ES2094722T5 - Plantas resistentes a los insectos. - Google Patents
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Abstract
METODO PARA PRODUCIR PLANTAS GENETICAMENTE TRANSFORMADAS QUE MUESTRAN TOXICIDAD FRENTE A INSECTOS COLEOPTEROS. EN OTRO ASPECTO LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A GENES VEGETALES QUIMERICOS, CELULAS TRANSFORMADAS GENETICAMENTE Y PLANTAS DIFERENCIADAS QUE MUESTRAN TOXICIDAD FRENTE A INSECTOS COLEOPTEROS. TAMBIEN INCLUYE LA PRESENTE INVENCION CELULAS BACTERIANAS Y VECTORES DE TRANSFORMACION DE PLANTAS QUE COMPRENDEN UN GEN VEGETAL QUMERICO QUE CODIFICA UNA PROTEINA TOXICA PARA LOS COLEOPTEROS DE BACILLUS THURINGIENSIS.
Description
Plantas resistentes a los insectos.
La presente invención se refiere a los campos de
la ingeniería genética, la bioquímica y la transformación de
plantas.
El Bacillus thuringiensis (B.t.) es una
bacteria del suelo formadora de esporas que es conocida por su
capacidad de producir una proteína cristalina paraesporal que es
tóxica hacia una amplia diversidad de insectos. La mayoría de las
cepas son activas frente a insectos lepidópteros (polillas y
mariposas) y unas pocas se ha descrito que tienen actividad frente a
insectos dípteros (mosquitos y moscas, véase Aronson et al. 1986).
Los genes de las toxinas de una diversidad de estas cepas han sido
clonados y las toxinas han sido expresadas en hospedantes
heterólogos (Schnepf et al., 1981; Klier et al., 1982). En los
últimos años, se han identificado cepas (B.t. var.
tenebrionis (B.t.t., Krieg et al., 1983; Krieg et al.,
1984) y B.t. var. san diego (B.t.sd., Herrnstadt et al., 1986) que
tienen actividad frente a insectos coleópteros. En el documento
EP-A-0213818 (Mycogen) ha sido
clonado el gen de la toxina de B.t.sd., pero la toxina
producida en E. Coli se describió por Herrnstadt et al.,
1986, que tenía un tamaño mayor que la toxina de los cristales de
B.t.sd., y la actividad de esta toxina de B.t.sd.
recombinante se suponía que era débil.
Los insectos susceptibles a la acción de la
toxina proteica de las bacterias Bacillus thuringiensis de
tipo coleóptero incluyen, pero sin estar limitados a ellos, el
escarabajo de la patata del Colorado (Leptinotarsa
decemlineata), gorgojo de cápsulas (Anthonomus grandis),
gusano amarillo de la harina (Tenebrio molitor), escarabajo
de la hoja de olmo (Pyrrhalta luteola) y gusano de raíz de
maíz del Sur (Diabrotica undecimpunctata howardi).
Por lo tanto, se previó la capacidad potencial de
que las plantas tratadas por ingeniería genética exhibieran
toxicidad o tolerancia hacia insectos coleópteros si tales plantas
pudieran ser transformadas para expresar una toxina de tipo
coleóptero a un nivel eficaz como insecticida. Cultivos
agronómicamente importantes que están afectados por insectos
coleópteros incluyen alfalfa, algodón, maíz, patata, colza (canola),
maíz, tabaco, tomate, remolacha azucarera y girasol.
Aunque ciertos genes quiméricos han sido
expresados en células transformadas de plantas transformadas y
plantas, tal expresión no es en modo alguna sencilla.
Específicamente, la expresión de proteínas de toxina de B.t.
de tipo lepidóptero ha sido particularmente problemática. Se ha
encontrado ahora que las explicaciones de la técnica con respecto a
la expresión de una proteína de toxina de B.t. de tipo
lepidóptero en plantas no se extiende a una proteína de toxina de
B.t. de tipo coleóptero. Estos descubrimientos son
directamente contrarios a las explicaciones anteriores, que sugerían
que se emplearían las mismas manipulaciones genéticas para obtener
una expresión útil de tales toxinas en plantas transformadas.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se ha proporcionado un procedimiento para producir
plantas genéticamente transformadas que exhiben toxicidad hacia
insectos coleópteros, que comprende las etapas de:
- (a)
- insertar en el genoma de una célula de una planta susceptible al ataque por insectos coleópteros, un gen quimérico que comprende:
- i)
- un promotor que actúa en las células de la planta para provocar la producción de RNA;
- ii)
- una secuencia de DNA que codifica una proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644), (48-644), (50-644), (58-644) o (77-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- iii)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de la planta para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia de RNA;
- (b)
- obtener células transformadas de la planta, y
- (c)
- regenerar a partir de las células transformadas de la planta, plantas genéticamente transformadas que exhiben resistencia a insectos coleópteros, en el que la planta se selecciona entre el grupo formado por tomate, patata y algodón.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se ha proporcionado un gen quimérico de plantas que
comprende, en secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las células de la planta para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica una proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644), (48-644), (50-644), (58-644) o (77-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (c)
- una región no traducida en 3' que actúa en las células de la planta para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA.
Se han proporcionado también, de acuerdo con otro
aspecto de la presente invención, células bacterianas, células
transformadas de plantas y vectores de transformación de plantas que
contienen, respectivamente, DNA comprendido por los elementos
anteriormente mencionados (a), (b) y (c), en el que las células de
la planta no son células de una planta monocotiledonea.
Todavía, de acuerdo con otro aspecto de la
presente invención, se ha proporcionado una planta diferenciada que
comprende células transformadas de planta, como se describe con
anterioridad, que exhibe toxicidad hacia insectos coleópteros y en
el que la planta se selecciona entre el grupo formado por tomate,
patata y algodón. La presente invención contempla también semillas
que producen las plantas transformadas descritas con anterioridad
seleccionadas entre el grupo formado por tomate, patata y
algodón.
La Figura 1 muestra las sondas de DNA usadas para
el aislamiento del gen de toxina de B.t.t.
La Figura 2 muestra las etapas empleadas en la
preparación de plásmido pMON5432.
La Figura 3 muestra una orientación de la
fracción HindIII de 3,0 kb que codifica el gen de la toxina en
pMON5420 y pMON5421 con respecto al multienlazante de pUC119.
La Figura 4 muestra la estrategia utilizada para
la secuenciación del gen de toxina de B.t.t. contenido en
pMON5420 y pMON5421.
La Figura 5 muestra la secuencia de DNA y los
sitios de colocación y restricción para el ORF de 1932 bp del gen de
B.t.t. que codifica la proteína de toxina del aminoácido
644.
La Figura 6 muestra las bandas observadas para la
toxina de B.t.t. siguiendo un análisis
SDS-PAGE.
La Figura 7 muestra los N terminales de proteínas
expresadas a partir del gen de toxina de B.t.t. o producidas
por vía proteolítica in vivo en B.t.t.
La Figura 8 representa los genes de B.t.t.
alterados usados para analizar el carácter crítico de la parte de
los C terminales de la toxina.
La Figura 9 representa los genes de B.t.t.
alterados usados para analizar el carácter crítico de la parte de
los N terminales de la toxina.
La Figura 10 muestra las deleciones producidas en
la evaluación de los mutantes de proteínas de toxinas de
B.t.t.
La Figura 11 muestra las etapas empleadas en la
preparación de los plásmidos pMON9758, pMON9754 y
pMON9753.
pMON9753.
La Figura 12 muestra las etapas empleadas en la
preparación de plásmido pMON9791.
La Figura 13 muestra las etapas empleadas en la
preparación de plásmido pMON9792.
La Figura 14 muestra un mapa de plásmido para un
vector cassette de transformación de la planta pMON893.
La Figura 15 muestra las etapas empleadas en la
preparación de plásmido pMON9741.
La Figura 16 muestra las etapas empleadas en la
preparación de plásmido pMON5436.
La Figura 17 ilustra los elementos que comprenden
la región T-DNA de Agrobacterium ACO
desarmado.
La Figura 18 muestra la secuencia de DNA para el
promotor CaMV35S intensificado.
La presente invención proporciona un
procedimiento para transformar plantas de tomate, patata y algodón
para exhibir toxicidad hacia insectos coleópteros susceptibles. Más
particularmente, la presente invención proporciona plantas
transgénicas que expresan la proteína de toxina de tipo coleóptero
de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tienen la
secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644),
(48-644), (50-644) o
(77-644) de dicha proteína en la que los residuos de
aminoácidos están numerados como se muestra en la Figura 10, a un
nivel insecticida, en el que las plantas se seleccionan del grupo
formado por tomate, patata y algodón.
\newpage
En un aspecto, la presente invención comprende
genes quiméricos que actúan en plantas y producen plantas
transgénicas que exhiben toxicidad hacia insectos coleópteros
susceptibles. La expresión de un gen de planta que existe en forma
de DNA de doble hebra incluye la transcripción de una hebra del DNA
mediante RNA polimerasa para producir RNA mensajero (mRNA), y el
tratamiento del mRNA primario transcrito dentro del núcleo. Este
tratamiento incluye una región no traducida en 3' que añade
poliadenilato nucleótidos al extremo 3' del mRNA.
La transcripción de DNA para producir mRNA está
regulada por una región de DNA habitualmente denominada el
"promotor". La región promotora contiene una secuencia de
nucleótidos que señala RNA polimerasa para asociar con el DNA, e
iniciar la producción de un mRNA transcrito usando la hebra de DNA
situada detrás del promotor como un molde para preparar una hebra
correspondiente de RNA.
En la bibliografía ha sido descrito un cierto
número de promotores que son activos en células de plantas. Estos
incluyen los promotores nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa
(OCS) y manopina sintasa (MAS) que son portados en plásmidos
inductores de tumores de Agrobacterium tumefaciens, los
promotores 19S y 35S del virus mosaico de la coliflor (CaMV), y el
promotor inducible por la luz de la subunidad pequeña de ribulosa
bis-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido
vegetal muy abundante). Estos tipos de promotores han sido usados
para crear diversos tipos de construcciones de DNA que han sido
expresadas en plantas; véase, por ejemplo, la publicación del
documento PCT WO 84/02913 (Rogers et al., Monsanto).
Promotores que son conocidos o que se encuentra
que provocan la producción de un mRNA transcrito en células de
plantas pueden ser usados en la presente invención. Promotores
adecuados pueden incluir tanto los que son derivados de un gen que
es expresado de forma natural en plantas como secuencias de
promotores sintéticos que pueden incluir secuencias intensificadoras
redundantes o heterólogas. El promotor seleccionado debe ser capaz
de provocar una suficiente expresión que de lugar a la producción de
una cantidad eficaz de proteína de toxina que haga la planta tóxica
hacia insectos coleópteros. Los expertos en la técnica reconocen que
la cantidad de proteína de toxina necesaria para inducir la
toxicidad deseada puede variar con los insectos coleópteros
particulares frente a los que se quiere proteger. Consecuentemente,
aunque se prefieren los promotores CaMV35S, ssRUBISCO y MAS, debe
entenderse que estos promotores pueden no ser promotores óptimos
para todas las realizaciones de la presente invención.
El mRNA producido por el gen quimérico contiene
también una secuencia líder no traducida en 5'. Esta secuencia puede
ser derivada del promotor particular seleccionado tal como los
promotores CaMV35S, ssRUBISCO o MAS. La región no traducida en 5'
puede ser obtenida también a partir de otros genes eucarióticos
adecuados o de una secuencia de genes sintéticos. Los expertos en la
técnica reconocen que la funcionalidad necesaria de la secuencia
líder no traducida en 5' es la intensificación de la unión del mRNA
transcrito a los ribosomas de la célula de la planta para
intensificar la traducción del mRNA en la producción de la proteína
codificada.
El gen quimérico contiene también una secuencia
codificadora estructural que codifica los fragmentos que tienen la
secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644),
(48-644), (50-644) o
(77-644) de la proteína de toxina de tipo coleóptero
de Bacillus thuringiensis, B.t. Tenebrionis o B.t. san
diego, en el que los residuos de aminoaácido de dicha proteína están
numerados como se muestra en la figura 10.
La región no traducida en 3' contiene una señal
de poliadenilación que actúa en las plantas para provocar la adición
de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' del RNA: Ejemplos de
regiones de 3' adecuadas son (1) las regiones transcritas en 3', no
traducidas, que contienen la señal de poliadenilato de los genes de
los plásmidos inductores de tumores (T_{i}) de
Agrobacterium, tal como el gen nopalina sintasa (NOS), y (2)
genes de plantas como los genes de proteínas de almacenamiento de
soja y el ssRUBISCO. Un ejemplo de las regiones 3' preferidas son la
de los genes NOS, ssRUBISCO y de proteínas de almacenamiento,
descritos más en detalle en los Ejemplos con posterioridad.
Los genes de proteínas de toxinas de tipo
coleóptero anteriores se insertan en el genoma de la planta de
tomate, patata o algodón mediante cualquier procedimiento adecuado.
Vectores adecuados de transformación de plantas incluyen los
derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens tal
como los descritos, por ejemplo, en la publicación del documento EPO
131.620 (Rogers et al.), Herrera-Estrella 1983,
Bevan 1983, Klee 1985 y publicación del documento EPO 120.516
(Schilperoort et al.). Además de los vectores de transformación de
plantas derivados de los plásmidos Ti o inductores de raíces (Ri) de
Agrobacterium, se pueden usar procedimientos alternativos
para insertar los genes de proteínas de toxinas de tipo coleóptero
de esta invención en células de plantas. Tales procedimientos pueden
incluir, por ejemplo, liposomas, electroporación, productos químicos
que aumentan la absorción de DNA libre, y el uso de virus o polen
como vectores. Si se desea, se puede insertar más de un gen en los
cromosomas de una planta, mediante procedimientos tales como repetir
el ciclo de transformación y selección más de una vez.
El material de plantas así modificado puede ser
ensayado, por ejemplo, mediante transferencia Northern en cuanto a
la presencia de mRNA de proteína de toxina de tipo coleóptero. Si no
se detecta mRNA de proteína de toxina (o un título demasiado bajo),
el promotor usado en la construcción de genes quiméricos es
sustituido con otro promotor potencialmente más fuerte, y la
construcción alterada se vuelve a ensayar. Alternativamente, se
puede ensayar el nivel de proteína de toxina mediante un
inmunoensayo tal como la transferencia Western. En muchos casos el
ensayo más sensible para la proteína de toxina es un bioensayo de
insectos.
