pI」。
蛋白質之pI可藉由改變顯露於其表面上的鹼性及/或酸性基團的數目而被提高或降低。此可藉由修飾此蛋白質之一或多個胺基酸而達成。例如，藉由減少酸性殘基的數目或藉由增加鹼性殘基的數目而可提供pI的提高。
本發明之經修飾的BoNT/A或其片段可具有高於非催化活性的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：2)或其片段之至少0.2、0.4、0.5或1 pI單位的pI值。較佳地，經修飾的BoNT/A或其片段可具有至少6.6之pI，例如，至少6.8。
下表列出20種標準胺基酸之性質：
| 胺基酸 | 側鏈 | ||
| 天冬胺酸 | Asp | D | 帶電(酸性) |
| 麩胺酸 | Glu | E | 帶電(酸性) |
| 精胺酸 | Arg | R | 帶電(鹼性) |
| 離胺酸 | Lys | K | 帶電(鹼性) |
| 組胺酸 | His | H | 不帶電(極性) |
| 天冬醯胺酸 | Asn | N | 不帶電(極性) |
| 麩醯胺酸 | Gln | Q | 不帶電(極性) |
| 絲胺酸 | Ser | S | 不帶電(極性) |
| 蘇胺酸 | Thr | T | 不帶電(極性) |
| 酪胺酸 | Tyr | Y | 不帶電(極性) |
| 甲硫胺酸 | Met | M | 不帶電(極性) |
| 色胺酸 | Trp | W | 不帶電(極性) |
| 半胱胺酸 | Cys | C | 不帶電(極性) |
| 丙胺酸 | Ala | A | 不帶電(疏水性) |
| 甘胺酸 | Gly | G | 不帶電(疏水性) |
| 纈胺酸 | Val | V | 不帶電(疏水性) |
| 白胺酸 | Leu | L | 不帶電(疏水性) |
| 異白胺酸 | Ile | I | 不帶電(疏水性) |
| 脯胺酸 | Pro | P | 不帶電(疏水性) |
| 苯丙胺酸 | Phe | F | 不帶電(疏水性) |
下列胺基酸被視為帶電的胺基酸：天冬胺酸(負的)、麩胺酸(負的)、精胺酸(正的)、及離胺酸(正的)。
於pH 7.4，天冬胺酸(pKa 3.1)及麩胺酸(pKa 4.1)之側鏈具有負電荷，而精胺酸(pKa 12.5)及離胺酸(pKa 10.8)之側鏈具有正電荷。天冬胺酸及麩胺酸被稱為酸性胺基酸殘基。精胺酸及離胺酸被稱為鹼性胺基酸殘基。
下列胺基酸被視為不帶電的極性(意指其可參與氫鍵結)胺基酸：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、及色胺酸。
下列胺基酸被視為不帶電的疏水性胺基酸：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、及甘胺酸。
於胺基酸插入，額外的胺基酸殘基(並非通常存在者)被併入BoNT/A多肽序列或其片段，如此，增加於該序列中的胺基酸殘基的總數。於胺基酸刪除，胺基酸殘基自梭狀芽孢桿菌毒素胺基酸序列移除，如此，減少於該序列中的胺基酸殘基的總數。
較佳地，修飾為一取代，其於經修飾的BoNT/A或其片段中有利地維持相同數目的胺基酸殘基。於胺基酸取代，形成BoNT/A多肽序列或其片段之部分的胺基酸殘基被以不同胺基酸殘基置換。置換胺基酸殘基可為如上述之20種標準胺基酸之一者。或者，於胺基酸取代中該置換胺基酸可為非標準胺基酸(非上述20種標準組之部分之胺基酸)。舉例而言，置換胺基酸可為鹼性非標準胺基酸，例如，L-鳥胺酸、L-2-胺基-3-胍基丙酸、或者離胺酸、精胺酸及鳥胺酸之D-異構物)。導入非標準胺基酸至蛋白質之方法為本技術領域已知，並且包括使用大腸桿菌營養缺陷型的表現宿主之重組蛋白質合成。
於一具體實施例，取代係選自：以鹼性胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基、以不帶電的胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基、及以鹼性胺基酸殘基取代不帶電的胺基酸殘基。於一具體實施例，其中取代為以不帶電的胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基，該酸性胺基酸殘基係以其對應的不帶電的醯胺胺基酸殘基置換(即，天冬胺酸係以天冬醯胺酸置換、及麩胺酸係以麩醯胺酸置換)。
較佳地，鹼性胺基酸殘基為離胺酸殘基或精胺酸殘基。換言之，該取代係以離胺酸或精胺酸取代。最佳地，修飾為以離胺酸取代。
較佳地，於本發明使用之經修飾的BoNT/A或其片段包含位於梭狀芽孢桿菌毒素H
CN域的4至40個胺基酸修飾。該經修飾的BoNT/A或其片段較佳亦具有至少6.6之pI。該經修飾的BoNT/A較佳包含選自下列之至少4個胺基酸的修飾：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、及ASN 1052；其中該修飾包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基來取代胺基酸。例如，該經修飾的BoNT/A或其片段可包含選自下列之至少5個胺基酸的修飾：ASN 886、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、及GLN 1229；其中該修飾包含以離胺酸殘基或精胺酸殘基來取代胺基酸。
藉由胺基酸殘基之取代、插入或刪除進行修飾蛋白質的方法為本技術領域已知。舉例而言，藉由編碼多肽之DNA序列(例如，編碼未經修飾的的BoNT/A或其片段)之修飾可導入胺基酸修飾。此可使用標準分子選殖技術而達成，例如：藉由定點誘變(site-directed mutagenesis)，其中使用聚合酶酵素，使用編碼所欲胺基酸之短股DNA(寡核苷酸)來置換原始編碼序列；或藉由以各種酵素(例如，連接酶及限制性核酸內切酶)來插入/刪除部分之基因。或者，可化學合成經修飾的基因序列。
於一具體實施例，依據本發明之使用的多肽包含：與SEQ ID NO：42具有至少70%序列同一性之多肽序列及/或由與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性之核苷酸序列所編碼的多肽序列。於一具體實施例，依據本發明之使用的多肽包含與SEQ ID NO：42具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列。較佳地，依據本發明之使用的多肽包含如SEQ ID NO：42所示的多肽序列。於一具體實施例，依據本發明之使用的多肽包含由與SEQ ID NO：41具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的核苷酸序列所編碼的多肽序列。較佳地，依據本發明之使用的多肽包含由如SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列所編碼的多肽序列。
於一具體實施例，依據本發明之使用的多肽包含與SEQ ID NO：62具有至少70%序列同一性之多肽序列。於一具體實施例，依據本發明之使用的多肽包含與SEQ ID NO：62具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列。較佳地，依據本發明之使用的多肽包含(更佳為由其所組成)如SEQ ID NO：62所示的多肽序列。
SEQ ID NO：42為經修飾的BoNT/A片段之一例且SEQ ID NO：62為非催化活性的經修飾的BoNT/A多肽之一例。此種經修飾的BoNT/A多肽及片段對於本發明的使用為特佳。如SEQ ID NO：42及62所示的多肽，當與野生型BoNT/A相比時，具有一些胺基酸修飾(例如，取代)，其提高該多肽的等電點。不希望受限於理論，咸信增加的淨正電荷促進該多肽與陰離子性細胞外組件之間的靜電交互作用，因而促進該多肽與細胞表面之間的結合，如此增加在投予部位的保留及/或作用期間。如此，設想使用SEQ ID NO：42及62的治療，與等效的缺乏該修飾的多肽相比將為經改善的。
於一具體實施例，包含與SEQ ID NO：42或62具有至少70%序列同一性之多肽序列及/或包含由與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性之核苷酸序列所編碼的多肽序列之多肽，係包含於下列一或多個位置之取代(較佳為二個以上、三個以上、四個以上、五個以上或六個以上，更佳為全部)：位置930、955、991、1026、1052、1229、及886。
較佳地，包含與SEQ ID NO：42或62具有至少70%序列同一性之多肽序列及/或包含由與SEQ ID NO：41具有至少70%序列同一性之核苷酸序列所編碼的多肽序列之多肽，係包含位於930、955、991、1026、1052、1229、及886之一或多個位置的離胺酸或精胺酸(更佳為離胺酸)。於一具體實施例，該多肽包含位於930、955、991、1026、1052、1229、及886之至少二、三、四、五、六或所有位置之離胺酸或精胺酸(更佳為離胺酸)。最佳地，該多肽包含位於930、955、991、1026、1052、1229、及886之所有位置之離胺酸或精胺酸(最佳為離胺酸)。
於一具體實施例，於本發明中使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素H
C域為經修飾的BoNT/A H
C域，其包含選自Y1117、F1252、H1253及L1278的一或多個胺基酸殘基之修飾。例如，經修飾的BoNT/A H
C域可包含一或多個(較佳二或多個)之下列修飾Y1117V、F1252Y、H1253K、及L1278F或L1278H。
於一具體實施例，經修飾的BoNT/A H
C域包含下列修飾：Y1117V及H1253K；或Y1117V、F1252Y、H1253K、及L1278F；或Y1117V、F1252Y、H1253K、及L1278H。
較佳地，經修飾的BoNT/A H
C域包含下列修飾：Y1117V及H1253K；或Y1117V、F1252Y、H1253K、及L1278H。
當與如SEQ ID NO：2所示的非催化活性的BoNT/A相比時，該修飾可為一修飾，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：2比對而確定。由於SEQ ID NO：2之位於位置1的甲硫胺酸殘基的存在係非必需的，當確定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：2包括甲硫胺酸的情形，位置編號將如上定義(例如，Y1117將與SEQ ID NO：2之Y1117比對)。或者，於該甲硫胺酸不存在於SEQ ID NO：2的情形，胺基酸殘基編號應以-1修改(例如，Y1117將與SEQ ID NO：2之Y1116比對。當本文所述的其它多肽序列的位置1的甲硫胺酸存在/不存在時，適用類似的考量，且所屬技術領域中具有通常知識者將使用本技術領域常規技術而容易決定正確的胺基酸殘基編號。
經修飾的BoNT/A H
C域可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性的多肽序列：46、48或50；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。於一具體實施例，經修飾的BoNT/A H
C域包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列：46、48或50；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。於一具體實施例，經修飾的BoNT/A H
C域包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少99%或99.9%序列同一性的多肽序列：46、48或50；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。較佳地，經修飾的BoNT/A H
C域包含(更佳由其組成)一包含下列SEQ ID NO之任一者的多肽序列：46、48或50。
經修飾的BoNT/A H
C域可包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性的多肽序列：46或50；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。於一具體實施例，經修飾的BoNT/A HC域包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列：46或50；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。於一具體實施例，經修飾的BoNT/A H
C域包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少99%或99.9%序列同一性的多肽序列：46或50；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。較佳地，經修飾的BoNT/A HC域包含(更佳由其組成)一包含下列SEQ ID NO之任一者的多肽序列：46或50。
經修飾的BoNT/A H
C域可為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列所編碼者：45、47或49；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。於一具體實施例，經修飾的BoNT/A H
C域為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列所編碼者：45、47或49；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。於一具體實施例，經修飾的BoNT/A H
C域為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少99%或99.9%序列同一性的核苷酸序列所編碼者：45、47或49；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。較佳地，經修飾的BoNT/A H
C域為由下列之SEQ ID NO之任一者所編碼者：45、47或49。
經修飾的BoNT/A H
C域可為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之核苷酸序列所編碼者：45或49；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。於一具體實施例，經修飾的BoNT/A H
C域為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之核苷酸序列所編碼者：45或49；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。於一具體實施例，經修飾的BoNT/A H
C域為由與下列SEQ ID NO之任一者具有至少99%或99.9%序列同一性的核苷酸序列所編碼者：45或49；其但書為經修飾的BoNT/A H
C域包含如上述之修飾。較佳地，經修飾的BoNT/A H
C域為由下列之SEQ ID NO之任一者所編碼者：45或49。
本發明之多肽可包含(或由其所組成)雜合或嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素(或者雜合或嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素之片段)，其但書為L鏈為非催化活性的(當存在時)。雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素包含來自一梭狀芽孢桿菌神經毒素或其亞型之輕鏈之至少一部分、及來自另一梭狀芽孢桿菌神經毒素或其亞型之重鏈之至少一部分。於一具體實施例，雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素可含有來自一梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之輕鏈之完整輕鏈、及來自另一梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之重鏈，其但書為L鏈為非催化活性的(當存在時)。於另一具體實施例，嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可含有一梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之重鏈之一部分(例如，結合域)、與來自另一梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型之重鏈之另一部分。相似地或替代地，治療元素可包含來自不同梭狀芽孢桿菌神經毒素之輕鏈部分，其但書為L鏈為非催化活性的(當存在時)。此種雜合或嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可用作例如遞送此種梭狀芽孢桿菌神經毒素之治療益處至下列對象的手段：對指定梭狀芽孢桿菌神經毒素亞型具有免疫抗性的對象、對指定梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈結合域可能具有低於平均濃度之受體的對象、或可能具有膜或囊泡毒素受質(例如，SNAP-25、VAMP及突觸融合蛋白)之蛋白酶抗性變異體之對象。雜合及嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素敘述於US 8,071,110，其之公開藉由引用其全文而併入本文中。如此，於一具體實施例，本發明之多肽為或包含雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素或嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素，其但書為L鏈為非催化活性的。
於一特佳具體實施例，本發明之多肽可為嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素，其包含(較佳由其組成)非催化活性的BoNT/A輕鏈及轉移域(LH
N域)、以及BoNT/B受體結合域(H
C域)或其一部分。適合的嵌合及/或雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素可為WO 2017/191315 A1所教示者，其藉由引用被併入本文，其但書為L鏈為非催化活性的(例如，已藉由修飾而不活化)。此種較佳序列包括SEQ ID NO：44及61。
