JP2001513323A - シュードモナス・シリンガエ由来の過敏感反応エリシターおよびその使用 - Google Patents

シュードモナス・シリンガエ由来の過敏感反応エリシターおよびその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物において過敏感反応を誘起する単離されたタンパク質またはポリペプチドに加え、過敏感反応を誘起するタンパク質またはポリペプチドをコードしている単離されたDNA分子に関する。この単離されたタンパク質またはポリペプチドならびに単離されたDNA分子を用いて、植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物体上の昆虫を防除することができる。これは、非感染型の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを、病気抵抗性を付与し、植物生育を強化し、および／または植物上または植物種子から生育させた植物上で昆虫を防除するのに効果的な条件下で、植物または植物種子に適用することによって達成することができる。または過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードしているDNA分子で形質転換されたトランスジェニック植物または植物種子を提供し、かつトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物種子から得た植物を、病気抵抗性を付与し、植物生育を強化し、および／または植物上または植物種子から生育させた植物上で昆虫を防除するのに効果的な条件下で生育する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、全米科学財団助成金（National Science Foundation Grant）No.MC
B 9631530の政府資金により開発された。政府は一定の権利を有し得る。
【０００２】 本明細書は、米国特許出願第60/055,107号と称される。
【０００３】発明の分野 本発明はシュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)由来の過敏感反
応エリシターおよびその使用に関する。
【０００４】発明の背景 病原菌とその植物宿主の間の相互作用は、一般に次の２つの範疇に収まる：(1
)適合性（病原菌−宿主）、宿主植物における、細胞内細菌増殖、徴候発現およ び病気の発症につながる；および(2)不適合性（病原菌−非宿主）、過敏感反応 をもたらし、病気の徴候の進行を伴うことなく、特定の型の不適合性の相互作用
が生じる。宿主植物との適合性のある相互作用の間には、細菌数は劇的に増加し
、かつ進行性の徴候が生じる。不適合性の相互作用の間には、細菌数は増加せず
、かつ進行性の徴候も生じない。
【０００５】 過敏感反応(「HR」)は、多くの病原菌に対する植物の能動的防御に関連してい
る急性の局所的壊死である（Kiraly, Z.、「侵略者によって惹起された防御：過
敏感（“Defenses Triggered by the Invader:Hypersensitivity”）」、201〜2
24頁、Plant Disease:An Advanced Treatise、第5巻、J.G. HoesfallとE.B. Cow
lingの編集、アカデミックプレス社、ニューヨーク、1980年；Klement, Z.、「 過敏感(“Hypersensitivity”)」、149〜177頁、Phytopathogenic Prokaryotes 、第2巻、M.S. MountとG.H. Lacyの編集、アカデミックプレス社、ニューヨーク
、1982年）。細菌によって誘起された過敏感反応は、高濃度の（≧107細胞／ml ）シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)またはエルウィニア・ア
ミローボラ(Erwinia amylovora)のような宿主範囲が限定された病原菌が非宿主 植物の葉へと浸潤する場合に、組織の崩壊として容易に認められる（低濃度の接
種では単離された植物細胞においてのみ壊死が生じる）（Klement, Z.、「植物 病原菌シュードモナスの病原性の迅速な検出（“Rapid Detection of Pathogeni
city of Phytopathogenic Pseudomonads”）」、Nature、199:299-300；Klement
ら、「タバコ葉における植物病原菌によって誘導された過敏感反応（“Hypersen
sitive Reaction Induced by Phytopathogenic Bacteria in the Tabacco Leaf ”）」、Phytopathology、54:474-477(1963)；Turnerら、「過敏感反応に関連し
た植物と細菌細胞の間の量的関係（“The Quantitative Relation Between Plan
t and Bacterial Cells Involved in the Hypersensitive Reaction”）」、Phy topathology 、64:885-890(1974)；Klement, Z.、「過敏感（Hypersensitivity）
」、Phytopathogenic Prokaryotes、149〜177頁、第2巻、M.S.MountとG.H.Lacy の編集、アカデミックプレス社、ニューヨーク、1982年）。非宿主において過敏
感反応を誘起する能力と宿主において病原性となる能力は関連しているように見
える。Klement, Z.の論文（「過敏感（Hypersensitivity）」、Phytopathogenic Prokaryotes 、149〜177頁、第2巻、M.S.MountとG.H.Lacyの編集、アカデミック
プレス社、ニューヨーク）に記されたように、これらの病原菌は更に、適合宿主
との相互作用において、遅延型ではあるが生理学的に類似した壊死も生じる。更
に過敏感反応または病原性を生じる能力は、hrpと称される共通の遺伝子セット に依存している（Lindgren, P.B.ら、「マメ科植物の病原性および非宿主植物の
過敏感を制御するシュードモナス・シリンガエ病原型ファセオリコラの遺伝子ク
ラスター（“Gene Cluster of Pseudomonas syringae pv.'phaseolicola' Contr
ols Pathogenicity of Bean Plants and Hypersensitivity on Nonhost Plants ”）」、J. Bacteriol.、168:512-22(1986)；Willis, D.K.ら、「植物病原菌のh
rp遺伝子（“hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria”）」、Mol.Plant-Micro be Interact. 、4:132-138(1991)）。結論としては、過敏感反応は、植物防御の 性質および細菌の病原性の基本の両方についての手がかりとなり得る。
【０００６】 hrp遺伝子は、グラム陰性の植物病原菌に広範に存在し、ここでこれらはクラ スター化され、保存され、一部は相互交換可能である（Willis, D.K.ら、「植物
病原菌のhrp遺伝子(hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria)」、Mol.Plant-Mi crobe Interact. 、4:132-138(1991)；Bonas, U.、「植物病原菌のhrp遺伝子(hrp
Genes of Phytopathogenic Bacteria)」、79〜98頁、Current Topics in Micro biology and Immunology:Bacterial Pathogenesis of Plants and Animal-Molec ular and Cell Mechanisms 、J.L. Dangle編集、スプリンガー−ベルラグ社、ベ ルリン(1994)）。いくつかのhrp遺伝子は、エルシニア、シゲラ、およびサルモ ネラ種が動物の病気に必須のタンパク質を分泌する際に使用するものに類似した
タンパク質分泌経路の成分をコードしている（Van Gijsegemら、「植物と動物の
病原菌の間の病原性の決定因子の発展的保存（“Evolutionary Conservation of
Pathogenicity Determinats Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria” ）」、Trends Microbiol.、1:175-180(1993)）。E.アミローボラ、P.シリンガエ
およびP.ソラナセアラム(P. solanacearum)において、hrp遺伝子は、過敏正反応
のグリシンが豊富なタンパク質エリシターの産生と分泌を制御することが示され
た（He, S.Y.ら、「シュードモナス・シリンガエ病原型シリンガエ・ハーピンPs s ：Hrp経路によって分泌され、植物の過敏感反応を誘起するタンパク質（“Pseu
domonas Syringae pv. Syringae HarpinPss : a Protein that is Secreted via
the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants”）」
、Cell、73:1255-1266(1993)；Wei, Z.H.ら、「エルウィニア・アミローボラのH
rpIは、ハーピン分泌に機能し、かつ新たなタンパク質ファミリーである(HrpI o
f Erwinia amylovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of
a New Protein Family)」、J.Bacteriol.、175:7958-7967(1993)；Arlat, M.ら 、「ペチュニアの特定の遺伝子型において過敏感様反応を誘起するタンパク質で
あるPopA1は、シュードモナス・ソラナセアラムのHrp経路によって分泌される(P
opA1, a Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Specific
Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solan
acearum)」、EMBO J.、13:543-553(1994)）。
【０００７】 これらのタンパク質は最初に、バラ科の植物日焼けを引き起こす細菌であるE.
アミローボラEa321において発見され、ハーピンと称された（Wei, Z.M.ら、「植
物病原菌エルウィニア・アミローボラによって産生される過敏感反応エリシター
であるハーピン(Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced
by the Plant Pathogen Erwinia amylovora)」、Science、257:85-88(1992)）。
hrpN遺伝子をコードしている変異は、E.アミローボラが非宿主であるタバコの葉
において過敏感反応を誘起し、かつ非常に罹病性であるナシ果実において病気の
徴候を刺激するためにハーピンが必要とされることを明らかにした。P.ソラナセ
アラムGMI1000 PopA1タンパク質は、同様の生理的特性を有し、同じくこの菌株 の宿主ではないタバコの葉において過敏感反応を誘起する（Arlatら、「ペチュ ニアの特定の遺伝子型において過敏感様反応を誘起するタンパク質であるPopA1 は、シュードモナス・ソラナセアラムのHrp経路によって分泌される」、EMBO J. 、13:543-53(1994)）。しかし、P.ソラナセアラムpopA変異株は、依然タバコに おいて過敏感反応を誘起し、かつトマトにおいて病気を刺激する。従って、これ
らのグリシンが豊富な過敏感反応エリシターの役割は、グラム陰性植物病原菌に
おいて広範に変動し得る。
【０００８】 別の植物病原性の過敏感反応のエリシターが、単離され、クローニングされ、
かつ配列決定されている。これらは以下を含む：エルウィニア・クリサンセミ(E
ewinia chrysanthemi)（Bauerら、「エルウィニア・クリサンセミのハーピンEch ：腐朽病原菌(Erwinia chrysanthemi HarpinEch : Soft-Rot Pathogenesis)」、 MPMI 、8(4):484-91(1995)；エルウィニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora) （Cuiら、「エルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ菌株Ecc71のRsmA-変 異株は、タバコの葉でhrpNEccを過剰発現し、過敏感反応様反応を誘起する(The
RsmA- Mutants of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overe
xpress hrpNEcc and Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tab
acco Leaves)」、MPMI、9(7):565-73(1966)；エルウィニア・ステワルティイ(Er
winia stewartii)（Ahmadら、「ハーピンはエルウィニア・ステワルティイのト ウモロコシに対する病原性には不要である(Harpin is not Necessary for the P
athogenicity of Erwinia stewartii)」、8th Int'l Cong. Molec. Plant-Micro b. Inter 、1996年7月14-19日、およびAhmadら、「ハーピンはエルウィニア・ス テワルチのトウモロコシに対する病原性には不要である(Harpin is not Necessa
