JP2001112490A - 虫害抵抗性植物 - Google Patents

虫害抵抗性植物

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JP2001112490A JP2000272128A JP2000272128A JP2001112490A JP 2001112490 A JP2001112490 A JP 2001112490A JP 2000272128 A JP2000272128 A JP 2000272128A JP 2000272128 A JP2000272128 A JP 2000272128A JP 2001112490 A JP2001112490 A JP 2001112490A
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アレン フィスクホフ デビッド
Roy L Fuchs
リー フックス ロイ
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ブルノ ラブリック ポール
Sylvia A Mcpherson
アン マックファーソン シルビア
Frederick J Perlak
ジョセフ パーラック フレデリック
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 甲虫類に対して毒性を発揮する遺伝子工学的
に形質転換された植物及びその製造法を提供する。 【解決手段】 Bacillus thuringiensisの甲虫類毒素蛋
白をコードするＲＮＡ配列の産生を誘導するＤＮＡ配列
を含むキメラ遺伝子を用いて植物細胞を形質転換し、該
形質転換植物細胞から形質転換された植物を再生する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学、生化
学及び植物形質転換の分野に関する。更に詳細には、本
発明は、甲虫類（Coleoptera）に対して毒性を示す蛋白
をコードするキメラ遺伝子を発現するための植物細胞形
質転換に関する。
【０００２】
【従来の技術】Bacillus thuringiensis ( B.t.) は胞
子形成土壌細菌であって、各種の昆虫に対して毒性を示
すパラ胞子結晶蛋白を産生することが知られている。ほ
とんどの株は、鱗翅類（ガ、チョウなど）に対して活性
を示すが、双翅類（カ、ハエなど）に対しては、わずか
の株しか活性を示さないことが報告されている（Aronso
nら、1986）。これら各種の株から毒素遺伝子がクロー
ン化され、また異種宿主において毒素が発現されている
（Schnepfら、1981；Klierら、1982）。
【０００３】最近、B.t. var. tenebrionis ( B.t.t.)
及びB.t. var. san diego ( B.t.sd.) 株が、甲虫類に
対して毒性を示すものとして同定されている（Krieg
ら、1983；Kriegら、1984；Herrnstadtら、1986）。B.
t.sd.から毒素蛋白遺伝子がクローン化されているが、
この遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現せしめて産生される毒
素は、Ｂ．ｔ．ｓｄ．の毒素よりそのサイズが大きいこ
とが報告されており、この組換えＢ．ｔ．ｓｄ．毒素の
活性は弱いものと考えられる。
【０００４】Bacillus thuringiensisの毒素蛋白に対し
て感受性の昆虫としては、コロラドポテト甲虫（Leptin
otarsa decemlineata）、メキシコワタノミゾウムシ（A
nthonomus grandis）、イエローゴミムシダマシ（Teneb
rio molitor）、ニレ葉甲虫（Pyrrhalta luteola）、サ
ウザンコーン根虫（Diabrotica undecimpunctata howar
di）などがあるがこれらに限定されない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】植物が形質転換されて
殺虫効果を示すレベルで甲虫類毒素を発現することがで
きれば、甲虫類に対して毒性あるいは耐性を示す遺伝子
工学植物が得られる可能性がある。
【０００６】甲虫類によって影響を受ける農業的に重要
な作物としては、アルファルファ、ワタ、トウモロコ
シ、ポテト、アブラナ（canola）、米、タバコ、トマ
ト、シュガービート、サンフラワーなどがある。
【０００７】ある種のキメラ遺伝子が形質転換植物細胞
及び植物において発現されてはいるが、これらの発現は
直接的なものではない。例えば、鱗翅類Ｂ．ｔ．毒素蛋
白の発現例は特に問題のあるものである。鱗翅類Ｂ．
ｔ．毒素蛋白を植物において発現せしめる際に用いられ
た技術をそのまま甲虫類Ｂ．ｔ．毒素蛋白の発現に適用
できないことが見出されている。かかる知見は、形質転
換植物においてこのような毒素を発現せしめるためには
同様の遺伝子増幅技術を用いればよいとする従来の考え
方とは相反するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の１つの局面によ
れば、甲虫類に対して毒性を発揮する遺伝子工学的に形
質転換された植物の製造法であって； （ａ） 甲虫類の攻撃に対して感受性の植物細胞のゲノ
ムに、（ｉ） 植物細胞においてＲＮＡの産生を誘導す
るプロモーター、（ii） Bacillus thuringiensisの甲
虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生を誘導する
ＤＮＡ配列、及び（iii） 植物細胞において、ＲＮＡ配
列の３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドの付加を誘
導する３′非翻訳ＤＮＡ配列、を含むキメラ遺伝子を挿
入し； （ｂ） 形質転換植物細胞を得；次いで （ｃ） 該形質転換植物細胞から、甲虫類に対して抵抗
性を示す遺伝子工学的に形質転換された植物を再生す
る；工程を含む上記製造法が提供される。
【０００９】本発明の他の局面によれば、キメラ植物遺
伝子であって、（ａ） 植物細胞においてＲＮＡの産生
を誘導する機能を有するプロモーター、（ｂ） Bacill
us thuringiensisの甲虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ
配列の産生を誘導するＤＮＡ配列、及び（ｃ） 植物細
胞において、ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニル化ヌ
クレオチドの付加を誘導する３′非翻訳ＤＮＡ配列、を
含むキメラ植物遺伝子が提供される。
【００１０】本発明の更に他の局面によれば、上記した
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の要素をそれぞれ含むＤＮＡ
を有する、バクテリア細胞、形質転換植物細胞及び植物
形質転換ベクターが提供される。
【００１１】本発明の更に他の局面によれば、甲虫類に
対して毒性を発揮する上記した如き形質転換植物細胞を
含む変異植物が提供される。
【００１２】本発明の更に他の局面によれば、上記した
形質転換植物を産生する種子が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明は、植物が甲虫類に対して
毒性を発揮するように植物を形質転換する方法を提供す
るものである。更に詳細には本発明は、Bacillus thuri
ngiensisの甲虫類毒素蛋白を殺虫効果を示すレベルで発
現するトランスジェニック植物を提供するものである。
【００１４】本発明の一つの局面によれば、植物におい
て機能し、感受性甲虫類に対して毒性を発揮するトラン
スジェニック植物を産生するキメラ遺伝子が提供され
る。２本鎖ＤＮＡとして存在する植物遺伝子の発現に
は、ＲＮＡポリメラーゼによって１本鎖のＤＮＡが転写
されてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が産生する工
程、及びｍＲＮＡ転写１次産物の核内でのプロセッシン
グ工程が含まれる。このプロセッシング工程には、ｍＲ
ＮＡの３′末端へポリアデニル化ヌクレオチドを付加せ
しめる３′非翻訳領域も関係している。
【００１５】ＤＮＡが転写されてｍＲＮＡが産生される
工程は、通常プロモーターと言われているＤＮＡ領域に
よって調節されている。このプロモーター領域には、Ｒ
ＮＡポリメラーゼに信号を送ってＤＮＡに結合せしめ、
プロモーターの下流のＤＮＡを鋳型として用いてｍＲＮ
Ａの転写を開始せしめ対応するＲＮＡ鎖を産生せしめる
ヌクレオチド領域が含まれている。
【００１６】植物細胞において作用する多くのプロモー
ターが文献に記載されている。これらのプロモーターと
しては、Agrobacterium tumefacieneの腫瘍誘導プラス
ミドにおいて使用されているノパリンシンターゼ（ＮＯ
Ｓ）プロモーター、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プ
ロモーター及びマンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）プロモ
ーター；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１
９Ｓプロモーター及びＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；あ
るいはリボースビスホスフェートカルボキシラーゼ（ｓ
ｓＲＵＢＩＳＣＯ、非常に豊富に存在する植物ポリペプ
チド）の小さなサブユニットから得た光誘導性プロモー
ターなどがある。これらのプロモーターは、植物におい
て発現する各種のＤＮＡ構築物を創製するために使用さ
れている（ＰＣＴ出願ＷＯ 84／02913 （Rogersら、Mon
santo））。
【００１７】植物細胞においてｍＲＮＡ転写物の産生を
誘導することが見出されているあるいは知られているプ
ロモーターを、本発明では使用することができる。適当
なプロモーターは、植物で発現される天然の遺伝子から
誘導したプロモーター、及び長いあるいは異種のエンハ
ンサー領域を含んでいてもよい合成プロモーターであ
る。プロモーターは、十分な量の毒素蛋白が産生されて
植物が甲虫類に対して毒性を示すように、遺伝子の発現
を十分に誘導できるものでなければならない。目的とす
る毒性を示すに必要な毒素蛋白の量は、対象とする甲虫
類によって変動することは、当業者には容易に理解され
よう。従って、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ｓｓＲＵ
ＢＩＳＣＯプロモーター、ＭＡＳプロモーターが好まし
いものであるが、これらのプロモーターが本発明の全て
の態様において必ずしも最適ではない。
【００１８】キメラ遺伝子によって産生されるｍＲＮＡ
には、５′非翻訳リーダー配列が含まれる。この配列
は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ
プロモーター、ＭＡＳプロモーターなどの個々のプロモ
ーターから誘導されたものでもよい。５′非翻訳領域
は、他の適当な真核細胞の遺伝子または合成遺伝子から
得られるものでもよい。５′非翻訳領域の必要な機能
は、ｍＲＮＡ転写物が植物細胞のリボソームへ結合する
のを促して、ｍＲＮＡの翻訳を促進することである。
【００１９】キメラ遺伝子には、Bacillus thuringiens
isの甲虫類毒素蛋白をコードする構造コード配列あるい
はその活性断片が含まれる。この構造コード配列は、例
えばB.t.tenebronis、B.t.san diegoなどから得られ
る。従って、本発明の１つの態様においては、Bacillus
thuringiensis var. tenebrionisから得られる構造コ
ード配列及びその活性断片が提供される。また、Ｂ．
ｔ．ｔ．の毒素コード配列と実質的に相同の他の構造コ
ード配列も、本明細書に記載した技術的事項に従って使
用することができ、従ってこれらも本発明の範囲内であ
ることは、当業者に容易に理解されよう。
【００２０】３′非翻訳領域には、ＲＮＡの３′末端に
ポリアデニル化ヌクレオチドの付加を誘導するために機
能しているポリアデニレーションシグナルが含まれる。
適当な３′領域としては、例えば、(1) Agrobacterium
の腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニレー
ションシグナルを含む、ノパリンシンターゼ（NOＳ）遺
伝子などの３′転写非翻訳領域、(2) 大豆貯蔵蛋白遺伝
子、ｓｓＲＵＢＳＩＣＯなどの植物遺伝子、などが挙げ
られる。３′領域の好ましい例としては、実施例におい
て詳述する如き、ＮＯＳ、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ、貯蔵蛋
白遺伝子から得られる領域が挙げられる。
【００２１】本発明の甲虫類毒素蛋白遺伝子は、適当な
方法によって、植物のゲノムに挿入される。適当な植物
形質転換ベクターとしては、ＥＰＯ公開公報No.１３
１，６２０（Rogersら）、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅ
ｌｌａ １９８３、Ｂｅｖａｎ１９８３、Ｋｌｅｅ １
９８５、ＥＰＯ公開公報No.１２０，５１６（Schilpero
ortら）などに記載された如き、Agrobacterium tumefac
iensのＴｉプラスミドから誘導されたベクターが挙げら
れる。AgrobacteriumのＴｉプラスミドあるいは根誘導
（Ｒｉ）プラスミドから得られる植物形質転換ベクター
に加えて、本発明の甲虫類毒素蛋白遺伝子を植物細胞へ
導入するために、他の方法を用いることもできる。この
ような方法としては、例えばリポソーム、エレクトロポ
レーション、あるいはフリーＤＮＡの取り込みを増進す
る化学物質を使用する方法、またはベクターとしてウイ
ルスもしくは花粉を使用する方法などがある。また必要
により、形質転換及び形質転換体の選択を繰り返す方法
により、２個以上の遺伝子を植物のクロモゾームに導入
してもよい。
【００２２】かくして得られる修正された植物は、例え
ばノーザンブロッティング法により、甲虫類毒素蛋白ｍ
ＲＮＡの存在について分析することができる。毒素蛋白
ｍＲＮＡが検出されない、あるいはその力価が低すぎる
場合には、キメラ遺伝子の構築に用いたプロモーターを
他のより強力なプロモーターに代えて新たな構築物を
得、これを再分析する。
【００２３】他の方法として、ウェスタンブロッティン
グ法などの免疫分析法により、毒素蛋白のレベルを分析
してもよい。多くの場合、最も感度の高い毒素蛋白分析
法は、昆虫を用いたバイオアッセイである。
【００２４】このバイオアッセイにおけるモニタリング
は、再生された植物全体で行なうことができる。いかな
る場合においても、毒素蛋白ｍＲＮＡの産生が十分に行
なわれ、形質転換細胞またはプロトプラストが再生され
て植物となった時には、植物について甲虫類に対する抵
抗性をスクリーニングすることができる。植物の再生工
程は臨界的なものではなく、次の如き植物から得られる
宿主に適用できるプロトコールであればよい。即ち、例
えばＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ（アルファルファ、大豆、
クローバーなど）、Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ（ニンジ
ン、セロリ、ボウフウなど）、Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ
（キャベツ、ラディシュ、ナタネ種子など）、Ｃｕｃｕ
ｒｂｉｔａｃｅａｅ（メロン、キウリなど）、Ｇｒａｍ
ｉｎｅａｅ（コムギ、米、コーンなど）、Ｓｏｌａｎａ
ｃｅａｅ（ポテト、タバコ、トマト、ペッパーなど）、
Ｍａｌｖａｃｅａｅ（ワタなど）、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉ
ａｃｅａｅ（サトウダイコンなど）、及び各種の作物な
どである（Ａｍｍｉｒａｔｏら、１９８４参照）。
【００２５】本明細書及び特許請求の範囲において記載
されている全ての蛋白構造は、慣用法によって示されて
おり、Ｎ末端のアミノ基は左側、Ｃ末端のカルボキシル
基は右側に示されている。同様に蛋白のアミノ酸の命名
は次の通りである。