Esta verificación se puede efectuar en plantas
regeneradas completas. En cualquier caso, cuando se consigue una
producción adecuada de mRNA de proteína de toxina, y las células
transformadas (o protoplastos) han sido regeneradas en plantas
completas, estas últimas son rastreadas en cuanto a la resistencia
al ataque por insectos coleópteros. La elección de una metodología
para la etapa de regeneración no es crítica, estando disponibles
protocolos adecuados para hospedantes de Leguminosae
(alfalfa, soja, trébol, etc.) Umbelliferae (zanahoria, apio,
chirivía), Cruciferae (repollo, rábano, semilla de colza,
etc.), Cucurbitaceae (melones y pepinos), Graminae
(trigo, arroz, maíz, etc.), Solanaceae (patata, tabaco,
tomate, pimientos), Malvaceae (algodón, etc.),
Chenopodiaceae (remolacha azucarera, etc.) y diversos
cultivos de flores. Véase, por ejemplo, Ammirato et al. (1984).
Todas las estructuras de proteínas representadas
en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones son mostradas
en un formato convencional en el que el grupo amino en el N terminal
aparece a la izquierda, y el grupo carboxilo en el C terminal a la
derecha. Análogamente, la nomenclatura de aminoácidos para los
aminoácidos que se producen de forma natural encontrados en la
proteína es como sigue: alanina (ala;A), asparagina (Asn;N), ácido
aspártico (Asp;D), Arginina (Arg;R), cisteína (Cys;C), ácido
glutámico (Glu;E), glutamina (Gln;Q), glicina (Gly;G), histidina
(His;H), isoleucina (Ile;I), Leucina (Leu;L), lisina (Lys;K),
metionina (Met;M), fenilalanina (Phe;F), prolina (Pro;P), serina
(Ser;S), treonina (Thr;T), triptófano (Trp;W), tirosina (Tyr;Y) y
valina (Val;V).
El gen de B.t.t. que codifica la proteína
de toxina de tipo coleóptero se aisló como se describe a
continuación.
El B.t. tenebriones se cultivó en medio de
caldo de soja de tripticasa (TSB) para el aislamiento de cristales
de proteínas. Al intentar aislar cristales intactos de B.t.t.
se apreció una diferencia significativa entre estos cristales y los
del tipo lepidóptero. Aunque los cristales de tipo lepidóptero se
aislaron rutinariamente en gradientes formados a partir de
Renografin. Hipaque o NaBr, se encontró que los cristales de
B.t.t. se disolvían en estos medios gradientes. Se encontró
que los cristales de B.t.t. eran estables en gradientes de
sacarosa, y se usaron gradientes de sacarosa para el aislamiento de
cristales de B.t.t.
Se analizaron cristales purificados en cuanto a
su composición de proteínas mediante electroforesis de gel de
poliacrilamida SDS. Los resultados de estos experimentos indicaron
que los cristales de B.t.t. contenían al menos dos
componentes proteicos con pesos moleculares de aproximadamente 68 a
70 kilodaltones (kDa) y aproximadamente 60 kDa, respectivamente. Las
cantidades relativas de los componentes eran variables de una
preparación a otra. Además, se sugirió que el componente de peso
molecular más elevado podría consistir en más de una única proteína.
Bernhard (1986) describió proteínas de aproximadamente 68 kDa y 50
kDa como componentes de cristales de B.t.t.. Hernstadt et al.
(1986) describieron que los cristales de B.t.san diego
estaban compuestos por una proteína de aproximadamente 64 kDa. Por
el contrario, las cepas B.t. de tipo lepidóptero tal como
B.t. kurstaki contienen típicamente una proteína de peso
molecular más elevado de 130 kDa a 140 kDa. Este resultado indica
una diferencia significativa en la estructura de las proteínas de
toxinas de lepidópteros y coleópteros.
Se adoptaron diversas aproximaciones para
purificar los componentes proteicos individuales del cristal. Un
enfoque isoeléctrico no fue satisfactorio porque todas las proteínas
precipitaron. Un cromatógrafo líquido a presión elevada de
intercambio aniónico (HPLC) en una columna Mono Q no consiguió
resolver los componentes. Una HPLC de intercambio catiónico en una
columna Mono S en presencia de urea 4 M resolvió cinco picos. Un
análisis de los picos mediante electroforesis de gel SDS indicó que
el pico A contenía solamente la banda de peso molecular superior de
los cristales completos. El pico B era rico en esta banda superior,
con pequeñas cantidades de la banda inferior. El pico C era rico en
la banda inferior, con cantidades significativas de la banda
superior. Los picos D y E eran mezclas de las dos bandas. En la
mayoría de las preparaciones, la banda de peso molecular superior,
correspondiente a los picos A y B, era la proteína predominante en
los cristales. Para el material separado por HPLC, los picos A y B
representaron la mayoría de la proteína recuperada.
Se determinaron las secuencias de aminoácidos
N-terminales correspondientes a los picos A, B y C.
Los picos A y B se encontró que tenían la misma secuencia
N-terminal, mientras que la secuencia del pico C era
diferente. Las secuencias determinadas fueron:
X representa un aminoácido sin determinar.
Varias preparaciones de B.t.t. y proteínas
de B.t.t. se ensayaron en cuanto a la toxicidad hacia
diversos insectos, incluidos tanto lepidópteros como coleópteros. No
se observó actividad hacia lepidópteros (gusano de la mazorca de
maíz, oruga nocturna negra, larva de esfíngido del tabaco y oruga
medidora de la col). Entre los coleópteros, se observó actividad
frente al escarabajo de la patata del Colorado (Leptinotarsa
decemlineata) y el gorgojo del algodón (Anthonomus
grandis). Se exhibió un nivel inferior de actividad frente al
gusano de la raíz de maíz del Sur (Diabrotica undecimpunctata
howardi). Se encontró una actividad insecticida en cultivos
bacterianos en bruto, cristales purificados, cristales solubilizados
y los picos aislados C, D, E (reunidos), A y B.
Se llevaron a cabo ensayos en cuanto a la
toxicidad hacia el escarabajo de la patata del Colorado aplicando la
preparación que iba a ser ensayada a hojas de tomate, y permitiendo
que los insectos se alimentaran en las hojas tratadas durante cuatro
días. Los ensayos con el gorgojo del algodón y el gusano de la raíz
de maíz del Sur se realizaron incorporando el material de ensayo en
una mezcla de dieta apropiada.
Usando esta información de la secuencia de
proteínas N-terminales, se diseñaron sondas de DNA
(Figura 1) que se usaron en el aislamiento de clones que contenían
el gen de toxina de B.t.t.. Las sondas se marcaron
terminalmente con [\gamma-P^{32}] ATP según
Maniatis (1982). Se cultivó B.thuringiensis var. tenebriones
durante 6 horas a 37ºC en medio Spizizen (Spizizen, 1958)
complementado con extracto de levadura al 0,1% y glucosa al 0,1%
(SPY) para el aislamiento de DNA total. El DNA total se aisló a
partir de B.t.t. mediante el procedimiento de Kronstad
(1983). Las células se cultivaron en placas de agar Luria para el
aislamiento de cristales de B.t.t. usados en los estudios de
toxicidad.
Se cultivaron rutinariamente cultivos de E.
Coli y Pseudomonas en caldo Luria (LB) con ampicilina
(Ap, 200 \mug/ml), kanamicina (Km, 50 \mug/ml), o gentamicina
(Gm, 15 \mug/ml) añadidos para la selección y el mantenimiento de
los plásmidos.
Se extrajo DNA de plásmidos de células de E.
Coli y Pseudomonas mediante el procedimiento de Birnboim
y Doly (1979) y se purificaron grandes cantidades usando resina
NACS-52 (Bethesda Research Laboratories) según las
instrucciones del fabricante. Se usaron endonucleasas de
restricción, fosfatasa alcalina de ternera y ligasa de DNA T4 según
las instrucciones del fabricante (New England Biolabs). Los
productos de digestión de restricción se analizaron en geles de
agarosa al 0,8% tratados por electroforesis en tampón
Tris-acetato. Los fragmentos de DNA para la
clonación se purificaron en agarosa usando el procedimiento de
congelación-descongelación. La construcción de
moléculas de DNA recombinante fue según Maniatis et al. (1982). La
transformación en E. Coli se realizó según Maniatis
(1982).
Se realizó un análisis Southern (Southern, 1975)
usando el procedimiento del gel seco modificado (Conner et al.,
(1983). La hibridación del filtro de colonias, para la detección de
clones de toxinas de B.t.t., usó el procedimiento de cloruro
de tetrametilamonio (Wood et al., 1985).
Un análisis Southern de DNA total de
B.t.t. digerido con BamHI y HindIII identificó un fragmento
BamHI de 5,8 kb y uno HindIII de 3,0 kb que se hibridizaron a la
sonda A1 sintética. Los fragmentos BamHI de DNA de B.t.t.
(5,4-6,5 kb) fueron purificados en geles de agarosa
y se ligaron al pUC119 digerido con BamHI tratado con fosfatasa
alcalina. El pUC119 se prepara aislando el fragmento HgiAI/DraI de
476 bp de bacteriofago M13 y rematando los extremos del fragmento
con polimerasa de DNA T4 (New England Biolabs). Este fragmento se
inserta seguidamente en pUC19 que ha sido digerido con NdeI y se
rellena con polimerasa de DNA Klenow (New England Biolabs). La
B.t.t. ligada y el DNA de pUC119 se usaron seguidamente para
transformar células JM101 de E. Coli. Después de varios
intentos, solamente se obtuvieron 150 colonias resistentes a Ap. Los
fragmentos HindIII de DNA de B.t.t. (2,8-3,5
kb) se clonaron también en el sitio HindIII de pUC119, y se
obtuvieron 1100 colonias. Todas las colonias fueron rastreadas
mediante hibridación de colonias a la sonda A1 (Figura 1). Once
clones HindIII mostraron una hibridación fuerte, pero ninguna de las
colonias BamHI mostraron hibridación alguna. Las colonias
identificadas por hibridación a A1 fueron seguidamente rastreadas
usando sonda sintética A2 (Figura 1) y dos colonias mostraron
hibridación a la segunda sonda. Los modelos de digestión con
restricción de las dos colonias sindicaron que el mismo fragmento
HindIII de 3,0 kb estaba contenido en las dos orientaciones, aunque
opuestas. Estos clones fueron denominados pMON5420 y pMON5421
(Figura 3). Para confirmar que los clones contenían el gen para la
proteína de toxina de B.t.t., el DNA de una hebra de ambos
clones fue secuenciado usando sondas degeneradas A1 y A2 como
cebadores para una secuenciación di-desoxi (Sanger,
1977). Un análisis de las secuencias con sonda A1 como cebador
reveló un marco de lectura abierto (ORF) cuya secuencia era idéntica
a los aminoácidos 9 a 15 de la secuencia de aminoácidos determinada
para los picos purificados A y B de la proteína de toxina de
B.t.t. La sonda A2 produjo una secuencia de DNA que comenzaba
más allá del extremo de la secuencia de aminoácidos determinada,
pero esta secuencia de DNA era idéntica a la secuencia producida con
A1. Estos resultados confirman que se clonó el gen de toxina de
B.t.t. deseado.
Una hibridación Southern del DNA total de
B.t.t., usando sondas degeneradas basadas en el
N-terminal del pico C, no consiguió detectar bandas
específicas que sugirieran que la secuencia de aminoácidos
determinada para el pico C fuera incorrecta o, lo más probablemente,
se obtuviera a partir de una mezcla de dos o más proteínas que
comprendían el pico C.
Las proteínas de cristales de B.t.t. y las
proteínas de B.t.t. recombinantes se examinaron mediante
SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Un ml de E. Coli
fue centrifugado, los sedimentos se volvieron a poner en suspensión
en 100 \mug de tampón SDS-muestra y muestras de 10
\mul fueron tratadas por electroforesis en geles de poliacrilamida
al 7,5%. Los geles fueron teñidos con azul de Coomassie o ensayados
en cuanto a su reactividad cruzada respecto a anticuerpos surgidos
frente a cristales purificados de toxina de B.t.t. Se
realizaron transferencias Western usando el procedimiento de
anticuerpos conjugados de peroxidasa de rábano picante (Towbin et
al., 1974). Se adquirieron marcadores de peso molecular elevado de
la empresa BioRad.
Se obtuvo una confirmación adicional de que los
clones produjeron toxina de B.t.t. mediante un análisis de
transferencia Western de las proteínas producidas en E. Coli.
Células de E. Coli JM101 que contenían pUC119, pMON5420 o
pMON5421 fueron cultivadas durante una noche en presencia de IPTG
(0,1 mM) para inducir el promotor 1ac. Se analizaron muestras
duplicadas mediante SDS-PAGE junto con proteínas de
cristal de B.t.t. purificadas incluidas como testigos. Un
análisis de transferencia Western de un gel reveló la producción de
2 proteínas de reacción cruzada mediante E. Coli que contenía
pMON5420 o pMON5421. Estas proteínas eran idénticas en tamaño a las
proteínas mayor y menor del cristal de B.t.t. Los pesos
moleculares de las proteínas fueron determinados mediante una
comparación con los patrones de pesos moleculares en el segundo gel
teñido con azul de Coomassie. La proteína de la toxina principal se
determinó que era de 74 kDa de tamaño, y la proteína de la toxina
menor se determinó que era de 68 kDa de tamaño. El nivel de
proteínas de toxinas de B.t.t. producido por pMON5420 se
aumentó mediante la adición de IPTG, mientras que la producción de
proteínas de toxinas mediante pMON5421 no fue afectada.
Se construyó un vector para un amplio espectro de
hospedantes, pMON5432, clonando pMON5420 digerido con BamHI en el
sitio BamHI de pMON7111, como se muestra en la Figura 2. Este vector
fue acoplado seguidamente en P. fluorescens 701E1 para un
análisis de la producción de toxinas. Se hicieron acoplamientos
Tri-parentales en Pseudomonas fluorescens,
como se describió anteriormente (Ditta et al., 1980). Las muestras
de los cultivos de una noche, cultivadas con y sin IPTG, fueron
preparadas para un análisis por transferencia Western y para
estudios de toxicidad hacia insectos. Las proteínas producidas por
Pseudomonas eran idénticas en tamaño a las proteínas
producidas por E. Coli, y la expresión de proteínas fue
aumentada con la adición de IPTG.