ry for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize)」、Ann.Mtg.AmPhy topath.Soc. 、1996年7月27-31日）；および、シュードモナス・シリンガエ病原 型シリンガエ（コーネル研究財団(Cornell Research Foundation, Inc.)に付与 された国際公開公報第94/26782号））。
【０００９】 本発明は更に、植物病原体からの過敏感反応エリシターのタンパク質またはポ
リペプチドを同定し、クローニングし、かつ配列決定する点で更なる進歩がある
。
【００１０】発明の概要 本発明は、植物において過敏感反応を誘起する単離されたタンパク質またはポ
リペプチド、更には過敏感反応を誘起するタンパク質またはポリペプチドをコー
ドしている単離されたDNA分子に関する。
【００１１】 過敏感反応を誘起するタンパク質またはポリペプチドを使用して、植物に病気
抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または昆虫を防除することがで
きる。このことは、非感染型の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプ
チドを、病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物上また
は植物種子から生育させた植物上で昆虫を防除するのに有効な条件下で、植物ま
たは植物種子に適用することに関する。
【００１２】 病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物上で昆虫を防
除するために過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを植物体また
は植物種子に適用する代わりに、トランスジェニック植物または植物種子を利用
することができる。トランスジェニク植物を利用する場合は、これは過敏感反応
エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードしているDNAで形質転換され たトランスジェニク植物を提供すること、および病気抵抗性を付与し、植物の生
育を強化し、および／または植物上または植物種子から生育した植物において昆
虫を防除するのに有効な条件下で植物を生育することに関連している。または、
過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードしているDNA分子 で形質転換されたトランスジェニック植物種子を提供し、土壌中に植えることが
できる。その後植物は、病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／ま
たは植物上または植物種子から生育した植物上の昆虫を防除するのに有効な条件
下で繁殖される。
【００１３】発明の詳細な説明 本発明は、下記の配列番号：1のヌクレオチド配列を有する単離されたDNA分子
に関する。
【００１４】
【００１５】 このDNA分子は、dspE遺伝子として知られている。本発明のこの単離されたDNA
分子は、下記の配列番号：2のアミノ酸配列を有する、植物病原菌の過敏感反応 を誘起するタンパク質またはポリペプチドをコードしている。
【００１６】
【００１７】 このタンパク質またはポリペプチドは、約42.9kDaである。
【００１８】 前述の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質の断片も、本発明
に含まれている。
【００１９】 適当な断片を、いくつかの方法によって作出することができる。まず、通常の
分子遺伝学的操作によって遺伝子断片をサブクローニングして、本発明のエリシ
タータンパク質をコードする遺伝子のサブクローンを作り出す。そして、このサ
ブクローンを、インビトロ、または細菌細胞の中でインビボで発現させ、下記で
説明する手順にしたがって、エリシター活性について調べることのできる比較的
小さなタンパク質またはペプチドを得る。
【００２０】 または、キモトリプシン、スタフィロコッカスプロテイナーゼA、またはトリ プシンなどのタンパク質分解酵素によって、全長のエリシタータンパク質を消化
して、エリシタータンパク質の断片を作出することができる。異なったタンパク
質分解酵素は、エリシタータンパク質のアミノ酸配列にもとづいて、異なった部
位でエリシタータンパク質を切断する可能性が高い。タンパク質分解によって生
じる断片のいくつかが、抵抗性の活性エリシターである可能性がある。
【００２１】 別の方法において、タンパク質の一次構造に関する知識に基づいて、タンパク
質の特定の部位を表すよう選択された特異的なプライマーセットとともに、PCR 技術を用いて、エリシタータンパク質遺伝子の断片を合成することができる。そ
して、短くなったペプチドまたはタンパク質の発現を増加させるために、適当な
ベクターの中に、これらをクローニングすることができる。
【００２２】 化学合成を用いて、適当な断片を作成することもできる。このような合成は、
産生されるエリシターに対する既知のアミノ酸配列を用いて行われる。または、
全長エリシターを高温高圧にかけると断片ができる。そして、これらの断片を、
常法（例えば、クロマトグラフィー、SDS-PAGE）によって分離できる。
【００２３】 変異型は、さらに（または、代りに）、例えば、ポリペプチドの特性、二次構
造、および水感応性に最小限の影響しか与えないようなアミノ酸を欠失または付
加して改変することができる。例えば、ポリペプチドには、タンパク質のN末端 に、翻訳と同時に、または翻訳後にタンパク質の移行を指令するシグナル（また
は先導）配列を結合させることができる。また、ポリペプチドには、ポリペプチ
ドの合成、精製、または同定を容易にするためのリンカー、またはその他の配列
を結合させてもよい。
【００２４】 適当なDNA分子は、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDNA分子に、ストリ ンジェントな条件下でハイブリダイズしたものである。適当な高度にストリンジ
ェントな条件とは、ハイブリダイゼーションが、1M NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.
4、10mM EDTA、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、0.2％フィコール、0.2％ポリビ ニルピロリドン、0.2％ウシ血清アルブミン、50μmg/ml E.coli DNAを含有する 培地中において、65℃で20時間行われることである。しかし、このようなストリ
ンジェントな条件下で配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDNA分子にハイブリ
ダイゼーションされるいずれのDNA分子も、以下のものの過敏感反応エリシター タンパク質またはポリペプチドをコードしている核酸と同じであってはならない
：E.アミローボラ（本明細書中に参照として組入れられているWei, Z.M.らの論 文、「植物病原菌エルウィニア・アミローボラによって産生される過敏感反応エ
リシターであるハーピン」、Science、257:85-88(1992)に記されたもの）、エル
ウィニア・クリサンセミ（本明細書に参照として組入れられているBauerらの論 文、「エルウィニア・クリサンセミのハーピンEch：腐朽病原菌」、MPMI、8(4):
484-91(1995)に記されたもの）、エルウィニア・カロトボーラ（本明細書に参照
として組入れられているCuiらの論文、「エルウィニア・カロトボーラ亜種カロ トボーラ菌株Ecc71のRsmA-変異株は、タバコ葉でhrpNEccを過剰発現し、過敏感 反応様反応を誘起する」、MPMI、9(7):565-73(1966)に記されたもの）、エルウ ィニア・ステワルチ（本明細書に参照として組入れられているAhmadらの論文、 「ハーピンはエルウィニア・ステワルティイのトウモロコシに対する病原性には
不要である」、8th Int'l Cong. Molec. Plant-Microb. Inter、1996年7月14-19
日、およびAhmadらの論文、「ハーピンはエルウィニア・ステワルティのトウモ ロコシに対する病原性には不要である」、Ann.Mtg.AmPhytopath.Soc.、1996年7 月27-31日に記されているもの）、および、シュードモナス・シリンガエ病原型 シリンガエ（本明細書に参照として組入れられているコーネル研究財団に付与さ
れた国際公開公報第94/26782号、開示されているもの）である。
【００２５】 本発明のタンパク質またはポリペプチドは、好ましくは、従来からの技術によ
って、（好ましくは、少なくとも約80%、より好ましくは90%純粋な）精製された
形で製造される。典型的には、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、組換
え宿主細胞の増殖培地中に分泌される。または、本発明のタンパク質またはポリ
ペプチドは、産生されても増殖培地中には分泌されない。このような場合、タン
パク質を単離するために、組換えプラスミドをもつ宿主細胞（例えば、大腸菌）
を増殖させ、音波処理によって溶菌し、加熱、示差的圧力、もしくは化学処理し
、このホモジネートを遠心分離して、細菌の残滓を取り除く。次に、上清を段階
的硫化アンモニウム沈降法に供する。本発明のポリペプチドまたはタンパク質を
含む画分を、適当なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドカラムでゲ
ル濾過して、タンパク質を分離する。必要ならば、HPLCによって、このタンパク
質画分をさらに精製することができる。
【００２６】 従来からの組換えDNA技術を用いて、細胞の中に過敏感反応エリシターポリペ プチドまたはタンパク質をコードするDNA分子を取り込むことができる。一般的 に、これには、そのDNA分子が異種的である（すなわち、通常は存在しない）発 現システムの中にDNA分子を挿入することが含まれる。異種性のDNA分子を、適正
なセンス鎖方向で、かつ正しい読み枠にはまるよう、発現システムまたはベクタ
ーの中に挿入する。このベクターは、挿入されたタンパク質をコードする配列の
転写および翻訳に必要な因子を含んでいる。
【００２７】 コーエンとボイヤー（Cohen and Boyer）に対する米国特許第4,237,224号は、
参照として本明細書に組み入れられるが、制限酵素切断、およびDNAリガーゼに よるライゲーションを用いて、組換えプラスミドという形での発現システムの作
成を記載している。そして、これらの組換えプラスミドを、形質転換という方法
で導入し、原核生物、および組織培養で増殖させた真核生物細胞などの単細胞培
養で複製させる。
【００２８】 組換え遺伝子は、ワクシニアウイルスなどのウイルスの中に導入することもで
きる。組換えウイルスは、ウイルス感染した細胞の中にプラスミドをトランスフ
ェクション（transfection）することによって作成することができる。
【００２９】 適当なベクターには、以下のウイルスベクターが含まれるが、これらに限定さ
れない。すなわち、gt11、gt WES.tB、Charon 4などのラムダベクターシステム 、また、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、p
LG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/- またはKS +/- （ カリフォルニア州ラホヤ（La Jolla）にあるストラタジーン社（Stratagene）の
「ストラタジーンクローニングシステム（Stratagene Cloning Systems）」カ タログ（1993）参照。このカタログは、参照として本明細書に組み入れられる）
、pQE、pIH821、pGEX、pETシリーズ（F. W. Studierら、「クローニングした遺 伝子を発現させるためのT7RNAポリメラーゼの使用（Use of T7 RNA Polymerase
to Direct Expression of Cloned Genes）」、Gene Expression Technology vol
. 185 (1990)を参照のこと。この論文は、参照として本明細書に組み入れられる
）などのプラスミドベクター、および、これらから派生したもの。組換え分子は
、形質転換、特に、形質導入、接合、可動化、またはエレクトロポレーションに
よって、細胞の中に導入できる。参照として本明細書に組み入れられる、サムブ
ルック（Sambrook）ら、（分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Clon
ing. A Laboratory Manual）、Cold Springs Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY (1989））によって説明されているような、当技術分野において標準的なク ローニング技術を用いて、DNA配列をベクターの中にクローニングする。
【００３０】 タンパク質をコードする配列を発現させるために、さまざまな宿主-ベクター システムを利用することができる。まず、このベクターシステムは、用いられる
宿主細胞に親和性がなければならない。宿主-ベクターシステムには、以下のシ ステムが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、バクテリオファージDN
A、プラスミドDNA、またはコスミドDNAによって形質転換された細菌、酵母ベク ターを含む酵母などの微生物、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノ
ウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイル
ス）に感染した昆虫細胞系、および細菌に感染した植物細胞。これらのベクター
の発現因子は、それらの強度および特異性において多様である。用いられる宿主
-ベクターシステムによって、多くの適当な転写因子および翻訳因子のいずれか を 用いることができる。
【００３１】 さまざまな遺伝子シグナルおよびプロセッシング事象によって、遺伝子発現（
例えば、DNA転写、およびメッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳）が、さまざまなレ
ベルで調節される。
【００３２】 DNAの転写は、RNAポリメラーゼを結合させ、それによってmRNA合成を促進させ
るDNA配列であるプロモーターの存在に依存している。真核生物のプロモーター のDNA配列は、原核生物のプロモーターのDNA配列とは異なっている。さらに、真
核生物のプロモーターと、それにともなう遺伝子シグナルは、原核生物システム
の中では認識されないか、機能しない可能性がある。そして、さらに、原核生物
のプロモーターは、真核生物の細胞の中では認識もされなければ、機能もしない
。
【００３３】 同様に、原核生物におけるmRNAの翻訳は、真核生物のシグナルとは異なる、原
核生物の適正なシグナルが存在することに依存する。原核生物におけるmRNAの効
率的な翻訳には、mRNA上に、シャイン-ダルガーノ（「SD」）配列と呼ばれるリ ボソーム結合部位が必要である。この配列は、タンパク質のアミノ末端のメチオ
ニンをコードする、通常はAUGの開始コドンの前に存在するmRNAの短いヌクレオ チド配列である。SD配列は、16S rRNA（リボソームRNA）の3'末端に相補的であ り、恐らく、rRNAと二本鎖を形成することによって、リボソームが正しい位置に
なるようにして、mRNAがリボソームに結合するのを促進すると考えられる。遺伝
子発現を最大にすることに関する総説は、参照として本明細書に組み入れられる
、ロバートとロウアー（Robert and Lauer）、Methods in Enzymology, 68:473
(1979)を参照のこと。
【００３４】 プロモーターの「強度」（すなわち、転写を促進する能力）はさまざまである
。クローニングされた遺伝子を発現させるために、転写のレベルを高くして、そ
れによって遺伝子発現レベルを上げるためには、強いプロモーターを使用するこ
とが望ましい。使用する宿主細胞システムによって、数ある適当なプロモーター
のいずれか一つを用いることができる。例えば、大腸菌、そのバクテリオファー
ジ、またはプラスミドにクローニングするときには、T7ファージプロモーター、
lacプロモーター、trpプロモーター、recAプロモーター、リボソームRNAプロモ ーター、コリファージラムダのPR、およびPLプロモーター、ならびにその他、la
cUV5、ompF、bla、lppなどを含むが、これらに限定されないプロモーターを用い
て、隣接するDNAセグメントを高レベルで転写させることができる。さらに、雑 種trp-lacUV5（tac）プロモーター、または組換えDNAもしくはその他の合成DNA 技術によって作出された大腸菌プロモーターを用いて、挿入された遺伝子の転写
をもたらすことができる。
【００３５】 細菌の宿主細胞菌株と発現ベクターは、特異的な誘導があるまでは、プロモー
ターの作用を阻止するものを選ぶことができる。ある操作においては、挿入され
たDNAの転写を効率的に行うためには、特異的なインデューサーの添加が必要に なる。例えば、lacオペロンは、ラクトースかIPTG（イソプロピルチオ-ベータ-D
-ガラクトシド）を加えることによって誘導される。その他、trp、proなど、さ まざまなオペロンが、異なる調節の下にある。
【００３６】 また、原核生物細胞での効率的な遺伝子転写と翻訳には、特異的な開始シグナ
ルも必要とされる。これらの転写および翻訳開始シグナルは、それぞれ、遺伝子
特異的なメッセンジャーRNAと合成されたタンパク質の量で測定される「強度」 がさまざまである。プロモーターを含むDNA発現ベクターは、さまざまな「強い 」転写シグナルおよび/または翻訳開始シグナルを任意に組み合わせたものを含 んでいてもよい。例えば、大腸菌における効率的な翻訳には、リボソーム結合部
位を提供するために、開始コドン（「ATG」）から約7〜9塩基5'側にあるSD配列 が必要である。したがって、宿主細胞のリボソームによって利用できる、いかな
るSD-ATGの組み合わせも用いることができる。このような組合せには、コリファ
ージラムダのcro遺伝子もしくはN遺伝子由来のSD-ATGの組合せ、または大腸菌の
トリプトファンE、D、C、B、もしくはA遺伝子由来のSD-ATGの組合せが含まれる が、これらに限定されない。さらに、組換えDNAまたは合成ヌクレオチドの組み 込みを含むその他の技術によって作出されたSD-ATGの組合せを用いることもでき
る。
【００３７】 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードする単離DNA分 子が、発現系にクローニングされたら、宿主細胞の中に取り込ませる準備ができ
たことになる。この取り込みは、ベクター/宿主細胞システムに応じて、上記し たさまざまな形質転換の形で行うことができる。適当な宿主細胞には、細菌、ウ
イルス、酵母、哺乳動物細胞、昆虫、植物などが含まれるが、これらに限定され
ない。
【００３８】 本発明は更に、植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／ま
たは植物のための昆虫の防除に作用する方法に関する。これらの方法は、非感染
型の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を、植物または植物種
子の全体または一部に、ポリペプチドまたはタンパク質が植物の全体もしくは一
部または植物種子の細胞と接触するような条件下で適用する。あるいは、過敏感
反応エリシタータンパク質またはポリペプチドは、このような植物自身から回収
された種子が植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または
昆虫の防除に作用するように、植物に適用することができる。
【００３９】 植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物または
種子から生育した植物上で昆虫を防除するために過敏感反応エリシターポリペプ
チドまたはタンパク質を植物または植物種子に適用する代わりに、トランスジェ
ニック植物又は植物種子を利用することができる。トランスジェニク植物を利用
する場合は、これは過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコー
ドしているDNAで形質転換されたトランスジェニク植物を提供すること、および 病気抵抗性を植物に付与し、植物の生育を強化し、および／または昆虫を防除す
るのに有効な条件下で植物を生育することに関連している。または、過敏感反応
エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしているDNA分子で形質転換 されたトランスジェニック植物種子を提供または土壌中に植えることができる。
その後植物は、植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／また
は昆虫を防除するのに有効な条件下で繁殖される。
【００４０】 本発明の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質が植物または植
物種子に適用されるような態様は、いくつかの方法で行うことができ、これは以
下を含んでいる：1)単離されたエリシターポリペプチドまたはタンパク質の適用
；2)病気を引き起こさず、かつ過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパ
ク質をコードしている遺伝子により形質転換された細菌の適用；および、3)一部
の植物種において病気を引き起こし（しかし適用された植物においては引き起こ
さない）、かつ天然に過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコ
ードしている遺伝子を含んでいる細菌の適用。
【００４１】 本発明のある態様において、本発明の過敏感反応エリシターポリペプチドまた
はタンパク質は、下記実施例に記載されたようにトマト病原型シュードモナス・
シリンガエから単離することができる。しかし好ましくは、単離された本発明の
過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、前述のように組換えに
より作出され、精製される。
【００４２】 本発明の別の態様において、本発明の過敏感反応エリシターポリペプチドまた
はタンパク質は、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコード
している遺伝子を含む細菌を適用することによって、植物または植物種子に適用
することができる。このような細菌は、該エリシターが植物または植物種子細胞
に接触することができるようなポリペプチドまたはタンパク質を分泌もしくは作
成することが可能でなければならない。これらの態様において、過敏感反応エリ
シターポリペプチドまたはタンパク質は、植物内(in planta)もしくは種子上の 細菌によって、または植物もしくは植物種子への細菌の導入直前に産生される。
【００４３】 本発明の細菌適用法のある態様において、細菌は病気を引き起こさず、かつ過
敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子によ
り（例えば組換えにより）形質転換されている。例えば植物において過敏感反応
を誘起しないE.coliは、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を
コードしている遺伝子により形質転換することができ、その後植物に適用される
。E.coli以外の細菌種も、本発明のこの態様において使用することができる。
【００４４】 本発明の細菌適用法の別の態様において、細菌は病気を引き起こし、かつ天然
に過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子
を含む。このような細菌の例は、前述のものである。しかしこの態様においては
、これらの細菌は、細菌によって運ばれた病気に対し罹病性でない植物またはそ
れらの種子に適用される。例えば、トマト病原型シュードモナス・シリンガエは
、トマトにおいて病気を引き起こすが、マメにおいては引き起こさない。しかし
このような細菌は、マメにおいて過敏感反応を誘起するであろう。従って、本発
明のこの態様に従って、トマト病原型シュードモナス・シリンガエは、マメ植物
または種子に適用して、その種において病気を引き起こすことなく、病気抵抗性
を付与し、生育を強化し、または昆虫を防除することができる。
【００４５】 本発明の方法を使用して、病気の抵抗性を付与する、生長を増強させる、およ
び／または昆虫を防除するために、さまざまな植物またはそれらの種子を処理す
ることができる。適当な植物には、双子葉類と単子葉類が含まれる。より具体的
には、有用な作物植物として、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ、ライ
ムギ、ワタ、ヒマワリ、ラッカセイ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、
マメ、エンドウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、芽キャベツ、ビート
、パースニップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレン
ソウ、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、カボチャ属、
カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、柑橘類、イチゴ、ブ
ドウ、ラズベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、ソルガム、および
サトウキビが含まれる。適当な観賞用植物の例は、シロイヌナズナ（Arabidopsi
s thaliana）、セントポーリア、ペチュニア、ペラルゴニューム、ポインセチア
、キク、カーネーション、およびジニアである。
【００４６】 病気抵抗性を付与する本発明の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペ
プチドの使用に関して、感染に対する絶対免疫は授けることができないが、この
病気に対する感受性は低下させられ、かつ徴候発現が遅延される。病巣数、病巣
の大きさ、および真菌病原体の胞芽形成の程度は全て減少される。この病気抵抗
性を付与する方法は、これまで治療することができなかった病気を治療し、費用
の点から個別に治療されなかった全身性病気を治療し、感染性薬剤および環境に
有害な物質の使用を回避する可能性がある。
【００４７】 本発明に従って植物に病原体抵抗性を付与する方法は、ウイルス、細菌および
真菌を含む広範な多様な病原体に対する抵抗性を付与するのに有用である。特に
下記のウイルスに対する抵抗性は、本発明の方法によって達成することができる
：タバコモザイクウイルスおよびトマトモザイクウイルス。特に下記の細菌に対
する抵抗性も、本発明に従って植物に付与することができる：シュードモナス・
ソランセアラム、シュードモナス・シリンガエ病原型タバシ(tabaci)、およびキ
サンタモナス・カンペストリス病原型ペラルゴニ(Xanthamonas campestris pv.