【００２６】アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン
（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アル
ギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グ
ルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；
Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；
Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅ
ｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅ
ｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン
（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン
（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロ
シン（Ｔｙｒ；Ｙ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
【００２７】
【実施例】Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子の単離 甲虫類毒素蛋白をコードするＢ．ｔ．ｔ．遺伝子を以下
の如くにして単離した。
【００２８】蛋白結晶の単離 蛋白結晶を単離するため、B.t. tenebrionisをトリプテ
ィケース・ソイブロース（ＴＳＢ）培地で生育せしめ
た。Ｂ．ｔ．ｔ．からインタクトの結晶を単離するに際
しては、この結晶と鱗翅類型の結晶との相違に注意して
行なった。鱗翅類型の結晶は、レノグラフィン（Ｒｅｎ
ｏｇｒａｆｉｎ）、ハイパーク（Ｈｙｐａｑｕｅ）ある
いはＮａＢｒから調製したグラジエントで単離できる
が、Ｂ．ｔ．ｔ．結晶はこれらのグラジエントに溶解す
ることが判った。Ｂ．ｔ．ｔ．結晶はシュクロースのグ
ラジエント中で安定であることが判った。従って、Ｂ．
ｔ．ｔ．結晶単離のためにシュクロースグラジエントを
使用した。
【００２９】結晶からＢ．ｔ．ｔ．毒素の単離 精製した結晶について、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動によりその蛋白組成を分析した。この実験結果
から、Ｂ．ｔ．ｔ．結晶は分子量が約６８−７０キロダ
ルトン（ｋＤａ）、約６０ｋＤａの２つの蛋白成分を少
なくとも含んでいることが判った。蛋白成分の相対量
は、実験によって変動した。また大きな分子量の蛋白成
分は、更に２以上の蛋白からなっていることが示唆され
た。Ｂ．ｔ．ｔ．結晶の蛋白成分として、約６８ｋＤａ
及び５０ｋＤａの蛋白が報告されている（Bernhard、19
86）。Ｂ．ｔ．ｓａｎ ｄｉｅｇｏの結晶は約６４ｋＤ
ａの蛋白から構成されていることが報告されている（He
rrnstadt、1986）。これに対し、Ｂ．ｔ．ｋｕｒｓｔａ
ｋｉなどの鱗翅類型Ｂ．ｔ．株には１３０ｋＤａ−１４
０ｋＤａの高分子量の蛋白が含まれている。これらの結
果から、鱗翅類毒素蛋白と甲虫類毒素蛋白とはその構造
が有意に相違していることが判る。
【００３０】結晶中の個々の蛋白成分を精製するために
いくつかのアプローチを実施した。等電点電気泳動法で
は、全ての蛋白が沈澱するため成功しなかった。モノ
（Ｍｏｎｏ）Ｑカラムを用いたアニオン交換高圧液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、蛋白成分を溶解す
ることができなかった。４Ｍ尿素の存在下でのＭｏｎｏ
Ｓカラムを用いたカチオン交換ＨＰＬＣでは、５つのピ
ークを溶解することができた。ＳＤＳゲル電気泳動によ
りピーク成分を分析したところ、ピークＡには高分子量
のバンドしか含まれていないことが判った。ピークＢに
は、低分子量のバンドが少し含まれているものの、この
高分子量のバンドが豊富に含まれていた。ピークＣには
高分子量のバンドとともに、低分子量のバンドが豊富に
含まれていた。ピークＥ及びＤは、両者のバンドの混合
物であった。ほとんどの調製法の場合において、ピーク
Ａ及びＢに対応する高分子量のバンドが結晶中の主要な
蛋白成分であった。ＨＰＬＣで分離したものについて
は、ピークＡとＢが、得られる蛋白のほとんどを代表し
ていた。
【００３１】ピークＡ、Ｂ及びＣに対応するＮ末端アミ
ノ酸配列を求めた。ピークＡとＢは同じＮ末端配列を有
し、ピークＣは異なる配列を有していることが判った。
得られた配列は以下の通りである。
【００３２】ピークＡ及びＢ：
【００３３】
【化１】
【００３４】ピークＣ：
【００３５】
【化２】
【００３６】Ｘは未決定アミノ酸を表す。
【００３７】Ｂ．ｔ．ｔ．蛋白の昆虫毒性 Ｂ．ｔ．ｔ．及びＢ．ｔ．ｔ．蛋白のいくつかの調製物
について、甲虫類、鱗翅類などの昆虫に対する毒性をテ
ストした。鱗翅類（オオタバコガの幼虫、ブラックヨト
ウムシ、タバコイモムシ幼虫、キャベツシャクトリム
シ）に対しては、何ら活性を示さなかった。甲虫類のな
かでも、コロラド（Ｃｏｌｏｒａｄ）ポテト甲虫（Lept
inotarsa decemlineata）、ワタミハナゾウムシ（Antho
nomus grandis）に対して活性を示した。サザンコーン
（Southern corn）根食い虫（Diabrotica undecimpunct
ata howardi）に対しては低い活性を示した。殺虫活性
は、バクテリア粗培養物においても見られ、また精製し
た結晶物、結晶を溶解したもの、及び単離したピーク
Ｃ、Ｄ、Ｅ（貯めたもの）、Ａ及びＢにおいても観察さ
れた。
【００３８】コロラドポテト甲虫に対する毒性の分析
は、テストすべき調製物をトマトの葉に適用し、次いで
該昆虫がこの葉を餌として食べるように４日間放置する
ことによって実施した。ワタミハナゾウムシ及びサザン
コーン根食い虫に対する毒性の分析は、テスト調製物を
適当な食物に混入することによって実施した。
【００３９】Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
でのＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子の同定及びクローニング Ｎ末端蛋白の配列から得られる情報に基づき、合成ＤＮ
Ａプローブ（図１）をデザインし、これを、Ｂ．ｔ．
ｔ．毒素遺伝子を含むクローンの単離に用いた。プロー
ブを、Ｍａｎｉａｔｉｓの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、１
９８２）により［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで末端ラベル化し
た。全ＤＮＡを単離するために、０．１％酵母抽出物及
び０．１％グルコース（ＳＰＹ）を添加したＳｐｉｚｉ
ｚｅｎ培地（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ、１９５８）で３７℃で
６時間、B. thuringiensis var. tenebrionisを生育せ
しめた。Ｋｒｏｎｓｔａｄの方法（Ｋｒｏｎｓｔａｄ、
１９８３）により、Ｂ．ｔ．ｔ．から全ＤＮＡを単離し
た。毒性を調べるのに使用するＢ．ｔ．ｔ．結晶物を単
離するため、Ｌｕｒｉａアガープレート上で細胞を生育
せしめた。
【００４０】プラスミドの選択及び維持のために加えた
アンピシリン（Ａｐ、２００μｇ／ｍｌ）、カナマイシ
ン（Ｋｍ、５０μｇ／ｍｌ）あるいはゲンタマイシン
（Ｇｍ、１５μｇ／ｍｌ）を含むＬｕｒｉａブロース
（ＬＢ）中で、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓを生育させた。
【００４１】ＤＮＡの単離及び増幅 ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙの方法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
とＤｏｌｙ、１９７９）により、Ｅ．ｃｏｌｉとＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓの細胞からプラスミドＤＮＡを抽出
し、ＮＡＣＳ−５２樹脂（Bethesda Research Laborato
ries）を用いてこの樹脂製造業者の指針に従って精製し
た。制限酵素、牛アルカリホスファターゼ及びＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを、製造業者（New England Biolabs）の指
針に従って使用した。Ｔｒｉｓ−アセテート緩衝液で
０．８％アガロースゲル上で電気泳動せしめて、制限酵
素で消化して得られる生成物を分析した。凍結融解法に
より、クローニング用のＤＮＡ断片をアガロースから精
製した。組換えＤＮＡ分子の構築は、Ｍａｎｉａｔｉｓ
らの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８２）に従って実施
した。
【００４２】Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子のクローニング 修正乾燥ゲル法（Ｃｏｎｎｅｒら、１９８３）により、
サザンブロッテイング法分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９
７５）を実施した。Ｂ．ｔ．ｔ．毒素クローンを検出す
るために、テトラメチルアンモニウムクロライド法（Ｗ
ｏｏｄら、１９８５）によりコロニーフィルターハイブ
リダイゼーションを行なった。
【００４３】Ｂ．ｔ．ｔ．全ＤＮＡのＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄIIIによる消化物をサザンブロッティング法によ
り分析したところ、合成Ａ１プローブにハイブリダイズ
する５．８ｋｂ ＢａｍＨＩ断片と３．０ｋｂ Ｈｉｎ
ｄIII断片が同定された。Ｂ．ｔ．ｔ． ＤＮＡのＢａ
ｍＨＩ断片（５．４−６．５ｋｂ）をアガロースゲルか
ら精製し、ＢａｍＨＩで消化しアルカリホスファターゼ
で処理したｐＵＣ１１９に連結した。ｐＵＣ１１９は、
バクテリオファージの４７６ｂｐ ＨｇｉＡＩ／Ｄｒａ
Ｉ断片を単離しＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（New England
Biolabs）で末端を平滑化することによって調製でき
る。次いでこの断片を、あらかじめＮｄｅＩで消化しク
レノーＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）で
充填したｐＵＣ１１９に挿入する。次いで連結された
Ｂ．ｔ．ｔ．とｐＵＣ１１９ＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌ
ｉ ＪＭ１０１細胞を形質転換する。何回かの試みの
後、Ａｐ抵抗性コロニーがわずかに１５０個得られた。
Ｂ．ｔ．ｔ．ＤＮＡのＨｉｎｄIII断片（２．８−３．
５ｋｂ）も、ｐＵＣ１１９のＨｉｎｄIII部位にクロー
ン化し、１１００個のコロニーを得た。全てのコロニー
について、Ａ１プローブ（図１）に対するコロニーハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニングを実施した。
１１個のＨｉｎｄIIIコロニーは強いハイブリダイゼー
ションを示したが、ＢａｍＨＩコロニーはいずれも何の
ハイブリダイゼーションも示さなかった。Ａ１プローブ
に対するハイブリダイゼーションにより同定されたコロ
ニーについて、更に合成したプローブＡ２（図１）を用
いてスクリーニングしたところ、２つのコロニーが第２
のプローブに対してハイブリダイゼーションを示した。
この２つのコロニーには同じ３．０ｋｂ ＨｉｎｄIII
断片が含まれており、そしてこれらは両者のコロニーに
おいて逆方向で含まれていることが判った。これらのコ
ロニーをｐＭＯＮ５４２０、ｐＭＯＮ５４２１（図３）
と命名した。Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋白の遺伝子をコロニー
が含んでいることを確認するために、プライマーとして
縮退プローブＡ１及びＡ２を用いてジデオキシ配列決定
法（Ｓａｎｇｅｒ、１９７７）により、両者のコロニー
から得た１本鎖ＤＮＡの配列決定を行なった。プライマ
ーとしてＡ１プローブを用いた配列分析により、Ｂ．
ｔ．ｔ．毒素蛋白の精製ピークＡ及びＢについて測定し
たアミノ酸配列の９−１５番目のアミノ酸配列と同一の
配列を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
の存在が判明した。プローブＡ２を用いた場合には、上
記のＯＲＦのアミノ酸配列の末端以降からスタートする
ＤＮＡ配列が産生された。しかしながらこのＤＮＡ配列
はＡ１プローブにより産生されるＤＮＡ配列と同じであ
った。これらの結果から、目的とするＢ．ｔ．ｔ．毒素
遺伝子がクローン化されたことが確認された。ピークＣ
のＮ−末端配列に基づいて作成した縮退プローブを用い
て全Ｂ．ｔ．ｔ．ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼ
ーションを行なったところ、ピークＣについて求めたア
ミノ酸配列は誤りである、あるいはそれはピークＣを含
む２つもしくはそれ以上の蛋白の混合物から得られたも
のであるということを示す特異的バンドは検出されなか
った。
【００４４】Ｅ．ｃｏｌｉで産生された蛋白の分析 Ｂ．ｔ．ｔ．結晶蛋白と組換えＢ．ｔ．ｔ．蛋白とを、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）により
調べた。Ｅ．ｃｏｌｉ １ｍｌを遠心し、ペレットを１
００μｇ ＳＤＳ−サンプル緩衝液及び１０μｌサンプ
ル中に再懸濁し、７．５％ポリアクリルアミドゲル上で
電気泳動した。ゲルをクーマシーブルーで染色するか、
あるいはＢ．ｔ．ｔ．毒素結晶に対する抗体の交差反応
性に基づいてゲルを探査した。西洋ワサビパーオキシダ
ーゼ結合抗体法（Ｔｏｗｂｉｎら、１９８４）により、
ウェスタンブロットを実施した。高分子量のマーカーは
ＢｉｏＲａｄから購入した。
【００４５】クローンがＢ．ｔ．ｔ．毒素を産生したこ
とを、Ｅ．ｃｏｌｉで産生された蛋白のウェスタンブロ
ット分析によって更に確認した。ｐＵＣ１１９、ｐＭＯ
Ｎ５４２０あるいはｐＭＯＮ５４２１のいずれかを保持
するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１細胞を、ｌａｃプロモー
ターの作用を誘導するためＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）の存
在下で１晩生育せしめた。コントロールとしての精製
Ｂ．ｔ．ｔ．結晶蛋白とともに、２重のサンプルについ
てＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。１つのゲル上でのウェ
スタンブロット分析により、ｐＭＯＮ５４２０またはｐ
ＭＯＮ５４２１を保持するＥ．ｃｏｌｉによって、交差
反応をする２つの蛋白が産生されることが示された。こ
れらの蛋白は、Ｂ．ｔ．ｔ．結晶の主要蛋白及びマイナ
ー蛋白とその大きさが同じであった。第２のゲル上にお
ける分子量スタンダードをクーマシーブルーで染色せし
め、これと比較することによって蛋白の分子量を測定し
た。主要毒素蛋白のサイズは７４ｋＤａでありマイナー
毒素蛋白のサイズは６８ｋＤａであることが判った。ｐ
ＭＯＮ５４２０によって産生されるＢ．ｔ．ｔ．毒素蛋
白のレベルは、ＩＰＴＧの添加によって上昇し、他方、
ｐＭＯＮ５４２１による毒素蛋白の産生は影響を受けな
かった。
【００４６】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｓにおけるＢ．ｔ．ｔ．毒素の産生 図２に示してあるように、ＢａｍＨＩで消化したｐＭＯ
Ｎ５４２０をｐＭＯＮ７１１１のＢａｍＨＩ部位にクロ
ーニングすることによって、広範囲宿主ベクターｐＭＯ
Ｎ５４３２を構築した。次いで毒素の産生を分析するた
め、このベクターを用いて、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ７０１Ｅ１を形質転換した。前記したと同様にして
