JP2002501388A - 過敏感反応誘発物質断片およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、その断片が植物において過敏感反応を誘発する、エルウィニア（Erwinia）過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドの単離された断片を目的とする。エルウィニア過敏感反応誘発断片をコードする単離されたDNA分子も開示する。過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドの単離された断片は過敏感反応を誘発し、それらをコードする単離されたDNA分子は植物に病気への抵抗性を付与し、植物の生長を促進し、および／または植物につく昆虫を制御するために用いることができる。これは、病気抵抗性を付与し、植物の生長を促進し、および／または植物もしくは該植物種子から生じる植物につく昆虫を制御するのに有効な条件下で、植物または植物種子に非感染型の過敏感反応誘発断片を適用することにより達成される。または、過敏感反応誘発断片をコードするDNA分子によって形質転換されたトランスジェニック植物もしくは植物の種子を提供し、該トランスジェニック植物または該トランスジェニック植物種子から生じた植物を、植物に病気への抵抗性を与え、植物の生長を促進し、および／または該植物もしくは該植物種子から産生された植物につく昆虫を制御するために有効な条件で生長させる。

Description

【発明の詳細な説明】 過敏感反応誘発物質断片およびその利用 本出願は米国特許出願第60/048,109号の優先権を主張する。 発明の分野 本発明は、その断片が過敏感反応を誘発する過敏感反応誘発物質の断片および その利用に関する。 発明の背景 細菌病原体とその植物宿主との相互作用は一般に２つに分類される：（1）宿 主植物において細胞間細菌増殖、症状の発現、および疾患の発症に至る適合性（ 病原体・宿主）；ならびに（2）進行性の疾患症状を伴わない、過敏感反応、特 に不適合性の相互作用が発生する不適合性（病原体・非宿主）。宿主植物に対し て植物適合性の相互作用が起こる場合、細菌集団は劇的に増加し、進行性の症状 が発生する。不適合性の相互作用の場合、細菌集団は増殖せず、進行性の症状は 起こらない。 過敏感反応は、多くの病原体に対する植物の能動的な防御機構に関連した急速 な局所の壊死である（キラリー（Kiraly，Z）、「侵入者によって誘発される防 御：過敏症（Defenses Triggered by the Invader：Hypersensitivity）」、201 〜224頁、「植物の疾患：学位論文（Plant Disease：An Advanced Treatise）」 、第５巻、ホルスフォール＆カウリング（J.G．Horsfall and E.B．Cowling）編 、Academic Press、ニューヨーク（1982）；クレメント（Klement，Z.）、「過 敏症（Hypersensitivity）」、149〜177頁、「植物病原性原核生物（Phytopatho genic Prokaryotes）」、第２巻、マウント＆レーシー（M.S．Mount and G．H． Lacy）編、Academic Press、ニューヨーク、（1982））。細菌によって誘発され る過敏感反応は、高濃度（≧10⁷個/ml)のシュードモナス・シリンゲ（Pseudomon as syringae）またはエルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）のよう な宿主の範囲が限られた病原体が非宿主植物の葉に侵入した場合の（壊死は接種 部位より下位の孤立した植物細胞に限って発生する）組織の崩壊として容易に認 められる（クレメント（Klement，Z.）、「植物病原性シュードモナス属の病原 性の迅速な検出（Rapid Detection of Pathogenicity of Phytopathogenic Pseu domona ds）」、Nature 199：299〜300；クレメントら（Klement，Z.）、「タバコの葉 における植物病原性細菌によって誘発される過敏感反応（Hypersensitive React ion Induced by Phytopathogenic Bacteria in the Tobacco Leaf）」、Phytopa thology 54：474〜477（1963）；ターナーら（Turner）、「植物と過敏感反応に 関係する細菌細胞との定量的関係（The Quantitative Relationship Between Pl ant and Bacterial Cells Involved in the Hypersensitive Reaction）」、Phy topathology 64:885〜890（1974）；クレメント（Klement，Z.）、「過敏症（Hy persensitivity）」、149〜177頁、「植物病原性原核生物（Phytopathogenic Pr okaryotes）」、第２巻、マウント＆レーシー（M.S．Mount and G．H．Lacy）編 、Academic Press、ニューヨーク、（1982））。非宿主において過敏感反応を誘 発できることと宿主において病原性となることができることは連鎖しているよう に思われる。クレメント（Klement，Z.）が、「過敏症（Hypersensitivity）」 、149〜177頁、「植物病原性原核生物（Phytopathogenic Prokaryotes）」、第 ２巻、マウント＆レーシー（M.S．Mountand G．H．Lacy）編、アカデミック・プ レス、ニューヨーク、（1982）において記載しているように、これらの病原体は また、適合性の宿主との相互作用において多少の遅れはあるものの生理学的に類 似の壊死を生じる。さらに、過敏感反応または発病を生じる能力は、hrpと呼ば れる一般的な組の遺伝子に依存する（リンドグレンら（Lindgren，P．B.）、「 シュードモナス・シリンゲ亜種ファセオリコラの遺伝子クラスタはマメ科植物の 発病および非宿主植物での過敏症を調節する（Gene Cluster of Pseudomonas sy ringae pv.'phaseolicola’Controls Pathogenicity of Bean Plants and Hyper sensitivity on Nonhost Plants）」、J ．Bacteriol．168：512〜22（1986）； ウィリスら（Willis，D．K.）、「植物病原性細菌のhrp遺伝子（hrp Genes of P hytopathogenic Bacteria）」、Mol ．Plant-Microbe Interact 4:132〜138（199 1））。したがって、過敏感反応は植物防御の特性および細菌病原性の基礎の双 方に対する手がかりとなる可能性がある。 hrp遺伝子はグラム陰性植物病原体に広く存在し、そこでそれらは集団となっ て保存され、場合によっては相互交換可能であった（ウィリスら（Willis，D．K .）、「植物病原性細菌のhrp遺伝子（hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria ）」 、Mol ．Plant-Microbe Interact 4：132〜138（1991）；ボナス（Bonas，U.）、 「植物病原性細菌のhrp遺伝子（hrp Genes of Phytopathogenic）」、79〜98頁 、「微生物学と免疫学の現在の話題：植物と動物の細菌病原性・分子細胞的作用 機序（Current Topics in Microbiology and Immunology：Bacterial Pathogene sis of Plants and Animals-Molecular and Cellular Mechanisms）」、ダンゲ ル（J．L．Dangel）編、Springer-Verlag）ベルリン（1994））。いくつかのhrp 遺伝子は、動物疾患において本質的なタンパク質を分泌するために、エルウィニ ア（Erwinia）、赤痢菌（Shigella）およびサルモネラ（Salmonella）属が用い るものと類似のタンパク質分泌経路の成分をコードする（ファン・ギセゲムら（ Van Gijsegem）、「植物および動物病原性細菌における病原性決定要因の進化的 保存（Evolutionary Conservation of Pathogenicity Determinants Among Plan t and Animal Pathogenic Bacteria）」、Trends Microbiol ．１：175〜180（19 93））。E．アミロボーラ（E．Amylovora）、P．シリンゲ（P．Syringae）、お よびP．ソラナセアラム（P．Solanacearum）では、hrp遺伝子は、過敏感反応の グリシンに富むタンパク質誘発剤の産生および分泌を制御することが知られてい る（へら（He，S．Y.）、「シュードモナス・シリンゲ亜種シリンゲ・ハーピンP ss：Hrp経路を通じて分泌され、植物において過敏感反応を誘発するタンパク質 （Pseudomonas syringae pv．sylingae Harpin_Pss：a Protein that is Secrete d via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants ）」、Cell 73：1255〜1266（1993）、ワイら（Wei，Z．H.）、「エルウィニア ・アミロボーラのHrpIはハーピンの分泌において機能し、新しいタンパク質ファ ミリーの一員である(HrpI of Erwinia amylovora Functions in Secretion of H arpin and is a Member of a New Protein Family）」、J ．Bacteriol．175：79 58〜7967（1993）；アーラトら（Arlat，M.）、「PopA1、特殊なペチュニア遺伝 子型に過敏症様反応を誘発するタンパク質はシュードモナス・ソラナセアラムの Hrp経路を通じて分泌される（PopA1，a Protein Which Induces a Hypersensiti ve-like Response on Specific Petunia Genotypes，is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomlonas solanacearum）」、EMBO J ．13：543〜553（1994）） 。 これらのタンパク質の最初のものは、バラ科植物の火傷病を引き起こす細菌で 、ハーピンと命名されたE.アミロボーラ（E．amlylovora）Ea321において発見さ れた（ワイら（Wei，Z．M.）、「ハーピン、植物病原菌エルウィニア・アミロボ ーラによって生じる過敏感反応の誘発物質（Harpin，Elicitor of the Hypersen sitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovorya）」、S cience 257：85〜88（1992））。hrpNコードする遺伝子の変異は、E．アミロボ ーラが宿主でないタバコの葉において過敏感反応を誘発し、非常に感受性の高い 梨の果実において病気の症状を誘発するために必要であることが判明した。P.ソ ラナセアラム（P．solanacearum）GMI1000 PopA1タンパク質は類似の物理的特性 を有し、同様に、その系統の宿主ではないタバコの葉において過敏感反応を誘発 する（アーラトら（Arlat，M.）、「PopA1、特殊なペチュニア遺伝子型に及ぼす 過敏症様反応を誘発するタンパク質はシュードモナス・ソラナセアラムのHrp経 路を通じて分泌される（PopA1，a Protein Which Induces a Hypersensitive-li ke Response on Specific Petunia Genotypes，is Secreted via the HrpPathwa y of Pseudomonas solanacearum）」、EMBO J. 13：543〜553(1994))。しかし、 P.ソラナセアラム(P．S01anaCearUHl)のpopA変異体はなお、タバコにおいて過敏 感反応を誘発し、トマトにおいても病気を誘発する。このように、これらのグリ シンに富む過敏感反応誘発物質の役割はグラム陰性植物病原菌において多様に変 化することができる。 他にも植物病原性過敏感反応誘発物質が単離され、クローニングされて、シー クエンシングされた。これらの中には：エルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）（バウアーら（Bauer）、「エルウィニア・クリサンテミのハー ピン_Ech：腐敗病の病因（Erwinia chrysanthemi Harpin_Ech：Soft-Rot Pathogen esis）」、MPMI 8(4)：484〜91（1995））；エルウィニア・カロトボーラ（Erwi nia carotovora）（キュイら（Cui）、「エルウィニア・カロトボーラ亜種カロ トボーラ株Ecc71のRsmA^-変異体はhrpN_Eccを過剰発現して、タバコの葉に過敏感 反応様反応を誘発する（The RsmA Mutants of Erwinia carotovora subsp.carot ovora Strain Ecc71 Overexpress hrpN_Ecc and Elicit a Hypersensitive React ion-like Response in Tobacco Leaves）」、MPMI 9（7）：565〜73（1966）） ；エルウィニア・ステワーチイ（Erwinia Stewartii）（アーマドら（Ahmad）、 「ハーピンはエ ルウィニア・ステワーチイがトウモロコシに病原性を及ぼすために必要ではない （Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia Stewartii on Maize）」、第８回国際植物微生物分子間相互作用会議（8th Int'l ．Cong．Mole c．Plant-Microb．Inter. ）1996年７月14〜19日、およびアーマドら（Ahmad）、 「ハーピンはエルウィニア・ステワーチイがトウモロコシに病原性を及ぼすため に必要ではない（Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia Stewartii on Maize）」、Ann ．Mt．Am．Phtoath．Soc．1996年７月27〜31日、 1996）；ならびにシュードモナス・シリンゲ種シリンゲ（Pseudomonas syringae pv．syringae）（コーネル・リサーチ・ファンデーション・インクに与えられ た国際公開公報第94/26782号）が含まれる。 本発明は、その断片が過敏感反応を誘発する過敏感反応誘発剤タンパク質また はポリペプチドの断片を同定する努力を行い、そのような断片を使用する。 発明の概要 本発明は、その断片が植物において過敏感反応を誘発するエルウィニア過敏感 反応誘発タンパク質またはポリペプチドの単離された断片に向けられる。そのよ うな断片をコードする単離されたDNA分子も開示する。 過敏感反応誘発物質の断片は植物に対して病気の抵抗性を付与するため、植物 の生長を促進するため、および／または昆虫を制御するために用いることができ る。この中には、病気への抵抗性を与え、植物の生育を促進し、および／または 植物もしくは植物の種子から成長した植物につく昆虫を制御するために有効な条 件下で、植物または植物の種子に、非感染型の断片を適用することが含まれる。 病気に対する抵抗性を与えるため、植物の生長を促進するため、および／また は植物につく昆虫を制御するために、植物もしくは植物種子に断片を適用する代 用法として、トランスジェニック植物もしくは植物種子を利用することができる 。トランスジェニック植物を利用する場合、これには、その断片が植物において 過敏感反応を誘発する過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドの断片をコ ードするDNA分子によって形質転換したトランスジェニック植物を提供する段階 、および病気への抵抗性を与えるため、植物の生長を促進するため、および／ま たは植物もしくは植物の種子から生長した植物上につく昆虫を制御するために有 効 な条件下で植物を生長させる段階が含まれる。または、そのような断片をコード するDNA分子によって形質転換したトランスジェニック植物の種子を提供して土 壌に播種することができる。次に植物を、病気への抵抗性を与えるため、植物の 生長を促進するため、および／または植物もしくは植物の種子から生長した植物 につく昆虫を制御するために有効な条件下で繁殖させる。 図面の簡単な説明 図１は、エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）の過敏感反応誘 発物質（すなわちハーピン）の欠失および蛋白分解分析を示す。Aはハーピン断 片の名前である。Bは断片のアミノ酸残基の長さである。Cは検出可能なタンパク 質が産生されるか否かを示す。Dは過敏感反応（すなわちHR）誘発活性の有無を 示す。実線はハーピンをコードしていないさらなるアミノ酸が存在することを示 し、破線は欠失しているハーピンの部分を示す。四角の枠の断片の上の数字は所 定の断片の末端に存在するアミノ酸残基を表し；残基#1はN末端および残基#403 はC末端である。 図２は、ハーピン_Eaは特異的に分泌されるが、ハーピン_EaC31は分泌されない ことを示すウェスタン・ブロットである。レーンA、Ea273（pGP1-2）CFEP；レー ンB、Ea273（pGP1-2）（pCPP1104）CFEP；レーンC、大腸菌DH5α（pCPP1107）CF EPハーピンの大きさの標準物質；レーンD、バイオラドの低分子量マーカー；レ ーンE、Ea273（pGP-1）上清；レーンF、Ea273（pGP1-2）（pCPP1104）上清。ブ ロットは抗ハーピン_Eaポリクローナル抗体をプローブとして調べた。 