pelargoni)。本発明の方法を使用することにより特に下記の真菌に対して植物を
抵抗性にすることができる：フサリウム・オキシプラム(Fusarium axysporum)お
よびフィトフソラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)。
【００４８】 植物の生育を強化するための本発明の過敏感反応エリシタータンパク質または
ポリペプチドの使用に関して、様々な形の植物の生育強化または促進を行うこと
ができる。これは、植物の生育が種子から始まる場合はできるだけ早く、もしく
は植物生活環のより後期において引き起こすことができる。例えば、本発明の植
物の生育は、増量した収穫高、産生された種子量の増大、種子の発芽率の上昇、
植物丈の伸張、より大きい有機物量(biomass)、より多くかつ大きい果実、より 早期の果実の色付き、ならびにより早い果実および植物の成熟を含んでいる。結
果的には、本発明は、栽培者に著しい経済的利益をもたらす。例えば早期の発芽
および早い成熟は、生育期が短くその地域での生育が妨げられるような地域で作
物が生育できるようにする。種子の発芽率の上昇は、結果的に作物の株立本数(s
tand)を改善し、より効果的な種子の使用ができる。より多い収穫量、丈の伸張 および増強された有機物量生成は、所定の土地区画からのより多い収益形成を可
能にする。
【００４９】 本発明の別の局面は、何らかの形で、植物のために昆虫防除を行うことに関す
る。例えば、本発明に従った昆虫防除には、過敏感反応エリシターが適用されて
いる植物には昆虫が接触できなくなるようにすること、食害によって植物が直接
的な虫害を受けるのを阻止すること、このような植物から昆虫が離れていくよう
にさせること、このような植物のすぐ近くにいる昆虫を殺すこと、昆虫の幼虫が
このような植物を餌にするのを阻止すること、昆虫が宿主植物上でコロニーを形
成するのを阻止すること、コロニーを形成した昆虫がフィトトキシンを放出する
のを阻止することなどが含まれる。本発明は、昆虫の感染から、その後に生じる
植物の病害も防止する。
【００５０】 本発明は、広範な種類の昆虫に対して有効である。アワノメイガ(European Co
rn Borer)は、トウモロコシ（デントコーンおよびスイートコーン）の主要害虫 であるだけでなく、グリーンビーン、ワックスビーン(wax bean)、ライビーン、
食用ダイズ、コショウ、ジャガイモ、およびトマト、更に多くの草本種を含む20
0を超える植物種を餌にする。さまざまな野菜に損傷を与える別の食害虫の幼虫 は以下を含む：ビートアーミーワーム(beat armyworm)、キャベツルーパ(cabbag
e looper)、コーンイヤーワーム(corn earworm)、フォールアーミーワーム(fall
armyworm)、ダイヤモンドバックモス(diamondback moth)、キャベツルートマゴ
ット(cabbage root maggot)、オニオンマゴット(onion maggot)、シードコーン マゴット(seed corn maggot)、ピックルワーム(pickleworm)（メロンワーム(mel
oneworm)）、ペッパーマゴット(pepper maggot)、およびトマトピンワーム(toma
te pinworm)。この昆虫のグループは、集合的に、世界中の野菜の生産にとって 経済的に最も重要な害虫グループである。
【００５１】 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質の適用に関する本発明の
方法は、葉、茎、根、栄養分体（例えば挿し木）、その他を含む、植物の全身ま
たは一部を処理するときに、さまざまな手順によって実施することができる。こ
れには、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を植物の中に浸潤
させることが含まれていてもよい（しかしその必要はない）。適切な適用法には
、高圧または定圧の噴霧、注入、およびエリシターを適用する直前に葉の表皮を
剥脱することが含まれる。本発明の応用の態様に従って植物種子を処理する場合
は、低圧または高圧の噴霧、コーティング、浸漬、または注入によって、過敏感
反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを適用することができる。過敏感
反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を植物または植物種子の細胞に接
触させることができるようにする、他の適当な適用手順を、当業者が考案するこ
とも可能である。本発明の過敏感反応エリシターで処理したら、植物を生産する
ための常法を用いて、種子を天然または人工の土に植えて栽培できる。本発明に
従って処理した種子から植物体を繁殖させた後、植物体に病気抵抗性を付与し、
植物の生育を強化し、および／または植物体上の昆虫を防除するために、過敏感
反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質で植物体を１回以上処理すること
ができる。
【００５２】 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、単独で、または他の
材料と混ぜて、本発明に従って、植物または植物種子に適用することができる。
または、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、異なった時機
に適用される別の材料とは別に植物へ適用することができる。
【００５３】 本発明の応用態様に従って植物または植物種子を処理するのに適した組成物は
、担体の中にか敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を含んでいる
。適当な担体としては、水、水溶液、スラリー、または乾燥粉末などがある。本
態様において、この組成物は、500nMよりも多い過敏感反応エリシターポリペプ チドまたはタンパク質を含む。
【００５４】 必要ではないが、この組成物は、肥料、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、および
これらの混合物など、更に別の添加剤を含むことができる。適当な肥料としては
、(NH4)2NO3などがある。適当な殺虫剤の例はマラチオン(Malathion)である。有
用な殺真菌剤としては、キャプタン(Captan)などがある。
【００５５】 この他の適当な添加剤には、緩衝剤、湿潤剤、被覆剤、および摩砕剤などがあ
る。これらの素材を用いて、本発明の処理を容易にすることができる。さらに、
過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、粘土および多糖類など
、他の従来からある種子用調合剤および処理剤とともに植物種子へ適用すること
ができる。
【００５６】 トランスジェニック植物およびトランスジェニック種子を使用することを含む
本発明の代替的態様において、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパ
ク質を植物または種子に局所的に用いる必要はない。その代わりに、過敏感反応
エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードしているDNA分子で形質転換 されたトランスジェニック植物を、当該技術分野において周知の処理法に従って
作出する。
【００５７】 組換えDNAを機械的に移すために、前述のベクターを植物細胞にマイクロピペ ットを用いて直接微量注入することができる（本明細書に参照として組入れられ
ているCrosswayの論文、Mol. Gen. Genetics.、202:179-85(1985)）。遺伝的材 料は、ポリエチレングリコールを用いて、植物細胞へ移すこともできる（本明細
書に参照として組入れられているKrensらの論文、Nature、296:72-74(1982)）。
【００５８】 病原菌に抵抗性を持つ遺伝子で植物細胞を形質転換する別の方法は、宿主細胞
のパーティクルガン法（バイオリスティック形質転換としても公知）である。こ
れは、いくつかの方法のひとつで達成することができる。第一の方法は、細胞へ
の不活性または生物学的に活性の粒子の打ち込みに関する。この技術は、米国特
許第4,945,050号、第5,036,006号および第5,100,792号に開示されているが、こ れらは全てStanfordらの特許であり、本明細書に参照として組入れられている。
一般に、この手順は、細胞外面を透過し、かつ細胞内に組込まれるのに有効な条
件下で、細胞で不活性または生物学的に活性の粒子を打ち込むことに関する。不
活性粒子を利用する場合は、粒子を異種DNAを含むベクターでコーティングする ことにより、ベクターを細胞内へ導入することができる。あるいは、標的細胞を
、ベクターで取り囲み、その結果ベクターが粒子の後を追って細胞へと運ばれる
ようにすることができる。生物学的に活性のある粒子（例えばベクターと異種DN
Aを含む乾燥した細菌細胞）も植物細胞に打ち込むことができる。
【００５９】 更に別の導入法は、プロトプラストの、他の実体(entity)、ミニ細胞、細胞、
リソソームまたは他の融合可能な脂質表面を持つ本体のいずれかとの融合である
（本明細書に参照として組入れられているFraleyらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、79:1859-63(1982)）。
【００６０】 DNA分子は更に、電気穿孔により植物細胞へ導入することができる（本明細書 に参照として組入れられているFrommらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、8
2:5824(1985)）。この技術において、植物のプロトプラストは、発現カセットを
有するプラスミドの存在下で、電気穿孔される。高い電場強度の電気パルスは、
プラスミドを導入できるように生体膜を可逆的に透過する。電気穿孔された植物
のプロトプラストは、細胞壁を再構築し、分割され、かつ再生される。
【００６１】 植物細胞にDNA分子を導入する別の方法は、あらかじめ該遺伝子で形質転換さ れたアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)また はA.リゾゲネス(A. rhizogenes)による植物細胞の感染である。当該技術分野に おいて公知の適切な条件下で、形質転換された植物細胞は増殖し、徒長枝または
根を形成し、更に植物体へと成長する。一般にこの方法は、細菌浮遊液による植
物組織の接種、および組織の抗生物質を含まない再生培地上の25〜28℃での48〜
72時間の培養に関連している。
【００６２】 アグロバクテリウムは、リゾビアセアエ科のグラム陰性菌の代表的種である。
この種は、クラウンゴール（A.ツメファシエンス）および毛根の病気（A.リゾゲ
ネス）に寄与している。クラウンゴール腫瘍や毛根中の植物細胞は、細菌によっ
てのみ異化されるオパインとして公知のアミノ酸誘導体の生成が誘導される。オ
パインの発現に寄与している細菌遺伝子は、キメラ発現カセットの調節エレメン
トの都合の良い供給源である。これに加えて、オパインの存在をアッセイして、
形質転換された組織を同定することができる。
【００６３】 A.ツメファシエンスのTiプラスミドまたはA.リゾゲネスのRiプラスミドにより
、異種遺伝子配列を、適当な植物細胞に導入することができる。TiおよびRiプラ
スミドは、アグロバクテリウムに感染時に植物細胞に伝達され、植物ゲノムに安
定して導入される。本明細書に参照として組入れられているシェル（J.Schell）
の論文、Science、237:1176-83(1987)。
【００６４】 形質転換後、形質転換された細胞は再生されなければならない。
【００６５】 培養したプロトプラストからの植物の再生は、エバンス（Evans）らの論文、 植物細胞培養ハンドブック（Handbook of Plant Cell Cultures 、第1巻：マクミ
ラン出版社、ニューヨーク、1983年）；およびバシル（Vasil I.R.）編集の植物 細胞培養および植物体細胞遺伝学Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants 、アカデミックプレス社、オーランド、第1巻、1984年、および第3巻、19
86年）に記載されており、これらは本明細書に参照として組入れられている。
【００６６】 特にサトウキビ、テンサイ、ワタ、果樹、およびマメの全ての主要な種を含む
が、これに限定されるものではない、あらゆる植物が、培養された細胞または組
織から再生できることが公知である。
【００６７】 再生手段は、植物種毎に異なるが、一般に形質転換されたプロトプラストの浮
遊液または形質転換された外植片(explant)を含むペトリ皿が最初に提供される 。カルス組織が形成され、かつこのカルスから徒長枝が誘導され、次に根が生え
る。あるいは、胚の形成が、カルス組織において誘導される。これらの胚は天然
の胚のように発芽し、植物体を形成する。培地は一般に、オーキシンやサイトカ
インのような様々なアミノ酸およびホルモンを含むであろう。培地へのグルタミ
ン酸やプロリンの添加も、特にトウモロコシやアルファルファのような種におい
ては利点である。効率的再生は、培地、遺伝子型、および培養歴によって左右さ
れるであろう。これら3種の変数が制御できる場合は、従って再生は通常再現可 能かつ反復可能なものである。
【００６８】 発現カセットがトランスジェニック植物に安定導入された後、有性交配により
他の植物体へ転移することができる。多くの標準的繁殖技術のいずれかを、交配
される種に応じて使用することができる。
【００６９】 一旦この種のトランスジェニック植物が作出されると、植物体それ自身を常法
に従い、過敏感反応エリシターをコードしている遺伝子の存在下で、栽培するこ
とができ、その結果病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または
植物上で昆虫を防除することができる。あるいは、トランスジェニック種子が、
トランスジェニック植物から回収される。これらの種子は次に土壌に植え、常法
により栽培し、トランスジェニク植物を作出することができる。このトランスジ
ェニック植物は、植えられたトランスジェニック種子から、植物体に病気抵抗性
を付与し、植物の生育を強化し、および／または昆虫を防除するような条件下で
繁殖される。理論的裏付けを意図するものではないが、このような病気抵抗性、
生育の強化および／または昆虫防除は、RNA媒介型であるか、もしくは、エリシ ターポリペプチドまたはタンパク質の発現の結果であることができる。
【００７０】 本発明にしたがってトランスジェニック植物および植物種子を用いるとき、過
敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を適用した植物または種子を
処理するために用いた材料と同じもので、さらに、それらを処理することができ
る。これら、過敏感反応エリシターを含む他の材料を、高圧または低圧の噴霧、
注入、被覆、および浸漬を含む上記の処理法によって、トランスジェニック植物
または植物種子に適用することができる。同様に、トランスジェニック種子から
植物体を繁殖させた後、病気への抵抗性を付与するため、生長を増強させるため
、および／または昆虫を防除するために、過敏感反応エリシターを1回以上適用 して植物を処理することができる。従来からある植物処理剤（例えば、殺虫剤、
肥料など）で、これらの植物を処理することもできる。
【００７１】 実施例実施例１ −細菌株、プラスミドおよび培地 大腸菌（E.coli）株を通常のようにLM（本明細書に参照として組入れられてい
るHanahan, D.の著書、(1985)、DNA Cloning:A Practical Approach.、Glover,
D.M.編集、(IRL Press、オックスフォード）、109〜135頁）、またはTerrificブ
ロス（Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis, T.の論文、Molecular Clo ning 、第2版、（コールドスプリングハーバーラボラトリプレス社、ニューヨー ク州コールドスプリングハーバー）、109〜135頁(1989)、これらは参照として本
明細書に組入れられている。）において37℃で増殖した。最初にプラスミド構築
に使用した大腸菌（E.coli）株は、DHα5またはDH5aF'IQ（ライフ・テクノロジ ー社、グランドアイランド、NY）であった。標準的DNA操作のために、ストラー タジーン（Stratagene）社（ラホヤ、CA）のpBluescriptIIベクターを用いた。P
.シリンガエ病原型トマトDC3000（本明細書に参照として組入れられているPrest
on, G.の論文、Mol.Plant-Microbe Interact.、8:717-32(1995)）およびP.フル オレセンス(P. fluoroscens)55（本明細書に参照として組入れられているHuang,
H.C.の論文、J.Bacteriol.、170:4748-56(1988)）を、キングの（King's ）Bブ
ロス（本明細書に参照として組入れられているKing, E.O.の論文、J.Lab.Med.、
22:301-07(1954)）、またはhrp-脱抑制フルクトース最小培地（本明細書に参照 として組入れられているHuynh, T.V.の論文、Science、245:1374-77(1989)）に おいて30℃で増殖した。抗生物質を下記の濃度で利用した（μg/ml）：アンピシ
リン、100；ゲンタマイシン10；カナマイシン、50；リファンピシン、100；スペ
クチノマイシン、50；およびテトラサイクリン、20。
【００７２】実施例２ −DNA操作 DNA操作およびPCR反応を、標準的操作手順に従って行った（本明細書に参照と
して組入れられているSambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis, T.の論文 、Molecular Cloning、第二版、（コールドスプリングハーバーラボラトリープ レス社、コールドスプリングハーバー、NY）(1989)；Innis，M.A.、Gelfand, D.