（Ｄｉｔｔａら、１９８０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにトリパレンテラルメーティ
ング（tri-parental matings）を行なった。ウェスタン
ブロット分析及び昆虫毒性の研究のために、ＩＰＴＧの
存在下及び不存在下で生育せしめて１晩培養してサンプ
ルを調製した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓによって産生さ
れる蛋白は、Ｅ．ｃｏｌｉで産生される蛋白とサイズが
同じであり、蛋白発現はＩＰＴＧの添加によって上昇し
た。
【００４７】昆虫毒性の分析 新たに孵化したコロラドポテト甲虫（Leptinotarsa dec
emlineata）を用いて、トマトの葉を餌とするアッセイ
法により、甲虫類毒素活性を調べた。Ｅ．ｃｏｌｉ及び
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ培養細胞をＩＰＴＧの存在下で
１晩生育せしめ、遠心分離し次いで１０ｍＭ ＭｇＳＯ
４中に各種濃度で再懸濁せしめた。次いで超音波処理
（氷上で１５秒パルス処理を３回）により、細胞を粉砕
した。Ｔｗｅｅｎ−２０（０．１％）を加えてサンプル
を、湿ったフィルターペーパーを詰めた９ｃｍペトリ皿
の中に入れたトマトの葉に塗布した。それぞれの葉に、
コロラドポテト甲虫の幼虫を置き、修正死亡率％（（コ
ントロールの生存甲虫数％−サンプル処理の生存甲虫数
％）／コントロールの生存甲虫数％）を、Ａｂｂｏｔｔ
の式（Ａｂｂｏｔｔ、１９２５）を用いて計算した。ア
ッセイは２重に行ない、データを重ね合わせて用いた。
ポジティブコントロールとして、Ｂ．ｔ．ｔ．結晶／胞
子調製物を用いた。
【００４８】ｐＭＯＮ５４２０及びｐＭＯＮ５４２１の
Ｅ．ｃｏｌｉ培養細胞について、ＩＰＴＧを添加して異
なる濃度で生育せしめて、甲虫類毒性を評価した。組換
え型のＢ．ｔ．ｔ．毒素と野生型のＢ．ｔ．ｔ．毒素と
を比較して表１に示した。得られる結果から、組換え
Ｂ．ｔ．ｔ．蛋白はコロラドポテト甲虫に対して毒性を
示すことが判る。ＩＰＴＧで誘導された２×濃度のｐＭ
ＯＮ５４２０培養細胞は、Ｂ．ｔ．ｔ．胞子／結晶コン
トロールと同様に１００％甲虫を殺した。これらの毒性
データの結果から、クローン化されたＢ．ｔ．ｔ．遺伝
子は、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋白をコードする遺伝子である
ことが判る。
【００４９】トマトの葉を餌とするアッセイの結果か
ら、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓによって産生される毒素は
コロラドポテト甲虫に対して毒性を示すことが判る。Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ培養細胞の相対毒性は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ培養細胞と比較した時、ウェスタンブロット分析に
よって測定した毒素蛋白産生量とよく一致した。
【００５０】
【表１】
【００５１】Ｂ．ｔ．ｔ．の毒素遺伝子の配列 クローン化断片中のＢ．ｔ．ｔ．遺伝子の位置と方向と
を、以下の手法から得られる情報に基づいて決定した。
即ち、ａ）１本鎖ｐＭＯＮ５４２１テンプレートからＤ
ＮＡ配列を得る；ｂ）ＤＮＡ配列分析により同定され
た、翻訳開始点近くのＰｓｔＩ部位を、ｐＭＯＮ５４２
０及びｐＭＯＮ５４２１中においてマップ化する；ｃ）
他のいくつかの制限酵素部位をマップ化する；ｄ）Ｂｇ
ｌII部位からＢａｍＨＩ部位までの１３０ｂｐを欠いた
ものを構築し、両者の全長蛋白を産生する。これらの情
報をｐＭＯＮ５４２０及びｐＭＯＮ５４２１のマップ構
築に用いた。図４に示されるように、毒素コード領域
は、５′末端ＨｉｎｄIII部位から５００ｂｐのところ
であって、ＰｓｔＩ部位から１５０ｂｐ上流のところか
らスタートしている。このコード領域は、３′末端Ｈｉ
ｎｄIII部位から約４５０ｂｐのところで終わってい
る。ＢｇｌII部位は、終止コドンから下流３５０ｂｐの
位置にある。
【００５２】プラスミド Ｂ．ｔ．ｔ．殺虫毒素遺伝子の配列を決定するために構
築したプラスミドを表IIに挙げた。親プラスミド、ｐＭ
ＯＮ５４２０、ｐＭＯＮ５４２１は、ｐＵＣ１１９に逆
方向でクローン化したＨｉｎｄIII断片のそれぞれ独立
した単離物である。
【００５３】
【表２】
【００５４】配列決定用１本鎖テンプレート調製 以下に示すプロトコールにより、配列決定用１本鎖テン
プレートを再現性よく高収率で得ることができる。
【００５５】配列決定すべき断片を有するｐＵＣ１１９
保持するシングルコロニーを、アンピシリン（１ｍｌ当
り２００μｇ）を含むＬ−寒天（１０ｇトリプトン、５
ｇ酵母抽出物、５ｇＮａＣｌ及び１５ｇ寒天を１ｌ当り
含有）上に塗布した。このプレート上のシングルコロニ
ーを、Ｌ−ブロース（１ｍｌ当りアンピシリン２００μ
ｇ含有）３ｍｌに接種し、振とうしながら３７℃で１晩
インキュベートした。この培養物から５０μｌを取っ
て、これを、サイドアーム付き１５０ｍｌフラスコ中に
入れたアンピシリン２００μｇを含む２ＸＹＴ（１ｌ当
り２０ｇトリプトン及び１０ｇ酵母抽出物を含む）１０
ｍｌに接種し、振とうしながら３７℃でインキュベート
した。２−３時間（５０のＫｌｅｔｔリーディング）
後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１中で生育せしめたＭ１３
Ｋ０７（ヘルパーファージ）１００μｌを加えて、培養
細胞を誘導せしめた。フラスコを１時間振とうし、次い
で２ＸＹＴ２０ｍｌを加えて、カナマイシンの終濃度を
１ｍｌ当り７０μｇ、アンピシリンの終濃度を１ｍｌ当
り２００μｇに調整した。培養液を３７℃で１６−１８
時間振とうした。誘導せしめて１晩インキュベートした
培養液３ｍｌが、４回の配列決定実験を行なうのに適当
な量のテンプレートを単離するのに十分であることが判
った。この３ｍｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブ
に入れて１分間回転し、次いでデカントして０．２μｍ
Gelman Science Acrodisc(登録商標)で濾過した。こ
の操作は、細胞デブリスインタクトＥ．ｃｏｌｉとを除
去するのに有効であった。室温下で１０分間、ポリエチ
レングリコール沈澱（２０％ＰＥＧ、２．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、溶解物２ｍｌ当り５００μｌ）を実施し、次いで１
０分間遠心分離した。上澄を除き、短時間回転させて
（１５秒間）、残存しているＰＥＧを除いた。ＰＥＧが
少しでも残存していてテンプレート単離物中に含まれて
しまう場合には、これはＤＮＡ配列決定反応に悪い影響
を与える。得られるペレットをＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１００μｌに再懸
濁し、これらを集めて、緩衝化フェノール（等量の１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衝化し次いで等量のＴＥで
平衡化して緩衝化した）２００μｌとよく混合した。５
５℃で１０分間インキュベーション後、等量（２００μ
ｌ）のフェノール／クロロホルム（１：１）を加えて渦
動せしめ、２分間遠心した。上層部を除去し、クロロホ
ルム２００μｌで抽出し、遠心分離して水層を除去し
た。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２５μｌ及び９
５％エタノール６００μｌを用いて、１本鎖テンプレー
トを沈澱せしめ、氷上で５分間インキュベートし、次い
で１０分間遠心した。沈殿物をＨ２Ｏ ２５μｌに再懸
濁せしめ、その２μｌを用いて、アガロースゲル上でそ
の正しいサイズ、相対濃度、ＤＮＡの混入をチェックし
た。
【００５６】配列決定用試薬及び条件 ＤＮＡ配列決定プロトコールは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手し得るハンドブックに詳
細に記載されている。試薬（ヌクレオチド、プライマ
ー、緩衝液、チェイス（ｃｈａｓｅ）溶液、、及びクロ
ノ−ポリメラーゼ）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｍ１３シー
クエンシングキット（カタログ＃Ｎ４５０２）から得
た。Ａｍｅｒｓｈａｍキットに備え付けてある配列決定
処方を、Ａ−Ｔを豊富に含むＢ．ｔ．ｔ．遺伝子の配列
決定にふさわしいように調整した。ｄＮＴＰとｄｄＮＴ
Ｐとの混合比１：１の代わりに、次の比率がより適当で
あることが判った。即ち、４０μｌ ｄＡＴＰ：１０μ
ｌ ｄｄＡＴＰ，３５μｌ ｄＴＴＰ：１５μｌ ｄｄ
ＴＴＰ，１５μｌ ｄＧＴＰ：３５μｌ ｄｄＧＴＰ及
び１０μｌ ｄＣＴＰ：４０μｌ ｄｄＣＴＰの混合比
を用いた。放射活性硫黄（［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ）を
配列決定反応（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ＃ＳＪ．１３
０４）に用いた。配列決定用ゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍハ
ンドブックの記載に基づいて調製した）を、Ｈｏｅｆｆ
ｅｒ“Ｐｏｋｅｒ Ｆａｃｅ”装置上で７０ワット（１
２００−１４００ボルト）で移動させた。この時に非常
に良好な分離が行なわれることが判った。高い電圧の場
合には、はっきりしないバンドが現れた。
【００５７】Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子の配列決定 単離したプラスミド、ｐＭＯＮ５４２０及びｐＭＯＮ５
４２１には、３．０ＨｉｎｄIII断片が逆方向で含まれ
ていた（図３参照）。オリゴヌクレオチドプローブをデ
ザインするためのベースとして用いたＢ．ｔ．ｔ．結晶
の主要蛋白は、分子量７３−７６ ｋｄａｌを有してお
り、これは約２．０ｋｂのＤＮＡに相当するものであ
る。Ａ１及びＡ２プライマー（ピークＡのアミノ酸配列
に基づいた合成オリゴヌクレオチド；表III参照）から
の最初の配列決定によって、ＤＮＡ配列は予想されるア
ミノ酸配列に対応していることが確認された。
【００５８】
【表３】
【００５９】ＰｓｔＩ部位は最初の配列部分に位置して
おり、この部位は、ｐＭＯＮ５４２０及びｐＭＯＮ５４
２１内のＢ．ｔ．ｔ．遺伝子の位置及び方向を同定する
ために用いた（図３及び図４参照）。多くの酵素（Ｈｐ
ａＩ、ＸｂａＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌII）を
用いた制限酵素部位のマッピング、及びｐＭＯＮ５４２
０とｐＭＯＮ５４２１のｐＵＣ１１９部分にある多くの
非反復部位のマッピングによって、配列決定用ユニバー
サルプライマーを用いて配列決定を行うことができるよ
うになった。ユニバーサルプライマーの相同領域を、遺
伝子の内部領域に近づけることによって、ｐＭＯＮ５４
２０とｐＭＯＮ５４２１の両者についてＤＮＡの欠失を
生ぜしめた。欠失を生ぜしめることによって容易に配列
決定できない領域については、コード配列における配列
決定領域に対応する合成オリゴヌクレオチド（表III）
をプライマーとして使用して、配列決定された領域を延
長せしめた。配列決定領域（シークエンスコーディネー
ト；表IV）及び配列決定の方向を図４に示した。
【００６０】
【表４】
【００６１】Ｂ．ｔ．ｔ．殺虫毒素遺伝子のコンピュー
ター分析 ｐＭＯＮ５４２０及びｐＭＯＮ５４２１より、配列の全
塩基対２６１５ｂｐを得た。配列をコンビューター分析
したところ、２０５から２１３６塩基対に唯一のオープ
ンリーディングフレームが見られた。図５に示したよう
に、Ｂ．ｔ．ｔ．殺虫毒素遺伝子は１９３２塩基対の遺
伝子であって、分子量７３，０９１ダルトンを有する６
４４個のアミノ酸の蛋白をコードしている。この蛋白は
実効電荷−１７を有しており、３４％のＧ−Ｃ量を有し
ている。
【００６２】甲虫類毒素遺伝子及び蛋白と鱗翅類毒素遺
伝子及び蛋白との比較 Bacillus thuringiensisから、甲虫類毒素及び鱗翅類毒
素が得られるが、両者の毒素遺伝子及び毒素蛋白には明
らかな相違がある。Bacillus thuringiensisから単離さ
れるように、両者の毒素蛋白はパラ胞子結晶中に見出さ
れる。しかしながら、前記したように、結晶の溶解特性
には明白な相違がある。更には、溶解した結晶中で見出
される毒素蛋白の大きさは、両者で完全に異なる。鱗翅
類毒素蛋白は１３０ｋＤａであり、他方、甲虫類毒素蛋
白は約７０ｋＤａである。
【００６３】Ｂ．ｔ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓから得た
甲虫類毒素遺伝子の単離及びＤＮＡ配列分析によって、
毒素蛋白のアミノ酸配列が予想される（図５参照）。甲
虫類毒素遺伝子のヌクレオチド配列とそれから誘導され
るアミノ酸配列とを、鱗翅類毒素遺伝子のヌクレオチド
配列及びそれから誘導されるアミノ酸配列と比較した。
ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）のアルゴリ
ズムを用いたＤｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）のコンピ
ュータープログラムＢＥＳＴＦＩＴを用いて、この比較
を実施した。ＢＥＳＴＦＩＴによって、両者のヌクレオ
チド配列あるいはアミノ酸配列のマキシマムアラインメ
ント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）が得られた。ＢＥＳＴＦＩ
Ｔによって２つのパラメーター、即ち、質及び比が計算
され、これらのパラメーターは、異なるアラインメント
を比較する時のアラインメント関数として使用される。
比は０と１．０の間を変動し、大きな比の場合には、両
者の配列間に良好なアラインメント（より多くの類似
性）が存することを示す。
【００６４】ＢＥＳＴＦＩＴアラインメントにより、両
者の毒素遺伝子は、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列の
両者の点で関連性を有していることが示された。しかし
ながら、また両者の配列は明白に相違しており、ヌクレ
オチド配列及びアミノ酸配列の両者において多くのミス
マッチ領域があることも、アラインメントによって示さ
れた。例えば、両者のアミノ酸配列を比較するための比
はわずかに０．２２であった。ヌクレオチドレベルで
は、両者の配列に多くのギャップを導入することによっ
て初めてマキシマムアラインメントが得られ、その比は
わずかに０．０７２であった。
【００６５】鱗翅類毒素遺伝子について、配列決定され
た多くの例がある。これらの遺伝子について同様の比較
が行なわれ、Ｓｃｈｎｅｐｆ（１９８５）によって報告
されたＢ．ｔ．Ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ−１の遺伝子と
Ａｄａｎｇら（１９８５）によって報告されたＢ．ｔ．
Ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ−７３の遺伝子とは、それぞれ
最も相違する鱗翅類毒素遺伝子を示すことが明らかにさ
れている。
【００６６】甲虫類遺伝子と鱗翅類遺伝子のアラインメ
ントについて求めた上記した比と比較すると、上記２つ
の異なる鱗翅類蛋白のアミノ酸配列についての比は０．
８１１であり、これら２つの鱗翅類遺伝子のヌクレオチ
ド配列についての比は０．７５５であった。このこと
は、甲虫類毒素遺伝子と鱗翅類毒素遺伝子とは進化論的
には関係しているが、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配
列の両者の点で全く相違していることを示すものであ
る。
【００６７】Ｅ．ｃｏｌｉでの組換えＢ．ｔ．ｔ．毒素
の高レベル産生 大量の組換えＢ．ｔ．ｔ．毒素を効率よく精製するため
に、Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ高発現ベクター
中にクローン化する必要がある。オープンリーディング
フレームの開始点であるＡＴＧコドンのところで、ｐＭ
ＯＮ５４２０にＮｃｏＩ部位を導入するため特定部位突
然変異誘発を用いた。
