CN1265145A - 过敏反应引发剂片段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及欧文氏菌属过敏反应引发剂蛋白或多肽在植物中引发过敏反应的分离的片段。也公开了编码欧文氏菌属过敏反应引发片段的分离的DNA分子。过敏反应引发剂蛋白或多肽引发过敏反应的分离片段和编码它们的分离DNA片段,可以用来赋予植物的抗病性、增强植物生长和/或防治植物虫害。通过在有效赋予抗病性、增强植物生长和/或防治植物或由植物种子培育的植物的虫害的条件下,将非感染形式的过敏反应引发剂蛋白或多肽引发过敏反应的片段施用于所述植物或植物种子上,可以达到这一点。或者,提供用编码过敏反应引发片段的DNA分子转化的转基因植物或植物种子,并在有效赋予抗病性、增强植物生长和/或防治植物或由所述植物种子培育的植物的虫害的条件下,种植转基因植物或由所述转基因植物种子产生的植物。

Description

过敏反应引发剂片段及其应用
本申请要求美国专利申请系列第60/048,109号的权益。
                      发明领域
本发明涉及过敏反应引发剂片段及其应用，所述片段引发过敏反应。
                      发明背景
细菌病原体及其植物宿主之间的相互作用一般分为两类：(1)相容性的(病原体-宿主)，导致在所述宿主植物中细胞间的细菌生长、症状发展和疾病发展；和(2)不相容性的(病原体-非宿主)，导致过敏反应(发生的一种特有类型的不相容相互作用)，没有进行性的病症。在宿主植物的相容性相互作用期间，细菌群体急剧增加，并且发生进行性症状。在不相容性相互作用期间，细菌群体不增加，不发生进行性症状。
过敏反应是一种快速的局部坏死，与植物对许多病原体的主动防御有关(Kiraly，Z.，“侵入者触发的防御：过敏性，”第201-224页，载于Plant Disease：An Advanced Treatise，第5卷，J.G.Horsfall和E.B.Cowling编辑，Academic Press New York(1980)；Klement，Z.，“过敏性”第149-177页，载于Phytopathogenic Prokaryotes，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy编辑，Academic Press，New York(1982))。如果高浓度(≥107细胞/ml)的宿主范围有限的病原体(如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)或解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora))浸润到非宿主植物叶中，则容易观察到表现为组织衰萎的由细菌引发的过敏反应(在低水平接种物下坏死仅发生在分离的植物细胞中)(Klement，Z.，“快速检测致植物病假单胞菌的致病性”Nature 199：299-300；Klement等，“在烟草叶中由致植物病细菌诱导的过敏反应”Phytopathology 54：474-477(1963)；Turner等，“参与过敏反应的植物和细菌细胞之间的定量关系”Phytopathology 64：885-890(1974)；Klement，Z.，“过敏性”第149-177页，载于Phytopathogenic Prokaryotes，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy编辑，Academic Press，New York(1982))。看来在非宿主中引发过敏反应的能力和在宿主中具有致病性有关。正如Klement，Z.，“过敏性”第149-177页，载于PhytopathogenicProkarvotes，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy编辑，Academic Press，New York所述，这些病原体在与相容宿主的相互作用中也引起尽管延长、但生理学上相似的坏死。此外，产生过敏反应或发病的能力取决于一组命名为hrp的共同的基因(Lindgren，P.B.等，“丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.‘phaseolicola’)的基因簇控制对菜豆植物的致病性和在非宿主植物上的过敏性”J.Bacteriol. 168：512-22(1986)；Willis，D.K.等，“致植物病细菌的hrp基因，”Mol.Plant-Microbe Interact.4：132-138(1991))。因此，过敏反应可能保留植物防御本质和细菌致病性基础的线索。
hrp基因广泛存在于革兰氏阴性植物病原体中，在这些植物病原体中，它们是成簇的、保守的，在某些情况下可交换(Willis，D.K.等，“致植物病细菌的hrp基因，”Mol.Plant-Microbe Interact.4：132-138(1991)；Bonas，U.，“致植物病细菌的hrp基因，”第79-98页，载于Current Topics in Microbiology and Immunology：Bacterial Pathogenesisof Plants and Animals-Molecular and Cellular Mechanisms，J.L.Dangl编辑，Springer-Verlag，Berlin(1994))。几种hrp基因编码与耶尔森氏菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)和沙门氏菌属(Salmonella)菌(spp.)所用途径相似的蛋白分泌途径，所述蛋白分泌途径分泌动物疾病中必需的蛋白(Van Gijsegem等，“植物和动物致病细菌中致病性决定簇在进化上保守”Trends Microbiol.1：175-180(1993))。在解淀粉欧文氏菌、丁香假单胞菌和茄假单胞菌(P.solanacearum)中，已经表明hrp基因控制富含甘氨酸的过敏反应的蛋白引发剂的产生和分泌(He，S.Y.等“丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)的HarpinPss：一种通过Hrp途径分泌且在植物中引发过敏反应的蛋白”Cell 73：1255-1266(1993)，Wei，Z.-H.等，“解淀粉欧文氏菌的HrpI在harpin分泌中起作用且为一个新蛋白家族的成员”J.Bacteriol.175：7958-7967(1993)；Arlat，M.等，“PopA1-一种对特定矮牵牛基因型诱导过敏样反应的蛋白，是通过茄假单胞菌的Hrp途径分泌的”EMBO J.13：543-553(1994))。
在引起蔷薇科植物火疫病的细菌解淀粉欧文氏菌Ea321中，发现了这些蛋白中的第一种，命名为harpin(Wei，Z.-M.等，“harpin-由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应的引发剂”Science 257：85-88(1992))。hrpN基因中的突变揭示，解淀粉欧文氏菌在非宿主烟草叶中引发过敏反应和在高度敏感性梨果实中引起病害需要harpin。茄假单胞菌GMI1000 PopA1蛋白具有相似的物理特性，在非该菌株宿主的烟草叶中也引发过敏反应(Arlat等“PopA1-一种对特定矮牵牛基因型诱导过敏样反应的蛋白，是通过茄假单胞菌的Hrp途径分泌的”EMBO J.13：543-53(1994))。然而，茄假单胞菌popA突变体在烟草中仍引发过敏反应，并在番茄中引起病害。因此，在革兰民阴性植物病原体中，这些富含甘氨酸的过敏反应引发剂的作用差异很大。
已经分离、克隆了其它植物病原体的过敏反应引发剂，并对其进行了测序。这些病原体包括菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)(Bauer等，“菊欧文氏菌的HarpinEch：软腐致病机理”MPMI 8(4)：484-91(1995))、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(Cui等，“胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株Ecc71的RsmA-突变体在烟草叶中超量表达hrpNEcc并引发过敏反应样反应”MPMI 9(7)：565-73(1966))、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)(Ahmad等，“harpin不是斯氏欧文氏菌对玉米的致病性所必需的”8thInt’l.Cong.Molec.Plant-Microb.Inter.7月14-19，1996和Ahmad等，“harpin不是斯氏欧文氏菌对玉米的致病性所必需的”Ann.Mtg.Am.Phytopath.Soc.7月27-31，1996)和丁香假单胞菌丁香致病变种(CornellResearch Foundation，Inc.的WO 94/26782)。
本发明试图鉴定引发过敏反应的过敏反应引发剂蛋白或多肽的片段以及这些片段的用途。
                    发明概述
本发明涉及欧文氏菌属过敏反应引发剂蛋白或多肽的分离片段，其中所述片段在引发植物中引发过敏反应。也公开了分离的编码这些片段的DNA分子。
过敏反应引发剂的片段可以用来赋予植物抗病性，以增强植物生长和/或防治虫害。这包括在有效赋予抗病性、增强植物生长和/或防治植物或由所述植物种子生长的植物的虫害的条件下，将非感染性形式的片段应用于植物或植物种子。
作为将所述片段应用于植物或植物种子以赋予抗病性、增强植物生长和/或防治植物虫害的选择方法，可以利用转基因植物或植物种子。当利用转基因植物时，这包括提供用DNA分子转化的转基因植物，所述DNA分子编码过敏反应引发剂蛋白或多肽的片段，所述片段在植物中引发过敏反应；并且在有效赋予抗病性、增强植物生长和/或防治所述植物或由所述植物种子生长的植物的虫害的条件下，培养该植物。或者，可以提供用编码这种片段的DNA分子转化的转基因植物种子，并在土壤中种植。然后，在有效赋予抗病性、增强植物生长和/或防治植物或由所述植物种子生长的植物的虫害的条件下繁殖植物。
                     附图简述
图1展示解淀粉欧文氏菌过敏反应引发剂(即harpin)的缺失和蛋白水解分析。A是该harpin片段的名称。B是以氨基酸残基计的该片段长度。C表示是否产生可检测蛋白。D表明是否有过敏反应(即HR)引发活性。实线表示有不是harpin编码的另外的氨基酸，而虚线表示harpin缺失的部分。框内片段上的数字表示给定片段末端存在于的氨基酸残基；残基#1是N端，而残基#403是C端。
图2是说明harpinEa、而不是harpinEaC31具体分泌的蛋白质印迹。A道，Ea273(pGP1-2)CFEP；B道，Ea273(pGP1-2)(pGPP1104)CFEP；C道，大肠杆菌DH5α(pGPP1107)CFEP harpin的大小标准；D道，BioRad低范围分子量标记；E道，Ea273(pGP1-2)上清液；F道，Ea273(pGP12)(pGPP1104)上清液。用抗harpinEa多克隆抗体探测该印迹。
图3是对如下浸润的烟草叶的HR分析：(1)A，harpinEa+树莓IF；(2)B，harpinEa+苹果IF；(3)C，harpinEa+烟草IF；(4)D，harpinEa+内切蛋白酶Glu-C；(5)E，harpinEa+胰蛋白酶；(6)F，harpinEa；(7)G，烟草IF；(8)H，内切蛋白酶Glu-C；(9)I，胰蛋白酶；和(10)J，harpinEa。IF是指细胞内液。
图4展示用内切蛋白酶Glu-C对harpin的消化。A道是harpin；B道是harpin+内切蛋白酶Glu-C；C道是BioRad低范围分子量标记。
图5A展示harpin的蛋白水解。如下向考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶上样：A，BioRad低范围分子量标记；B，IF-苹果；C，IF-树莓；D，IF-烟草；E，harpinEa；F，harpinEa+IF-苹果；G，harpinEa+IF-树莓；H，harpinEa+IF-烟草。
图5B展示如下上样的考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶：A，IF-烟草；B，IF-烟草+harpinEa；C，harpinEa；D，BioRad低范围分子量标记；E，IF-烟草+harpinEa+PMSF。在凝胶下标明样品蛋白水解后的HR引发活性。
图5C描述蛋白水解活性是否存在于所有测试植物的IF中。通过PAGE，在含0.1％共聚明胶的凝胶中分析从数株植物收获的细胞内液。洗涤以除去SDS和温育以允许明胶蛋白水解后，将凝胶染色，以显示明胶水解活性是否存在。A，IF-苹果；B，IF-烟草；C，IF-栒子属植物；D，BioRad mw；E，内切蛋白酶Glu-C；和F，研磨的叶提取物-烟草。
图6展示用烟草IF蛋白水解harpinEa后引发剂活性肽的重新分级分离。于210nm测量吸光度。峰1含有肽P91和P95；峰2含有肽P65和P69。
图7展示harpin内几种测试的蛋白酶的预测的蛋白水解酶切位点、以及这些酶切对活性harpin片段活性的影响。底部向上的箭头指明根据进一步切割后活性丧失确定的对于HR引发活性潜在重要的残基。
图8展示欧文氏菌属菌(Erwinia spp.)中N端附近的相似性。下划线的残基存在于(相同或相似)5种所检查的蛋白中的至少4种中。前26个残基中的9个残基以该方式保守。
图9A-B展示细菌HR引发蛋白的Kyte-Doolittle hydropathyplot。Ea，解淀粉欧文氏菌EA321；Est，斯氏欧文氏菌DC283；Ech，菊欧文氏菌AC4150；Ecc，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种；Rs，R，solanacearum；Pss，丁香假单胞菌丁香致病变种。
图10展示所述过敏反应引发剂蛋白或多肽的截短蛋白。
图11展示用于构建截短的harpin蛋白的合成寡核苷酸引物一览表。N表示N端(5’区)，而C表示C端(3’区)。所述引物对应于本申请所示序列鉴别号：N1(SEQ.ID.No.1)、N76(SEQ.ID.No.2)、N99(SEQ.ID.No.3)、N105(SEQ.ID.No.4)、N110(SEQ.ID.No.5)、N137(SEQ.ID.No.6)、N150(SEQ.ID.No.7)、N169(SEQ.ID.No.8)、N210(SEQ.ID.No.9)、N267(SEQ.ID.No.10)、N343(SEQ.ID.No.11)、C75(SEQ.ID.No.12)、C104(SEQ.ID.No.13)、C168(SEQ.ID.No.14)、C180(SEQ.ID.No.15)、C204(SEQ.ID.No.16)、C209(SEQ.ID.No.17)、C266(SEQ.ID.No.1 8)、C342(SEQ.ID.No.19)和C403(SEQ.ID.No.20)。
                      发明详述
本发明涉及过敏反应引发剂蛋白或多肽的分离片段，其中所述片段在植物中引发过敏反应。也公开了编码这种片段的DNA分子以及含有这类分子的表达系统、宿主细胞和植物。公开了所述片段本身和编码这些片段的DNA分子的用途。
按照本发明的过敏反应引发剂蛋白或多肽的片段得自种类繁多的真菌和细菌病原体的过敏反应引发剂蛋白或多肽。这类多肽或蛋白能够在用该引发剂接触的植物组织中引发局部坏死。合适的多肽或蛋白引发剂的细菌源的实例包括欧文氏菌属、假单胞菌属和黄单胞菌(Xanthamonas)属菌种(例如以下细菌：解淀粉欧文氏菌、菊欧文氏菌、斯氏欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、丁香假单胞菌、茄假单胞菌、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)和它们的混合物)。
过敏反应引发剂蛋白或多肽的真菌源的实例是疫霉属(Phytophthora)。合适的疫霉属菌种包括寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、樟疫霉(Phytophthoracinnamomi)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、大雄疫霉(Phytophthoramegasperma)和柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)。
来自菊欧文氏菌的过敏反应引发剂蛋白或多肽具有对应于如下SEQ.ID.No.21的氨基酸序列：Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1               5               10              15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser
        20                  25                  30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr
    35                  40                  45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu
50                  55                  60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65                  70                  75                  80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys
            85                  90                  95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp
        100                 105                 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln
    115                 120                 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met
130                 135                 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145                 150                 155                 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly
            165                 170                 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu
        180                 185                 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala
    195                 200                 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val
210                 215                 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225                 230                 235                 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp
            245                 250                 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys
        260                 265                 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln
    275                 280                 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr
290                 295                 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305                 310                 315                 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala
            325                 330                 335Asn Ala
该过敏反应引发剂蛋白或多肽的分子量为34kDa，是热稳定的，其甘氨酸含量高于16％，并基本上不含半胱氨酸。菊欧文氏菌过敏反应引发剂蛋白或多肽由核苷酸序列对应于如下SEQ.ID.No.22的DNA分子编码：
CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG     60
GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC    120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG     180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG     240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG     300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG     360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC     420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT     480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG     540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA     600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC     660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT     720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT     780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC     840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA     900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC     960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC    1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG    1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT    1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT    1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA    1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA    1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA    1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG    1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA    1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC    1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA    1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC    1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA    1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC    1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC    1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG      1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG      1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC      2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG      2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T                          2141