図３は、以下のように浸潤させたタバコの葉のHRアッセイである：（1）A、ハ ーピン_Ea＋ラズベリーIF；（2）B、ハーピン_Ea＋リンゴのIF；（3）C、ハーピン_Ea ＋タバコのIF；（4）D、ハーピン_Ea＋エンドプロテイナーゼGlu-C；（5）E、 ハーピン_Ea＋トリプシン；（6）F、ハーピン_Ea；（7）G、タバコのIF；（8）H、 エンドプロテイナーゼGlu-C；（9）I、トリプシン；および（10）J、ハーピン_Ea 。IFは細胞内液体を指す。 図４は、エンドプロテイナーゼGlu-Cによるハーピンの消化を示す。レーンAは ハーピンである；レーンBはハーピン＋エンドプロテイナーゼGlu-C；レーンCは バイオラドの低分子量マーカーである。 図5Aは、ハーピンのタンパク質溶解を示す。クーマシー・ブルー染色を施した ポリアクリルアミドゲルに以下のようにローディングした：A、バイオラド低分 子量マーカー；B、IF-リンゴ；C、IF-ラズベリー；D、IF-タバコ；E、ハーピン_{E a} ；F、ハーピン_Ea＋IF-リンゴ；G、ハーピン_Ea＋IF-ラズベリー；H、ハーピン_Ea ＋IF-タバコ。 図5Bは、以下のようにローディングしたクーマシーブルー染色ポリアクリルア ミドゲルを示す：A、IF-タバコ；B、IF-タバコ＋ハーピン_Ea；C、ハーピン_Ea；D 、バイオラド低分子量マーカー；E、IF-タバコ＋ハーピン_Ea＋PMSF。タンパク質 溶解後の試料のHR誘発活性をゲルの下に示す。 図5Cは、調べた全ての植物からのIF中に存在するタンパク質溶解活性の有無を 示す。いくつかの植物から採取した細胞間液体を0.1％共重合ゼラチンを含むゲ ルにおいてPAGEによって分析した。洗浄してSDSを除去し、インキュベートを行 ってゼラチンをタンパク質溶解させた後、ゲルを染色してゼラチン溶解活性の有 無を調べた。A、IF-リンゴ；B、IF-タバコ；C、IF-コトネアスター；D、バイオ ラド分子量マーカー；E、エンドプロテイナーゼGlu-C；およびF、すりつぶした 葉の抽出物＋タバコ。 図６は、タバコのIFによるハーピン_Eaのタンパク質溶解後の誘発物質活性ペプ チドの再分画を示す。吸光度は210nmで測定した。ピーク1はペプチドP91およびP 95を含む；ピーク2はP65およびP69を含む。 図７は、調べたいくつかのプロテイナーゼのハーピン内の予想されるタンパク 質溶解開裂部位、および活性なハーピン断片の活性に及ぼすこれらの開裂の影響 を示す。さらなる開裂後活性の喪失に基づいてHR-誘発活性に関して重要と思わ れる残基は下に上向きの矢印で示す。 図８は、エルウィニア属のハーピンにおけるN末端付近の類似性を示す。下線 で示した残基は、調べたタンパク質５個中少なくとも４個に存在する（同一また は類似である）。最初の26残基の９個はこのようにして保存される。 図９A-Bは細菌のHR誘発タンパク質のカイト・ドリトル・ハイドロパシー・プ ロットを示す。Ea、E．アミロボーラ（E．amylovora）EA321；Est、E．ステワー チイ（E．stewartii）DC283；Ech、E．クリサンテミ（E．chrysanthemi）AC4150 ； Ecc、E．カルトボーラ（E．cartovora）亜種カロトボーラ（carotovora）；Rs、 R．ソラナセアラム（R．solanacearum）；Pss、P.シリンゲ（P．syringae）属シ リンゲ（syringae）。 図10は過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドの切断されたタンパク質 を示す。 図11は、切断されたハーピンタンパク質を構築するために合成されたオリゴヌ クレオチドプライマーのリストを示す。NはN末端（5'領域）およびCはC末端（3 ’領域）を表す。プライマーは表示の本出願の配列番号に対応する：N1（配列番 号：１）、N176（配列番号：２）、N99（配列番号：３）、N105（配列番号：４ ）、N110（配列番号：５）、N137（配列番号：６）、N150（配列番号：７）、N1 69（配列番号：８）、N210（配列番号：９）、N267（配列番号：10）、N343（配 列番号：11）、C75（配列番号：12）、C104（配列番号：13）、C168（配列番号 ：14）、C180（配列番号：15）、C204（配列番号：16）、C209（配列番号：17） 、C266（配列番号：18）、C342（配列番号：19）、およびC403（配列番号：20） 。 発明の詳細な説明 本発明は、断片が植物における過敏感反応を誘発する過敏感反応誘発タンパク 質またはポリペプチドの単離された断片に向けられる。そのような断片をコード するDNA分子についても、発現系、宿主細胞、およびそのような分子を含む植物 と共に開示する。断片そのものおよびそれらをコードするDNA分子の使用を開示 する。 本発明の過敏感反応誘発ポリペプチドまたはタンパク質の断片は、多様な真菌 および細菌病原体の過敏感反応誘発ポリペプチドまたはタンパク質に由来する。 そのようなポリペプチドまたはタンパク質は誘発物質に接触させた植物組織にお いて局所壊死を誘発することができる。ポリペプチドまたはタンパク質誘発物質 の適した細菌源の例にはエルウィニア（Erwinia）、シュードモナス（Pseudomon as）、およびザンタモナス（Xanthamonas）種が含まれる（例えば、以下の細菌 ：エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルウィニア・クリサ ンテミ（Erwinia Chrysanthemi）、エルウィニア・ステワーチイ（Erwinia stew artii）、エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）、シュードモナ ス・シ リンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・ソランセアルム（Pseudomo nas solancearum）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas Campestri s）およびその混合物）。 過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドの真菌源の例は疫病菌（phytop hthora）である。疫病菌（phytophthora）の適した種には、フィトフトラ・パラ シチカ（Phytophthora parasitica）、フィトフトラ・クリプトゲア（Phytophth ora cryptogea）、フィトフトラ・シナモミ（Phytophthora cinnamomi）、フィ トフトラ・カプシチ（Phytophthora capsici）、フィトフトラ・メガスペルマ （Phytophthora megasperma）、およびフィトフトラ・シトロフトラ（Phytophth oracitrophthora）が含まれる。 エルウィニア・クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi）由来の過敏感反応エリ シターポリペプチドまたはタンパク質は、以下のとおり、配列番号：21に相当す るアミノ酸配列をもつ： この過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、分子量34kDa、熱 安定的で、グリシン含量が16％よりも高く、実質的にシステインを含まない。エ ルウィニア・クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi）の過敏感反応エリシターポ リペプチドまたはタンパク質は、以下のとおり、配列番号：22に相当する塩基配 列をもつDNA分子によってコードされている： エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）由来の過敏感反応エリシ ターポリペプチドまたはタンパク質は、以下のとおり、配列番号：23に相当する アミノ酸配列をもつ： この過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、分子量約39kDa、P Iは約4.3、100℃で少なくとも10分間熱安定的である。この過敏感反応エリシタ ーポリペプチドまたはタンパク質は、実質的にシステインを含まない。エルウィ ニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）由来の過敏感反応エリシターポリペプ チドまたはタンパク質については、参照として本明細書に組み入れらている[Wei ，Z.-M.，He，R．J．Laby，C．H．Zumoff，D．W．Bauer，S.-Y．He，A．Collmer およびS．V．Beer）、「植物病原菌エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amyl ovora）によって産生されるハーピン（Harpin）過敏感反応エリシター（Harpin Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen E rwinia amylovora）」、Science 257:85-88(1992)]において、より完全に説明さ れている。このポリペプチドまたはタンパク質をコードするDNA分子は、以下の とおり、配列番号：24に相当する塩基配列をもつ： シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）由来の過敏感反応エリ シターポリペプチドまたはタンパク質は、以下のとおり、配列番号：25に相当す るアミノ酸配列をもつ： この過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、分子量34〜35kDa である。グリシンに富み（約13.5％）、システインとチロシンをもたない。シュ ードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）由来の過敏感反応エリシター についてのさらに詳しい情報は、参照として本明細書に組み入れらている[He，S ．Y.，H．C．HuangおよびA．Collmer、「シュードモナス・シリンガエ病原型シ リンガエ（Pseudomonas syringae pv．syringae）ハーピン_Pss（Harpin_Pss）：H rp経路によって分泌され、植物の過敏感反応を誘発するタンパク質（Pseudomona s syringae pv．syringae Harpin_Pss：a Protein that is Secreted via the Hr p Pathway and Elicts the Hypersensitive Response in Plants）」、Cell 73: 1255-1266(1993)]に書かれている。シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）に由来する過敏感反応エリシターをコードするDNA分子は、以下のと おり、配列番号：26に相当する塩基配列をもつ： シュードモナス・ソラナセアルム（Pseudomonas solanacearum）由来の過敏感 反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、以下のとおり、配列番号：27 に相当するアミノ酸配列をもつ： これは、以下のとおり、配列番号：28に相当する塩基配列をもつDNA分子によっ てコードされている： シュードモナス・ソラナセアルム（Pseudomonas solanacearum）由来の過敏感反 応エリシターポリペプチドまたはタンパク質についてのさらに詳しい情報は、参 照として本明細書に組み入れらている[Arlat，M.，F．Van Gijsegem，J．C．Hue t，J．C．PemolletおよびC．A．Boucher「ペチュニアの特定の遺伝子型において 過敏感反応様反応を誘導するPopA1タンパク質は、シュードモナス・ソラナセアル ム（Pseudomonas solanacearum）のHrp経路によって分泌される（PopA1，a Prot ein which Induces a Hypersensitive-like Response in Specifc Petunia Geno types is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum）」、E MBO J．13:543-553(1994)]で述べられている。 キサントモナス・カンペストリス病原型グリシネス（Xanthomonas campestris pv．glycines）由来の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、 以下のとおり、配列番号：29に相当するアミノ酸配列をもつ： この配列は、キサントモナス・カンペストリス病原型グリシネス（Xanthomonas c ampestris pv．glycines）の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク 質の26残基だけのアミノ末端配列である。これは、別のキサントモナス・カンペ ストリス（Xanthomonas campestris）の病原型で決定された縁が房状（フィムブ リエ状）のサブユニットタンパク質と一致する。 キサントモナス・カンペストリス病原型ぺラルゴニイ（Xanthomonas campestri s pv．pelargonii）由来の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質 は、熱安定的、プロテアーゼ感受性で、20kDaの分子量をもつ。そして、次のと おり、配列番号：30に相当するアミノ酸配列を含む： エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）の過敏感反応エリシター ポリペプチドまたはタンパク質の単離は、参照として本明細書に組み入れられる [クイ（Cui）ら、「エルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ（Erwinia car otovora subsp．carotovora）菌株Ecc71のRsmA変異株は、タバコの葉でhrp N_ECC を過剰発現し、過敏感反応様反応を誘発する（The RsmA Mutants of Erwinia ca rotovora subsp．carotovora Strain Ecc 71 Overexpress hrp N_ECCand Elicit a Hyper sensitive Reaction-like Response in Tabacco Leaves）」、MPMI，9( 7):565-73(1996)]に記載されている。エルウィニア・ステワルチ（Erwinia stew artii）の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドは、参照として 本明細書に組み入れられる[アーマド（Ahmad）ら、「ハーピン（Harpin）は、エ ルウィニア・ステワルティイ（Erwinia stewartii）のトウモロコシに対する病原 性には必要ではない（Harpin is Not Necessary for the Pathogenicity of Erw inia stewartii on Maize）」、8th Int'l．Cong．Molec．Plant-Microbe Inter act.，1996年７月14〜19日]、および[アーマド（Ahmad）ら、「ハーピン（Harpi n）は、エルウィニア・ステワルティイ（Erwinia stewartii）のトウモロコシに 対する病原性には必要ではない（Harpin is Not Necessary for the Pathogenic ity of Erwinia stewartii on Maize）」Ann．Mtg．Am．PhytopaLh．Soc.，1996 年７月14〜19日]に示されている。 フィトフィトラ・パラシティカ（Phytophthora parasitica）、フィトフィト ラ・クリプトケア（Phytophthora cryptogea）、フィトフィトラ・シナモニ（Phyt ophthora cinnamoni）、フィトフィトラ・カプシキ（Phytophthora capsici）、 フィ トフィトラ・メガスペルマ（Phytophthora megasperma）、およびフィトフィトラ・ シトロフィトラ（Phytophthora citrophthora）由来の過敏感反応エリシターポ リペプチドまたはタンパク質は、[カマン（Kaman）ら、「フィトフィトラ属から の細胞外タンパク質エリシター：最も特異的で、細菌および菌類植物病原菌に対 する抵抗性の誘導（Extracellular Protein Elicitors from Phytophthoura:Mos t Specificity and Induction of Resisitance to Bacterial and Fungal Phyto pathogens）」、Molec．Plant-Microbe Interact.，6(1):15-25(1993)]、[リッ チ（Ricci）ら、「タバコにおいて壊死と獲得抵抗性を誘導する、病原菌フィト フィトラ属由来のタンパク質の構造と活性（Structure and Activity of Protei ns from Pathogenic Fungi Phytophthora Eliciting Necrosis and Acquired Re sistance in Tobacco）」、Eur．J．Biochem.，183:555-63(1989)]、[リッチ（R icci）ら、「フィトフィトラ・パラシティカの単離株による、パラシティセイン の特異的産生、およびタバコにおける壊死と抵抗性のエリシター（Differential Production of Parasiticein，and Elicitor of Necrosis and Resistance in Tabacco，by Isolates of Phytophythora parasitica）」、Plant Path．41:298 -307(1992)]、[ベイルリュール（Baillreul）ら、「タバコの新しい過敏感反応 エリシター：菌類の糖タンパク質が、細胞死、防御遺伝子の発現、サリチル酸の 産生、および全身的獲得抵抗性の誘導を誘起する。