【００６８】特定部位の突然変異誘発 新しい制限酵素部位を導入するために、Ｋｕｎｋｅｌ
（１９８５）の方法に従い、特定部位の突然変異誘発を
実施した。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｂｗ３１３への形質転換によ
りプラスミドｐＭＯＮ５４２０を導入した。この株はＤ
ＮＡにデオキシウリジンを組込むためにｄｕｔ−突然変
異及びｕｎｇ−突然変異を含んでいる。形質転換シング
ルコロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．
２５μｇ／ｍｌウリジンを含む２ＸＹＴ培地で１晩生育
せしめた。この培養液の０．５ｍｌアリコートを、同じ
培地１０ｍｌに加え、激しく振とうしながら、０．２３
（Ａ６００）の密度にまで３７℃で１時間インキュベー
トした。フアージ粒子を含む１本鎖の形成を誘導するた
めに、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を約１０の多重で
加え、１時間インキュベートして０．４（Ａ６００）の
濃度にした。上記した培地３０ｍｌを加えて培養液を希
釈し、終濃度７０μｇ／ｍｌでカナマイシンを加えた。
インキュベーションを１５時間行ない、その後遠心によ
って細胞を除いた。２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣｌ
／５０μｇ／ｍｌ ＲＮＡアーゼＡ５ｍｌを加え次いで
氷上で１５分間インキュベーションすることによって、
２５ｍｌの上澄からファージ粒子を沈殿せしめた。遠心
してファージを回収し、０．８ｍｌＴＥバッファーに溶
解した。０．８ｍｌフェノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール（２５：２４：１）で３回抽出し次いで
エタノールで沈澱せしめて、粒子からＤＮＡを単離し
た。ＤＮＡペレットを水１００μｌに溶解し、終濃度約
１ｍｇ／ｍｌ（アガロースゲル電気泳動により評価）と
した。
【００６９】突然変異誘発のため、合成オリゴヌクレオ
チドプライマーを、濃度約１０ｐｍｏｌ／μｌで水に懸
濁した。５０ｐｍｏｌオリゴヌクレオチド、１ｍＭ Ａ
ＴＰ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭスペルミジン−ＨＣｌ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ及び酵素２単位を含む反応液中でＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを利用して、オリゴヌクレオチドを
リン酸化した。反応液を３７℃で３０分間インキュベー
トし、次いで７０℃で５分間加熱した。６．６ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、６．６ｍＭ
ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＤＴＴを含む反応液中でファー
ジＤＮＡ（２μｇ）約１ｐｍｏｌｅとプライマー１０ｐ
ｍｏｌｅとを混合して、リン酸化プライマーをファージ
ＤＮＡを含むデオキシウリジンにアニール化した。混合
物を７０℃で７分間加熱し、次いで室温にゆっくりと冷
却した。ｄＮＴＰを０．５ｍＭ、ＡＴＰを０．５ｍＭ加
え更にクレノー断片ＤＮＡポリメラーゼ５単位及びＴ
４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）４００単位
を加えて、２本鎖閉環ＤＮＡ合成用の基質としてアニー
ル化プライマー／テンプレートを用いた。アニーリング
に用いたのと同様のバッファー塩中で、１５℃で約１５
時間反応を実施した。反応後リガーゼ４００単位を加
え、２時間インキュベーションを行なった。反応液の半
分を用いて、ＣａＣｌ２で処理したＪＭ１０１細胞０．
１５ｍｌを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン
を含むＬＢプレート上に細胞を広げた。突然変異誘発反
応液のそれぞれについて、３０から数百個のコロニーを
回収した。アンピシリンを含むＬＢ培地中で１晩シング
ルコロニーを生育せしめ、アルカリＳＤＳ法によりプラ
スミド調製物を得た。プラスミドについて、新たな制限
酵素部位の存在を分析し、この部位の存在を前記した配
列分析によって確認した。
【００７０】Ｂ．ｔ．ｔ．殺虫毒素遺伝子の開始点にお
いて、Ｎｃｏ Ｉ部位を含むプラスミド（ｐＭＯＮ９７
５９）を部位特異的突然変異誘発によって作成した。こ
こで使用したプライマーは次の通りである。
【００７１】
【化３】
【００７２】Ｎ末端におけるＮｃｏ Ｉ部位の生成によ
り、２番目のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン
酸に変わった。この変化によっては、昆虫毒性に影響は
なかった。Ｎｃｏ Ｉ部位を導入した結果、ＢａｍＨ Ｉ
部位及びＳｔｙ Ｉ部位も生成した。Ｎｃｏ Ｉ部位を含
むプラスミドをｐＭＯＮ９７５９と命名した。ｐＭＯＮ
９７５９から得た、毒素をコードするセグメントを含む
２．５ｋｂ ＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄ III断片を、ｐＭＯＮ
５４３６を構築するためにＮｃｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ III消
化ｐＭＯＮ５６３４にクローン化した。第１６図に示す
ように、ｐＭＯＮ５６３４はｐＢＲ３２７に基づいたプ
ラスミドであり、ｆ１ファージの複製起点を含んでい
る。このベクターは、ナリジキシン酸によって誘導され
る合成ｒｅｃ Ａプロモーターを含んでいる。ファージ
Ｔ７から得た１０リーダー遺伝子（１９８７年２月４日
に出願されたＵ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ出願番号００５８２
１の明細書に記載されており、その記載を本明細書に引
用する）も、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現を増加させるために
存在している。プロモーター及び１０リーダー遺伝子配
列の下流に遺伝子を挿入するために、多くのクローニン
グ部位を有する合成リンカーが加えられている。
【００７３】ｒｅｃ Ａプロモーターを誘導するため
に、１晩インキュベートした培養液を、０．２％カザミ
ノ酸及び０．２５％グルコースを添加したＭ９最少培地
（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）で、１：５０に希釈した。
１５０Ｋｌｅｔｔ単位でナリジキシン酸を５０μｇ／ｍ
ｌまで加え、誘導３時間後に細胞を採取した。ナリジキ
シン酸で誘導したｐＭＯＮ５４３６によって産生される
Ｂ．ｔ．ｔ．毒素のレベルを、ＩＰＴＧで誘導したｐＭ
ＯＮ５４２０によって産生されるレベルと、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでの分析によって比較した。クーマシーブルーに
よってゲルを染色した所、ｐＭＯＮ５４２０によって産
生されるＢ．ｔ．ｔ．毒素は検出されなかった。他方、
ｐＭＯＮ５４３６によって産生されるＢ．ｔ．ｔ．毒素
のレベルは、全蛋白の約５％であった。この構築体を、
毒性レベル、昆虫特異性及び活性様式を調べる目的で多
量の組換えＢ．ｔ．ｔ．毒素蛋白を単離するのに使用し
た。
【００７４】Ｂ．ｔ．ｔ．毒素の特徴 Ｂ．ｔ．ｔ．蛋白の数と起源の同定 Ｂ．ｔ．ｖａｒ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓによって多数
の甲虫類毒素蛋白が産生され、これらは、胞子形成とと
もに産生される蛋白結晶中に存在している（第６図参
照）。これらの蛋白結晶は、細胞が自己消化する間にあ
るいは胞子形成後に、培地中に放出される。Ｂ．ｔ．ｖ
ａｒ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓによって産生される多数
の毒素蛋白を測定するために、この微生物の培養液５０
０ｍｌを、２リットルフラスコ中の１００ｍＭ２−（Ｎ
−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファ
ー、ｐＨ７．０の１５％ＴＳＢ培地で、３０℃で２時間
生育せしめた。生育後、培養細胞は胞子形成し、溶解し
た。４℃で２０，０００×ｇで２０分間遠心することに
より、蛋白結晶と胞子とを採取した。ペレットを過剰の
水で３回洗浄し、次いで２Ｍ ＮａＣｌで３回洗浄し
た。得られるペレットを、水及び０．０２％ナトリウム
アジド中で４℃で保存した。ペレットを１００ｍＭ炭酸
ナトリウムバッファー、ｐＨ１０に懸濁し、この懸濁液
を室温で２時間撹拌することによって、Ｂ．ｔ．ｔ．毒
素蛋白を蛋白結晶から溶解せしめた。２０，０００×ｇ
で２０分間遠心して不溶物質を除去した後、上澄を０．
２μｍフィルターで濾過して残存している胞子を除い
た。このようにして調製したＢ．ｔ．ｔ．毒素蛋白は、
１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４％ ＳＤＳ、２０％
グリセロール及び１０％２−メルカプトエタノール、ｐ
Ｈ６．８（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用のサンプルを調製す
るために用いたＳＤＳサンプルバッファー）に溶解した
蛋白結晶と同様に、４つの主要蛋白とこれらと異なる１
つの蛋白から構成されていることがＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析によって判った。５つのユニークな生成物を、Ｎ末端
アミノ酸分析によって同定した。これら５つの全ての蛋
白が同じ遺伝子から産生されているのか否か、あるいは
これらを合成するためには２つまたはそれ以上の遺伝子
が必要であるのか否かを調べるため、これら蛋白のそれ
ぞれのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解法により測定
した。
【００７５】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉ
ｎｃ．モデル４７０Ａガスフェーズシークエンサー（Fo
ster City，CA）を用いた（Hunkapillerら、1983）。Ｂ
ｒｏｗｎｌｅｅ ２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．ＰＴＨ−Ｃ１８
カラムを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．モデル１２０ＡＰＴＨを用いて、オンライ
ン法によるＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって、それぞれのＰ
ＴＨ−アミノ酸誘導体を同定した。蛋白のＮ末端アミノ
酸配列を決定することによって、これらの蛋白が前記し
たＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子から誘導されたものであるか
否かがはっきりする。
【００７６】これら蛋白の配列を決定する手法は、Ｅ．
ｃｏｌｉクローンＪＭ１０１（ｐＭＯＮ５４３６）から
のバンド１及び３（図６参照）に対応するＢ．ｔ．ｔ．
毒素蛋白；及びＢ．ｔ．ｖａｒ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉ
ｓによって産生される蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電
気溶出して得られるバンド２、３及び４に対応するＢ．
ｔ．ｔ．毒素蛋白の配列を決定する方法である。ＪＭ１
０１（ｐＭＯＮ５４３６）から精製した蛋白を用いて、
Ｂ．ｔ．ｔ．１及び３の配列を決定した。
【００７７】他のＥ．ｃｏｌｉ構築体（ｐＭＯＮ５４５
０，５４５６及び５４６０）と同様に、ＪＭ１０１（ｐ
ＭＯＮ５４３６）も、高レベルの発現を誘導することに
よって、不溶性で屈折性の形態を有するＢ．ｔ．ｔ．を
産生する。改変Ｍ９培地で３７℃でＥ．ｃｏｌｉ構築体
を生育せしめた。１晩生育せしめた培養液を用いて、
２．４ｌフエルンバツフフラスコ中の改変Ｍ９培地に最
初の濃度１０Ｋｌｅｔｔ単位で接種した。０．１Ｎ Ｎ
ａＯＨに溶解したナリジキシン酸を１００Ｋｌｅｔｔ単
位の培養液に加えて終濃度５０μｇ／ｍｌとし、Ｂ．
ｔ．ｔ．毒素蛋白の発現を誘導した。更に４時間インキ
ュベーション後、２０，０００×ｇで４℃で２０分間遠
心することによって培養細胞を採取した。細胞ペレット
を水に懸濁して、１ｍｌ当たり５０００Ｋｌｅｔｔ単位
に相当する濃度とし、次いでヒート・システム・ウルト
ラソニックス・ソニケーターにより９．５０％デューテ
ィサイクル（duty cycle）でトータル５分間、氷浴中に
て超音波処理した。超音波処理した調製物を２０，００
０×ｇで４℃で２０分間遠心した。屈折性の物質と細胞
破片を含むペレットを冷水で２回洗浄し、水及び２５％
スルホラン中に、１ｍｌ当たり１０，０００単位に相当
する濃度で懸濁した。室温で２時間撹拌後、溶解した屈
折性物質を２０，０００×ｇで４℃で再び遠心し不溶性
物質を除いた。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを上澄に加えて終濃度
５０ｍＭ、ｐＨ７．６とした。５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、２５％スルホラン、ｐＨ７．６に溶解した７５−２
００ｍＭＮａＣｌグラジエントを用いて、ＨＲ５／５Ｍ
ｏｎｏＱイオン交換カラムによりＢ．ｔ．ｔ．バンド１
及び３を共に精製した。Ｂ．ｔ．ｔ．バンド１及び３を
含むフラクションを９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で同定
し、これらを集めて、１００ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ
１０バッファーに対して透析し、Ａｍｉｃｏｎ ｃｅｎ
ｔｒｉｃｏｎコンセントレーターで濃縮した。同様の方
法により、バンド３に対応するＢ．ｔ．ｔ．毒素蛋白を
ＪＭ１０１（ｐＭＯＮ５４５６）から精製した。
【００７８】１００ｍＭ炭酸ナトリウム、２０ｍＭジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ１０バッファーに溶解
したＢ．ｔ．ｔ．結晶４０μｇとともに展開した７％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥスラブゲルより、２のみに対応するバン
ド、及びバンド３，３′と４とを合わせたもの（図６参
照）を電気溶出した。クーマシーブルーＲ２５０で１０
分間ゲルを染色し、次いで５０％メタノール、１０％酸
で２０分間脱色した。適当なバンドをレーザーカミソリ
で切り出し、Ｂ．ｔ．ｔ．蛋白を電気溶出せしめた。
Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化したＢ．ｔ．ｔ．毒素蛋白の
ＤＮＡ配列からアミノ酸配列を推定して、これら５つの
ユニークな蛋白のＮ−末端を同定した（図７参照）。
【００７９】バンド１及び３に対応する蛋白は、それぞ
れ独立した２つの翻訳開始から始まっており、これらの
開始点はそれぞれ１及び４８の位置のメチオニンからス
タートしている（図６及び図７）。Ｂ．ｔ．ｔ．バンド
２、３及び４に対応する蛋白はＢ．ｔ．ｖａｒ．ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓにのみ見られＥ．ｃｏｌｉ構築体では
見られず、これらの蛋白はバンド１または３のいずれか
が加水分解によって開裂して生じたものである。これら
の結果により、５つの全ての蛋白は同じ遺伝子から生成
していることが明確になった。
【００８０】昆虫毒性テストのためのＢ．ｔ．ｔ．バン
ド１及び３の精製 バンド３、及びバンド１と３に対応するＥ．ｃｏｌｉで
産生されたＢ．ｔ．ｔ．蛋白を２５％スルホランに溶解
し、Ｎ−末端アミノ酸配列分析に用いたＭｏｎｏＱクロ
マトグラフィーにより精製したところ、これらはコロラ
ドポテト甲虫に対して毒性を示さなかった。続いての実
験で、スルホラン自身がＢ．ｔ．ｔ．を不活性化するこ
とが証明された。そこで他の精製法を開発し、これを用
いて、Ｅ．ｃｏｌｉで産生されるＢ．ｔ．ｔ．バンド１