来自解淀粉欧文氏菌的过敏反应引发剂蛋白或多肽具有对应于如下SEQ.ID.No.23的氨基酸序列：Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1               5                   10                  15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln
        20                  25                  30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn
    35                  40                  45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met
50                  55                  60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65                  70                  75                  80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu
            85                  90                  95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr
        100                 105                 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro
    115                 120                 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser
130                 135                 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145                 150                 155                 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly
            165                 170                 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu
        180                 185                 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly
    195                 200                 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly
210                 215                 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225                 230                 235                 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln
            245                 250                 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln
        260                 265                 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe
    275                 280                 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met
290                 295                 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305                 310                 315                 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser
            325                 330                 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn
        340                 345                 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn
    355                 360                 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp
370                 375                 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385                 390                 395                 400Gly Ala Ala
该过敏反应引发剂蛋白或多肽的分子量为39kDa，pI约为4.3，于100℃热稳定至少10分钟。该过敏反应引发剂蛋白或多肽基本上不含半胱氨酸。在Wei，Z.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer和S.V.Beer，“harpin-由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应引发剂”Science 257：85-88(1992)(该文献通过引用结合到本文中)中更全面地描述了得自解淀粉欧文氏菌的过敏反应引发剂蛋白或多肽。编码该多肽或蛋白的DNA分子具有对应于如下SEQ.ID.No.24的核苷酸序列：AAGCTTCGGC   ATGGCACGTT   TGACCGTTGG   GTCGGCAGGG   TACGTTTGAA   TTATTCATAA               60GAGGAATACG   TTATGAGTCT   GAATACAAGT   GGGCTGGGAG   CGTCAACGAT   GCAAATTTCT              120ATCGGCGGTG   CGGGCGGAAA   TAACGGGTTG   CTGGGTACCA   GTCGCCAGAA   TGCTGGGTTG              180GGTGGCAATT   CTGCACTGGG   GCTGGGCGGC   GGTAATCAAA   ATGATACCGT   CAATCAGCTG              240GCTGGCTTAC   TCACCGGCAT   GATGATGATG   ATGAGCATGA   TGGGCGGTGG   TGGGCTGATG              300GGCGGTGGCT   TAGGCGGTGG   CTTAGGTAAT   GGCTTGGGTG   GCTCAGGTGG   CCTGGGCGAA              360GGACTGTCGA   ACGCGCTGAA   CGATATGTTA   GGCGGTTCGC   TGAACACGCT   GGGCTCGAAA              420GGCGGCAACA   ATACCACTTC   AACAACAAAT   TCCCCGCTGG   ACCAGGCGCT   GGGTATTAAC              480TCAACGTCCC   AAAACGACGA   TTCCACCTCC   GGCACAGATT   CCACCTCAGA   CTCCAGCGAC              540CCGATGCAGC   AGCTGCTGAA   GATGTTCAGC   GAGATAATGC   AAAGCCTGTT   TGGTGATGGG              600CAAGATGGCA   CCCAGGGCAG   TTCCTCTGGG   GGCAAGCAGC   CGACCGAAGG   CGAGCAGAAC              660GCCTATAAAA   AAGGAGTCAC   TGATGCGCTG   TCGGGCCTGA   TGGGTAATGG   TCTGAGCCAG              720CTCCTTGGCA   ACGGGGGACT   GGGAGGTGGT   CAGGGCGGTA   ATGCTGGCAC   GGGTCTTGAC              780GGTTCGTCGC   TGGGCGGCAA   AGGGCTGCAA   AACCTGAGCG   GGCCGGTGGA   CTACCAGCAG              840TTAGGTAACG   CCGTGGGTAC   CGGTATCGGT   ATGAAAGCGG   GCATTCAGGC   GCTGAATGAT              900ATCGGTACGC   ACAGGCACAG   TTCAACCCGT   TCTTTCGTCA   ATAAAGGCGA   TCGGGCGATG              960GCGAAGGAAA   TCGGTCAGTT   CATGGACCAG   TATCCTGAGG   TGTTTGGCAA   GCCGCAGTAC             1020CAGAAAGGCC   CGGGTCAGGA   GGTGAAAACC   GATGACAAAT   CATGGGCAAA   AGCACTGAGC             1080AAGCCAGATG   ACGACGGAAT   GACACCAGCC   AGTATGGAGC   AGTTCAACAA   AGCCAAGGGC             1140ATGATCAAAA   GGCCCATGGC   GGGTGATACC   GGCAACGGCA   ACCTGCAGGC   ACGCGGTGCC             1200GGTGGTTCTT   CGCTGGGTAT   TGATGCCATG   ATGGCCGGTG   ATGCCATTAA   CAATATGGCA             1260CTTGGCAAGC   TGGGCGCGGC   TTAAGCTT                                                      1288
得自丁香假单胞菌的过敏反应引发剂蛋白或多肽具有对应于如下SEQ.ID.No.25的氨基酸序列：Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1               5                   10                  15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser
        20                  25                  30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met
    35                  40                  45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala
50                  55                  60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65                  70                  75                  80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe
            85                  90                  95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met
        100                 105                 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu
    115                 120                 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met
130                 135                 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145                 150                 155                 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe
            165                 170                 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile
       180                  185                 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly
    195                 200                 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser
210                 215                 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225                 230                 235                 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp
            245                 250                 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val
        260                 265                 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln
    275                 280                 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala
290                 295                 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305                 310                 315                 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg
            325                 330                 335Asn Gln Ala Ala Ala
        340
该过敏反应引发剂蛋白或多肽的分子量为34-35kDa。它富含甘氨酸(约13.5％)，且缺乏半胱氨酸和酪氨酸。在He，S.Y.，H.C.Huang和A.Collmer，“丁香假单胞菌丁香致病变种的harpinPss：一种通过Hrp途径分泌且在植物中引发过敏反应的蛋白”Cell 73：1255-1266(1993)(该文献通过引用结合到本文中)中发现得自丁香假单胞菌过敏反应引发剂蛋白或多肽的进一步的信息。编码丁香假单胞菌过敏反应引发剂蛋白或多肽的DNA分子具有对应于如下SEQ.ID.No.26的核苷酸序列：ATGCAGAGTC   TCAGTCTTAA   CAGCAGCTCG   CTGCAAACCC   CGGCAATGGC   CCTTGTCCTG                60GTACGTCCTG   AAGCCGAGAC   GACTGGCAGT   ACGTCGAGCA   AGGCGCTTCA   GGAAGTTGTC               120GTGAAGCTGG   CCGAGGAACT   GATGCGCAAT   GGTCAACTCG   ACGACAGCTC   GCCATTGGGA               180AAACTGTTGG   CCAAGTCGAT   GGCCGCAGAT   GGCAAGGCGG   GCGGCGGTAT   TGAGGATGTC               240ATCGCTGCGC   TGGACAAGCT   GATCCATGAA   AAGCTCGGTG   ACAACTTCGG   CGCGTCTGCG               300GACAGCGCCT   CGGGTACCGG   ACAGCAGGAC   CTGATGACTC   AGGTGCTCAA   TGGCCTGGCC               360AAGTCGATGC   TCGATGATCT   TCTGACCAAG   CAGGATGGCG   GGACAAGCTT   CTCCGAAGAC               420GATATGCCGA   TGCTGAACAA   GATCGCGCAG   TTCATGGATG   ACAATCCCGC   ACAGTTTCCC               480AAGCCGGACT   CGGGCTCCTG   GGTGAACGAA   CTCAAGGAAG   ACAACTTCCT   TGATGGCGAC               540GAAACGGCTG   CGTTCCGTTC   GGCACTCGAC   ATCATTGGCC   AGCAACTGGG   TAATCAGCAG               600AGTGACGCTG   GCAGTCTGGC   AGGGACGGGT   GGAGGTCTGG   GCACTCCGAG   CAGTTTTTCC               660AACAACTCGT   CCGTGATGGG   TGATCCGCTG   ATCGACGCCA   ATACCGGTCC   CGGTGACAGC               720GGCAATACCC   GTGGTGAAGC   GGGGCAACTG   ATCGGCGAGC   TTATCGACCG   TGGCCTGCAA               780TCGGTATTGG   CCGGTGGTGG   ACTGGGCACA   CCCGTAAACA   CCCCGCAGAC   CGGTACGTCG               840GCGAATGGCG   GACAGTCCGC   TCAGGATCTT   GATCAGTTGC   TGGGCGGCTT   GCTGCTCAAG              900GGCCTGGAGG   CAACGCTCAA   GGATGCCGGG   CAAACAGGCA   CCGACGTGCA   GTCGAGCGCT              960GCGCAAATCG   CCACCTTGCT   GGTCAGTACG   CTGCTGCAAG   GCACCCGCAA   TCAGGCTGCA             1020GCCTGA                                                                                  1026
得自茄假单胞菌的过敏反应引发剂蛋白或多肽具有对应于如下SEQ.ID.No.27的氨基酸序列：Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1               5                   10                  15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser
        20                  25                  30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile
    35                  40                  45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly
50                  55                  60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65                  70                  75                  80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser
            85                  90                  95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met
        100                 105                 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala
    115                 120                 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val
130                 135                 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145                 150                 155                 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly
            165                 170                 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly
        180                 185                 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala
    195                 200                 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn
210                 215                 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225                 230                 235                 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn
            245                 250                 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln
        260                 265                 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly
    275                 280                 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser
290                 295                 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305                 310                 315                 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln
            325                 330                 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met
        340它由核苷酸序列对应于如下SEQ.ID.No.28的DNA分子编码：ATGTCAGTCG   GAAACATCCA   GAGCCCGTCG   AACCTCCCGG   GTCTGCAGAA   CCTGAACCTC               60AACACCAACA   CCAACAGCCA   GCAATCGGGC   CAGTCCGTGC   AAGACCTGAT   CAAGCAGGTC              120GAGAAGGACA   TCCTCAACAT   CATCGCAGCC   CTCGTGCAGA   AGGCCGCACA   GTCGGCGGGC              180GGCAACACCG   GTAACACCGG   CAACGCGCCG   GCGAAGGACG   GCAATGCCAA   CGCGGGCGCC              240AACGACCCGA   GCAAGAACGA   CCCGAGCAAG   AGCCAGGCTC   CGCAGTCGGC   CAACAAGACC              300GGCAACGTCG   ACGACGCCAA   CAACCAGGAT   CCGATGCAAG   CGCTGATGCA   GCTGCTGGAA              360GACCTGGTGA   AGCTGCTGAA   GGCGGCCCTG   CACATGCAGC   AGCCCGGCGG   CAATGACAAG              420GGCAACGGCG   TGGGCGGTGC   CAACGGCGCC   AAGGGTGCCG   GCGGCCAGGG   CGGCCTGGCC              480GAAGCGCTGC   AGGAGATCGA   GCAGATCCTC   GCCCAGCTCG   GCGGCGGCGG   TGCTGGCGCC              540GGCGGCGCGG   GTGGCGGTGT   CGGCGGTGCT   GGTGGCGCGG   ATGGCGGCTC   CGGTGCGGGT              600GGCGCAGGCG   GTGCGAACGG   CGCCGACGGC   GGCAATGGCG   TGAACGGCAA   CCAGGCGAAC              660GGCCCGCAGA   ACGCAGGCGA   TGTCAACGGT   GCCAACGGCG   CGGATGACGG   CAGCGAAGAC              720CAGGGCGGCC   TCACCGGCGT   GCTGCAAAAG   CTGATGAAGA   TCCTGAACGC   GCTGGTGCAG              780ATGATGCAGC   AAGGCGGCCT   CGGCGGCGGC   AACCAGGCGC   AGGGCGGCTC   GAAGGGTGCC               840GGCAACGCCT   CGCCGGCTTC   CGGCGCGAAC   CCGGGCGCGA   ACCAGCCCGG   TTCGGCGGAT               900GATCAATCGT   CCGGCCAGAA   CAATCTGCAA   TCCCAGATCA   TGGATGTGGT   GAAGGAGGTC               960GTCCAGATCC   TGCAGCAGAT   GCTGGCGGCG   CAGAACGGCG   GCAGCCAGCA   GTCCACCTCG              1020ACGCAGCCGA   TGTAA                                                                       1035
在Arlat，M.，F.Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet和C.A.Boucher，“PopA1-一种对特定矮牵牛基因型诱导过敏样反应的蛋白，是通过茄假单胞菌的Hrp途径分泌的”EMBO J.13：543-553(1994)(该文献通过引用结合到本文中)中，提出了关于得自茄假单胞菌的过敏反应引发剂蛋白或多肽的进一步信息。
来自野油菜黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.glycin)的过敏反应引发剂蛋白或多肽具有对应于如下SEQ.ID.No.29的氨基酸序列：
Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr
            20                  25
该序列是仅具有野油菜黄单胞菌大豆致病变种的过敏反应引发剂蛋白或多肽的26个残基的氨基末端序列。它与在其它野油菜黄单胞菌致病变种中检测到的菌毛亚基蛋白匹配。
来自野油菜黄单胞菌天竺葵致病变种(Xanthomonas campestris pv.pelargonii)的过敏反应引发剂蛋白或多肽是热稳定的，对蛋白酶敏感，其分子量为20kDa。它包含对应于如下SEQ.ID.No.30的氨基酸序列：
Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Met
            20
在Cui等，“胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种菌株Ecc71的RsmA-突变体在烟草叶中超量表达hrp NEcc并引发过敏反应样反应”MPMI，9(7)：565-73(1996)中，描述了胡萝卜软腐欧文氏菌过敏反应引发剂蛋白或多肽的分离，该文献通过引用结合到本文中。在Ahmad等，“harpin不是斯氏欧文氏菌对玉米的致病性所必需的”8th Int’l.Cong.Molec.Plant-Microbe Interact.7月14-19，1996和Ahmad等，“harpin不是斯氏欧文氏菌对玉米的致病性所必需的”Ann.Mtg.Am.Phytoath.Soc.7月27-31，1996中，陈述了斯氏欧文氏菌的过敏反应引发剂蛋白或多肽，这些文献通过引用结合到本文中。
在以下文献中描述了来自寄生疫霉、隐地疫霉、樟疫霉、大雄疫霉和柑桔褐腐疫霉的过敏反应引发剂蛋白或多肽：Kaman等，“来自疫霉属的胞外蛋白引发剂：大多数对细菌和真菌植物病原体具特异性并诱导对其的抗性”Molec.Plant-Microbe Interact.，6(1)：15-25(1993)，Ricci等，“来自致病真菌疫霉属在烟草中引发坏死和获得性抗性的蛋白的结构和活性”Eur.J.Biochem.，183：555-63(1989)，Ricci等，“寄生疫霉分离物在烟草中的parasiticein的差示产生和坏死和抗性的引发剂”Plant Path.41：298-307(1992)，Baillreul等，“烟草中一种新的过敏反应引发剂：一种真菌糖蛋白引发细胞死亡、防御基因的表达、水杨酸的产生和系统获得性抗性的诱导”Plant J.，8(4)：551-60(1995)和Bonnet等，“在烟草和其它植物中由引发剂触发的获得性抗性”Eur.J.Plant Path.，102：181-92(1996)，这些文献通过引用结合到本文中。
以上引发剂是示范性的。通过在表达编码引发剂的基因的条件下培养引发过敏反应的真菌或细菌，可以鉴定其它引发剂。通过用来自培养上清液的无细胞制备物浸润合适的植物组织，可以测试所述制备物的引发剂活性(即局部坏死)。
本发明的方法包括上述过敏反应引发剂多肽或蛋白的片段以及来自其它病原体的全长引发剂的片段。
可以用几种方法产生合适的片段。首先，通过常规分子遗传操作，通过亚克隆基因片段，产生编码已知引发剂蛋白的亚克隆。然后使所述亚克隆在体外或在细菌细胞中体内表达，以产生较小的蛋白或肽，可以按照下述步骤测试其引发剂活性。
作为另一种方法，通过用象胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌属(Staphylococcus)蛋白酶A或胰蛋白酶消化全长的引发剂蛋白，可以产生引发剂蛋白片段。根据该引发剂蛋白的氨基酸序列，不同的蛋白水解酶可能在不同位点切割引发剂蛋白。由蛋白水解产生的一些片段可能是抗性的活性引发剂。
在另一方法中，根据对该蛋白一级结构的了解，可以采用PCR技术和选择代表该蛋白特定部分的特定的数组引物，合成该引发剂蛋白基因的片段。然后将这些片段克隆入合适的载体中，以表达截短的肽或蛋白。
也可以用化学合成来制备合适的片段。用待产生的引发剂的已知氨基酸序列，进行这种合成。或者，使全长引发剂经水高温和高压将产生片段。然后，可以通过常规方法(例如层析、SDS-PAGE)分离这些片段。
欧文氏菌属过敏反应引发剂引发过敏反应的合适片段的实例，是解淀粉欧文氏菌过敏反应引发剂的片段。合适的片段包括：SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的C端片段、SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的N端片段或SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的内部片段。SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的C端片段可以跨越SEQ.ID.No.23的氨基酸105和403。SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的N端片段可以跨越SEQ.ID.No.23的以下氨基酸：1和98、1和104、1和122、1和168、1和218、1和266、1和342、1和321以及1和372。SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的内部片段可以跨越SEQ.ID.No.23的以下氨基酸：76和209、105和209、99和209、137和204、137和200、109和204、109和200、137和180以及105和180。可以按照本发明鉴定其它合适的片段。
通过例如缺失或添加对该多肽的特性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸，可以制备变异体。例如，可以将一段多肽连接至该蛋白N末端的信号(或前导)序列，该信号序列在共同翻译时或翻译后指导该蛋白的转移。该多肽也可以连接于一接头或其它序列，以便容易合成、纯化或鉴定该多肽。
最好用常规技术，以纯化形式(纯度优选至少约为60％，更优选为80％)产生本发明的片段。通常，产生本发明的片段，但不将其分泌到重组宿主细胞的生长培养基中。或者，本发明的蛋白或多肽分泌到生长培养基中。在非分泌蛋白的情况下，为了分离所述蛋白片段，繁殖携带重组质粒的宿主细胞(例如大肠杆菌)，通过超声处理、加热或化学处理裂解细胞，并将匀浆离心以去除细菌碎片。然后将上清液热处理，通过离心分离该片段。将含有该片段的上清液部分在大小合适的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中经过凝胶过滤，以分离该片段。必要时，可以通过离子交换或HPLC进一步纯化该蛋白部分。
可以采用常规重组DNA技术，将编码该过敏反应引发剂多肽或蛋白片段的DNA分子引入细胞中。一般而言，这包括将该DNA分子插入该DNA分子为异源(即通常不存在)的表达系统中。将该异源DNA分子以正确的方向插入表达系统或载体的正确读框中。该载体含有所插入的蛋白编码序列转录和翻译的必需元件。
Cohen和Boyer的美国专利第4,237,224号(该专利通过引用结合到本文中)描述了采用限制性酶切和用DNA连接酶连接，产生重组质粒形式的表达系统。然后通过转化引入这些重组质粒，并在包括原核生物和在组织培养物中生长的真核细胞在内的单细胞培养物中繁殖。
也可以将重组基因引入诸如痘苗病毒的病毒中。可以通过将质粒转染入受病毒感染的细胞中，产生重组病毒。
合适的载体包括但不限于以下的病毒载体，诸如λ载体系统gt11、gtWES.tB、卡隆4；和质粒载体，诸如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/-或KS+/-(参见“Stratagene克隆系统”Stratagene的产品目录(1993)，La Jolla，Calif，该产品目录通过引用结合到本文中)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(参见F.W.Studier等，“使用T7 RNA聚合酶指导所克隆基因的表达”Gene Expression Technology第185卷(1990)，该文献通过引用结合到本文中)和它们的衍生物。可以通过转化，特别是转导、接合、带动转移(mobilization)或电穿孔，将重组分子引入细胞中。采用本领域标准克隆方法，将所述DNA序列克隆入载体中，所述标准克隆方如Sambrook等，分子克隆：实验手册，ColdSprings Laboratory，Cold Springs Harbor，New York(1989)中所述，该文献通过引用结合到本文中。
可以利用多种宿主-载体系统表达所述蛋白编码序列。主要的是，该载体系统必需与所用的宿主匹配。宿主-载体系统包括但不限于以下：用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；诸如含有酵母载体的酵母的微生物；用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；和用细菌感染的植物细胞。这些载体的表达元件的强度和特异性不同。根据所用的宿主-载体系统，可以使用许多合适的转录和翻译元件中的任何一种。
不同的基因信号和加工事件控制许多基因表达水平(例如DNA转录和信使RNA(mRNA)翻译)。
DNA的转录取决于启动子是否存在，启动子是指导RNA聚合酶结合并藉此促进RNA合成的DNA序列。真核启动子的DNA序列不同于原核启动子的DNA序列。而且，真核启动子和伴随的遗传信号在原核系统中可能不被识别或可能不起作用，此外，原核启动子在真核细胞不被识别并且不起作用。
同样，mRNA在原核细胞中的翻译取决于不同于真核信号的适当的原核信号是否存在。mRNA在原核细胞中的有效翻译需要该mRNA上称为Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖体结合位点。该序列是短的mRNA核苷酸序列，位于起始密码子之前，起始密码子通常为AUG，编码该蛋白氨基末端的甲硫氨酸。SD序列与16S RNA(核糖体RNA)的3’端互补，并且可能通过与该rRNA形成双链，促进mRNA结合于核糖体，以允许核糖体正确的定位。关于使基因表达最大化的综述，参见Roberts和Lauer，Methods in Enzymology，68：473(1979)，该文献通过引用结合到本文中。
启动子的“强度”(即它们促进转录的能力)不同。为了表达所克隆的基因，最好使用强启动子，以获得高水平的转录，并由此获得高水平的基因表达。根据所用的宿主细胞系统，可以使用多种合适启动子中的任一种。例如，当在大肠杆菌、其噬菌体或质粒中克隆时，可以使用以下启动子来指导相邻DNA区段的高水平转录：诸如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体λ的PR启动子和PL启动子和其它启动子，包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等。另外，杂种trp-lacUV5(tac)启动子或用重组DNA技术或其它合成DNA技术产生的其它大肠杆菌启动子可以用来提供所插入基因的转录。
可以选择除非特异性诱导、否则抑制该启动子作用的细菌宿主细菌菌株和表达载体。在某些操作中，加入特定的诱导物对于所插入基因的有效转录是必需的。例如，通过加入乳糖或IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导lac操纵子。诸如trp、pro等的多种其它操纵子处于不同的控制之下。
在原核细胞中有效的基因转录和翻译也需要特定的起始信号。分别通过合成的基因特异性信使RNA和蛋白的量测定，这些转录和翻译起始信号的“强度”不同。含有启动子的DNA表达载体也可以含有不同的“强”转录和/或翻译起始信号的组合。例如，在大肠杆菌中的有效表达需要距起始密码子(“ATG”)5’端7-9个碱基的SD序列，以提供一个核糖体结合位点。因此，宿主细胞可以利用的任何SD-ATG组合均可以使用。这类组合包括但不限于来自大肠杆菌噬菌体λ的cro基因或N基因、或来自大肠杆菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG组合。另外，可以使用用重组DNA技术或涉及引入合成核苷酸序列的其它技术的产生的任何SD-ATG组合。
一旦将编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的片段的分离DNA分子克隆入表达系统，则可以将其引入宿主细胞。这类引入可以通过不同形式的上述转化进行，这取决于所述载体/宿主细胞系统。合适的宿主细胞包括但不限于细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、植物等。
本发明还涉及赋予植物抗病性、增强植物生长和/或实现植物虫害防治的方法。这些方法包括将过敏反应引发剂多肽或蛋白引发过敏反应的非感染形式的片段，在该片段有效赋予抗病性、增强生长和/或防治虫害的条件下，以应用于植物或植物种子的全部或一部分。或者，可以将过敏反应引发剂蛋白或多肽的这些片段应用于植物，使得从这种植物本身回收的种子能够赋予植物抗病性、增强植物生长和/或实现虫害的防治。
作为将过敏反应引发剂多肽或蛋白应用于植物或植物种子、以便赋予植物抗病性、实现植物生长和/或防治植物或由所述种子生长的植物的虫害的替代方法，可以利用转基因植物或植物种子。当利用转基因植物时，这包括提供用编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的片段的DNA分子转化的转基因植物，其中所述片段引发过敏反应；并在有效允许该DNA分子赋予植物抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件下培育该植物。或者，可以提供用编码过敏反应引发剂多肽或蛋白的片段的DNA分子转化的转基因植物种子，其中所述片段引发过敏反应；并将所述植物种子种植于土壤中。然后在有效允许该DNA分子赋予植物抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件下，从该植物种子繁殖植物。
本发明将所述过敏反应引发剂多肽或蛋白应用于植物或植物种子的实施方案，以多种方式进行，包括：1)应用分离的片段，或2)应用不引起病害并用编码该片段的基因转化的细菌。在后一实施方案中，可以通过应用含有编码该过敏反应引发剂多肽或蛋白引发过敏反应的片段的DNA分子的细菌，将该片段应用于植物或植物种子。这类细菌必须能够分泌或输出该片段，使得该片段可以接触植物细胞或植物种子细胞。在这些实施方案中，由植物或种子中的所述细菌生产该片段，或恰好在将所述细菌引入植物或植物种子之前，由细菌生产该片段。
本发明的方法可以用来处理种类繁多的植物及其种子，以赋予抗病性、增强生长和/或防治虫害。合适的植物包括双子叶植物和单子叶植物。更具体地讲，有用的作物可以包括：亚麻、水稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、番薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、卷心菜、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、硬花茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨子、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。合适的观赏植物的实例是：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、非洲紫苣苔属(Saintpaulia)、矮牵牛、天竺葵属植物、一品红、菊花、康乃馨和百日草。
关于本发明过敏反应引发剂蛋白或多肽片段在赋予抗病性方面的用途，可能不赋予对感染的绝对免疫，但降低病害的严重程度和延迟症状的发生。侵蚀斑数、侵蚀斑的大小和真菌病原体孢子形成的程度均降低和减小。赋予抗病性的该方法具有治疗先前无法治疗的病害、治疗由于成本可能没有治疗的系统性病害以及避免使用传染物或环境有害材料的潜力。
按照本发明的赋予植物的病原体抗性的方法，可用来赋予对种类繁多的病原体的抗性，所述病原体包括病毒、细菌和真菌。通过本发明的方法可以获得特别是对以下病毒的抗性：烟草花叶病毒和番茄花叶病毒。按照本发明可以赋予植物特别是对以下细菌的抗性：茄假单胞菌、丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonas syringae pv.tabaci)和野油菜黄单胞菌天竺葵致病变种。利用本发明方法可以使植物特别是抗以下真菌：尖镰孢(Fusarium oxysporum)和致病疫霉(Phytophthorainfestans)。
关于本发明过敏反应引发剂蛋白或多肽片段增强植物生长的用途，可以获得各种形式的植物生长增强或促进。这可以在早至植物开始从种子生长或在植物生命较晚时发生。例如，按照本发明的植物生长包括产量更大、产生的种子量增加、萌发的种子百分率提高、植物大小增加、生物量增加、果实更多更大、果实着色更早以及果实和植物成熟更早。结果，本发明为栽培者提供显著的经济利益。例如萌发早和成熟早使得作物在短生长季节在其它情况下妨碍作物在该地生长的地区生长。产量更高、大小更大和生物量产量提高，使得由给定小区土地产生的岁入更多。