（A New Elicitor of the Hy persensitive Response in Tobacco:A Fungal Glycoprotein Elicits Cell Deat h，Expression of Defence Genes，Production of Salicylic Acid，and Induct ion of Systemic Acquired Resisitance）」、Plant J.，8(4):551-60(1995)]、 および[ボネット（Bonett）ら、「タバコおよびその他の植物における、エリシ ターによって発生する獲得抵抗性（Acquired Resistance Triggered by Elicito rs in Tobacco and Other Plants）」、Eur．J．Plant Path.，102:181-92(1996 )]で説明されており、これらは、参照として本明細書に組み入れられる。 上記のエリシターは典型的なものである。エリシターをコードする遺伝子が発 現されるような過敏感反応を誘発する菌または細菌を増殖させることにより、こ の他のエリシターを同定することができる。培養上清からの無細胞調製物を用い て適当な植物組織に浸潤させることによって、それらのエリシター活性（すなわ ち、局所的な壊死）を調べることができる。 上記の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質の断片も、別の病 原菌の全長エリシター断片と同様に、本発明の方法に包含される。 適当な断片を、いくつかの方法によって作出することができる。まず、通常の 分子遺伝学的操作によって遺伝子断片をサブクローニングして、既知のエリシタ ータンパク質をコードする遺伝子のサブクローンを作り出す。そして、このサブ クローンを、インビトロ、または細菌細胞の中でインビボで発現させ、下記で説 明する手順にしたがって、エリシター活性について調べることのできる比較的小 さなタンパク質またはペプチドを得る。 または、キモトリプシン、スタフィロコッカスプロテイナーゼA、またはトリ プシンなどのタンパク質分解酵素によって、全長のエリシタータンパク質を消化 して、エリシタータンパク質の断片を作出することができる。異なったタンパク 質分解酵素は、エリシタータンパク質のアミノ酸配列にもとづいて、異なった部 位でエリシタータンパク質を切断する可能性が高い。タンパク質分解によって生 じる断片のいくつかが、抵抗性の活性エリシターである可能性がある。 別の方法において、タンパク質の一次構造に関する知識に基づいて、タンパク 質の特定の部位を表すよう選択された特異的なプライマーセットとともに、PCR 技術を用いて、エリシタータンパク質遺伝子の断片を合成することができる。そ して、短くなったペプチドまたはタンパク質を発現させるために、適当なベクタ ーの中に、これらをクローニングすることができる。 化学合成を用いて、適当な断片を作成することもできる。このような合成は、 産生されるエリシターに対する既知のアミノ酸配列を用いて行われる。または、 全長エリシターを高温高圧にかけると断片ができる。そして、これらの断片を、 常法（例えば、クロマトグラフィー、SDS-PAGE）によって分離できる。 その断片が過敏感反応を誘発するエルウィニアの過敏感反応誘発物質の適した 断片の例は、エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）過敏感反応誘 発物質の断片である。適した断片には、配列番号：23のアミノ酸配列のC末端断 片、配列番号：23のN末端断片、または配列番号：23のアミノ酸配列の中間断片 が含まれる。配列番号：23のアミノ酸配列のC末端断片は、配列番号：23のアミ ノ酸105 〜403位に及ぶ。配列番号：23のアミノ酸配列のN末端断片は配列番号：23の以下 のアミノ酸に及ぶ：１〜98、１〜104、１〜122、１〜168、１〜218、１〜266、 １〜342、１〜321、および1〜372。配列番号：23のアミノ酸配列の内部断片は、 配列番号：23の以下のアミノ酸に及ぶ：76〜209、105〜209、99〜209、137〜204 、137〜200、109〜204、109〜200、137〜180、および105〜180。その他の適した 断片は本発明に従って特定することができる。 変異型は、例えば、ポリペプチドの特性、二次構造、および水感応性に最小限 の影響しか与えないようなアミノ酸を欠失または付加して作製することができる 。例えば、ポリペプチドには、タンパク質のN末端に、翻訳と同時に、または翻 訳後にタンパク質の移行を指令するシグナル（または先導）配列を結合させるこ とができる。また、ポリペプチドには、ポリペプチドの合成、精製、または同定 を容易にするためのリンカー、またはその他の配列を結合させてもよい。 本発明の断片は、好ましくは、従来からの技術によって、（好ましくは、少な くとも約60％、より好ましくは80％純粋な）精製された形で製造される。典型的 には、本発明の断片は、産生されても、組換え宿主細胞の増殖培地の中には分泌 されない。または、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、増殖培地の中に は分泌される。非分泌タンパク質の場合、タンパク質断片を単離するために、組 換えプラスミドをもつ宿主細胞（例えば、大腸菌）を増殖させ、音波処理によっ て溶菌し、加熱もしくは化学処理し、このホモジネートを遠心分離して、細菌の 残滓を取り除く。次に、上清に熱処理を加えて、遠心分離して断片を分離する。 断片を含む上清画分を、適当なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミド カラムでゲル濾過して、断片を分離する。必要ならば、イオン交換またはHPLCに よって、このタンパク質画分をさらに精製することができる。 従来からの組換えDNA技術を用いて、細胞の中に過敏感反応エリシターポリペ プチドまたはタンパク質の断片をコードするDNA分子を取り込むことができる。 一般的に、これには、そのDNA分子が異種的である（すなわち、通常は存在しな い）発現システムの中にDNA分子を挿入することが含まれる。異種性のDNA分子を 、適正なセンス鎖方向で、かつ正しい読み枠にはまるよう、発現システムまたは ベクターの中に挿入する。このベクターは、挿入されたタンパク質をコードする 配列の 転写および翻訳に必要な因子を含んでいる。 コーエンとボイヤー（Cohen and Boyer）に対する米国特許第4,237,224号は、 参照として本明細書に組み入れられるが、制限酵素切断、およびDNAリガーゼに よるライゲーションを用いて、組換えプラスミドという形での発現システムの作 成を記載している。そして、これらの組換えプラスミドを、形質転換という方法 で導入し、原核生物、および組織培養で増殖させた真核生物細胞などの単細胞培 養で複製させる。 組換え遺伝子は、ワクシニアウイルスなどのウイルスの中に導入することもで きる。組換えウイルスは、ウイルス感染した細胞の中にプラスミドをトランセク ト（transection）させることによって作成することができる。 適当なベクターには、以下のウイルスベクターが含まれるが、これらに限定さ れない。すなわち、gt11、gt WES.tB、Charon 4などのラムダベクターシステム 、また、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、p LG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/-またはKS+/-（カリ フォルニア州ラホヤ（La Jolla）にあるストラタジーン社（Stratagene）の「ス トラタジーンクローニングシステム（Stratagene Cloning Systems）」カタログ （1993）参照。このカタログは、参照として本明細書に組み入れられる）、pQE 、pIH821、pGEX、pETシリーズ（F．W．Studierら、「クローニングした遺伝子を 発現させるためのT7RNAポリメラーゼの使用（Use of T7 RNA Polymerase to Dir ect Expression of Cloned Genes）」、Gene Expression Technology vol．185( 1990)を参照のこと。この論文は、参照として本明細書に組み入れられる）など のプラスミドベクター、および、これらから派生したもの。組換え分子は、形質 転換、特に、形質導入、接合、可動化、またはエレクトロポレーションによって 、細胞の中に導入できる。参照として本明細書に組み入れられる、サムブルック （Sambrook）ら、（分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning．A Laboratory Manual）、Cold Springs Laboratory，Cold Spring Harbor，NY（1 989））によって説明されているような、当技術分野において標準的なクローニ ング技術を用いて、DNA配列をベクターの中にクローニングする。 タンパク質をコードする配列を発現させるために、さまざまな宿主-ベクター シ ステムを利用することができる。まず、このベクターシステムは、用いられる宿 主細胞に親和性がなければならない。宿主-ベクターシステムには、以下のシス テムが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、バクテリオファージDNA 、プラスミドDNA、またはコスミドDNAによって形質転換された細菌、酵母ベクタ ーを含む酵母などの微生物、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウ イルスなど）に感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイルス ）に感染した昆虫細胞系、および細菌に感染した植物細胞。これらのベクターの 発現因子は、それらの強度および特異性において多様である。用いられる宿主- ベクターシステムによって、多くの適当な転写因子および翻訳因子のいずれかを 用いることができる。 さまざまな遺伝子シグナルおよびプロセッシング事象によって、遺伝子発現（ 例えば、DNA転写、およびメッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳）が、さまざまなレ ベルで調節される。 DNAの転写は、RNAポリメラーゼを結合させ、それによってmRNA合成を促進させ るDNA配列であるプロモーターの存在に依存している。真核生物のプロモーター のDNA配列は、原核生物のプロモーターのDNA配列とは異なっている。さらに、真 核生物のプロモーターと、それにともなう遺伝子シグナルは、原核生物システム の中では認識されないか、機能しない可能性がある。そして、さらに、原核生物 のプロモーターは、真核生物の細胞の中では認識もされなければ、機能もしない 。 同様に、原核生物におけるmRNAの翻訳は、真核生物のシグナルとは異なる、原 核生物の適正なシグナルが存在することに依存する。原核生物におけるmRNAの効 率的な翻訳には、mRNA上に、シャイン-ダルガーノ（「SD」）配列と呼ばれるリ ボソーム結合部位が必要である。この配列は、タンパク質のアミノ末端のメチオ ニンをコードする、通常はAUGの開始コドンの前に存在するmRNAの短い塩基配列 である。SD配列は、16S rRNA（リボソームRNA）の3'末端に相補的であり、恐ら く、rRNAと二本鎖を形成することによって、リボソームが正しい位置になるよう にして、mRNAがリボソームに結合するのを促進すると考えられる。遺伝子発現を 最大にすることに関する総説は、参照として本明細書に組み入れられる、ロバー トとロウアー（Robert and Lauer）、Methods in Enzymology，68:473(1979)を 参照の こと。 プロモーターの「強度」（すなわち、転写を促進する能力）はさまざまである 。クローニングされた遺伝子を発現させるために、転写のレベルを高くして、そ れによって遺伝子発現レベルを上げるためには、強いプロモーターを使用するこ とが望ましい。使用する宿主細胞システムによって、数ある適当なプロモーター のいずれか一つを用いることができる。例えば、大腸菌、そのバクテリオファー ジ、またはプラスミドにクローニングするときには、T7ファージプロモーター、 lacプロモーター、trpプロモーター、recAプロモーター、リボソームRNAプロモ ーター、コリファージラムダのP_R、およびP_Lプロモーター、ならびにその他、la cUV5、ompF、bla、lppなどを含むが、これらに限定されないプロモーターを用い て、隣接するDNAセグメントを高レベルで転写させることができる。さらに、雑 種trp-lacUV5（tac）プロモーター、または組換えDNAもしくはその他の合成DNA 技術によって作出された大腸菌プロモーターを用いて、挿入された遺伝子の転写 をもたらすことができる。 細菌の宿主細胞菌株と発現ベクターは、特異的な誘導があるまでは、プロモー ターの作用を阻止するものを選ぶことができる。ある操作においては、挿入され たDNAの転写を効率的に行うためには、特異的なインデューサーの添加が必要に なる。例えば、lacオペロンは、ラクトースかIPTG（イソプロピルチオ-ベータ-D -ガラクトシド）を加えることによって誘導される。その他、trp、proなど、さ まざまなオペロンが、異なる調節の下にある。 また、原核生物細胞での効率的な遺伝子転写と翻訳には、特異的な開始シグナ ルも必要とされる。これらの転写および翻訳開始シグナルは、それぞれ、遺伝子 特異的なメッセンジャ−RNAと合成されたタンパク質の量で測定される「強度」 がさまざまである。プロモーターを含むDNA発現ベクターは、さまざまな「強い 」転写シグナルおよび/または翻訳開始シグナルを任意に組み合わせたものを含 んでいてもよい。例えば、大脳菌における効率的な翻訳には、リボソーム結合部 位を提供するために、開始コドン（ATG）から約7〜9塩基5'側にあるSD配列が必 要である。したがって、宿主細胞のリボソームによって利用できる、いかなるSD -ATGの組み合わせも用いることができる。このような組合せには、コリファージ ラムダの cro遺伝子もしくはN遺伝子由来のSD-ATGの組合せ、または大腸菌のトリプトファ ンE、DNC、B、もしくはA遺伝子由来のSD-ATGの組合せが含まれるが、これらに限 定されない。さらに、組換えDNAまたは合成ヌクレオチドの組み込みを含むその 他の技術によって作出されたSD-ATGの組合せを用いることもできる。 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質の断片をコードする単離 DNA分子が、発現系にクローニングされたら、宿主細胞の中に取り込ませる準備 ができたことになる。この取り込みは、ベクター/宿主細胞システムに応じて、 上記したさまざまな形質転換の形で行うことができる。適当な宿主細胞には、細 菌、ウイルス、酵母、哺乳動物細胞、昆虫、植物などが含まれるが、これらに限 定されない。 本発明はさらに、植物に病気への抵抗性を与え、植物の生育を促進し、および ／または植物の昆虫制御を行う方法に関する。これらの方法は、その断片そのも のが過敏感反応を誘発する過敏感反応誘発ポリペプチドまたはタンパク質の断片 を、断片が病気への抵抗性を与え、植物の生育を促進し、および／または植物の 昆虫制御を行うために有効な条件下で、非感染性型として植物の全体もしくは一 部または植物の種子に適用することを含む。または、過敏感反応誘発タンパク質 もしくはポリペプチドのこれらの断片は、そのような植物そのものから回収され た種子が植物に病気への抵抗性を与え、植物の生長を促進し、および／または昆 虫の制御を行うことができるように、植物に適用することができる。 植物に病気への抵抗性を与え、植物の生育を促進し、および／または植物もし くは種子から成長した植物につく昆虫を制御するために、植物もしくは植物の種 子に、過敏感反応誘発ポリペプチドまたはタンパク質の断片を適用することの代 用として、トランスジェニック植物または植物種子を利用することができる。ト ランスジェニック植物を利用する場合、これには、その断片が過敏感反応を誘発 する過敏感反応誘発ポリペプチドまたはタンパク質の断片をコードするDNA分子 によって形質転換されたトランスジェニック植物を提供する段階、および病気へ の抵抗性を与え、植物の生育を促進し、および／または植物の昆虫制御を行うた めに有効な条件下で植物を生長させる段階を含む。または、その断片が過敏感反 応を誘発する過敏感反応誘発ポリペプチドまたはタンパク質の断片をコードする DN A分子によって形質転換したトランスジェニック植物の種子を提供して土壌に播 種することができる。次に植物を、病気への抵抗性を与えるため、植物の生長を 促進するため、および／または植物または植物の種子から生長した植物につく昆 虫を制御するために有効な条件下で繁殖させる。 過敏感反応誘発ポリペプチドまたはタンパク質を植物もしくは植物の種子に適 用する本発明の態様は、以下を含む多くの方法において行うことができる：1)単 離された断片を適用する、または2)病気を引き起こさず、断片をコードする遺伝 子で形質転換した細菌を適用する。後者の態様において、その断片が過敏感反応 を誘発する過敏感反応誘発ポリペプチドまたはタンパク質の断片をコードするDN A分子を含む細菌を適用することによって、断片を植物または植物の種子に適用 することができる。そのような細菌は、断片が植物または植物の種子細胞に接触 することができるように、断片を分泌または輸送することができなければならな い。これらの態様において、断片は、植物内もしくは種子上で、または植物もし くは植物の種子への細菌の導入の直前に細菌によって産生される。 本発明の方法を使用して、病気への抵抗性を付与し、生長を増強し、および／ または昆虫を防除するために、さまざまな植物またはそれらの種子を処理するこ とができる。適当な植物には、双子葉類と単子葉類が含まれる。