と３の相対殺虫毒性を、Ｂ．ｔ．ｖａｒ．ｔｅｎｅｂｒ
ｉｏｎｉｓの結晶から溶解したＢ．ｔ．ｔ．と比較し
た。
【００８１】培養細胞を生育せしめて、誘導して採取
し、次いで前記したと同様にして屈折性の物質を単離し
た。１００ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０を用いて、各
種のＢ．ｔ．ｔ．蛋白を屈折性物質から溶解せしめた。
アミコンで撹拌した細胞を用いてＹＭ−１０膜によって
濃縮した溶解Ｂ．ｔ．ｔ．を、Pharmacia Superose １
２ゲル濾過ＦＰＬＣカラムにより精製してＢ．ｔ．ｔ．
バンド１及び３を他の混入蛋白より分離した。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析により適当なフラクションを集め、濃縮し
てコロラドポテト甲虫に対する毒性実験に用いた。バン
ド１（ｐＭＯＮ５４３６、ｐＭＯＮ５４６０）及びバン
ド３（ｐＭＯｎ５４５６）に対応する蛋白は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析によると９０％の純度を有していた。ｐＭ
ＯＮ５４６０によって産生されたバンド１は、４８番目
のアミノ酸がメチオニンの代わりにイソロイシであった
（下記参照）。
【００８２】毒性比較用のＢ．ｔ．ｖａｒ．ｔｅｎｅｂ
ｒｉｏｎｉｓの本来（ｎａｔｉｖｅ）の蛋白毒素を得る
ために、前記したと同様にしてシュクロースグラジェン
ト遠心により蛋白結晶を単離精製した。結晶を１００ｍ
Ｍ炭酸ナトリウム、２０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ１０に溶解し
て昆虫毒性テストに使用した。
【００８３】昆虫アッセイ用の全てのＢ．ｔ．ｔ．毒性
蛋白調製物及びコントロールには、トマトの葉への結合
性を高めるために０．３％Ｔｗｅｅｎ２０界面活性剤が
含まれていた。３−４週令のトマトの葉を取り、この葉
の上面及び下面にＢ．ｔ．ｔ．蛋白を含むバッファー溶
液を十分に塗布して、昆虫毒性テストを実施した。トマ
トの葉の表面を空気乾燥して、１枚の葉と１０匹のコロ
ラドポテト甲虫をペトリ皿中に入れ、２２℃で４日間イ
ンキュベートした。死亡した昆虫の数を測定して、前記
したＡｂｂｏｔｔの式によって修正死亡率％（％ＣＭ）
を求めて毒性を表わした。全ての実験は２重に行ない、
ｐＭＯＮ５４６０から得られたＢ．ｔ．ｔ．バンド１以
外の全ては異なる日に実験を繰り返した。これらの結果
は下記の表に示した。
【００８４】
【表５】
【００８５】Ｅ．ｃｏｌｉ構築体から得た精製蛋白の相
対毒性を、溶解せしめた本来のＢ．ｔ．ｔ．結晶と比較
した。バンド１（ｐＭＯＮ５４３６）及びバンド３（ｐ
ＭＯＮ５４５６）を前記したようにして精製した。バン
ド１（ｐＭＯＮ５４６０）はゲル濾過クロマトグラフィ
ーにより精製した。本来のＢ．ｔ．ｔ．結晶は１００ｍ
Ｍ Ｎａ２ＣＯ３，ｐＨ１０に溶解した。
【００８６】コロラドポテト甲虫を５０％殺すのに必要
なＢ．ｔ．ｔ．毒素の量は、ｐＭＯＮ５４３６及びｐＭ
ＯＮ５４６０から単離したＢ．ｔ．ｔ．バンド１とｐＭ
ＯＮ５４５６から単離したＢ．ｔ．ｔ．バンド３とでは
本質的に同じであった（表Ｖ）。同様にＥ．ｃｏｌｉか
ら得たこれらの精製したＢ．ｔ．ｔ．調製物の毒性は、
Ｂ．ｔ．ｖａｒ．ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓから得て炭酸
ナトリウムに溶解した本来の毒素の毒性と本質的に同じ
であることが証明された。
【００８７】Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋白の毒性断片の決定 鱗翅類毒素のＣ末端を切りとっても毒性は減少しないこ
とが多くのグループによって報告されている（Schnepf
ら、1985；Hofteら、1986；Wabikoら、1986）（１１５
５個のアミノ酸を切りつめて６０７個のアミノ酸にして
も毒性のロスはなかった）。従って、蛋白のＣ末端の半
分は毒性に不要なものである。Ｃ末端欠失を有する鱗翅
類毒素遺伝子は形質転換植物においてより高レベルで発
現されることが他のグループによって報告されている。
また、毒性を維持するためには、Ｎ末端はわずかしか切
り捨てることができないことも報告されている（Schnep
ら、1985；Hofteら、1986）。これらに反して、甲虫類
Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋白は実質的に相違する特性を有する
ことが見出された。即ち、Ｃ末端部分は毒性に臨界的で
あり、従ってこれらを切りとることはできない。しかし
ながらＮ末端を欠失することはでき、毒性はこの場合維
持される。下記した構築体を用いて、これらの相違を明
らかにした。
【００８８】ｐＭＯＮ５４２６（Ｂｇ１ II／ＢａｍＨ
Ｉ欠失）の構築 ｐＭＯＮ５４２０をＢｇ１ IIとＢａｍＨ Ｉで消化し、
連結し、次いでＪＭ１０１を形質転換してｐＭＯＮ５４
２６を生成した。Ｂｇｌ II部位はＢ．ｔ．ｔ．毒素遺
伝子のコード領域内にないことを確認するために、この
欠失体を構築した。
【００８９】ｐＭＯＮ５４３８（Ｈｐａ Ｉ、Ｃ末端４
６３ｂｐの欠失）の構築 ｐＭＯＮ５４２０をＨｐａＩで消化し、以下の合成ター
ミネータリンカーに連結した。このリンカーはそれぞれ
のリーディングクレームにナンセンスコドンを有してお
り、またＢｇｌ II部位が５′末端に突出している。
【００９０】
【化４】
【００９１】多数のリンカー挿入を除くため連結体をＢ
ｇｌ IIで消化し、再び再連結した。連結体を用いてＪ
Ｍ１０１を形質転換し、ｐＭＯＮ５４３０を単離した。
切りつめられた遺伝子のスタート部位にＮｃｏ Ｉ部位
を導入するため、ｐＭＯＮ５４３０の１．４７ｋｂ Ｐ
ｓｔ Ｉ断片を、ｐＭＯＮ９７５９の２．３２ｋｂＰｓ
ｔ Ｉ断片と置換した。この新しい構築体をｐＭＯＮ５
４３４と命名した。ｐＭＯＮ５４３４の１．５７ｋｂ
Ｎｃｏ Ｉ／Ｈｉｎｄ III断片をＥ．ｃｏｌｉ高発現ベ
クターｐＭＯＮ５６３４にクローン化して、ｐＭＯＮ５
４３８を生成せしめた。
【００９２】ｐＭＯＮ５４４１（ＥｃｏＲ Ｖ、Ｃ末端
３２７ｂｐの欠失）の構築 ｐＭＯＮ５４２０をＥｃｏＲ Ｖで消化し、合成ターミ
ネーターリンカーに連結せしめた。多数のリンカー挿入
を除くため、連結体Ｂｇｌ IIで消化し、次いで再連結
せしめた。連結体を用いてＪＭ１０１を形質転換し、ｐ
ＭＯＮ５４３１を単離した。切りつめた遺伝子のスター
ト部分にＮｃｏ Ｉ部位を導入するために、ｐＭＯＮ９
７５９の２．３２ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ断片をｐＭＯＮ５４
３１の１．６１ｋｂ Ｐｓｔ断片と置換した。新たな構
築体をｐＭＯＮ５４３５と命名した。ｐＭＯＮ５４３５
の１．７１ｋｂ Ｎｃｏ Ｉ／Ｈｉｎｄ III断片をＥ．
ｃｏｌｉ高発現ベクターｐＭＯＮ５４３３にクローン化
してｐＭＯＮ５４４１を生成せしめた。
【００９３】ｐＭＯＮ５４４９（Ｂａｌ ３１、Ｃ末端
１９０ｂｐの欠失）の構築 Ｂｇｌ IIで消化したｐＭＯＮ９７５９をＢａｌ ３１で
製造業者の指針に従い５分間処理した。ＤＮＡを０．８
％アガロースゲルで電気泳動し、凍結融解法によってア
ガロースから精製した。次いで合成ターミネーターリン
カーを精製ＤＮＡに連結してｐＭＯＮ５４４２を単離し
た。ｐＭＯＮ９７５９のＮｃｏ Ｉ／Ｂｇｌ II断片を、
ｐＭＯＮ５４４２の切りつめた遺伝子断片で置換してｐ
ＭＯＮ５４４５を生成せしめた。ｐＭＯＮ５４４５のＮ
ｃｏ Ｉ／Ｈｉｎｄ III断片をＥ．ｃｏｌｉ高発現ベク
ターｐＭＯＮ５６３４ヘクローン化してｐＭＯＮ５４４
９を生成せしめた。Ｂａｌ ３１によって作成された欠
失体の終点をＤＮＡ配列分析により測定した。
【００９４】ｐＭＯＮ５４４８（Ｘｍｎ Ｉ、Ｃ末端１
６ｂｐの欠失）の構築 ｐＭＯＮ５４３６をＸｍｎ Ｉで消化し、合成ターミネ
ーターリンカーに連結した。連結体をＮｃｏ Ｉ及びＢ
ｇｌ IIで消化し、切りつめた遺伝子を含む１．９２ｋ
ｂ Ｎｃｏ Ｉ／Ｂｇｌ II断片をＮｃｏ Ｉ及びＢｇｌ
IIで消化したｐＭＯＮ９７５９にクローン化して、完全
な長さの遺伝子を置換しｐＭＯＮ５４４６を生成せしめ
た。ｐＭＯＮ５４４６のＮｃｏ Ｉ／Ｈｉｎｄ III断片
をＥ．ｃｏｌｉ高発現ベクターｐＭＯＮ５６３４ヘクロ
ーン化してｐＭＯＮ５４４８を生成せしめた。
【００９５】ｐＭＯＮ５４５０（Ｎｃｏ Ｉ充填末端、
毒素ＯＲＦから最初のＡＴＧの除去） ｐＭＯＮ５４３６をＮｃｏ Ｉで消化し、末端をクレノ
ー断片ＤＮＡポリメラーゼで充填し、連結してＪＭ１０
１を形質転換しｐＭＯＮ５４５０を生成せしめた。この
プラスミドはバンド３蛋白のみを発現する。
【００９６】ｐＭＯＮ５４５２（Ｎ末端２２４ｂｐの欠
失）の構築 Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子は２つのＳｔｙ Ｉ部位（２２７と
１５８７）を含んでおり、ｐＭＯＮ９７５９にＮｃｏ
Ｉ部位を導入するために突然変異誘発により３番目の部
位を加えた。５′末端Ｂ．ｔ．ｔ．ＤＮＡから２２７塩
基対までを除去するため次の実験を行なった。ｐＭＯＮ
５４３４（前記したＨｐａｌ欠失誘導体）をＳｔｙ Ｉ
で消化し、末端をクレノーＤＮＡポリメラーゼで充填
し、連結して、連結体を用いてＪＭ１０１を形質転換
し、ｐＭＯＮ５４４４を単離した。この増幅によっＮｃ
ｏ Ｉ及びＳｔｙ Ｉ開裂部位が破壊された。この増幅に
よって、最初のメチオニン（第１番目のアミノ酸）とロ
イシン（７７番目のアミノ酸）とのフレーム融合が起こ
った。ｐＭＯＮ９７５９の１．９ｋｂ Ｎｄｅ Ｉ／Ｋｐ
ｎ Ｉ断片をｐＭＯＮ５４４４へクローニングして遺伝
子のＣ末端を加え、ｐＭＯＮ５４５２を生成せしめた。
【００９７】ｐＭＯＮ５４５６（バンド３変異体、Ｎ末
端１４０ｂｐの欠失） 以下に示すプライマーを用いて、前記した如き特定部位
突然変異誘発により、Ｎｃｏ Ｉ部位をｐＭＯＮ５４２
０のバンド３のＡＴＧの位置に導入してｐＭＯＮ５４５
５を生成せしめた。
【００９８】突然変異誘発プライマー−ＢＴＴＬＯＯＰ
【００９９】
【化５】
【０１００】この突然変異誘発によって、バンド１の４
８個のＮ末端アミノ酸をコードする上流配列も除去され
た。ｐＭＯＮ５４５５のＮｃｏ Ｉ／Ｈｉｎｄ III断片
をＥ．ｃｏｌｉ高発現ベクターｐＭＯＮ５６３４ヘクロ
ーン化して、ｐＭＯＮ５４５６を生成せしめた。このプ
ラスミドはバンド３のみを発現する。Ｎｃｏ Ｉ部位の
導入により、２番目のアミノ酸がチオニンからアスパラ
ギン酸に変わった。
【０１０１】ｐＭＯＮ５４６０（ＭＥＴ４８がＩＬＥに
変わったバンド１遺伝子変異体）の構築 ｐＭＯＮ９７５９における４８番目のメチオニンをコー
ドするコドンを、以下に示すプライマーを用いて前記し
た特定部位突然変異誘発により、イソロイシンをコード
するコドンに変え、ｐＭＯＮ５４５８を生成せしめた。
ｐＭＯＮ５４５８のＮｃｏ Ｉ／Ｈｉｎｄ III断片を
Ｅ．ｃｏｌｉ高発現ベクターｐＭＯＮ５６３４にクロー
ン化して、ｐＭＯＮ５４６０を生成せしめた。バンド３
の蛋白の翻訳を開始するＡＴＧコドンを除去することに
よって、４８番目の位置にイソロイシンを有するバンド
１の蛋白のみをｐＭＯＮ５４６０が産生するようになっ
た。
【０１０２】突然変異誘発プライマー−ＢＴＴＭＥＴ
【０１０３】
【化６】
【０１０４】ｐＭＯＮ５４６７（バンド５変異体、Ｎ末
端２９３ｂｐの欠失）の構築 ９８個のＮ末端アミノ酸を除去するために、以下に示す
プライマーを用いた特定部位突然変異誘発によりｐＭＯ
Ｎ５４２０にＮｃｏ Ｉ部位を導入し、ｐＭＯＮ５４６
６を生成せしめた。
【０１０５】突然変異誘発プライマー
【０１０６】
【化７】
【０１０７】突然変異誘発によりメチオニン及びアラニ
ンも挿入せしめた。ｐＭＯＮ５４６６のＮｃｏ Ｉ／Ｈ
ｉｎｄ III断片をＥ．ｃｏｌｉ高発現ベクターｐＭＯＮ
５６３４ヘクローン化して、ｐＭＯＮ５４６７を生成せ
しめた。
【０１０８】昆虫毒性の結果 Ｃ末端を切りつめた蛋白 前記した如く、新たに孵化したコロラドポテト甲虫を用
いたトマトの葉を餌とするアッセイ法により、甲虫類毒
素活性を調べた。Ｃ末端の分析に用いたＢ．ｔ．ｔ．遺
伝子変異体を図８と図１０に示した。ｐＭＯＮ５４３８
は、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋白の４９０個のアミノ酸と、ベ
クター構築に用いたリンカーによってコードされている
３個のアミノ酸を含んでいる。切りつめられた蛋白が
Ｅ．ｃｏｌｉ中で高レベルで産生されたが、コロラドポ
テト甲虫に対して活性を示さなかった。ｐＭＯＮ５４４
１は、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素の５３６個のアミノ酸を含む蛋
白を産生する。切りつめられたこの蛋白がＥ．ｃｏｌｉ
中で高レベルで産生されたが、コロラドポテト甲虫に対
して活性を示さなかった。ｐＭＯＮ５４４９は、Ｂ．
ｔ．ｔ．蛋白の５８２個のアミノ酸と、ベクター構築に
用いたリンカーによってコードされる２個のアミノ酸を
含んでいる。この切りつめられた蛋白はＥ．ｃｏｌｉ中
で高レベルで産生されたが、コロラドポテト甲虫に対し
て活性を示さなかった。ｐＭＯＮ５４４８は、Ｂ．ｔ．
ｔ．蛋白の６４０個のアミノ酸と、ベクター構築に用い
たリンカーによってコードされる２個のアミノ酸を含ん
でいる。この切りつめられた蛋白がＥ．ｃｏｌｉで高レ
ベルで発現されたが、コロラドポテト甲虫に対して活性
を示さなかった。
【０１０９】これらの結果から、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋白
Ｃ末端はコロラドポテト甲虫に対して毒性を発揮するの
に必要であることが判る。僅かに４個のアミノ酸が欠失
しても（ｐＭＯＮ５４４８）、活性は完全に失われた。
これらの結果は、鱗翅類Ｂ．ｔ．毒素について報告され
ている文献とは全く対象的である。
【０１１０】Ｎ末端変異体及び欠失体についての結果 Ｎ末端分析に用いた他のＢ．ｔ．ｔ．遺伝子変異体を図
９及び図１０に示した。ｐＭＯＮ５４５０によって産生
される蛋白の分析結果から、Ｅ．ｃｏｌｉでのバンド３
の産生は、プロテアーゼの開裂によるのではなくむしろ
ＭＥＴ４８の位置で翻訳が開始されるためであることが
判った。また、毒性研究の結果、バンド３は毒性を示す
ことが明らかになった。ｐＭＯＮ５４５６は、４８番目
のアミノ酸から始まり、４９番目のアミノ酸がスレオニ
ンからアスパラギン酸に変わった蛋白を産生する。この
蛋白はＥ．ｃｏｌｉで高レベルに産生され、コロラドポ
テト甲虫に対して毒性を示す。ｐＭＯＮ５４５２は、７
７番目のアミノ酸から始まる蛋白を産生する。この蛋白
はＥ．ｃｏｌｉで発現され、コロラドポテト甲虫に対し
て活性を示す。ｐＭＯＮ５４６７は、９９番目のアミノ
酸から始まり、Ｎ末端に２個のアミノ酸（メチオニンと
アラニン）が加わった蛋白を産生する。この蛋白はＥ．
ｃｏｌｉで産生されたがコロラドポテト甲虫に対して検
出できる活性を示さなかった。しかしながらこの欠失体
の発現レベルは他の欠失体よりもはるかに低くかった。
これらの結果から、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋白のＮ末端は欠
失していてもよいことが示された。７６個のアミノ酸が
欠失していても毒性を示した。しかしながら、９９個の
アミノ酸が欠失した場合には、毒性は示さなかった。ｐ
ＭＯＮ５４６０は、バンド３の産生を抑制するために４
８番目のメチオニンがイソロイシンに変わっている。ｐ
ＭＯＮ５４６０によって産生されるバンド１の毒性は、
ｐＭＯＮ５４５６によって産生されるバンド３の毒性と
同じであった。
【０１１１】植物形質転換用ベクターの構築 ｐＭＯＮ５４２０に含まれているＢ．ｔ．ｖａｒ．ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓ毒素遺伝子を、植物発現ベクター用
に改良した。
【０１１２】前記したＫｕｎｋｅｌ（１９８５）の特定
部位突然変異誘発法により、完全な長さのＢ．ｔ．ｔ．
毒素蛋白（バンド１と言う）の翻訳開始を規定するＡＴ
Ｇコドンの直ぐ上流にＢｇｌ III部位を導入した。Ｂ．
ｔ．ｔ．毒素遺伝子のイニシェーターＡＴＧの領域のＤ
ＮＡ配列は以下の通りである。
【０１１３】
【化８】
【０１１４】この突然変異誘発（ｂｔｔｂｇｌ）に用い
たプライマーは２７個のヌクレオチドからなり、その配
列は以下の通りである。
【０１１５】
【化９】
【０１１６】突然変異誘発に続いて、新たなＢｇｌ II