H.、Sninsky, J.J.およびWhite,T.J.の論文、PCR Protocols、（アカデミックプ
レス社、サンディエゴ）(1990)。配列決定またはPCRのためのオリゴヌクレオチ ドプライマーは、ライフテクノロジー（Life Technologies）社から購入した。P
CR反応にはPfuポリメラーゼ（ストラタジーン（Stratagene）社）を使用した。D
NA配列決定は全て、コーネル・バイオテクノロジーセンター（Cornell Biotechn
ology Center）において、自動DNAシーケンサー、モデル373A（アプライド・バ イオシステムズ（Applied Biosystems）社、フォスターシティ、CA）で行った。
DNA配列は、ジェネティックス コンピュータ グループ（Genetics Computer G
roup） Ver.7.3（本明細書に参照として組入れられているDevereaux, J.の論文 、Gene、12:387-95(1984)）およびDNASTAR（マディソン、WI）ソフトウェアパッ
ケージで解析した。hrpWのDNA配列は、ジーンバンク（GenBank）に、寄託番号AF
005221において寄託されている。
【００７３】実施例３ −植物アッセイ タバコ（ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)L.“Xanthi”）およびト マト（リコペルシカム・エスクレンタム(Lycopersicum esculentum)Mill.“Mone
ymaker”）植物を育種し、かつ記載されているように細菌を接種した（本明細書
に参照として組入れられているGopalan, S.の論文、Plant Cell、8:1095-05(199
6)）。毒性アッセイのために、104細胞／mlを含有する細菌浮遊液をトマト葉に 浸潤させ、徴候発現および細菌の増殖について5日間にわたって毎日観察した。
【００７４】実施例４ −P.シリンガエ病原型トマトDC3000においてhrpクラスターに隣接するD
NAの単離 P.シリンガエ病原型トマトDC3000からの全DNAを、Sau3Aにより部分的に消化し
、コスミドベクターpCPP47（本明細書に参照として組入れられているBauer, D.W
.の論文、Mol.Plant-Microbe Interact.、10:369-79(1997)）のBamHI部位にライ
ゲーションし、Gigapack III Gold Packaging Extract（ストラタジーン（Strat
agene）社）によりファージ粒子にパッケージングした。およそ800の細菌コロニ
ーを、コロニー／プラークスクリーンハイブリダイゼーションメンブレン（デュ
ポンNENリサーチ・プロダクツ社、ボストン、MA）に移し、かつ高いストリンジ ェンシーにおいてP.シリンガエ病原型シリンガエ61由来のhrpRを含む32P-標識し
たPstI断片でプロービングし、ハイブリダイズしているコスミドpCPP2357を得た
。pCPP2357の6.5kbのEcoRI断片を、pML123（本明細書に参照として組入れられて
いるLabes, M.の論文、Gene、89:37-46(1990)）にサブクローニングし、pCPP237
3を作成した。MfeIによるpCPP2373の部分消化、およびpHP45ΩからのΩSpr断片 を保持するEcoRI断片のhrpWまたは転写ユニットIVへの挿入により、pCPP2374とp
CPP2375を構築した（本明細書に参照として組入れられているPrentki, P.の論文
、Gene、29:303-13(1984)）。更にP.シリンガエ病原型シリンガエB728Aの全DNA からのpCPP47において、同じ方法を用いてコスミドライブラリーを作成した。
【００７５】実施例５ −DNAゲルブロッティング 全DNA（2μg）を、EcoRIで消化し、0.5％アガロースゲル上での電気泳動によ り分離した。DNAを、Immobilon-Nメンブレン（ミリポア社、ベッドフォード、MA
）に移し、Prime-It IIキット（ストラタジーン社）を用いて、32P-標識した1.3
kb PCR増幅したhrpW断片と、HYB-9ハイブリダイゼーション溶液（GENTRAシステ ムズ社、リサーチトライアングルパーク、NC）中で62℃で8時間ハイブリダイズ した。膜を、1.0％SDSおよび1X SSCで4回、その後1.0％SDSおよび0.2X SSCで2回
洗浄した。膜をOMAT X-線フィルムに4〜12時間曝露した。
【００７６】実施例６ −HrpWおよび誘導体の調製 HrpWの完全なコード配列は、pCPP2368から、各々BamHI部位を含むプライマー5
N-ATGAGGATCCAGCATCGGCATCACACCC-3N（W1と称す）（配列番号：3）およびHindII
I部位を含む5N-ATGAAAGCTTAAGCTCGGTGTGTTGGGT-3N(W2と称す)（配列番号：4）に
よりPCR増幅した。HrpWのN-末端の186個のアミノ酸をコードしているDNAは、pCP
P2368から、W1プライマーおよびHindIII部位を含むプライマー5N-ATGAAAGCTTGCC
ACCGCCTGTTGCAGT-3N（配列番号：5）でPCR増幅した。HrpWのC-末端の236個のア ミノ酸をコードしているDNAは、pCPP2368から、BamHI部位を含むプライマー5N-A
TGAGGATCCGAGGGTGGCGTAACACCG-3N（配列番号：6）およびW2プライマーを用いてP
CR増幅した。完全な長さのHrpW、HrpWのN-末端分析およびC-末端分析に相当する
増幅産物を、pQE30（キアゲン社）のBamHIおよびHindIII部位へ直接クローニン グし、それぞれ、pCPP2377、pCPP2378およびpCPP2379を得た。Ni-NTAスピンカラ
ム（キアゲン社）を用いるHis-標識したタンパク質を単離するために使用した手
順が公表されている（本明細書に参照として組入れられているAlfano, J.R.の論
文、Mol.Microbiol.、19:715-28(1996)）。E.coli ABLE K（ストラタジーン社）
を、グルコース（0.2％）、カサミノ酸（0.02％）およびチアミン（1μg/ml）を
補充したM9培地（本明細書に参照として組入れられているSambrook, J.の論文、 Molecular Cloning 、第2版、（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス
社、コールドスプリングハーバー、NY）(1989)）で増殖し、これを用いて見かけ
の毒性によりHis6-HrpWを得た。SDS-PAGEならびに先に得た抗-HrpZ抗体および抗
-HrpW抗体、ならびにウェスタンライト化学発光検出システム（トロポックス社 、ベッドフォード、MA）およびOMAT X-線フィルム（コダック社、ロチェスター 、NY）を用いるイムノブロット分析（本明細書に参照として組入れられているHe
,S.Y.の論文、Cell、73:1255-66(1993)；Yuan, J.の論文、J.Bacteriol、178:63
99-6402(1966)）を前述のように行った（本明細書に参照として組入れられてい るAlfano, J.R.らの論文、Mol.Microbiol、19:715-28(1996)）。
【００７７】実施例７ −hrpZおよびhrpW変異の構築ならびにP.シリンガエ病原型トマトDC3000
のマーカー交換突然変異誘発 P.シリンガエ病原型トマトDC3000 hrpZ変異を構築するために、hrpZ内側の603
bp ClaI断片を、hrpAとhrpZを含むLITMUS 28（ニューイングランドバイオラボ社
）誘導体であるpCPP2334から欠失し、pCPP2336を作成した。転写ターミネーター
を欠損したnptll誘導体を、pCPP2988（本明細書に参照として組入れられているA
lfano, J.R.らの論文、Mol. Microbiol.、19:715-28(1996)）から、プライマー5
N-CCATCGATGGTGGTGGCGATAGCTAGACTTGG-3N（配列番号：7）および5N-CCATCGATGGT
CTCGTGATGGCAGGTTG-3N（配列番号：8）を用いてPCR増幅し、かつpCPP2336に特有
のClaI部位に正しい方向でクローニングした。得られた構築体からのBglII／Hin
dIII断片であるpCPP2338は、hrpZ変異を有するが、これをpCPP2340中に保持され
たBglII／HindIII断片と交換し、pCPP2342を作成した。hrpZ変異を保持するpCPP
2342からの5.3kb EcoRI断片を、宿主範囲が広いプラスミドpRK415（本明細書に 参照として組入れられているKeen, N.T.らの論文、Gene、70:191-97(1988)）に クローニングし、pCPP2344を作成した。ΩSpr断片が挿入されたhrpWを保持したp
CPP2375からの8.5kb EcoRI断片を、pRK415にサブクローニングし、pCPP2376を作
成した。pCPP2376およびpCPP2344を、個別にP.シリンガエ病原型トマトDC3000へ
電気穿孔した。プラスミドの欠損とマーカーの保持は、先に記したように行った
（本明細書に参照として組入れられているAlfano, J.R.らの論文、Mol. Microbi ol. 、19:715-28(1996)）。
【００７８】実施例８ −トランスで発現されたhrpWはP.フルオロセンス(pHIR11)のHRを誘起す
る能力を失わせる P.シリンガエ病原型トマトDC3000 DNAフランキングhrpR中の過敏感反応エリシ
ター−様遺伝子を同定するために、ベクターpCPP47中にこの領域を含むコスミド
pCPP2357を単離した。pML123における一連のサブクローンを構築し、2種の可能 性のある過敏感反応エリシター表現型についてスクリーニングした：(i)pCPP227
4、ΔhrpZ pHIR11誘導体を有するP.フルオロセンス細胞におけるタバコのHR誘起
活性を促進する能力（本明細書に参照として組入れられているGopalan, S.らの 論文、Plant Cell、8:1095-105(1996)）；および(ii)野生型pHIR11を保持するP.