本发明的另一方面涉及实现任一形式的植物虫害防治。例如，按照本发明的虫害防治包括防止昆虫接触应用所述过敏反应引发剂的植物、防止昆虫通过取食伤害植物、使昆虫离开这类植物、杀死接近这类植物的昆虫、干扰昆虫幼虫在这类植物上取食、防止昆虫在宿主植物上定殖、防止定殖昆虫释放毒植物素等。本发明也防止由昆虫感染产生的对植物的后续病害。
本发明对种类繁多的昆虫有效。欧洲玉米螟是玉米(马齿种甜玉米(dent and sweet corn))的主要害虫，但也在包括绿菜豆(green bean)、黄荚种菜豆和利马豆以及食用大豆、胡椒、马铃薯和番茄以及许多杂草物种在内的超过200种植物物种上取食。损害种类繁多的蔬菜作物的其它的昆虫幼虫取食害虫包括以下：甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、玉米穗蛾、秋粘虫、小菜蛾、甘蓝根花蝇(cabbage root maggot)、葱蝇、瓜种蝇、瓜野螟(甜瓜绢野螟)、胡椒实蝇、番茄蠹蛾和蛆。总起来说，该组害虫代表一组世界范围内在经济上最重要的蔬菜生产的害虫。
当处理植物全部或一部分，包括处理叶、茎、根等时，可以通过多种方法，进行涉及应用过敏反应引发剂多肽或蛋白片段的本发明方法，其中所述片段引发过敏反应。这可以(但不必)包括使该过敏反应引发剂多肽或蛋白浸润入该植物。合适的应用方法包括高压或低压喷洒、注射和接近施用引发剂时擦伤叶片。当按照本发明应用实施方案处理植物种子和繁殖体(例如插条)时，可以通过低压和高压喷洒、涂布、浸渍或注射，施用按照本发明的过敏反应引发剂蛋白或多肽的片段。本领域技术人员可以设想其它合适的施用方法，只要它们能够实现该片段与该植物或植物种子的细胞接触即可。一旦用本发明的过敏反应引发剂片段处理，则可以将种子种植于天然或人工土壤中，采用常规方法栽培以产生植物。从按照本发明处理的种子繁殖出植物后，所述植物可以施用所述过敏反应引发剂蛋白或多肽片段或完整的引发剂处理一次或多次，以赋予植物抗病性、增强植物生长和/或防治该植物的虫害。
按照本发明的过敏反应引发剂多肽或蛋白的片段可以单独或与其它材料混合，施用于植物或植物种子上。或者，可以在不同时间分别施用该片段和其它材料。
适用于按照本发明的应用实施方案处理植物或植物种子的组合物，在载体中含有过敏反应引发剂多肽或蛋白引发过敏反应的片段。合适的载体包括水、水溶液、浆液或干粉。在该实施方案中，该组合物含有高于500nM的该片段。
尽管不需要，但该组合物可以含有其它的添加剂，包括肥料、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂和它们的混合物。合适的肥料包括(NH4)2NO3。合适的杀虫剂的实例是马拉硫磷。有用的杀真菌剂是克菌丹。
其它合适的添加剂包括缓冲剂、润湿剂、包被剂(coating agent)和摩擦剂。这些材料可以用来促进本发明方法。另外，过敏反应引发片段可以与其它常规种子制剂和处理材料(包括粘土和多糖)施用于植物种子。
在本发明涉及使用转基因植物和转基因种子的替代实施方案中，过敏反应引发片段不必局部施用于植物或种子。而是，按照本领域熟知的方法，产生用编码这种片段的DNA分子转化的转基因植物。
可以利用微量吸管，将上述载体直接微注射入植物细胞中，以机械转移该重组DNA。Crossway，Mol.Gen.Genetics，202：179-85(1985)，该文献通过引用结合到本文中。也可以用聚乙二醇将该遗传物质转移到植物细胞中。Krens等，Nature，296：72-74(1982)，该文献通过引用结合到本文中。
用赋予对病原体抗性的基因转化植物细胞的另一种方法是粒子轰击(也称为生物弹道转化)宿主细胞。这可以以几种方式之一完成。第一种方法涉及将惰性或生物活性粒子发射到细胞。该技术在Sanford等的美国专利第4,945,050、5,036,006和5,100,792号中有描述，这些专利通过引用结合到本文中。一般而言，该方法包括在有效刺入细胞外表面并被引入细胞内部的条件下，将惰性或生物活性粒子发射到所述细胞。当利用惰性粒子时，可以通过用含该异源DNA的载体包被所述粒子，将该载体引入细胞。或者，可以用该载体包围靶细胞，使得该载体跟随所述粒子而被携带入细胞。也可以将生物活性粒子(例如含有该载体和异源DNA的干燥的细菌细胞)发射入植物细胞。
再一引入方法是原生质体与其它实体融合，所述其它实体或者为小细胞、细胞、溶酶体，或者为其它可融合的脂质表面的物体。Fraley等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA.79：1859-63(1982)，该文献通过引用结合到本文中。
也可以将该DNA分子通过电穿孔引入植物细胞中。Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：5824(1985)，该文献通过引用结合到本文中。在该技术中，在含所述表达盒的质粒存在下，将植物原生质体电穿孔。高场强的电脉冲使生物膜可逆地通透，允许引入所述质粒。电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁，分裂并再生。
将该DNA分子引入植物细胞的另一种方法是用预先用该基因转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(A.rhizogenes)感染植物细胞。在本领域已知的合适条件下，培养转化的植物细胞，以形成苗或根，并进一步发育为植物。一般而言，该方法涉及用细菌悬浮液接种植物组织，并在无抗生素的再生培养基上，于25-28℃培养该组织48-72小时。
农杆菌是革兰氏阴性根瘤菌科(Rhizobiaceae)的一个代表属。该属的物种引起根瘤病(根癌农杆菌)和毛根病(毛根农杆菌)。根瘤和毛根中的植物细胞被诱导产生称为冠瘿碱的氨基酸衍生物，它们仅被细菌分解代谢。负责表达冠瘿碱的细菌基因是嵌合表达盒控制元件的便利的来源。另外，对冠瘿碱存在的分析，可以用来鉴定转化的组织。
可以利用根癌农杆菌的Ti质粒或毛根农杆菌的Ri质粒，将异源基因序列引入合适的植物细胞中。农杆菌感染时，将Ti质粒或Ri质粒转送植物细胞，并且稳定地整合入植物基因组中。J.Schell，Science.237：1176-83(1987)，该文献通过引用结合到本文中。
转化后，必须再生转化的植物细胞。
在Evans等，Handbook of Plant Cell Cultures.第1卷：(MacMillanPubilishing Co.，New York，1983)；和Vasil I.R.(编辑)，Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants，Acad.Press，Orlando，第I卷，1984和第III卷(1986)中描述了由培养的原生质体再生植株，所述文献通过引用结合到本文中。
已知实际上可以由培养的细胞或组织再生所有的植物，包括但不限于甘蔗、糖甜菜、棉花、果树和豆科植物的所有主要物种。
再生方法随植物物种而变，但一般首先提供转化的原生质体的悬浮液或含转化的外植体的培养皿。形成愈伤组织，并可以由愈伤组织诱导苗，随后生根。或者，可以在愈伤组织中诱导胚形成。这些胚作物天然的胚开始发育形成植株。培养基一般含有各种氨基酸和激素，诸如生长素和细胞分裂素。也最好将谷氨酸和脯氨酸加入培养基中，尤其对于玉米和亚麻的这类物种。有效的再生将取决于培养基、基因型、培养的历史。如果控制这三种变量，则再生一般可重现和可重复。
在表达盒稳定引入转基因植物后，可以通过有性杂交将其转移至其它植物。许多标准育种技术的任一种均可以使用，这取决于待杂交的物种。
一旦产生了该类型的转基因植物，则按照常规方法培育所述植物本身，编码该过敏反应引发片段的基因的存在导致抗病性、增强植物生长和/或防治植物虫害。或者从转基因植物回收转基因种子或繁殖体(例如插条)。然后可以将种子种植于土壤中，并用常规方法栽培，以产生转基因植物。在有效赋予植物抗病性、增强植物生长和/或防治虫害的条件下，由种植的转基因种子繁殖转基因植物。尽管不希望被理论束缚，但这种抗病性、生长的增强和/或虫害的防治可能是RNA介导的，或可能由于表达所述多肽或蛋白片段而产生。
当按照本发明使用转基因植物和植物种子时，它们还可以用处理施用过敏反应引发片段的植物和种子所用的相同材料进行处理。这些其它材料包括过敏反应引发片段，可以通过上述方法施用于转基因植物和植物种子，所述方法包括高压或低压喷洒、注射、涂布和浸渍。同样，在由转基因植物种子繁殖植物后，所述植物可以用过敏反应引发片段处理一次或多次，以赋予抗病性、增强生长和/或防治虫害。这类植物也可以用常规植物处理剂(例如杀虫剂、肥料等)处理。
                         实施例实施例1-所有的菌株和质粒
以下表1陈述了所有的菌株和质粒。
                                 表1
质粒名称 解淀粉欧文氏菌源株  简述、相关表型、文献 harpin，片段(或NA)
 pBCKS -  pBluescript KS的Cmr衍生物，Stratagene，LaJolla，CA
 pBCSK -  pBluescript KS的Cmr衍生物，Stratagene，LaJolla，CA
 pBCKS -  pBluescript KS；Apr.Stratagene，La Jolla，CA
 pBSSK II -  pBluescript II SK；Apr.Stratagene，La Jolla，CA
 pBW7 -  Mob+Tcr辅助质粒。(Rella等，“用Tn5衍生物  NA
对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)进行转座子插入诱变：应用于arc基因簇的物理图谱”Gene 33：293-303(1985)，该文献通过引用结合到本文中。
 pCPP51  - 含pRO1614ori的pBSSK II的宿主范围广泛的衍生物。 NA
 PCPP430  321 将解淀粉欧文氏菌Ea321的功能性hrp基因簇克隆入pCPP9中。Beer，S.BV.等，“解淀粉欧文氏菌的hrp基因簇”载于Hennecke，H.和D.P.S.Verma(编辑)，Advances in MolecularGenetics of Plant-Microbe Interactions.KluwerAcademic Publishers，Dordrecht，Netherlands，53-60(1991)，该文献通过引用结合到本文中。
 pCPP460  246 将解淀粉欧文氏菌Ea246的功能性hrp基因簇克隆入pCPP9中。
 pCPP1104  321 pBCKS中的pCPP1084的1.2kb PstI片段 Ea C31
 pCPP1105  321 pBCSK中的pCPP1084的1.1kb SmaI片段 Ea C82
 pCPP1107  321 pBCSK中的pCPP1084的1.3kb HindIII片段 Ea wt
 pCPP1108  321 pBCSK中的pCPP1084的1.2kb HincI-hindIII片段 Ea N11
 pCPP1109  321 缺失内部AvaII片段的pCPP1107 Ea 1175
 pCPP1110  321 作为pCPP1108，但克隆入pBCKS中 Ea N9
 pCPP1111  321 pBCSK中的pCPP1107的367bp TaqI片段 Ea C305
 pCPP1113  246 作为pCPP1109，但缺失pCPP1098的425bp的AvaII片段 Ear 1175
 pCPP1119  246 pCPP1098中的定点突变；于L36插入终止密码子 Ear C368
 pCPP1120  246 pCPP1098中的定点突变；于T123插入终止密码子 Ear C281
 pCPP1121  321 缺失内部至hrpN的702bp KpnI片段 Ea C375
 pCPP1127  246 pSU21中的pCPP1098的3.1kb BamHI片段 Ear wt
 pCPP1128  246 pCPP1127中的Tn10 minikan Ear undef
 pCPP1136  246 重新连接的pCPP1120的4.4kb EcoRI片段 EAR N122
 pCPP1146  246 重新连接的pCPP1119的4.2kb EcoRI片段 Ear N35
 pCPP1147  321 pCPP1084的1.2kb BamHI片段，PCR扩增的，克隆入pSU23 Ea wt
 pCPP1148  246 作为pCPp1147，但来自pCPP1098 Ear wt
 pCPP1150  246 作为pCPp1148，但在pCPP51载体中 Ear wt
 pCPP1163  246 pCPP51中的pCPP1098的3.1kb BamHI片段 Ear wt
 pCPP1164  321 pCPP51中的pCPp1084的1.3kb HindIII Ea wt
 pCPP1165 pCPP51 w/KpnI的衍生物，除去SacII位点 NA
 pCPP1167  321 pCPP1165中的pCPp1107的1.3kb HindII片段 Ea wt
 pCPP1169  246 作为pCPP1167，但为来自pCPp1098的3.1kBBamHI插入片段 Ear wt
 pCPP1170  246 PCPP1098；∑-Sp连接入EcoRV位点 Ear C128∑
 pCPP1171  246 缺失内部至hrpN的KpnI片段；读框移码 Ea C375
 pCPP1172  321 pCPP1167的衍生物，符合读框地缺失内部至 Ea 1235
 hrpN的KpnI片段
 pCPP1173  246  作为pCPP1172，但来自pCPP1169  Ear 1235
 pCPP217  321  PCPP1084，缺失2个StyI片段，平端并重连接  Ea C185
 pCPP1252  321  于SmaI位点连接∑-Sp的PCPP1105  Ea C82∑
 pGP1-2  P15a ori.T7 RNA聚合酶编码质粒；用于蛋白表达(Tabor，S.等，“用于受控的仅表达特定基因的噬菌体T7 DNA聚合酶/启动子系统”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：1074-1078(1985)，该文献通过引用结合到本文中)  N/A
 pHP45∑Ω  Apr；Spr；Ω-Sp片段源；(Fellay，R.等，“土壤细菌和水生细菌的插入子(interposon)诱变，设计用于革兰氏阴性细菌体外插入诱变的一个DNA片段家族”Gene，52：147-154(1987)，该文献通过引用结合到本文中。)  N/A
 pSU21  P15a ori Kmr(Bartolome，B.Y.等，“与pBR322及其衍生物匹配的pACYC184衍生的克隆载体家族的构建和特性”Gene，102：75-78(1991)，该文献通过引用结合到本文中。  N/A
 pSU23  P15a ori Kmr(Bartolome，B.Y.等，“与pBR322及其衍生物匹配的pACYC184衍生的克隆载体家族的构建和特性”Gene，102：75-78(1991)，该文献通过引用结合到本文中。  N/A
所用的菌株
解淀粉欧文氏菌  Ea273Nx；Ea273的萘啶酮酸抗性(Nxr)衍生物。CUCPB 2348
解淀粉欧文氏菌  Ea32的利福平抗性衍生物。CUCPB 2545
大肠杆菌  GM272；dam-，dcm-。CUCPB 3047；(Blumenthal，R.M.等，“大肠杆菌可以限制甲基化DNA，并可以使基因组文库偏斜”Trends in Biotech，4：302-305(1986)，该文献通过引用结合到本文中。
大肠杆菌  BL21(DE3)；CUCPB 4277；(Studier，F.W.和B.A.Moffatt，“用噬菌体T7 RNA聚合酶指导所克隆基因的选择性高水平的表达”J.Mol.Biol.，189：113-130(1986)，该文献通过引用结合到本文中。)
大肠杆菌  DH5α；(Nxr).CUCPB 2475；Stratagene，La Jolla，CA.
实施例2-分子生物学技术
采用几种方法获得两种解淀粉欧文氏菌harpin的截短的或者改变的形式。这些技术包括：(i)用标准技术(Sambrook等，分子克隆：实验手册，第二版，编辑Cold Spring Harbor，Labotatory Cold Spring，Harbor，NY(1989)，该文献通过引用结合到本文中)，将含有编码解淀粉欧文氏菌过敏反应引发剂蛋白或多肽的基因(即hrpN)的部分的限制性片段，亚克隆入表达载体中；(ii)将Ω片段(Fellay，R.等，“土壤细菌和水生细菌的插入子(interposon)诱变，设计用于革兰氏阴性细菌体外插入诱变的一个DNA片段家族”Gene 52：147-154(1987)，该文献通过引用结合到本文中)插入hrpN中；(iii)定点诱变方法(Innis等，PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，Academic Press San Diego，CA(1990)；Kunkel等，“不用选择表型的快速有效的定点诱变”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)，该文献通过引用结合到本文中)；和(iv)产生嵌套缺失(Erase-a-BaseTM试剂盒；Promega，Madison，WI)。因为在pCPP1084中对限制性酶切位点进行了定位，所以可以不进行pCPP1084中的解淀粉欧文氏菌的过敏反应引发剂蛋白或多肽(即harpinEa)的C端缺失分析。对于N端缺失，用Qiagen小量制备柱(Qiagen，Chatsworth，CA)制备pCPP1084 DNA，并用sstI消化，然后用EcoRI消化。随后，将消化的DNA经过外切核酸酶III消化，连接并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。通过琼脂糖凝胶电泳估计缺失的大小。参考缺失的harpin的部分，将harpin片段命名(例如harpinEaC82缺失全长harpinEa的C端82个氨基酸残基)。实施例3-蛋白表达
为了由T7启动子进行表达，施用依赖于T7 RNA聚合酶的系统。这些系统不是利用菌株大肠杆菌BL21(DE3)(Studier等，“用噬菌体T7 RNA聚合酶指导所克隆基因的选择性高水平的表达”J.Mol.Biol.，189：113-130(1986)，该文献通过引用结合到本文中)，就是利用大肠杆菌DH5α中的质粒pGP1-2(Tabor，S.等，“用于受控的仅表达特定基因的噬菌体T7 DNA聚合酶/启动子系统”Proc.Natl.Acad.Sci.，USA82：1074-1078(1985)，该文献通过引用结合到本文中)。通过加入终浓度为0.4mM的IPTG，诱导由T7启动子表达hrpN。对于在解淀粉欧文氏菌Ea321(即harpinEa)或Ea273中的表达，通过42℃热休克10分钟转化，或通过电穿孔(Biorad Gene PulserTM)，引入pGP1-2。在烟草Xanthi栽培品种叶片中，通过植物内裂解(He等，“丁香假单胞菌丁香致病变种的harpinPss：一种通过Hrp途径分泌且在植物中引发过敏反应的蛋白”Cell 73：1255-1266(1993)该文献通过引用结合到本文中)，或通过制备煮沸或未煮沸的“CFEP”(Wei等，“harpin-由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应的引发剂”Science 257：85-88(1992)该文献通过引用结合到本文中)，筛选过敏反应(即HR)引发活性。实施例4-harpin的体外蛋白水解
按照建议(Scopes等，Protein Purification：Principles and Practice，第二版，Springer-Verlag.New York(1987)，该文献通过引用结合到本文中)，于20-37°下，用葡萄球菌属V8蛋白酶(也称为内切蛋白酶Glu-C)、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶在体外将harpinEa蛋白水解16小时。或者在50mM碳酸氢铵pH7.8(其中仅在谷氨酸后发生切割)中，或者在50mM磷酸钾pH7.8(其中在谷氨酸和天冬氨酸后发生切割)中，进行内切蛋白酶Glu-C的消化。实施例5-植物来源的蛋白酶
如所描述的(Hammond-Kosack等，“细胞间液的制备和分析”第15-21页，载于S.J.Gurr，M.J.McPherson和D.J.Bowles(编辑)，Molecular Plant Pathology A Practical Approach，第二版，The PracticalApproach Series，IRL Publishers，Oxford(1992)，该文献通过引用结合到本文中)，通过用高纯度水真空浸润胞间隙，由烟草、番茄、苹果、树莓和栒子属植物获得细胞间液。于20-37℃、pH，通过将等体积IF与harpinEa混合，进行PAGE纯化的harpinEa的蛋白水解消化。通过用研钵和研棒在5mM磷酸钾中研磨烟草叶片(leaf panel)，获得总叶片提取物。将该提取物离心并过滤，如使用IF一样，使用澄清的研磨叶片提取物。如下使用蛋白酶抑制剂：胃酶抑制剂A(终浓度为1μM)、E-64(1μM)、抑酶肽(2μg/ml)、邻二氮杂菲(1mM)和对苯甲酸汞(PCMB)(Sigma，St.Louis，MO)。实施例6-肽的纯化
通过在Vydac C18柱上进行反相HPLC，采用0.1％三氟乙酸中的2-60％乙腈梯度，分级分离用烟草IF消化后获得的harpin的肽片段。将分级部分冻干，重新悬浮于5mM磷酸钾中，并浸润入烟草叶片中。如上所述，用35-70％的乙腈梯度，重新分级分离具有最大HR引发活性的分级部分，并通过气相层析-质谱(GC-MS)和通过在ComellBiotechnology Program Core Facility上对N端蛋白测定，分析每个分级部分的纯度。实施例7-蛋白酶活性染色的凝胶
在活性染色的与0.1％明胶共聚的聚丙烯酰胺凝胶(Laemmli，“在噬菌体T4头部装配期间结构蛋白的切割，”Nature 227：680-685(1970)，该文献通过引用结合到本文中)中分析IF的蛋白酶活性(Heussen等，“在含有十二烷基硫酸钠和共聚基质的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析血纤溶酶原激活物，”Anal.Biochem.102：196-202(1980)，该文献通过引用结合到本文中)。电泳后，彻底冲洗每个凝胶，以除去SDS，并允许蛋白酶在凝胶中重新折叠。在另外的温育以允许发生蛋白水解后，用30％甲醇成/10％乙酸中的0.1％氨基黑将凝胶染色。每个凝胶均染成黑色(由于存在共聚明胶)，蛋白酶已经消化明胶的情况除外，导致代表蛋白酶活性位点的无色条带。实施例8-截短的harpin保留HR引发活性
图1显示由各种DNA构成物编码的蛋白的稳定性和HR引发活性。编码harpinEa或harpinEar的部分的许多DNA构成物，在T7启动子-聚合酶系统(Tabor等，“用于受控的仅表达特定基因的噬菌体T7DNA聚合酶/启动子系统”Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 82：1074-1078(1985)，该文献通过引用结合到本文中)中诱导表达并通过PAGE分析细胞提取物后，可能由于所编码蛋白的不稳定性，不产生可检测的蛋白产物。DNA构成物(例如通过Erase-a BaseTM方案获得的那些构成物)不产生可检测的显示相对于全长蛋白为N端缺失的蛋白产物。没有鉴定出稳定而无活性的蛋白。编码于C端截短的蛋白、且通常包括另外的载体编码的氨基酸的几种构成物产生可检测的产物(例如harpinEaC82)。相反，编码harpinEa的相同321个N端氨基酸残基、但由于存在Ω片段而产生截短的蛋白(harpinEa C82Ω)的构成物是不稳定的(即没有检测到产物)。编码具有大的内部缺失的harpinEa片段(harpinEa I175)的构成物也成功地用于表达蛋白。测试这些不同的截短的蛋白的HR引发活性。98个残基的N端harpinEa片段(harpinEa C305)是表现出HR引发活性的最小的细菌产生的肽。实施例9-具有改变的C端的harpinEa的分泌
检查harpin C端的改变对其分泌的影响。harpin C31含有harpinN端的372个氨基酸，但缺失C端的31个残基，这些残基被该载体编码的47个残基取代，产生略大于野生型harpinEa的蛋白。C31蛋白保留HR引发活性，且是稳定的，并且容易表达和通过蛋白质分析或PAGE检测出，但它不再如野生型蛋白一样，分泌到培养上清液中(图2)。harpinEaC31的存在不干扰野生型harpin的分泌，在CFEP和培养上清液中均发现野生型harpin。然而，harpinEaC31仅在CFEP中发现。实施例10-蛋白水解对harpinEa的HR引发活性的影响