非催化活性的BoNT/A LH
N域可被共價連結至BoNT/B H
C域。於本文該嵌合BoNT/A亦稱為「BoNT/AB」或「BoNT/AB嵌合體」。
LH
N域之C端胺基酸殘基可對應於BoNT/A之分開LH
N及H
C域的3
10螺旋(3
10helix)的第一胺基酸殘基，且H
C域之N端胺基酸殘基可對應於BoNT/B之分開LH
N及H
C域的3
10螺旋的第二胺基酸殘基。
本文中提及「BoNT/A之分開LH
N及H
C域的3
10螺旋的第一胺基酸殘基」意指分開LH
N及H
C域的3
10螺旋的N端殘基。
本文中提及「BoNT/B之分開LH
N及H
C域的3
10螺旋的第二胺基酸殘基」意指分開LH
N及H
C域的3
10螺旋的N端殘基後的胺基酸殘基。
「3
10螺旋」與α-螺旋、β-褶板及反轉，皆為於蛋白質及多肽中發現的一種二級結構的類型。3
10螺旋中胺基酸以右手螺旋結構的方式排列，其中每個完整轉折(turn)係由三個殘基且由分離其之間的分子內氫鍵的十個原子所完成。螺旋中各胺基酸對應120°轉折(即，螺旋於每一轉折具有三個殘基)，及伴隨螺旋軸之2.0Å(=0.2nm)的位移(translation)，且於藉由作成氫鍵所形成的環中具有10個原子。最重要地，胺基酸之N-H基團與在前的三個胺基酸之C=O基團形成氫鍵；此重複的i+3→i氫鍵定義了3
10螺旋。3
10螺旋係本技術領域中具有通常知識者所熟知的結構生物學中的標準概念。
此3
10螺旋係對應於形成真正螺旋的四個殘基、及兩個各自在此等四個殘基端上的帽(cap)(或過渡的)殘基。於本文中使用的術語「分開LH
N及H
C域的3
10螺旋」係由彼等6個殘基所組成。
透過進行結構分析及序列比對，鑑定分開LH
N及H
C域的3
10螺旋。此3
10螺旋於其N端(即，於LH
N域之C端部分)被α-螺旋環繞且於其C端(即，位於H
C域之N端部分)被β-褶板環繞。3
10螺旋之第一(N端)殘基(帽或過渡殘基)亦對應於此α-螺旋之C端殘基。
分開LH
N及H
C域的3
10螺旋可被例如由公開可取得之肉毒桿菌神經毒素的結晶結構所確定，分別例如肉毒桿菌神經毒素A1之3BTA (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA)及肉毒桿菌神經毒素B1之1EPW (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW)。
公開可使用的電腦模擬塑模及比對工具亦可用於確定在其它神經毒素中分開LH
N及H
C域的3
10螺旋的位置，例如同源性塑模伺服器LOOPP (Learning, Observing and Outputting Protein Patterns，http://loopp.org)、PHYRE (Protein Homology/analogY Recognition Engine，http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)及Rosetta (https://www.rosettacommons.org/)、蛋白質疊加(protein superposition)伺服器SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)、比對程式Clustal Omega (http://www.clustal.org/omega/)、及列於Internet Resources for Molecular and Cell Biologists (http://molbiol-tools.ca/)之許多其它工具/伺服器。尤其圍繞「H
N/H
CN」接合之區域係結構上高度保留，使其成為疊加不同血清型的理想區域。
例如，可使用下列方法學以確定於其它神經毒素中之此3
10螺旋的序列：
1.使用結構同源性塑模工具LOOP (http://loopp.org)以獲得基於BoNT/A1結晶結構(3BTA.pdb)之其它BoNT血清型的預測結構；
2.編輯如此獲得的結構(pdb)檔案以包括僅H
CN域之N端及其之前的約80個殘基(其為H
N域之部分)，因而保有結構上高度保留的「H
N/H
CN」區域；
3.使用蛋白質疊加伺服器SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)以疊加各血清型於3BTA.pdb結構；
4.檢查疊加的pdb檔案以定位於BoNT/A1之HC域起始的310螺旋，然後鑑定於其它血清型中對應的殘基；
5.以Clustal Omega比對其它BoNT血清型序列，以檢查對應的殘基是否正確。
藉由此方法確定的LH
N、H
C及3
10螺旋域之例呈示於下：
| 神經毒素 | 登錄號 ( 小數點後加上序列版本 ) | LH N | H C | 3 10 螺旋 |
| 非催化活性的BoNT/A1 (SEQ ID NO：2) | N/A | 1-872 | 873-1296 | 872NIINTS 877 |
| BoNT/A2 | X73423.3 | 1-872 | 873-1296 | 872NIVNTS 877 |
| BoNT/A3 | DQ185900.1 (亦稱為Q3LRX9.1) | 1-872 | 873-1292 | 872NIVNTS 877 |
| BoNT/A4 | EU341307.1 (亦稱為Q3LRX8.1) | 1-872 | 873-1296 | 872NITNAS 877 |
| BoNT/A5 | EU679004.1 (亦稱為C1IPK2.1) | 1-872 | 873-1296 | 872NIINTS 877 |
| BoNT/A6 | FJ981696.1 | 1-872 | 873-1296 | 872NIINTS 877 |
| BoNT/A7 | JQ954969.1 (亦稱為K4LN57.1) | 1-872 | 873-1296 | 872NIINTS 877 |
| BoNT/A8 | KM233166.1 | 1-872 | 873-1297 | 872NITNTS 877 |
| BoNT/B1 (亦稱為SEQ ID NO：52) | B1INP5.1 | 1-859 | 860-1291 | 859EILNNI 864 |
| BoNT/B2 | AB084152.1 (亦稱為Q8GR96.1) | 1-859 | 860-1291 | 859EILNNI 864 |
| BoNT/B3 | EF028400.1 (亦稱為A2I2S2.1) | 1-859 | 860-1291 | 859EILNNI 864 |
| BoNT/B4 | EF051570.1 (亦稱為A2I2W0.1) | 1-859 | 860-1291 | 859EILNNI 864 |
| BoNT/B5 | EF033130.1 (亦稱為A2I2U6.1) | 1-859 | 860-1291 | 859DILNNI 864 |
| BoNT/B6 | AB302852. 1(亦稱為A8R089.1) | 1-859 | 860-1291 | 859EILNNI 864 |
| BoNT/B7 | JQ354985.1 (亦稱為H9CNK9.1) | 1-859 | 860-1291 | 859EILNNI 864 |
| BoNT/B8 | JQ964806.1 (亦稱為I6Z8G9.1) | 1-859 | 860-1292 | 859EILNNI 864 |
使用結構分析及序列比對，發現分開LH
N及H
C域的3
10螺旋後的β-褶板係於所有肉毒桿菌及破傷風神經毒素中被保留的結構，且起始於當自分開LH
N及H
C域的3
10螺旋的第一殘基算起之第8殘基(例如，於BoNT/A1之殘基879)。
BoNT/AB嵌合體可包含源自BoNT/A的LH
N域(具有非催化活性的L鏈)共價連結至源自BoNT/B的H
C域，
● 其中LH
N域之C端胺基酸殘基對應於：對於位於BoNT/A之H
C域的起始(N端)的β-褶板為N端上第八胺基酸殘基，且
● 其中H
C域之N端胺基酸殘基對應於：對於位於BoNT/B之H
C域的起始(N端)的β-褶板為N端上第七胺基酸殘基。
BoNT/AB嵌合體可包含源自BoNT/A的LH
N域(具有非催化活性的L鏈)共價連結至源自BoNT/B的H
C域，
● 其中LH
N域之C端胺基酸殘基對應於：位於BoNT/A之LH
N域端(C端)之α-螺旋的C端胺基酸殘基，且
● 其中H
C域之N端胺基酸殘基對應於：對於位於BoNT/B之LH
N域端(C端)之α-螺旋的C端胺基酸殘基為緊鄰C端的胺基酸殘基。
BoNT/AB嵌合體之設計過程的原理係試圖確保不會危及二級結構，因而使對三級結構的任何改變最小化。不希望受理論束縛，假設藉由不破壞BoNT/AB嵌合體中3
10螺旋之四個中央胺基酸殘基，確保嵌合神經毒素的最佳構形。
源自BoNT/A的非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：2或61之胺基酸殘基1至872或者與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/A的非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：2或61之胺基酸殘基1至872或者與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/A的非催化活性的LH
N域對應SEQ ID NO：2或61之胺基酸殘基1至872。
源自BoNT/B的H
C域可對應SEQ ID NO：52之胺基酸殘基860至1291或者與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/B的H
C域可對應SEQ ID NO：52之胺基酸殘基860至1291或者與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/B的H
C域對應SEQ ID NO：52之胺基酸殘基860至1291。
較佳地，非催化活性的LH
N域對應BoNT/A (SEQ ID NO：2或61)之胺基酸殘基1至872且H
C域對應BoNT/B (SEQ ID NO：52)之胺基酸殘基860至1291。
較佳地，BoNT/B H
C域進一步於H
CC次域中包含至少一個胺基酸殘基取代、添加、或缺失，當與天然BoNT/B序列比較時，其具有增加BoNT/B神經毒素對人類Syt II結合親和性的效果。於BoNT/B H
CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失已被揭示於WO 2013/180799及WO 2016/154534(藉由引用將兩者皆併入本文)。
於BoNT/B H
CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失包括選自由下列所組成的群組之取代突變：V1118M；Y1183M；E1191M；E1191I；E1191Q；E1191T；S1199Y；S1199F；S1199L；S1201V；E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其組合。
於BoNT/B H
CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失進一步包括兩個選自由下列所組成的群組的取代突變的組合：E1191M及S1199L、E1191M及S1199Y、E1191M及S1199F、E1191Q及S1199L、E1191Q及S1199Y、E1191Q及S1199F、E1191M及S1199W、E1191M及W1178Q、E1191C及S1199W、E1191C及S1199Y、E1191C及W1178Q、E1191Q及S1199W、E1191V及S1199W、E1191V及S1199Y、或E1191V及W1178Q。
於BoNT/B H
CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失亦包括三個取代突變之組合，其為E1191M、S1199W及W1178Q。
較佳地，於BoNT/B H
CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失包括兩個取代突變之組合，其為E1191M及S1199Y。
當與SEQ ID NO：52所示的未經修飾的BoNT/B比較時，該修飾可為一種修飾，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：52比對而確定。由於SEQ ID NO：52之位於位置1的甲硫胺酸殘基的存在係非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：52包括甲硫胺酸的情形，位置編號將如上定義(例如，E1191將為SEQ ID NO：52之E1191)。或者，於該甲硫胺酸不存在於SEQ ID NO：52的情形，胺基酸殘基編號應以-1修改(例如，E1191將為SEQ ID NO：52之E1190)。當本文所述的其它多肽序列的位置1的甲硫胺酸存在/不存在時，適用類似的考量，且所屬技術領域中具有通常知識者將使用本技術領域常規技術而容易決定正確的胺基酸殘基編號。
於一具體實施例，依據本發明之使用的多肽包含與SEQ ID NO：61具有至少70%序列同一性之多肽序列。於一具體實施例，依據本發明之使用的多肽包含與SEQ ID NO：61具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列。較佳地，依據本發明之使用的多肽包含(更佳為由其所組成)如SEQ ID NO：61所示的多肽序列。
於本發明中使用的嵌合及/或雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含BoNT/A多肽之一部分及BoNT/B多肽之一部分，其例包括本文所述之多肽，如SEQ ID NO：44。
於一具體實施例，依據本發明之使用的多肽包含：與SEQ ID NO：44具有至少70%序列同一性之多肽序列及/或由與SEQ ID NO：43具有至少70%序列同一性之核苷酸序列所編碼的多肽序列。於一具體實施例，依據本發明之使用的多肽包含與SEQ ID NO：44具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的多肽序列。較佳地，依據本發明之使用的多肽包含如SEQ ID NO：44所示的多肽序列。於一具體實施例，依據本發明之使用的多肽包含由與SEQ ID NO：43具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性的核苷酸序列所編碼的多肽序列。較佳地，依據本發明之使用的多肽包含由如SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列所編碼的多肽序列。
適合的嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可包括BoNT/FA，其但書為任何存在的L鏈為非催化活性的。如此，本發明之多肽可包含BoNT/FA或其片段，其但書為任何存在的L鏈為非催化活性的。BoNT/FA之非催化活性的形式於本文中描述為SEQ ID NO：26及34。BoNT/FA之適合的片段亦於本文中描述為SEQ ID NO：28、30、及32。
於另一較佳具體實施例，本發明之多肽可為嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素，其包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域(LH
N域)、及源自不同的梭狀芽孢桿菌神經毒素(即，非BoNT/X)之受體結合域(H
C域)或其部分。適合的嵌合及/或雜合梭狀芽孢桿菌神經毒素可為WO 2020/065336 A1所教示者，其藉由引用被併入本文，其但書為L鏈為非催化活性的(例如，已藉由修飾而不活化)。此種較佳序列包括本文所述的SEQ ID NO：63-70。
嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域(LH
N域)，及：
(i)BoNT/A受體結合域(H
C域)或其一部分；或
(ii)BoNT/B受體結合域(H
C域)或其一部分；或
(iii)BoNT/C受體結合域(H
C域)或其一部分；或
(iv)BoNT/D受體結合域(H
C域)或其一部分；或
(v)BoNT/E受體結合域(H
C域)或其一部分；或
(vi)BoNT/F受體結合域(H
C域)或其一部分；或
(vii)BoNT/G受體結合域(H
C域)或其一部分；或
(viii)TeNT受體結合域(H
C域)或其一部分。
於一具體實施例，源自不同梭狀芽孢桿菌神經毒素(即，非BoNT/X)域之受體結合域(H
C域)或其一部分可為與突觸結合蛋白I及/或II (Syt I/II)結合者。
較佳地，嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域(LH
N域)、及BoNT/B受體結合域(H
C域)或其一部分。
包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域(LH
N域)以及源自不同的梭狀芽孢桿菌神經毒素(即，非BoNT/X)的受體結合域(H
C域)或其一部分之多肽，其可包含與SEQ ID NO：63-70之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列。於一具體實施例，包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域(LH
N域)以及源自不同的梭狀芽孢桿菌神經毒素(即，非BoNT/X)的受體結合域(H
C域)或其一部分之多肽，其包含與SEQ ID NO：63-70之任一者具有至少80%、90%、95%或98%序列同一性之多肽序列。較佳地，包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域(LH
N域)以及源自不同的梭狀芽孢桿菌神經毒素(即，非BoNT/X)的受體結合域(H
C域)或其一部分之多肽，其包含(更佳為由其組成)SEQ ID NO：63-70之任一者。彼等多肽中，SEQ ID NO：63-66為最佳。
包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域(LH
N域)以及源自不同的梭狀芽孢桿菌神經毒素(即，非BoNT/X)的受體結合域(H