より具体的には 、有用な作物植物として、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ 、ワタ、ヒマワリ、ラッカセイ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、イン ゲン、エンドウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、芽キャベツ、ビート 、パースニップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレン ソウ、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、ウリ、カボチ ャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、ミカン、イチゴ、ブドウ、 ラズベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、ソルガム、およびサトウ キビが含まれる。適当な観賞用植物の例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thal iana）、セントポーリア、ペチュニア、ペラルゴニューム、ポインセチア、キク 、カーネーション、およびジニアである。 本発明の過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドの断片を、病気への抵 抗性を与えるために使用することに関して、感染症に対する絶対的な免疫は得ら れないかも知れないが、病気の重症度は軽減され、症状の発現は遅れる。病変の 数、病変の大きさ、および真菌病原体の胞子形成の程度は全て減少する。病気へ の抵抗性を与えるこの方法は、これまで処置できなかった病気を治療する、費用 の点から個別に治療していた病気を全体的に治療する、および感染剤または環境 に有害な材料の使用を防止することができる。 本発明に従って植物に病原体に対する抵抗性を与える方法は、ウイルス、細菌 、および真菌を含む多様な病原体に対する抵抗性を与えるために有用である。中 でも以下のウイルスに対する抵抗性は本発明の方法によって得ることができる： タバコモザイクウイルスおよびトマトモザイクウイルス。中でも以下の細菌に対 する抵抗性は本発明の方法によって植物に与えることができる：シュードモナス ・ソランセアラム（Pseudomonas solancearum）、シュードモナス・シリンゲ（P seudomonas sylingae）亜種タバチ（tabaci）、およびザンタモナス・カンペス トリス（Xanthamonas campestris）亜種ペラルゴニイ（pelargonii）。本発明の 方法を用いることによって、植物は中でも以下の真菌に対して抵抗性となること ができる：フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）およびフィトフ トラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）。 植物の生長を促進するために本発明の過敏感反応誘発タンパク質またはポリペ プチドの断片を使用することに関して、様々なタイプの植物生長増強または促進 を得ることができる。これは、植物の生長が種子から始まる初期に、または植物 の一生の後期にも起こりうる。例えば、本発明による植物の生長は、より大きい 収量、産生される種子量の増加、種子の発芽率の増加、植物の大きさの増加、生 物量がより大きくなること、果実がより多く大きくなること、果実が早期に色づ き始め、ならびにより早期に果実および植物の成熟が起こることを含む。その結 果として、本発明は生産者に対して有意な経済的利益を与える。例えば、初期発 芽および初期成熟によって、生長シーズンが短いためにその場所では生育できな かった地域での作物の生育が可能となる。発芽率の増加は生育する作物数が増加 し、より有効な種子利用となる。収率の増加、大きさの増加、および生物量産生 の増強によって、土地の所定の区画からより大きい収入が得られる。 本発明のもう一つの局面は植物の昆虫制御の何らかの形に影響を及ぼすことに 向けられる。例えば、本発明による昆虫の制御には、過敏感反応誘発物質を適用 する植物に昆虫が接触しないようにし、損傷を与えることによって昆虫による植 物への直接被害を防止し、そのような植物から昆虫を引き離し、そのような植物 に近づく昆虫を殺し、そのような植物を食べる昆虫の幼虫を妨害し、昆虫が宿主 植物にコロニーを形成することを防止し、コロニーを形成した昆虫が植物毒素等 を放出することを防止することが含まれる。本発明はまた、昆虫の感染が原因で 起こる後の病気による植物への障害を防止する。 本発明は、多様な昆虫に対して有効である。アワノメイガは、トウモロコシの 主な害虫である（馬歯トウモロコシおよびスイートコーン）が、インゲン、黄イ ンゲン、およびライマメ、ならびに食用大豆、コショウ、ジャガイモおよびトマ トに加えて多くの雑草種を含む200以上の植物種を食べる。多様な野菜に損傷を 及ぼすさらなる昆虫幼虫の葉を食べる害虫には：シロイチモンジヨトウガの幼虫 、イラクサキンウワバ、オオタバコガの幼虫、ヤガ、コナガ、キャベツの根のウ ジ虫、タマネギのウジ虫、トウモロコシ種子のウジ虫、ピックルワーム（pickle worm）（メロンの害虫）、コショウのウジ虫、トマトの蛸虫、およびウジ虫が含 まれる。この害虫グループは、集合的に、世界中の野菜の生産にとって経済的に 最も重要な害虫グループである。 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質の断片、すなわち過敏感 反応を誘起する断片を適用することを含む本発明の方法は、葉、茎、根、その他 を含む、植物の全身または一部を処理するときに、さまざまな手順によって実施 することができる。これには、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパ ク質を植物の中に浸潤させることが含まれていてもよい（しかし、その必要はな い）。適切な適用法には、高圧または低圧の噴霧、注入、および、エリシターを 適用する直前に葉の表皮を剥脱することが含まれる。本発明の応用の態様にした がって植物種子または胎芽（例えば挿し木）を処理するとき、本発明に従って、 低圧または高圧の噴霧、コーティング、浸漬、または注入によって、過敏感反応 エリシターポリペプチドまたはタンパク質の断片を適用することができる。断片 を植物または植物種子の細胞に接触させることができるようにする、他の適当な 適用手順を、当業者が考案することも可能である。本発明の過敏感反応エリシタ ー断片で処理したら、植物を生産するための常法を用いて、種子を天然または人 工の土に植えて栽培できる。本発明にしたがって処理した種子から植物体を繁殖 させた後、植物に病気の抵抗性を付与するために、植物の生長を増強するために 、および／または植物体上の昆虫を防除するために、過敏感反応エリシターポリ ペプチドもしくはタンパク質の断片、または完全なエリシターで植物体を１回以 上処理することができる。 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質の断片は、単独で、また は他の材料と混ぜて、本発明にしたがって、植物または植物種子に適用すること ができる。または、断片は、異なった時期に適用される別の材料とは別に植物へ 適用することができる。 本発明の応用態様にしたがって植物または植物種子を処理するのに適した組成 物は、担体の中に過敏感反応を誘起する過敏感反応エリシターポリペプチドまた はタンパク質の断片を含んでいる。適当な担体としては、水、水性溶液、スラリ ー、または乾燥粉末などがある。本態様において、この組成物は、500nMよりも 多い断片を含む。 必要ではないが、この組成物は、肥料、殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、および、 これらの混合液など、さらに別の添加剤を含むことができる。適当な肥料として は、（NH₄)₂NO₃などがある。適当な殺虫剤の例はマラチオン（Malathion）であ る。有用な殺菌剤としては、キャプタン（Captan）などがある。 この他の適当な添加剤には、緩衝剤、湿潤剤、被覆剤、および摩砕剤などがあ る。これらの素材を用いて、本発明の処理を容易にすることができる。さらに、 過敏感反応誘起断片は、粘土および多糖類など、他の従来からある種子用調合剤 および処理剤とともに植物種子へ適用することができる。 トランスジェニック植物およびトランスジェニック種子を使用することを含む 、本発明の代替的態様において、過敏感反応誘起断片を植物または種子に局所的 に用いる必要はない。その代りに、該断片をコードするDNA分子で形質転換され たトランスジェニック植物を、当技術分野で周知の方法に従って作出する。 上記のベクターは、組み換えDNAを機械的に移すためにマイクロピペットを用 いて植物細胞に直接マイクロインジェクションすることができる。本明細書に参 照 として組み入れられるクロスウェイ（Crossway）、Mol ．Gen．Genetics 202：17 9〜85（1985）。遺伝子材料はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞 に移してもよい。本明細書に参照として組み入れられるクレンスら（Krens）、N ature 296：72〜74（1982）。 病原体に対する抵抗性を与える遺伝子によって植物細胞を形質転換するもう一 つのアプローチは、宿主細胞の粒子照射（バイオリスティック（biolistic）形 質転換としても知られる）である。これはいくつかの方法の一つにおいて実施す ることができる。最初の方法は、不活性または生物学的に活性な粒子を細胞に噴 射することを含む。この技法は、本明細書に参照として組み入れられ、全てサン フォードら（Sanford）に与えられた米国特許第4,945,050号、第5,036,006号、 および第5,100,792号に開示されている。一般的にこの技法は、細胞の外表面に 浸透し、およびその内部に取り込まれるために有効な条件下で、細胞に不活化ま たは生物学的に活性な粒子を噴射することを含む。不活化粒子を利用する場合、 ベクターは異種DNAを含むベクターで粒子をコーティングすることによって細胞 に導入することができる。または、標的細胞は、ベクターが粒子の跡を通って細 胞の中に運ばれるように、ベクターで取り巻くことができる。生物学的に活性な 粒子（例えば、ベクターを含む乾燥細菌細胞、および異種DNA）はまた、植物細 胞に噴霧することができる。 さらにもう一つの導入法は、他の物質、ミニ細胞、細胞、ライソゾーム、また はその他の融合可能な脂質表面体とプロトプラストとの融合である。本明細書に 参照として組み入れられるフラレーら（Fraley）、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 79：1859〜63（1982）。 DNA分子はまた、電気穿孔によって植物細胞に導入してもよい。本明細書に参 照として組み入れられるフロムら（Fromm）、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 82： 5824（1985）。この技法において、植物のプロトプラストは発現カセットを含む プラスミドの存在下で電気穿孔される。場の強さが高い電気パルスは生体膜を可 逆的に透過性にしてプラスミドを導入させる。電気穿孔した植物のプロトプラス トは細胞壁を再構成して、分裂し、再生する。 DNA分子を植物細胞に導入するもう一つの方法は、この遺伝子で先に形質転換 し たアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）また はA．リゾゲネス（A．rhizogenes）に植物細胞を感染させることである。当技術 分野で既知の適当な条件下で、形質転換した植物細胞を生育させて、苗条、また は根を形成させ、さらに植物に生育させる。一般にこの技法は、細菌の懸濁液を 植物に接種すること、および組織を抗生物質を含まない再生培地上で48〜72時間 、25〜28℃でインキュベートすることを含む。 アグロバクテリウムは、グラム陰性ファミリーである根粒菌（Rhizobiaceae） の代表的な種である。この種は、クラウンゴール（A．ツメファシエンス（A．tu mefaciens））および毛根病（A．リゾゲネス（A．rhizogenes））に関係してい る。クラウンゴール腫瘍および毛根の植物細胞は、オピンとして知られるアミノ 酸誘導体を産生するように誘導され、これは細菌に限って異化される。オピンの 発現に関与する細菌の遺伝子はキメラ発現カセットの簡便な制御エレメント源で ある。さらに、オピンの有無をアッセイすることを用いて、形質転換された組織 を同定することができる。 A．ツメファシエンス（A．tumefaciens）のTiプラスミドまたはA．リゾゲネス （A．rhizogenes）のRiプラスミドを用いて、異種の遺伝子配列を適当な植物細 胞に導入することができる。TiまたはRiプラスミドはアグロバクテリウムによっ て感染した植物細胞に移され、植物のゲノムに安定に組み入れられる。本明細書 に参照として組み入れられるシェル（J．Schell）、Science 237：1176〜83（19 87）。 形質転換後、形質転換した植物細胞を再生させなければならない。 培養したプロトプラストからの植物の再生は、本明細書に参照として組み入れ られる、エバンスら（Evans）の「植物細胞培養ハンドブック第１巻（Handobook of Plant Cell Cultures，Vol．1）」：（マックミラン出版社、ニューヨーク 、1983）；およびベージル（Vasil，I．R.）編、「植物の細胞培養と体細胞遺伝 子（Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants）」、アカデミックプ レス、オーランド、第I巻、1984および第III巻（1986）に記載されている。 サトウキビ、テンサイ、ワタ、果樹およびマメ果を含むがこれらに限定しない 実質的に全ての植物は、培養細胞または組織から再生することができることは知 られている。 再生法は植物の種によって異なるが、一般的に、形質転換したプロトプラスト の懸濁液または形質転換した外植体を含むペトリ皿をまず準備する。カルス組織 を形成して、苗条をカルスから誘導して、その後定着させる。または、カルス組 織において胚芽形成を誘導することができる。これらの胚芽は天然の胚芽と同じ ように発芽して植物を形成する。培養培地は一般に、オーキシンおよびサイトキ ニンのような様々なアミノ酸およびホルモンを含む。特に、トウモロコシおよび アルファルファのような種ではグルタミン酸およびプロリンを培地に加えると都 合がよい。有効な再生は培地、遺伝子型、および培養の経過に依存するであろう 。これらの３つの変数が制御されれば、再生は通常、再現可能で反復可能である 。 発現カセットがトランスジェニック植物に安定に組み込まれた後、交配によっ てこれを他の植物に移すことができる。交配すべき種に応じて標準的な多くの育 種技法を用いることができる。 このタイプのトランスジェニック植物を作製すれば、植物そのものは、過敏感 反応誘発断片をコードする遺伝子の存在下で従来の技法に従って栽培し、病気に 対する抵抗性、植物の生長の促進、および／または植物につく昆虫を制御するこ とができる。またはトランスジェニック種子または胎芽（例えば、挿し木）をト ランスジェニック植物から回収する。次に種子を土に播種して、従来の技法を用 いて栽培するとトランスジェニック植物が得られる。トランスジェニック植物は 、植物に病気への抵抗性を与え、植物の生長を促進し、および／または植物につ く昆虫を制御するために有効な条件下で植えられたトランスジェニック種子から 繁殖させる。理論に拘束されることなく、そのような病気への抵抗性、生長促進 、および／または昆虫の制御はRNA媒介であってもよく、ポリペプチドまたはタ ンパク質断片の発現によって得てもよい。 本発明にしたがってトランスジェニック植物および植物種子を用いるとき、過 敏感反応誘起断片を適用した植物または種子を処理するために用いた材料と同じ もので、さらに、それらを処理することができる。これら、過敏感反応誘起断片 を含む他の材料を、高圧または低圧の噴霧、注入、被覆、および浸漬を含む上記 の処理法によって、トランスジェニック植物または植物種子に適用することがで きる。同様に、トランスジェニック種子から植物体を繁殖させた後、病気への抵 抗性を付与するため、生長を増強するため、および／または昆虫を防除するため に、過敏感反応誘起断片を1回以上適用して植物を処理することができる。従来 からある植物処理剤（例えば、殺虫剤、肥料など）で、これらの植物を処理する こともできる。 実施例 実施例１ −用いた株およびプラスミド 用いた株およびプラスミドは下記の表1に示す通りである。 表１ 実施例２−分子生物学技法 いくつかのアプローチを用いて、切断型またはそうでなければ改変型の両E． アミロボーラ（E．amylovora）ハーピンを得た。これらの技法には：（i）本明 細書に参照として組み入れられる標準的な技法（サムブルックら（Sambrook）、 「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manu al）」、第２版、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハー バー、ニューヨーク（1989））による、エルウィニア・アミロボーラからの過敏 感反応誘発タンパク質（すなわちhrpN）またはポリペプチドをコードする遺伝子 の一部を含む制限断片の発現ベクターへのサブクローニング；（ii）Ω-断片のh rpNへの挿入（本明細書に参照として組み入れられる、フェレーら（Fellay，R. ）、「土壌水性細菌のインターポゾン変異誘発、グラム陰性細菌のインビトロ挿 入変異誘発のためにデザインされたDNA断片のファミリー（Interposon Mutagene sis of Soil and Water Bacteria a Family of DNA Fragments Desigened for i n vitro Insertional Mutagenesis of Gram-Negative Bacteria）」、Gene 52： 147〜154（1987））；（iii）部位特異的変位誘発アプローチ（本明細書に参照 として 組み入れられる、イニスら（Innis）、「PCRプロトコール。方法と応用の手引き （PCR Protocols．A Guide to Methods and Applications）」、Academic Press 、サンジエゴ、カリフォルニア州（1990）；クンケルら（Kunkel）、「表現型選 択を行わない迅速かつ有効な部位特異的変位誘発（Rapid and Efficient Site-S pecific Mutagenesis Without Phenotypic Selection）」、Proc ．