为了产生另外的harpinEa片段，用包括内切蛋白酶Glu-C、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶在内的几种蛋白酶，在体外蛋白水解纯化的全长蛋白(例如图3和图4)。用胰蛋白酶或用木瓜蛋白酶消化的harpin溶液损失了所有活性。相反，在用内切蛋白酶Glu-C消化后，保留了HR引发活性。用胰蛋白酶消化后通过PAGE检测，没有明显的大于6kD的肽。内切蛋白酶Glu-C消化，产生一种约20kD的片段，大于如果切割所有酶切位点所预期的大小，表明消化不完全(图4)。实施例11-质外体液(apoplastic fluid)(IF)含有harpin降解蛋白水解活性
来自烟草和其它植物的质外体液(细胞间液；IF)也用来蛋白水解harpin。在含共聚明胶的聚丙烯酰胺凝胶中存在多个活性染色条带(图5A至5C)，以及在用IF过夜消化纯化的harpinEa后，可检测harpinEa消失(Schagger等，“用于分离1-100kDa蛋白的Tricine-十二烷基硫酸钠凝胶电泳，“Anal.Biochem.166：368-379(1987)，该文献通过引用结合到本文中)，表明每种测试的IF均具有蛋白酶活性。蛋白酶活性于30℃下基本上高于20℃下的活性，该活性于pH8.5下高于pH7下的活性。使用几种抑制剂，以限定IF的蛋白水解活性。使用的单一的蛋白酶没有防止harpinEa的降解。然而，分别针对酸性蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的抑制剂胃酶抑制剂A(1μM)、E-64(1μM)、抑酶肽(2μg/ml)和邻二氮杂菲(1mM)的混合物，部分抑制蛋白水解。
由于植物质外体中存在的蛋白水解活性而降解的harpinEa保留HR引发活性(图3)。相反，通过用研钵和研棒研磨烟草叶产生的澄清提取物蛋白水解的harpinEa，损失HR引发活性。为了研究harpin的质外体降解是否是其HR引发活性的必要条件，比较将或者完整的harpin或者用烟草IF预降解的harpin浸润入烟草叶片所需的时间长度。两种制备物均在相似的时间范围(12-18小时，取决于实验)内引发HR。实施例12-HR引发肽片段的特征鉴定
通过反相HPLC(Vydac C18柱)将用质外体植物蛋白酶消化产生的肽分级分离，并测试其活性。用烟草IF处理完整的harpinEa后，三个分离部分含有对烟草的一些HR引发活性。三种中的两种的活性弱，几乎不存在蛋白。没有将它们进一步特征鉴定。含有最强活性以及最多蛋白的分级部分19，用更窄的洗脱梯度重新分级分离(图6)。重新分级分离、N端蛋白测序和通过质谱分析分子量，表明存在四种大范围重叠的肽。峰19-1含有肽P91和P95，对应于harpinEa残基110-200和110-204；峰19-2含有肽P64和P68，对应于harpinEa残基137-200和137-204。19-1和19-2每种均具有HR引发活性。由此证实保留活性的最小的肽由残基137-204组成。每个峰中的两种肽在所用的条件下无法有分离。这些活性片段不同于最小的活性N端片段(harpinEaC305)，表明在植物中harpinEa的一个以上的部分表现出活性。用胰蛋白酶进一步消化，去除了19-2的HR引发活性。该蛋白酶切割图7所示的P64和P68。在碳酸氢铵缓冲液中用内切蛋白酶Glu-C进一步消化，消除了19-1的HR引发活性。预测内切蛋白酶Glu-C切割图7所示的P91和P95。在用内切蛋白酶Glu-C或胰蛋白酶进一步消化这些肽后，丧失了引发剂活性。实施例13-解淀粉欧文氏菌的harpin与其它蛋白的相似性
将来自几种其它细菌性植物病原体的蛋白性HR引发剂和已知或被认为通过III型分泌途径分泌的其它蛋白的预测蛋白质序列，与harpinEa的蛋白序列进行比较。当将harpinEa与解淀粉欧文氏菌Ea246(即harpinEar)、菊欧文氏菌EC16(harpinEch)(Bauer等，“菊欧文氏菌的harpinEch：一种引起软腐病发病的过敏反应的引发剂，”Mol.Plant-Microbe Interact 8：484-491(1995)，该文献通过引用结合到本文中)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(harpinEcc)(Mukherjee等，于第8届国际分子植物-微生物相互作用大会上提出，Knoxville，TN(1996)，该文献通过引用结合到本文中)、斯氏欧文氏菌(harpinEs)(Frederick等，“斯氏欧文氏菌的wts吸湿(Water-Soaking)基因与hrp基因相关”于第7届国际分子植物-微生物相互作用研讨会上提出，Edinburgh，Scotland(1994)，该文献通过引用结合到本文中)、Ralstonia solanacearum(茄假单胞菌)(PopA)(“PopA1-一种对特定矮牵牛基因型诱导过敏样反应的蛋白，是通过茄假单胞菌的Hrp途径分泌的”EMBO J.13：543-553(1994)，该文献通过引用结合到本文中)、丁香假单胞菌61(harpinPss)(He等，“丁香假单胞菌丁香致病变种的harpinPss：一种通过Hrp途径分泌且在植物中引发过敏反应的蛋白”Cell 73：1255-1266(1993)该文献通过引用结合到本文中)、丁香假单胞菌番茄致病变种(harpinPst)(Preston等，“丁香假单胞菌丁香、大豆和番茄致病变种的hrpZ蛋白是由含耶尔森氏菌数ysc同系物的操纵子编码，并在番茄而不是大豆中引发过敏反应，”Mol.Plant-Microbe Interact 8：717-732(1995)，该文献通过引用结合到本文中)的引发剂比较时，得自欧文氏菌属的harpin在C端含有许多相似性区。另外，所有引发剂均富含甘氨酸，为分泌的和热稳定的。先前已经报道了harpinPss和harpinEa之间有限的相似性(He等，“丁香假单胞菌丁香致病变种的harpinPss：一种通过Hrp途径分泌且在植物中引发过敏反应的蛋白”Cell 73：1255-1266(1993)该文献通过引用结合到本文中)、(Laby等，于第7届国际分子植物-微生物相互作用研讨会上提出，Edinburgh，Scotland(1994)，该文献通过引用结合到本文中)。harpinEa和来自欧文氏菌属菌种(Erwinia spp.)的其它harpin之间在每种蛋白的极N端明显有一个有限的相似性区，其中在前26个残基中的9个是保守的(图8)。图9描述了由不同欧文氏菌属菌种产生的每种harpin的Kyte-Doolittle亲水性图。所检查的每种欧文氏菌属harpin均显示出通常相似的沿全长该蛋白的疏水性分布图。该分布图不同于用PopA1和harpinPss证明的分布图，不具有在那两种蛋白的分布图中明显的对称性。每种欧文氏菌属harpin的亲和性分布图一般相互相似，但不同于报道的harpinPss的分布图(Alfano等，“用功能性非极性harZ缺失突变、截短的hrpZ片段和hrmA突变，分析丁香假单胞菌HrpZ harpin在引发烟草过敏反应中的作用”Mol.Microbiol.19：715-728(1996)，该文献通过引用结合到本文中)。harpinEcc在残基54-143周围具有显著的疏水区(Mukherjee等，于第8届国际分子植物-微生物相互作用大会上提出，Knoxville，TN(1996)，该文献通过引用结合到本文中)。该蛋白的该部分也是harpinEa和harpinEs最具疏水性的区域。每种蛋白的其余部分主要是亲水的。
全长蛋白蛋白水解消化后获得的harpin的截短蛋白和片段显示出harpinEaHR引发活性的几个意料之外的方面。这些harpin片段证明，HR引发活性残基位于该蛋白的不同区内，并且该蛋白的小至68个残基和可能更小的相对小的片段对于该活性是足够的。得自其它植物病原体的引发剂蛋白片段也保留生物活性，包括Caldosporium fulvum的Avr9(Van den Ackervecken等，“用内源植物蛋白酶加工Caldosporiumfulvum的AVR9品种特异性引发剂”Pl.Physiol.103：91-96(1993)，该文献通过引用结合到本文中)、大雄疫霉的Pep-13(Nurnburger等，“真菌寡肽引发剂与欧芹质膜的高亲和性结合触发多种防御反应”Cell，78：449-460(1990)，该文献通过引用结合到本文中)和丁香假单胞菌丁香致病变种的harpinPss(Alfano等，“用功能性非极性harZ缺失突变、截短的HrpZ片段和hrmA突变，分析丁香假单胞菌HrpZ harpin在引发烟草过敏反应中的作用”Mol.Microbiol.19：715-728(1996)，该文献通过引用结合到本文中)。
截短的harpin片段的表达和全长harpin的蛋白水解，表明这两种不同的片段保留HR引发活性。每种活性片段的一级结构显示出相互没有可辨别的相似性，或与其它引发剂活性肽没有可辨别的相似性。然而，胰蛋白酶和内切蛋白酶Glu-C的酶切位点提示活性需要每种片段的部分。可能感兴趣的是特异性地改变酶切位点或其附近的氨基酸残基，以确定HR引发活性是改变还是丧失。另外，harpinEaP64和P68在反相HPLC期间表现出不同的疏水性(图6)，它们对应于Kyte-Doolittle图中的一个疏水峰(图9)。可以通过诱变或通过合成改变的肽，测试该推定的疏水域的作用。然而，多种片段独立地具有HR引发活性的事实，使全长蛋白的分析变复杂。
该蛋白的片段保留HR引发活性的这一发现，也使得确定了(至少)两种质外体蛋白酶活性，这些蛋白酶不同于胞间的植物蛋白酶。已经在一些细节上研究了两种质外体植物蛋白酶(来自大豆)。一种对EDTA敏感的金属蛋白酶SMEP(Huangpu等，“来自大豆嫩叶的胞外蛋白酶的纯化和发育分析”Plant Physiol 108：969-974(1995)；McGeeham等，“大豆叶金属蛋白酶的测序和特征鉴定”Plant Phvsiol.99：1179-1183(1992)，这些文献通过引用结合到本文中)，被认为于G/L和G/I进行切割。有趣的是，尽管在完整的harpinEa中有19个潜在的SMEP酶切位点，但其中仅有一个位于片段P91和P95中，在片段P64和P68内中没有一个酶切位点(图7)。因此，P91和P95可以代表烟草质外体中的SMEP样蛋白酶的部分消化产物。其他人研究了大豆质外体蛋白酶SLAP，这是一种对对氯苯甲酸汞(pCMB)敏感的巯基蛋白酶(Huangpu等，“来自大豆嫩叶的胞外蛋白酶的纯化和发育分析”Plant Physiol108：969-974(1995)，该文献通过引用结合到本文中)。几方面的证据提示，在所述IF中的多种蛋白水解活性降解harpinEa。一种丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF减少harpinEa的降解，但不完全阻断harpinEa的降解(图5C)；所测试的单个蛋白酶均不阻断harpin的降解，残基109、136、200和204后的酶切位点是不同的。内切蛋白酶Glu-C不消除全长harpin的活性，但确实消除P91和P95的活性(推定消除P64和P68的活性)；胰蛋白酶消除P64和P68的活性(推定消除P91和P95的活性)。这些最终的消化物提示每种不同的HR引发肽推定对其活性必需的具体部分，如前所述。
与研磨的叶提取物中存在的消除活性的胞内蛋白水解活性相反，质外体活性降解harpin，但不破坏其HR引发活性。这产生许多吸引人的问题，例如植物使用harpin片段作为引发剂信号吗？当将用全长harpin和烟草细胞间液预消化的harpin浸润入烟草叶时，检查HR的定时。由每种制备物引发的HR在浸润后12-18小时发生。将蛋白酶抑制剂与harpin共同浸润入烟草叶片中，对harpin的HR引发活性也没有作用，尽管在这种情况下不能消除有限的蛋白水解降解，特别是因为看来至少两种，可能多种质外体蛋白酶存在于烟草中。因为预消化的harpin引发的HR不比未消化的蛋白快，所以蛋白水解降解看来不可能是发生HR所需的限速步骤。这些能够部分水解harpin、而不能消除harpin对烟草的HR引发活性的质外体蛋白酶的作用尚不清楚。Salzer等，“云杉属植物细胞对从外生菌根真菌(Hebelomacrustuliniforme)释放的引发剂快速反应以及云杉属植物细胞的胞外酶使这些引发剂失活”Planta 198：118-126(1996)(该文献通过引用结合到本文中)已经注意到云杉(Picea abies(L.)Karst.)通过使质外体中的这些由外生菌根真菌Hebeloma crustuliniforme释放的真菌细胞壁引发剂失活，而调节所述引发剂的水平。他们提出，作为云杉属(Picea)与真菌共生相互作用的一部分，云杉属控制该引发剂的水平。同样，已经表明菜豆(Phaseolus vulgaris)的PGIP在调节菜豆中植物-寄生物相互作用期间存在的具引发剂活性的寡聚半乳糖醛酸酐(galacturonide)的水平(Desiderio等，“细胞-细胞通信中的聚半乳糖醛酸酶PGIP和寡聚半乳糖醛酸酐”Biochem.Sci.Trans.22：394-397(1994)，该文献通过引用结合到本文中)。也许harpin片段保留HR引发活性是植物识别病原体存在能力的主要原因。在该方面，可能感兴趣的是探索：与非工程改造的植物相比，为质外体表达harpin活性降解蛋白酶而工程改造的转基因宿主和非宿主植物是否可以表现出对解淀粉欧文氏菌表达出降低或提高的敏感性。
尽管进行了许多尝试，但从hrpN仅成功地表达了harpinEa和harpinEa的少数截短的衍生物。关于蛋白稳定性的问题是明显的，因为几种截短的harpin不稳定，并且难以纯化。另外，截短的harpin的表达可以对细菌有害。然而，截短的harpinEaC31是稳定的且容易纯化，但不分泌，暗示C端序列参与harpin的分泌。不幸的是，在该蛋白中存在载体编码的氨基酸使该结论复杂化。克隆β-半乳糖苷酶-harpin融合蛋白的所有尝试均未成功，在诸如pBluescript的几种常用的质粒中克隆和表达lacZ启动子下游的hrpN也未成功。这类构成物的表达显然对细菌菌株有害。
Wei等，“harpin-由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应的引发剂”Science 257：85-88(1992)(该文献通过引用结合到本文中)先前报道了，BLAST检索标明，harpinEa与包括角蛋白在内的几种其它富含甘氨酸的蛋白以及富含甘氨酸的细胞壁蛋白具有略微相似性。然而，这被认为是由于harpinEa的高甘氨酸含量引起的，就这一点而论，没有提示harpinEa的作用。对来自几种致植物病细菌产生的HR引发蛋白的N端的检查(图8)产生了以下潜在的相似性。然而，所述区域相当短。推导的一级序列相似性的区域限于N端前26个残基，其作用尚不清楚。令人惊奇的是，胡萝卜软腐欧文氏菌的harpinEcc看来与来自解淀粉欧文氏菌和斯氏欧文氏菌的harpin比与来自菊欧文氏菌的harpin更相似，在其分类位置以及其发病机制(即软腐病)方面与菊欧文氏菌更相关。另外，尽管一级序列的相似性仅在每种蛋白C端三分之一中是最强的，但欧文氏菌属的harpin沿其整个长度具有广泛的相似的疏水性分布图(图9)。根据其疏水性分布图，Alfano等，“用功能性非极性harZ缺失突变、截短的hrpZ片段和hrmA突变，分析丁香假单胞菌HrpZ harpin在引发烟草过敏反应中的影响”Mol.Microbiol.19：715-728(1996)(该文献通过引用结合到本文中)推测，harpinPss可能具有两性性质。然而，欧文氏菌属的harpin的分布图不匹配harpinPss的分布图。
最近，已经描述了来自其它植物致病细菌和真菌的许多其它分泌的富含甘氨酸的致病性相关蛋白、HR或其它植物防御反应的引发剂(Boller，“植物细胞中的微生物信号的化学感觉(chemoperception)”Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.46：189-214(1996)，该文献通过引用结合到本文中)，所述其它植物致病细菌和真菌包括大雄疫霉(Ballieul等，“烟草中的一种新的过敏反应引发剂：一种真菌糖蛋白引发细胞死亡、表达防御基因，产生水杨酸并诱导系统获得性抗性”Plant Journal 8：551-560(1995)；Nurnburger等，“真菌寡肽引发剂与欧芹质膜的高亲和性结合触发多种防御反应”Cell.78：449-460(1994)，所述文献通过引用结合到本文中)和Magnaporthe grisea(Sweigard等，“在稻瘟病真菌中宿主菌种特异性的基因-PWL2的鉴定、克隆和特征鉴定，”Platn Cell 7：1221-1223(1995)，该文献通过引用结合到本文中)。已经描述了来自Phynchosporium secalis的蛋白性HR引发剂(Rohe等，“来自大麦病原体Phynchosporium secalis的品种特异性引发剂NIP1决定对Rrs1抗性基因型宿主植物的无毒性，”EMBO Journal14：4168-4177(1995)，该文献通过引用结合到本文中)，而致病疫霉(Pieterse等，“致病疫霉的ipiB和ipiO基因簇的结果和基因组组织，”Gene，138：67-77(1994)，该文献通过引用结合到本文中)产生功能未知的富含甘氨酸的致病性相关蛋白家族。因为每种引发剂蛋白或肽片段的一级氨基酸序列相互之间没有表现出明显的相似性，所以不清楚它们是否与植物细胞、质膜或靶细胞上或其中的相同靶相互作用。在该方面，可能感兴趣的是测试这些分子中的任一种是否抑制其它分子的作用。诸如Pep13、Avr9、P68和harpinEaC305的具有植物防御反应引发活性(HR和其它)的肽的增加的可得性，使得可以精确地探测它们在植物细胞上或植物细胞中的靶，以及可以确定它们的活性机制是否相似、不同或重叠。实施例14-细菌菌株和质粒
用于以下实施例的大肠杆菌菌株包括分别购自Gibco BRL和Stratagen的DH5α和BL21(DE3)。pET28(b)载体购自Novagen。EcoDH5α/2139含有完整的hrpN基因。2139构成物由Cornell University的D.Bauer产生。通过用HindIII限制性酶消化，从2139质粒上切下hrpN基因，然后从琼脂糖凝胶中纯化，以用作PCR合成截短的hrpN克隆的DNA模板。这些克隆随后插入含有用于选择转化子的Kanr基因的(His)6载体pET28(b)中。实施例15-DNA操作
限制性酶得自Boehringer Mannheim或Gibco BRL。T4 DNA连接酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)和PCR SupermixTM得自Gibco BRL。QIAprep Spin Miniprep试剂盒、Quagen Plasmid Mini试剂盒和QIAquick PCR纯化试剂盒购自Qiagen。由Lofstrand Labs Limited(Gaithersbutg，MD)合成PCR引物。由Bio-Synthesis，Inc.(Lewisville，TX)合成寡肽。所有的DNA操作，诸如质粒分离、限制性酶消化、DNA连接和PCR，均按照标准技术(分子克隆)或生产商提供的方案进行。实施例16-hrpN基因的片段化
通过PCR产生一系列N端和C端截短的hrpN基因片段和内部片段(图10)。全长的hrpN基因用作DNA模板，设计用于每个截短的克隆的3’和5’引物(图11)。3’引物包含于含有起始密码子ATG(甲硫氨酸)的NdeI酶切位点中，而5’引物含有终止密码子TAA和用于连接入pET28(b)载体中的一个HindIII酶切位点。在GeneAmpTM 9600或9700中，在0.5ml试管中进行PCR。将45μl SupermixTM与每对DNA引物各20pmole、10ng全长harpin DNA和diH2O混合，终体积为50μl。将混合物于95℃加热2分钟后，进行30个循环的PCR，每个循环于94℃1分钟、58℃1分钟和于72℃1.5分钟。在6％TBE凝胶(Novex)上证实PCR产物。用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA，用Nde I和Hind II于37℃消化5小时，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶25∶1)抽提一次，并用乙醇沉淀。5μg pET28(b)载体DNA用15单位的Nde I和20单位的Hind III于37℃消化3小时，然后用CIAP处理，以降低由不完全单一酶消化产生的背景。消化的载体DNA用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化，直接用于连接。在含约200ng消化的pET28(b)、30ng靶PCR片段和1单位T4 DNA连接酶的15μl混合物中，于14-16℃下进行连接5-12小时。将5-7.5μl连接溶液加入15ml facon试管中的100μl DH5α感受态细胞中，并冰上温育30分钟。于42℃热休克45秒后，将0.9ml SOC溶液或0.45ml LB培养基加入每个试管中，并于37℃温育1小时。将20、100和200μl转化细胞置于具有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂上，并于37℃温育过夜。将单个菌落转移至3ml LB培养基，并于37℃温育过夜。用QIAprepMiniprep试剂盒由2ml培养物制备质粒DNA。通过限制性酶消化或部分测序，分析来自转化细胞的DNA，以证实转化的成功。用上述标准化学转化法，将有所需DNA序列的质粒转染入BL21中。产生在pet28(b)载体中包含全长harpin蛋白的克隆作为阳性对照，产生仅具有pET28(b)载体的克隆作为阴性对照。实施例17-harpin截短蛋白的表达
使含hrpN克隆的大肠杆菌BL21(DE3)菌株于37℃在含30μg/ml卡那霉素的Luriar肉汤培养基(g/l Difco酵母提取物、10g/L Difco胰蛋白胨、5g/L NaCl和1mM NaOH)中生长过夜。然后将细菌接种到100倍体积的相同培养基中，并于37℃生长至OD620为0.6-0.8。然后将细菌接种到250倍体积的相同培养基中，于37℃生长至OD620为约0.3或0.6-0.8。加入1mM IPTG，并将培养物于19℃生长过夜(约18小时)。用该策略，不是所有的克隆均成功地表达。其中几个克隆必须在Terrfic肉汤(12g/L Bacto胰蛋白胨、24g/L Bacto酵母、0.4％甘油、0.17M K2PO4和0.72 K2HPO4)中生长，和/或在IPTG诱导后于37℃生长，和/或生长不足过夜时间时(earlier than overnight)收获(表2)。
                               表2：harpin截短蛋白的表达
  片段     氨基酸(SEQ.ID.No.23)  生长培养基 诱导O.D.  表达温度   收获时间
   1(+对照)     1-403     LB 约0.3或0.6-0.8  19℃或25℃   16-18小时
   2(+对照)     -     LB和TB 约0.3或0.6-0.8  19℃和37℃   16-18小时
   3     105-403     LB 0.6-0.8  19℃   16-18小时
   4     169-403     LB 约0.3  19℃   16-18小时
   5     210-403     LB或M9ZB 0.6-0.8  19℃   16-18小时
   6     257-403     LB或M9ZB 0.6-0.8  19℃   16-18小时
   7     343-403     LB 约0.3  19℃   5小时
   8     1-75     TB 约0.3  37℃   16-18小时
   9     1-104     TB 约0.3  37℃   16-18小时
   10     1-168     TB 约0.3  37℃   16-18小时
   11     1-266     LB 约0.3  37℃   4小时
   12     1-342     LB 0.6-0.8  19℃   16-18小时
   13     76-209     LB 约0.3  37℃   5小时
   14     76-168     TB或LB 约0.3  37℃   3小时或16-18小时
   15     105-209     M9ZB 约0.3  37℃   3小时
   16     169-209                              未表达
   17     105-168     LB 约0.3  37℃   3-5小时
   18     99-209     LB 约0.3  37℃   3小时
   19     137-204     LB 约0.3  37℃   3小时
   20     137-180     LB 约0.3  37℃   16-18小时
   21     105-180     LB 约0.3  37℃   3小时
   22     150-209                              未表达