フルオロセンス細胞のHR誘起活性による妨害（本明細書に参照として組入れられ
ているAlfano, J.R.らの論文、Mol. Microbiol.、19:715-28(1996)）。いずれの
サブクローンも第一の表現型を有さなかったが、唯一pCPP2373が第二の型を有し
た。pCPP2373は、転写ユニットIVおよびVを有するpCPP2357の6.5kb EcoRI断片を
含み（本明細書に参照として組入れられているLorang, J.M.らの論文、Mol. Pla nt-Microbe Interact. 、8:49-57(1995)）、かつP.フルオロセンス（pHIR11）のH
R誘起活性が取り除かれている（図1）。どの転写ユニットがこの表現型に寄与し
ているかを決定するために、ΩSpr断片を、転写ユニットIVおよびVのMfeI部位に
挿入し、それぞれ、pCPP2374およびpCPP2375を構築した。両方のプラスミドを、
P.フルオロセンス(pHIR11)細胞に形質転換し、その後これでタバコ葉を浸潤した
。pCPP2375のみが、HR誘起を阻害し（図1）、このことは、転写ユニットVがHrpZ
のひとつの特徴を持つタンパク質をコードしていることを示している。
【００７９】実施例９ −hrpWのDNA配列は、過敏感反応エリシタードメインおよびPelドメイン
の両方を持つタンパク質を予想する 転写ユニットVの完全なDNA配列を決定し、hrpWと称される1,275-bp ORFを明ら
かにした。この遺伝子は、コンセンサスhrpプロモーターが先行し（本明細書に 参照として組入れられているLorang, J.M.らの論文、Mol. Plant-Microbe Inter act. 、8:49-57(1995)）、rho-非依存のターミネーターが続いている（図2A）。 予想されるHrpWのN-末端配列は、ユアン（Yuan）およびヘ（He）によって同定さ
れた5種のP.シリンガエ病原型トマトDC3000のHrp-分泌タンパク質の1つであるEX
P-60に合致した（本明細書に参照として組入れられているYuan, J.らの論文、J. Bacteriol. 、178:6399-402(1996)）。hrpWは、不一致の方向に転写されたオペロ
ンに隣接しており、モノシストロン性オペロンのように見える。過敏感反応エリ
シターのように、予想される42.9kDaのHrpWタンパク質は、酸性でグリシンが豊 富でシステインを含まず、かつ芳香族アミノ酸が欠損している。予想されるHrpW
のタンパク質配列は、少なくとも2種の個別のドメインを明らかにしている（図2
B）。過敏感反応エリシター−様ドメイン（アミノ酸1-186）は、グルタミン、セ
リンおよびグリシンが豊富である。119-186領域は、酸性残基および極性残基が 多い6個の不完全なグリシンが豊富な反復を含み、これをP.シリンガエ病原型ト マトおよびP.シリンガエ病原型シリンガエのHrpZタンパク質の同様の反復と並べ
た（図2C）。この領域のT P S/D A Tモチーフは、β−シートの一方が全てトレ オニンおよびセリン残基を有するβ−シート構造を有すると予想され、かつグリ
シン反復は、Garnier-Robsonアルゴリズムによってターン構造であると予想され
る（本明細書に参照として組入れられているPlasterer, T.N.の論文、Methods i n Molecular Biology 、第70巻、Swindell, S.R.編集（フマナプレス社、トタワ 、NJ）、227〜239頁(1997)）。交互のβ−シートおよびターンは、β−バレル構
造を形成することができる。BLAST（本明細書に参照として組入れられているAlt
schul, S.F.の論文、J. Mol. Biol.、215:403-10(1990)）を用いるデータベース
の検索は、過敏感反応エリシタードメインに明らかに類似しているタンパク質は
ないことを明らかにした。
【００８０】 対照的に、HrpWのC-末端の236個のアミノ酸は、ネクトリア・ハエマトコッカ(
Nectria haematococca)交配型IV（フサリウム・ソラニf.種ピシ）由来のいくつ かの真菌Pel、およびE.カロトボーラ由来の一つの細菌性Pelに類似している。例
えば、HrpWは、N.ハエマトコッカPelC（本明細書に参照として組入れられている
Guo, W.らの論文、Arch. Biochem. Biophys.、323:352-60(1995)）と32.5％の同
一性を、E.カロトボーラ由来のPel-3（本明細書に参照として組入れられているL
iu, Y.らの論文、Appl. Environ. Microbiol.、60:2545-52(1994)）と21.2％の 同一性を示す。このグループの中のPelのアミノ酸配列は、公知のPelの大半とは
異なり、このグループのタンパク質の活性部位および三次構造についてはほとん
どわかっていない（本明細書に参照として組入れられているHenrissat, B.らの 論文、Plant Physiol.、107:963-76(1995)）。
【００８１】実施例10 −hrpWは植物病原菌において広範に分布されているように見え、かつ2 種のP.シリンガエ病原性変異株(pathovar)間で保存された領域にある hrpWの分布およびhrpW領域の保存を、DNAゲルブロッティングおよびDNA配列解
析により調べた。hrpWのORFを、PCRにより増幅し、これをプローブとして用いて
代表的な壊死性のグラム陰性植物病原菌由来のEcoRIで消化したDNAとの高度のス
トリンジェントなゲルブロットハイブリダイゼーションを行った（図3）。hrpW プローブは、試験したP.シリンガエ病原性変異株：グリシナエ(glycinea)、パピ
ュランス(papulans)、ピシ、ファセオリコラ、タバシおよびシリンガエ株B728a および61（弱い）の各々について、少なくとも1本の識別できるバンドとハイブ リダイズした。ハイブリダイゼーションは更に、P.ビリディフラバ・ラルストニ
ア(viridiflava Ralstonia)（シュードモナス）ソラナセアラム（弱い）、およ びキサントモナス・カンペルトリス病原性変異株アモラシアエ(amoraciae)およ びベシカトリア(vesicatoria)についても認められた。エルウィニア種からのDNA
とのハイブリダイゼーションは認められなかった。P.シリンガエ病原型シリンガ
エB728a中のこの領域を、更にhrpRとhrpWの両方とハイブリダイズしているDNAを
保持するコスミドpCPP2347を単離することによって試験した。制限地図および部
分的DNA配列解析は、この領域が、これらの2種のP.シリンガエ病原性変異株類に
おいて高度に保存されていること、およびP.シリンガエ病原型シリンガエB728a
HrpWもPelドメインを有することを示した（図2A）。
【００８２】実施例11 −HrpWおよびその過敏感反応エリシタードメインは、タバコ葉において
HR-様壊死を誘起するが、HrpWおよびPelドメインは検出可能なPel活性を欠失し ている hrpWのPCRサブクローンを、pQE30中で構築し、HrpW誘導体およびN-末端His6- 標識を有する2個のドメイン断片の作成を可能にした。これらの融合タンパク質 は、一部Ni-NTAクロマトグラフィーにより精製し、かつSDS-PAGEおよびP.シリン
ガエ病原型トマトDC3000 Hrp-分泌タンパク質に対する抗体によるイムノブロッ ティングにより分析した（図4）。抗-HrpW抗体は、完全な長さのHrpWとも、両方
の断片とも結合するが、過敏感反応エリシタードメイン断片への結合は著しく弱
いものである。HrpWを産生する形質転換体は、それらのプラスミドの維持におい
て非常に不安定である。従ってHrpWレベルは極めて低く、かつNi-NTAクロマトグ
ラフィーはHrpW中の単に部分的に豊富な調製物を生じた。しかしながらこのHrpW
調製物は、タバコ葉において過敏感反応（「HR」）-様壊死を誘起し、これは約1
2時間後にのみ生じるP.シリンガエ病原型シリンガエ61 HrpZによって誘起された
壊死とは視覚的に異なっていた（図5）。エリシター活性は、熱安定性でプロテ アーゼ感受性であり、かつベクター調節調製物(vector control preparation)は
反応をもたらさなかった。部分的精製した過敏感反応エリシタードメイン断片も
、わずかに遅延型の壊死を誘導し、かつこの反応は、HrpZによって誘起されるも
のと同様に、カルシウムチャネルブロッカーである1.0mM塩化ランタンにより阻 害された。（図5）。従って、HrpWハーピンドメインによって誘起された壊死は 、能動的な植物反応である。対照的に、E.coli JA-221（pPEL748）（本明細書に
参照として組入れられているKeen, N.T.らの論文、J.Bacteriol.、168:595-606(
1986)）から得られた精製したE.クリサンセミPelEは、黒色のふやけた壊死を誘 導し、これは1.0mM塩化ランタン、50μMバナジン酸ナトリウムまたは100μMシク
ロヘキシミドによっては阻害されなかった。これは細胞死プログラムの誘導より
もむしろ、弱まった細胞壁による膨れたプロトプラストの分解によって、ペクチ
ックエンザイムが殺傷するという予想と一致した。更に、Pelドメイン断片は、 浸潤したタバコ組織において視覚的な反応を誘導しなかった。3種のタンパク質 は全て、4,5-不飽和ペクチック産物について高感度A230アッセイを用いることに
よって、Pel活性について試験した（本明細書に参照として組入れられているCol
lmer, A.らの論文、Meth. Enzymol.、161:329-35(1988)）。基質としてのポリガ
ラクツロン酸および31％メチルエステル化誘導体、コファクターとしてのCaCl2 およびMnCl2、いくつかのpHレベルを試みたにもかかわらず、活性は検出されな かった。
【００８３】実施例12 −P.シリンガエ病原型トマトDC3000 hrpZおよびhrpW変異株のHRを誘起 する能力は実質的に低下している マーカー交換突然変異誘発を用いて、P.シリンガエ病原型トマト変異株CUCPB5
094(ΔhrpZ::nptII)、CUCPB5095(hrpW::ΩSpr(m abd/cycOB5985 *ΔhrpZ::nptII
hrpW::ΩSpr)を構築した。ΔhrpZ::nptII変異は、機能的に非極性であり、かつ
全ての変異株構築はDNAゲルブロッティングおよびイムノブロッティングによっ て確認した。タバコの葉を、P.シリンガエ病原型トマトDC3000、および前述の3 種の変異株誘導体で2種の接種レベルで浸潤し、その48時間後に壊死した浸潤さ れた組織の割合について調べた（表1）。
【００８４】
【表1】 タバコ葉におけるP.シリンガエ病原型トマトDC3000 hrpZおよびhrpW変異株によ る過敏感反応誘起の頻度の低下 a接種後48時間の接種された総数に対する50％以上の崩壊を示す接種されたパネ ル数
【００８５】 hrpZ hrpW変異株のみが、強固なHRを誘起した頻度を顕著に低下した。この変 異株が毒性も低下したかどうかを決定するために、この変異株および野生型DC30
00を接種したトマト葉を、徴候の発生および細菌増殖について5日間モニタリン グした。差異は認められなかった。P.シリンガエにおいて予想された第二の過敏
感反応エリシターを同定するために、P.シリンガエ病原型トマトDC3000 hrp遺伝
子領域のDNAを、過敏感反応エリシター様表現型を伴う遺伝子についてスクリー ニングした。hrpWは、トランスで発現された場合にHR誘起を妨害すると予測され
たが相反した表現型を有し、かつ先に同定された転写ユニットVと同じであるこ と、および先に同定されたHrp-分泌タンパク質EXP-60をコードしていることが発
見された（本明細書に参照として組入れられているLorang, J.M.らの論文、Mol. Plant-Microbe Interact. 、8:49-57(1995)；Yuan, J.らの論文、J.Bacteriol. 、178:6399-402(1996)）。hrpWおよびその産物のいくつかの特徴は、過敏感反応
エリシターの機能、寄生−促進(parasite-promoting)「Avr」タンパク質が植物 細胞壁を通して植物細胞内に移される機序、ならびに植物病原菌における毒性の
座の保存および組織化に関する懸案の問題点と関わりがあった。
【００８６】 HrpWは、アミノ酸組成、熱安定性、SDS-PAGEにおける予想外の低い移動度、な
らびに完全な長さのタンパク質および短縮されたタンパク質の両方のHRを誘起す
る能力を含む過敏感反応エリシターのいくつかの一般的特徴を有する（本明細書
に参照として組入れられているAlfano, J.R.らの論文、Plant Cell、8:1683-98(
1996)；He, S.Y.らの論文、Cell、73:1255-66(1993)；Wei, Z.M.らの論文、Scie nce 、257:85-8(1992)；Alfano, J.R.らの論文、Mol.Microbiol.、19:715-28(199
6)）。HrpWは、HrpZにおいて認められた反復配列に似た6個のグリシンが豊富な 反復を有し、HrpZの反復が豊富な構造を予想させる（本明細書に参照として組入
れられているAlfano, J.R.らの論文、Mol.Microbiol.、19:715-28(1996)）。相 同の真菌Pelおよび細菌Pelとの比較により、これらのタンパク質において6種全 ての保存されたシステイン残基がHrpWにおいて置換されていことが明らかになっ
たので、過敏感反応エリシターにはシステイン残基が一般に含まれないことは、
特にHrpWにおいて印象的である。これらの特徴の全ては、サルモネラ・チフィム
リウム(Salmonella typhimurium)FlgMタンパク質のような過敏感反応エリシター
が、その基質または標的が存在しない状況において、折りたたまれていない状態
である可能性を生じる（本明細書に参照として組入れられているDaughdrill, G.