部位を含むプラスミドをＢｇｌ IIで消化することによ
って同定し、Ｂｇｌ II部位の導入をＤＮＡ配列分析に
よって証明した。Ｂｇｌ II部位を有するＢ．ｔ．ｔ．
毒素遺伝子を保持するプラスミドを、ｐＭＯＮ９７５８
と命名した（図１１）。
【０１１７】ｐＭＯＮ９７５８のＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝
子を、発現カセットベクターｐＭＯＮ３１６（Sanders
ら、1987）に挿入した。ｐＭＯＮ３１６は、ＣａＭＶ３
５ｓプロモーター、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝
子の３′末端、及びこれらのエレメントの間に挿入用の
Ｂｇｌ II部位を有している。プラスミドｐＭＯＮ９７
５８をＢｇｌ IIで消化し、約２．３ｋｂの断片を単離
した。この断片は、ＡＴＧコドンの直ぐ上流のＢｇｌII
部位から、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子の終止コドンの約３
６０ｂｐ下流のＢｇｌ II部位まで延びている。しかし
て、この断片は、Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の完全なコード配
列を含んでおり、また終止コドンまでの３５０ｂｐ非コ
ード３′末端も含んでいる。このＢｇｌ II断片を、Ｂ
ｇｌ IIで消化したｐＭＯＮ３１６に連結した。Ｅ．ｃ
ｏｌｉを形質転換した後、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子の
５′末端がＣａＭＶ３５ｓプロモーターに接するように
Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子がｐＭＯＮ３１６に挿入された
コロニーを同定した。このプラスミドをｐＭＯＮ９７５
３と命名した。Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子をｐＭＯＮ３１
６中に逆方向で保持しているプラスミドを単離しｐＭＯ
Ｎ９７５４と命名した（図１１）。
【０１１８】無害化Ｔｉプラスミドを含むAgrobacteriu
m tumefaciens株ＡＳＥに、このｐＭＯＮ９７５３及び
ｐＭＯＮ９７５４をトリパレンテラルメーティング法に
より導入した。無害化ＴｉプラスミドとｐＭＯＮ９７５
３あるいはｐＭＯＮ９７５４とのコインテグレイトを、
Ｆｒａｌｅｙら（１９８５）の方法により同定し、Agro
bacteriumの全ＤＮＡのサザン分析によりその構造を確
認した。
【０１１９】Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子を含む他の植物発
現ベクターも構築した（図１２及び図１３参照）。これ
らのベクターにおいては、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子は植
物発現ベクターｐＭＯＮ８９３（図１４）に挿入されて
いる。図１４に示したように、発現カセットｐＭＯＮ８
９３は、エンハンスされたＣａＭＶ３５ｓプロモータ
ー、及びベーターコングリシニンのアルファ−プライム
サブユニット（下に“７ｓ遺伝子”と記されている）を
コードする大豆遺伝子から得たポリアデニル化シグナル
を含む３′末端を含んでいる。この２つのエレメントの
間に、遺伝子挿入用の多数の制限酵素部位を有するマル
チリンカーがある。
【０１２０】エンハンスされたＣａＭＶ３５ｓプロモー
ターは以下のようにして構築された。−３４３と＋９の
間に渡っているＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの断片を、
Ｏｄｅｌｌら（１９８５）の方法に従ってあらかじめｐ
ＵＣ１３内に構築した。このセグメントは、Ｏｄｅｌｌ
ら（１９８５）によってＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの
最大発現に必要と同定された領域を含んでいる。このセ
グメントをＣｌａ Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片として切り出
し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片）で平滑末端化
し、ｐＵＣ１８のＨｉｎｃ II部位へ挿入した。３５Ｓ
プロモーターの上流領域を、Ｈｉｎｄ III−ＥｃｏＲ
Ｖ断片（−３４３から−９０に渡っている）としてこの
プラスミドから切り出し、Ｈｉｎｄ IIIとＰｓｔ Ｉ部
位の間の同じプラスミドに挿入した。かくして得られる
エンハンスされたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、−３
４３と−９０との間に２重配列を含んでいる（図１８参
照）。
【０１２１】７Ｓ遺伝子の３′末端は、１７．１クロー
ン（Schulerら、1982）に含まれている７Ｓ遺伝子から
誘導した。この３′末端は、ポリアデニル化シグナルを
含んでおり、クローン１７．１のベーターコングリシニ
ンの終止コドンの約３０ｂｐ上流にあるＡｖａ II部位
から、この終止コドンの約４５０ｂｐ下流の位置にある
ＥｃｏＲ Ｉ部位に渡っている。
【０１２２】ｐＭＯＮ８９３の残りの領域には、Ｅ．ｃ
ｏｌｉでの複製起点及びAgrobacterium株ＡＣＯ（下記
参照）の無害化Ｔ−ＤＮＡとの相同組換えのための領域
を付与するｐＢＲ３２２のセグメント；広範囲宿主のプ
ラスミドＲＫ２から得たｏｒｉ Ｖ領域；Ｔｎ７から得
たストレプトマイシン耐性／スプレクチノマイシン耐性
遺伝子；及びＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びノパリン
シンターゼ（ＮＯＳ）３′末端を含み、形質転換植物細
胞に対してカナマイシン耐性を付与するキメラＮＰＴ I
I遺伝子が含まれている。
【０１２３】ｐＭＯＮ９７５３には、終止コドンの下流
にまで至る約４００ｂｐの３′末端非コード領域が含ま
れていた。この領域は毒素産生には不必要であったの
で、ｐＭＯＮ８９３に挿入したＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子
セグメントからこの領域を除いた。３′フランキング配
列を有しないＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子を作成するため
に、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）の方法に従って、終止コ
ドンの直ぐ後にＢｇｌ II部位を導入した。Ｂ．ｔ．
ｔ．毒素遺伝子の終止コドンのまわりの配列は以下の通
りであった。
【０１２４】
【化１０】
【０１２５】以下の配列を有するプライマー（ｂｔｔｃ
ｔｅｒｍ）を用いて突然変異誘発を実施した。
【０１２６】
【化１１】
【０１２７】ｐＭＯＮ９７５８を用いて、Ｂ．ｔ．ｔ．
毒素遺伝子の突然変異誘発を行なった。新たなＢｇｌ I
I部位を有するプラスミドをｐＭＯＮ９７８７と命名し
た（図１２参照）。ｐＭＯＮ９７８７はＡＴＧ開始コド
ンの直ぐ上流にＢｇｌ IIを有しているため、約１９４
０ｂｐのＢｇｌ II断片上に、５′または３′フランキ
ング配列を本質的に有しないＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子の
完全な長さのコード配列が保持されている。
【０１２８】この１９４０ｂｐ断片をｐＭＯＮ９７８７
から単離し、Ｂｇｌ IIで消化したｐＭＯＮ８９３に連
結した。Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子の５′末端がエンハン
スされたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに隣接しているプ
ラスミドを同定し、ｐＭＯＮ９７９１と命名した（図１
２参照）。
【０１２９】Ｅ．ｃｏｌｉにて、完全な長さのＢ．ｔ．
ｔ．毒素の変換体が第２のメチオニン開始コドンから産
生された。この蛋白を“バンド３”と命名し、これは完
全な長さの毒素（“バンド１”）と同様の毒性をコロラ
ドポテト甲虫に対して有していることが見出された。
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の場合と同様に、Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝
子の切りつめた形態の遺伝子も植物細胞中で発現させる
ことが可能である。したがって、バンド３のＡＴＧコド
ンの上流領域が除かれた改良Ｂ．ｔ．ｔ．毒性遺伝子を
構築した。この領域を除去するためにＫｕｎｋｅｌ（１
９８５）の方法に従い、バンド３のＡＴＧの直ぐ上流に
Ｂｇｌ II部位を導入した。バンド３のＡＴＧのまわり
の配列は次の通りであった。
【０１３０】
【化１２】
【０１３１】以下に示すプライマー（ｂｔｔｎｔｅｒ
ｍ）を用いて、突然変異誘発を実施した。
【０１３２】
【化１３】
【０１３３】このプライマーを用いた突然変異誘発を、
ｐＭＯＮ５４２０内に含まれるＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子
に対して行なった。新たなＢｇｌ II部位を有するプラ
スミドをｐＭＯＮ９７８８と命名した。バンド３のこの
Ｂｇｌ II部位から始まり、ｐＭＯＮ９７８７の終止コ
ドンの末端部分のＢｇｌ II部位まで延びた切りつめら
れたＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子を、以下のようにしてｐＭ
ＯＮ８９３内に構築した。ｐＭＯＮ９７８８（図１３参
照）をＢｇｌ II及びＸｂａ Ｉで消化し、約１２５０ｂ
ｐの断片を単離した。この断片は、バンド３のＡＴＧか
ら、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子の中間にある非反復Ｘｂａ
Ｉ部位に渡っている。ｐＭＯＮ９７８７もＢｇｌ IIと
Ｘｂａ Ｉで消化し、約５５０ｂｐの断片を単離した。
この断片は、毒素遺伝子の中間にある非反復Ｘｂａ Ｉ
部位から、終止コドンの末端部分のＢｇｌ Ｉ部位に渡
っている。この２つの断片を混合し、Ｂｇｌ IIで消化
したｐＭＯＮ８９３に連結した。毒素遺伝子の５′末端
がエンハンスされたＣａＭＶ３５ｓプロモーターに隣接
したプラスミドを同定し、これをｐＭＯＮ９７９２と命
名した。ｐＭＯＮ９７９２は、バンド３のみをコードす
る、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子のＮ末端を切りつめた誘導
体を含んでいる（図１３参照）。
【０１３４】ｐＭＯＮ９７９１とｐＭＯＮ９７９２の両
者を、無害化Ｔｉプラスミドを保持するA.tumefaciens
株ＡＣＯに導入した。コインデクレイトしたものを選択
し、トマトとポテトの形質転換に用いた。
【０１３５】ＡＣＯは、Ｆｒａｌｅｙら（１９８５）に
よって報告されたｐＴｉＢ６ＳＥと同様に、無害化され
た株である。ＡＣＯを構築するために、ノパリン型Ｔｉ
プラスミドを保持するＡ２０８株をＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍの出発株として用いた。Ｔ−ＤＮＡのレフトボ
ーダーとレフトボーダー内の２，３百個の塩基対以外は
本質的にすべてのＴ−ＤＮＡを除去するため、Ｆｒａｌ
ｅｙら（１９８５）によって報告されたと同じ方法に従
って、Ｔｉプラスミドを無害化した。Ｔ−ＤＮＡのライ
トボーダーの終わりまで延びたＴ−ＤＮＡの残りの領域
を、ｐＢＲ３２２のセグメント、プラスミドＲＫ２から
得たｏｒｉ Ｖ領域及びＴｎ６０１から得たカナマイシ
ン耐性遺伝子を含む（左側から右側にかけて）新たなＤ
ＮＡ断片と置換した。ｐＢＲ３２２とｏｒｉ Ｖセグメ
ントは、ｐＭＯＮ８９３のセグメントと同様であり、コ
インテグレイトを起こすための相同領域を与えるもので
ある。ＡＣＯ Ｔｉプラスミドの構造を図１７に示し
た。
【０１３６】ＭＡＳプロモーターを用いたキメラＢ．
ｔ．ｔ．毒素遺伝子 ＭＡＳプロモーターを、１．５ｋｂ ＥｃｏＲ Ｉ−Ｃｌ
ａ Ｉ断片としてｐＴｉＡ６から単離した。このＤＮＡ
断片は、Ｂａｒｋｅｒら（１９８３）の配列の２０，１
３８番目のヌクレオチドのＣｌａ Ｉ部位から、２１，
６３１番目のヌクレオチドのＥｃｏＲ Ｉ部位に渡って
いる。図１５に示したように、ＥｃｏＲＩ−Ｃｌａ Ｉ
断片を、あらかじめＥｃｏＲ ＩとＣｌａ Ｉで消化した
バイナリーベクターｐＭＯＮ５０５（Horschら、1986）
に連結した。得られるプラスミドをｐＭＯＮ７０６と命
名した。ＮＯＳ３′末端を含む断片を、ＭＡＳプロモー
ターの下流に挿入してＭＡＳ−ＮＯＳ３′発現カセット
ベクターを得た。ＮＯＳ３′断片を、３００ｂｐ Ｂｇ
ｌ II−ＢａｍＨ Ｉ断片としてｐＭＯＮ５３０から切り
出し、Ｂｇｌ IIで消化したｐＭＯＮ７０６に挿入し
た。得られるプラスミドをｐＭＯＮ７０７と命名した。
【０１３７】プラスミドｐＭＯＮ５３０は、ｐＭＯＮ２
００をＮｄｅ Ｉで開裂して９００ｂｐ Ｎｄｅ Ｉ断片
を除去してｐＭＯＮ５０３を作成することによって構築
される。プラスミドｐＭＯＮ５０３をＨｉｎｄ III及び
Ｓｍａ Ｉで開裂し、あらかじめＨｉｎｄ IIIとＳｍａ
Ｉで開裂せしめたプラスミドｐＴＪＳ７５（Schmidhaus
erとHelinski、1985）と混合した。ｐＭＯＮ５０３の８
ｋｂ Ｈｉｎｄ III−Ｓｍａ Ｉ断片に結合したｐＴＪ
Ｓ７５の３．８ｋｂ Ｈｉｎｄ III−ＳｍａＩ断片を含
むプラスミドを単離し、ｐＭＯＮ５０５と命名した。次
いで、ｐＭＯＮ３１６をＳｔｕ ＩとＨｉｎｄ IIで開裂
して、ＮＯＳ−ＮＰＴ II′−ＮＯＳマーカーとＣａＭ
Ｖ３５Ｓ−ＮＯＳ３′カセットとを含む２．５ｋｂ Ｓ
ｔｕＩ−Ｈｉｎｄ III断片を単離することによって、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ３′カセットをｐＭＯＮ５０５に
移した。これを、Ｓｔｕ ＩとＨｉｎｄ IIIで開裂した
ｐＭＯＮ５０５に加えた。連結、形質転換に続いて、ｐ
ＭＯＮ５０５内にＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ３′カセット
を保持するプラスミドを単離し、これをｐＭＯＮ５３０
と命名した。
【０１３８】コインテグレイティングベクターに比べ
て、バイナリーベクターはトマトでの形質転換頻度がか
なり減少するため（McCormickら、1986）、ＭＡＳ−Ｎ
ＯＳ３′カセットをｐＭＯＮ７０７からコインテグレイ
ティングベクターｐＭＯＮ２００（Fraleyら、1985）に
移した。プラスミドｐＭＯＮ２００をＳｔｕ ＩとＨｉ
ｎｄ IIIで消化し、アガロースゲル電気泳動によって
７．７ｋｂ断片を単離した。プラスミドｐＭＯＮ７０７
を同様にしてＳｔｕ ＩとＨｉｎｄ IIIで消化し、アガ
ロースゲル電気泳動次いで１Ｍ ＮａＣｌで溶出するこ
とによってＤＥＡＥ膜上に回収することにより、ＭＡＳ
−ＮＯＳ３′カセットを含む３．５ｋｂ Ｓｔｕ Ｉ−
Ｈｉｎｄ III断片を単離した。２つのＤＮＡ断片を連結
し、得られるプラスミドをｐＭＯＮ９７４１と命名した
（図１５）。このプラスミドは、ｐＭＯＮ２００コイン
テグレイティングバックグランド中にＭＡＳ−ＮＯＳ
３′カセットを含んでいる。
【０１３９】ｐＭＯＮ９７９１あるいはｐＭＯＮ９７９
２をＢｇｌ IIで消化し、毒素をコードする断片を回収
し、本明細書に記載した方法に従ってこの断片をｐＭＯ
Ｎ９７４１に導入して、ＭＡＳプロモーターによって誘
導させるキメラＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子を構築した。
【０１４０】これらの中間体ベクターを用いて植物を形
質転換し、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋白に対して感受性を示す
甲虫類に対して毒性を発揮せしめることもできる。
【０１４１】植物での甲虫類毒素遺伝子の発現 トマト植物の形質転換 Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ｐＭＯＮ９７５３−ＡＳ
ＥとｐＭＯＮ９７５７−ＡＳＥを用いて、ＭｃＣｏｒｍ
ｉｃｋら（１９８６）の方法に従って、トマトの葉ディ
スクを形質転換した。形質転換トマト植物を、ＭｃＣｏ
ｒｍｉｃｋらの方法に従って回収し、カナマイシン耐性
についてアッセイした。