C域)或其一部分之多肽，其可包含下列N端胺基酸序列MGS。於SEQ ID NO：63-66含有該N端胺基酸序列的情形，該序列為非必需的。於一具體實施例，SEQ ID NO：63-66缺少如MGS所示的N端胺基酸序列。於一具體實施例，SEQ ID NO：63-66包含如MGS所示的N端胺基酸序列。
源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：63之胺基酸殘基1至899或者與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：63之胺基酸殘基1至899或者與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：63之胺基酸殘基1至899。
源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：63之胺基酸殘基4至899或者與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：63之胺基酸殘基4至899或者與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：63之胺基酸殘基4至899。
源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：65之胺基酸殘基1至866或者與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：65之胺基酸殘基1至866或者與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：65之胺基酸殘基1至866。
源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：65之胺基酸殘基4至866或者與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：65之胺基酸殘基4至866或者與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/X之非催化活性的LH
N域可對應SEQ ID NO：65之胺基酸殘基4至866。
源自BoNT/B的H
C域可對應SEQ ID NO：52之胺基酸殘基860至1291或者與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/B的H
C域可對應SEQ ID NO：52之胺基酸殘基860至1291或者與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/B的H
C域對應SEQ ID NO：52之胺基酸殘基860至1291。
較佳地，BoNT/B H
C域進一步於H
CC次域中包含至少一個胺基酸殘基取代、添加、或缺失，當與天然BoNT/B序列比較時，其具有增加BoNT/B神經毒素對人類Syt II結合親和性的效果。於BoNT/B H
CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失已被揭示於WO 2013/180799及WO 2016/154534(藉由引用將兩者皆併入本文)。
於BoNT/B H
CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失包括選自由下列所組成的群組之取代突變：V1118M；Y1183M；E1191M；E1191I；E1191Q；E1191T；S1199Y；S1199F；S1199L；S1201V；E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其組合。
於BoNT/B H
CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失進一步包括兩個選自由下列所組成的群組的取代突變的組合：E1191M及S1199L、E1191M及S1199Y、E1191M及S1199F、E1191Q及S1199L、E1191Q及S1199Y、E1191Q及S1199F、E1191M及S1199W、E1191M及W1178Q、E1191C及S1199W、E1191C及S1199Y、E1191C及W1178Q、E1191Q及S1199W、E1191V及S1199W、E1191V及S1199Y、或E1191V及W1178Q。
於BoNT/B H
CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失亦包括三個取代突變之組合，其為E1191M、S1199W及W1178Q。
較佳地，於BoNT/B H
CC次域中適合的胺基酸殘基取代、添加或缺失包括兩個取代突變之組合，其為E1191M及S1199Y。
當與SEQ ID NO：52所示的未經修飾的BoNT/B比較時，該修飾可為一種修飾，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：52比對而確定。由於SEQ ID NO：52之位於位置1的甲硫胺酸殘基的存在係非必需的，當決定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具有通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：52包括甲硫胺酸的情形，位置編號將如上定義(例如，E1191將為SEQ ID NO：52之E1191)。或者，於該甲硫胺酸不存在於SEQ ID NO：52的情形，胺基酸殘基編號應以-1修改(例如，E1191將為SEQ ID NO：52之E1190。當本文所述的其它多肽序列的位置1的甲硫胺酸存在/不存在時，適用類似的考量，且所屬技術領域中具有通常知識者將使用本技術領域常規技術而容易決定正確的胺基酸殘基編號。
源自BoNT/A的H
C域可對應SEQ ID NO：60之胺基酸殘基873至1296或者與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/A的H
C域可對應SEQ ID NO：60之胺基酸殘基873至1296或者與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/B的H
C域對應SEQ ID NO：60之胺基酸殘基873至1296。
於一具體實施例，於多肽係用於治療發炎性失調的情形，使用的多肽不包含非催化活性的BoNT/X L鏈、BoNT/X轉移域(H
N域)、及BoNT/A受體結合域(H
C域)。如此，於一具體實施例，於多肽係用於治療發炎性失調的情形，該多肽可包含非催化活性的BoNT/X L鏈、BoNT/X轉移域(H
N域)及：(i)BoNT/B受體結合域(H
C域)；(ii)BoNT/D受體結合域(H
C域)；或(iii)BoNT/F受體結合(H
C域)。
相似地，於一具體實施例，於多肽係用於治療疼痛的情形，使用的多肽不包含非催化活性的BoNT/X L鏈、BoNT/X轉移域(H
N域)、及BoNT/A受體結合域(H
C域)。如此，於一具體實施例，於多肽係用於治療疼痛的情形，該多肽可包含非催化活性的BoNT/X L鏈、BoNT/X轉移域(H
N域)及：(i)BoNT/B受體結合域(H
C域)；(ii)BoNT/D受體結合域(H
C域)；或(iii)BoNT/F受體結合(H
C域)。
源自BoNT/D的H
C域可對應SEQ ID NO：54之胺基酸殘基865至1276或者與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/D的H
C域可對應SEQ ID NO：54之胺基酸殘基865至1276或者與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/D的H
C域對應SEQ ID NO：54之胺基酸殘基865至1276。
源自BoNT/F的H
C域可對應SEQ ID NO：56之胺基酸殘基866至1278或者與其具有至少70%序列同一性的多肽序列。源自BoNT/F的H
C域可對應SEQ ID NO：56之胺基酸殘基866至1278或者與其具有至少80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。較佳地，源自BoNT/F的H
C域對應SEQ ID NO：56之胺基酸殘基866至1278，其具有於位置1241之組胺酸至離胺酸的取代(H1241K)。
較佳地，嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素可包含(較佳由其組成)非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域(LH
N域)、及源自不同的梭狀芽孢桿菌神經毒素(即，非BoNT/X)的受體結合域(H
C域)或其一部分、及Cys-(Xaa)
a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)
b-Cys (SEQ ID NO：71)，其中a=1-10及b=4-15。SEQ ID NO：71為基於BoNT/C1活化圈的活化圈共通序列(consensus sequence)。
然而，本發明之任一多肽可包含Cys-(Xaa)
a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)
b-Cys (SEQ ID NO：71)，其中a=1-10及b=4-15。該活化圈可適當地置換存在於本文所述多肽中的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈及/或轉移域(H
N域)中存在的任何活化圈序列。
在SEQ ID NO：71的上下文中使用之Xaa或Yaa可為任何胺基酸。位置Xaa及Yaa的胺基酸數分別由字母「a」及「b」表示。於一具體實施例，「a」及「b」可為允許蛋白水解切割活化圈並產生活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素的任何整數。於一具體實施例，「a」為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。於一具體實施例，「b」為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。於一具體實施例，「a」為≤12、≤11、≤10、≤9、≤8、≤7、≤6、≤5或≤4。於一具體實施例，「b」為≤20、≤19、≤18、≤17、≤16、≤15、≤14、≤13、≤12、≤11、≤10或≤9。
於一具體實施例，「a」為1-12，例如1-10。較佳地，「a」為1-7，如2-4。更佳地，「a」為3。於一具體實施例，「b」為1-20，例如4-15。較佳地，「b」為6-10。更佳地，「b」為8。
無意將Xaa或Yaa限制為僅一種類型的胺基酸。如此，存在於位置Xaa的一或多個殘基可獨立選自標準胺基酸：天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、半胱胺酸、丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、及苯丙胺酸。存在於位置Yaa的一或多個殘基可獨立選自標準胺基酸：天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、半胱胺酸、丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、及苯丙胺酸。較佳地，於位置Yaa的胺基酸(更佳為緊鄰SEQ ID NO：71之Arg殘基C端者)不為脯胺酸。
替代地/附加地，存在於位置Xaa或Yaa之一或多個殘基可獨立地選自非標準胺基酸(非上述20種標準組之部分之胺基酸)。舉例而言，非標準胺基酸可包括4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸、α-甲基絲胺酸、反-3-甲基脯胺酸、2,4-甲橋脯胺酸(2,4-methano-proline)、順-4-羥基脯胺酸、反-4-羥基脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別蘇胺酸、甲基蘇胺酸、羥乙基半胱胺酸、羥乙基升半胱胺酸(hydroxyethylhomo-cysteine)、硝基麩醯胺酸、升麩醯胺酸(homoglutamine)、2-哌啶甲酸(pipecolic acid)、三級白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸、L-鳥胺酸、L-2-胺基-3-胍基丙酸、或離胺酸、精胺酸及/或鳥胺酸之D-異構物、及4-氟苯丙胺酸。導入非標準胺基酸至蛋白質之方法為本技術領域已知，並且包括使用大腸桿菌營養缺陷型的表現宿主之重組蛋白質合成。
包含於SEQ ID NO：71之序列Ile-Asp/Glu-Gly-Arg係指在WO 2020/065336 A1中令人驚訝地被發現的被腸激酶(以及因子Xa)識別的位點。該文獻描述用於切割Ile-Asp/Glu-Gly-Arg因而產生雙鏈多肽之適合的方法。較佳地，序列為Ile-Asp-Gly-Arg，例如，Cys-(Xaa)
a-Ile-Asp-Gly-Arg-(Yaa)
b-Cys。咸信腸激酶及因子Xa水解緊鄰SEQ ID NO：71之Arg的C端的肽鍵(即，Arg及Yaa之間的肽鍵)。
於一具體實施例，位於緊鄰SEQ ID NO：71之Ile的N端的Xaa的胺基酸殘基為一不帶電的疏水性胺基酸，較佳為丙胺酸。於一些具體實施例，「a」為至少2，且Xaa包含至少一C端不帶電的極性胺基酸及一緊鄰其N端之帶電的鹼性胺基酸。該帶電的鹼性胺基酸較佳為離胺酸。如此，於「a」為至少2的具體實施例的情形，Xaa可包含至少Lys-Ala，其中Ala緊鄰SEQ ID NO：71之Ile的N端。
於一具體實施例，Xaa包含序列HKA或由其所組成。
於一具體實施例，位於緊鄰SEQ ID NO：71之Arg的C端Yaa的胺基酸殘基為一不帶電的極性胺基酸，較佳為絲胺酸。於一些具體實施例，「b」為至少2，且Yaa包含至少一N端不帶電的極性胺基酸及一緊鄰其C端之不帶電的疏水性胺基酸。該不帶電的疏水性胺基酸較佳為白胺酸。如此，於「b」為至少2的具體實施例的情形，Yaa可包含至少Ser-Leu，其中Ser緊鄰SEQ ID NO：71之Arg的C端。
於一具體實施例，Yaa包含序列SLYNKTLDC或由其所組成。
於一些具體實施例，本文之多肽包含與SEQ ID NO：72具有至少70%序列同一性之活化圈。於一具體實施例，本文之多肽包含與SEQ ID NO：72具有至少80%、85%或90%序列同一性之活化圈。較佳地，本文之多肽包含與SEQ ID NO：72具有至少95%序列同一性之活化圈。更佳地，本文之多肽包含與SEQ ID NO：72具有至少99%序列同一性之活化圈。
於一特佳具體實施例，本文之多肽包含活化圈，該活化圈包含SEQ ID NO：72，更佳地係由SEQ ID NO：72所組成。
該活化圈亦可為SEQ ID NO：72之變異體，如SEQ ID NO：73或與其具有至少70%序列同一性的序列。SEQ ID NO：73為SEQ ID NO：72之變異體，其中腸激酶識別位IDGR已突變為IEGR。於一具體實施例，本文之多肽包含與SEQ ID NO：73具有至少70%序列同一性之活化圈。於一具體實施例，本文之多肽包含與SEQ ID NO：73具有至少80%、85%或90%序列同一性之活化圈。較佳地，本文之多肽包含與SEQ ID NO：73具有至少95%序列同一性之活化圈。更佳地，本文之多肽包含與SEQ ID NO：73具有至少99%序列同一性之活化圈。
於一特佳具體實施例，本文之多肽包含活化圈，該活化圈包含SEQ ID NO：73，更佳地係由SEQ ID NO：73所組成。
於一具體實施例，描述於本文的活化圈(例如，SEQ ID NO：71、72或73)可修飾成包括額外或替代的蛋白酶位。例如，如SEQ ID NO：77所示的蛋白酶位。此種經修飾的活化圈之例係如SEQ ID NO：78所示。如此，於一具體實施例，本文之多肽包含與SEQ ID NO：78具有至少70%序列同一性之活化圈。於一具體實施例，本文之多肽包含與SEQ ID NO：78具有至少80%、85%或90%序列同一性之活化圈。較佳地，本文之多肽包含與SEQ ID NO：78具有至少95%序列同一性之活化圈。更佳地，本文之多肽包含與SEQ ID NO：78具有至少99%序列同一性之活化圈。於一特佳具體實施例，本文之多肽包含活化圈，該活化圈包含SEQ ID NO：78，更佳地係由SEQ ID NO：78所組成。
於一具體實施例，本發明之多肽可包含(或由其所組成)重定靶向的(retargeted)梭狀芽孢桿菌神經毒素，其但書為任何存在的L鏈為非催化活性的。於一重定靶向的梭狀芽孢桿菌神經毒素，梭狀芽孢桿菌神經毒素被修飾以包括已知為靶向部分(Targeting Moiety (TM)的外源性配體。選擇TM以提供所欲目標細胞之結合特異性，且作為重定靶向的過程的一部分，梭狀芽孢桿菌神經毒素之天然結合部分(例如，H
C域、或H
CC域)可被移除。重定靶向的技術被描述於例如：EP-B-0689459；WO 1994/021300；EP-B-0939818；US 6,461,617；US 7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US 5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US 7,052,702；WO 1999/017806；EP-B-1107794；US 6,632,440；WO 2000/010598；WO 2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO 2000/61192；及WO 1999/58571；其所有藉由引述被完整併入本文中。如此，於一具體實施例，本發明之多肽為重定靶向的梭狀芽孢桿菌神經毒素，其但書為任何存在的L鏈為非催化活性的。本發明之多肽可缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之功能性H
C域且亦缺少任何功能上等效的TM。
於具體實施例中，於本文所述的多肽具有純化用標籤(例如，His標籤)及/或連結子，該標籤及/或連結子為非必需的。
本發明之多肽可不含天然存在的梭狀芽孢桿菌神經毒素複合物中存在的複合蛋白(complexing protein)。