W.らの論文、Nature Struct. Biol.、4:285-91(1997)）。これは、鞭毛を介して
の球状タンパク質の動きに対する空間的拘束のために、FlgMにとって重要である
ように見える。過敏感反応エリシターでは、植物細胞へのHrp経路を移動すると 考えられるいくつかのAvrタンパク質は比較的巨大でありかつシステインが豊富 であるので、植物細胞壁マトリックスへの浸透にとっては、折りたたまれていな
い状態の方が、Hrp経路を通じての転位よりも恐らく重要であろう。
【００８７】 単離されたP.シリンガエHrpZおよびHrpWタンパク質がタバコ葉組織を浸潤した
際にHRを誘起する能力は、Avrタンパク質が細菌のHR誘起について必須かつ十分 であるように（一旦は植物細胞質へ送達された）現時点では見えるので、直接生
物学的機能を反映するものではない（本明細書に参照として組入れられているAl
fano, J.R.らの論文、Plant Cell、8:1683-98(1996)）。従って多くの植物の過 敏感反応エリシターに対する過敏感反応は、寄生促進「Avr」タンパク質送達の 助けを借りて局所的に植物細胞壁構造を修飾する際のこれらのタンパク質の主要
活性の副産物であり得る。いくつかに系列化された証拠は、P.シリンガエの過敏
感反応エリシターがHrp分泌システムの細胞外成分であり得ることを示唆してい る：(i)hrpZは、P.シリンガエ病原性変異体間で保存されているように見えるhrp
分泌オペロン内に局在する(本明細書に参照として組入れられているPreston, G.
らの論文、Mol. Plant-Microbe Interact.、8:717-32(1995))、およびhrpW（典 型的なavr遺伝子とは対照的）はhrpクラスターに保存され連結されているように
見える；および(ii)Avrタンパク質は宿主（イエルシニア(Yersinia)Yopエフェク
タータンパク質の接触依存性タイプIII分泌に類似している）と接触したときに のみ細菌細胞質の外へと分泌されるように見えるが（本明細書に参照として組入
れられているCornelis, G.R.らの論文、Mol. Microbiol.、23:861-67(1997)）、
HrpZおよびHrpWは、Hrpシステムが転写活性化された場合に分泌され、このこと はこれらが転座装置の構成要素であり得ることを示唆している；(iii)hrpZまた はhrpWのいずれかのトランスでの発現が、野生型細菌のHR誘起活性を阻害すると
いう知見は、化学量論的に感受性のあるタンパク質アッセンブリの構成要素であ
る過敏感反応エリシターに一致する；(iv)HrpZは、植物の細胞膜よりもむしろ細
胞壁に関連しており、かつこのタンパク質は無壁プロトプラストからは反応を誘
起しない（本明細書に参照として組入れられているHoyos, M.E.らの論文、Mol. Plant-Microbe Interact. 、9:608-16(1996)）；(v)HrpW中のPelドメインの存在 は、このマトリックスの多孔性を制御する成分である細胞壁のペクチック分画と
の相互作用を強力に示唆している（本明細書に参照として組入れられているBaro
n-Epel, O.らの論文、Planta、175:389-95(1988)）。例えばAvrBs3(125kDa)（本
明細書に参照として組入れられているVan den Ackervekenらの論文、Cell、87:1
307-16(1996)）のような巨大なAvrタンパク質類は植物細胞の細胞質に送達され るという証拠が集まるにつれて、Hrpシステムは植物細胞壁を貫通するチャネル を開くということが示唆されている。
【００８８】 HrpWタンパク質では、Pel活性は検出できない。検出可能なインビトロにおい て活性を持たないPel相同体も、いくつかの植物の花粉および花柱組織において 発見されており、これらのタンパク質における触媒的残基の保存は、不可解な酵
素機能を示唆している（本明細書に参照として組入れられているHenrissat, B. らの論文、Plant Physiol.、107:963-76(1995)）。HrpWでPel活性が検出できな いことは、驚くべきことに、P.シリンガエの生物栄養的な(biotrophic)寄生菌感
染および植物組織に対する典型的Pelの損傷作用をもたらさない。しかしながら 、P.シリンガエおよびE.アミローボラのHrpWタンパク質のPelドメインの保存は 、これらのタンパク質がPel-関連機能を有することを示唆している。対照的に、
エリシター−活性ドメインにおける際だった変異は、これらのタンパク質のエリ
シター活性に関する酵素的基礎について反対の結論をもたらす。
【００８９】 転写ユニットVの変異は、P.シリンガエ病原型トマトDC3000のHRも毒性表現型 も低下せず（本明細書に参照として組入れられているLorang, J.M.らの論文、Mo l. Plant-Microbe Interact. 、8:49-57(1995)）、かつhrpZhrpW変異株はHR表現 型のみが顕著に減少した（しかし毒性アッセイはおそらく微妙な低下(subtile r
eduction)をもたらさないであろう）。これらの知見に関するある解釈は、P.シ リンガエは別の過敏感反応エリシター−様タンパク質である、E.クリサンセミと
E.カロトボーラの複数のPelアイソザイム類似体を産生するということである（ 本明細書に参照として組入れられているBarras, F.らの論文、Annu.Rev.Phytopa thol. 、32:201-34(1994)）。恐らく宿主−寄生菌の共進化の結果または細胞壁構
造の複雑さの結果として、重複性（または微妙な特異化）は、植物細胞壁と広範
囲に相互作用する毒性システムの特徴であろう。
【００９０】 他のいくつかの植物病原菌、特にP.ビリディフラバおよびX.カンペルストリス
のhrpWとハイブリダイズする配列の存在は、いくつかの理由で重要である。E.ア
ミローボラまたはE.カロトボーラは、各々、同様の過敏感反応エリシターおよび
Pelを産生することが公知であるが、これらに由来するDNAは、hrpWとはハイブリ
ダイズしないので、P.ビリディフラバおよびX.カンペルストリスとのハイブリダ
イゼーションは、これらの細菌がHrpWに非常に類似したタンパク質を産生するこ
とを示唆している。このことは次にはP.ビリディフラバがHrpシステムを有し、 かつX.カンペルストリスが過敏感反応エリシターを産生することを暗示している
。X.カンペルストリスのHrpシステムは詳細に特徴付けられているにもかかわら ず（本明細書に参照として組入れられているBonas, U.の論文、「微生物学およ び免疫学における最近のトピックス」、第192巻、Bacterial Pathogenesis of P lants and Animals-Molecular and Celler Mechanisms 、Dangl, J.L.編集、（ス
プリンガー−ベルラグ社、ベルリン）、79〜98頁、1994年）、過敏感反応エリシ
ターまたはいずれか他のタンパク質が、培養においてHrpシステムから分泌され ることは認められていない。hrpWは、このようなタンパク質をコードしている遺
伝子のX.カンペルストリスからのクローニングのプローブとして有用であるはず
である。
【００９１】 病原性の島(pathogenicity island)の概念は、hrp遺伝子クラスターが、毒性 に関連した遺伝子が豊富な比較的大きい領域に局在すると予想している（本明細
書に参照として組入れられているGroisman, E.A.らの論文、Cell、87:791-94(19
96)；Alfano, J.R.らの論文、Plant Cell、8:1683-98(1996)）。この毒性領域の
いくつかの部分は、寄生菌の宿主との迅速な共進化ができるように「スイッチ可
能な」エフェクター−コード遺伝子を保持すると予想される。このような例とし
てhrpRからのhrpクラスターの反対端のhrmAlavrPphE座がある。一方より保存さ れた領域が、エフェクター（例えば「Avr」）タンパク質の宿主細胞内部への送 達のような必須の寄生機能に関連した遺伝子を保持するであろう。P.シリンガエ
病原性変異株のトマトおよびシリンガエの比較は、hrpWがこのような領域に位置
していることを示している。まとめると、これらの知見は、細菌の植物病原性に
おけるHrpWの広範な重要な役割を示唆している。過敏感反応エリシターおよびAv
rタンパク質の両方共、タイプIII経路を移動しなければならないが、これらは、
それらの構造特性、それらの培地中に分泌される能力、ならびにそれらの宿主−
範囲決定に対する作用および他の毒性への寄与が際立って異なっている。Pelド メインを伴うP.シリンガエ過敏感反応エリシターの発見は、多くのAvrタンパク 質は植物細胞の内部に作用し、かつ過敏感反応エリシターは外部に作用するとい
うように、それらの作用部位も異なることの更なる証拠を提供している。
【００９２】 本発明は例証することを目的として詳細に説明してきたが、このような詳細は
その目的のためのみであり、添付された請求の範囲によって限定された本発明の
精神および範囲を逸脱しない限りは、当業者によって変更することができると理
解される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、P.シリンガエ病原型トマトDC300 hrpWのトランスでの発 現によるP.フルオロセンス（pHIR11）によってタバコにおいて誘起されたHRの阻
害を示す。hrpW領域を保持するベクターpML123誘導体で、その中の2種が示され た部位にΩSpr挿入断片を有するものを左側に示した。タバコ葉に対して、これ らの構築体を保持するP.フルオロセンス細胞を濃度5 x 108細胞／mlで接種した 後24時間での作用を、右側に示した。
【図２】 図2A-Cは、P.シリンガエ病原型トマトDC300 hrpW領域の物理的地
図、P.シリンガエ病原型シリンガエB728aの相当領域とその保存、HrpWの構造的 特長を示す。図2Aは、推定σ54プロモーター示す白矢印、および先に定義された
転写ユニットを制御する推定HrpL-依存性プロモーターを示す黒矢印とを一緒に 示した、hrp遺伝子クラスターに隣接するDC3000ゲノムの物理的地図を示す（本 明細書に参照として組入れられているLorang, J.M.らの論文、Mol.Plant-Microb e Interact. 、8:49-57(1995)）。hrpRおよびhrpSは、調節タンパク質をコードし
、かつhrpクラスターの右側末端に位置している。地図上のボックスの数値は、D
C3000 DNA配列と直線上に並置されたB728a DNA部分配列との同一性の割合である
。図2BのHrpWの略図は、過敏感反応エリシター様ドメインおよびペクテートリア
ーゼ(pectate lyase)(「Pel」）様ドメインを示している。PCRサブクローニング
によって作出したHis6-標識した過敏感反応エリシタードメイン断片は、アミノ 酸1-186を含み；His6-標識したPelドメインは、アミノ酸187-425を含む。図2Cは
、6個のグリシンが豊富な反復（ボックス参照）を含むHrpWの中央領域の配列を 、下記に併記したP.シリンガエ病原型トマト（「Pto」）およびP.シリンガエ病 原型シリンガエ（「Pss」）由来のHrpZタンパク質の類似の反復と共に示す。
【図３】 図3は、他の植物病原菌からの全DNAへの高度にストリンジェント
な条件でのhrpWのハイブリダイゼーションを示す。示された病原菌のDNAを単離 し、EcoRIで消化し、0.5％アガロースゲル上で分解し、Immobilon-N膜に移し、 かつ32P-標識したhrpWサブクローンで62℃でハイブリダイズした。略号：Pto、P
.シリンガエ病原型トマト；Psy、P.シリンガエ病原型シリンガエ；Pgy、P.シリ ンガエ病原型グリシネア；Ppp、P.シリンガエ病原型パピュランス；Ppi、P.シリ
ンガエ病原型ピシ；Pph、P.シリンガエ病原型ファセオリコラ；Pta、P.シリンガ
エ病原型タバシ；Pvf、P.ビリディフラバ；Rso、ラルストニア・ソラナセアラム
；Xam、キサントモナス・カンペストリス病原型アモラシアエ；Xvs、X.カンペス
トリス病原型ベシカトリア；Ea、エルウィニア・アミローボラ；Eca、E.カロト ボーラ；Ech、E.クリサンセミ。