   23     150-180                              未表达
通用表达方法：使含hrpN亚克隆的大肠杆菌BL21(DE3)菌株于37℃在含30μg/ml卡那霉素的Luriar肉汤培养基(5g/l Difco酵母提取物、10g/L Difco胰蛋白胨，5g/L NaCl和1mMNaOH)中生长过夜。然后将细菌按种到100倍体积的相同培养基中，并于37℃生长至OD620为0.6-0.8。然后将细菌接种到250倍体积的相同培养基中，于37℃生长至特定的诱导OD620。加入1mM IPTG，并将培养物于最适温度下生长以表达蛋白，并于特定时间收获以回收最高水平的蛋白。实施例18-harpin截短蛋白的小规模纯化(表达的证实)
如上所述培养50ml hrpN克隆的培养物，以诱导所述截短蛋白的表达。在收获培养物时，将1.5ml细胞悬浮液于14,000rpm离心5分钟，将其重新悬浮于尿素裂解缓冲液(8M尿素、0.1M Na2HPO4和0.01M Tris--pH8.0)，于室温下温育10分钟，再以14,000rpm离心10分钟，保留上清液。将50μl等份的50％平衡的(His)6-结合镍琼脂糖树脂的浆液加入上清液中，并于4℃混合1小时。然后用尿素洗涤缓冲液(8M尿素、0.1M Na2HPO4和0.01M Tris--pH6.3)洗涤镍琼脂糖3次，在洗涤之间以5,000rpm离心5分钟。从该树脂上用50μl尿素洗脱缓冲液(8M尿素、0.1M Na2HPO4、0.01M Tris和0.1MEDTA--pH6.3)洗脱该蛋白。根据所述截短蛋白的大小，流出液在4-20％、16％或10-20％Tris-甘氨酸预制凝胶上电泳，以证实表达。实施例19-在烟草中诱导HR
将来自50ml培养用于小规模纯化所述截短蛋白的培养物的1.5ml等份，以14,000rpm离心4分钟，并重新悬浮于等体积的5mM磷酸钾缓冲液pH6.8中。将细胞上清液超声处理约30秒，然后用磷酸缓冲液以1∶2和1∶10稀释。通过在单板叶片中制造一个洞，并用无针头的注射器将细菌裂解液浸润到叶胞间隙(intercellular leaf space)，将两种稀释液加纯细胞裂解液浸润到10-15片叶烟草植株的第4-9片叶中。记录浸润后24-48小时记录HR反应。烟草(Nicotiana tabacum v.Xanthi)幼苗在环境室中于20-25℃下生长，光周期为12h光照/12h黑暗，RH约为40％。细胞裂解液用于原始HR分析(以便根据HR活性筛选所述截短的蛋白)，因为小规模尿素纯化由于纯化方法将蛋白变性，产生非常少的蛋白。实施例20-大规模天然纯化harpin截短蛋白用于综合生物活性分析
将6个500ml hrpN克隆的培养物如前所述培养，以诱导所述截短蛋白的表达。收获培养物时，将细胞以7,000rpm离心5分钟，重新悬浮于咪唑裂解缓冲液(5mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Tris)加0.05％Triton X-100和0.1mg/ml溶菌酶中，于30℃温育15分钟，超声处理2分钟，然后再以15,000rpm离心20分钟，并保留上清液。将4ml等份的50％平衡的(His)6-结合镍琼脂糖树脂的浆液加入上清液中，并于4℃混合约4小时。然后用咪唑洗涤缓冲液(20mM咪唑、0.5M NaCl和20mM Tris)洗涤镍琼脂糖3次，在洗涤之间以5,000rpm离心5分钟，然后置于一次性层析柱中。将该柱以1100prm离心1分钟，以除去任何残留的洗涤缓冲液，然后通过将该柱与4ml咪唑洗脱缓冲液(1M咪唑、0.5M NaCl和20mM Tris)于室温下温育10分钟，然后将该柱以1100rpm离心1分钟，将该蛋白从该树脂上洗脱下来。根据截短的蛋白，流出液在4-20％、16％或10-20％Tris-甘氨酸预制凝胶上电泳，以证实表达。通过将该蛋白带与Mark 12分子量标记中的标准蛋白进行比较，确定该蛋白的浓度。实施例21-大规模尿素纯化harpin截短蛋白用于综合生物活性分析
该方法与大规模天然纯化相同，只是使用尿素裂解缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，并且不将细胞如天然纯化中进行超声处理。纯化后，通过对浓度逐步降低的尿素透析8小时，然后对10mM Tris/20mM NaCl透析过夜，将蛋白复性。复性过程引起所述N端蛋白沉淀。通过加入100mM Tris-HCl pH10.4，然后将该蛋白于30℃加热约1小时，将沉淀的1-168蛋白溶解。通过将该蛋白带与Mark 12分子量标记中的标准蛋白进行比较，确定该蛋白的浓度。用该策略，1-75和-104蛋白片段没有成功地溶解，因此将它们在100mM Tris-HCl pH10.4中超声处理以尽可能溶解该蛋白，并暴露该蛋白的活性位点以用于生物活性分析。实施例22-harpin截短蛋白的表达
进行所述片段蛋白的小规模表达和纯化，以根据表达和HR活性进行筛选(表3)。
                                  表3
    片段号       氨基酸(SEQ.ID.No.23)     表达     HR活性
    1(+对照)     1-403     +     +
    2(-对照)     -     仅背景蛋白     -
    3     105-403     +     +
    4     169-403     +     -
    5     210-403     +     -
    6     267-403     +     -
    7     343-403     +/-     -
    8     1-75     +     -
    9     1-104     +     +/-
    10     1-168     +     +
    11     1-266     +     +
    12     1-342     +     +
    13     76-209     +     +
    14     76-168     +     -
    15     105-209     +     +
    16     169-209     -     -
    17     105-168     +     -
    18     99-209     +     +
    19     137-204     +     +
    20     137-180     +     +
    21     105-180     +     +
    22     150-209     -     -
    23     150-180     -     -
所有克隆的片段蛋白均在一定程度上表达，三种小片段(氨基酸169-209、150-209、150-209和150-180)除外。所述片段以不同水平表达。片段210-403和267-403表达非常好，由小规模纯化产生高浓度的蛋白，在SDS凝胶电泳上产生显著的蛋白带。其它片段(诸如氨基酸1-168和1-104)产生少得多的蛋白，电泳时产生弱蛋白带。难以确定最小的C端蛋白片段343-403是否表达，因为除怀疑的343-403蛋白外，在凝胶上还出现几种背景蛋白。也测试分别由全长harpin蛋白和仅背景蛋白组成的阳性对照蛋白和阴性对照蛋白的表达和HR活性。
进行所述片段蛋白的大规模表达和纯化，以测定表达水平和HR活性的效价(表4)。
                                      表4
                  harpin截短蛋白的表达水平和HR效价(大规模纯化)
    片段号       氨基酸(SEQ.ID.No.23)     表达     HR效价
    1(+对照)     1-403     3.7mg/ml     5-7μg/ml
    2(-对照)     -     -     1∶2稀释液
    4     169-403     2mg/ml     -
    5     210-403     5mg/ml     -
    6     267-403     4mg/ml     -
    7     343-402     200μg/ml     -
    8     1-75     50μg/ml     -
    9     1-104     50μg/ml     3μg/ml(1∶16稀释液)
    10     1-168     1mg/ml     1μg/ml
    13     76-209     2.5mg/ml     5μg/ml
    14     76-168     2mg/ml     -
    15     105-209     5mg/ml     5-10μg/ml
    17     105-168     250μg/ml     -
    19     137-204     3.6mg/ml     3.5μg/ml
    20     137-180     250μg/ml     16μg/ml
由于时间限制，不是所有的所述蛋白均以大规模表达。选择在harpin特征鉴定中被认为是最重要的截短的蛋白。阳性对照(全长harpin)表达的水平相对高，为3.7mg/ml。所有的C端蛋白均以相对高水平表达，为2-5mg/ml，如前讨论的片段343-403除外。N端片段也表达非常好，然而在纯化过程期间，所述蛋白沉淀，很少重新溶解。表3中的浓度仅反映出溶解的蛋白。内部片段表达范围为2-3.6mg/ml。极难测定片段105-168的浓度(推测该浓度比所显示的高得多)，因为SDS凝较上的蛋白带大，但染色差。阴性对照含有预期的几种背景蛋白，但不含有显著诱导的主蛋白。实施例23-烟草中HR的诱导
低至仅5-7μg/ml的全长阳性对照蛋白诱发HR。阴性对照(pET28)咪唑纯化“蛋白”仅含有背景蛋白，低至1∶2稀释度的该蛋白诱导HR反应，这将降低了该测定的灵敏度，因为不能使用1∶1和1∶2稀释度。这种假HR可能是由于用于纯化过程中的咪唑结合一种或几种背景蛋白的亲和性，由此咪唑没有完全透析出。约60mM浓度的咪唑不引发假HR反应。
一个确定的结构域包含该蛋白从氨基酸137-180(SEQ.ID.No.23)的一个小内部区，仅有44个氨基酸，被鉴定为最小的HR域。另一潜在的HR域被认为位于该蛋白的N端，从氨基酸1-104(可能是1-75)(SEQ.ID.No.23)。由于在纯化这些片段蛋白中遇到的困难，难以证实或缩小N端HR域。所述N端片段蛋白必须用尿素纯化，因为当使用天然纯化方法时，没有回收到蛋白。这样，这些蛋白在复性期间沉淀，并难以或几乎不可能恢复为溶液，由此使得难以使所述蛋白通过HR测定，因为仅可溶性蛋白能够引发HR。缩小N端HR域的困难仅由以下事实构成：阴性对照在低稀释度水平下引发假HR，由此降低该测定的灵敏度。
如阳性对照一样，内部域蛋白在5-10μg/ml蛋白下引发HR反应，而N端域蛋白在1-3μg/ml下引发HR反应，浓度低于阳性对照。
令人惊奇的是，当在氨基酸168和169之间切割所述内部HR域时(片段76-168和105-168)(SEQ.ID.No.23)，所述片段损失其HR活性。这提示片段1-168(SEQ.ID.No.23)的HR活性不应归因于内部HR域，但应归因于某些其它域，导致这样一种假设：在该蛋白的N端区中可能发现一个第二HR域。然而，如前所讨论的，难以证实这种假设。
harpin C端(氨基酸210-403(SEQ.ID.No.23))不含有HR域。用目前HR测定，它不诱发可检测水平的HR。甚至氨基酸169-403(SEQ.ID.No.23)的大C端片段也不诱发HR，即使它含有部分内部HR域。如上所述，该蛋白氨基酸168和169之间(SEQ.ID.No.23)引起HR活性的丧失。
因为具有61个氨基酸或更少氨基酸的某些小的克隆蛋白不表达，所以合成具有30个氨基酸的几种寡肽，以缩小内部HR域的功能区。合成氨基酸121-179(SEQ.ID.No.23)范围内的所述寡肽。然而，这些寡聚物不诱发HR反应。预期没有由寡聚物137-166、121-150和137-156(SEQ.ID.No.23)产生HR反应，因为这些片段不含有必不可少的氨基酸168和169(SEQ.ID.No.23)。预期寡聚物150-179(SEQ.ID.No.23)诱发HR反应。可能30个氨基酸对于该蛋白太小，因为缺乏折叠，并因此缺乏结合，而不能诱发任何活性，或可能在该肽合成期间重要的氨基酸丢失(或者在加工中，或仅由于选择合成哪30个氨基酸)，因此，所述片段不能诱发HR。也可能(尽管不可能)这些小蛋白在大肠杆菌中已经经历了合成时它们不含有的某种形式的翻译后修饰，因此不能引发HR反应。实施例24-HR诱导片段的生物活性
跨越SEQ.ID.No.24的核苷酸1-104和核苷酸1-168的两种N端harpin片段，有效地诱导烟草对TMV的抗性，其方式类似于全长的harpin蛋白。跨越SEQ.ID.No.24的核苷酸76-209和核苷酸105-209的内部片段，也有效地诱导TMV抗性。另外，这些相同的四种片段在番茄中赋予植物生长的增强(“PGE”)，株高比缓冲液对照植物高，增加4-19％。全长harpin蛋白比缓冲液诱导的植物生长增加高6％。阴性对照不诱导TMV抗性或生长的增强。
                            表5
            衍生自harpin的HR诱导片段的TMV抗性和PGE活性
    片段号      氨基酸(SEQ.ID.No.23)     HR活性   TMV抗性   PGE ht＞缓冲液
    1(+对照)     1-403     +     +     6％
    2(-对照)     -     -     -     -2％
    9     1-104     +     +     4-8％
    10     1-168     +     +     5-13％
    13     76-209     +     +     4-18％
    15     105-209     +     +     6-19％
尽管为了说明已经详细地描述了本发明，但不用说，这种细节仅用于该目的，本领域技术人员可以在其中进行变化，而不偏离以下权利要求书限定的本发明的精神和范围。
                           序列表(1)一般资料
(i)申请人：Cornell Research Foundation，Inc.and EDEN Bioscience Corporation
(ii)发明名称：诱发过敏反应的过敏反应引发剂片段及其应用
(iii)序列数：30
(iv)通信地址：
    (A)收信人：Nixon，Hargrave，Devans和Doyle LLP
    (B)街道：Clinton Square，P.O.Box 1051
    (C)城市：Rochester
    (D)州：纽约州
    (E)国家：美国
    (F)邮政编码：14603
(v)计算机可读形式
    (A)媒体类型：软盘
    (B)计算机：IBM兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本1.30
(vi)当前申请数据
    (A)申请号：
    (B)提交日期：
    (C)分类：
(vii)在先申请数据
    (A)申请号：US 60/048,109
    (B)申请日：1997年5月30日
(viii)代理律师/代理人资料
    (A)姓名：Goldman，Michael L.
    (B)注册号：30,727
    (C)参考/档案号：19603/1302
(ix)电讯资料
    (A)电话：(716)263-1304
    (B)传真：(716)263-1600(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GGGAATTCAT ATGAGTCTGA ATACAAGTGG G                                   31(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GGGAATTCAT ATGGGCGGTG GCTTAGGCGG T                                   31(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：29个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GGCATATGTC GAACGCGCTG AACGATATG                                      29(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GGGAATTCAT ATGTTAGGCG GTTCGCTGAA C                                   31(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：29个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GGCATATGCT GAACACGCTG GGCTCGAAA                                      29(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：29个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GGCATATGTC AACGTCCCAA AACGACGAT                                      29(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GGCATATGTC CACCTCAGAC TCCAGCG                                        27(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：34个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：GGGAATTCAT ATGCAAAGCC TGTTTGGTGA TGGG                                34(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：GGGAATTCAT ATGGGTAATG GTCTGAGCAA G                                   31(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：GGAATTCAT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC G                                    31(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：34个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GGGAATTCAT ATGACACCAG CCAGTATGGA GCAG                                34(2)SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GCAAGCTTAA CAGCCCACCA CCGCCCATCA T                                   31(2)SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GCAAGCTTAA ATCGTTCAGC GCGTTCGACA G                                   31(2)SEQ ID NO：14的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：34个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：GCAAGCTTAA TATCTCGCTG AACATCTTCA GCAG                                34(2)SEQ ID NO：15的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：GCAAGCTTAA GGTGCCATCT TGCCCATCAC                                     30(2)SEQ ID NO：16的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：34个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：GCAAGCTTAA ATCAGTGACT CCTTTTTTAT AGGC                                34(2)SEQ ID NO：17的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：GCAAGCTTAA CAGGCCCGAC AGCGCATCAG T                                   31(2)SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：GCAAGCTTAA ACCGATACCG GTACCCACGG C                                   31(2)SEQ ID NO：19的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：34个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：GCAAGCTTAA TCCGTCGTCA TCTGGCTTGC TCAG                                34(2)SEQ ID NO：20的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：25个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：GCAAGCTTAA GCCGCGCCCA GCTTG                                          25(2)SEQ ID NO：21的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：338个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1               5                   10                  15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser
        20                  25                  30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr
    35                  40                  45
Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser
65                  70                  75                  80
Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys
                85                  90                  95
Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp
            100                 105                 110
Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln
        115                 120                 125
Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met
    130                 135                 140
Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly
145                 150                 155                 160
Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly
                165                 170                 175
Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu
            180                 185                 190
Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala
        195                 200                 205
Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val
    210                 215                 220
Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp
225                 230                 235                 240
Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp
                245                 250                 255
Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys
            260                 265                 270
Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln
        275                 280                 285
Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr
    290                 295                 300
Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala
305                 310                 315                 320
Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala
                325                 330                 335
Asn Ala(2)SEQ ID NO：22的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：2141个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：CGATTTTACC   CGGGTGAACG   TGCTATGACC   GACAGCATCA   CGGTATTCGA   CACCGTTACG                 60GCGTTTATGG   CCGCGATGAA   CCGGCATCAG   GCGGCGCGCT   GGTCGCCGCA   ATCCGGCGTC                120GATCTGGTAT   TTCAGTTTGG   GGACACCGGG   CGTGAACTCA   TGATGCAGAT   TCAGCCGGGG                180CAGCAATATC   CCGGCATGTT   GCGCACGCTG   CTCGCTCGTC   GTTATCAGCA   GGCGGCAGAG                240TGCGATGGCT   GCCATCTGTG   CCTGAACGGC   AGCGATGTAT   TGATCCTCTG   GTGGCCGCTG                300CCGTCGGATC   CCGGCAGTTA   TCCGCAGGTG   ATCGAACGTT   TGTTTGAACT   GGCGGGAATG                360ACGTTGCCGT   CGCTATCCAT   AGCACCGACG   GCGCGTCCGC   AGACAGGGAA   CGGACGCGCC                420CGATCATTAA   GATAAAGGCG   GCTTTTTTTA   TTGCAAAACG   GTAACGGTGA   GGAACCGTTT                480CACCGTCGGC   GTCACTCAGT   AACAAGTATC   CATCATGATG   CCTACATCGG   GATCGGCGTG                540GGCATCCGTT   GCAGATACTT   TTGCGAACAC   CTGACATGAA   TGAGGAAACG   AAATTATGCA                600AATTACGATC   AAAGCGCACA   TCGGCGGTGA   TTTGGGCGTC   TCCGGTCTGG   GGCTGGGTGC                660TCAGGGACTG   AAAGGACTGA   ATTCCGCGGC   TTCATCGCTG   GGTTCCAGCG   TGGATAAACT                720GAGCAGCACC   ATCGATAAGT   TGACCTCCGC   GCTGACTTCG   ATGATGTTTG   GCGGCGCGCT                780GGCGCAGGGG   CTGGGCGCCA   GCTCGAAGGG   GCTGGGGATG   AGCAATCAAC   TGGGCCAGTC                840TTTCGGCAAT   GGCGCGCAGG   GTGCGAGCAA   CCTGCTATCC   GTACCGAAAT   CCGGCGGCGA                900TGCGTTGTCA   AAAATGTTTG   ATAAAGCGCT   GGACGATCTG   CTGGGTCATG   ACACCGTGAC                960CAAGCTGACT   AACCAGAGCA   ACCAACTGGC   TAATTCAATG   CTGAACGCCA   GCCAGATGAC               1020CCAGGGTAAT   ATGAATGCGT   TCGGCAGCGG   TGTGAACAAC   GCACTGTCGT   CCATTCTCGG               1080CAACGGTCTC   GGCCAGTCGA   TGAGTGGCTT   CTCTCAGCCT   TCTCTGGGGG   CAGGCGGCTT               1140GCAGGGCCTG   AGCGGCGCGG   GTGCATTCAA   CCAGTTGGGT   AATGCCATCG   GCATGGGCGT               1200GGGGCAGAAT   GCTGCGCTGA   GTGCGTTGAG   TAACGTCAGC   ACCCACGTAG   ACGGTAACAA               1260CCGCCACTTT   GTAGATAAAG   AAGATCGCGG   CATGGCGAAA   GAGATCGGCC   AGTTTATGGA           1320TCAGTATCCG   GAAATATTCG   GTAAACCGGA   ATACCAGAAA   GATGGCTGGA   GTTCGCCGAA           1380GACGGACGAC   AAATCCTGGG   CTAAAGCGCT   GAGTAAACCG   GATGATGACG   GTATGACCGG           1440CGCCAGCATG   GACAAATTCC   GTCAGGCGAT   GGGTATGATC   AAAAGCGCGG   TGGCGGGTGA           1500TACCGGCAAT   ACCAACCTGA   ACCTGCGTGG   CGCGGGCGGT   GCATCGCTGG   GTATCGATGC           1560GGCTGTCGTC   GGCGATAAAA   TAGCCAACAT   GTCGCTGGGT   AAGCTGGCCA   ACGCCTGATA           1620ATCTGTGCTG   GCCTGATAAA   GCGGAAACGA   AAAAAGAGAC   GGGGAAGCCT   GTCTCTTTTC           1680TTATTATGCG   GTTTATGCGG   TTACCTGGAC   CGGTTAATCA   TCGTCATCGA   TCTGGTACAA           1740ACGCACATTT   TCCCGTTCAT   TCGCGTCGTT   ACGCGCCACA   ATCGCGATGG   CATCTTCCTC           1800GTCGCTCAGA   TTGCGCGGCT   GATGGGGAAC   GCCGGGTGGA   ATATAGAGAA   ACTCGCCGGC           1860CAGATGGAGA   CACGTCTGCG   ATAAATCTGT   GCCGTAACGT   GTTTCTATCC   GCCCCTTTAG           1920CAGATAGATT   GCGGTTTCGT   AATCAACATG   GTAATGCGGT   TCCGCCTGTG   CGCCGGCCGG           1980GATCACCACA   ATATTCATAG   AAAGCTGTCT   TGCACCTACC   GTATCGCGGG   AGATACCGAC           2040AAAATAGGGC   AGTTTTTGCG   TGGTATCCGT   GGGGTGTTCC   GGCCTGACAA   TCTTGAGTTG           2100GTTCGTCATC   ATCTTTCTCC   ATCTGGGCGA   CCTGATCGGT   T                                 2141(2)SEQ ID NO：23的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：403个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1               5                   10                  15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln
        20                  25                  30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn
    35                  40                  45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met
50                  55                  60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65                  70                  75                  80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu
            85                  90                  95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr
        100                 105                 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro
    115                 120                 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser
130                 135                 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145                 150                 155                 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly
            165                 170                 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu
        180                 185                 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly
    195                 200                 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly
210                 215                 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225                 230                 235                 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln
            245                 250                 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln
        260                 265                 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe
    275                 280                 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met
290                 295                  300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305                 310                 315                 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser
            325                 330                 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn
        340                 345                 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn
    355                 360                 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp
370                 375                 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385                 390                 395                 400GlyAla Ala(2)SEQ ID NO：24的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：1288个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：AAGCTTCGGC   ATGGCACGTT   TGACCGTTGG   GTCGGCAGGG   TACGTTTGAA   TTATTCATAA                 60GAGGAATACG   TTATGAGTCT   GAATACAAGT   GGGCTGGGAG   CGTCAACGAT   GCAAATTTCT                120ATCGGCGGTG   CGGGCGGAAA   TAACGGGTTG   CTGGGTACCA   GTCGCCAGAA   TGCTGGGTTG                180GGTGGCAATT   CTGCACTGGG   GCTGGGCGGC   GGTAATCAAA   ATGATACCGT   CAATCAGCTG                240GCTGGCTTAC   TCACCGGCAT   GATGATGATG   ATGAGCATGA   TGGGCGGTGG   TGGGCTGATG                300GGCGGTGGCT   TAGGCGGTGG   CTTAGGTAAT   GGCTTGGGTG   GCTCAGGTGG   CCTGGGCGAA                360GGACTGTCGA   ACGCGCTGAA   CGATATGTTA   GGCGGTTCGC   TGAACACGCT   GGGCTCGAAA                420GGCGGCAACA   ATACCACTTC   AACAACAAAT   TCCCCGCTGG   ACCAGGCGCT   GGGTATTAAC                480TCAACGTCCC   AAAACGACGA   TTCCACCTCC   GGCACAGATT   CCACCTCAGA   CTCCAGCGAC                540CCGATGCAGC   AGCTGCTGAA   GATGTTCAGC   GAGATAATGC   AAAGCCTGTT   TGGTGATGGG                600CAAGATGGCA   CCCAGGGCAG   TTCCTCTGGG   GGCAAGCAGC   CGACCGAAGG   CGAGCAGAAC                660GCCTATAAAA   AAGGAGTCAC   TGATGCGCTG   TCGGGCCTGA   TGGGTAATGG   TCTGAGCCAG                720CTCCTTGGCA   ACGGGGGACT   GGGAGGTGGT   CAGGGCGGTA   ATGCTGGCAC   GGGTCTTGAC                780GGTTCGTCGC   TGGGCGGCAA   AGGGCTGCAA   AACCTGAGCG   GGCCGGTGGA   CTACCAGCAG                840TTAGGTAACG   CCGTGGGTAC   CGGTATCGGT   ATGAAAGCGG   GCATTCAGGC   GCTGAATGAT                900ATCGGTACGC   ACAGGCACAG   TTCAACCCGT   TCTTTCGTCA   ATAAAGGCGA   TCGGGCGATG                960GCGAAGGAAA   TCGGTCAGTT   CATGGACCAG   TATCCTGAGG   TGTTTGGCAA   GCCGCAGTAC               1020CAGAAAGGCC   CGGGTCAGGA   GGTGAAAACC   GATGACAAAT   CATGGGCAAA   AGCACTGAGC               1080AAGCCAGATG   ACGACGGAAT   GACACCAGCC   AGTATGGAGC   AGTTCAACAA   AGCCAAGGGC               1140ATGATCAAAA   GGCCCATGGC   GGGTGATACC   GGCAACGGCA   ACCTGCAGGC   ACGCGGTGCC               1200GGTGGTTCTT   CGCTGGGTAT   TGATGCCATG   ATGGCCGGTG   ATGCCATTAA   CAATATGGCA               1260CTTGGCAAGC   TGGGCGCGGC   TTAAGCTT                                                        1288(2)SEQ ID NO：25的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：341个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1               5                   10                  15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser
        20                  25                  30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met
    35                  40                  45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala
50                  55                  60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65                  70                  75                  80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe
            85                  90                  95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met
        100                 105                 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu
    115                 120                 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met
130                 135                 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145                 150                 155                 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe
            165                 170                 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile
        180                 185                 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly
    195                 200                 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser
210                 215                 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225                 230                 235                 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp
            245                 250                 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val
        260                 265                 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln
    275                 280                 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala
290                 295                 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305                 310                 315                 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg
            325                 330                 335Asn Gln Ala Ala Ala
        340(2)SEQ ID NO：26的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：1026个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：ATGCAGAGTC   TCAGTCTTAA   CAGCAGCTCG   CTGCAAACCC   CGGCAATGGC   CCTTGTCCTG               60GTACGTCCTG   AAGCCGAGAC   GACTGGCAGT   ACGTCGAGCA   AGGCGCTTCA   GGAAGTTGTC              120GTGAAGCTGG   CCGAGGAACT   GATGCGCAAT   GGTCAACTCG   ACGACAGCTC   GCCATTGGGA              180AAACTGTTGG   CCAAGTCGAT   GGCCGCAGAT   GGCAAGGCGG   GCGGCGGTAT   TGAGGATGTC              240ATCGCTGCGC   TGGACAAGCT   GATCCATGAA   AAGCTCGGTG   ACAACTTCGG   CGCGTCTGCG              300GACAGCGCCT   CGGGTACCGG   ACAGCAGGAC   CTGATGACTC   AGGTGCTCAA   TGGCCTGGCC              360AAGTCGATGC   TCGATGATCT   TCTGACCAAG   CAGGATGGCG   GGACAAGCTT   CTCCGAAGAC              420GATATGCCGA   TGCTGAACAA   GATCGCGCAG   TTCATGGATG   ACAATCCCGC   ACAGTTTCCC              480AAGCCGGACT   CGGGCTCCTG   GGTGAACGAA   CTCAAGGAAG   ACAACTTCCT   TGATGGCGAC              540GAAACGGCTG   CGTTCCGTTC   GGCACTCGAC   ATCATTGGCC   AGCAACTGGG   TAATCAGCAG              600AGTGACGCTG   GCAGTCTGGC   AGGGACGGGT   GGAGGTCTGG   GCACTCCGAG   CAGTTTTTCC              660AACAACTCGT   CCGTGATGGG   TGATCCGCTG   ATCGACGCCA   ATACCGGTCC   CGGTGACAGC              720GGCAATACCC   GTGGTGAAGC   GGGGCAACTG   ATCGGCGAGC   TTATCGACCG   TGGCCTGCAA              780TCGGTATTGG   CCGGTGGTGG   ACTGGGCACA   CCCGTAAACA   CCCCGCAGAC   CGGTACGTCG              840GCGAATGGCG   GACAGTCCGC   TCAGGATCTT   GATCAGTTGC   TGGGCGGCTT   GCTGCTCAAG              900GGCCTGGAGG   CAACGCTCAA   GGATGCCGGG   CAAACAGGCA   CCGACGTGCA   GTCGAGCGCT              960GCGCAAATCG   CCACCTTGCT   GGTCAGTACG   CTGCTGCAAG   GCACCCGCAA   TCAGGCTGCA             1020GCCTGA                                                                                  1026(2)SEQ ID NO：27的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：344个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1               5                   10                  15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser
        20                  25                  30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile
    35                  40                  45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly
50                  55                  60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65                  70                  75                  80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser
            85                  90                  95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met
        100                 105                 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala
    115                 120                 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val
130                 135                 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145                 150                 155                 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly
            165                 170                 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly
        180                 185                 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala
    195                 200                 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn
210                 215                 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225                 230                 235                 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn
            245                 250                 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln
        260                 265                 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly
    275                 280                 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser
290                 295                 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305                 310                 315                 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln
            325                 330                 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met
        340(2)SEQ ID NO：28的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：1035个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：ATGTCAGTCG   GAAACATCCA   GAGCCCGTCG   AACCTCCCGG   GTCTGCAGAA   CCTGAACCTC                 60AACACCAACA   CCAACAGCCA   GCAATCGGGC   CAGTCCGTGC   AAGACCTGAT   CAAGCAGGTC                120GAGAAGGACA   TCCTCAACAT   CATCGCAGCC   CTCGTGCAGA   AGGCCGCACA   GTCGGCGGGC                180GGCAACACCG   GTAACACCGG   CAACGCGCCG   GCGAAGGACG   GCAATGCCAA   CGCGGGCGCC                240AACGACCCGA   GCAAGAACGA   CCCGAGCAAG   AGCCAGGCTC   CGCAGTCGGC   CAACAAGACC                300GGCAACGTCG   ACGACGCCAA   CAACCAGGAT   CCGATGCAAG   CGCTGATGCA   GCTGCTGGAA                360GACCTGGTGA   AGCTGCTGAA   GGCGGCCCTG   CACATGCAGC   AGCCCGGCGG   CAATGACAAG                420GGCAACGGCG   TGGGCGGTGC   CAACGGCGCC   AAGGGTGCCG   GCGGCCAGGG   CGGCCTGGCC                480GAAGCGCTGC   AGGAGATCGA   GCAGATCCTC   GCCCAGCTCG   GCGGCGGCGG   TGCTGGCGCC                540GGCGGCGCGG   GTGGCGGTGT   CGGCGGTGCT   GGTGGCGCGG   ATGGCGGCTC   CGGTGCGGGT                600GGCGCAGGCG   GTGCGAACGG   CGCCGACGGC   GGCAATGGCG   TGAACGGCAA   CCAGGCGAAC                660GGCCCGCAGA   ACGCAGGCGA   TGTCAACGGT   GCCAACGGCG   CGGATGACGG   CAGCGAAGAC                720CAGGGCGGCC   TCACCGGCGT   GCTGCAAAAG   CTGATGAAGA   TCCTGAACGC   GCTGGTGCAG                780ATGATGCAGC   AAGGCGGCCT   CGGCGGCGGC   AACCAGGCGC   AGGGCGGCTC   GAAGGGTGCC                840GGCAACGCCT   CGCCGGCTTC   CGGCGCGAAC   CCGGGCGCGA   ACCAGCCCGG   TTCGGCGGAT                900GATCAATCGT   CCGGCCAGAA   CAATCTGCAA   TCCCAGATCA   TGGATGTGGT   GAAGGAGGTC                960GTCCAGATCC   TGCAGCAGAT   GCTGGCGGCG   CAGAACGGCG   GCAGCCAGCA   GTCCACCTCG               1020ACGCAGCCGA   TGTAA                                                                        1035(2)SEQ ID NO：29的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：26个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：
Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr
            20                  25(2)SEQ ID NO：30的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：20个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：
    (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：
Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Met
            20

Claims (43)

1.欧文氏菌属过敏反应引发剂蛋白或多肽的分离片段，其中所述片段在植物中引发过敏反应。
2.按照权利要求1的分离片段，其中所述过敏反应引发剂蛋白或多肽得自解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、菊欧文氏菌或斯氏欧文氏菌。
3.按照权利要求2的分离片段，其中所述过敏反应引发剂蛋白或多肽得自解淀粉欧文氏菌。
4.按照权利要求3的分离片段，其中所述片段选自SEQ.ID.No.23氨基酸序列的C端片段、SEQ.ID.No.23氨基酸序列的N端片段和SEQ.ID.No.23氨基酸序列的内部片段。
5.按照权利要求4的分离片段，其中所述片段为跨越SEQ.ID.No.23的氨基酸105和403的SEQ.ID.No.23氨基酸序列的C端片段。
6.按照权利要求4的分离片段，其中所述片段为跨越SEQ.ID.No.23的以下氨基酸的SEQ.ID.No.23氨基酸序列的N端片段：1和98、1和104、1和122、1和168、1和218、1和266、1和342、1和321以及1和372。
7.按照权利要求4的分离片段，其中所述片段为跨越SEQ.ID.No.23的以下氨基酸的SEQ.ID.No.23氨基酸序列的内部片段：76和209、105和209、99和209、137和204、137和200、109和204、109和200、137和180以及105和180。
8.编码按照权利要求1的分离的DNA分子。
9.按照权利要求8的分离的DNA分子，其中所述过敏反应引发剂蛋白或多肽得自解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、菊欧文氏菌或斯氏欧文氏菌。
10.按照权利要求9的分离的DNA分子，其中所述过敏反应引发剂蛋白或多肽得自解淀粉欧文氏菌。
11.按照权利要求10的分离的DNA分子，其中所述片段选自SEQ.ID.No.23氨基酸序列的C端片段、SEQ.ID.No.23氨基酸序列的N端片段和SEQ.ID.No.23氨基酸序列的内部片段。
12.按照权利要求10的分离的DNA分子，其中所述片段为跨越SEQ.ID.No.23的氨基酸105和403的SEQ.ID.No.23氨基酸序列的C端片段。
13.按照权利要求10的分离的DNA分子，其中所述片段为跨越SEQ.ID.No.23的以下氨基酸的SEQ.ID.No.23氨基酸序列的N端片段：1和98、1和104、1和122、1和168、1和218、1和266、1和342、1和321以及1和372。
14.按照权利要求10的分离的DNA分子，其中所述片段为跨越SEQ.ID.No.23的以下氨基酸的SEQ.ID.No.23氨基酸序列的内部片段：76和209、105和209、99和209、137和204、137和200、109和204、109和200、137和180以及105和180。
15.用按照权利要求8的DNA分子转化的表达系统。
16.按照权利要求15的表达系统，其中所述分子处于正确意义的取向和正确的读框中。
17.用按照权利要求8的DNA分子转化的宿主细胞。
18.按照权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物和细菌细胞。
19.按照权利要求17的宿主细胞，其中所述DNA分子用表达系统转化。
20.用按照权利要求8的DNA分子转化的转基因植物。
21.按照权利要求20的转基因植物，其中所述植物选自：亚麻、水稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、番薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、卷心菜、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、硬花茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨子、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。
22.按照权利要求20的转基因植物，其中所述植物选自：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、非洲紫苣苔属(Saintpaulia)、矮牵牛、天竺葵属植物、一品红、菊花、康乃馨和百日草。
23.用按照权利要求8的DNA分子转化的转基因植物种子。
24.按照权利要求23的转基因植物种子，其中所述植物选自：亚麻、水稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、番薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、卷心菜、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、硬花茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨子、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。
25.按照权利要求23的转基因植物种子，其中所述植物选自：拟南芥、非洲紫苣苔属、矮牵牛、天竺葵属植物、一品红、菊花、康乃馨和百日草。
26.赋予植物抗病性的方法，包括：
在赋予抗病性的条件下，将非感染形式的过敏反应引发剂蛋白或多肽引发过敏反应的片段施用于植物或植物种子。
27.按照权利要求26的方法，其中在所述施用期间处理植物。
28.按照权利要求26的方法，其中在所述施用期间处理植物种子，所述方法还包括：
在天然或人工土壤中种植用所述过敏反应引发剂片段处理的种子，和
在所述土壤中由所述种子繁殖植物。
29.增强植物生长的方法，包括：
在有效增强植物生长的条件下，将非感染形式的过敏反应引发剂蛋白或多肽引发过敏反应的片段施用于植物或植物种子。
30.按照权利要求29的方法，其中在所述施用期间处理植物。
31.按照权利要求29的方法，其中在所述施用期间处理植物种子，所述方法还包括：
在天然或人工土壤中种植用所述过敏反应引发剂片段处理的种子，和
在所述土壤中由所述种子繁殖植物。
32.防治植物虫害的方法，包括：
在有效防治虫害的条件下，将非感染形式的过敏反应引发剂蛋白或多肽引发过敏反应的片段施用于植物或植物种子。
33.按照权利要求32的方法，其中在所述施用期间处理植物。
34.按照权利要求32的方法，其中在所述施用期间处理植物种子，所述方法还包括：
在天然或人工土壤中种植用所述过敏反应引发剂片段处理的种子，和
在所述土壤中由所述种子繁殖植物。
35.赋予植物抗病性的方法，包括：
提供用一种DNA分子转化的转基因植物或植物种子，所述DNA分子编码过敏反应引发剂蛋白或多肽的片段，所述片段引发过敏反应，和
在有效赋予抗病性的条件下，种植所述转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植物。
36.按照权利要求35的方法，其中提供转基因植物。
37.按照权利要求35的方法，其中提供转基因植物种子。
38.增强植物生长的方法，包括：
提供用一种DNA分子转化的转基因植物或植物种子，所述DNA分子编码过敏反应引发剂蛋白或多肽的片段，所述片段引发过敏反应，和
在有效增强植物生长的条件下，种植所述转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植物。
39.按照权利要求38的方法，其中提供转基因植物。
40.按照权利要求38的方法，其中提供转基因植物种子。
41.防治植物虫害的方法，包括：
提供用一种DNA分子转化的转基因植物或植物种子，所述DNA分子编码过敏反应引发剂蛋白或多肽的片段，所述片段引发过敏反应，和
在有效防治虫害的条件下，种植所述转基因植物或由所述转基因植物种子产生的种转基因植物。
42.按照权利要求41的方法，其中提供转基因植物。
43.按照权利要求41的方法，其中提供转基因植物种子。
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