Se ensayó la actividad de toxinas hacia
coleópteros usando insectos de escarabajos de la patata del Colorado
(Leptinotarsa decemlineata) en un ensayo de alimentación con
hojas de tomate. Se cultivaron cultivos de E. Coli y
Pseudomonas durante una noche en presencia de IPTG, se
centrifugaron y se volvieron a poner en suspensión a diversas
concentraciones en MgSO_{4} 10 mM. Las células fueron disueltas
mediante sonicación (tres tratamientos pulsados de 15 segundos en
hielo). Se añadió Tween-20 (0,1%) y la muestra se
aplicó como revestimiento sobre una hoja de tomate colocada en una
placa de petri de 9 cm alineada con papel de filtro húmedo. Se
añadieron diez larvas de escarabajo de la patata del Colorado a cada
hoja. Después de cuatro días, se calculó por ordenador el porcentaje
de mortalidad corregida (porcentaje de insectos vivos en el testigo
menos el porcentaje de insectos vivos en la muestra tratada dividido
por el porcentaje vivo en el testigo) usando la fórmula de Abbott
(Abbott, 1925). Los ensayos se realizaron poro duplicado y se
combinaron los datos. Se usó una preparación de cristales/esporas de
B.t.t. como testigos positivos.
Cultivos de E. Coli de pMON5420 y pMON5421
fueron evaluados en cuanto a la toxicidad hacia coleópteros usando
diferentes concentraciones en cultivos cultivados con IPTG añadido.
Una comparación de las actividades de toxina de B.t.t. de
tipo recombinante y salvaje se muestra a continuación en la Tabla I.
Los resultados muestran que la(s) proteína(s) de
B.t.t. recombinante(s) son tóxicas hacia el escarabajo
de la patata del Colorado. El cultivo de pMON5420 inducido por IPTG,
concentrado a 2x, destruyó un 100% de insectos, como lo hizo el
testigo de esporas/cristales de B.t.t. Estos resultados de
toxicidad demuestran que el gen de B.t.t. clonado era el gen
que codificaba la proteína de toxina de B.t.t.
El ensayo de alimentación de insectos demostró
que las toxinas producidas por Pseudomonas eran tóxicas hacia
el escarabajo de la patata del Colorado. La toxicidad relativa de
los cultivos de Pseudomonas era congruente con la cantidad de
proteína de toxina producida según se determinó mediante un análisis
de transferencia Western cuando se comparó con cultivos de E.
Coli.
| Muestra^{1} | Concentración^{2} | Mortalidad corregida |
| E. Coli JM101 | ||
| pUC119 | 2x | 0% |
| pMON5420 | 1x | 83% |
| pMON5420 | 2x | 100% |
| pMON5421 | 1X | 44% |
| pMON5421 | 2X | 61% |
| P. fluorescens 701E1 | ||
| pMON5432 | 3x | 60% |
| Prep. de B.t.t. | 100% |
^{1} Los cultivos se cultivaron
durante una noche con IPTG añadido, se concentraron, se sonicaron y
se ensayaron en cuanto a la toxicidad.
^{2} Concentración
celular igual a 1x de cultivo durante una noche.
La colocación y la orientación del gen de
B.t.t. dentro de fragmento clonado fueron determinadas
basándose en la siguiente información: a) la secuencia de DNA se
obtuvo a partir del molde de pMON5421 de hebra única, b) un sitio
Ost identificado mediante análisis de secuencia de DNA, cerca del
comienzo de la traducción, se colocó en el mapa en pMON5420 y
pMON5421, c) se colocaron en el mapa otros diversos sitios de
restricción, d) se construyó una deleción de un sitio BglII a un
sitio BamHI que suprime 130 bp, y se produjeron las dos proteínas de
longitud completa. Esta información se usó para construir mapas de
pMON5420 y pMON5421. Haciendo referencia a la Figura 4, la región
que codifica la toxina comienza 500 bp a partir del sitio HindIII en
5', y 150 bp aguas arriba del sitio PstI. La región codificadora
termina aproximadamente a 450 bp del sitio HindIII en 3'. El sitio
BglII está aproximadamente 350 bp aguas abajo del codón de
terminación.
Los plásmidos generados para secuenciar el gen de
toxina insecticida de B.t.t. se listan en la Tabla II. Los
plásmidos parentales, pMON5420 y pMON5421, son aislamientos
independientes del fragmento HindIII clonado en pUC119 en
orientación opuesta.
| pMON5420 | Inserto en HindIII de 3,0 de DNA de B.t.t. (plásmido parental) | |
| pMON5421 | Inserto en HindIII de 3,0 de DNA de B.t.t. (plásmido parental) | |
| pMON5307 | Deleción en EcoRI de pMON5420 | |
| pMON5308 | Deleción en EcoRI de pMON5421 | |
| pMON5309 | Deleción en PstI de pMON5420 | |
| pMON5310 | Deleción den XbaI de pMON5421 | |
| pMON5311 | Deleción en EcoRV-SmalI de pMON5421 | |
| pMON5312 | Deleción en NdeI-BamHI de pMON5421* | |
| pMON5313 | Deleción en NdeI-BamHI de pMON5420* | |
| pMON5314 | Deleción en AsuII-BamHI de pMON5421* | |
| pMON5315 | Deleción en AsuII (parcial)-BamHI de pMON5421* | |
| pMON5316 | Deleción en AsuII-BamHI de pMON5421** | |
| pMON5426 | Deleción en BglII-BamHI de pMON5420 | |
| pMON5427 | Deleción en EcoRV-SmaI de pMON5420 | |
| pMON5428 | Deleción en HpaI-SmaI de pMON5420 | |
| pMON5429 | Deleción en XbaI de pMON5420 |
* - Después de la digestión del DNA con
ambas enzimas, los extremos fueron rellenados con polimerasa Klenow,
ligada y usada para transformar JM101.
\text{**} - La
generación de la deleción en AsuII-BamHI de esta
construcción dio lugar a un reagrupamiento de un fragmento AsuII a
una orientación opuesta a su colocación original. Esto dio lugar a
una secuencia de lectura 5316 hacia el extremo NH_{2}.
El siguiente protocolo proporciona buenos
rendimientos con carácter reproducible de moldes de hebra única para
la secuenciación. Una única colonia que contenía el pUC119 con el
fragmento que va a ser secuenciado, fue linealmente extendido en
L-agar (10 g de triptona, 5 g de extracto de
levadura, 5 g de NaCl y 15 g de agar por litro) que contenía
ampicilina (200 \mug por ml). Una colonia única de esta placa se
inoculó en 3 ml de caldo de cultivo L (200 \mug por ml de
ampicilina) y se incubó a 37ºC durante una noche con agitación. A
partir de este cultivo, se inocularon 50 \mul en 10 ml de 2X YT
(20 g de triptona y 10 g de extracto de levadura por litro) con 200
\mug de ampicilina por ml en un matraz con mango lateral de 150 ml
y se incubaron a 37ºC con agitación. Después de 2-3
horas (lectura klett de 50), se añadieron 100 \mul de M13K07 (fago
helper) cultivado en E. Coli JM101, para inducir el cultivo.
El matraz se agitó durante una hora y seguidamente se añadieron 20
ml de 2X YT, ajustando la concentración final de Kanamicina a 70
\mug por litro y la ampicilina a 200 \mug por ml. Los cultivos
fueron agitados durante 16-18 horas a 37ºC. Se
encontró que un total de tres ml del cultivo inducido durante una
noche era suficiente para aislar una cantidad adecuada de molde para
cuatro experimentos secuenciales. Los tres ml fueron centrifugados
en tubos Eppendorf de 1,5 ml durante 1 minuto. Se decantaron y se
filtraron a través de un filtro Gelman Sciences Acrodisc® de 0,2
\mum. Esta etapa se encontró que era útil para la separación de
debris celular y E. Coli intacto. Una precipitación con
polietilenglicol (PEG al 20%, NaCl 2,5 M, 500 \mul por 2 ml de
lisado) a temperatura ambiente durante 10 minutos, estuvo seguida
por una centrifugación durante 10 minutos. El material sobrenadante
se desechó y seguidamente se centrifugó brevemente (15 segundos) y
se separó el PEG residual. Cualquier PEG restante será llevado hasta
el aislamiento del molde y afectará adversamente a las reacciones de
secuenciación de DNA. Los sedimentos se vuelven a poner en
suspensión en 100 \mul de TE (Tris 10 mM EDTA 1 mM, pH 8,0), se
combinan y se mezclan bien con 200 \mul de fenol tamponado
(tamponado mediante equilibrado con un volumen igual de Tris 1
M-HCl, Ph 8,0, y seguidamente Tris 0,1
M-HCl, pH 8,0, seguido de un volumen igual de TE).
Después de incubar a 55ºC durante 10 minutos, se añadió un volumen
igual (200 \mul) de fenol/cloroformo (1:1), se agitó vorticalemnte
y se centrifugó durante 2 minutos. La capa superior se separó, se
extrajo con 200 \mul de cloroformo, se centrifugó y la fase acuosa
se separó. El molde de hebra única se precipitó con 25 \mul de
acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 600 \mul de etanol al 95%, se
incubó sobre hielo seco durante 5 minutos y se centrifugó durante 10
minutos. el precipitado se volvió a poner en suspensión en 25 \mul
de H_{2}O y 2 \mul fueron verificados sobre un gel de agarosa en
cuanto al tamaño correcto, concentración relativa y DNA
contaminante.
Los protocolos para la secuenciación de DNA se
describen en detalle en el manual disponible en la empresa Amersham
Corporation. Los reactivos (nucleótidos, cebador, tampón, solución
de seguimiento y polimerasa Klenow) fueron obtenidos a partir del
estuche de ensayo para secuenciación Amersham M13 (catálogo nº
N4502). Las mezclas de secuenciación proporcionadas en el estuche de
ensayo de Amersham fueron ajustadas para la secuenciación eficaz del
gen de B.t.t. rico en A-T. En lugar de la
mezcla recomendada 1:1 de dNTP a ddNTP, se encontró que las
siguientes relaciones eran más apropiadas; 40 \mul de dATP:10
\mul de ddATP, 35 \mul de ddTP: 15 \mul de ddTTP, 15 \mul de
dGTP: 35 \mul de ddGTP y 10 Rl de dCTP: 40 \mul de ddCTP. Se usó
azufre radioactivo ([\alpha-S^{35}]dATP)
en las reacciones de secuenciación (catálogo de Amersham nº
SJ.1304). Los geles de secuenciación (preparados como se describe en
el manual de Amersham) se realizaron en el aparato Hoeffer "Poker
Face" a 70 watios (1200-1400 voltios), que se
encontró que proporcionaban una muy buena resolución. Unos voltajes
superiores dieron lugar a bandas borrosas.
Los plásmidos aislados, pMON5420 y pMON5421,
contenían un fragmento HindIII de 3,0 en orientación opuesta (véase
la Figura 3). La proteína principal del cristal de B.t.t.,
que se usó como la base para diseñar las sondas de oligonucleótidos,
tiene un peso molecular estimado de 73-76 kdal que
correspondía a aproximadamente 2,0 kb de DNA. La secuenciación
inicial de los cebadores A1 y A2 (oligonucleótidos sintéticos
basados en la secuencia de aminoácidos del pico A; véase la Tabla
III, a continuación) confirmó que la secuencia de DNA correspondía a
la secuencia de aminoácidos anticipada.
| Cebador | Molde | Secuencia | Posición 1 |
| Bttstart | pMON5420 | tgaacatggttagttgg | 291-275 |
| Bttext | pMON5421 | taggtgatctctaggcg | 422-439 |
| Bttseq | pMON5421 | ggaacaaccttctctaatat | 1156-1175 |
| BttA1* | pMON5421 | atgaayccnaayaaycg | 205-222 |
| BttA2* | pMON58421 | garcaygayacyathaa | 227-242 |
* y = t o c. r = a o g. h = t, c o a. n
= a, g, c o t.
^{1} La colocación de los cebadores se
basa en el total de 2615 bases secuenciadas. La secuenciación a
partir de pMON5420 prosiguió hacia el extremo de aminoácido y a
partir de pMON5421, hacia el extremo carboxilo (véase la Figura
3).
Se colocó un sitio PstI en la secuencia inicial
que se usó para identificar la colocación y orientación probable del
gen de B.t.t. dentro de pMON5420 y pMON5421 (véanse las
Figuras 3 y 4). La elaboración de los mapas de los sitios de
restricción con un número de enzimas (HpaI, XbaI, NdeI, EcoRV y
BglII) y los numerosos sitios únicos que quedaban en la parte pUC119
tanto de pMON5420 como de pMON5421 proporcionaron la oportunidad de
obtener una secuencia usando el cebador secuenciador universal. Se
generaron deleciones tanto en pMON5420 como en pMON5421 llevando la
región homóloga del cebador universal en proximidad cercana a las
regiones internas del gen. En las áreas no fácilmente secuenciadas
por deleciones generantes, se usaron oligonucleótidos sintéticos
correspondientes a las regiones secuenciadas en la secuencia
codificadora (Tabla III) como cebadores para obtener extensiones de
las regiones secuenciadas. Las regiones secuenciadas (coordenadas de
secuencia; Tabla IV) y la dirección de secuenciación se describen en
la Figura 4.
| Plásmido | Longitud (bp) | Colocación | Plásmido | Longitud (bp) | Colocación |
| pMON5307 | 414 | 797-1211 | pMON5316 | 153 | 1861-2041 |
| pMON5308 | 276 | 1895-2171 | pMON5426 | 300 | 2220-2520 |
| pMON5309 | 170 | 114-284 | pMON5427 | 110 | 1701-1812 |
| pMON5310 | 283 | 1595-1880 | pMON5428 | 129 | 1548-1677 |
| pMON5311 | 110 | 1812-1922 | pMON5429 | 303 | 1292-1595 |
| pMON5312 | 248 | 782-1030 | Bttstart | 264 | l-264 |
| pMON5314 | 291 | 2041-2305 | Bttext | 380 | 440-820 |
| pMON5315 | 330 | 1157-1187 | BttA2 | 267 | 250-517 |
Se obtuvo un total de 2615 pares de bases de
secuencia a partir de pMON5420 y pMON5421. Un análisis por ordenador
de la secuencia reveló un único marco de lectura abierto a partir
del par de bases 205 a 2136. Haciendo referencia a la Figura 5, el
gen de toxina insecticida de B.t.t. es de 1932 pares de
bases, que codifican una proteína de 644 aminoácidos con un peso
molecular de 73.091 daltones. La proteína tiene una carga neta de
-17 y un contenido G-C de 34%.