使用重組核酸技術可生產本發明之多肽。如此，於一具體實施例，多肽(如上述)為重組多肽。
於一具體實施例，提供包含編碼多肽的核酸序列的核酸(例如，DNA)。於一具體實施例，核酸序列被製備為包含啟動子及終止子的DNA載體的一部分。核酸序列可選自本文描述的任何核酸序列。
於一較佳具體實施例，載體具有選自下列的啟動子：
| 啟動子 | 誘導劑 | 典型誘導條件 |
| Tac(雜合) | IPTG | 0.2 mM (0.05-2.0mM) |
| AraBAD | L-阿拉伯糖 | 0.2% (0.002-0.4%) |
| T7-lac操縱子 | IPTG | 0.2 mM (0.05-2.0mM) |
於另一較佳具體實施例，載體具有選自下列的啟動子：
| 啟動子 | 誘導劑 | 典型誘導條件 |
| Tac(雜合) | IPTG | 0.2 mM (0.05-2.0mM) |
| AraBAD | L-阿拉伯糖 | 0.2% (0.002-0.4%) |
| T7-lac操縱子 | IPTG | 0.2 mM (0.05-2.0mM) |
| T5-lac操縱子 | IPTG | 0.2 mM (0.05-2.0mM) |
可使用本技術領域已知的任何適合方法來製備核酸分子。如此，可使用化學合成技術製備核酸分子。或者，可使用分子生物技術製備本發明之核酸分子。
本發明之DNA構築體較佳以電腦模擬設計，然後藉由常規DNA合成技術合成。
依據所使用的最終宿主細胞(例如，大腸桿菌)表現系統，上述核酸序列資訊係為了密碼子偏好而被選擇性地修飾。
術語「核苷酸序列」及「核酸」在本文中同義地使用。較佳地，核苷酸序列為DNA序列。
本發明之多肽(及特別是其任一梭狀芽孢桿菌神經毒素部分)可呈單鏈或雙鏈形式存在。然而，較佳為多肽以雙鏈形式存在，其中非催化活性的L鏈經由雙硫鍵與H鏈(或其組件，例如H
N域)連接。
本發明提供一種生產具有非催化活性的輕鏈及重鏈的單鏈多肽之方法，該方法包含：於表現宿主中表現本文所述核酸；溶解宿主細胞以提供含有單鏈多肽的宿主細胞均質物；及單離單鏈多肽。於一態樣，本發明提供一種蛋白水解加工本文所述多肽之方法，該方法包含使多肽與蛋白酶接觸，該蛋白酶水解該多肽之活化圈的肽鍵，因而轉化(單鏈)多肽成對應的雙鏈多肽(例如，其中該非催化活性的輕鏈及重鏈藉由雙硫鍵而一起連結)。
因此，本發明提供藉由本發明之方法可獲得的雙鏈多肽。
本文所使用的「對象」可為哺乳類動物，諸如人類或其它哺乳類動物。較佳地，「對象」意指人類對象。
本文使用的術語「失調」亦涵蓋「疾病」。於一具體實施例，該失調為疾病。
本文所使用的術語「治療」或「處理」涵蓋預防性處理(例如，預防失調[例如，疼痛]的發作)以及矯正治療(corrective treatment)(對已經罹患失調[例如，疼痛]的對象的治療)。較佳地，本文所使用的「治療」或「處理」意指矯正治療。
本文所使用的術語「治療」或「處理」係指失調(例如，疼痛)及/或其症狀。
因此，本發明之多肽可以治療有效量或預防有效量來投予至對象。較佳地，本發明之多肽係以治療有效量來投予至對象。
「治療有效量」係當單獨或組合另一劑投予至對象以治療該失調(例如，疼痛)(或其症狀)時，足以實現此失調或其症狀的此種治療之任何多肽量。
「預防有效量」係當單獨或組合另一劑投予至對象時，抑制或延緩失調(例如，疼痛)(或其症狀)之發作或復發之任何多肽量。於一些具體實施例，預防有效量完全防止失調(例如，疼痛)的發作或復發。「抑制」發作意指減少失調發作(例如，失調為疼痛的情形)(或其症狀)的可能性、或完全防止發作。
可以任何適合的方式調配本發明之多肽以投予至對象，例如作為醫藥組成物之一部分。如此，於一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本發明之多肽及醫藥上可接受的載劑、賦形劑、佐劑、推進劑及/或鹽。
本發明之多肽可調配用於口服、非經口、連續輸注、吸入或局部投予。適合注射的組成物可為溶液、懸浮液或乳劑、或乾粉(其在使用前溶解或懸浮在適合的媒劑中)的形式。
在多肽被局部遞送的情況下，該多肽可被調配成霜劑(例如，用於局部投予)或用於皮下注射。
局部遞送手段可包括氣霧劑(aerosol)或其它噴霧劑(例如，噴霧器(nebuliser))。就此方面而言，多肽的氣霧劑調配物能夠遞送至肺及/或其它鼻及/或支氣管或氣道通道。
本發明之多肽可藉由鞘內腔或硬膜外注射於涉及受影響器官的神經支配的脊髓節段部位(level of the spinal segment)的脊柱中而投予至對象。
投予途徑可經由腹腔鏡及/或局部注射。於一具體實施例，本發明之多肽被投予在被治療部位或附近，較佳為在被治療部位。例如，多肽可鞘內腔或脊椎內投予。於一具體實施例，本發明之多肽的投予途徑可為神經周圍的、神經內的、脊椎內的及/或鞘內腔的。
於一具體實施例，本發明之多肽可神經周圍投予。於一具體實施例，多肽可皮內、皮下或肌內投予。較佳地，本發明之多肽係皮內投予。
投予本發明多肽的劑量範圍為產生所欲治療及/或預防作用者。應了解所需劑量範圍取決於梭狀芽孢桿菌神經毒素或組成物之確切性質、投予之途徑、調配物之性質、對象年齡、對象病況的性質、範圍或嚴重度、禁忌(若有時)、以及主治醫師的判斷。可使用用以最佳化之標準經驗慣例來調整此等劑量程度的變動。
於一具體實施例，多肽之劑量為均一劑量(flat dose)。均一劑量可在50 pg至250 µg之範圍，較佳為100 pg至100 µg。於一具體實施例，均一劑量可為至少50 pg、100 pg、500 pg、1ng、50ng、100ng、500ng、1 µg或50 µg。該劑量可為單一均一劑量。
於一較佳具體實施例，多肽可以大於250 µg的量投劑。於一具體實施例，本發明之多肽可以大於500 µg、1 mg、10 mg、100 mg、500 mg、1 g或5 g的量投劑。於一具體實施例，本發明之多肽可以等於或少於10 g、5 g、1 g、500 mg、100 mg、10 mg或1 mg的量投劑。較佳地，本發明之多肽係以251 µg至10 g、251 µg至5 g、251 µg至1 g、251 µg至500 mg、251 µg至100 mg、251 µg至10 mg、或251 µg至1000 µg的量投劑，例如，251 µg至500 µg。於一具體實施例，本發明之多肽係以500 µg至5 g之量投劑，例如，1 mg至1 g或1 g至3 g。此係藉由本發明之多肽的無毒性質(例如，實質上無毒)而成為可能。
一般利用多肽及無熱原無菌媒液而製備液體劑型。梭狀芽孢桿菌神經毒素，取決於使用的媒液及濃度，可被溶解或懸浮於媒液中。於製備溶液時，多肽可被溶解於媒液中，若需要，藉由添加氯化鈉使溶液為等張的，且於填充到適合的無菌小瓶或安瓿中並密封之前，藉由使用無菌技術通過無菌過濾器進行過濾而滅菌。或者，若溶液安定性為適當的，則其密封容器中的溶液可藉由高壓蒸氣滅菌來滅菌。有利地，如緩衝劑、助溶劑、安定劑、防腐劑或殺菌劑、懸浮劑或乳化劑及/或局部麻醉劑之添加劑可被溶解於媒液中。
使用前溶解或懸浮於適合的媒液之乾粉可藉由使用無菌技術於無菌區中將經預滅菌的成分填充至無菌容器來製備。或者，可使用無菌技術於無菌區中將成分溶解於適合的容器。然後將產物冷凍乾燥並將容器無菌密封。
適合本文所述投予途徑之非經口懸浮液，除了將無菌成分懸浮於無菌媒液而替代溶解，且滅菌無法藉由過濾而完成以外，係以實質上相同的方式被製備。成分可在無菌狀態下被單離，或者其可在單離後藉由例如γ射線照射而滅菌。
有利地，於組成物中包括懸浮劑，例如聚乙烯吡咯啶酮，以促進成分的均勻分布。
依據本發明之投予可利用多種遞送技術，包括微粒包囊(microparticle encapsulation)、或高壓氣溶膠衝擊(high-pressure aerosol impingement)。
本發明之多肽較佳為被反覆投予(例如，多至5、10、15或20次)作為治療方案的一部分。反覆投予意指投予至少2次，例如，至少5、10、15或20次。如此，於一具體實施例，本發明之多肽可被投予二或多次以治療對象(例如，治療對象中的疼痛)。此對於通常需要持續治療的慢性病況(如慢性疼痛)的治療特別適當。於一具體實施例，本發明之多肽可每週、每月二次、每月、每兩個月、每六個月或每年投予，較佳為至少每年兩次或每年一次。於一具體實施例，本發明之多肽係於10年、5年、2年或1年期間投予兩次以上。較佳地，本發明之多肽係於1年期間投予兩次以上。治療可持續至少6個月、1年、2年、3年、5年、10年、15年、20年、25年或30年。
較佳為該多肽不與除了非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈、H
N域及/或H
C域以外之另外的治療或診斷劑(例如，核酸、蛋白質、肽或小分子治療或診斷劑)一起投予。例如，於一具體實施例，該多肽不與另外的鎮痛劑及/或消炎劑一起投予。於一具體實施例，本發明之多肽不與共價聯結的治療劑一起投予。於一具體實施例，本發明之多肽不與非共價聯結的治療劑一起投予。
本文所述多肽可用於治療罹患一或多種疼痛類型的對象。疼痛可為慢性或急性疼痛。疼痛可為選自下列疼痛之四種類別之一或多種：感覺接受性疼痛(nociceptive pain)；神經病變性疼痛(neuropathic pain)；混合性疼痛；及未知來源的疼痛。感覺接受性疼痛可由已知對痛覺受器(疼痛受體)的有害刺激所引起，且可能為體感性的(somatic)或內臟性的。神經病變性疼痛可為由神經系統中的原發性病變或功能障礙所激發或引起的疼痛。混合性疼痛可為感覺接受性疼痛與神經病變性疼痛的組合。
藉由本發明治療之疼痛之例(例如，慢性疼痛之例)包括神經病變性疼痛、發炎性疼痛、頭痛、體感性疼痛(somatic pain)、內臟性疼痛、轉移痛(referred pain)、觸摸痛(allodynia)、混合性疼痛、及術後疼痛。
本文使用的術語「疼痛」意指任何不愉快的感覺體驗，通常與身體失調有關。身體失調對臨床醫生而言可能為顯而易見的，也可能不是。疼痛有兩種類型：慢性及急性。「急性疼痛」為短期間而突然發作的疼痛。一種類型的急性疼痛，例如由於諸如割傷或燒傷所引起的對皮膚或其他淺層組織的傷害而感覺到的皮膚疼痛。皮膚痛覺受器即終止於皮膚下方，由於神經末梢的高度集中，會產生明確的局部持續時間短的疼痛。「慢性疼痛」為非急性疼痛的疼痛。
本發明之多肽可用於治療由以下任何神經病變性疼痛病況所引起或與之相關的疼痛。「神經病變性疼痛」意指來自周圍神經系統、中樞神經系統或兩者的異常感覺輸入，從而導致不適。神經病變性疼痛之症狀可涉及持續性、自發性疼痛，以及觸摸痛(對通常不會疼痛的刺激的一種疼痛反應)、痛覺過敏(對通常僅引起輕度不適的疼痛的刺激(如針刺)的一種加重反應)、或痛覺過度(hyperpathia)(短暫的不適感變成長期的劇烈疼痛)。神經病變性疼痛可由下列任一者引起：
1.創傷性傷害，例如，神經壓迫性損傷(例如，神經擠壓、神經拉伸、神經陷套(nerve entrapment)或不完全的神經橫切)；脊髓損傷(例如，脊髓半切)；肢體截肢；挫傷；發炎(例如，脊髓發炎)；或手術程序。
2.缺血性事件，包括例如，中風及心臟病發作。
3.感染性試劑。
4.暴露於毒性試劑，包括例如，藥物、酒精、重金屬(例如，鉛、砷、汞)、工業試劑(例如，溶劑、來自膠水的發煙)或氧化亞氮。
5.疾病，包括例如，發炎性失調、新生性腫瘤、後天性免疫不全症侯群(AIDS)、萊姆病(Lymes disease)、麻瘋、代謝性疾病、周圍神經失調、類神經瘤、單神經病變或多發性神經病變。
神經病變性疼痛的類型包括下列：
1.神經痛
神經痛為一種沿著一條或多條特定神經散發的疼痛，通常在神經結構上沒有任何明顯的病理變化。神經痛的原因係各式各樣。化學刺激、發炎、創傷(包括手術)、受附近結構(例如腫瘤)壓迫、及感染皆可能導致神經痛。然而，在許多情況下，原因為未知或無法確定的。神經痛在老年人中最常見，但其可能發生在任何年齡。神經痛包括但不限於三叉神經痛、帶狀疱疹後神經痛、疱疹後神經痛、舌咽神經痛、坐骨神經痛及非典型性面部疼痛。
神經痛為一種或多種神經分布中的疼痛。例如三叉神經痛、非典型性面部疼痛、及疱疹後神經痛(由帶狀疱疹或疱疹引起)。受影響的神經負責感應從下巴到前額的面部區域的觸摸、溫度及壓力。該失調通常會導致劇烈疼痛的短暫發作，通常持續不到兩分鐘，且僅發生在面部的一側。可用多種方式來描述該疼痛，例如「穿刺」、「尖銳」，「像閃電」、「灼燒」甚至「癢」。在TN的非典型形式中，疼痛也可能表現為嚴重或僅酸痛並持續較長時間。與TN相關的疼痛被認為係可能經歷的最劇烈的疼痛之一。
如吃飯、說話、洗臉、任何輕觸或感覺之簡單刺激皆可觸發發作(甚至微風輕拂的感覺)。該發作可成群發生或單獨發作。
症狀包括：任何位置的尖銳的刺痛或持續不斷的灼痛，通常在身體表面上或附近，位於每次發作的同一位置；沿著特定神經的路徑的疼痛；疼痛導致之受影響的身體部位的功能受損、或伴隨的運動神經損傷導致之肌肉虛弱；皮膚敏感性或受影響皮膚區域的麻木感增加(感覺類似於局部麻醉，例如奴佛卡因(Novocaine)注射)；以及任何觸摸或壓力被解釋為疼痛。移動亦可能疼痛。
三叉神經痛為神經痛的最常見形式。其影響面部的主要感覺神經：三叉神經(「三叉神經」字面意指「三個來源」，指神經分為3個分支)。此種情況涉及於面部一側，沿著該側的三叉神經所提供的區域之突然且短暫發作的劇烈疼痛。此種疼痛發作可能嚴重到足以引起面目猙獰，其在傳統上被稱為疼痛性抽搐(tic douloureux)。有時，三叉神經痛的原因係血管或小腫瘤壓在神經上。如多發性硬化症(一種影響大腦及脊髓的發炎性疾病)、某些形式的關節炎、及糖尿病(高血糖)之失調亦可能引起三叉神經痛，但並非總是能夠確定原因。在此種情況下，某些動作(例如咀嚼、說話、吞嚥或觸摸臉部區域)可能會觸發劇烈疼痛的痙攣。
相關但相當不常見的神經痛會影響舌咽神經，其使喉嚨產生感覺。此種神經痛的症狀為位於喉嚨之短暫的、類似休克的疼痛發作。
如水痘帶狀疱疹病毒(疱疹病毒的一種類型)所引起的帶狀疱疹之感染後可能會出現神經痛。帶狀疱疹皮疹治癒後，此種神經痛會產生持續的灼痛。移動或接觸患部會使疼痛加重。並非所有被診斷為帶狀疱疹者都會繼續經歷疱疹後神經痛，其可能比帶狀疱疹更疼痛。該疼痛及敏感性可能持續數月甚至數年。疼痛通常表現為對任何觸摸(尤其是輕觸)無法忍受的敏感性。疱疹後神經痛不僅僅局限於面部；其可發生在身體的任何地方，但通常發生在帶狀疱疹皮疹的位置。由於患病期間的疼痛及社會隔離，抑鬱症並非少見。
帶狀疱疹後神經痛可能會在原始疱疹感染跡象消失後很長一段時間使人衰弱。能引起神經痛的其他傳染病為梅毒及萊姆病。
糖尿病為神經痛的另一常見原因。此非常普遍的醫學問題影響到成年期間幾乎每20位美國人中1位。糖尿病會損害提供神經循環的細小動脈，從而導致神經纖維功能障礙，有時甚至會導致神經喪失。糖尿病幾乎可以產生任何神經痛，包括三叉神經痛、腕隧道症候群(手及腕部疼痛及麻木)及感覺異常性股痛(大腿的麻木及疼痛，由於股外側皮神經(lateral femoral cutaneous nerve)受損所致)。嚴格控制血糖可防止糖尿病神經損傷，並可加速確實患有神經痛的對象的恢復。
可能與神經痛有關的其它醫學病況為慢性腎功能不全及紫質症-一種遺傳性疾病，在此種疾病中，人體無法自行除去體內正常血液分解後產生的某些物質。某些藥物亦可能導致此問題。
2.傳入神經阻滯(deafferentation)
傳入神經阻滯表示來自身體的一部分的感覺輸入的喪失，並且可由周圍的感覺纖維或來自中樞神經系統的神經的中斷所引起。傳入神經阻滯疼痛症候群包括但不限於腦或脊髓損傷、中風後疼痛、幻痛、截癱、臂神經叢撕脫傷、腰部神經根病變。
3.複雜性局部疼痛症候群(Complex regional pain syndromes (CRPSs))
CRPS係一種由交感神經維持的疼痛(sympathetically-maintained pain)引起的慢性疼痛症候群，呈現兩種形式。CRPS 1目前替代術語「反射性交感神經失養症症候群」。其為一種慢性神經失調，最常見於輕度或重度傷害後的手臂或腿部。CRPS 1與下列有關：嚴重疼痛；指甲、骨頭及皮膚的變化；及增加患肢對觸碰的敏感性。CRPS 2代替術語灼熱痛(causalgia)，由確定的神經損傷所引起。CRPS包括但不限於第I型CRPS(反射性交感神經失養症)及第II型CRPS(灼熱痛)。
4.神經病變
神經病變為神經的功能或病理變化，臨床上以感覺或運動神經元異常為特徵。
中樞神經病變為中樞神經系統的功能或病理變化。
周圍神經病變為一種或多種周圍神經的功能或病理變化。周圍神經將信息從中樞神經系統(大腦及脊髓)傳遞到肌肉及其它器官，且從皮膚、關節及其它器官傳遞回大腦。當此等神經無法在大腦及脊髓之間傳遞信息時，會導致周圍神經病變，從而造成疼痛、感覺喪失或無法控制肌肉。在某些情況下，控制血管、小腸及其它器官的神經衰竭會導致血壓異常、消化問題、及其它基本身體處理過程的喪失。神經病變的危險因子包括糖尿病、大量飲酒、以及暴露於某些化學藥品及藥物。有些人有神經病變的遺傳傾向。長期施加於神經的壓力係發展成神經損傷的另一種風險。長時間不動(如長時間的外科手術或長期生病)或石膏、夾板、支架、拐杖或其它裝置壓迫神經可能會造成壓力損傷。多發性神經病變意味著一個廣泛的過程，通常會平均地影響身體的兩側。症狀取決於受影響的神經類型。神經的三種主要類型為感覺神經、運動神經及自主神經。神經病變可影響三種類型神經的任何一種、或組合、或全部。症狀亦取決於病況係影響整個身體或僅影響一條神經(由於受傷)。慢性發炎性多發性神經病變的原因係異常的免疫反應。特異性抗原、免疫過程及觸發因子為可變的，且於許多情況下係未知的。其之發生可能與HIV、發炎性腸病、紅斑性狼瘡、慢性活動性肝炎、及血球異常之其它病況有關。
周圍神經病變可能涉及單個神經或神經群的功能或病理改變(單神經病變)或影響多條神經的功能或病理改變(多發性神經病變)。
周圍神經病變可包括以下幾種：
遺傳性失調
夏馬杜三氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)
弗裏德賴希共濟失調(Friedreich's ataxia)
全身性或代謝性疾病
糖尿病(糖尿病神經病變)
營養缺乏(尤其是維生素B-12)
過量飲酒(酒精性神經病變)
尿毒症(由於腎衰竭)
癌症
傳染性或發炎性病況
AIDS
肝炎
克羅拉多壁蝨熱(Colorado tick fever)
白喉
格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)
未發展AIDS的HIV感染
麻瘋
萊姆病
結節性多動脈炎
類風濕性關節炎
類肉瘤病
休格倫氏症候群(Sjogren syndrome)
梅毒
全身性紅斑狼瘡
類澱粉蛋白
暴露於毒性化合物
吸食膠或其它毒性化合物
氧化亞氮
工業試劑-尤其是溶劑
重金屬(鉛、砷、汞等)
藥物繼發性神經病變，如鎮痛性腎病
其它原因
缺血(氧氣減少/血流減少)
長時間暴露於冷的溫度下
a.多發性神經病變