Natl．Acad． Sci ．USA 82:488〜492（1985））；および（iv）ネステッド（nested）欠失の作 製（イレーズアベース（登録商標）キット；プロメガ社、マディソン、ウィスコ ンシン州）が含まれた。pCPP1084におけるエルウィニア．アミロボーラ（Erwini a．amylovora）過敏感反応誘発タンパク質（すなわちハーピン_Ea）またはポリペ プチドのC末端欠失分析は、pCPP1084に制限酵素開裂部位が存在したために行う ことができなかった。N末端欠失に関しては、キアゲン社のミディプレップカラ ム（キアゲン、チャッツワース、カリフォルニア州）を用いてpCPP1084 DNAを調 製し、sStIで消化した後EcoRIで消化した。次に、消化したDNAにエキソヌクレア ーゼIII消化を行い、ライケーションを行って大脳菌BL21(DE3)に形質転換した。 欠失サイズはアガロースゲル電気泳動によって推定した。ハーピン断片は、欠失 したハーピンの部分に関して命名した（例えば、ハーピン_EaC82は、全長のハー ピン_EaのC末端のアミノ酸残基82個を欠損する）。実施例３ −タンパク質発現 T7プロモーターからの発現に関して、T7 RNAポリメラーゼ依存的系を用いた。 これらの系は大脳菌株BL21(DE3)（本明細書に参照として組み入れられる、スツ ディアら（Studier）、「クローニングした遺伝子の選択的高レベル発現の指向 へのバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼの使用（Use of Bacteriophage T7 RNA Polymerase to Direct Selective High-Level Expression of Cloned Genes ）」、J ．Mol．Biol．189：113〜130（1986））または大腸菌DH5αにおけるプラ スミドpGP1-2（本明細書に参照として組み入れられる、タバーら（Tabor，S.） 、「特異的遺伝子の制御された排他的発現のためのバクテリオファージT7 DNAポ リメラーゼ／プロモーター系（A Bacteriophage T7 DNA Polymerase/Promoter S ystem for Controlled Exclusive Expression of Specific Genes）」、Proc ．N atl Acad．Sci．USA 82：1074〜1078（1985））のいずれかを利用した。T7プロ モーター からのhrpNの発現はIPTGを最終濃度0.4mMで加えることによって誘導した。E．ア ミロボーラのEa321（例えば、ハーピンEa）またはEa273における発現に関しては 、pGP1-2を42℃で10分間の熱ショックによっる形質転換によって、または電気穿 孔（バイオラド遺伝子パルサー（登録商標））によって導入した。過敏感反応（ すなわちHR-）誘発活性はタバコ亜種ザンチ（Xanthi）の葉において、植物内で の溶解によって（本明細書に参照として組み入れられる、へら（He）、「シュー ドモナスシリンゲ亜種シリンゲのハーピンPss：Hrp経路によって分泌され、植物 において過敏感反応を誘発するタンパク質（Pseudomonas syringae pv.syringae harpinPss：a Protein That is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits t he Hypersensitive Response in Plants）」、Cell 73：1255〜1266（1993）、 または煮沸および非煮沸「CFEPs」の調製（本明細書に参照として組み入れられ る、ワイら（Wei）、「ハーピン、植物病原体エルウィニア・アミロボーラによ って生じる過敏感反応の誘発物質（Harpin，Elicitor of the Hypersensitive R esponse Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora）」、Science 25 7：85〜88（1992））によってスクリーニングした。実施例４ −ハーピンのインビトロ蛋白溶解 ハーピン_Eaのブドウ球菌（Staphylococcus）V8プロテイナーゼ（エンドプロテ イナーゼGlu-Cとも呼ばれる）、トリプシン、ペプシンおよびパパインによるイ ンビトロタンパク質溶解は、推奨されるように（本明細書に参照として組み入れ られる、スコープスら（Scopes）、「タンパク質の精製：原理と実際（Protein Purification：Principles and Practice）、第２版、Springer-Verlag、ニュー ヨーク（1987））20〜37℃で２〜16時間実施した。エンドプロテイナーゼGlu-C 消化は50mM重炭酸アンモニウムpH7.8（その中ではグルタミン酸の後に限って開 裂が起こる）、または50mM燐酸カリウム、pH7.8（その中ではグルタミン酸とア スパラギン酸の双方の後で開裂が起こる）のいずれかで実施した。実施例５ −植物由来プロテイナーゼ 細胞間液体（IF）を、記述（本明細書に参照として組み入れられる、ハモンド ・コサックら（Hamond-Kosack）、「細胞間液体の調製と分析（Preparation and Analysis of Intercellular Fluid）」、15〜21頁、グール、マクファーソン、 およびボウルズ（S．J．Gurr，M.J．McPherson，and D．J．Bowles）編、「分子 植物病理学：実践アプローチ（Molecular Plant Pathology：A Practical Appro ach）」、第２版、実践アプローチシリーズ、IRL Publishers、オックスフォー ド（1992））のように、純水を細胞間隙に真空で浸潤させることによってタバコ 、トマト、リンゴ、ラズベリーおよびコトネアスターから得た。PAGE-精製ハー ピン_Eaのタンパク質溶解消化は、20〜37℃、pHでIFの等量をハーピン_Eaと混和す ることによって２〜16時間行った。タバコの葉を乳鉢と乳棒で５mM燐酸カリウム 中ですりつぶすことによって葉の総抽出物を得た。抽出物を遠心して濾過し、透 明にしたすりつぶした葉の抽出物をIFと同一のものとして用いた。プロテイナー ゼ阻害剤は以下のように用いた：ペプスタチンA（最終濃度１μM）、E-64（１μ M）、アプロチニン（２μg/ml）、o-フェナンスロリン（１mM）、およびp-安息 香酸水銀（PCMB）（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）。実施例６ −ペプチドの精製 タバコIFの消化後に得られたハーピンのペプチド断片を、２〜60％アセトニト リル勾配の0.1％トリフルオロ酢酸溶液を用いてVydac C18カラム上で逆相HPLCに よって分画した。分画を凍結乾燥して、５mM燐酸カリウム中に再懸濁し、タバコ の葉に浸潤させた。最高のHR誘発活性を示す分画を上記のように35〜70％アセト ニトリル勾配で再分画して、各分画の純度を、コーネルバイオテクノロジープロ グラム中心研究施設においてガスクロマトグラフィー・マススペクトル分光法（ GS-MS）およびN末端タンパク質シークエンシングによってアッセイした。実施例７ −プロテイナーゼ活性染色ゲル IFのプロテイナーゼ活性は、0.1％ゼラチンと共重合した（本明細書に参照と して組み入れられる、ヘウセンら（Heussen）、「ドデシル硫酸ナトリウムおよ び共重合基質を含むポリアクリルアミドゲルにおけるプラスミノーゲン活性化因 子の電気泳動的分析（Electrophoretic Analysis of Plasminogen Activators i n Polyacrylamide Gels Containing Sodium Dodecyl Sulfate and Copolymerize d Substrates）」、Anal ．Biochem．102：196〜202（1980））活性染色ポリアク リルアミドゲルにおいてアッセイした（本明細書に参照として組み入れられる、 ラエムリ（Laemmli）、「バクテリオファージT4ヘッドの集合時の構造タンパク 質の開 裂（Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of B acteriophage T4）」、Nature 227：680〜685（1970））。電気泳動の後、各ゲ ルを十分にすすいでSDSを除去し、ゲルの中でプロテイナーゼを再生させた。タ ンパク質溶解を起こさせるさらなるインキュベーションの後、ゲルを0.1％アミ ドブラックの30％メタノール／10％酢酸溶液で染色した。各ゲルは、プロテイナ ーゼがゼラチンを消化した場合を除いて、暗色に染色（共重合ゼラチンの存在に よる）すると、プロテイナーゼ活性部位を表す無色のバンドが得られた。実施例８ −切断されたハーピンはHR誘発活性を保持する 様々なDNA構築物によってコードされたタンパク質の安定性およびHR-誘発活性 を図１に示す。ハーピン_Eaまたはハーピン_Earの一部をコードする多くのDNA構築 物は、T7プロモーター・ポリメラーゼ系における発現の誘導後（本明細書に参照 として組み入れられる、タバーら（Tabor，S.）、「特異的遺伝子の制御された 排他的発現のためのバクテリオファージT7 DNAポリメラーゼ／プロモーター系（ A Bacteriophage T7 DNA Polymerase/Promoter System for Controlled Exclusi ve Expression of Specific Genes）」、Proc ．Natl Acad．Sci．USA 82：1074 〜1078（1985））、およびおそらくコードされたタンパク質の不安定性のために PAGEによる細胞抽出物の分析後に、検出可能なタンパク質産物を生じなかった。 全長のタンパク質に関連してN末端欠失を示す検出可能なタンパク質産物を生じ たDNA構築物（例えば、イレーズアベース（登録商標）プロトコールによって得 られたもの）はなかった。安定なタンパク質は同定されず、不活性なタンパク質 が同定された。C末端で切断されたタンパク質をコードし、さらなるベクターが コードするアミノ酸をしばしば含むいくつかの構築物は、検出可能な産物（例え ばハーピン_EaC82）を生じた。対照的に、ハーピン_Eaの同じ321 N末端アミノ酸残 基をコードするが、Ω-断片（ハーピン_EaC82Ω）の存在によって切断されたタン パク質を生じる構築物は不安定であった（すなわち産物は検出されなかった）。 大きい内部欠失（ハーピン_Ea1175）を有するハーピン_Ea断片をコードする構築物 もまた、タンパク質を発現するために用いて成功した。これらの様々な切断され たタンパク質についてHR-誘発活性の有無を調べた。98残基のN末端ハーピン_Ea断 片（ハーピン_EaC305）は、HR誘発活性を示す細菌によって生じた最少のペプチド であった。実施例９ −C末端が変化したハーピン_Eaの分泌 ハーピンのC末端での変化がその分泌に及ぼす影響を調べた。ハーピンC31は、 ハーピンのN末端のアミノ酸372個を含むが、C末端の残基31個を欠失し、これを ベクターによってコードされる残基47個によって置換すると、野生型のハーピン_Ea よりわずかに大きいタンパク質が得られた。C31タンパク質はHR-誘発活性を保 持し、安定かつ容易に発現されてウェスタン分析またはPAGEによって検出される が、野生型のタンパク質のように培養上清には分泌されない（図２）。ハーピン_Ea C31が存在しても野生型ハーピンの分泌は妨害されず、野生型ハーピンはCFEP および培養上清の双方に認められる。しかし、ハーピン_EaC31はCFEPの中に限っ て認められる。実施例10 −タンパク質溶解がハーピン_EaのHR誘発活性に及ぼす影響 さらなるハーピン_Ea断片を産生するために、精製した全長のタンパク質を、エ ンドプロテイナーゼGlu-C、トリプシン、ペプシン、およびパパイン（例えば、 図３および４）を含むいくつかのプロテイナーゼによってインビトロでタンパク 質溶解した。トリプシンまたはパパインで消化したハーピン溶液は全ての活性を 失った。対照的に、エンドプロテイナーゼGlu-Cによる消化後では、HR誘発活性 は保持された。トリプシン消化後にPAGEを行ったところ、６kD以上のペプチドは 認められならなかった。エンドプロテイナーゼGlu-C消化によって約20kD断片を 生たが、これは全ての開裂部位が切断された場合に予想されるより大きく、この ことは消化が完全でなかったことを示している（図４）。実施例11 −アポプラスチック液（IF）はハーピン分解タンパク質溶解活性を含む タバコおよび他の植物からのアポプラスチック液（細胞間液体；IF）をまた用 いてハーピンをタンパク質溶解した。調べたそれぞれのIFは、共重合ゼラチンを 含むポリアクリルアミドゲルに多数の活性染色バンドが存在すること（図5A〜5C ）によって示されると共に、精製ハーピン_EaをIFで一晩消化させた後に検出可能 なハーピン_Eaが消失することによって示されるように（本明細書に参照として組 み入れられる、シェガーら（Schagger）、「１〜100lDaの範囲のタンパク質の分 離のためのトリシン・ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動（Tricine-Sodium D odecyl Sulfate Gel Electrophoresis for the Separation of Proteins in the Ran ge From1 to 100kDa）」、Anal ．Biochem 166：368〜379（1987））、プロテイ ナーゼ活性を有した。プロテイナーゼ活性は37℃では20℃より実質的に大きく、 pH7よりpH8.5で高かった。IFのタンパク質溶解活性を定義するためにいくつかの 阻害剤を用いた。用いた単一のプロテイナーゼ阻害剤ではハーピン_Eaの分解を防 止しなかった。しかし、酸プロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、セリン プロテイナーゼ、およびメタロプロテイナーゼをそれそれ標的としたペプチタチ ンA（１μM）、E-64（１μM）、アプロチニン（２μg/ml）、およびo-フェナン スロリン（１mM）の阻害剤混合物は、部分的にタンパク質溶解を阻害した。 植物のアポプラストに存在するタンパク質溶解活性によって分解するハーピン_Ea は、HR誘発活性を保持した（図３）。対照的に、乳鉢と乳棒でタバコの葉の組 織をすりつぶすことによって生じた透明な抽出物によってタンパク質分解された ハーピン_Eaは、HR誘発活性を消失した。ハーピンのアポプラスト分解がそのHR誘 発活性にとって必須であるか否かを調べるために、無傷のハーピンまたはタバコ のIFによって予め消化したハーピンのいずれかをタバコの葉に浸潤させた場合に 葉の崩壊に要する時間を比較した。いずれの調製物も同様の時間範囲内でHRを誘 発した（12〜18時間、実験による）。実施例12 −HR誘発ペプチド断片の特徴付け アポプラスト植物のプロテイナーゼによる消化によって得られたペプチドを逆 相HPLC（Vydac C18カラム）によって分画し、活性の有無を調べた。無傷のハー ピン_EaをタバコIFで処置した後、３つの分画がタバコに対する何らかのHR活性を 含んだ。３つのうち２つは活性が弱く、タンパク質はほとんど存在しなかった。 それらはさらに特徴付けを行わなかった。最もタンパク質の量が多くしかも最も 強い活性を含む分画19をより浅い溶出勾配を用いて再分画した（図６）。再分画 、N末端タンパク質シークエンシング、およびマススペクトル分光法による分子 量分析によって、４つの大きく重なり合うペプチドが存在することが示された。 ピーク19-1はペプチドP91およびP95を含み、これはハーピン_Ea残基の110〜200位 および110〜204位に対応した；ピーク19-2はペプチドP64およびP68を含み、これ はハーピン_Ea残基の137〜200位および137〜204位に対応した。19-1および19-2は それぞれ、HR誘発活性を有した。このように活性を保持することが確認された最 少のペプチ ドは残基137〜204を含んだ。それぞれのピークにおける２つのペプチドは用いた 条件下では分離できなかった。これらの活性断片は最少の活性N末端断片（ハー ピン_EaC305）とは異なっており、ハーピン_Eaの１つ以上の部分が植物内で活性を 示すことを示している。トリプシンによってさらに消化すると、19-2のHR誘発活 性は消失した。このプロテアーゼは、図７に示すように、P64およびP68を開裂し た。重炭酸アンモニウム緩衝液においてエンドプロテイナーゼGlu-Cでさらに消 化すると、19-1のHR誘発活性は消失した。エンドプロテイナーゼGlu-Cは図７に 示すようにP91およびP95を開裂すると予想される。これらのペプチドをエンドプ ロテイナーゼGlu-Cまたはトリプシンでさらに消化すると誘発物質活性は消失し た。実施例13 −E．アミロボーラのハーピンの他のタンパク質との類似性 他のいくつかの細菌植物病原体のタンパク質様HR誘発物質、およびタイプIII 分泌経路によって分泌されることが知られているまたは分泌されると思われる他 のタンパク質について予想されるタンパク質配列も、ハーピン_Eaと比較した。ハ ーピン_EaをE．アミロボーラ（E．amylovora）のEa246(すなわちハーピン_Ear）、 エルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）EC16（ハーピン_Ech）（ 参照として本明細書に組み入れられる、バウアーら（Bauer）、「エルウィニア ・クリサンテミのハーピン_Ech：腐敗病の発病に関与する過敏感反応誘発物質（E rwinia chrysanthemi Harpin_Ech：An Elicitor of the Hypersensitive Respons e That Contributes to Soft-Rot Pathogenesis）」、Mol ．Plant-Microbe Inte ract 8：484〜491（1995）、エルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ（Er winia carotovora subsp．