Aunque las toxinas de tipo coleóptero y las
toxinas de tipo lepidóptero son derivadas de Bacillus
thuringiensis, hay diferencias significativas entre los genes de
toxinas y las proteínas de toxinas de los dos tipos. En la medida en
que se aislan a partir de Bacillus thuringiensis, ambos tipos
de toxinas se encuentran en cristales parasporales; sin embargo,
como se describió anteriormente, las propiedades de solubilidad de
los cristales son distintivamente diferentes. Además, los tamaños de
las proteínas de toxinas encontradas en los cristales solubilizados
son completamente diferentes. Las proteínas de toxinas de tipo
lepidóptero son típicamente del orden de 130 kDa, mientras que las
proteínas de toxinas de tipo coleóptero son de aproximadamente 70
kDa.
El aislamiento y el análisis de la secuencia de
DNA del gen de toxina de tipo coleóptero de B.t. tenebrionis
predice la secuencia de aminoácidos de la proteína de toxina (véase
la Figura 5). Tanto la secuencia de nucleótidos como la secuencia de
aminoácidos derivados del gen de toxina de tipo coleóptero han sido
comparados con la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de una
toxina típica de tipo lepidóptero. Esta comparación se realizó
usando el programa de ordenador BESTFIT de Devereux et al. (1984)
que emplea el algoritmo de Smith y Waterman (1981). BESTFIT obtiene
una máxima alineación de dos secuencias de nucleótidos o
aminoácidos. BESTFIT calcula dos parámetros, calidad y relación, que
pueden ser usados como medidores de alineaciones cuando se comparan
alineaciones diferentes. La relación varía entre 0 y 1,0. Una
relación mayor indica una mejor alineación (mayor similitud) entre
dos secuencias.
La alineación BESTFIT muestra que los dos tipos
de genes de toxinas están relacionados a un nivel tanto de secuencia
de nucleótidos como de secuencia de aminoácidos. Sin embargo, la
alineación muestra también que las dos secuencias son claramente
distintas y poseen muchas regiones de desapareamiento a niveles de
secuencias tanto de nucleótidos como de aminoácidos. Por ejemplo, la
relación para la comparación de dos secuencias de aminoácidos es
solamente 0,22. A nivel de la secuencia de nucleótidos, se obtiene
una alineación máxima solamente mediante la introducción de muchos
huecos en las dos secuencias, y la relación es solamente 0,072.
Hay muchos ejemplos secuenciaciones de genes de
toxinas de tipo lepidóptero; una comparación similar entre estos
genes ha mostrado que el gen de B.t. kurstaki
HD-1 descrito por Schnepf et al. (1985) y el de
B.t. kurstaki HD-73 descrito por Adang et al.
(1985) representan los dos genes de toxinas de tipo lepidóptero más
divergente. Por comparación con las relaciones calculadas
anteriormente para la alineación del gen de tipo coleóptero y de
tipo lepidóptero, la relación para la comparación de secuencia de
aminoácidos de las dos proteínas de tipo lepidóptero más divergentes
es 0,811, y la relación para estos dos genes de tipo lepidóptero al
nivel de secuencia de nucleótidos es 0,755. Esto indica que aunque
los genes de toxinas de tipo coleóptero y de tipo lepidóptero pueden
estar relacionados por sus evolución, son bastante distintos en su
secuencia tanto de nucleótidos como de aminoácidos.
Para facilitar la purificación de grandes
cantidades de toxina de B.t.t. recombinante, fue necesario
clonar el gen de B.t.t. en vectores de expresión elevada de
E. Coli. Se usó mutagénesis dirigida al sitio para introducir
un sitio de restricción NcoI en pMON5420 en el codón ATG al comienzo
del marco de lectura abierto.
Se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para
introducir nuevos sitios de restricción mediante el procedimiento de
Kunkel (1985). Se introdujo el plásmido pMON5420 mediante
transformación en E. Coli cepa BW313, que contiene las
mutaciones dut^{-} y ung^{-} con el fin de incorporar
desoxiuridina en el DNA. Se cultivó una única colonia transformada
durante una noche en medio 2X YT que contenía 100 \mug/ml de
ampicilina y 0,25 \mug/ml de uridina. Se añadió una parte alícuota
de 0,5 ml de este cultivo a 10 ml del mismo medio, y se incubó
durante una hora a 37ºC con agitación vigorosa hasta una densidad de
0,23 (A600). Para introducir la formación de partículas de fagos que
contienen una única hebra, se añadió fago helper M13K07 a una
multiplicidad de aproximadamente 10, y se continuó la incubación
durante una hora hasta una densidad de 0,4 (A600). El cultivo se
diluyó mediante la adición de 30 ml del medio anterior, y se añadió
kanamicina hasta una concentración final de 70 \mug/ml. La
incubación se continuó durante 15 horas, en cuyo momento se
separaron las células por centrifugación. Las partículas de fagos se
precipitaron a partir de 25 ml de material sobrenadante mediante la
adición de 5 ml de PEG al 20%/NaCl 2,5 M/50 \mug/ml de RNAasa A
seguida de incubación en hielo durante 15 minutos. Los fagos se
recuperaron mediante centrifugación y se disolvieron en 0,8 ml de
tampón TE. Se aisló DNA a partir de las partículas mediante tres
extracciones con 0,8 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico
(25:24:1) seguida de precipitación en etanol. El sedimento de DNA se
disolvió en 100 \mul de agua hasta una concentración final de
aproximadamente 1 mg/ml (estimada mediante electroforesis en gel de
agarosa).
Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para
la mutagénesis se pusieron en suspensión en agua a una concentración
de aproximadamente 10 pmoles/\mul. Los oligonucleótidos fueron
fosforilados utilizando polinucleótido quinasa T4 en una reacción
que contenía 50 pmoles de oligonucleótido, ATP 1 mM,
Tris-Cl 25 mM a pH 8, MgCl_{2} 10 mM,
espermidina-HCl 0,2 mM, DTT 1 mM y 2 unidades de
enzima. La reacción se incubó a 37ºC durante 30 minutos y
seguidamente se calentó a 70ºC durante 5 minutos. El cebador
fosforilado fue reasociado a la desoxiuridina que contenía DNA de
fagos mezclando aproximadamente 1 pmol del DNA de fagos (2 \mug)
con 10 pmoles de cebador en una reacción que contenía
Tris-HCl 6,6 mM, MgCl_{2} 6,6 mM, NaCl 6,6 mM y
DTT 5 mM. La mezcla se calentó a 70ºC durante siete minutos y
seguidamente se enfrió lentamente a temperatura ambiente. El
cebador/molde reasociado se usó como el sustrato para la síntesis de
DNA circular cerrado, de doble hebra, mediante la adición de cada
uno de dNTP a 0,5 mM, ATP a 0,5 mM, 5 unidades de DNA polimerasa del
fragmento de Klenow y 400 unidades de T4 DNA ligasa (New England
Biolabs). La reacción se llevó a cabo en las mismas sales
tamponantes que para la reasociación a 15ºC, durante aproximadamente
15 horas. En este momento se añadieron 400 unidades adicionales de
ligasa y se continuó la incubación durante dos horas.
Una mitad de la reacción se usó para transformar
0,15 ml de células JM101 tratadas con CaCl_{2}, y las células
fueron extendidas en placas LB que contenían 100 \mug/\mul de
ampicilina. Se recuperaron entre 30 y varios centenares de colonias
para cada reacción de mutagénesis. Las colonias únicas fueron
cultivadas durante una noche en ampicilina que contenía LB y se
prepararon minipreparaciones de plásmidos mediante el procedimiento
SDS alcalino. Los plásmidos fueron analizados en cuanto a la
presencia del nuevo sitio de restricción y la presencia del sitio
fue confirmada mediante análisis de secuencias, como se describió
anteriormente.
Un plásmido que contenía un sitio NcoI (pMON9759)
al comienzo del gen de toxina insecticida de B.t.t., fue
generado mediante mutagénesis específica para el sitio. El cebador
usado se muestra a continuación:
| Sitio deseado | Cebador |
| NcoI | GATTGTTCGGATCCATGGTTCTTCCTCCCT |
La generación del sitio NcoI en el
N-terminal ha cambiado el segundo aminoácido de
asparagina a ácido aspártico. Este cambio no afecta a la toxicidad
hacia los insectos. Los sitios BamHI y StyI han sido generados
también como una consecuencia de la introducción de este sitio NcoI.
El plásmido que contiene el sitio NcoI ha sido denominado pMON9759.
El fragmento NcoI-HindIII de 2,5 kb que contiene el
pMON9759 del segmento que codifica la toxina fue seguidamente
clonado en pMON5634 digerido con NcoI-HindIII para
producir pMON5436. Haciendo referencia a la Figura 16, pMON5634 es
un plásmido basado en pBR327 que contiene también el fago f1 origen
de la replicación. El vector contiene un promotor recA sintético que
es inducido por ácido nalidíxico. El gen 10 conductor del fago T7
(descrito en la solicitud de patente europea 87870039.2) está
presente también para aumentar la expresión en E. Coli. Se
añadió un conector sintético con múltiples sitios de clonación para
la inserción de genes aguas abajo del promotor y la secuencia
conductora del gen 10.
Para la inducción del promotor recA, cultivos de
una noche fueron diluidos 1:50 en medios mínimos M9 (Miller, 1972)
añadiéndose casaminoácidos al 0,2% y glucosa al 0,25%. En las
unidades de Klett 150, se añadió ácido naladíxico a 50 \mug/ml, y
las células fueron recolectadas 3 horas después de la inducción. El
nivel de toxina de B.t.t. producida por pMON5436 inducido por
ácido nalidíxico se comparó con el pMON5420 inducido por IPTG
mediante análisis en SDS-PAGE. El gel teñido con
azul de Coomassie no reveló B.t.t. detectable producido por
pMON5420, mientras que el nivel de B.t.t. producido por
pMON5436 fue aproximadamente un 5% de la proteína total. Esta
construcción se usó para aislar grandes cantidades de proteínas de
toxinas de B.t.t. recombinante para investigar los niveles de
toxicidad, la especifidad para los insectos y el modo de acción.
La B.t. var. tenebriones produce un cierto
número de proteínas de toxinas de tipo coleóptero, presentes en
cristales de proteínas, que son producidas de forma
co-incidental con la esporulación (véase la Figura
6). Estos cristales de proteínas son liberados en los medios y
células autolisadas durante o con posterioridad a la esporulación.
Para determinar el número de proteínas de toxinas producidas por
B.t. var. tenebriones, se cultivaron cultivos de 500 ml de
este organismo en matraces de 2 litros en medio TSB al 15% en tampón
de ácido
2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES)
100 mM, pH 7,0, a 30ºC durante 7 días. En este momento, los cultivos
han esporulado y las células están lisadas. Los cristales de
proteínas y las esporas fueron cultivados mediante centrifugación a
20.000 x gravedad (g) durante 20 minutos a 4ºC. Los sedimentos
fueron lavados tres veces con agua en exceso, a lo que siguieron
tres lavados con NaCl 2 M. El sedimento resultante se almacenó a 4ºC
en agua más acida de sodio al 0,02%. La proteína de toxina de
B.t.t. se solubilizó a partir de los cristales poniendo en
suspensión el sedimento en tampón de carbonato de sodio 100 mM, pH
10, y agitando esta suspensión durante dos horas a temperatura
ambiente. Después de una centrifugación a 20.000 x g durante 20
minutos para separar los materiales insolubilizados, el material
sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum para
separar cualesquiera esporas restantes. La proteína de toxina de
B.t.t. preparada de esta manera, como también los cristales
solubilizados en Tris-HCl 125 mM, SDS al 4%,
glicerol al 20% y 2-mercaptoetanol al 10%, pH 6,8,
(tampón de muestra SDS usado para preparar muestras para análisis
SDS-PAGE), está comprendida por cuatro proteínas
principales y diferentes, según se estimó mediante análisis
SDS-PAGE. Cinco únicos productos fueron
identificados mediante análisis de aminoácidos
N-terminales. Para determinar si la totalidad de
estas cinco proteínas derivaban del mismo gen, o si se requieren dos
o más genes para su síntesis, se determinó la secuencia de
aminoácidos N-terminales de cada una de estas
proteínas usando química de degradación de Edman automática.
Se empleó un secuenciador en fase gaseosa modelo
470A de la empresa Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA)
(Hunkapiller, et al., 1983). Los respectivos derivados de
PTH-aminoácido fueron identificados mediante
análisis RP-HPLC de una forma en línea, empleando un
análisis PTH modelo 120A de Applied Biosystems, Inc., equipado con
una columna PTH-C18 de 2,1 mm de D.I. (diámetro
interno) Broownlee. La determinación de la secuencia de aminoácidos
N-terminales de cada proteína establecerá si estas
proteínas derivan del gen de toxina de B.t.t. anteriormente
descrito.
La estrategia para secuenciar estas proteínas fue
secuenciar proteínas de toxina de B.t.t. que correspondían a
las bandas 1 y 3 (véase la Figura 6) del clon de E. Coli
JM101 (pMON5436), bandas 2, 3 y 4, mediante
electro-elución de las proteínas producida por
B.t. var. tenebriones a partir de geles
SDS-PAGE. La secuencia de B.t.t. 1 y 3 se
determinó con proteínas purificadas a partir de JM101 (pMON5436). El
JM101 (pMON5436), así como las demás construcciones de E.