【０１４２】トランスジェニックトマト植物の昆虫毒性 コロラドポテト甲虫（Leptinotarsa decemlineata）を
用いたバイオアッセイにより、ｐＭＯＮ９７５３内に保
持されたＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子で形質転換されたトマ
ト植物について、毒素遺伝子の発現を分析した。分析す
べきトマト植物から切り取った葉を、水を含ませたフィ
ルターペーパーが入ったペトリ皿に入れた。１０匹ある
いは２０匹の新たに孵化したポテト甲虫をこれに入れ
て、葉を餌として食べるようにした。４日後に死亡した
甲虫を調べた。更に、成長が遅れた（気絶した）甲虫に
ついても調べ、また葉についても、餌として食べた時に
ダメージを与える毒性が残っているか否かを調べた。
【０１４３】それぞれの実験において、コントロールと
して多くの非形質転換植物が含まれていた。５０から１
００個の非形質転換植物をコントロールとしてアッセイ
した。これらのコントロール植物で、８０％以上の植物
がポテト甲虫を殺すことが出来ず、約１５％の植物がポ
テト甲虫を１０％殺し、５％またはそれ以下の植物がポ
テト甲虫を２０％殺した。２０％より多くポテト甲虫を
殺すコントロール植物は見当らなかった。
【０１４４】表VIに示したように、非形質転換コントロ
ール植物よりも高レベルのコロラドポテト甲虫死亡率を
有するいくつかの植物が回収された。これらの結果か
ら、植物を餌として食べた時に有意に多数の昆虫を殺す
に十分なレベルでＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子が発現されて
いることが判る。
【０１４５】
【表６】
【０１４６】ポテトでの甲虫類遺伝子の発現 ＭＳメジャー及びマイナー塩、０．１７ｇ／ｌリン酸２
水素ナトリウム、０．４ｍｇ／ｌチアミン−ＨＣｌ、
０．１ｇ／ｌイノシトール、３％シュクロース、２．０
ｇ／ｌ Gelrite（Kelco Co.）（ｐＨ５．６）を含む培
地で、ポテト変種Ｋｅｎｎｅｂｅｃの新芽の先端を継代
培養した。培養液を２４℃で１６時間光を照射して４週
間生育せしめた。茎の節間を約８ｍｍの長さに切って、
切った表面をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ｐＭＯＮ９
７５３−ＡＳＥで塗り付けた。この株はＬＢ寒天上に塗
布して２乃至３日間生育させたものである。前記した如
くｐＭＯＮ９７５３−ＡＳＥは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーターによって誘導されるキメラＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝
子を含んでいる。また他の方法として、キメラＢ．ｔ．
ｔ．毒素遺伝子を保持するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
株ｐＭＯＮ９７９１−ＡＣＯまたはｐＭＯＮ９７９２−
ＡＣＯを用いた。茎の切断部分を、Ｊａｒｒｅｔら（１
９８０）の方法と同じように塩と有機物を含み更に３％
シュクロース、３ｍｇ／ｌ ＢＡおよび０．１ｍｇ／ｌ
ＮＡＡ（ｐＨ５．６）を含む０．８％寒天で固化した培
地上に置いた。４日後、この茎を、同じ組成ではあるが
５００ｍｇ／ｌカルベニシリンと形質転換植物細胞の選
択試薬としての１００ｍｇ／ｌカナマイシンを含む培地
に移した。４週間後、再び、同じ組成ではあるが唯一の
ホルモンとして０．３ｍｇ／ｌ ＧＡ３を含む培地に移
した。１００ｍｇ／ｌカナマイシンの存在下で発達せし
めたカルスは、ポテト細胞が形質転換されたことを示す
ドットブロットアッセイでテストしたところ、ＮＰＴ I
I酵素を含んでいることが判った。非接種のコントロー
ル組織は１００ｍｇ／ｌカナマイシンの存在下では抑制
された。形質転換ポテト組織はＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子
を発現した。Ｂ．ｔ．ｔ．毒素ｍＲＮＡはノーザン分析
によって検出することができ、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋白は
ウエスタンブロット分析などのイムノアッセイによって
検出することができる。しかしながら、多くの場合、
Ｂ．ｔ．ｔ．毒素の存在を分析する最も感度の良いアッ
セイ法は昆虫バイオアッセイである。形質転換組織を食
べたコロラドポテト甲虫の幼虫は、毒素の効果によるダ
メージを受けた。
【０１４７】カナマイシン耐性形質転換ポテト細胞を作
成するこの方法は、新芽を再生するのにも使用すること
ができた。１から２ｃｍの長さの新芽を外植片より取
り、新芽が容易に根付くことのできる前記した新芽の先
端を維持するのに用いた培地上に置いた。
【０１４８】この方法で作成された植物について、ＮＰ
ＴＩＩ酵素の発現をアッセイしまたカナマイシンを含む
培地上でその茎の部分がカルスを形成することができる
か否かを調べることによって、形質転換されたかどうか
をテストした。形質転換した植物はＢ．ｔ．ｔ．毒素遺
伝子を発現した。Ｂ．ｔ．ｔ．毒素ｍＲＮＡはノーザン
分析によって検出することができ、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋
白はウエスタンブロット分析などのイムノアッセイによ
って検出することができる。形質転換組織を食べたコロ
ラドポテト甲虫の幼虫は、毒素の効果によるダメージを
受けた。
【０１４９】ワタでの甲虫類毒素の発現 ワタの種子を、Sparkleen soapを加えた洗浄剤水溶液に
１０分間浸し、４００ｍｌ当たり２滴のＴｗｅｅｎ ２
０を含む３０％ Ｃｈｌｏｒｏｘ溶液中で２０分間撹拌
し、次いで滅菌蒸留水で２回リンスすることによって、
ワタの種子の表面を滅菌した。次いで、種子を０．４％
ベノレート（ｂｅｎｏｌａｔｅ）に１０分間浸した。ベ
ノレートを流出させ、次いで寒天で固化した半分の強度
のＭＳ塩上に無菌的に種子を置いた。暗所中で３２℃で
種子を３−１０日間発芽させた。次いで、子葉と胚軸を
無菌的に取り、切断した。この断片を、１）３％グルコ
ース、２ｍｌ／ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及び１ｍｇ
／ｌカイネチンを含む寒天で固化したＭＳ培地（ＭＳＳ
培地）または２）３％グルコース、Ｂ５ビタミン、１０
０ｍｇ／ｌイノシトール、０．７５ｍｇ／ｌ ＭｇＣｌ
２、０．１ｍｇ／ｌジクロロフェノキシ酢酸（２，４−
Ｄ）及び０．１もしくは０．５ｍｇ／ｌカイネチンを含
むＧｅｌｒｉｔｅで固化したＭＳ培地（ＭＳＴ培地）上
に置いた。胚形成が始まるまで、カルスをこれらいずれ
かの培地上に２８℃で１６／８光照射して維持した。グ
ルコースの変わりに３％シュクロースを含む以外は最初
に用いたと同じ培地上に、胚形成サブカルチャーを置い
た。０．７５ｇ／ｌ ＭｇＣｌ２は含むが植物成長調節
剤を含まないＧｅｌｒｉｔｅで固化したＳｔｅｗａｒｔ
培地に移して、体性胚を発芽させた。発芽した胚を、成
長し続けることのできる成長チャンバー中の土壌に移し
た。次いで、種子を発育させ花を咲かせるために植物を
グリーンハウスに移した。
【０１５０】ワタ組織の形質転換、及び形質転換カルス
と植物の産生は以下のようにして行なった。植物再生用
に無菌苗木を調製した。子葉と胚軸断片に、１晩液体培
養したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養液または栄養プ
レート上で生育せしめたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを
接種した。1／10濃度のＭＳ塩を含むＭＳＳまたはＭＳ
Ｔ培地上で２〜３日間外植片を培養した。外植片をフィ
ルターペーパー上にブロットして過剰のバクテリアを除
き、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン及び３０−１００ｍ
ｇ／ｌカナマイシンを含むＭＳＳまたはＭＳＮ培地上に
プロレートした。形質転換されたカルスはこの培地上で
生育し、胚を産生する。この胚を生育せしめて再生植物
とする。この植物について、ＮＰＴＩＩの発現をアッセ
イすることにより形質転換されたかどうかをテストし
た。
【０１５１】形質転換に用いたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ株がｐＭＯＮ９７５３、ｐＭＯＮ９７９１、ｐＭＯ
Ｎ９７９２などのキメラＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子を保持
している場合には、形質転換カルス、このカルスから誘
導される胚及びこの胚から誘導させる形質転換植物にお
いてＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子が発現される。これらすべ
ての場合において、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素ｍＲＮＡの発現は
ノーザン分析によって検出することができ、Ｂ．ｔ．
ｔ．毒素蛋白の発現はウエスタンブロット分析などのイ
ムノアッセイによって検出することができる。毒素蛋白
の存在を測定する最も感度の良い方法は昆虫バイオアッ
セイである。
【０１５２】カルス、胚あるいは植物の昆虫毒性を、ワ
タミハナゾウムシの幼虫（Anthonomous grandis）を用
いたバイオアッセイにより調べた。Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺
伝子を発現している形質転換ワタの細胞または植物を食
べたワタミハナゾウムシは毒素の効果によるダメージを
受けた。
【０１５３】トウモロコシでの甲虫類毒素遺伝子の発現 以下に、トウモロコシからのプロトプラストの調製、エ
レクトロポレーションによるキメラＢ．ｔ．ｔ．毒素遺
伝子のプロトプラストへの導入、及びキメラＢ．ｔ．
ｔ．毒素遺伝子を発現するカナマイシン耐性安定形質転
換トウモロコシ細胞の回収についての概略を述べる。
【０１５４】トウモロコシプロトプラストの調製 Ｆｒｏｍｍら（１９８５及び１９８６）の方法に従い、
Black Mexican Sweet（ＢＭＳ）トウモコシサスペンジ
ョン系ＢＭＳＩ（ＡＴＣＣ５４０２２）からプロトプラ
ストを調製した。ＭＳ塩、２０ｇ／ｌシュクロース、２
ｍｇ／ｌ（２，４−ジクロロフェノキシ）酢酸、２００
ｍｇ／ｌイノシトール、１３０ｍｇ／ｌアスパラギン、
１．３ｍｇ／ｌナイアシン、０．２５ｍｇ／ｌチアミ
ン、０．２５ｍｇ／ｌピリドキシン、０．２５ｍｇ／ｌ
パントテン酸カルシウム、ｐＨ５．８を含むＢＭＳ培地
でＢＭＳＩ懸濁細胞を生育せしめた。１２５ｍｌエルレ
ンマイヤーフラスコ中に培養液４０mlを入れて２６℃で
１５０ｒｐｍで振とうした。等量の新たな培地で３日ご
とに培養液を希釈した。新たな培地添加１−２日後の活
発に生育する細胞からプロトプラストを単離した。プロ
トプラストを単離するに際しては、振とう容器テーブル
トップ遠心機で２００×ｇで細胞を遠心してペレット化
した。上澄を、プロトプラストを培養するためのならし
培地として使用するため取っておいた。１％セルロー
ス、０．５％ヘミセルロース及び０．０２％ペクチナー
ゼを含む０．２Ｍマニトール／５０ｍＭ ＣａＣｌ２／
１０ｍＭ酢酸ナトリウム４０ｍｌに細胞６ｍｌを再懸濁
した。２６℃で２時間インキュベーション後、プロトプ
ラストを６０μｍナイロンメッシュスクリーンで濾過し
て分離し、２００×ｇで遠心し、酵素を含まない以外は
同様の溶液で１回洗浄した。
【０１５５】エレクトロポレーションを用いた、Ｂ．
ｔ．ｔ．毒素遺伝子ＤＮＡベクターによるトウモロコシ
プロトプラストの形質転換 ２ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．１、４ｍＭ塩化カルシ
ウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．２Ｍマニトー
ルを含む溶液中で洗浄して、エレクトロポレーション用
のプロトプラストを調製した。洗浄後、１ｍｌ当たり４
×１０６プロトプラストの濃度で、プロトプラストを同
じ溶液に再懸濁した。溶液を含むプロトプラストの半分
を、スーパーコイルプラスミドベクターＤＮＡ５０マイ
クログラムを含む同じ溶液０．５ｍｌと混合し、１ｍｌ
エレクトロポーレーションキュヴェットに入れた。Ｆｒ
ｏｍｍら（１９８６）の方法に従ってエレクトロポレー
ションを実施した。２００ｖに荷電した１２２または２
４５マイクロＦａｒａｄコンデンサーから電気パルスを
出した。４℃で１０分間、室温で１０分間後に、ＭＳ
塩、０．３Ｍマニトール、２％シュクロース、２ｍｇ／
ｌ ２，４−Ｄ、２０％ならしＢＭＳ培地（前記参照）
及び０．１％低融点アガロースを含む培地８ｍｌでプロ
トプラストを希釈した。暗所で２６℃で２週間放置後、
マニトールは含まないがカナマイシンを含む培地を加え
て、カナマイシンの終濃度を１００ｍｇ／ｌとした。更
に２週間後、培養液からマイクロカルスを取り、１００
ｍｇ／ｌカナマイシンを含むアガロースで固化した培養
上のメンブレンフィルターディスクの上に置いた。形質
転換トウモロコシ細胞で構成されるカナマイシン耐性カ
ルスが１−２週間後に現われた。
【０１５６】トウモロコシ細胞でのＢ．ｔ．ｔ．毒素遺
伝子の発現 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｎｐｔ IIコード領域及
びＮＯＳ３′末端から構成されるキメラカナマイシン耐
性遺伝子を含むＤＮＡベクターでエレクトロポレーショ
ン後、カナマイシンを含む培地で生育した細胞を選択す
ることによって、形質転換トウモロコシ細胞を選択する
ことができる（Ｆｒｏｍｍら（１９８６）の方法）。ｐ
ＭＯＮ９７９１とｐＭＯＮ９７９２がこのようなキメラ
ＮＰＴ II遺伝子を含み、またキメラＢ．ｔ．ｔ．毒素
遺伝子を含んでいる。上記したように、ｐＭＯＮ９７９
１またはｐＭＯＮ９７９２のベクターを用いて、エレク
トロポレーションによりトウモロコシプロトプラストを
形質転換した。カナマイシン耐性に基づいて選択後、形
質転換トウモロコシ細胞についてＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝
子の発現をアッセイした。ノーザンブロット分析により
Ｂ．ｔ．ｔ．ｍＲＮＡの分析を実施し、ウエスタンブロ
ット分析などのイムノアッセイによってＢ．ｔ．ｔ．毒
素蛋白を分析した。
【０１５７】サザーンコーン根食い虫の幼虫（Diabroti
a undecimpunctata howardi）に形質転換トウモロコシ
カルスを与えることによって昆虫毒性のアッセイを実施
した。また、形質転換トウモロコシ細胞から、Ｂ．ｔ．
ｔ．毒素蛋白を含む蛋白抽出物を調製し、この抽出物を
適当な餌に加えて、サザーンコーン根食い虫の幼虫に与
えることによってアッセイすることもできる。形質転換
カルスあるいはこのようなカルスの蛋白抽出物を食べた
根食い虫の幼虫は、毒素の効果によりダメージを受け
た。
【０１５８】以上に述べた例は、本発明の実施をよりよ
く説明するために述べたものであって、本発明の範囲を
限定するためのものではない。本発明の範囲及び精神を
逸脱して、本発明の改良を行なうことは当業者にとって
不可能であることが理解されよう。
【０１５９】引用文献 Abbott, W.S. (1925), J. Econ. Entomol. 18：265-26
7． Adang, M.J., Staver, M.J., Rocheleau, T.A., Leight
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8． M13 Cloning and Sequencing Handbook, Amersham Corp
oration Cat. # N 4502．
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子の単離に用いたＤＮＡ
プローブを示す。Ａは、Ｂ．ｔ．ｔ．毒素のピークＡと
ＢのＮ末端蛋白配列及び推定ＤＮＡ配列を示す。Ｂは、
アミノ酸１−６にも基づいた３２倍に縮退した１７マー
（ｍｅｒ）の合成Ａ１プローブを示す。Ｃは、アミノ酸
８−１３に基づいた４８倍に縮退した１７マーの合成Ａ
２プローブを示す。
【図２】プラスミドｐＭＯＮ５４３２の構築工程を示
す。
【図３】ｐＭＯＮ５４２０及びｐＭＯＮ５４２１におけ
る毒素遺伝子をコードする３．０ｋｂ ＨｉｎｄIII断