carotovora）（ハーピン_Ecc）（本明細書に参照とし て組み入れられる、ムクヘルジーら（Mukherjee）、テネシー州ノックスビルで の第８回国際分子植物微生物相互作用会議（1996）での発表）、エルウィニア・ ステワーチイ（Erwinia stewartii）（ハーピン_Es）（本明細書に参照として組 み入れられる、フレデリックら（Frederick）、「エルウィニア・ステワーチイ のwtsウォーターソキング（Water-Soaking）遺伝子はhrp可遺伝子に関係する（T he wts Water-Soaking Genes of Erwinia Stewartii are Related to hrp genes ）」、スコットランド、エジンバラでの第７回国際分子植物微生物相互作用シン ポジウムでの発表）、ラルストニア（シュードモナス）ソラナセアラム（Ralsto nia（Pseudomonas）solanace arum）（PopA）（参照として本明細書に組み入れられる、アーラトら（Arlat） 、「PopA1、特殊なペチュニア遺伝子型に過敏症様反応を誘発するタンパク質は シュードモナス・ソラナセアラムのHrp経路を通じて分泌される（PopA1，a Prot einWhich Induces a Hypersensitive-like Response on Specific Petunia Geno types，is Secre Led via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum）」 、EMBO J ．13：543〜553（1994））、シュードモナス・シリンゲ61（Pseudomona s syringae）（ハーピン_Pss）（参照として本明細書に組み入れられるへら（He ）、「シュードモナス・シリンゲ亜種シリンゲ・ハーピン_Pss：Hrp経路を通じて 分泌され、植物において過敏感反応を誘発するタンパク質（Pseudomonas syring ae pv．syringae Harpin_Pss：a Protein that is Secreted via the Hrp Pathwa y and Elicits the Hypersensitive Response in Plants）」、Cell 73：1255〜 1266（1993））、シュードモナス・シリンゲ亜種トマト（Pseudomonas syringae pv．tomato）（ハーピン_Pst）（プレストンら（Preston）、「シュードモナス ・シリンゲ亜種シリンゲ、グリシネア、およびトマトのhrpZタンパク質はエルシ ニアysc相同体を含むオペロンによってコードされ、トマトでは過敏感反応を誘 発するが、大豆では誘発しない（The HrpZ Proteins of Pseudomonas syringae pvs．syringae，glycinea，and tomato Are Encoded By An Operon Containing Yersinia ysc Homologs and Elicit the Hypersensitive Response in Tomato B ut Not Soybean.）」、Mol ．Plant-Microbe Interact．8：717〜732（1995）） からの誘発物質と比較すると、エルウィニア由来のハーピンはC末端で有意な類 似性領域を含んだ。さらに、全ての誘発物質はグリシンに富み、分泌され、熱に 安定であった。ハーピン_Pssとハーピン_Eaとの類似性が限局されていることは既 に報告されている（参照として本明細書に組み入れられる、へら（He）、「シュ ードモナス・シリンゲ亜種シリンゲ・ハーピンPss：Hrp経路を通じて分泌され、 植物において過敏感反応を誘発するタンパク質（Pseudomonas syringae pv．syr ingae Harpin_Pss：a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elic its the Hypersensitive Response in Plants）」、Cell 73：1255〜1266（1993 ））、（ラビーら（Laby）、参照として本明細書に組み入れられる、スコットラ ンド、エジンバラでの第７回国際分子植物微生物相互作用シンポジウム（1994） での発表）。ハーピン_Eaとエルウ ィニア属の他のハーピンとの限られた類似性領域もまた各タンパク質の最もN末 端では明確であり、ここでは最初の26残基中９残基が保存されていた（図８）。 異なるエルウィニア属から産生されたハーピンのそれぞれのカイトドリトル・ハ イドロパシー・プロットを図９に示す。エルウィニア・ハーピンのそれぞれは全 長のタンパク質に対して一般的に類似の疎水性プロフィールを示した。このプロ フィールはPopA1およびハーピン_Pssによって示されたプロフィールとは異なって おり、それら２つのタンパク質のプロフィールには存在する対称性を有しない。 各エルウィニアハーピンのハイドロパシー・プロフィールは一般に、他のプロフ ィールと類似しているが、ハーピン_Pssに関して報告されたプロフィールとは異 なる（参照として本明細書に組み入れられる、アルファノら（Alfano）、「機能 的に非極性のhrpZ欠失変異、切断されたhrpZ断片およびhrmA変異を用いた、タバ コへの過敏感反応の誘発におけるシュードモナス・シリンゲのhrpZハーピンの役 割の分析（Analysis of the Role of the Pseudomonas Syringae HrpZ harpin i n Elicit ation of the Hypersensitive Response to Tobacco Using Functiona lly Nonpolar hrpZ Deletion Mutations，Truncated HrpZ Fragments，and hrmA Mutations）」、Mol ．Microbiol．19：715〜728（1996））。ハーピン_Eccは残 基54〜143位周辺に極めて疎水性領域を有する（本明細書に参照として組み入れ られる、ムクヘルジーら（Mukherjee）、テネシー州ノックスビルでの第８回国 際分子植物微生物相互作用会議（1996）での発表）。タンパク質のこの部分はま た、ハーピン_Eaおよびハーピン_Esに関して最も疎水性の強い領域である。各タン パク質の残りは極めて親水性である。 全長のタンパク質のタンパク質溶解消化後に得られた切断されたタンパク質お よび断片は、ハーピンEaのHR-誘発活性に関していくつかの驚くべき局面を示し ている。これらのハーピン断片は、HR誘発活性がタンパク質の明確な領域に存在 すること、そしてこの活性には68残基およびおそらくそれより少ない比較的小さ い断片で十分であることを示している。カルドスポリウム・フルブム（Caldospo rium fulvum）からのAvr9（本明細書に参照として組み入れられる、ファン・デ ン・アッカーベッケンら（Van den Ackervecken）、「カルドスポリウム・フル ブムのAVR9種特異的誘発物質は内因性および植物プロテアーゼによってプロセシ ングさ れる（The AVR9 Race-Specific Elicitor of Cladosporium fulvum is Processe d by Endogenous and Plant Proteases）」、PI ．Phsiol．103：91〜96（1993） ）、フィトフトラ・メガスペルマ（Phytophthora megasperma）のPep-13（参照 として本明細書に組み入れられる、ニュルンブルガーら（Nurnburger）、「真菌 のオリゴペプチド誘発物質がパセリの原形質膜に高親和性結合すると多くの防御 反応を誘発する（High Affinity Binding of Fungal Oligopeptide Elicitor to the Parsley Plasma Membrane Triggers Multiple Defence Responses）」、Ce ll 78：449〜460（1994））、およびP．シリンゲ亜種シリンゲのハーピン_Pss（ 参照として本明細書に組み入れられる、アルファノ（Alfano）、「機能的に非極 性のhrpZ欠失変異、切断されたhrpZ断片およびhrmA変異を用いた、タバコへの過 敏感反応の誘発におけるシュードモナス・シリンゲのhrpZハーピンの役割の分析 （Analysis of the Role of the Pseudomonas Syringae HrpZ harpin in Elicit ation of the Hypersensitive Response to Tobacco Using Functionally Nonpo lar hrpZ Deletion Mutations，Truncated HrpZ Fragments，and hrmA Mutation s）」、Mol ．Microbiol．19：715〜728（1996））を含む、他の植物病原体に由 来する誘発物質タンパク質の断片もまた生物活性を保持する。 切断されたハーピン断片の発現および全長のハーピンのタンパク質溶解により 、２つの異なる断片がHR誘発活性を保持することが示された。それぞれの活性断 片の一次配列は、互いに識別可能な類似性、または他の誘発活性ペプチドとの類 似性を示さなかった。しかし、トリプシンおよびエンドプロテイナーゼGlu-Cに よる開裂部位は各断片の一部が活性に必要であることをを示唆している。HR誘発 活性が変化したか、または失われたかを明らかにするために、これらの開裂部位 で、またはその近傍でのアミノ酸残基を特に変化させることは重要であろう。さ らに、ハーピン_EaP64およびP68は、逆相HPLCの際に異なる疎水性を示し（図６） 、それらはカイトドリトル・プロットにおいて疎水性のピークに対応する（図９ ）。この椎定の疎水性ドメインの役割は、変異誘発、または変化させたペプチド の合成によって調べることができる。しかし、多数の断片がHR誘発活性を個別に 有するという事実によって全長のタンパク質の分析は複雑となる。 タンパク質の断片がHR誘発活性を保持するというこの知見により、細胞内植物 プロテイナーゼとは異なる（少なくとも）２つのアポプラストプロテイナーゼ活 性が存在することが明らかとなる。２つのアポプラスト植物プロテイナーゼ（大 豆の）をいくぶん詳しく調べた。EDTAに対して感受性があるメタロプロテイナー ゼ（参照として本明細書に組み入れられる、ヒュアンクプら（Hyangpu）、「大 豆の若葉からの細胞外プロテイナーゼの精製と生育的分析（Purification and D evelopmental Analysis of an Extracellular Proteinase From Young Leaves o f Soybean）」、Plant Phsiol ．108：969〜974（1995）；マクギーハンら（McGe ehan）、「大豆の葉のメタロプロテイナーゼのシークエンシングおよび特徴付け （Sequencing and Characterization of the Soybean Leaf Metalloproteinase ）」、Plant Phsiol ．99：1179〜1183（1992））であるSMEPは、G/LおよびG/Iで 開裂すると思われる。興味深いことに、無傷のハーピン_Eaには、考えられるSMEP 開裂部位が19箇所あるが、断片P91およびP95の中に存在するのは１箇所に過ぎず 、断片P64およびP68の断片の中には存在しない（図７）。P91およびP95はこのよ うに、タバコのアポプラストにおけるSMEP様プロテイナーゼの部分的消化産物を 表す可能性がある。他の研究者は大豆のアポプラストプロテイナーゼ、SLAP、p- クロロ水銀安息香酸（pCMB）に感受性があるスルフヒドリル・プロテイナーゼ（ 参照として本明細書に組み入れられる、ヒュアングプら（Huangpu）、「大豆の 若葉からの細胞外プロテイナーゼの精製と生育的分析（Purification and Devel opmental Analysis of an Extracellular Proteinase From Young Leaves of So ybean）」、Plant Phsiol ．108：969〜974（1995））を研究している。一連の証 拠から、IFにおける多数のタンパク質溶解活性がハーピン_Eaを分解することが示 唆される。セリンプロテアーゼ阻害剤であるPMSFはハーピン_Ea分解を減少させる が、完全には遮断しない（図5C）；調べたプロテイナーゼ阻害剤は単独ではハー ピン分解を遮断せず、残基109、136、200および204位後の開裂部位は異なってい る。エンドプロテイナーゼGlu-Cは全長のハーピンの活性を消失させないがP91お よびP95の活性を消失させる（ならびにおそらくP64およびP68）；トリプシンはP 64およびP68の活性を消失させる（ならびにおそらくP91およびP95）。これらの 最終消化物は、先に述べたように、それぞれの異なるHR誘発ペプチドにはその活 性におそらく必要な特異的部分が存在することを示唆しているる。 アポプラスト活性は、すりつぶした葉の抽出物に存在する細胞内タンパク質溶 解活性が活性を消失することとは対照的に、そのHR誘発能を破壊することなくハ ーピンを分解する。これは、好奇心を刺激するような多くの問題を生じる、例え ば誘発物質のシグナルとしてこれらのハーピン断片を植物は利用しているのか。 全長のハーピンおよびタバコの細胞間液体によって予め消化したハーピンをそれ ぞれタバコの葉に浸潤させて、HRの発現時期を調べた。それぞれの調製物によっ て誘発されたHRは浸潤の12〜18時間後に発生した。プロテイナーゼ阻害剤をタバ コの葉にハーピンと共に浸潤させてもハーピンのHR誘発能に影響を及ぼさなかっ たが、特にタバコには少なくとも２個、おそらくそれ以上のアポプラストプロテ イナーゼが存在するように思われるため、この場合わずかながらタンパク質溶解 性の分解があったことを否定できない。予め消化したハーピンは、未消化のタン パク質と同じ速さでHRを誘発したため、タンパク質溶解消化がHRが起こるために 必要な律速段階である可能性は低いように思われる。タバコにおいてハーピンを 部分的に加水分解することができるが、ハーピンのHR誘発活性を消失させること ができないこれらのアポプラストプロテイナーゼの役割はなおも不明である。本 明細書に参照として組み入れられるサルツァーら（Salzer）の、「外菌根真菌で あるベヘローマ・クルスツリニホルムから放出された誘発物質に対するトウヒ細 胞の急速な反応および細胞外トウヒ細胞酵素によるこれらの誘発物質の不活化（ Rapid Reactions of Spruce Cells to Elicitors Released From the Ectomycor rhizal Fungus Hebelomla crustuliniforme and Inactivation of These Elicit ors by Extracellular Spruce Cell Enzymes）」、Planta 198：118〜126（1996 ）は、トウヒ（オウシュウトウヒ（Picea abjes（L.）Karst））が、アポプラス トにおけるこれらの分子を不活化することによって外菌根真菌であるヘベローマ ・クルスツリニホルム（Hebeloma crustuliniforme）によって放出された真菌細 胞壁誘発物質のレベルを調節することを認めた。彼らは、トウヒが真菌との共生 相互作用の一部として誘発物質のレベルを制御していると提唱している。同様に 、ファセオルス・ブルガリス（Phaseolus vulgaris）のPGIPは、マメにおける植 物寄生虫相互作用の際に存在するオリゴガラクツロニドのレベルを調節すること が示唆されている（参照として本明細書に組み入れられる、デシデリオら（Desi de rio）、「細胞・細胞コミュニケーションにおけるポリガラクツロナーゼ、PGIP 、およびオリゴガラクツロニド（Polygalacturonase，PGIP，and Oligogalactur onides in Cell-Cell Communication）」、Biochem ．Sci．Trans．22：394〜397 （1994））。おそらくハーピン断片がHR誘発活性を保持していることによって、 植物は病原体の存在を認識することができる。この点において、ハーピン活性分 解プロテイナーゼのアポプラストを発現するように遺伝子操作したトランスジェ ニック宿主および非宿主植物が、操作していない植物と比較してE．アミロボー ラに対する感受性の減少または増加を示すか否かを調べることは興味深いであろ う。 多くの試みにもかかわらず、hrpNの一部からの発現に成功したのはハーピン_Ea およびハーピン_Earの切断された誘導体の少数であった。切断されたいくつかの ハーピンは不安定で精製することが難しいというタンパク質の安定性に関する問 題が明らかとなった。さらに、切断されたハーピンの発現は細菌に対して有害で ある可能性がある。しかし、切断されたハーピン_EaC31は安定かつ容易に精製さ れたが、分泌されず、このことはC末端配列がハーピン分泌に関係していること を示唆している。残念なことに、このタンパク質にはベクターがコードするアミ ノ酸が存在するために、この結論は複雑になっている。β-ガラクトシダーゼ・ ハーピン融合タンパク質をクローニングする全ての試みは、pBluescriptのよう な一般的に用いられるいくつかのベクターにおいてlacZプロモーターの下流にhr pNを発現する試みと同様に、失敗に終わった。そのような構築物の発現は細菌株 にとって明らかに有害である。 本明細書に参照として組み入れられる、ワイら（Wei）、「ハーピン、植物病 原菌エルウィニア・アミロボーラによって生じる過敏感反応の誘発物質（Harpin ，Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora）」、Science 257：85〜88（1992）は既に、BLAST検索によ り、ハーピン_Eaが、ケラチンおよびグリシンに富む細胞壁タンパク質を含む他の いくつかのグリシンに富むタンパク質との類似性はわずかであることが示された と報告した。しかし、これはハーピン_Eaのグリシン含有量が高いことが原因であ ると思われ、そのため、ハーピン_Eaの役割を示唆していない。植物病原菌によっ て生じたいくつかのHR-誘発タンパク質からのN末端配列の検査（図８）では、可 能性があ るいくつかの類似性が得られた。