Coli (pMON5450, 5456 y 5460, infra) produce el B.t.t. en
forma de estructuras refráctiles insolubles después de que los
cultivos son inducidos para una expresión de nivel elevado. Las
construcciones de E. Coli fueron cultivadas en medios M9
modificados a 37ºC. Se usó un cultivo cultivado durante una noche
para inocular 400 ml de los medios M9 modificados en matraces
fernbach de 2,4 l hasta una densidad de partida inicial de 10
unidades Klett. Se añadió ácido nalidíxico, en NaOH 0,1 N, a los
cultivos, a 100 unidades Klett, hasta una concentración final de 50
\mug/ml, para inducir la expresión de proteína de toxina de
B.t.t. Después de 4 horas adicionales de incubación, los
cultivos fueron recolectados por centrifugación a 20.000 x g durante
20 minutos a 4ºC. Los sedimentos celulares fueron puestos en
suspensión en agua hasta una densidad equivalente a 5000 unidades
Klett por ml, y fueron sonicados en un baño con hielo, con un
sonicador "Heat Systems Ultrasonics" a una potencia de 9, ciclo
de servicio de 50%, durante un total de 5 minutos. La preparación
sonicada se centrifugó durante 20 minutos a 20.000 x g a 4ºC. Los
sedimentos, que contenían estructuras refráctiles y debris celular,
fueron lavados dos veces con agua fría y puestos en suspensión a
10.000 equivalentes de unidades Klett por ml en agua más sulfolano
al 25%. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas,
las preparaciones de estructuras refráctiles solubilizadas fueron
centrifugadas nuevamente a 20.000 x g a 4ºC para separar materiales
sin solubilizar. Se añadió Tris-HCl a la materia
sobrenadante hasta una concentración final de 50 mM, pH 7,6. Las
bandas 1 y 3 de B.t.t. fueron purificadas conjuntamente en
una columna de intercambio iónico HR5/5 MonoQ usando un gradiente de
75 a 200 mM de NaCl en Tris-HCl 50 mM, sulfolano al
25%, pH 7,6. Las fracciones que contenían las bandas 1 y 3 de
B.t.t. fueron identificadas mediante análisis
SDS-PAGE al 9%, fueron reunidas, dializadas en
tampón a pH 10 de carbonato de sodio 100 mM y concentradas en
concentradores Amicon centricon. La proteína de toxina de
B.t.t. que correspondía a la banda 3 fue purificada a partir
de JM101 (pMON5456) de una manera análoga.
Las bandas que correspondían a 2 solamente y las
bandas 3, 3' y 4 (véase la Figura 6, combinadas, fueron
electroeluidas a partir de geles de placas SDS-PAGE
al 7%, que se realizaron con 48 \mug de cristales de B.t.t.
solubilizados en tampón de carbonato de sodio 100 mM, ditioteitol
(DTT) 20 mM, a pH 10. Los geles fueron teñidos durante 10 minutos en
azul de Coomassie R250 y fueron desteñidos en metanol al 50%, ácido
acídico al 10% durante 20 minutos. Las bandas apropiadas fueron
cortadas con una hoja de afeitar y la proteína de B.t.t. fue
electro-eluida. Conociendo la secuencia de
aminoácidos, deducida de la secuencia de DNA del gen de toxina de
B.t.t. clonado en E. Coli, se identificaron la
totalidad de los N-terminales de estas proteínas
únicas (Figura 7).
Las proteínas correspondientes a las bandas 1 y 3
se originan a partir de 2 sucesos de iniciación traduccional
independientes, que comienzan en la metionina en las posiciones 1 y
48 (Figuras 6 y 7), respectivamente. Las proteínas que corresponden
a las bandas 2, 3 y 4 de B.t.t., observadas solamente en
B.t. var. tenebriones y no en construcciones de E.
Coli, surgieron aparentemente a partir de la escisión
proteolítica de cualquiera de las bandas 1 ó 3. Estos resultados
establecen que la totalidad de las cinco proteínas se originan a
partir del mismo gen.
Las proteínas de B.t.t. producidas en
E. Coli que corresponden a las bandas 3 y 1 más 3, que fueron
solubilizadas en sulfolano al 25% y purificadas mediante
cromatografía MonoQ para un análisis de la secuencia de aminoácidos
N-terminales, no mostraron toxicidad hacia insectos
frente a insectos del escarabajo de la patata del Colorado. En
experimentos posteriores, se demostró que el sulfolano por sí mismo
inactiva el B.t.t. Por lo tanto, se desarrolló un
procedimiento de purificación alternativo y se usó para comparar las
toxicidades insecticidas relativas de las bandas 1 y 3 de
B.t.t. producidas en E. Coli, comparada con el
B.t.t. solubilizado a partir de cristales nativos de B.t.
var. tenebriones. Los cultivos fueron cultivados, inducidos,
recolectados y se aislaron estructuras refráctiles como se describió
anteriormente. Las diversas proteínas de B.t.t. fueron
solubilizadas en las estructuras refráctiles usando carbonato de
sodio 100 mM, pH 10. La toxina de B.t.t. solubilizada,
concentrada usando células agitadas Amicon con membranas
YM-10, se purificó en una columna FPLC de filtración
sobre gel, de Pharmacia Superose-12, que separa las
bandas 1 y 3 de B.t.t. y de otras proteínas contaminantes.
Las fracciones apropiadas, basadas en un análisis
SDS-PAGE, fueron reunidas, concentradas y se usaron
para experimentos de toxicidad hacia insectos con insectos de
escarabajo de la patata del Colorado. Las proteínas correspondientes
a la banda 1 (pMON5436), banda 1 (pMON5460) y banda 3 (pMON5456)
tenían una pureza mayor que 90% basada en un análisis
SDS-PAGE. La banda 1, producida por pMON5460, tiene
isoleucina en el aminoácido 48 en lugar de metionina (véase a
continuación).
Para obtener toxina de proteína nativa a partir
de B.t. var. tenebriones para comparaciones de toxicidad, se
aislaron cristales nativos y se purificaron usando centrifugación
con gradientes de sacarosa como se describió anteriormente. Los
cristales fueron solubilizados en carbonato de sodio 100 mM, DTT 20
mM, pH 10, y se usaron para ensayos de toxicidad hacia insectos.
Todas las preparaciones de proteínas de toxinas
de B.t.t. y los testigos para el ensayo con insectos
contenían 0,3% de Tween 20, un tensioactivo que aumenta la capacidad
de estas soluciones para unirse a las hojas de tomate. Los
experimentos de toxicidad hacia insectos se realizaron revistiendo a
fondo las superficies superior e inferior de hojas de tomate
cortadas de 3 a 4 semanas antes, con soluciones tamponantes que
contenían las proteínas de B.t.t. designadas a las
concentraciones de proteínas indicadas. Después de que las
soluciones se secaron con aire sobre la superficie de las hojas de
tomate, una única hoja y 10 insectos de escarabajos de la patata del
Colorado fueron colocados en una placa de petri y se incubaron a
22ºC durante 4 días. Se determinó el número de insectos muertos y
los resultados de toxicidad se expresaron como % de mortalidad
corregida (% CM); según la fórmula de Abbott anteriormente descrita.
Todos los experimentos se realizaron por duplicado y todos, excepto
la banda 1 de B.t.t. para pMON5460, fueron repetidos en días
diferentes. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla
de a continuación.
| Muestra | Concentración (\mug/ml) | Mortalidad corregida (%) |
| B.t.t. solubilizada | 100 | 100 |
| 20 | 70 | |
| 4 | 10 | |
| Banda 1 purificada | 100 | 87 |
| (pMON5436) | 20 | 68 |
| 10 | 34 | |
| Banda 1 purificada | 100 | 67 |
| (pMON5460) | 20 | 72 |
| 10 | 44 | |
| Banda 3 purificada | 100 | 91 |
| (pMON5456) | 20 | 64 |
| 10 | 32 |
\newpage
La toxicidad relativa de proteínas purificadas de
diferentes construcciones de E. Coli fueron comparadas con
cristales de B.t.t. nativo solubilizados. La banda 1
(pMON5436) y la banda 3 (pMON5456) fueron purificadas como se ha
descrito. La banda 1 (pMON5460) fue purificada usando cromatografía
de filtración sobre gel. Los cristales de B.t.t. nativos
fueron solubilizados en Na_{2}CO_{3} 100 mM, pH 10.
Las cantidades de toxina de B.t.t.
requeridas para destruir un 50% de los insectos de escarabajos de la
patata del Colorado fueron esencialmente idénticas a la banda 1 de
B.t.t. aislada a partir de pMON5436 y pMON5460 y la banda 3
de B.t.t. aislada a partir de pMON5456 (Tabla V).
Análogamente, todas estas preparaciones de B.t.t. purificadas
a partir de E. Coli demostraron toxicidades esencialmente
idénticas a las observadas con la toxina nativa solubilizada en
carbonato de sodio de B.t. var. tenebriones.
Diversos grupos (Schnepf et al. 1985, Hofte et
al. 1986 y Wabiko et al. 1986) han descrito que las truncaciones
C-terminales de las toxinas de tipo lepidóptero no
reducen la toxicidad (de los 1155 aminoácidos, una truncación hasta
607 aminoácidos no dio lugar a una pérdida de toxicidad). Por lo
tanto, la mitad de los C-terminales de la proteína
no son necesarios para la toxicidad. Otros han descrito también que
los genes de toxinas de tipo lepidóptero que contienen deleciones
C-terminales están más altamente expresados en
plantas transformadas. Hay también descripciones de que para retener
la toxicidad, solo se pueden hacer pequeñas truncaciones en el
N-terminal (Schnepf et al. 1985, y Hofte et al.
1986). Contrariamente a estas explicaciones, se ha encontrado ahora
que la toxina de tipo coleóptero de B.t.t. tiene propiedades
sustancialmente diferentes. Es decir, la parte del
C-terminal parece ser crítica para la toxicidad,
permitiendo por lo tanto que no haya esencialmente truncaciones. Sin
embargo, se pueden hacer deleciones N-terminales y
mantener la toxicidad. Estas diferencias se pusieron de manifiesto
usando las construcciones descritas a continuación:
pMON5420 fue digerido con BglII y BamHI, ligado y
transformado en JM101 para crear pMON5426. Esta deleción se
construyó para confirmar que el sitio BglII no estaba dentro de la
región codificadora del gen de toxina de B.t.t.
pMON5420 fue digerido con HpaI y ligado con el
siguiente conector terminador sintético. El conector contiene
codones sin sentido en cada marco de lectura y un saliente BglII en
5'.
5'-TAGTAGGTAGCTAGCCA-3'
3'-ATCATCCATCGATCGGTCTAG-5'
La ligadura fue digerida con BglII, para separar
múltiples insertos de conector, y seguidamente
re-ligada. La ligadura fue transformada en JM101 y
se aisló pMON5430. Para generar un sitio NcoI al comienzo del gen
truncado, al fragmento PstI de 2,32 kb de pMON5430 y la nueva
construcción fue designada pMON5434. El fragmento NcoI/HindIII de
1,57 kb de pMON5434 fue clonado en el vector de expresión elevada de
E. Coli pMON5634, para crear pMON5438.
pMON5420 fue digerido con EcoRV y ligado con el
conector terminador sintético. La ligadura fue digerida con BglII,
para separar múltiples insertos de conector, y seguidamente
re-ligada. La ligadura fue transformada en JM101 y
se aisló pMON5431. Para generar un sitio NcoI al comienzo del gen
truncado, el fragmento PstI de 2,32 kb de pMON9759 fue sustituido
con el fragmento Pst de 1,61 kb de pMON5431, y la nueva construcción
fue designada pMON5435. El fragmento Nco(/HindIII de 1,71 kb de
pMON5435 fue clonado en el vector de expresión elevada de E.
Coli pMON5433 para crear pMON5441.
pMON9759 digerido con BglII fue tratado con Bal31
nucleasa durante 5 minutos siguiendo las instrucciones del
fabricante. El DNA fue tratado por electroforesis en un gel de
agarosa al 0,8% y purificado de la agarosa mediante el procedimiento
de congelación-descongelación. El conector
terminador sintético fue ligado seguidamente al DNA purificado y se
aisló pMON5442. El fragmento NcoI/GblII de pMON9759 fue sustituido
con el fragmento del gen truncado de pMON5442 para crear pMON5445.
El fragmento NoI/HindIII de pMON5445 fue clonado en el vector de
expresión elevada de E. Coli pMON5634 para crear pMON5449. El
punto final en la deleción creada Bal31 fue determinado mediante
análisis de secuencia de DNA.
pMON5436 fue digerido con XmnI y ligado con el
conector terminador sintético. La ligadura se digirió seguidamente
con NcoI y BglII, y el fragmento NcoI/BglII de 1.92 kb que contenía
en gel truncado fue clonado en NcoI y pMON9759 digirió con BlgII
para sustituir el gen de longitud completa y crear pMON5446. El
fragmento NcoI/HindIII de pMON5446 fue clonado en el vector de
expresión elevada de E. Coli pMON5634 para crear
pMON5448.
pMON5436 fue digerido con NcoI, los extremos
rellenados usando fragmento Klenow de DNA polimerasa, ligados y
transformados en JM101 para crear pMON5450. Este plásmido expresa
solamente proteína de la banda 3.
El gen de B.t.t. contiene dos sitios StyI
(227 y 1587) y se añadió un tercer sitio mediante la mutagénesis
para crear un sitio NcoI en pMON9759. Se realizaron los siguientes
experimentos para eliminar DNA de B.t.t. en 5' al par de
bases 227. pMON5434 (derivado de la deleción en Hpal anteriormente
descrita) fue digerido con StyI, los extremos rellenados con DNA
polimerasa Klenow, ligados y transformados en JM101 para aislar
pMON5444. Esta manipulación destruye los dos sitios de escisión NcoI
y StyI. Esta manipulación crea una fusión en el marco con la primera
metionina (aminoácido 1) y lecucina (aminoácido 77). El C terminal
del gen fue añadido clonado el fragmento NdiI/KpnI de 1.9 kb de
pMON9759 en pMON5444 para crear pMON5452.
Se introdujo un sitio NcoI en pMON5420 en el ATG
para la banda 3 mediante mutagénesis dirigida al sitio como se
describió anteriormente usando el cebador:
Cebador de mutagénesis -
BTTLOOP
CGTATTATTATCTGCATCCATGGTTCTTCCTCCCT
para crear pMON5455. La mutagénesis eliminó
también la secuencia aguas arriba que codifica los 48
aminoácidos
N-terminales de la banda 1. El fragmento Nco/HindIII de pMON5455 fue clonado en el vector de expresión elevada de E. Coli pMON5634 para crear pMON5456. La generación del sitio NcoI cambia el segundo aminoácido de tionina a ácido aspártico.
N-terminales de la banda 1. El fragmento Nco/HindIII de pMON5455 fue clonado en el vector de expresión elevada de E. Coli pMON5634 para crear pMON5456. La generación del sitio NcoI cambia el segundo aminoácido de tionina a ácido aspártico.
El codón para metionina en la posición 48 en
pMON9759 fue cambiado a un codón para isoleucina mediante
mutagénesis dirigida al sitio, como se describió anteriormente,
usando el cebador:
Cebador de mutagénesis -
BTTMET
ATTATTATCTGDAGTTATTCTTAAAAACTCTTTAT
para crear pMON5458. El fragmento Nco/HindIII de
pMON5458 fue clonado en el vector de expresión elevada de
E. Coli pMON5634 para crear pMON5460. Separando el codón ATG que inicia la traducción de la proteína de la banda 3, pMON5460 produce solamente proteína de la banda 1, con un residuo de isoleucina en la posición 48.