多發性神經病變為一種周圍神經病變，涉及由多條周圍神經的損傷或破壞所引起的區域的運動或感覺喪失。多發性神經病變性疼痛，包括但不限於脊髓灰質炎後症候群(post-polio syndrome)、乳房切除術後症候群(postmastectomy syndrome)、糖尿病神經病變、酒精神經病變、類澱粉蛋白、毒素、AIDS、甲狀腺功能低下症、尿毒症、維生素缺乏症、化療引起的疼痛、2',3'-二去氧胞苷(ddC)治療、格巴二氏症候群或法布瑞氏病(Fabry's disease)。
b.單神經病變
單神經病變為一種周圍神經病變，涉及由單一周圍神經或神經群的損傷或破壞所引起的區域的運動或感覺喪失。單神經病變最常由受傷或創傷造成的局部損傷所引起，儘管偶爾的全身性失調亦可能引起獨立的神經損傷(如多發性單神經炎(mononeuritis multiplex))。常見的原因係直接的創傷、長時間對神經的壓力以及由於附近身體結構腫脹或受傷造成的神經壓迫。損傷包括破壞神經或部分神經細胞(軸突)的髓鞘(覆蓋物)。此種損傷減緩或阻止衝動通過神經的傳導。單神經病變可涉及身體的任何部分。單神經病變性疼痛，包括但不限於坐骨神經功能障礙、常見的腓神經功能障礙、橈神經功能障礙、尺骨神經功能障礙、顱部單神經病變VI、顱部單神經病變VII、顱部單神經病變III(壓迫型)、顱部單神經病變III(糖尿病型)、腋神經功能障礙、腕隧道症候群、股神經功能障礙、脛神經功能障礙、貝爾氏麻痹症(Bell's palsy)、胸廓出口症候群(thoracic outlet syndrome)、腕隧道症候群及第六(外展)神經麻痺。
c.全身性周圍神經病變
全身性周圍神經病變為對稱的，通常由於各種全身性疾病及疾病過程全面影響周圍神經系統而引起。彼等可進一步細分為數個類別：
i.遠端軸突病變(distal axonopathy)係神經元某些代謝或毒性紊亂的結果。彼等可能由諸如糖尿病、腎衰竭、如營養不良的缺乏症候群及酒精中毒、或毒素或藥物的作用所引起。遠端軸突病變(又稱為逆行性神經病變)為周圍神經病變的一種類型，由周圍神經系統(PNS)神經元的某些代謝或毒性紊亂引起。其為神經對代謝或毒性紊亂的最常見反應，因此可能由諸如糖尿病、腎衰竭之代謝性疾病、諸如營養不良之缺乏症候群及酒精中毒、或毒素或藥物的作用所引起。遠端軸突病變的最常見原因為糖尿病，且最常見的遠端軸突病變為糖尿病神經病變。
ii.髓鞘白質病(myelinopathy)係由於對髓磷脂的原發性攻擊，導致衝動傳導的急性衰竭。最常見的原因為急性發炎性脫髓鞘性多發性神經病變(AIDP；又名格巴二氏症候群)，儘管其它原因包括慢性發炎性脫髓鞘性症候群(CIDP)、遺傳性代謝失調(例如，腦白質失養症(leukodystrophy))或毒素。髓鞘白質病係由於髓磷脂或髓鞘化的許旺氏細胞的原發性破壞而導致，該軸突完好無損，但會導致衝動傳導的急性衰竭。此種脫髓鞘作用減緩或完全阻止電脈衝通過神經的傳導。最常見的原因為急性發炎性脫髓鞘性多發性神經病變(AIDP，更常稱為格巴二氏症候群)，儘管其它原因包括慢性發炎性脫髓鞘性多發性神經病變(CIDP)、遺傳性代謝失調(例如，腦白質失養症或夏馬杜三氏病)或毒素。
iii.神經病變為周圍神經系統(PNS)神經元破壞的結果。彼等可能由運動神經元疾病、感覺神經病變(例如帶狀疱疹)、毒素或自主神經功能障礙引起。神經毒素可能會引起神經病變，如化療藥劑長春新鹼(vincristine)。神經病變係由於損害周圍神經系統(PNS)的神經元而導致的功能障礙，導致周圍神經病變。其可能由運動神經元疾病、感覺神經病變(例如帶狀疱疹)、毒性物質或自主神經功能障礙引起。罹患神經病變的人可能會以不同的方式呈現，取決於原因、其影響神經細胞的方式、以及受影響最嚴重的神經細胞的類型。
iv.局部陷套神經病變(Focal entrapment neuropathy)(例如，腕隧道症候群)。
於疼痛為神經病變性疼痛的情形，於一具體實施例中，使用的多肽不包含非催化活性的BoNT/X L鏈、BoNT/X轉移域(H
N域)及/或a BoNT/X受體結合域(H
C域)。於一具體實施例，於疼痛為神經病變性疼痛的情形，使用的多肽不包含非催化活性的BoNT/X L鏈及轉移域(H
N域)，可選擇組合源自不同的梭狀芽孢桿菌神經毒素(即，非BoNT/X)的H
C域(例如，源自BoNT/B的H
C域)。較佳地，於疼痛為神經病變性疼痛的情形，使用的多肽不包含非催化活性的BoNT/X L鏈及轉移域(H
N域)、及BoNT/B H
C域。
本發明之多肽可用於治療由下列發炎性病況任一者引起的疼痛或者與其相關的疼痛。相似地，本發明之多肽可用於治療下列發炎性病況之一或多種。
A.關節炎性失調
關節炎性失調包括例如：類風濕性關節炎；幼年類風濕性關節炎；全身性紅斑狼瘡(SLE)；痛風性關節炎；硬皮症；骨關節炎；牛皮癬性關節炎；關節黏連性脊椎炎；萊特氏症候群(Reiter's syndrome)(反應性關節炎)；成人史迪爾氏病(adult Still's disease)；病毒感染引起的關節炎；細菌感染引起的關節炎，例如淋菌性關節炎及非淋菌性細菌性關節炎(敗血性關節炎)；三級萊姆病；結核性關節炎；及真菌感染引起的關節炎，例如，芽生菌病。
B.自體免疫疾病
自體免疫疾病包括例如：格巴二氏症候群、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、惡性貧血、愛迪生氏病(Addison's disease)、第I型糖尿病、全身性紅斑狼瘡、皮肌炎、休格倫氏症候群、紅斑性狼瘡、多發性硬化症、重症肌無力症、萊特氏症候群及格雷氏病(Grave's disease)。
C.結締組織失調
結締組織失調包括例如脊椎關節炎、皮肌炎、及纖維肌痛(fibromyalgia)。
D.傷害
由傷害引起的發炎(包括例如組織或關節的擠壓、穿刺、拉伸)可能會引起慢性發炎性疼痛。
E.感染
由感染引起的發炎(包括例如結核病或間質性角膜炎)可引起慢性發炎性疼痛。
F.神經炎
神經炎為影響神經或神經群的發炎性過程。症狀取決於所涉及的神經，但可能包括疼痛、感覺異常、輕癱或感覺遲鈍(麻木)。
例子包括：
a.臂神經炎
b.球後神經病變(retrobulbar neuropathy)，一種發炎過程，影響緊接眼球後面的視神經部分。
c.視神經病變，一種影響視神經的發炎過程，導致患眼的視力突然下降。視神經炎的原因並不清楚。視神經(連接眼睛及大腦的神經)的突然發炎，導致髓鞘的腫脹及破壞。發炎有時可能為病毒感染的結果，或可能由自體免疫疾病(如多發性硬化症)所引起。風險因子與可能的原因有關。
d.前庭神經炎，一種引起炎症過程的病毒感染，影響前庭神經。
G.關節發炎
關節發炎，例如由黏液囊炎或肌腱炎所引起，可能會引起慢性發炎性疼痛。
H.曬傷及/或紫外線引起的傷害
本發明之多肽可用於治療由下列頭痛病況任一者引起的疼痛或者與其相關的疼痛。頭痛(醫學上稱為頭痛(cephalgia))為一種頭部之輕度至重度的疼痛病況；有時脖子或上背部疼痛也可被解釋為頭痛。其可能表示潛在的局部或全身性疾病，或者本身就是一種疾病。
A.肌肉/肌源性頭痛
肌肉/肌源性頭痛似乎與面部及頸部肌肉的緊繃或緊張有關；彼等可能會擴散到前額。緊張性頭痛為肌源性頭痛的最常見形式。
緊張性頭痛係涉及頭部、頭皮或頸部的疼痛或不適的病況，通常與此等區域的肌肉緊繃有關。頸部及頭皮肌肉的收縮會導致緊張性頭痛。此種肌肉收縮的原因之一係對壓力、抑鬱或焦慮的反應。任何導致頭部長時間保持不動的活動都會引起頭痛。此類活動包括打字或使用電腦、用手進行精細操作以及使用顯微鏡。在寒冷室內睡覺或頸部處於異常姿勢而睡覺也可能引發此種類型的頭痛。緊張型頭痛包括但不限於發作性緊張性頭痛及慢性緊張性頭痛。
B.血管性頭痛
血管性頭痛最常見的類型是偏頭痛。其它類型的血管性頭痛包括叢集性頭痛(會引起劇烈疼痛的反復發作)及高血壓導致的頭痛。
1.偏頭痛
偏頭痛為一種異質性失調，通常涉及反復發作的頭痛。偏頭痛因其會伴有其他症狀而與其它頭痛有所不同，其他症狀例如噁心、嘔吐或對光敏感。在大多數人中，僅在頭部的一側感覺到抽痛。在具有不同潛在病理生理及遺傳機制的對象亞組中，可看到臨床特徵，例如先兆症狀(aura symptom)的類型、前徵的存在或相關症狀，例如眩暈。偏頭痛包括但不限於無先兆偏頭痛(普通偏頭痛)、有先兆偏頭痛(典型偏頭痛)、經期偏頭痛、頭痛等位發作(migraine equivalent)(無頭痛型偏頭痛(acephalic headache))、複雜性偏頭痛、腹型偏頭痛及混合性緊張偏頭痛。
2.叢集性頭痛
叢集性頭痛會影響頭部的一側(單側)，並且可能與眼睛流淚及鼻塞有關。其成簇地發生，數週內每天在同一時間重複發生，然後緩和。
D.高血壓頭痛
E.牽引及發炎性頭痛
牽引及發炎性頭痛通常為其它失調的症狀，範圍從中風到鼻竇感染。
F.荷爾蒙頭痛
G.反彈性頭痛
當過度頻繁服用藥物以緩解頭痛時，就會發生反彈性頭痛，也稱為藥物過度使用性頭痛。反彈性頭痛經常每天發生，並且可能非常疼痛。
H.慢性鼻竇炎頭痛
鼻竇炎為鼻副鼻竇的炎症，無論是細菌性、真菌性、病毒性、過敏性或自體免疫。慢性鼻竇炎為普通感冒最常見的併發症之一。症狀包括：鼻塞；面部疼痛；頭痛；發燒；全身不適；濃稠的綠色或黃色分泌物；彎腰時面部「脹滿感」的感覺加重。在少數情況下，慢性上頜竇炎也可由牙科感染中細菌的傳播而引起。慢性增生性嗜酸球性鼻竇炎為慢性鼻竇炎的一種非感染性形式。
I.器質性頭痛
J.癲癇頭痛
癲癇頭痛係與癲癇發作相關的頭痛。
本發明之多肽可用於治療由以下任何體感性疼痛病況所引起或與之相關的疼痛。體感性疼痛源自韌帶、肌腱、骨骼、血管、甚至神經本身。其係通過體感性痛覺受器檢測。此等區域缺乏疼痛受體，會產生比皮膚疼痛持續時間更長的缺乏局部性的鈍痛；例如包括扭傷及骨折。其它示例包括以下者。
A.過度的肌肉緊張
過度的肌肉張力可能由扭傷或拉傷所引起。
B.反覆性運動失調
反覆性運動失調可由過度使用手、腕、肘、肩膀、頸、背部、臀部、膝蓋、腳、腿或腳踝而引起。
C.肌肉失調
引起體感性疼痛的肌肉失調包括例如多發性肌炎、皮肌炎、狼瘡、纖維肌痛、風濕性多發性肌痛、及橫紋肌溶解。
D.肌痛
肌痛為肌肉疼痛，且為許多疾病及失調的症狀。肌痛的最常見原因係過度使用或過度拉伸肌肉或肌肉群。沒有創傷史的肌痛通常係由病毒感染所引起。長期肌痛可能表示代謝性肌病、某些營養缺乏或慢性疲勞症候群。
E.感染
感染可引起體感性疼痛。此類感染的例子包括，例如，肌肉膿瘍、旋毛蟲病、流感、萊姆病、瘧疾、落磯山斑疹熱、禽流感、普通感冒、社區型肺炎(community-acquired pneumonia)、腦膜炎、猴痘、嚴重急性呼吸道症候群、毒性休克症候群、旋毛蟲病、傷寒、及上呼吸道感染。
F.藥物
藥物可引起體感性疼痛。此類藥物包括例如：古柯鹼(cocaine)、用於降低膽固醇的斯他汀(statin) (例如阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)及洛伐他汀(ovastatin))、以及用於降低血壓的ACE抑製劑(例如依那拉普利(enalapril)及卡托普利(captopril))。
本發明之多肽可用於治療由以下任何內臟性疼痛病況所引起或與之相關的疼痛。內臟性疼痛源自身體的內臟或器官。內臟的痛覺受器位於人體器官及內腔中。與體感性疼痛相比，此等區域痛覺受器的更大程度的缺乏會產生通常比體感性疼痛更疼痛，並且持續時間更長的疼痛。內臟性疼痛很難定位，對內臟組織的幾種損傷會表現出「轉移的」疼痛，其中感覺被定位在與損傷部位完全無關的區域。內臟性疼痛的例子包括下列者。
A.功能性內臟痛
功能性內臟痛包括例如：腸躁症候群及慢性功能性腹痛(CFAP)、功能性便秘及功能性消化不良、非心臟胸痛(NCCP)及慢性腹痛。
B.慢性胃腸道發炎
慢性胃腸道發炎包括例如胃炎、發炎性腸病，例如克隆氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、微觀結腸炎(microscopic colitis)、憩室炎及胃腸炎；間質性膀胱炎；腸缺血；膽囊炎；闌尾炎；胃食道逆流；潰瘍、腎結石、尿路感染、胰臟炎及疝氣。
C.自體免疫疼痛
自體免疫疼痛包括例如類肉瘤病及血管炎。
D.器質性內臟痛
器質性內臟痛包括例如由腸道的創傷性、發炎性或退化性病變引起的疼痛，或由影響感覺神經支配的腫瘤產生的疼痛。
E.治療誘導的內臟痛
治療誘導的內臟痛包括例如化療引起的疼痛或放射治療引起的疼痛。
本發明之多肽可用於治療由以下任何轉移痛病況所引起或與之相關的疼痛。
轉移痛源自位於與疼痛刺激部位不同的區域的疼痛。通常，當神經在其起源處或附近受壓迫或受損時，會產生轉移痛。在此種情況下，即使損傷起源於其它地方，通常會在神經服務的區域感覺到疼痛感。一個常見的例子發生在椎間盤突出症，其中源自脊髓的神經根被相鄰的椎間盤材料擠壓。儘管疼痛可能源於受損的椎間盤本身，但在受壓迫神經所服務的區域(例如，大腿、膝蓋或腳)也會感覺到疼痛。減輕神經根的壓力可減緩該轉移痛，前提係未發生永久性神經損傷。心肌缺血(流向部分心肌組織的血流減少)可能為轉移痛最著名的例子；此種感覺可能以受束縛的感覺出現在上胸部或以疼痛出現在左肩、手臂甚至手。
本發明之多肽可用於治療術後疼痛。
術後(例如，手術後)疼痛係由手術程序引起的令人不快的感覺。術後疼痛可由切口、手術本身、傷口的閉合以及手術期間施加的任何力對組織造成的損傷所引起。手術後疼痛(例如，術後疼痛)亦可能源於手術伴隨的因子。例如，對象可能由於其在手術台上的安置方式而遭受背部疼痛，或者由於胸部區域的切口而遭受胸痛。全身麻醉後也可能出現喉嚨痛，因為插入呼吸管會引起刺激。然而，最常見的為由手術切口切入皮膚及肌肉而引起的術後疼痛。
例如，手術程序(或更具體而言，手術切口)可能代表引起疼痛的「有害刺激」。有害刺激，可引起組織損傷的刺激，可活化神經傳導物質從感覺接受性傳入末端釋放、以及如P物質(Substance P)及降鈣素基因相關肽(CGRP)之神經肽從感覺末端釋放。然後，有害信息從周圍神經系統傳導到中樞神經系統，在中樞神經系統中，疼痛會被個體感知。
發炎及神經組織損傷的結合可引起術後疼痛。例如，反應組織損傷而活化的肥大細胞的脫顆粒可導致多種物質的釋放，包括蛋白酶、細胞激素、血清素及細胞外空間。此等物質可致敏(以較低的閾值活化)初級傳入神經元，以產生疼痛超敏(pain hypersensitivity)。由於組織廣泛地被神經支配，身體的任何部位都容易感受到手術造成的神經損傷。
提及手術，意指涉及對象的損傷或疾病之治療的醫療程序，包括對身體的一部分進行切口(可選擇地去除或修復身體的受損部分)。儘管侵入性的水準(例如，所需的手術切口的水準)在手術類型之間可能變化，但意圖涵蓋具有一旦手術完成而在對象中引起疼痛之侵入性的水準的手術。
手術可包括對皮膚及/或筋膜及/或肌肉的切口。較佳地，手術包括對皮膚的切口。
手術不限於可由醫生進行的手術，還包括例如牙科手術。手術的非限制性實例包括闌尾切除術(appendectomy)、乳房生檢、乳房增大或縮小、整容、膽囊切除術、冠狀動脈繞道術、清創術(例如，傷口、燒傷或感染)、皮膚移植、器官移植及扁桃體切除術。
較佳地，「術後」可指手術後(例如，手術後)開始至多一天的時期。換言之，術語「術後」可指手術後開始不大於一天的時期。例如，術語「術後」可指手術後開始1-20小時的時間點；可選擇地為手術後2-15小時；可選擇地為手術後5-10個小時。此種時間可代表從時序界面開始的時期，在該時期，投予至對象的手術麻醉劑的鎮痛作用減弱(例如，逐漸減弱)，因此對象開始感知到疼痛。
此外，術語「術後」可與術語「手術後」互換使用，因為本文中以「外科手術」的意義使用「手術」。
相似地，術語「術後疼痛」可指在手術後(例如，手術後)開始最多一天的時期內感知到的(或更具體而言，開始感知到的)疼痛。換言之，術語「術後」可指對象在手術後開始不大於一天的時期內感知到的疼痛。例如，術語「術後」可指在手術後1-20小時開始的時期內感知到的疼痛；可選擇地為手術後2-15小時；可選擇地為手術後5-10個小時。
該時期可為手術後的1-50週；例如5-45週、10-40週或10-35週。
此與術語「手術全期(peri-operative)」對比，手術全期可指例如對象接受手術的時間或前後的時期(例如，當對象在手術室時的時間)，適合為從手術前至少1小時開始及/或在少於手術後1小時結束的時期。
本發明解決廣範圍的疼痛病況，例如，慢性疼痛病狀。於一些具體實施例，本發明之多肽係用於治療癌性及非癌性疼痛。
較佳地，本發明之多肽係用於治療神經病變性疼痛。神經病變性疼痛可為急性或慢性。於一具體實施例，神經病變性疼痛為傷害誘導的神經病變性疼痛(與傷害有關的神經病變性疼痛)。於一具體實施例，神經病變性疼痛為化療誘導的神經病變性疼痛(與化療有關的神經病變性疼痛)。
較佳地，本發明之多肽係用治療發炎性疼痛。發炎性疼痛可為急性或慢性。於一具體實施例發炎性疼痛可為燒傷。例如，發炎性疼痛可為由UV損傷(例如，UV-B損傷)所引起。
最佳地，本發明之多肽係用於治療膀胱疼痛症候群、幻肢痛、或偏頭痛。膀胱疼痛症候群可能由間質性膀胱炎所引起或與之相關。
治療疼痛較佳意指減輕疼痛。換言之，於一具體實施例，本發明之多肽的投予於對象中減輕疼痛。
更詳言之，提及「減輕」或「降低」(就疼痛而言)較佳意指與投予前(pre-administration)對象感知到的疼痛水準相比，對象在投予本發明之多肽後(投予後)感知到較低水準的疼痛。例如，與投予前相比，投予後感知到的疼痛水準可降低至少15%、25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%或95%。例如，投予後感知到的疼痛的水準可降低至少75%；較佳為至少85%；更佳為至少95%。
用於評估疼痛知覺的多種手段為所屬技術領域中具有通常知識者已知。例如，機械性觸摸痛(靜態或動態)的評估通常用於人類疼痛研究中，如Pogatzki-Zahn等人所述(Pain Rep. 2017 Mar; 2(2): e588)，藉由引用併入本文。
用於評估對象的疼痛知覺的適合的(儘管非限制性的)方法包括下列：數字評定量表(NRS)分數；儘管所屬技術領域中具有通常知識者知道可附加地或替代地使用的其它方法，如感覺閾值、疼痛知覺閾值、靜態機械性觸摸痛、動態機械性觸摸痛、時間加成性、壓痛閾值、條件性疼痛調節(conditioned pain modulation)、及溫度閾值。
疼痛知覺測量之其它非限制性示例包括：在每個計劃的時間點從SF-36評分的基線的變化；研究期間服用的急救藥物的量以及首次服用急救藥物的時間。此等可被視為「探索性」終點或疼痛知覺評估測量。
如此，於一較佳具體實施例，投予本發明之多肽後，可藉由下列一或多者評估疼痛知覺：(a)數字評定量表(NRS)；(b)刺激誘發的NRS；(c)疼痛區域的溫度；(d)疼痛區域的大小；(e)鎮痛作用開始的時間；(f)鎮痛效果峰值；(g)達到鎮痛效果峰值的時間；(h)鎮痛作用的持續時間；及(i)SF-36生活品質。
所屬技術領域中具有通常知識者知道用於評估疼痛知覺的此類方法。為了方便，以下提供數字評定量表及生活品質調查表Short Form-36的進一步描述。