しかし、問題の領域はかなり短い。推定の一次 配列類似性領域はN末端の最初の26残基に限定され、その役割はなおも不明であ る。意外にも、E．カロトボーラ(E．carotovora）のハーピン_Eccは、その発病の メカニズム（すなわち、腐敗病）のみならずその分類学的位置から見てより近縁 であるE．クリサンテミ（E．chrysanthemi）からのハーピンよりE．アミロボー ラ（E．amylovora）およびE．ステワーチイ（E．stewartii）からのハーピンと より類似しているように思われる。さらに、一次配列の類似性はそれぞれのタン パク質のC末端側の３分の１に限って最も強いが、エルウィニアのハーピンはそ の全長に対して広く類似の疎水性プロフィールを有する（図９）。その疎水性プ ロフィールに基づいて、本明細書に参照として組み入れられる、アルファノら（ Alfano）、「機能的に非極性のhrpZ欠失変異、切断されたhrpZ断片およびhprmA 変異を用いた、タバコへの過敏感反応の誘発におけるシュードモナス・シリンゲ のhrpZハーピンの役割の分析（Analysis of the Role of the Pseudomonas Syri ngae HrpZ harpin in Elicitation of the Hypersensitive Response to Tobacc o Using Functionally Nonpolar hrpZ Deletion Mutations，Truncated HrpZ Fr agments，and hrmA Mutations）」、Mol ．Microbiol．19：715〜728（1996）は 、ハーピン_Easが両親媒特性を有する可能性があると推測した。しかし、エルウ ィニア（Erwinia）のハーピンのプロフィールはハーピン_Pssのプロフィールと一 致しない。 最近、フィトフトラ・メガスペルマ（phytophthora megasperma）（バリュー ルら（Ballieul）、「タバコにおける過敏感反応の新規誘発物質：真菌の糖タン パク質が細胞死、防御遺伝子の発現、サリチル酸の産生、および全身後天性抵抗 の誘導を誘発する（A New Elicitor of the Hypersensitive Response in Tobac co：a Fungal Glycoprotein Elicits Cell Death，Expression of Defence Gene s，Production of Salicylic Acid，and Induction of Systemic Acquired Resi stance）」、Plant Journal 8：551〜560（1995）；ニュルンブルガーら（Nurnb urger）、「真菌のオリゴペプチド誘発物質がパセリの細胞質膜に高親和性結合 すると多くの防御反応を誘発する（High Affinity Binding of Fungal Oligopep tide Elicitor to the Parsley Plasma Membrane Triggers Multiple Defence R esponses）」、Cell 78：449〜460（1994））およびマグナポルテ・グリセア（M agna rthe grisea）（参照として本明細書に組み入れられる、スウエイガードら（Swe igard）、「コメ枯れ病真菌における宿主種特異性のための遺伝子であるPVVL2の 同定、クローニング、および特徴付け(Identification，Cloning，and Characte rization of PWL2，a Gene For Host Species Specificity in the Rice Blast Fungus）」、Plant Cell 7：1221〜1233（1995））を含む、他の植物病原菌およ び真菌から、分泌性のグリシンに富む他の多くの病原性関連タンパク質、HRまた は他の植物防御反応の誘発物質が記述されている（参照として本明細書に組み入 れられる、ボラー（Boller）、「植物細胞における微生物シグナルの化学認識（ Chemoperception of Mirobial Signals in Plant Cells）」、Ann ．Rev．Plant ．Phsiol．Plant．Molec．Biol． 46：189〜214（1996））。本明細書に参照とし て組み入れられる、フィンコスポリウム・セカリス（Phynchosporium secalis） （ロチェら（Roche）、「大麦病原体リンコスポリウム・セカリスからの種特異 的誘発物質NIP1はRrs1耐性遺伝子型の宿主植物に及ぼす毒性を左右する（The Ra ce-Specific Elicitor，NIPI，From the Barley Pathogen，Rhynchosporium sec alis，Determines A Virulence on Host Plants of the Rrs1 Resistance Genot ype）」、EMBO Journal 14：4168〜4177（1995））からのタンパク質様HR誘発物 質もまた記述されているが、P．インフェスタンス（P．infectans）（参照とし て本明細書に組み入れられる、ピエテルセら（Pieterse）、「フィトフトラ・イ ンフェスタンスのipiBおよびipiO遺伝子クラスタの構造およびゲノム構築（Stru cture and Genomic Organization of the ipiB and ipiO Gene Clusters of Phy tophthor a infestans）」、Gene 138：67〜77（1994））は、未知機能のタンパ ク質のグリシンに富む病原性に関連するファミリーを生じる。各誘発剤タンパク 質またはペプチド断片の一次アミノ酸配列は、他の配列と明確な類似性を示さな いため、それらが植物細胞上もしくは細胞内、原形質膜、または細胞壁上の同じ 標的と相互作用するか否かは不明である。この点において、これらの分子のいず れかが他の作用を阻害するか否かを調べることは興味深い。Pep13、Avr9、P68、 およびハーピン_EaC305のような植物防御反応誘発活性（HRおよびその他）を有す るペプチドがますます利用できるようになれば、植物細胞上もしくは細胞内の標 的を正確に調べることができるのみならず、活性のメカニズムが類似、異なる、 または重なる か否かを決定することができるはずである。実施例14 −細菌株およびプラスミド 以下の実施例に用いた大脳菌株には、それぞれギブコBRL社およびストラタジ ーン社から購入した、DH5αおよびBL21（DE3）が含まれる。pET28（b）ベクター はノバゲン社から購入した。Eco DH5α/2139は完全なhrpN遺伝子を含んだ。2139 構築物はコーネル大学のバウアー（Bauer）博士によって作製された。hrpN遺伝 子はHind IIIによる制限酵素消化によって2139プラスミドから開裂し、アガロー スゲルから精製して、切断されたhrpNクローンのPCR合成のDNA鋳型として用いた 。これらのクローンをその後、形質転換体の選択のためにKan^r遺伝子を含む（Hi s）₆ベクターpET28(b)に挿入した。実施例15 −DNA操作 ベーリンガー・マンハイム社またはギブコBRL社から制限酵素を購入した。T4D NAリガーゼ、仔ウシ腸アルカリフォスファターゼ（CIAP）およびPCRスーパーミ ックス（登録商標）をギブコBRL社から得た。QIAプレップ・スピン・ミニプレッ プ・キット、キアケンプラスミド・ミニキットおよびQIAクイックPCR精製キット は、キアゲン社から購入した。PCRプライマーはロフストランド・ラブス・リミ テッド（メリーランド州、ガイサースバーク）が合成した。オリゴペプチドはバ イオシンセシス・インク（テキサス州、ルイスビル）が合成した。プラスミドの 単離、制限酵素消化、DNAライゲーション、およびPCRのような全てのDNA操作は 、標準的な技法（分子クローニング）または製造元から供給されたプロトコール に従って実施した。実施例16 −hrpN遺伝子の断片化 一連のN末端およびC末端切断hrpN遺伝子をPCRによって作製した（図10）。全 長のhrpN遺伝子をDNA鋳型として用いて、それそれの切断されたクローンに対し て3'および5'プライマー-をデザインした（図11）。3'プライマーは、開始コド ンATG（メチオニン）を含むNdeI酵素切断部位を含み、5'プライマーは停止コド ンTAAおよびpET28(b)ベクターへのライゲーションのためにHind III酵素切断部 位を含む。PCRはジーンアンプ（登録商標）9600または9700において0.5mlチュー ブ中で実施した。スーパーミックス（登録商標）45μlを各対のDNAプライマー20 pmol、 全長のハーピンDNA 10ng、およびdiH₂Oと共に最終容量50μlとなるように混合し た。混合物を95℃で２分加熱した後、PCRを94℃で１分、58℃で１分、および72 ℃で1.5分を30サイクル実施した。PCR産物は６％TBEゲル（ノベックス）上で確 認した。増幅したDNAをQIAクイックPCR精製キットで精製し、Nde IおよびHInd I IIで37℃で５時間消化し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（ 25：25：1）で１回抽出してエタノールで沈殿させた。pET28(b)ベクターDNA ５ μgをNde Iの15単位およびHind IIIの20単位で37℃で３時間消化させ、その後不 完全な１回酵素処理が原因であるバックグラウンド減少させるためCIAP処置を行 った。消化したベクターDNAをQIAクイックPCR精製キットによって精製して、ラ イゲーションのために直接用いた。ライゲーションは、消化したpET28(b)約200n g、標的PCR断片30ng、およびT4 DNAリガーゼ１単位を含む混合物15μl中で14〜1 6℃で５〜12時間実施した。ライゲーション溶液5〜7.5μlを15miファルコンチュ ーブ中でDH5αコンピテント細胞100μlに加えて、氷中で30分インキュベートし た。42℃で45秒間、熱ショックを加えた後、SOC溶液0.9mlまたはLB培地0.45mlを 各チューブに加えて37℃で１時間インキュベートした。形質転換した細胞20、10 0、および200μlを、30μg/mlカナマイシンを含むLBアガーに載せて、37℃で一 晩インキユベートした。単一のコロニーを３mL LB培地に写して37℃で一晩イン キュベートした。プラスミドDNAはQIAプレップミニプレップキットによって培養 ２mlから調製した。形質転換細胞からのDNAを制限酵素消化または部分的シーク エンシングによって分析して、形質転換の成否を確認した。望ましいDNA配列を 有するプラスミドを、上記のような標準的な化学的形質転換法を用いてBL21株に トランスファーした。pet28(b)ベクターにおいて全長のハーピンタンパク質を含 むクローンを陽性対照として作製し、pET28(b)ベクターのみを有するクローンを 陰性対照として作製した。実施例17 −ハーピン切断タンパク質の発現 hrpNクローンを含む大腸菌BL21（DE3）株を、カナマイシン30μg/mlを含むル リア・ブロス培地（g/Lディフコ酵母抽出物、10g/Lディフコトリプトン、５g/L NaCl、および１mM NaOH）で37℃で一晩増殖させた。次に細菌を同じ培地の100倍 容量に接種して37℃でOD₆₂₀が0.6〜0.8となるまで増殖させた。次に細菌を同じ 培地の250倍容量に接種して、37℃OD₆₂₀がおよそ0.3または0.6〜0.8となるまで 増殖させた。次にIPTG１ミリモルを加えて、培養を19℃で一晩増殖させた（約18 時間）。この方法を用いて必ずしも全てのクローンがうまく発現されなかった。 いくつかのクローンはテリフィック・ブロス（12g/Lディフコトリプトン、24g/L バクト酵母、0.4％グリセロール、0.17M KH₂PO₄および0.72K₂HPO₄）で増殖させ るか、および／またはIPTG誘導後37℃で増殖させ、および／または一晩より早く 回収した（表２）。 表２：ハーピン切断タンパク質の発現一般的な発現法：hrpNサブクローンを含む大脳菌BL21（DE3）株を、カナマイシ ン 30μg/mlを含むルリア・ブロス培地（５g/Lディフコ酵母抽出物、10g/Lディフコ トリプトン、５g/L NaCl、および１mM NaOH）で37℃で一晩増殖させた。次に細 菌を同じ培地の100倍容量に接種して37℃でOD₆₂₀が0.6〜0.8となるまで増殖させ た。次に細菌を増殖培地の250倍容量に接種して、37℃で特異的誘導OD₆₂₀となる まで増殖させた。次にIPTG１ミリモルを加えて、培養をタンパク質発現のための 至適温度で増殖させ、タンパク質が最高レベル回収される特定の時間に回収した 。実施例18 −ハーピン切断タンパク質の小規模精製（発現の確認） hrpNクローンの50ml培養を上記のように増殖させて、切断されたタンパク質の 発現を誘導した。培養の回収時に、細胞懸濁液1.5mlを14,000rpmで５分間遠心し 、尿素溶解緩衝液（８M尿素、0.1M Na₂HPO₄、および0.01Mトリス、pH8.0）に再 懸濁して、室温で10分間インキユベートし、14,000rpmで10分間再度遠心し、上 清を回収した。平衡にした（His）₆-結合ニッケルアガロース樹脂50％スラリー の50μlアリコットを上清に加えて４℃で１時間混合した。次に、ニッケルアガ ロースを尿素洗浄緩衝液（８M尿素、0.1M Na₂HPO₄、および0.01Mトリス、pH6.3 ）で３回洗浄し、洗浄毎に5,000rpmで５分間遠心した。タンパク質を尿素溶出緩 衝液（８M尿素、0.1M Na₂HPO₄、0.01Mトリス、および0.1M EDTA、pH6.3）50μl によって樹脂から溶出させた。溶出液は、発現を確認するために切断されたタン パク質の大きさに応じて４〜20％、16％、10〜20％トリス・グリシン既成型ゲル 上で流した。実施例19 −タバコにおけるHRの誘導 切断されたタンパク質の小規模精製のために増殖させた50ml培養からの1.5ml アリコットを14,000rpmで４分間遠心し、５mM燐酸カリウム緩衝液pH6.8の等量に 再懸濁した。細胞懸濁液を約30秒間超音波処理して燐酸緩衝液で２倍希釈および 10倍希釈した。両希釈プラス適切な細胞溶解物を、１枚の葉に穴を開け、針をつ けないシリンジを用いて葉の細胞間間隙に細菌溶解液を浸潤させることによって 10〜15葉のタバコ植物の第４〜第９葉に浸潤させた。HR反応は浸潤後24〜48時間 に記録した。タバコ（ニコチアナ・タバキュム種ザンチ（Nicotiana tabacumv． Xanthi））実生を12時間照明／12時間消灯の照明サイクルおよび約40％相対湿度 の環境チャンバー中で20〜25℃で生長させた。小規模尿素精製では、精製プロ セスのためにタンパク質が変性してほとんどタンパク質を生じないため、細胞溶 解液を初回HRアッセイに用いた（HR活性に関して切断されたタンパク質をスクリ ーニングするため）。実施例20 −総合生物活性アッセイのためのハーピン切断タンパク質の大規模未変 性精製 HrpNクローンの500ml培養６本を先に記述したように増殖させて切断されたタ ンパク質の発現を誘導した。培養を回収した後、細胞を7,000rpmで５分間遠心し 、イミダゾール溶解緩衝液（５mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mMトリス）にト ライトンX-100を0.05％の濃度で、およびライソゾームを0.1mg/mlを加えた溶液 に再懸濁して30℃で15分インキュベートして、２分間超音波処理し、再度15,000 rpmで20分間遠心し、上清を回収した。平衡した（His）₆-結合ニッケルアガロー ス樹脂の50％スラリーの４mlアリコットを上清に加えて４℃で約４時間混合した 。ニッケルアガロースをイミダゾール洗浄緩衝液（20mMイミダゾール、0.5M NaC l、および20mMトリス）で３回洗浄して、洗浄毎に5,000rpmで５分間遠心し、使 い捨てのクロマトグラフィーカラムに載せた。カラムを1100rpmで１分間遠心し て、残っている洗浄緩衝液を除去し、室温でカラムを溶出緩衝液と共に10分間イ ンキュベートし、その後カラムを1100rpmで１分間遠心することによって、タン パク質をイミダゾール溶出緩衝液（１Mイミダゾール、0.5M NaCl、および20mMト リス）４mlで樹脂から溶出させた。溶出液は、発現を確認するために切断された タンパク質の大きさに応じて４〜20％、16％、10〜20％トリス・グリシン既成型 ゲル上で流した。タンパク質の濃度は、タンパク質のバンドをマーク12分子量マ ーカーにおける標準タンパク質と比較することによって決定した。実施例21 −総合生物活性アッセイのためのハーピン切断タンパク質の大規模尿素 精製 技法は尿素溶解緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液を用いたこと、ならび に細胞を未変性の精製の場合のように超音波処理しなかったことを除いては大規 模未変性精製と同じであった。精製後、タンパク質を低濃度の尿素に対して８時 間以上透析し、次に10mMトリス／20mM NaClに対して一晩透析することによって 変性させた。変性過程はN末端タンパク質を沈殿させた。沈殿した１〜168タンパ ク質は100mMトリス塩酸、pH10.4を加えることによって可溶化し、その後タンパ ク質を30℃で約１時間加熱した。タンパク質の濃度はタンパク質のバンドを、マ ーク12分子量マーカーにおける標準タンパク質と比較することによって決定した 。１〜75および１〜104タンパク質断片は、この方法を用いてうまく可溶化する ことができなかったため、それらは100mMトリス塩酸、pH10.4中で超音波処理し てできる限り多くのタンパク質を可溶化し、生物活性アッセイに関するタンパク 質の活性部位を露出した。実施例22 −ハーピン切断タンパク質の発現 断片タンパク質の小規模発現および精製は発現およびHR活性をスクリーニング するために行った（表３）。 表３ ハーピン切断タンパク質の発現およびHR活性（小規模スクリーニング） クローニングした断片タンパク質は全て、小さい断片３個を除いてある程度発 現された（アミノ酸169〜209、150〜209、および150〜180）。断片は多様なレベ ルで発現された。断片210〜403および267〜403は非常に多く発現され、小規模精 製から高濃度のタンパク質が得られ、その結果SDSゲル電気泳動上で実質的なタ ンパク質のバンドを生じた。