E. Coli pMON5634 para crear pMON5460. Separando el codón ATG que inicia la traducción de la proteína de la banda 3, pMON5460 produce solamente proteína de la banda 1, con un residuo de isoleucina en la posición 48.
Se introdujo un sitio NcoI en pMON5420 para crear
una deleción N-terminal de noventa y ocho
aminoácidos mediante mutagénesis dirigida al sitio, usando el
cebador:
Cebador de
mutagénesis
TCACTTGGCCAAATTGCCATGGTATTTAAAAAGTTTGT
para crear pMON5466. Una metionina y una alanina
fueron isertadas también mediante la mutagénesis. El fragmento
NcoI/HindIII de pMON5466 fue clonado en el vector de expresión
elevada de E. Coli pMON5634 para crear
pMON5467.
La actividad de la toxina para coleópteros se
determinó usando escarabajos de la patata del Colorado recientemente
eclosionados en un ensayo de alimentación con hojas de tomate
anteriormente descrito. Los genes de B.t.t. mutantes usados
para el análisis del C-terminal se muestran en las
Figuras 8 y 10. pMON5438 contiene 490 aminoácidos de la proteína de
toxina de B.t.t. más 3 aminoácidos codificados por el
conector usado en la construcción del vector. La proteína truncada
se produjo a niveles elevados en E. Coli, pero no tenía
actividad frente al escarabajo de la patata del Colorado. pMON5441
produce una proteína que contiene 536 aminoácidos de la toxina de
B.t.t. La proteína truncada se produjo a niveles elevados en
E. Coli, pero no tenía actividad frente al escarabajo de la
patata del Colorado. pMON5449 contiene 582 aminoácidos de la
proteína de B.t.t. más dos aminoácidos codificados por el
conector usado en la construcción del vector. La proteína truncada
se produjo a niveles elevados en E. Coli, pero no tuvo
actividad frente al escarabajo de la patata del Colorado. pMON5448
contiene 640 aminoácidos de la proteína de B.t.t. más 2
aminoácidos codificados por el conector usado en la construcción del
vector. La proteína truncada se produjo a niveles muy elevados
mediante E. Coli, pero la proteína no tenía actividad frente
al escarabajo de la patata del Colorado. Estos resultados sugieren
que el C terminal de la proteína de toxina de B.t.t. es
necesario para la toxicidad hacia el escarabajo de la patata del
Colorado. Una deleción de solamente 4 aminoácidos (pMON5448) dio
lugar a una pérdida completa de actividad. Estos resultados son
directamente contrarios a la bibliografía descrita con respecto a
toxinas de B.t.t. de tipo lepidóptero.
Los demás genes de B.t.t. mutantes usados
para el análisis de los N terminales se muestran en las Figuras 9 y
10. Un análisis de la proteína producida por pMON5450 reveló que la
producción de la banda 3 en E. Coli fue debida a la
iniciación de la traducción en MET48 en lugar de un producto de
escisión de proteasa. Estudios de toxicidad mostraron también que la
banda 3 era tóxica. pMON5456 produce una proteína que comienza en el
aminoácido 48, con el aminoácido 49 cambiado de treonina a ácido
aspártico. Esta proteína se produjo a niveles elevados en E.
Coli y era tóxica hacia el escarabajo de la patata del Colorado.
pMON5452 produce una proteína que comienza en el aminoácido 77. Esta
proteína fue expresada en E. Coli, y tenía actividad frente
al escarabajo de la patata del Colorado. pMON5467 produce una
proteína que comienza en el aminoácido 99 y tiene dos aminoácidos
añadidos al N terminal (metionina y alanina). Esta proteína se
produjo en E. Coli y no exhibió actividad detectable frente
al escarabajo de la patata del Colorado, sin embargo, el nivel de
expresión de esta variante de deleción fue significativamente
inferior al de las demás variantes. Estos resultados sugieren que el
N terminal de la proteína de toxina de B.t.t. puede tolerar
deleciones. Una deleción de 76 aminoácidos exhibió toxicidad. Una
deleción de 99 aminoácidos, sin embargo, dio lugar a una pérdida de
toxicidad. pMON5460 contiene una mutación que cambió metionina en la
posición 48 a isoleucina para impedir la producción de la banda 3.
La toxicidad de la banda 1 producida por pMON5460 fue igual a la
toxicidad de la banda 3 producida por pMON5456.
El gen de toxina de B.t. var. tenebriones
contenido en pMON5420 fue modificado para la incorporación en
vectores de expresión de plantas. Se introdujo in situ BglII
justo aguas arriba del codón ATG, que especifica la iniciación de la
traducción de la proteína de toxina de B.t.t. de longitud
completa (denominada banda 1) usando el protocolo de mutagénesis
específico para el sitio de Kunkel (1985) como se describió
anteriormente. La secuencia del gen de toxina de B en la región del
iniciador ATG es:
ATGATAAGAAAGGGAGGAAGAAAAATGAATCCGAACAATCGAAGTGAACATGATACAATA
\hfillMetAsnProAsnAsnArgSerGluHisAspThrIle
El cebador para esta mutagénesis (bttbgl) era de
una longitud de 27 nucleótidos, y tiene la secuencia:
CGGATTCATT TTAGATCTTC
CTCCCTT
A continuación de la mutagénesis, un plásmido que
contenía el nuevo sitio BglII fue identificado mediante digestión
con BGlII, y el cambio fue verificado mediante análisis de secuencia
de DNA. El plásmido resultante contenía el gen de toxina de
B.t.t., en el que el nuevo sitio BglII fue designado pMON9758
(Figura 11).
El gen de toxina de B.t.t. en pMON9758 fue
insertado en el vector cassette de expresión pMON316 (Sanders et
al., 1987). pMON316 contiene el promotor CaMV35S y el extremo 3' del
gen nopalina sintasa (NOS) con un sitio BglII para la inserción de
genes entre estos dos elementos. El plásmido pMON9758 fue digerido
con BglII, y se aisló un fragmento de aproximadamente 2,3 kb. Este
fragmento se extiende desde el sitio BGlII justo aguas arriba del
codón ATG hasta un sitio BglII que se encuentra aproximadamente 350
bp aguas abajo del codón de terminación para el gen de toxina de
B.t.t. Por tanto, este fragmento contiene la secuencia
codificadora completa del gen de B.t.t. y también
aproximadamente 350 bp de secuencia no codificadora 3' respecto al
codón de terminación. Este fragmento BGlII fue ligado con pMON316
digerido con BglII. A continuación de la transformación en E.
Coli, se identificó una colonia en la que el gen de toxina de
B.t.t. fue insertado en pMON316, de forma que el extremo 5'
del gen de toxina era adyacente al promotor CaMV35S. Este plásmido
fue designado pMON9753. Se aisló un plásmido que contenía el gen de
toxina de B.t.t. en la orientación opuesta en pMON316 y fue
designado pMON9754 (Figura 11).
Tanto pMON9753 como pMON9754 fueron introducidos
mediante un procedimiento de apareamiento triparental en la cepa
Agrobacterium tumefaciens ASE que contiene un plásmido Ti
desarmado. Los cointegrados entre pMON9753 o pMON9754 y el plásmido
Ti desarmado fueron identificados como se describe por Fraley et al.
(1985), y sus estructuras fueron confirmadas mediante análisis
Southern de DNA de Agrobacterium total.
\newpage
Han sido construidos también vectores de
expresión de plantas adicionales que contienen el gen de toxina de
B.t.t. (véanse las Figuras 12 y 13). En estos vectores, el
gen de toxina de B.t.t. ha sido insertado en el vector de
expresión de plantas pMON893 (Figura 14). Haciendo referencia a la
Figura 14, el cassette de expresión pMON893 consiste en el promotor
CaMV35S intensificado y el extremo 3' que incluye señales de
poliadenilación a partir de un gen de soja que codifica la subunidad
alfa-prima de beta-conglicina
(denominada a continuación el "gen 7S"). Entre estos dos
elementos está un multi-conector que contiene
múltiples sitios de restricción para la inserción de genes.
El promotor CaMV35S intensificado fue construido
como sigue. Un fragmento del promotor CaMV35S que se extiende entre
la posición -343 y +9 fue previamente construido en pUC13 por Odell
et al. (1985). Este segmento contiene una región identificada por
Odell et al. (1985) que es necesaria para una expresión máxima del
promotor CaMV35S. Fue cortada como un fragmento
ClaI-HindIII, rematado en el extremo con DNA
polimerasa I (fragmento Klenow) y se insertó en el sitio HindII de
pUC18. La región aguas arriba del promotor 35S se cortó de este
plásmido en forma de un fragmento HindIII-EcoRV (que
se extiende desde -343 hasta -90) y se insertó en el mismo plásmido
entre los sitios HindIII y PstI. Por tanto, el promotor CaMV35S
intensificado contiene una duplicación de secuencias entre -343 y
-90 (véase la Figura 18).
El extremo 3' del gen 7S deriva del gen 7S
contenido en el clon designado 17,1 (Schuler et al., 1982). Este
fragmento del extremo 3', que incluye las señales de
poliadenilación, se extiende desde un sitio AvaII colocado
aproximadamente 30 bp aguas arriba del codón de terminación para el
gen beta-conglicinina en el clon 17,1 hasta un sitio
EcoRI colocado aproximadamente 450 bp aguas abajo de este codón de
terminación.
El resto del pMON893 contiene un segmento de
pBR322 que proporciona un origen de replicación en E. Coli y
una región para la recombinación homóloga con el
T-DNA desarmado en la cepa Agrobacterium ACO
(descrita a continuación). La región oriV del plásmido RK2 para un
amplio espectro de hospedantes; el gen de resistencia a la
estreptomicina/resistencia a la esprectinomicina de Tn7; un gen
NPTII quimérico, que contiene el promotor CaMV35S y el extremo 3'
nopalina sintasa (NOS), que proporciona resistencia a la kanamicina
en células transformadas de la planta.
pMON9753 contenía aproximadamente 400 bp de
secuencia no codificadora 3' más allá del codón de terminación. Como
esta región no es necesaria para la producción de toxinas, se separó
de los segmentos de genes de toxinas de B.t.t. insertados en
pMON893. Con el fin de crear un gen de toxina de B.t.t. que
no contenga la secuencia flanqueante en 3', se introdujo un sitio
BglII justo después del codón de terminación mediante el
procedimiento de Kunkel (1985). La secuencia del gen de toxina de
B.t.t. alrededor del codón de terminación es:
GTTTATATAGACAAAATTGAATTTATTCCAGTGAATTAAATTAACTAGAAAGTAAAGAAG
ValTyrIleAspLysIleGluPheIleProValAsnEnd
La mutagénesis se realizó con un cebador
(bttcterm) de secuencia:
CTTTCTAGTT AAAGATCTTT
AATTCACTG
La mutagénesis del gen de toxina de B.t.t.
se realizó en pMON9758. Un plásmido que contiene el nuevo sitio
BglII se designó pMON9787 (Figura 12). Como pMON9787 contiene un
sitio BglII justo aguas arriba del codón de iniciación ATG, la
secuencia codificadora completa para el gen de toxina de
B.t.t., esencialmente sin secuencia flanqueadora 5' o 3',
está contenida en un fragmento BglII de aproximadamente 1940 bp.
Este fragmento de 1940 bp se aisló a partir de
pMON9787 y se ligó con pMON893 digerido con BglII. Un plásmido en el
que el extremo 5' del gen de toxina de B.t.t. era adyacente
al promotor CaMV35S intensificado fue identificado y designado
pMON9791 (Figura 12).
Una variante de la toxina de B.t.t. de
longitud completa se produce en E. Coli a partir de un
segundo codón iniciador de metionina. Esta proteína, designada
"banda 3", se ha encontrado que es tóxica hacia el escarabajo
de la patata del Colorado en forma de la toxina de longitud completa
("banda 1"). Es posible, como era el caso para el gen de
B.t.k., que las formas truncadas del gen de B.t.t.
puedan ser más fácilmente expresadas en células de plantas. Por lo
tanto, se construyó un gen de toxina de B.t.t. modificado en
el que la región aguas arriba del codón ATG de la banda 3 había sido
separada. con el fin de separar esta secuencia, se insertó un sitio
BglII justo aguas arriba de la ATG de la banda 3 mediante el
procedimiento de Kunkel (1985). La secuencia que rodea a la ATG de
la banda 3 es:
CCAAATCCAACACTAGAAGATTTAAATTATAAAGAGTTTTTAAGAATGACTGCAGATAAT
ProAsnProThrLeuGluAspLeuAsnTyrLysGluPheLeuArgMetThrAlaAspAsn
La mutagénesis se realizó con cebador (bttnterm)
de secuencia:
ATCTGCAGTC ATTGTAGATC TCTCTTTATA
ATTT
\newpage
La mutagénesis con este cebador se realizó sobre
el gen de toxina de B.t.t. contenido en pMON5420. Un plásmido
que contenía el nuevo sitio BglII fue designado pMON9788. Un gen de
toxina de B.t.t. truncado que comenzaba en este sitio BglII
de la banda 3, y que se extendía hasta el sitio BglII justo distal
al codón de terminación encontrado en pMON9787, fue construido en
pMON893 como sigue. pMON9788 (Figura 13) fue digerido con BglII y
XbaI, y se aisló un fragmento de aproximadamente 1250 bp. Este
fragmento se extiende desde la ATG de la banda 3 hasta un sitio XbaI
único en el medio del gen de toxina de B.t.t. pMON9787 fue
digerido también con BglII y XbaI, y se aisló un fragmento de
aproximadamente 550 bp. Este fragmento se extiende desde el sitio
XbaI único en el medio del gen de la toxina hasta el sitio BglII
justo distal al codón de terminación. Estos dos fragmentos fueron
mezclados y ligados con pMON983 digerido con BglII. Se identificó un
plásmido en el que el extremo 5' respecto al gen de toxina era
adyacente al promotor CaMV35S intensificado y fue designado
pMON9792. pMON9792 contiene un derivado truncado
N-terminal del gen de toxina de B.t.t.
(Figura 13) que codifica solamente la banda 3.
Tanto pMON9791 como pMON9792 fueron introducidos
en la cepa A. tumefaciens ACO que contiene un plásmito Ti
desarmado. Los cointegrados han sido seleccionados y han sido usados
en la transformación de tomate y patata.