數字評定量表(NRS)：通常，根據本發明的疼痛知覺使用數字評定量表(NRS)。NRS為一種11分制的評分標準，以評估對象疼痛知覺。要求對象給出一個最適合其疼痛強度的0到10之間的數字。0表示「完全沒有疼痛」，而上限10表示「可能最嚴重的疼痛」。
NRS可用於評估疼痛之眾多方面，包括自發性平均疼痛、自發性最嚴重疼痛、及自發性當前疼痛。藉由要求對象選擇最能描述對象在一段時間(例如至少6小時、12小時、24小時或至少48小時)內的平均疼痛(例如感知到的疼痛)的數字，來評估自發性平均疼痛。藉由要求對象選擇一個最能描述對象在指定期間內最嚴重疼痛的數字，來評估自發性最嚴重疼痛，例如，至少前6小時、12小時、24小時、或前48小時。藉由要求對象選擇一個最能描述對象在評估時的疼痛程度的數字，來評估自發性當前疼痛。
NRS亦可用於評估對象對各種不同刺激的疼痛知覺。為了評估對刺激反應的疼痛知覺，對象將接受適加於疼痛區域的各種性質的刺激。在投劑前及刺激後詢問對象其當前的NRS分數為何。
所使用的刺激之例包括：(i)輕觸(可藉由在應用本文所述的馮・弗雷絲(von Frey filament)之後，通過測量放射輻(radial spoke)的疼痛區域表面上的疼痛來評估)；(ii)壓力(壓痛閾值)，可藉由使用壓力感覺計，於施加增加的壓力時要求對象給予NRS分數來評估；及(iii)溫度(可藉由使用熱電極(thermode)施加於疼痛區域，詢問對象對溫暖、冷及熱刺激的NDS分數來評估)。
較佳地，當與投予前對象的NRS分數比較時，本發明之多肽的投予降低對象的投予後NRS分數(例如，由評定≥7至評定≤6)。
生活品質調查表Short Form-36 (SF-36)：SF-36生活質量調查表可用於評估對象的疼痛知覺。SF-36為對象報告的36項對象健康的調查。SF-36由八項評分(活力、身體機能、身體疼痛、一般健康知覺、身體角色機能、情感角色機能、社會角色機能及心理健康)所組成。假設每個問題的權重相等，則每個量表直接轉換為0-100尺度。SF-36中記錄的分數越高，失能程度越小。
在臨床試驗中通常測試的用於治療疼痛的相關參數為本技術領域已知，且可由所屬技術領域中具有通常知識者容易地選擇。此種參數之例包括但不限於NRS；刺激誘發的NRS；疼痛區域的溫度；疼痛區域的大小；鎮痛作用開始的時間；鎮痛效果峰值；達到鎮痛效果峰值的時間；鎮痛作用的期間；及/或如本文所述之SF-36生活品質。評估此等參數的方法於本技術領域中亦為已知，且可由所屬技術領域中具有通常知識者使用常規方法及程序進行。
較佳地，當與投予前對象的SF-36分數比較時，本發明之多肽的投予增加對象的投予後SF-36分數(例如，由≤50的分數至≥50的分數)。
藉由本發明之多肽治療的發炎性失調可為以下的發炎性失調：神經系統、心血管系統、呼吸系統、消化系統、皮膚系統(integumentary system)、肌肉骨骼系統、泌尿系統、生殖系統、內分泌系統、或淋巴系統。
神經系統的發炎性失調可為選自由下列所組成的群組之一或多者：中樞神經系統發炎(例如腦炎、脊髓炎、腦膜炎或蜘蛛膜炎(arachnoiditis))、周圍神經系統發炎(例如神經炎)、眼部發炎(例如淚腺炎、鞏膜炎、上鞏膜炎、角膜炎、視網膜炎、脈絡膜視網膜炎、瞼緣炎(blepharitis)、結膜炎或眼色素層炎)、及耳朵發炎(例如外耳炎、中耳炎、迷路炎及乳突炎)。
心血管系統的發炎性失調可選自由下列所組成的群組之一或多者：心臟炎(例如，心內膜炎、心肌炎或心包炎)及血管炎(例如，動脈炎、靜脈炎、或微血管炎)。
呼吸系統的發炎性失調可選自由下列所組成的群組之一或多者：上呼吸道系統發炎性疾病(例如，鼻竇炎、鼻炎、咽炎、或喉炎)、下呼吸道系統發炎性失調(例如氣管炎、支氣管炎、細支氣管炎、肺炎或胸膜炎)、及縱隔炎(mediastinitis)。
消化系統的發炎性失調可選自由下列所組成的群組之一或多者：口腔發炎(例如，口腔炎、牙齦炎、齦口炎、舌炎、扁桃腺炎、唾液腺炎(sialadenitis)/腮腺炎、唇炎、牙髓炎或頜炎)、胃腸道發炎(例如，食道炎、胃炎、胃腸炎、腸炎、結腸炎、小腸結腸炎、十二指腸炎、迴腸炎、盲腸炎、闌尾炎或直腸炎)、以及輔助消化器官的發炎(例如，肝炎、上行性膽管炎(ascending cholangitis)、膽囊炎、胰臟炎或腹膜炎)。
皮膚系統的發炎性失調可為選自由以下所組成的群組的一種或多種：皮膚炎(例如，毛囊炎)、蜂窩性組織炎、及汗腺炎。
肌肉骨骼系統的發炎性失調可為選自由以下所組成的群組的一種或多種：關節炎、皮肌炎、軟組織發炎(例如，肌炎、滑膜炎/腱鞘炎、黏液囊炎、接骨點炎(enthesitis)、筋膜炎、囊炎(capsulitis)、上髁炎(epicondylitis)、肌腱炎或脂層炎(panniculitis))、骨軟骨炎、骨炎/骨髓炎、脊椎炎、骨膜炎、及軟骨炎。
泌尿系統的發炎性失調可為選自由以下所組成的群組的一種或多種：腎炎(例如，腎絲球腎炎或腎盂腎炎)、輸尿管炎、膀胱炎及尿道炎。
生殖系統的發炎性失調可為選自由以下所組成的群組的一種或多種：女性生殖系統的發炎(例如，卵巢炎、輸卵管炎、子宮內膜炎、子宮旁炎(parametritis)、子宮頸炎，陰道炎、外陰炎或乳腺炎)、男性生殖系統的發炎(例如，睪丸炎、附睪炎、前列腺炎、精囊炎、龜頭炎、包皮炎或龜頭包皮炎)、及與妊娠、分娩及/或新生兒有關的發炎(例如，絨毛羊膜炎(chorioamnionitis)、臍帶炎(funisitis)或臍炎(omphalitis))。
內分泌系統的發炎性失調可為選自由以下所組成的群組的一種或多種：胰島炎、垂體炎、甲狀腺炎、副甲狀腺炎、腎上腺炎。
淋巴系統的發炎性失調可為選自由以下所組成的群組的一種或多種：淋巴管炎及淋巴腺炎。
較佳地，發炎性失調係選自以下的一種或多種：複雜性局部疼痛症候群、子宮內膜異位、類風濕性關節炎、膀胱炎及神經炎。膀胱炎較佳為間質性膀胱炎。神經炎較佳為周圍神經炎。
與本發明的各種治療用途有關的具體實施例係意圖與治療方法相同地應用，反之亦然。
序列同源性可使用多種序列比對方法中的任一種來確定一致性百分比，包括但不限於整體法(global methods)、局部法及雜合法((hybrid methods)，諸如，例如區段逼近法(segment approach method)。確定一致性百分比的實驗規程為本技術領域所屬技術領域中具有通常知識者範疇內的常規程序。整體法從分子的起始到末端比對序列，並藉由累加各個殘基對的分數並藉由施加間隙罰分(gap penalty)來確定最佳比對。非限制性方法包括例如：CLUSTAL W，參見例如Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)；及其疊代精化(iterative refinement)，參見例如Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)。局部方法藉由鑑定由所有輸入序列所共有的一個或多個保守模體來比對序列。非限制性方法包括例如：Match-box，參見例如Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)；吉布斯抽樣(Gibbs sampling)，參見例如C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)；Align-M，參見例如Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)。
如此，藉由習知方法確定序列同一性百分比。參見例如Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992。簡而言之，使用間隙開放罰分10、間隙延伸罰分1、以及如下所示的Henikoff及Henikoff(同上)的「blosum 62」評分矩陣(胺基酸藉由標準的單一字母代碼表示)，將兩個胺基酸序列進行比對，以最佳化比對分數；較佳地，此方法係用於將一序列與本文所述的SEQ ID NO比對以定義胺基酸位置編號，如本文所述。
在兩個以上核酸或胺基酸序列間的「序列同一性百分比」，係在序列所共有的相同位置之數目的函數。如此，同一性%能以下述方式計算：相同核苷酸/胺基酸的數目除以核苷酸/胺基酸總數乘以100。序列同一性%的計算亦可考慮到為了最佳化兩個以上序列的比對所需要導入之間隙的數量、以及各間隙的長度。兩個以上序列之間的序列比較及一致性百分比的確定可使用例如BLAST的特定數學演算法進行，其為所屬技術領域中具有通常知識者所熟悉。
用於確定序列同一性的比對分數
然後，同一性百分比計算為：
實質上同源的多肽，特徵在於具有一或多個胺基酸取代、缺失或添加。此等改變較佳為較小的性質，即保留式胺基酸取代(詳見下文)及不會顯著影響多肽的折疊或活性的其它取代；小缺失，通常缺失1至約30個胺基酸；及小的胺基或羧基末端延伸，諸如胺基末端的甲硫胺酸殘基、最多約20-25個殘基的小型連接肽或親和性標籤。
保留式胺基酸取代
| 鹼性： | 精胺酸 |
| 離胺酸 | |
| 組胺酸 | |
| 酸性： | 麩胺酸 |
| 天冬胺酸 | |
| 極性： | 麩醯胺酸 |
| 天冬醯胺酸 | |
| 疏水性： | 白胺酸 |
| 異白胺酸 | |
| 纈胺酸 | |
| 芳香族： | 苯丙胺酸 |
| 色胺酸 | |
| 酪胺酸 | |
| 小的： | 甘胺酸 |
| 丙胺酸 | |
| 絲胺酸 | |
| 蘇胺酸 | |
| 甲硫胺酸 |
除了20種標準胺基酸之外，非標準胺基酸(諸如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸及α-甲基絲胺酸)亦可取代本發明的多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保留式胺基酸、非由遺傳密碼所編碼的胺基酸及非天然胺基酸可取代多肽胺基酸殘基。本發明之多肽亦可包含非天然存在的胺基酸殘基。
非天然存在的胺基酸包括但不限於反-3-甲基脯胺酸、2,4-甲橋脯胺酸、順-4-羥基脯胺酸、反-4-羥基脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別蘇胺酸、甲基蘇胺酸、羥乙基半胱胺酸、羥乙基升半胱胺酸、硝基麩醯胺酸、升麩醯胺酸、2-哌啶甲酸、三級白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸、及4-氟苯丙胺酸。本技術領域已知將非天然存在的胺基酸殘基併入蛋白質中的數種方法。例如，可使用活體外系統，其中使用經化學胺基醯化的壓制型tRNA(suppressor tRNA)而壓制無意義突變(nonsense mutation)。用於合成胺基酸及胺基醯化tRNA的方法為本技術領域所知。含有無意義突變的質體的轉錄及轉譯係於無細胞系統中進行，該無細胞系統包含大腸桿菌S30萃取物及可商業上購得的酶及其它試劑。蛋白質可藉由層析純化。參見例如：Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991；Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991；Chung et al., Science 259:806-9, 1993；及Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993)。於第二種方法中，藉由顯微注射經突變的mRNA及經化學胺基醯化的壓制型tRNA，而在爪蟾卵母細胞(Xenopus oocyte)中進行轉譯(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996)。於第三種方法中，在欲置換的天然胺基酸(例如苯丙胺酸)不存在且所欲的非天然存在的胺基酸(例如2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸或4-氟苯丙胺酸)存在下培養大腸桿菌細胞。非天然存在的胺基酸被併入多肽中代替其天然的對應物。參見Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994。天然存在的胺基酸殘基可藉由活體外化學修飾而轉化為非天然存在的種類。化學修飾可與定點誘變結合以進一步擴大取代範圍(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。
有限數量的非保留式胺基酸、非由遺傳密碼所編碼的胺基酸、非天然存在的胺基酸及非天然的胺基酸可取代本發明之多肽的胺基酸殘基。
本發明之多肽中的必需胺基酸可根據所屬技術領域中已知的程序鑑定，諸如定點誘變或丙胺酸掃描誘變(alanine-scanning mutagenesis)(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989)。生物相互作用的位置亦可藉由結構物理分析來確定，如藉由如下列之技術結合推定的接觸位胺基酸的突變：核磁共振、結晶學、電子繞射或光親和性標幟(photoaffinity labeling)之技術，結合推定的接觸位胺基酸的突變。參見例如：de Vos et al., Science 255:306-12, 1992；Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992；Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992。必需胺基酸的同一性亦可由與本發明之多肽的相關組件(例如轉移或蛋白酶組件)的同源性分析來推斷。
可使用已知的誘變與篩選方法而進行及測試多個胺基酸取代，如由Reidhaar-Olson及Sauer (Science 241:53-7, 1988)或Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)所揭示者。簡而言之，此等作者揭示用於在多肽中同時隨機化二或多個位置，選擇功能性多肽，然後定序所誘變的多肽以確定每個位置允許取代的幅度之方法。可使用的其它方法包括噬菌體展示(phage display)(例如，Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991；Ladner et al.，U.S.專利號No. 5,223,409；Huse，WIPO 公開案WO 92/06204)及區域定向誘變(region-directed mutagenesis)(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986；Ner et al., DNA 7:127, 1988)。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術及科學術語具有如被本揭示所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解的相同含義。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)及Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)提供本揭示中使用的許多術語的一般詞典給所屬技術領域中具有通常知識者。
此揭示並不受限於本文所揭示的例示方法及材料，且與本文描述者相似或等同的任何方法及材料皆可用於本揭示之具體實施例的實施或試驗中。數字範圍包括定義範圍的數字。除非另有說明，否則任何核酸序列均分別以5'至3'方向從左至右書寫；胺基酸序列分別以胺基至羧基的方向從左至右書寫。
本文所提供的標題並非此揭示之各種態樣或具體實施例的限制。
在本文中提及胺基酸係使用胺基酸的名稱、三字母縮寫或單字母縮寫。本文所使用之術語「蛋白質」包括蛋白質、多肽及肽。本文所使用之術語「胺基酸序列」與術語「多肽」及/或術語「蛋白質」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「肽」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「酶」同義。術語「蛋白質」及「多肽」在本文可互換使用。在本揭示及申請專利範圍中，可使用用於胺基酸殘基的習知一字母及三字母代碼。胺基酸的三字母代碼，係與IUPACIUB生化命名聯合委員會(Joint Commission on Biochemical Nomenclature) (JCBN)一致地定義。亦應理解，由於遺傳密碼的簡併性，一種多肽可藉由一種以上的核苷酸序列所編碼。
術語之其它定義可能於整個說明書中出現。在更詳細地描述示例性具體實施例之前，應理解本揭示不限於所描述的特定具體實施例，並且因此可變化。亦應理解，本文所使用的術語僅用於描述特定具體實施例的目的，而無意於限制本發明，由於本揭示內容的範疇僅由所附申請專利範圍定義。
在提供一數值範圍時，應當理解，除非上下文另有明確指明，否則在該範圍的上限及下限之間的每個居中值(intervening value)至下限單位的十分之一亦被具體揭示。在本揭示內容中包含「在所述範圍內的任何所述值或中間值」與「所述範圍內的任何其它所述或中間值」之間的每個較小範圍。此等較小範圍的上限及下限可獨立地在該範圍內被包括或排除，且於較小範圍內包含此限值中的任一個、兩個皆不包含或兩個皆包含之每個範圍亦被包括於本揭示內容中，受到於所述範圍內任何明確排除的限制。當於所述範圍包括此限值的一或兩個時，排除彼等所包含的限值之一或兩個的範圍亦包括於本揭示內容。
必需注意於本文及所附申請專利範圍中使用時，單數形式「一」、「一種」、及「該」包括複數的指涉對象，除非上下文另有明確規定。如此，例如，提及「一種梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括多種的此種候選藥劑，且提及「該梭狀芽孢桿菌神經毒素」包括提及所屬技術領域中具有通常知識者已知的一或多種梭狀芽孢桿菌神經毒素及其等效物等。
本文中討論的出版物僅提供用於彼等在本申請案之申請日之前的揭示。本文中的任何內容均不應解釋為承認此類出版物構成所附之申請專利範圍的先前技術。
序列表於下列SEQ ID NO之任一者中顯示起始Met胺基酸殘基或對應的起始密碼子時，該殘基/密碼子為非必需的。
SEQ ID NO：1-重組非催化活性的BoNT/A (rBoNT/A(0))之核苷酸序列
SEQ ID NO：2-rBoNT/A(0)之多肽序列
SEQ ID NO：3-rLH
N/A(僅輕鏈加上轉移域)之核苷酸序列
SEQ ID NO：4-rLH
N/A之多肽序列
SEQ ID NO：5-rL/A(僅輕鏈)之核苷酸序列
SEQ ID NO：6-rL/A之多肽序列
SEQ ID NO：7-rH
C/A之核苷酸序列
SEQ ID NO：8-rH
C/A之多肽序列
SEQ ID NO：9-rBoNT/B(0)之核苷酸序列
SEQ ID NO：10-rBoNT/B(0)之多肽序列