【図４】 図4A-Bは、HrpWならびにその過敏感反応エリシタードメインおよ
びPelドメインの断片を含む調製物のSDS-PAGEおよびイムノブロット分析を示す 。図4Aは、His6-標識した完全な長さのHrpWおよび2種のドメイン断片を、Ni-NTA
クロマトグラフィーにより部分的に精製し、SDS-PAGEにより分離し、かつクーマ
シーブルーR250により染色した。矢印は、完全な長さのHrpWを示し、これは非常
に少量産生された。レーン：1、Pelドメイン断片；2、過敏感反応エリシタード メイン断片；3、HrpW。図4Bにおいて、同じHrpW誘導体を、更に抗-HrpW抗体を用
いたイムノブロッティングをウェスタンライト化学発光アッセイと組み合わせる
ことにより可視化した。レーン：4、Pelドメイン断片；5、過敏感反応エリシタ ードメイン断片；6、HrpW。
【図５】 図5は、HrpWおよびN-末端断片を含有する無細胞調製物によるHR を示す活性組織の死のタバコ葉における誘起を示す。図4において分析したタン パク質調製品を、タバコ葉に浸潤させ、一部においては1.0mM 塩化ランタンと共
に浸潤させた。48時間後に葉を写真撮影した。パネル：A、P.シリンガエ病原型 シリンガエ 61 HrpZ（0.12μg/ml）；B、HrpW；C、HrpWのハーピンドメイン断片
（0.22μg/ml）；D、HrpZ＋塩化ランタン；E、HrpW＋塩化ランタン；F、HrpWのP
elドメイン断片（1.40μg/ml）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｑ 1/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アルファノ ジェイムズ アール. アメリカ合衆国 カリフォルニア州 シミ バレイ サントゥリー レーン 1840

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a)配列番号：1記載のヌクレオチド配列を含むDNA分子、(b)
    配列番号：2記載のアミノ酸を含むタンパク質をコードするDNA分子、(c)ストリ ンジェントな条件下で配列番号：1記載のヌクレオチド配列を含むDNA分子とハイ
    ブリダイズするDNA分子、ならびに(d)DNA分子(a)、(b)および(c)と相補的なDNA 分子からなる群より選択される、過敏感反応を誘起するタンパク質またはポリペ
    プチドをコードする単離されたDNA分子。
  2. 【請求項２】 配列番号：1記載のヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の
    単離されたDNA分子。
  3. 【請求項３】 配列番号：2記載のアミノ酸を含むタンパク質をコードする 、請求項1記載の単離されたDNA分子。
  4. 【請求項４】 ストリンジェントな条件下で配列番号：1記載のヌクレオチ ド配列を含むDNA分子にハイブリダイズする、請求項１記載の単離されたDNA分子
    。
  5. 【請求項５】 DNA分子(a)、(b)および(c)と相補的な、請求項１記載の単離
    されたDNA分子。
  6. 【請求項６】 請求項１記載のDNA分子が挿入された発現ベクター。
  7. 【請求項７】 DNA分子が、適正なセンス鎖方向であり、かつ正しい読み枠 を持つ、請求項６記載の発現ベクター。
  8. 【請求項８】 請求項１記載のDNA分子により形質転換された宿主細胞。
  9. 【請求項９】 植物細胞または細菌細胞からなる群より選択される、請求項
    ８記載の宿主細胞。
  10. 【請求項10】 発現ベクターを用いてDNA分子による形質転換がなされる、 請求項８記載の宿主細胞。
  11. 【請求項11】 請求項１記載のDNA分子により形質転換されたトランスジェ ニック植物。
  12. 【請求項12】 アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ワタ
    、ヒマワリ、ラッカセイ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、マメ、エン
    ドウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、メキャベツ、ビート、パースニ
    ップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレンソウ、タマ
    ネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、カボチャ属、カボチャ、
    ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、柑橘類、イチゴ、ブドウ、ラズ
    ベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、ソルガム、およびサトウキビ
    からなる群より選択される、請求項11記載のトランスジェニック植物。
  13. 【請求項13】 シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、セントポーリア、
    ペチュニア、ペラルゴニューム、ポインセチア、キク、カーネーション、および
    ジニアからなる群より選択される、請求項11記載のトランスジェニック植物。
  14. 【請求項14】 請求項１記載のDNA分子により形質転換されたトランスジェ ニック植物種子。
  15. 【請求項15】 アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ワタ
    、ヒマワリ、ラッカセイ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、マメ、エン
    ドウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、メキャベツ、ビート、パースニ
    ップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレンソウ、タマ
    ネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、カボチャ属、カボチャ、
    ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、柑橘類、イチゴ、ブドウ、ラズ
    ベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、ソルガム、およびサトウキビ
    からなる群より選択される、請求項14記載のトランスジェニック植物種子。
  16. 【請求項16】 シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、セントポーリア、
    ペチュニア、ペラルゴニューム、ポインセチア、キク、カーネーション、および
    ジニアからなる群より選択される、請求項14記載のトランスジェニック植物種子
    。
  17. 【請求項17】 配列番号：2を含むアミノ酸、および配列番号：1記載のヌク
    レオチド配列を含むDNA分子にハイブリダイズする核酸によりコードされるアミ ノ酸を有するタンパク質またはポリペプチドからなる群より選択される、過敏感
    反応を誘起する単離されたタンパク質またはポリペプチド。
  18. 【請求項18】 配列番号：2を含むアミノ酸を有する、請求項17記載の単離 されたタンパク質またはポリペプチド。
  19. 【請求項19】 配列番号：1記載のヌクレオチド配列を含むDNA分子にハイブ
    リダイズする核酸によってコードされる、請求項17記載の単離されたタンパク質
    またはポリペプチド。
  20. 【請求項20】 病気抵抗性を付与するために有効な条件下で、植物または植
    物種子に、非感染型の請求項17記載のタンパク質またはポリペプチドを適用する
    工程を含む、植物に病気抵抗性を付与する方法。
  21. 【請求項21】 適用の間に植物が処理される、請求項20記載の方法。
  22. 【請求項22】 適用の間に植物種子が処理され、更に過敏感反応エリシター
    により処理された種子を天然または人工の土壌に植える工程、および土壌に植え
    た種子から植物を繁殖させる工程を含む、請求項20記載の方法。
  23. 【請求項23】 植物の生育を強化するために有効な条件下で、植物または植
    物種子に、非感染型の請求項17記載のタンパク質またはポリペプチドを適用する
    工程を含む、植物の生育を強化する方法。
  24. 【請求項24】 適用の間に植物が処理される、請求項23記載の方法。
  25. 【請求項25】 適用の間に植物種子が処理され、更に過敏感反応エリシター
    により処理された種子を天然または人工の土壌に植える工程、および土壌に植え
    た種子から植物を繁殖させる工程を含む、請求項23記載の方法。
  26. 【請求項26】 昆虫防除に有効な条件下で、植物または植物種子に、非感染
    型の請求項17記載のタンパク質またはポリペプチドを適用する工程を含む、植物
    のための昆虫防除の方法。
  27. 【請求項27】 適用の間に植物が処理される、請求項26記載の方法。
  28. 【請求項28】 適用の間に植物種子が処理され、更に過敏感反応エリシター
    により処理された種子を天然または人工の土壌に植える工程、および土壌に植え
    た種子から植物を繁殖させる工程を含む、請求項26記載の方法。
  29. 【請求項29】 請求項１記載のDNA分子により形質転換されたトランスジェ ニック植物、または植物種子を提供する工程、および病気抵抗性を付与するため
    に有効な条件下で、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物種子
    から作出されたトランスジェニック植物を生育させる工程を含む、植物に病気抵
    抗性を付与する方法。
  30. 【請求項30】 トランスジェニック植物が提供される、請求項29記載の方法
    。
  31. 【請求項31】 トランスジェニック植物種子が提供される、請求項29記載の
    方法。
  32. 【請求項32】 請求項１記載のDNA分子により形質転換されたトランスジェ ニック植物または植物種子を提供する工程、および植物の生育を強化するために
    有効な条件下で、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物種子
    から作出されたトランスジェニック植物を生育させる工程を含む、植物の生育を
    強化する方法。
  33. 【請求項33】 トランスジェニック植物が提供される、請求項32記載の方法
    。
  34. 【請求項34】 トランスジェニック植物種子が提供される、請求項32記載の
    方法。
  35. 【請求項35】 請求項１記載のDNA分子により形質転換されたトランスジェ ニック植物または植物種子を提供する工程、および昆虫防除に有効な条件下で、
    トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物種子から作出されたト
    ランスジェニック植物を生育させる工程を含む、植物のための昆虫防除の方法。
  36. 【請求項36】 トランスジェニック植物が提供される、請求項35記載の方法
    。
  37. 【請求項37】 トランスジェニック植物種子が提供される、請求項35記載の
    方法。
  38. 【請求項38】 請求項17記載のタンパク質またはポリペプチド、および 担体を含む組成物。
  39. 【請求項39】 肥料、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、およびそれらの混合物
    からなる群より選択される添加剤をさらに含む、請求項38記載の組成物。
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