ACO es una cepa desarmada similar a pTiB6SE
descrita por Fraley et al. (1985). Para la construcción de ACO, la
cepa Agrobacterium de partida era la cepa A208, que contiene
un plásmido Ti de tipo nopalina. El plásmido Ti fue desarmado de una
manera similar a la descrita por Fraley et al. (1985) de forma que
esencialmente todo el T-DNA nativo fue separado,
excepto el borde izquierdo y unos pocos centenares de pares de bases
de T-DNA dentro del borde izquierdo. El resto del
T-DNA que se extiende hasta un punto justo más allá
del borde derecho, fue sustituido con un nuevo trozo de DNA que
incluye (de izquierda a derecha) un segmento de pBR322, la región
oriV de plásmido RK2, y el gen resistente a la kanamicina de Tn601.
Los segmentos pBR322 y oriV son similares a los segmentos en
pMON893, y proporcionan una región de homología para la formación de
cointegrados. La estructura del plásmido Ti de ACO se muestra en la
Figura 17.
El promotor MAS fue aislado a partir de pTiA6 en
forma de un fragmento EcoRI-ClaI de 1,5 kb. Este
fragmento de DNA se extiende desde el sitio ClaI en el nucleótido
20.138 hasta el sitio EcoRI en 21.631 en la secuencia de Barker et
al. (1983). Haciendo referencia a la Figura 15, el fragmento
EcoRI-ClaI fue ligado con el vector binario pMON505
(Horsch et al. 1986), que había sido previamente digerido con EcoRI
y ClaI. El plásmido resultante se designó pMON706. Un fragmento que
contenía el extremo 3' de NOS fue insertado aguas abajo del promotor
MAS para obtener un vector cassette de expresión en 3'
MAS-NOS. El fragmento en 3' NOS fue cortado de
pMON530 en forma de un fragmento BglII-BamHI de 300
bp, y fue insertado en pMON706 digerido con BglII. El plásmido
resultante fue designado pMON707.
El plásmido pMON530 fue construido mediante
escisión de pMON200 con NdeI para separar un fragmento NdeI de 900
bp para crear pMON503. El plásmido pMON503 fue escindido con HindIII
y SmaI y se mezcló con plásmido pTJS75 (Schmidhauser y Helinski,
1985) que había sido escindido también con HindIII y SmaI. Un
plásmido que contenía el fragmento HindIII-SmaI de
3,8 kb de pTJS75 unido al fragmento HindIII-SmaI de
8 kb de pMON503 fue aislado y designado pMON505. A continuación el
cassette CaMV35S-NOS3' fue transformado en pMON505
mediante escisión de pMON316 con StuI y HindII y aislamiento del
fragmento StuI-HindIII de 2,5 kb que contenía el
marcador NOS-NPTII'-NOS y el
cassette CaMV35S-NOS3'. Este se añadió a pMON505 DNA
escindido con StuI y HindIII. A continuación de la ligadura y
transformación, un plásmido que portaba el cassette
CaMV35S-NOS3' en pMON505 fue aislado y designado
pMON530.
Como algunos vectores binarios tienen frecuencias
grandemente reducidas de transformación en tomate si se compara con
vectores co-integrantes, (McCormick et al., 1986),
el cassette MAS-NOS 3' fue trasladado desde pMON707
al vector co-integrante pMON200 (Fraley et al.,
1985). El plásmido pMON200 fue digerido con StuI y HindIII y se
aisló un fragmento de 7,7 kb mediante electroforesis en gel de
agarosa. El plásmido pMON707 fue análogamente digerido con StuI y
HindIII, y se aisló un fragmento StuI-HindIII de 3,5
kb que contenía el cassette MAS-NOS 3' mediante
electroforesis sobre gel de agarosa y recuperación sobre unas
membranas DEAE con posterior elución con NaCl 1 M. Estos dos
fragmentos de DNA fueron ligados, y el plásmido resultante fue
designado pMON9741 (Figura 15). Este plásmido contiene el cassette
MAS-NOS 3' en el fondo co-integrante
de pMON200.
Los genes quiméricos de toxina de B.t.t.
guiados por el promotor MAS se preparan mediante digestión de
cualquiera de pMON9791 o pMON9792 con BglII, recuperando el
fragmento codificador de toxinas y trasladando este fragmento en
pMON9741, siguiendo las explicaciones proporcionadas en la presente
memoria descriptiva.
Estos vectores intermedios pueden ser usados para
transformar plantas que exhiben toxicidad hacia insectos coleópteros
susceptibles a la proteína de toxina de B.t.t.
\newpage
Las cepas A.tumefaciens
pMON9753-ASE y pMON9754-ASE fueron
usadas para transformar discos de hojas de tomate mediante el
procedimiento de McCormick et al. (1986). Las plantas de tomate
transformadas fueron recuperadas como se describe y se ensaya para
la resistencia a la kanamicina.
Plantas de tomate transformadas con gen de toxina
de B.t.t. contenido en pMON9753 fueron ensayadas en cuanto a
la expresión del gen de toxina mediante bioensayo con insectos de
escarabajos de la patata del Colorado (Leptinotarsa
decemlineata). Cortes de hojas de plantas que iban a ser
ensayadas fueron colocados en placas de petri que contenían papel de
filtro saturado con agua. Se añadieron diez o veinte insectos de
escarabajo de la patata recientemente eclosionados a los cortes de
hojas, y se dejaron alimentar sobre las hojas. Después de cuatro
días, los insectos fueron puntuados en cuanto a la mortalidad.
Además, los insectos fueron examinados en cuanto a evidencia de
velocidad de crecimiento ralentizada (atrofiamiento), y el tejido de
la hoja que permanece fue examinado para determinar el deterioro
relativo por la alimentación.
En cada experimento se incluyeron muchas plantas
no transformadas como testigos. Entre 50 y 100 plantas no
transformadas han sido ensayadas ahora como testigos. De estas
plantas testigos, más de 80% no muestran mortalidad para el
escarabajo de la patata; aproximadamente 15% proporcionan 10% de
mortalidad y 5% o menos muestran 20% de mortalidad. La mortalidad de
más de 20% no ha sido observada con una planta testigo.
La Tabla VI de a continuación resume los
resultados de toxicidad obtenidos con diversas plantas de tomate
transgénicas pMON9753.
| Planta | Resistencia a la kanamicina^{1} | Mortalidad del EPC (%) | ||
| Ens. Nº 1 | Ens. Nº 2 | Ens. Nº 3 | ||
| 794 | R | 30 | 20 | |
| 810 | n.d. | 50 | 20 | 40 |
| 871 | R | 30 | 10 (atrofiado) | |
| 886 | R | 50 | 40 | |
| 887 | n.d. | 20 | 30 | 30 |
| 1009 | n.d. | 50 | ||
| 1044 | R | 20 (atrofiado) | ||
| 1046 | R | 40 (atrofiado) | 20 |
EPC = escarabajo de la patata del
Colorado.
^{1}n.d. representa que no hay
datos.
Como se muestra en la Tabla VI, han sido
recuperadas diversas plantas que muestran consistentemente niveles
superiores de mortalidad de escarabajo de la patata del Colorado que
las plantas testigos no transformadas. Estos resultados sindican que
el gen de toxina de B.t.t. está siendo expresado a niveles
suficientes para destruir un número significativo de los insectos
que se alimentan de estas plantas.
Cultivos inclinados de brotes de cultivos de
patata de Kennebec son subcultivados en medios que contienen sales
MS mayores y menores, 0,17 g/l de
dihidrogeno-fosfato de sodio, 0,4 mg/l de
tiamina-HCl, 0,1 g/l de inositol, 3% de sacarosa,
2,0 g/l de Gelrite (Kelco Co.) a pH 5,6. Los cultivos se cultivan
durante 4 semanas a 24ºC en un fotoperíodo de 16 horas. Se cortan
internodos de tallo en longitudes de aproximadamente 8 mm y las
superficies cortadas son infectadas con Agrobacterium cepa
pMON9753-ASE que ha sido linealmente extendida en
una placa de agar LB y cultivada durante 2 a 3 días.
pMON9753-ASE que se describe anteriormente contiene
el gen quimérico de toxina de B.t.t. guiado por el promotor
CaMV35S. alternativamente, se usan cepas Agrobacterium
pMON9791-ACO o pMON9792-ACO que
contienen genes quiméricos de toxina de B.t.t. Las secciones
de tallo se colocan en medio solidificado en agar al 0,8% que
contiene sales y añadidos orgánicos, como en Jarret et al. (1980),
3% de sacarosa, 3 mg/l de BA y 0,1 mg/l de NAA a pH 5,6. Después de
4 días, los explantes son transferidos a un medio de la misma
composición, pero con carbenicillina a 500 mg/l y kanamicina como el
agente selectivo para células transformadas de la planta a 100 mg/l.
Cuatro semanas más tarde, los explantes son transferidos nuevamente
a un medio de la misma composición, pero con GA_{3} a 0,3 mg/l
como la única hormona. Los callos que se desarrollan en presencia de
100 mg/l de kanamicina se demuestra que contienen el enzima NPTII
cuando son ensayados mediante un ensayo de transferencia que indique
que las células de patata son transformadas. El tejido testigo sin
inocular es inhibido a esta concentración de kanamicina. El tejido
de patata transformado expresa el gen de toxina de B.t.t. El
mRNA de toxina de B.t.t. puede ser detectado mediante
análisis Northern, y la proteína de toxina de B.t.t. puede
ser detectada mediante inmunoensayo tal como el análisis de
transferencia Western. Sin embargo, en muchos casos el ensayo más
sensible para la presencia de toxina de B.t.t. es el
bioensayo de insectos. Las larvas de escarabajo de la patata del
Colorado que se alimentan con tejido transformado padecen los
efectos de la toxina.
Este procedimiento para producir células de
patata transformadas resistentes a la kanamicina ha sido usado
también satisfactoriamente para regenerar brotes. Los brotes que son
de 1 a 2 cm de longitud son retirados de los explantes y colocados
en el medio de mantenimiento del cultivo inclinado de brotes
descrito anteriormente, en el que los brotes arraigan
fácilmente.
Las plantas generadas de esta forma son ensayadas
en cuanto a la transformación valorando la expresión del enzima
NPTII y mediante la capacidad de los segmentos de tallo para formar
callos en medio que contiene kanamicina. Las plantas transformadas
expresan el gen de toxina de B.t.t. Puede ser detectado mRNA
de toxina de B.t.t. mediante análisis Northern y la proteína
de toxina de B.t.t. puede ser detectada mediante inmunoensayo
tal como análisis de transferencia Western. Las larvas de escarabajo
de la patata del Colorado que se alimentan en el tejido transformado
padecen los efectos de la toxina.
Semillas de algodón son esterilizadas
superficialmente empapándolas primero durante 10 minutos en una
solución detergente de agua a la que se ha añadido jabón Sparkleen,
seguidamente agitándola durante 20 minutos en una solución de
Chlorox al 30% que contenía 2 gotas de Tween 20 por 40 ml antes de
aclararlas dos veces con agua destilada estéril. Las semillas se
empapan seguidamente en benolato al 0,4% durante 10 minutos. El
benolato se vierte antes de colocar las semillas asépticamente en
sales MS de resistencia media solidificadas en agar. Las semillas
son germinadas durante 3-10 días en la oscuridad a
32ºC. Los cotiledones e hipocotilos se separan seguidamente
asépticamente y se segmentan. Los segmentos se colocan en 1) medio
MS solidificado en agar que contiene 3% de glucosa, 2 mg/l de ácido
naftaleno-acético (NAA) y 1 mg/l de kinetina (medio
MSS) o 2) medio MS solidificado en Gelrite que contiene 3% de
glucosa, vitaminas B5, 100 mg/l de inositol, 0,75 mg/l de
MgCl_{2}, 0,1 mg/l de ácido diclorofenoxi-acético
(2,4-D) y 0,1 ó 0,5 mg/l de kinetina (medio MST). El
callo se mantiene en fotoperíodo de 16/8 a 28ºC en cualquiera de
estos medios hasta que se inicie la embriogénesis. El subcultivo del
callo embriogénico se hace en el mismo medio que para la iniciación,
pero conteniendo 3% de sacarosa en lugar de glucosa. Los embriones
somáticos son germinados trasladándolos a un medio de Stewart
solidificado en Gelrite sin reguladores del crecimiento de plantas,
pero conteniendo 0,75 g/l de MgCl_{2}. Los embriones germinados se
trasladan a tierra en una cámara de cultivo en la que continúan
cultivándose. Las plantas se trasladan seguidamente al invernadero
con el fin de asentar la semilla y la flor.
La transformación de tejidos de algodón y la
producción de callos y plantas transformados se realiza como sigue.
Se preparan plantones asépticos como para la regeneración de
plantas. Los segmentos de hipocotilos y cotiledones son inoculados
con cultivos líquidos de Agrobacterium durante una noche o
con Agrobacterium cultivado en placas nutrientes. Los
explantes son conjuntamente cultivados durante 2-3
días en medio MSS o MST que contiene 1/10 la concentración de sales
de MS. Los explantes son transferidos en papel de filtro para
separar las bacterias en exceso y se colocan en placas sobre medio
MSS o MSN que contienen 500 mg/l de carbenicillina y
30-100 mg/l de kanamicina. El callo que es
transformado se cultivará en este medio y producirá embriones. Los
embriones se cultivan en forma de plantas como se estableció para la
regeneración. Las plantas son ensayadas en cuanto a la
transformación mediante la valoración de la expresión de NPTII.
Cuando la cepa Agrobacterium usada para la
transformación contiene un gen quimérico de toxina de B.t.t.
tal como pMON9753, pMON9791 o pMON9792, el gen de toxina de
B.t.t. es expresado en el callo transformado, embriones
derivados de este callo y en las plantas transformadas derivadas de
los embriones. Para todos estos casos, la expresión del mRNA de
toxina de B.t.t. puede ser detectado mediante análisis
Northern, y la expresión de la proteína de toxina de B.t.t.
puede ser detectada mediante inmunoensayo tal como análisis de
transferencia Western. El bioensayo de insectos puede ser la medida
más sensible para la presencia de proteína de toxina.
La toxicidad hacia insectos del callo, embriones
o plantas se ensaya mediante bioensayo con larvas de gorgojo del
algodón (Anthonomous grandis). Las larvas de gorgojo del
algodón que se alimentan en las células o plantas de algodón
transformadas que expresan el gen de toxina de B.t.t. padecen
los efectos de la toxina.
La siguiente descripción indica la preparación de
protoplastos a partir de maíz, la introducción de genes quiméricos
de toxinas de B.t.t. en los protoplastos mediante
electroporación y la recuperación de células de maíz resistentes a
la kanamicina, establemente transformadas, que expresan genes
quiméricos de toxinas de B.t.t.