SEQ ID NO：11-rBoNT/C(0)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 12-rBoNT/C(0)之多肽序列
SEQ ID NO ： 13-rBoNT/E(0)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 14-rBoNT/E(0)之多肽序列
SEQ ID NO ： 15-rBoNT/F(0)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 16-rBoNT/F(0)之多肽序列
SEQ ID NO ： 17-rBoNT/A(0)(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 18-rBoNT/A(0)(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 19-rLH
N/A(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 20-rLH
N/A(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 21-rH
C/A(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 22-rH
C/A(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 23-rLC/A(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 24-rLC/A(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 25-rBoNT/FA(0)(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 26-rBoNT/FA(0)(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 27-rLH
N/FA(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 28-rLH
N/FA(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 29-rH
C/FA(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 30-rH
C/FA(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 31-rLC/FA(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 32-rLC/FA(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 33-rBoNT/F(0)(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 34-rBoNT/F(0)(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 35-rL
HN/F(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 36-rL
HN/F(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 37-rH
C/F(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 38-rH
C/F(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 39-rLC/F(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 40-rLC/F(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 41-陽離子性rH
C/A(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 42-陽離子性rH
C/A(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 43-rH
C/AB(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 44-rH
C/AB(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 45-rH
C/A變異體Y1117V H1253K(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 46-rH
C/A變異體Y1117V H1253K(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 47-rH
C/A變異體Y1117V F1252Y H1253K L1278F(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 48-rH
C/A變異體Y1117V F1252Y H1253K L1278F(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 49-rH
C/A變異體Y1117V F1252Y H1253K L1278H(His標籤)之核苷酸序列
SEQ ID NO ： 50-rH
C/A變異體Y1117V F1252Y H1253K L1278H(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 51-BoNT/A-UniProt P10845之多肽序列
SEQ ID NO ： 52-BoNT/B-UniProt P10844之多肽序列
SEQ ID NO ： 53-BoNT/C-UniProt P18640之多肽序列
SEQ ID NO ： 54-BoNT/D-UniProt P19321之多肽序列
SEQ ID NO ： 55-BoNT/E-UniProt Q00496之多肽序列
SEQ ID NO ： 56-BoNT/F-UniProt A7GBG3之多肽序列
SEQ ID NO ： 57-BoNT/G-UniProt Q60393之多肽序列
SEQ ID NO ： 58-TeNT-UniProt P04958之多肽序列
SEQ ID NO ： 59-BoNT/X之多肽序列
SEQ ID NO ： 60-未經修飾的BoNT/A1之多肽序列
SEQ ID NO ： 61-mrBoNT/AB(0)之多肽序列
SEQ ID NO ： 62-mrBoNT/A(0)之多肽序列
SEQ ID NO ： 63-BoNT/XB(0)(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 64-BoNT/XB(0)之多肽序列
SEQ ID NO ： 65-BoNT/XB(0)變異體(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 66-BoNT/XB(0)變異體之多肽序列
SEQ ID NO ： 67-BoNT/XA(0)之多肽序列
SEQ ID NO ： 68-BoNT/XA(0)變異體之多肽序列
SEQ ID NO ： 69-BoNT/XD(0)之多肽序列
SEQ ID NO ： 70-BoNT/XF(0)之多肽序列
SEQ ID NO ： 71-C1活化圈共通序列
SEQ ID NO ： 72-C1活化圈
SEQ ID NO ： 73-C1活化圈變異體
SEQ ID NO ： 74-rLC/A(0)(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 75-rLH
N/A(0)(His標籤)之多肽序列
SEQ ID NO ： 76-rLC/X(0)之多肽序列
SEQ ID NO ： 77-PreScission蛋白酶位
SEQ ID NO ： 78-C1活化圈變異體2
實施例 1 BoNT/A(0) 於活體外及活體內為非催化活性的於活體外細胞系模式中試驗BoNT/A(0)(SEQ ID NO：2)之催化活性，其測量SNAP25(BoNT/A目標SNARE蛋白)之切割。圖1顯示在人類神經元分析中，與野生型BoNT/A(SEQ ID NO：60)相反， BoNT/A(0)不切割SNAP25。圖2在大鼠神經元分析中確認到此結果。
通過確認的方式，使用BoNT/A及BoNT/A(0)進行活體內DAS分析。藉由將20μl由明膠磷酸鹽緩衝液配製的梭狀芽孢桿菌毒素注射到小鼠腓腸肌/比目魚肌複合肌群(gastrocnemius/soleus complex)中，然後使用Aoki的方法(Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001)評估趾外展分數(Digital Abduction Score)而進行DAS分析。於DAS分析，小鼠係藉由尾巴被短暫懸吊以誘發特徵性的驚嚇反應(圖3A)，其中小鼠伸展其後肢並外展其後趾。注射梭狀芽孢桿菌神經毒素後，以五分制將趾外展的變化程度進行評分(0=正常至4=趾外展的最大減少-圖3B)。此提供由神經毒素在神經肌肉會合處的活性所引起的麻痺的功能量度。此外，在投予7日內評估小鼠的體重變化。此提供毒性及毒素自投予部位擴散的不希望作用的量度。結果呈示於下表1中。
表 1.投予BoNT/A(0)或BoNT/A後之DAS分數(24小時後)及體重變化。
| DAS分數 | 觀察到的體重變化 | |
| BoNT/A | 4 | 有 |
| BoNT/A(0) | 0 | 無 |
此結果確認BoNT/A(0)於活體內為非催化活性的且不會產生任何毒性症狀。如此，BoNT/A(0)為安全、實質上無毒性的治療劑。
實施例
2
使用非催化活性的
BoNT
之慢性神經病變性疼痛的治療
(
慢性壓迫性損傷
(Chronic Constriction Injury (CCI))
大鼠模式
)
[材料&方法]
如先前的Bennett and Xie (1988), Pain, 33(1):87-107所述，進行慢性壓迫性損傷(CCI)。於第-14日，將成年雄性Sprague-Dawley大鼠(220-250 g)麻醉，然後暴露出左坐骨神經的一段，並在神經上放置四根鬆散的絲線結紮。於第0日(D0)，大鼠經由足底(i.pl.)途徑注射而投予BoNT/A (30 pg/kg)、BoNT/A (60 pg/kg)、BoNT/A(0) (60 pg/kg)或媒液(GPB) (n=10-11/組)，而陽性對照(加巴噴丁(100 mg/kg))經由口服(p.o.)途徑投予(n=8/組)。以加巴噴丁處理的動物係於處理後1、2及4 h試驗。經BoNT/A、BoNT/A(0)或媒液處理的動物係於第3、5及9日試驗。在馮・弗雷試驗中評估動物的機械敏感性。
[結果]
實驗顯示藉由投予非催化活性的BoNT (BoNT/A(0))，於同側腳掌的機械敏感性減輕(圖4B)。此外，當與等效投劑的BoNT/A相比時，BoNT/A(0)於減輕機械敏感性更為有效。於較晚的時間點，BoNT/A(0)亦較加巴噴丁更為有效。為了確認敏感性降低係BoNT/A(0)投予的結果，亦測試對側腳掌的機械敏感性。結果顯示，於不同條件下對側腳掌的機械敏感性差異並不顯著(圖4C)。此外，作為BoNT/A(0)的實質上無毒性的確認，隨著時間經過的體重變化與投予媒液或加巴噴丁的大鼠等值(圖4D)。此與在投予催化活性BoNT/A的大鼠中觀察到的變化相反，其在第9日有統計學上顯著的差異。
綜上所述，非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素令人驚訝地能夠減輕疼痛(例如，慢性神經病變性疼痛)，因而暗示此種神經毒素為適合的疼痛治療劑。
實施例
3
使用非催化活性的
BoNT
之急性神經病變性疼痛的治療
(
奧沙利鉑大鼠模式
)
[材料&方法]
藉由奧沙利鉑之腹腔內注射而誘導奧沙利鉑誘導的周圍感覺神經病變的實驗模式(Ling
et al(2007), Pain, 128(3):225-234；Ling
et al (2007), Toxicology, 20;234(3):176-84)。於第0日，成年雄性Sprague-Dawley大鼠(100-133 g)接受假治療(sham-treatment)(5%葡萄糖)或奧沙利鉑(10 mg/kg)之i.p.注射。之後立即使經假治療的動物接受媒液之i.pl.注射，而經奧沙利鉑治療的動物接受BoNT/A(0) (1000 pg/kg)、BoNT/A (50 pg/kg)、BoNT/A (100 pg/kg)、BoNT/A (160 pg/kg)或媒液(GPB；n=10/組)之i.pl.注射。於D3，經由p.o.途徑給予陽性對照度洛西汀(100 mg/kg)。於D3及D5評價動物的熱(冷)敏感性。
[結果]
實驗顯示藉由投予非催化活性的BoNT (BoNT/A(0))，於同側腳掌的冷敏感性減輕(圖5B)。以BoNT/A、BoNT/A(0)或媒液處理的各組中，對側腳掌的熱敏感性沒有差異(圖5C)。
綜上所述，非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素令人驚訝地能夠減輕急性神經病變性疼痛，因而暗示此種神經毒素具有對於治療疼痛的通用應用。
實施例
4
使用非催化活性的
BoNT
之慢性神經病變性疼痛的治療
(
奧沙利鉑大鼠模式
)
[材料&方法]
於經由i.pl.途徑於第0日以BoNT/A (100 pg/kg)、BoNT/A(0) (100 pg/kg)或媒液(GPB)處理之前，於第-2日(D-2)，成年雄性Sprague-Dawley大鼠(180-210 g)接受奧沙利鉑(10 mg/kg)之i.p.注射(n=11-12/組)。於D3對陽性對照投予普瑞巴林(n=12)。於第3、6及9日試驗動物的機械敏感性(馮・弗雷試驗)及熱(冷)敏感性(冷板試驗)。
[結果]
此實驗顯示藉由投予非催化活性的BoNT (BoNT/A(0))，同側腳掌中機械敏感性(圖6B)及冷敏感性(圖6D)降低。
綜上所述，於不同化療誘導的疼痛模式中非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素令人驚訝地能夠減輕慢性神經病變性疼痛。
實施例
5
使用非催化活性的
BoNT
之發炎性疼痛
(UV-B
曬傷大鼠模式
)
的治療
[材料&方法]
在人類以及囓齒動物模式中，紫外線(UV)B輻射會導致機械性及熱的痛覺過敏(hyperalgesia)兩者。成年雄性Wistar大鼠(180-210g)藉由i.pl.注射被投予BoNT/A (100 pg/kg)、BoNT/A(0) (100 pg/kg)或媒液(GPB；n=12/組)。24小時後，將同側腳掌蹠面暴露於紫外光B(UVB)輻射約5分鐘，並接受500 mJ/cm
2的劑量。UVB輻射48小時後及72小時後注射BoNT/A、BoNT/A(0)或媒液，於馮・弗雷試驗中試驗動物的機械敏感性。另一組UVB暴露的動物於48小時後注射陽性對照(吲哚美辛)並於注射後1小時於馮・弗雷試驗中測試(n=12/組)。
[結果]
實驗顯示藉由投予非催化活性的BoNT (BoNT/A(0))，降低機械敏感性(圖7B)。綜上所述，非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素令人驚訝地能夠減輕發炎性疼痛(例如，急性發炎性疼痛)，因而確認此種神經毒素具有對於治療疼痛的通用應用。
令人驚訝的發現非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素減輕發炎性疼痛，表示其發現在治療潛在的發炎性病況(例如包括治療發炎性病況的至少一種症狀，即相關的疼痛)中具有效用。如此，認為非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素可用於治療發炎性病況係可信的。
實施例
6
使用非催化活性的嵌合
BoNT
之發炎性疼痛
(CFA
誘導的發炎性疼痛模式
)
的治療
[材料&方法]
BoNT或媒液投劑之前，連續3天使用遞增力的分級馮・弗雷絲評量70隻成年雄性C57/BL6小鼠(22-26g)的腳掌縮回閾值(paw withdrawal threshold)(PWT, g)。最後2日的平均值被視為基線。在第0日，於氣體麻醉下，將BoNT/XB (0.3及30 ng/kg)、BoNT/XB(0) (0.3及30 ng/kg)、BoNT/A (160 pg/kg)或媒液(840 µl/kg)注射至左後腳掌足底肉墊(n=10/組)。於第2日，CFA注射之前，重新評估PWT。然後於異氟烷麻醉下，將20 µL固定體積的CFA (1.5 mg/mL)注射至相同後腳掌。於第3日(CFA後第1日)，PWT評估前1小時，分配至吲哚美辛組的動物口服投予吲哚美辛(10 mg/kg，n=9)。
[結果]
實驗顯示包含非催化活性的BoNT/X L鏈及轉移域(BoNT/X LH
N)以及BoNT/B受體結合域BoNT/X (H
C域)的非催化活性的嵌合BoNT (BoNT/XB(0))於治療發炎性疼痛為有效的。更詳言之，圖8顯示在以30 ng/kg的劑量投予催化活性的BoNT/XB及非催化活性的BoNT/XB(0)的小鼠中，CFA誘導的發炎性疼痛後的機械敏感性降低。敏感性的降低與BoNT/A或陽性對照(吲哚美辛)的降低等值。
令人驚訝的發現BoNT/XB(0)減輕發炎性疼痛，表示其發現在治療潛在的發炎性病況(例如包括治療發炎性病況的至少一種症狀，即相關的疼痛)中具有效用。如此，認為進一步證明非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素用於治療發炎性病況的可信度。
實施例 7 使用非催化活性的嵌合 BoNT 之異位性皮膚炎的治療暴露於卡泊三醇(Calcipotriol)前一日，皮下投予媒液或BoNT/XB(0) (40 pg/小鼠、100 pg/小鼠或400 pg/小鼠)於成年C57/BL6小鼠的背部中間部分。然後連續5日以卡泊三醇治療小鼠。研究結束時，使動物安樂死，收集背部皮膚，固定並處理以進行組織學分析。蘇木精及伊紅染色後，評估表皮厚度。進行免疫標識以證明CD45+細胞。
實驗顯示包含非催化活性的BoNT/X L鏈及轉移域(BoNT/X LH
N)以及BoNT/B受體結合域BoNT/X (H