他の断片（アミノ酸1〜168および1〜104）はタンパ ク質の産生量はこれよりはるかに少なく、電気泳動ではかすかなタンパク質バン ドを生じた。疑われる343〜403タンパク質の他にいくつかのバックグラウンドタ ンパク質がゲルに存在したため、最少のC末端タンパク質である断片343〜403が 発現されたか否かを明らかにすることは難しかった。それぞれ全長のハーピンタ ンパク質およびバックグラウンドタンパク質のみを含む陽性対照および陰性対照 タンパク質についても、発現およびHR活性に関して調べた。 断片タンパク質の大規模発現および精製は発現レベルおよびHR活性の力価を決 定するために行った（表４）。 表４ ハーピン切断タンパク質の発現レベルおよびHR力価（大規模精製） 時間的制約から必ずしも全てのタンパク質が大規模で発現されなかった。ハーピ ンを特徴付けする上で最も重要であるように思われた切断タンパク質を選択した 。陽性対照（全長のハーピン）は比較的高レベルで3.7mg/mlで発現された。先に 述べた断片343〜403を除いて、C末端タンパク質は全て２〜５mg/mlから比較的高 レベルで発現された。N末端断片も非常によく発現されたが、精製プロセスにお いてタンパク質は沈殿し、ほとんど再可溶化されなかった。表３における濃度は 可溶化されたタンパク質のみを反映する。内部断片は２〜3.6mg/mlの範囲で発現 された。SDSゲル上のタンパク質バンドは大きかったものの染色が不良であった ために、断片105〜168の濃度を決定することは極めて難しかった（濃度は示され たよりはるかに高いことが疑われた）。陰性対照タンパク質はいくつかのバック グラウンドタンパク質を予想通り含んだが、明らかに誘導された優勢なタンパク 質を認めなかった。実施例23 −タバコにおけるHRの誘導 全長の陽性対照タンパク質はHRを５〜７μg/mlまで誘発した。陰性対照（pET2 8）イミダゾール精製タンパク質は、バックグラウンドタンパク質のみを含むが 、HR反応を２倍希釈まで誘発し、このために１倍希釈および２倍希釈を用いるこ とができないためにアッセイの感度は低下した。この偽HRは、精製プロセスにお いて用いられたイミダゾールのバックグラウンドタンパク質の１つまたはいくつ かに対する結合親和性が原因で、その後完全に透析することができなかった可能 性がある。 アミノ酸137〜180（配列番号23）、単なるアミノ酸44個からのタンパク質の小 さい内部領域を含む１つの明確なドメインを最小のHRとして同定する。その他の 考えられるHRドメインはタンパク質のアミノ酸１〜104（おそらくアミノ酸１〜 ７5）（配列番号：23）に存在すると思われる。これらの断片タンパク質を精製 することが難しいためにＮ末端のHRドメインを確認、または範囲を狭めることは 難しかった。未変性の精製プロセスを用いた場合にはタンパク質は回収されなか ったために、N末端断片タンパク質は尿素によって精製しなければならなかった 。その結果、これらのタンパク質は変性過程で沈殿し、溶液に戻すことが困難ま たはほとんど不可能となり、それによって可溶性タンパク質のみがHRを誘発する ことができるため、HRアッセイを通じて蛋白を流すことが難しくなった。N末端 のHRドメインを狭めることの困難さは、陰性対照が低希釈度において偽HRを誘発 し、それに よってアッセイの感度を低下させるという事実によってさらに悪化した。 内部ドメインタンパク質は、陽性対照と同じようにタンパク質の５〜10μg/ml の間でHR反応を誘発し、N末端ドメインタンパク質は陽性対照より低く１〜３μg /mlの間でHR反応を誘発した。 意外にも、内部HRドメインをアミノ酸168位と169位の間（断片76〜168および1 05〜168）（配列番号：23）開裂させると、断片はそのHR活性を消失した。この ことは断片１〜168（配列番号：23）のHR活性が内部HRドメインに起因せず、他 のドメインに起因することを示唆し、タンパク質のN末端領域に第二のHRドメイ ンが存在する可能性があると椎測される。しかし、最初に検討したように、この 推測を確認することは難しかった。 ハーピンC末端（アミノ酸210〜403）（配列番号：23）はHRドメインを含まな かった。これは現行のHRアッセイを用いて検出可能なレベルのHRを誘発しなかっ た。アミノ酸169〜403位（配列番号：23）の大きいC末端断片でも、これが内部 皿ドメインを含むにもかかわらずHRを誘発しなかった。先に述べたように、アミ ノ酸168位と169位（配列番号：23）の間のタンパク質はHR活性を消失した。 クローニングされたアミノ酸61個以下の小さいタンパク質のいくつかは発現さ れなかったため、アミノ酸30個のいくつかのオリゴペプチドを合成して内部HRド メインの機能的領域を狭めた。オリゴペプチドはアミノ酸121〜179位（配列番号 ：23）の範囲内で合成した。しかし、これらのオリゴはHR反応を誘発しなかった 。オリゴ137〜166、121〜150、および137〜156（配列番号：23）は必須の168お よび169位アミノ酸（配列番号：23）を含んでいなかったため、これらの断片か らHR反応があるとは予想されなかった。オリゴ150〜179（配列番号：23）はHR反 応を誘発すると予想された。アミノ酸30個は、折り畳み構造の欠如のためタンパ ク質が何らかの活性を誘発するためには小さすぎ、したがって、結合の欠如また はペプチド合成の際に重要なアミノ酸が欠損した可能性があり（プロセスにおい て、または単にどのアミノ酸30個を合成するかという選択によって）、したがっ て断片はHRを誘発することができないのであろう。同様に、可能性は低いが、こ れらの小さいタンパク質は、大腸菌細胞内において合成されたときには含まない ような何らかの形の翻訳後修飾を受けて、したがってHR反応を誘発することがで きな いということもあり得る。実施例24 −HR誘導断片の生物活性 配列番号：24の核酸のヌクレオチド１〜104およびヌクレオチド１〜168に及ぶ ２つのN末端ハーピン断片は、全長のハーピンタンパク質と同様に、TMVに対する タバコの耐性の誘導に有効であった。配列番号：24の核酸のヌクレオチド76〜20 9およびヌクレオチド105〜209に及ぶ内部断片もまた、TMV耐性を誘導するために 有効であった。さらに、これらの同じ４つの断片は植物の生長増強（「PGE」） をトマトに与え、植物の高さは緩衝液対照植物より４〜19％高くなった。全長の ハーピンタンパク質は緩衝液より６％大きい生長増強を誘導した。陰性対照はTM V耐性または生長増強を誘導しなかった。 表５ ハーピンに由来するHR誘導断片のTMV耐性およびPGE活性 本発明は、説明を目的として詳細に記述してきたが、それらの内容は説明目的 のために記載されているのであって、当業者は本発明に改変を行ってもよく、そ れらも以下の請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると理解される 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 レビー ロナルド ジェイ. アメリカ合衆国 テキサス州 ヒュースト ン ハドン ストリート 1411 (72)発明者 ウェイ ソン−ミン アメリカ合衆国 ワシントン州 カークラ ンド 125ス コート 8230 (72)発明者 ビア スティーブン ブイ. アメリカ合衆国 ニューヨーク州 イサカ ハドソン ストリート 211

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物において過敏感反応を誘発する、エルウィニア（Erwinia）過敏感反応 誘発タンパク質またはポリペプチドの単離断片。 ２．過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドがエルウィニア・アミロボー ラ（Erwinia amylovora）、エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora ）、エルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）、またはエルウィニ ア・ステワーチイ（Erwinia stewartii）に由来する、請求項１記載の単離され た断片。 ３．過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドがエルウィニア・アミロボー ラに由来する請求項２記載の単離断片。 ４．配列番号：23のアミノ酸配列のC末端断片、配列番号：23のアミノ酸配列のN 末端断片、および配列番号：23のアミノ酸配列の内部断片からなる群より選択さ れる、請求項３記載の単離断片。 ５．配列番号：23のアミノ酸105〜403位に及ぶ配列番号：23のアミノ酸配列のC 末端断片である、請求項４記載の単離断片。 ６．配列番号：23の以下のアミノ酸；１〜98、１〜104、１〜122、１〜168、１ 〜218、１〜266、１〜342、１〜321、および１〜372に及ぶ配列番号：23のアミ ノ酸配列のN末端断片である、請求項４記載の単離断片。 ７．配列番号：23の以下のアミノ酸；76〜209、105〜209、99〜209、137〜204、 137〜200、109〜204、109〜200、137〜180、および105〜180に及ぶ配列番号:23 のアミノ酸配列の内部断片である、請求項４記載の単離断片。 ８．請求項１記載の断片をコードする単離DNA分子。 ９．過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドがエルウィニア・アミロボー ラ（Erwinia amylovora）、エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora ）、エルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）、またはエルウィニ ア・ステワーチイ（Erwinia stewartii）に由来する、請求項８記載の単離DNA分 子。 10．過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドがエルウィニア・アミロボー ラに由来する、請求項９記載の単離DNA分子。 11．断片が配列番号：23のアミノ酸配列のC末端断片、配列番号:23のアミノ酸配 列のN末端断片、および配列番号：23のアミノ酸配列の内部断片からなる群より 選択される、請求項10記載の単離DNA分子。 12．断片が配列番号：23のアミノ酸105〜403位に及ぶ配列番号：23のアミノ酸配 列のC末端断片である、請求項10記載の単離DNA分子。 13．断片が、配列番号：23の以下のアミノ酸；１〜98、１〜104、１〜122、１〜 168、１〜218、１〜266、１〜342、１〜321、および１〜372に及ぶ配列番号:23 のアミノ酸配列のＮ末端断片である、請求項10記載の単離DNA分子。 14．断片が、配列番号：23の以下のアミノ酸；76〜209、105〜209、99〜209、13 7〜204、137〜200、109〜204、109〜200、137〜180、および105〜180に及ぶ配列 番号：23のアミノ酸配列の内部断片である、請求項10記載の単離DNA分子。 15．請求項８記載のDNA分子によって形質転換された発現系。 16．DNA分子が適切なセンス方向および正しい読みとり枠にある、請求項15記載 の発現系。 17．請求項８記載のDNA分子で形質転換された宿主細胞。 18．宿主細胞が植物細胞および細菌細胞からなる群より選択される、請求項17記 載の宿主細胞。 19．DNA分子が発現系によって形質転換されている、請求項17記載の宿主細胞。 20．請求項８記載のDNA分子で形質転換されたトランスジェニック植物。 21．植物が、アルファルファ、コメ、コムギ、大麦、ライ麦、ワタ、ヒマワリ、 ピーナッツ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、インゲン、エンドウ、チ コリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、芽キャベツ、ビート、アメリカボウフウ 、カブラ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレンソウ、タマネ ギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリー、ニンジン、カボチャ（squash）、カ ボチャ（pumpkin）、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、洋なし、メロン、柑橘類 、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、パイナップル、大豆、タバコ、トマト、モロコ シ、およびサトウキビからなる群より選択される、請求項20記載のトランスジェ ニック植物。 22．植物がシロイヌナズナ（Arabidopsis thaijana）、セントポーリア、ペチュ ニア、ぺラゴルニューム、ポインセチア、クリサンセマム、カーネーションおよ びジニアからなる群より選択される、請求項20記載のトランスジェニック植物。 23．請求項８記載のDNA分子によって形質転換されたトランスジェニック植物種 子。 24．植物の種子が、アルファルファ、コメ、コムギ、大麦、ライ麦、ワタ、ヒマ ワリ、ピーナッツ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、インゲン、エンド ウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、芽キャベツ、ビート、アメリカボ ウフウ、カブラ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレンソウ、 タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリー、ニンジン、カボチャ（squash ）、カボチャ（pumpkin）、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、梨、メロン、柑橘 類、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、パイナップル、大豆、タバコ、トマト、モロ コシ、およびサトウキビからなる群より選択される、請求項23記載のトランスジ ェニック植物種子。 25．植物の種子がシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、セントポーリア、 ペチュニア、ペラゴルニューム、ポインセチア、クリサンセマム、カーネーショ ンおよびジニアからなる群より選択される、請求項23記載のトランスジェニック 植物種子。 26．断片が病気への抵抗性を付与する条件下で植物もしくは植物種子に非感染型 として過敏感反応を誘発する、過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドの 断片を適用する段階を含む、植物に病気への抵抗性を付与する方法。 27．適用する際に植物を処置する、請求項26記載の方法。 28．適用の際に植物種子を処置する請求項26記載の方法であって、 天然または人工土壌に過敏感反応誘発物質の断片で処置された種子を播種する 段階と、 土壌に播種した種子から植物を繁殖させる段階とをさらに含む方法。 29．断片が植物の生長を促進するために有効な条件下で植物もしくは植物種子に 非感染型として過敏感反応を誘発する、過敏感反応誘発タンパク質またはポリペ プチドの断片を適用する段階を含む、植物の生長を促進する方法。 30．適用する際に植物を処置する、請求項29記載の方法。 31．適用の際の植物種子を処置する請求項29記載の方法であって、 天然または人工土壌に過敏感反応誘発物質の断片で処置された種子を播種する 段階と、 土壌に播種した種子から植物を繁殖させる段階とをさらに含む方法。 32．断片が昆虫を制御するために有効な条件下で植物もしくは植物種子に非感染 型として過敏感反応を誘発する、過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチド の断片を適用する段階を含む、植物のための昆虫制御方法。 33．適用する際に植物を処置する、請求項32記載の方法。 34．適用の際の植物種子を処置する請求項32記載の方法であって、 天然または人工土壌に過敏感反応誘発物質の断片で処置された種子を播種する 段階と、 土壌に播種した種子から植物を繁殖させる段階とをさらに含む方法。 35．過敏感反応を誘発する過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドの断片 をコードするDNA分子によって形質転換されたトランスジェニック植物または植 物種子を提供する段階と、 病気への抵抗性を付与するために有効な条件下で、トランスジェニック植物ま たはトランスジェニック植物種子から産生されたトランスジェニック植物を生長 させる段階とを含む、植物に病気への抵抗性を付与する方法。 36．トランスジェニック植物が提供される、請求項35記載の方法。 37．トランスジェニック植物種子が提供される、請求項35記載の方法。 38．過敏感反応を誘発する過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドの断片 をコードするDNA分子によって形質転換されたトランスジェニック植物または植 物種子を提供する段階と、 植物の生長を促進するために有効な条件下で、トランスジェニック植物または トランスジェニック植物種子から産生されたトランスジェニック植物を生長させ る段階とを含む、植物の生長を促進する方法。 39．トランスジェニック植物が提供される、請求項38記載の方法。 40．トランスジェニック植物種子が提供される、請求項38記載の方法。 41．過敏感反応を誘発する過敏感反応誘発タンパク質またはポリペプチドの断片 をコードするDNA分子によって形質転換されたトランスジェニック植物または植 物種子を提供する段階、および 昆虫を制御するために有効な条件下で、トランスジェニック植物またはトラン スジェニック植物種子から産生されたトランスジェニック植物を生長させる段階 とを含む、植物のための昆虫制御方法。 42．トランスジェニック植物が提供される、請求項41記載の方法。 43．トランスジェニック植物種子が提供される、請求項41記載の方法。