Se preparan protoplastos a partir de una línea de
suspensión de maíz en dulce mejicano negro (BMS), BMSI (ATCC 54022)
como se describe por Fromm et al. (1985 y 1986). Las células en
suspensión en BMSI se cultivan en medio BMS que contiene sales MS,
20 g/l de sacarosa, 2 mg/l de ácido
(2,4-diclorofenoxi)-acético, 200
mg/l de inositol, 130 mg/l de asparagina, 1,3 mg/l de niacina, 0,25
mg/l de tiamina, 0,25 mg/l de piridoxina, 0,25 mg/l de pantotenato
de calcio, pH 5,8. Cultivos de cuarenta ml en matraces erlenmeyer de
125 ml se agitan a 150 rpm a 126ºC. El cultivo se diluye con un
volumen igual de medio reciente cada 3 días. Los protoplastos son
aislados a partir de células en crecimiento activo 1 a 2 días
después de añadir el medio reciente. Para el aislamiento de
protoplastos, las células son sedimentadas a 200 x g en una
centrífuga de sobremesa de cangilones oscilantes. El material
sobrenadante se recupera como medio acondicionado para cultivar los
protoplastos. Seis ml de células envasadas se vuelven a poner en
suspensión en 40 ml de manitol 0,2 M/CaCl_{2} 50 mM/acetato de
sodio 10 mM que contiene 1% de celulasa, 0,5% de hemicelulasa y
0,02% de peptinasa. Después de incubar durante 2 horas a 26ºC, los
protoplastos se separan por filtración a través de un tamiz de malla
de nilón de 60 \mum, se centrifugan a 200 x g, y se lavan una vez
en la misma solución sin enzimas.
Los protoplastos se preparan para la
electroporación lavando en una solución que contiene fosfato de
potasio 2 mM a pH 7,1, cloruro de calcio 4 mM, cloruro de sodio 140
mM y manitol 0,2 M. Después de lavar, los protoplastos se vuelven a
poner en suspensión en la misma solución a una concentración de 4 x
10^{6} protoplastos por ml. Medio ml de la solución que contiene
protoplastos se mezcla con 0,5 ml de la misma solución que contiene
50 microgramos de la misma solución que contiene 50 microgramos de
DNA de vector de plásmido supercoloide y se coloca en una cubeta de
electroporación de 1 ml. La electroporación se lleva a cabo como se
describe por Fromm et al. (1986). Como se describe, se suministra
una pulsación eléctrica de un capacitor de 122 ó 245 microfaradios
cargado a 220 V. Después de 10 minutos a 4ºC, y 10 minutos a
temperatura ambiente, los protoplastos se diluyen con 8 ml de medio
que contiene sales MS, manitol 0,3 M, 2% de sacarosa, 2 mg/l de
2,4-D, 20% de medio BMS acondicionado (véase lo que
antecede) y 0,1% de agarosa de bajo punto de fusión. Después de 2
semanas en la oscuridad a 26ºC, se añade medio sin manitol y que
contiene kanamicina para proporcionar una concentración final de
kanamicina de 100 mg/l de líquido. Después de 2 semanas adicionales,
se retiran los microcallos del líquido y se colocan en un disco de
filtro de membrana sobre medio solidificado en agarosa que contiene
100 mg/l de kanamicina. Aparecen callos resistentes a la kanamicina
compuestos por células de maíz transformadas después de
aproximadamente 1-2 semanas.
Como se describe por Fromm et al. (1986), las
células de maíz transformadas pueden ser seleccionadas mediante
cultivo en medio que contiene kanamicina después de electroporación
con vectores de DNA que contienen genes resistentes a la kanamicina
quiméricos compuestos por el promotor CaMV35S, la región
codificadora NPTII y el extremo NOS 3'. pMON9791 y pMON9792
contienen tales genes NPTII quiméricos y contienen también genes
quiméricos de toxina de B.t.t. Como se describió
anteriormente, los protoplastos de maíz son transformados mediante
electroporación con vectores de DNA, en los que los vectores de DNA
son pMON9791 o pMON9792. Después de la selección en cuanto a la
resistencia a la kanamicina, las células de maíz transformadas son
ensayadas en cuanto a la expresión del gen de toxina de
B.t.t. Los ensayos se realizan en cuanto al mRNA de
B.t.t. mediante análisis por transferencia Northern y en
cuanto a la proteína de toxina de B.t.t. mediante
inmunoensayo tal como análisis de transferencia Western.
Los ensayos en cuanto a la toxicidad hacia
insectos se realizan alimentando larvas de gusanos de la raíz de
maíz Southern (Diabrotica undecimpunctata howardi) con callos
de maíz transformados. Alternativamente, se prepara un extracto de
proteínas que contiene la proteína de toxina de B.t.t. a
partir de células de maíz transformadas, y este extracto se
incorpora en una dieta apropiada para insectos con la que se
alimentan las larvas de gusanos de raíz de maíz Southern. Las larvas
de gusanos de raíz que se alimentan de los tallos transformados o de
los extractos de proteínas de tales callos padecen los efectos de la
toxina.
Los ejemplos anteriores se proporcionan para
aclarar mejor la práctica de la presente invención y no están
concebidos, en modo alguno, para limitar el alcance de la presente
invención.
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Corporation Cat. #N4502.
Claims (38)
1. Un gen quimérico, que comprende en
secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (c)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA.
2. Un gen quimérico, que comprende en
secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (48-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (c)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA.
3. Un gen quimérico, que comprende en
secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (50-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (c)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA.
4. Un gen quimérico, que comprende en
secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (58-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (c)
- una secuencia de DNA no traducida en 3', que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA.
5. Un gen quimérico, que comprende en
secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (77-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (c)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA.
6. El gen de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5,
en el que el promotor se selecciona entre el grupo que consiste en
promotor CaMV35S, promotor MAS y promotores ssRUBISCO.
7. El gen de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5,
en el que el promotor es el promotor CaMV35S.
8. El gen de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5,
en el que el promotor es el promotor manopina sintasa.
9. El gen de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5,
en el que la secuencia de DNA no traducida en 3' es de un gen de
proteína de almacenamiento de soja.
10. El gen de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó
5, que comprende adicionalmente una secuencia intensificadora 5' del
promotor.
11. El gen de la reivindicación 10, en el que el
promotor es el promotor CaMV35S y la secuencia intensificadora tiene
la secuencia de nucleótidos de los residuos 27-279
como se muestra en la Figura 18.
12. Un procedimiento para producir una plana
genéticamente transformada, que exhibe toxicidad hacia insectos
coleópteros, que comprende las etapas de:
- (a)
- insertar en el genoma de una célula de una planta un gen quimérico que comprende en secuencia:
- (i)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (ii)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10, y
- (iii)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;
- (b)
- obtener células transformadas de la planta; y
- (c)
- regenerar a partir de las células transformadas de la planta, plantas genéticamente transformadas que exhiben resistencia a insectos coleópteros;
en el que la planta se selecciona entre el grupo
formado por tomate, patata y
algodón.
13. Un procedimiento para producir una planta
genéticamente transformada, que exhibe toxicidad hacia insectos
coleópteros, que comprende las etapas de:
- (a)
- insertar en el genoma de una célula de una planta un gen quimérico que comprende en secuencia:
- (i)
- un promotor que actúe en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (ii)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (48-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (iii)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;
- (b)
- obtener células transformadas de la planta; y
- (c)
- regenerar a partir de las células transformadas de la planta, plantas genéticamente transformadas que exhiben resistencia a insectos coleópteros;
en el que la planta se selecciona entre el grupo
formado por tomate, patata y
algodón.
14. Un procedimiento para producir una planta
genéticamente transformada, que exhibe toxicidad hacia insectos
coleópteros, que comprende las etapas de:
- (a)
- insertar en el genoma de una célula de una planta, un gen quimérico que comprende en secuencia:
- (i)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (ii)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (50-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numeradas como se muestra en la Figura 10; y
- (iii)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;
- (b)
- obtener células transformadas de la planta; y
- (c)
- regenerar a partir de las células transformadas de la planta, plantas genéticamente transformadas que exhiben resistencia a insectos coleópteros;
en el que la planta se selecciona entre el grupo
formado por tomate, patata y
algodón.
15. Un procedimiento para producir una planta
genéticamente transformada, que exhibe toxicidad hacia insectos
coleópteros, que comprende las etapas de:
- (a)
- insertar en el genoma de una célula de una planta un gen quimérico que comprende en secuencia:
- (i)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (ii)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (58-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (iii)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;
- (b)
- obtener células transformadas de la planta; y
- (c)
- regenerar a partir de las células transformadas, plantas genéticamente transformadas que exhiben resistencia a insectos coleópteros;
en el que la planta se selecciona entre el grupo
formado por tomate, patata y
algodón.
16. Un procedimiento para producir una planta
genéticamente transformada, que exhibe toxicidad hacia insectos
coleópteros, que comprende las etapas de:
- (a)
- insertar en el genoma de una célula de una planta un gen quimérico que comprende en secuencia:
- (i)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (ii)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (77-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (iii)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúe en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;
- (b)
- obtener células transformadas de la planta; y
- (c)
- regenerar a partir de las células de las plantas transformadas, plantas genéticamente transformadas que exhiben resistencia a insectos coleópteros;
en el que la planta se selecciona entre el grupo
formado por tomate, patata y
algodón.
17. El procedimiento de las reivindicaciones 12,
13, 14, 15 ó 16, en el que el promotor se selecciona entre el grupo
que consiste en promotor CaMV35S, promotor MAS y promotores
ssRUBISCO.
18. El procedimiento de las reivindicaciones 12,
13, 14, 15 ó 16 en el que el promotor es el promotor CaMV35S.
19. El procedimiento de las reivindicaciones 12,
13, 14, 15 ó 16, en el que el promotor es el promotor manopina
sintasa.
20. El procedimiento de las reivindicaciones 12,
13, 14, 15 ó 16, en el que la secuencia de DNA no traducida en 3' es
de un gen de proteína de almacenamiento de soja.
21. El procedimiento de las reivindicaciones 12,
13, 14, 15 ó 16, que comprende adicionalmente una secuencia
intensificadora 5' del del promotor.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en
el que el promotor es el promotor CaMV35S y la secuencia
intensificadora tiene la secuencia de nucleótidos de los residuos
27-279 como se muestra en la Figura 18.
23. Una célula de planta transformada, que
contiene un gen quimérico que comprende en secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
\newpage
- (c)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;
en la que la célula de planta transformada no es
una célula de una planta
dicotiledonea.
24. Una célula de planta transformada, que
contiene un gen quimérico que comprende en secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (48-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (c)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;
en la que la célula de planta transformada no es
una célula de una planta
dicotiledonea.
25. Una célula de planta transformada, que
contiene un gen quimérico que comprende en secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebriones que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (50-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (c)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;
en la que la célula de planta transformada no es
una célula de una planta
dicotiledonea.
26. Una célula de planta transformada, que
contiene un gen quimérico que comprende en secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacilluss thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (58-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (c)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;
en la que la célula de planta transformada no es
una célula de una planta
dicotiledonea.
27. Una célula de planta transformada, que
contiene un gen quimérico que comprende en secuencia:
- (a)
- un promotor que actúa en las plantas para provocar la producción de RNA;
- (b)
- una secuencia de DNA que codifica proteína de toxina de tipo coleóptero de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos (77-644) de dicha proteína, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína están numerados como se muestra en la Figura 10; y
- (c)
- una secuencia de DNA no traducida en 3' que actúa en las células de las plantas para provocar la adición de poliadenilato nucleótidos al extremo 3' de la secuencia de RNA;
en la que la célula de planta transformada no es
una célula de una planta
dicotiledonea.
28. La célula de planta transformada de las
reivindicaciones 23, 24, 25, 26 ó 27, que contiene un gen en el que
el promotor se selecciona entre el grupo que consiste en promotor
CaMV35S, promotor MAS y promotores ssRUBISCO.
29. La célula de planta transformada de las
reivindicaciones 23, 24, 25, 26 ó 27, que contiene un gen en el que
el promotor es el promotor CaMV35S.
30. La célula de planta transformada de las
reivindicaciones 23, 24, 25, 26 ó 27, en la que la planta se
selecciona entre el grupo que consiste en tomate, patata y
algodón.
\newpage
31. Una célula de planta transformada que expresa
la proteína de toxina de Bacillus thuringiensis var.
tenebrionis que tiene la secuencia de aminoácidos de los
residuos (48-644) de la proteína de longitud
completa, en la que los residuos de aminoácidos de dicha proteína de
longitud completa están numerados como se muestra en la Figura
10,
y en la que la célula de planta transformada no
es una célula de una planta
dicotiledonea.
32. Una planta diferenciada, que exhibe toxicidad
hacia insectos coleópteros susceptibles, que comprende células
transformadas de la planta de las reivindicaciones 23, 24, 25, 26 ó
27, en la que la planta se selecciona entre el grupo formado por
tomate, patata y algodón.
33. Una planta transformada que expresa la
proteína de toxina de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis
que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos
(48-644) de la proteína de longitud completa, en la
que los residuos de aminoácidos de dicha proteína de longitud
completa están numerados como se muestra en la Figura 10, en la que
la célula de planta transformada no es una célula de una planta
dicotiledonea.
34. Una semilla, que contiene un gen quimérico de
las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, en la que la planta se
selecciona entre el grupo formado por tomate, patata y algodón.
35. Una proteína de toxina sustancialmente pura
de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la
secuencia de aminoácidos de los residuos (16-644) de
la proteína de longitud completa, en la que los residuos de
aminoácidos de dicha proteína de longitud completa están numerados
como se muestra en la Figura 10.
36. Una proteína de toxina sustancialmente pura
de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la
secuencia de aminoácidos de los residuos (48-644) de
la proteína de longitud completa, en la que los residuos de
aminoácidos de dicha proteína de longitud completa están numerados
como se muestra en la Figura 10.
37. Una proteína de toxina sustancialmente pura
de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la
secuencia de aminoácidos de los residuos (58-644) de
la proteína de longitud completa, en la que los residuos de
aminoácidos de dicha proteína de longitud completa están numerados
como se muestra en la Figura 10.
38. Una proteína de toxina sustancialmente pura
de Bacillus thuringiensis var. tenebrionis que tiene la
secuencia de aminoácidos de los residuos (77-644) de
la proteína de longitud completa, en la que los residuos de
aminoácidos de dicha proteína de longitud completa están numerados
como se muestra en la Figura 10.
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