片の、ｐＵＣ１１９マルチリンカーについての方向を示
す。ＢはＢａｍＨＩ、ＳａはＳａｌＩ、ＥはＥｃｏＲ
Ｉ、ＳｃはＳａｃＩ、ＨはＨｉｎｄIII、ＳｍはＳｍａ
Ｉ、ＫはＫｐｎＩ、ＳｐはＳｐｈＩ、ＰはＰｓｔＩ、Ｘ
はＸｂａＩを表す。
【図４】ｐＭＯＮ５４２０及びｐＭＯＮ５４２１に含ま
れるＢ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子の配列決定に用いた技術知
見を示す。
【図５Ａ】６４４個のアミノ酸毒素蛋白をコードする
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の１９３２ｂｐＯＲＦの制限酵素部
位の位置及びＤＮＡ配列を示す。
【図５Ｂ】６４４個のアミノ酸毒素蛋白をコードする
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の１９３２ｂｐＯＲＦの制限酵素部
位の位置及びＤＮＡ配列を示す。
【図５Ｃ】６４４個のアミノ酸毒素蛋白をコードする
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の１９３２ｂｐＯＲＦの制限酵素部
位の位置及びＤＮＡ配列を示す。
【図５Ｄ】６４４個のアミノ酸毒素蛋白をコードする
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の１９３２ｂｐＯＲＦの制限酵素部
位の位置及びＤＮＡ配列を示す。
【図５Ｅ】６４４個のアミノ酸毒素蛋白をコードする
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の１９３２ｂｐＯＲＦの制限酵素部
位の位置及びＤＮＡ配列を示す。
【図５Ｆ】６４４個のアミノ酸毒素蛋白をコードする
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の１９３２ｂｐＯＲＦの制限酵素部
位の位置及びＤＮＡ配列を示す。
【図５Ｇ】６４４個のアミノ酸毒素蛋白をコードする
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の１９３２ｂｐＯＲＦの制限酵素部
位の位置及びＤＮＡ配列を示す。
【図５Ｈ】６４４個のアミノ酸毒素蛋白をコードする
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の１９３２ｂｐＯＲＦの制限酵素部
位の位置及びＤＮＡ配列を示す。
【図５Ｉ】６４４個のアミノ酸毒素蛋白をコードする
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の１９３２ｂｐＯＲＦの制限酵素部
位の位置及びＤＮＡ配列を示す。
【図５Ｊ】６４４個のアミノ酸毒素蛋白をコードする
Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の１９３２ｂｐＯＲＦの制限酵素部
位の位置及びＤＮＡ配列を示す。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって観察されるＢ．
ｔ．ｔ．毒素のバンドを示す。Bacillus thuringiensis
var. tenebrionis とE.coli JM１０１(ｐＭＯＮ５４３
６、ｐＭＯＮ５４５６、ｐＭＯＮ５４５０、ｐＭＯＮ５
４６０)から産生されるＢ．ｔ．ｔ．蛋白を９％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離し、それぞれのパターンを示した。
【図７】Ｂ．ｔ．ｔ．毒素遺伝子から発現した、あるい
はｉｎ ｖｉｖｏで酵素的加水分解によって産生された
蛋白のＮ末端を示す。Ｂ．ｔ．ｔ．及び／又はＥ．ｃｏ
ｌｉから産生されるユニークなＢ．ｔ．ｔ．蛋白のＮ末
端をアミノ酸配列により測定した。矢印及びそれに付い
た番号は、図６に示した蛋白の最初のアミノ酸に対応し
ている。
【図８Ａ】毒素のＣ末端部分の臨界性を分析するために
用いた、Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の変換体を示す。図中に挿
入した配列は、変化したＢ．ｔ．ｔ．蛋白のアミノ酸配
列を示す。
【図８Ｂ】毒素のＣ末端部分の臨界性を分析するために
用いた、Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の変換体を示す。図中に挿
入した配列は、変化したＢ．ｔ．ｔ．蛋白のアミノ酸配
列を示す。
【図９Ａ】毒素のＮ末端部分の臨界性を分析するために
用いた、Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の変換体を示す。図中に挿
入した配列は、変化したＢ．ｔ．ｔ．蛋白のアミノ酸配
列を示す。
【図９Ｂ】毒素のＮ末端部分の臨界性を分析するために
用いた、Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子の変換体を示す。図中に挿
入した配列は、変化したＢ．ｔ．ｔ．蛋白のアミノ酸配
列を示す。
【図１０】Ｂ．ｔ．ｔ．毒素蛋白変異体を評価するため
に作成した欠失体を示す。
【図１１】プラスミドｐＭＯＮ９７５８、ｐＭＯＮ９７
５４及びｐＭＯＮ９７５３の構築工程を示す。
【図１２】プラスミドｐＭＯＮ９７９１の構築工程を示
す。
【図１３】プラスミドｐＭＯＮ９７９２の構築工程を示
す。
【図１４】植物形質転換カセットベクターｐＭＯＮ８９
３のプラスミドマップを示す。
【図１５】プラスミドｐＭＯＮ９７４１の構築工程を示
す。
【図１６】プラスミドｐＭＯＮ５４３６の構築工程を示
す。
【図１７】無害化Agrobacterium ACOのＴ−ＤＮＡ領域
を構成するエレメントを説明するものである。
【図１８】エンハンスされたＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
ーのＤＮＡ配列を示す。カッコで示した配列はエンハン
サー配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 ポール ブルノ ラブリック アメリカ合衆国ミズリー州カークウッド, フォーリスト アベニュー 1200 (72)発明者 シルビア アン マックファーソン アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，デイボット ドライブ 2301 (72)発明者 フレデリック ジョセフ パーラック アメリカ合衆国ミズリー州セント ルイ ス，クリムソン ドライブ 11035

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 甲虫類（Coleoptera）に対して毒性を発
    揮する遺伝子工学的に形質転換された単子葉植物の製造
    法であって； （ａ） 植物細胞のゲノムに、 （ｉ） 植物においてＲＮＡの産生を誘導するプロモー
    ター、 （ii） Bacillus thuringiensis var. tenebrionisの
    甲虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生を誘導す
    るＤＮＡ配列、及び （iii） 植物細胞において、ＲＮＡ配列の３′末端にポ
    リアデニル化ヌクレオチドの付加を誘導する３′非翻訳
    ＤＮＡ配列、を含むキメラ遺伝子を挿入し； （ｂ） 形質転換植物細胞を得；次いで （ｃ） 該形質転換植物細胞から、甲虫類に対して抵抗
    性を示す遺伝子工学的に形質転換された植物を再生す
    る；工程を含む上記製造法。
  2. 【請求項２】 甲虫類（Coleoptera）に対して毒性を発
    揮する遺伝子工学的に形質転換された植物の製造法であ
    って； （ａ） 植物細胞のゲノムに、 （ｉ） 植物においてＲＮＡの産生を誘導するプロモー
    ター、 （ii） Bacillus thuringiensis var. san diegoの甲
    虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生を誘導する
    ＤＮＡ配列、及び （iii） 植物細胞において、ＲＮＡ配列の３′末端にポ
    リアデニル化ヌクレオチドの付加を誘導する３′非翻訳
    ＤＮＡ配列、を含むキメラ遺伝子を挿入し； （ｂ） 形質転換植物細胞を得；次いで （ｃ） 該形質転換植物細胞から、甲虫類に対して抵抗
    性を示す遺伝子工学的に形質転換された植物を再生す
    る；工程を含む上記製造法。
  3. 【請求項３】 プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモ
    ーター、ＭＡＳプロモーター及びｓｓＲＵＢＩＳＣＯプ
    ロモーターからなる群より選ばれたプロモーターである
    請求項１又は２記載の製造法。
  4. 【請求項４】 甲虫類毒素蛋白をコードするＤＮＡ配列
    が、Bacillus thuringiensis var. tenebrionisから得
    たものである請求項１記載の製造法。
  5. 【請求項５】 プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモー
    ターである請求項３に記載の製造法。
  6. 【請求項６】 プロモーターがマンノピンシンターゼプ
    ロモーターである請求項３記載の製造法。
  7. 【請求項７】 ３′非翻訳ＤＮＡ配列が、大豆貯蔵蛋白
    遺伝子から得たものである請求項５記載の製造法。
  8. 【請求項８】 植物が、トマト、ポテト及びワタからな
    る群より選ばれるものである請求項２記載の製造法。
  9. 【請求項９】 （ａ） 植物においてＲＮＡの産生を誘
    導するプロモーター、 （ｂ） Bacillus thuringiensis var. san diegoの甲
    虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生を誘導する
    ＤＮＡ配列、及び （ｃ） 植物細胞において、ＲＮＡ配列の３′末端にポ
    リアデニル化ヌクレオチドの付加を誘導する３′非翻訳
    ＤＮＡ配列、を含むキメラ遺伝子。
  10. 【請求項１０】 プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロ
    モーター、ＭＡＳプロモーター及びｓｓＲＵＢＩＳＣＯ
    プロモーターからなる群より選ばれるものである請求項
    ９記載の遺伝子。
  11. 【請求項１１】 プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロ
    モーターである請求項１０記載の遺伝子。
  12. 【請求項１２】 プロモーターがマンノピンシンターゼ
    プロモーターである請求項１０記載の遺伝子。
  13. 【請求項１３】 ３′非翻訳ＤＮＡ配列が、大豆貯蔵蛋
    白遺伝子から得たものである請求項１１記載の遺伝子。
  14. 【請求項１４】 プロモーターが更にエンハンサー配列
    を含むものである請求項１１記載の遺伝子。
  15. 【請求項１５】 （ａ） 植物においてＲＮＡの産生を
    誘導するプロモーター、 （ｂ） Bacillus thuringiensis var. san diegoの甲
    虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生を誘導する
    ＤＮＡ配列、及び （ｃ） 植物細胞において、ＲＮＡ配列の３′末端にポ
    リアデニル化ヌクレオチドの付加を誘導する３′非翻訳
    ＤＮＡ配列、を含むキメラ遺伝子を保持した形質転換植
    物細胞。
  16. 【請求項１６】 プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロ
    モーター、ＭＡＳプロモーター及びｓｓＲＵＢＩＳＣＯ
    プロモーターからなる群より選ばれるプロモーターであ
    る請求項１５記載の細胞。
  17. 【請求項１７】 プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロ
    モーターである請求項１６記載の細胞。
  18. 【請求項１８】 プロモーターがマンノピンシンターゼ
    プロモーターである請求項１６記載の細胞。
  19. 【請求項１９】 ３′非翻訳ＤＮＡ配列が、大豆貯蔵蛋
    白遺伝子から得たものである請求項１７記載の細胞。
  20. 【請求項２０】 植物細胞が、トマト細胞、ポテト細
    胞、ワタ細胞及びトウモロコシ細胞からなる群より選ば
    れる植物細胞である請求項１５記載の細胞。
  21. 【請求項２１】 請求項１５記載の形質転換植物細胞を
    含む、感受性甲虫類に対して毒性を発揮する変異植物。
  22. 【請求項２２】 植物がトマトである請求項２１記載の
    植物。
  23. 【請求項２３】 植物がポテトである請求項２１記載の
    植物。
  24. 【請求項２４】 植物がワタである請求項２１記載の植
    物。
  25. 【請求項２５】 （ａ） 植物においてＲＮＡの産生を
    誘導するプロモーター、 （ｂ） Bacillus thuringiensis var. tenebrionisの
    甲虫類毒素蛋白をコードするＲＮＡ配列の産生を誘導す
    るＤＮＡ配列、及び （ｃ） 植物細胞において、ＲＮＡ配列の３′末端にポ
    リアデニル化ヌクレオチドの付加を誘導する３′非翻訳
    ＤＮＡ配列、を含むキメラ遺伝子を保持した形質転換単
    子葉植物細胞を含む、感受性甲虫類に対して毒性を発揮
    する変異植物。
  26. 【請求項２６】 請求項９記載のキメラ遺伝子を含む植
    物形質転換ベクター。
  27. 【請求項２７】 請求項１０記載の遺伝子を含む請求項
    ２６記載のベクター。
  28. 【請求項２８】 請求項１１記載の遺伝子を含む請求項
    ２６記載のベクター。
  29. 【請求項２９】 請求項１２記載の遺伝子を含む請求項
    ２６記載のベクター。
  30. 【請求項３０】 請求項１３記載の遺伝子を含む請求項
    ２６記載のベクター。
  31. 【請求項３１】 エンハンスされたＣａＭＶ３５Ｓプロ
    モーターが、−３４３から−９０に対応するエンハンサ
    ーＤＮＡ配列を含んでおり、明細書添付の第１８図に示
    す配列を有するものである請求項１４記載の遺伝子。
  32. 【請求項３２】 アミノ酸配列（１−６４４）を有する
    Bacillus thurigiensis var. san diego毒素蛋白。
  33. 【請求項３３】 Ｎ−末端の１５個のアミノ酸が除かれ
    ている請求項３２記載の毒素蛋白。
  34. 【請求項３４】 Ｎ−末端の４７個のアミノ酸が除かれ
    ている請求項３２記載の毒素蛋白。
  35. 【請求項３５】 Ｎ−末端の４８個のアミノ酸が除かれ
    ている請求項３２記載の毒素蛋白。
  36. 【請求項３６】 Ｎ−末端の５７個のアミノ酸が除かれ
    ている請求項３２記載の毒素蛋白。
  37. 【請求項３７】 Ｎ−末端の７６個のアミノ酸が除かれ
    ている請求項３２記載の毒素蛋白。
  38. 【請求項３８】 請求項３２記載の毒素蛋白をコードす
    る請求項９記載の遺伝子。
  39. 【請求項３９】 請求項３３記載の毒素蛋白をコードす
    る請求項９記載の遺伝子。
  40. 【請求項４０】 請求項３４記載の毒素蛋白をコードす
    る請求項９記載の遺伝子。
  41. 【請求項４１】 請求項３５記載の毒素蛋白をコードす
    る請求項９記載の遺伝子。
  42. 【請求項４２】 請求項３６記載の毒素蛋白をコードす
    る請求項９記載の遺伝子。
  43. 【請求項４３】 請求項３７記載の毒素蛋白をコードす
    る請求項９記載の遺伝子。
  44. 【請求項４４】 請求項２１記載の植物から産生される
    種子。
  45. 【請求項４５】 請求項２５記載の植物から産生される
    種子。
  46. 【請求項４６】 植物がトマトである請求項４４記載の
    種子。
  47. 【請求項４７】 植物がポテトである請求項４４記載の
    種子。
  48. 【請求項４８】 植物がワタである請求項４４記載の種
    子。
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