C域)的非催化活性的嵌合BoNT (BoNT/XB(0))於治療異位性皮膚炎(一典型的發炎性病況)為有效的。結果顯示，投予BoNT/XB(0)後，皮膚厚度有改善。皮膚厚度為纖維化(對卡泊三醇的發炎反應)的指標，且在經BoNT/XB(0)處理的動物中顯示出統計學上顯著的降低。此外，藉由經BoNT/XB(0)處理的動物中CD45陽性細胞(CD45在發炎細胞中轉導活化信號)數量的減少證實BoNT/XB(0)的抗發炎作用。
如此，可推論BoNT/XB(0)具有抗發炎特性，因此發現於治療發炎性失調的效用。
於上述說明書中提及的所有出版物均藉由引用併入本文。在不脫離本發明的範疇及精神的情況下，本發明所描述的方法及系統之各種修飾及變化對於所屬技術領域中具有通常知識者將係顯而易見的。儘管已結合特定較佳具體實施例對本發明進行描述，但應當理解，所請發明不應過度限於此類特定具體實施例。實際上，對於生物化學及生物技術或相關技術領域中具有通常知識者而言顯而易見的是，所述用於實施本發明之模式的各種修飾皆在以下申請專利範圍的範疇內。
無
無。
Claims (69)
- 一種於治療疼痛中使用的多肽，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
- 一種治療疼痛之方法，該方法包含對於對象投予多肽，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
- 一種多肽於製造用於治療疼痛的醫藥中之用途，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
- 如請求項1之使用的多肽、如請求項2之方法或如請求項3之用途，其中該多肽不藉由下列任一者來治療疼痛：藉由促進神經元生長、藉由促進神經元修復、或藉由促進神經元生長及修復。
- 一種於治療發炎性失調中使用的多肽，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
- 一種治療發炎性失調之方法，該方法包含對於對象投予多肽，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
- 一種多肽於製造用於治療發炎性失調的醫藥中之用途，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C域)，其中當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
- 如請求項5之使用的多肽、如請求項6之方法或如請求項7之用途，其中該多肽不藉由下列任一者來治療發炎性病況：藉由促進神經元生長、藉由促進神經元修復、或藉由促進神經元生長及修復。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽不包含另外的催化活性域。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽除了梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈、H N域及/或H C域之外，不包含治療或診斷劑(例如，共價或非共價聯結的治療或診斷劑)。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽不與另外的治療或診斷劑一起投予(例如，依序地或後續地)。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含非催化活性的梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈、H N域及H C域，其中該L鏈為非催化活性的。
- 如請求項1至12中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽基本上由梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C域)所組成，其中當該多肽包含或基本上由梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈所組成時，該L鏈為非催化活性的。
- 如請求項1至12或14中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽基本上由梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)及梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)所組成，其中該L鏈為非催化活性的。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽基本上由梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)及梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C域)所組成，其中該L鏈為非催化活性的。
- 如請求項1至12或14中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽由梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)及/或梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C域)所組成，其中當該多肽包含或由梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈所組成時，該L鏈為非催化活性的。
- 如請求項1至12、15或17中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽由梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)及梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)所組成，其中該L鏈為非催化活性的。
- 如請求項1至13、14、16或17中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽由梭狀芽孢桿菌神經毒素輕鏈(L鏈)、梭狀芽孢桿菌神經毒素轉移域(H N域)及梭狀芽孢桿菌神經毒素受體結合域(H C域)所組成，其中該L鏈為非催化活性的。
- 如請求項1至12、14、15、17或18中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽不包含梭狀芽孢桿菌神經毒素H N域及H C域兩者。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽不進一步包含非梭狀芽孢桿菌催化域。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為慢性疼痛。
- 如請求項1至21中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為急性疼痛。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為發炎性疼痛。
- 如請求項24之使用的多肽、方法或用途，其中該發炎性疼痛係由下列所引起或與其有關：曬傷、UV誘導的損傷、關節炎性失調、自體免疫疾病、結締組織失調、創傷、感染、神經炎、關節發炎或頭痛(較佳為肌肉/肌原性頭痛、血管性頭痛、高血壓頭痛、荷爾蒙頭痛、反彈性頭痛、慢性鼻竇炎頭痛、器質性頭痛(organic headache)、或癲癇發作性頭痛(ictal headache))。
- 如請求項1至23中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中疼痛為神經病變性疼痛。
- 如請求項26之使用的多肽、方法或用途，其中該神經病變性疼痛為(或由其引起或與其有關)神經痛、傳入神經阻滯(deafferentation)、複雜性局部疼痛症候群(complex regional pain syndrome (CRPS))、或神經病變(例如，中樞或周圍神經病變)。
- 如請求項1至23中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為混合性疼痛。
- 如請求項1至23中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為觸摸痛(allodynia)。
- 如請求項1至23中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為內臟痛。
- 如請求項30之使用的多肽、方法或用途，其中該內臟痛為(或由其引起或與其有關)功能性內臟痛、慢性腸胃道發炎、自體免疫疼痛、器質性內臟痛、或治療誘導的內臟痛。
- 如請求項1至23中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為頭痛(例如，偏頭痛)。
- 如請求項32之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為偏頭痛。
- 如請求項32之使用的多肽、方法或用途，其中該頭痛係由下列所引起或與其有關：肌肉/肌原性頭痛、血管性頭痛、高血壓頭痛、荷爾蒙頭痛、反彈性頭痛、慢性鼻竇炎頭痛、器質性頭痛、或癲癇發作性頭痛。
- 如請求項1至23中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為術後疼痛。
- 如請求項1至23中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為轉移痛(referred pain)。
- 如請求項1至23中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為體感性疼痛(somatic pain)。
- 如請求項37之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為由下列所引起或與其有關的體感性疼痛：過度肌張力、重覆性動作失調(repetitive motion disorder)、肌肉失調、肌痛(myalgia)、感染、或藥物。
- 如請求項1至23中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為膀胱疼痛症候群，較佳為其中該膀胱疼痛係由間質性膀胱炎所引起或與其有關。
- 如請求項1至23中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為幻肢痛(phantom limb pain)。
- 如請求項5至21中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該發炎性失調為選自下列之一或多種：膀胱炎、子宮內膜異位、類風濕性關節炎、複雜性局部疼痛症候群、及神經炎。
- 如請求項41之使用的多肽、方法或用途，其中該膀胱炎為間質性膀胱炎。
- 如請求項41之使用的多肽、方法或用途，其中神經炎為周圍神經炎。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中所投予的多肽的單一劑量為大於250 µg。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中所投予的多肽的單一劑量為251 µg至10 g。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中所投予的多肽的單一劑量為251 µg至1 g。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中所投予的多肽的單一劑量為251-1000 µg。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽被反覆地投予(例如，作為疼痛治療方案之一部分)。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽係被皮內投予。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少70%序列同一性之多肽序列：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、74、75或76；其但書為當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少80%序列同一性之多肽序列：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、74、75或76；其但書為當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含與下列SEQ ID NO之任一者具有至少90%序列同一性之多肽序列：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、74、75或76；其但書為當該多肽包含梭狀芽孢桿菌神經毒素L鏈時，該L鏈為非催化活性的。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含下列SEQ ID NO之任一者之多肽序列：2、8、10、12、14、16、18、22、26、30、34、38、42、44、46、48、50、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、74、75或76。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為非催化活性的BoNT/A。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為由修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素，如嵌合梭狀芽孢桿菌神經毒素或雜合(hybrid)梭狀芽孢桿菌神經毒素，較佳為其中該多肽不包含天然的梭狀芽孢桿菌神經毒素H鏈。
- 如請求項1至53或55中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之功能性H CC域或H C域。
- 如請求項1至53或55至56中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為包含非梭狀芽孢桿菌靶向部分(Targeting Moiety (TM))之重定靶向的(retargeted)梭狀芽孢桿菌神經毒素。
- 如請求項1至53或55至56中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽缺少梭狀芽孢桿菌神經毒素之功能性H C域且亦缺少任何功能上等效的外源性配體靶向部分(TM)。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽未於該對象的細胞中表現，例如，其中該用途或方法不包含於對象的細胞中表現編碼該多肽的核酸。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽進一步包含一或多個非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列。
- 如請求項60之使用的多肽、方法或用途，其中該一或多個非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列不與細胞受體結合。
- 如請求項60或61之使用的多肽、方法或用途，其中該一或多個非梭狀芽孢桿菌神經毒素序列不包含細胞受體的配體。
- 如請求項1至53、55或59至62中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為包含非催化活性的BoNT/A輕鏈及轉移域、及BoNT/B受體結合域(H C域)之嵌合肉毒桿菌神經毒素(BoNT)。
- 如請求項1至55或59至62中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含經修飾的BoNT/A H C域，其包含於選自下列之一或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277；其中該修飾係選自： i. 以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； ii. 以不帶電的胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基； iii. 以鹼性胺基酸殘基取代不帶電的表面暴露的胺基酸殘基； iv. 鹼性胺基酸殘基之插入；及 v. 酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。
- 如請求項1至53或55至62中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含非催化活性的肉毒桿菌神經毒素血清型X(BoNT/X) L鏈、BoNT/X H N域、及/或BoNT/X H C域。
- 如請求項1至53、59至62或65中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域、及源自不同(即，非BoNT/X)梭狀芽孢桿菌神經毒素的受體結合域(H C域)之嵌合肉毒桿菌神經毒素(BoNT)。
- 如請求項1至53、59至62或65至66中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽為包含非催化活性的BoNT/X輕鏈及轉移域、及BoNT/B受體結合域(H C域)之嵌合肉毒桿菌神經毒素(BoNT)。
- 如請求項65至67中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該疼痛為發炎性疼痛。
- 如前述請求項中任一項之使用的多肽、方法或用途，其中該多肽包含Cys-(Xaa) a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa) b-Cys (SEQ ID NO：71)，其中a=1-10且b=4-15。
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