JPH09502343A - ハイブリッド毒素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、とりわけ、Ｃ−末端に、第一Ｃryタンパク質のドメインIIIもしくはそのドメインの一部またはドメインに実質的に類似のタンパク質を含む(ただし、フラグメントのＮ−末端領域は第二Ｃryタンパク質のＮ−末端領域もしくは領域の一部または領域に実質的に類似のタンパク質を含んでいる)Ｂ.ｔ.ハイブリッド毒素フラグメントを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ハイブリッド毒素 本発明はバチラス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性結晶タ ンパク質に由来する、ハイブリッド毒素フラグメント、およびそれらを含む毒素 に関する。 バチラス・スリンギエンシス(以後Ｂ.ｔ.という)は結晶として細胞内に蓄積す るタンパク質を生成することができる。これらの結晶タンパク質は多くの昆虫の 幼虫に対し毒性を有する。配列相同性と殺虫特異性に基づき、結晶タンパク質は 異なるクラスに類別されて来た。最も良く研究されているのは、１４０kDaプロ トキシンとして生成され、そして鱗翅目に活性を示すＣryＩクラスのタンパク質 である。 結晶タンパク質の活性形態はある程度まで解明されている。経口摂取後、結晶 は幼虫の中腸のアルカリ性環境下で溶解する。溶解されたタンパク質は、次いで 中腸プロテイナーゼにより処理されて約６５kDaのプロテイナーゼ耐性毒素フラ グメントとなり、昆虫の中腸の上皮細胞上のレセプターに結合し、細胞膜を通過 する。これは最終的に細胞破壊と幼虫の死滅をもたらす。 特定の結晶タンパク質の活性スペクトルは、感受性の昆虫の中腸上皮細胞上の レセプターの発生によって殆ど決定される。前記スペクトルは、結晶タンパク質 の溶解化効率およびそのインビボタンパク分解活性によって決定される。 中腸上皮レセプターに対する結晶タンパク質の結合の重要性は、昆虫が結晶タ ンパク質の一種に耐性を持つようになった場合に、耐性昆虫の中腸上皮細胞への 結晶タンパク質の結合が著しく減少していることによっても証明されている。 結晶タンパク質の毒素フラグメントは、三つの識別できる構造ドメインから構 成されていると考えられる。最もＮ−末端ドメインであるドメインＩは７つのα −螺旋からなっている。ドメインIIは３つのβ−シートから構成され、ドメイン III(最もＣ−末端)はβ−サンドイッチに折り畳まれている。仮にＣryＩ配列に 投影すれば、ドメインＩはアミノ酸残基約２８から２６０まで、ドメインIIは約 ２６０から４６０まで、そしてドメインIIIは約４６０から６００まで伸びてい る。 本発明はハイブリッド結晶タンパク質に関し、特にそれに限定するわけではな いが、ＣryＩＣおよびＣryＩＥまたはＣryＩＡを含むものである。Ｂ.ｔ.亜種エ ントモシダス６０.５に由来するＣryＩＣ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番 号１に与えれており、前記ヌクレオチド配列によってコード化されるタンパク質 の対応アミノ酸の配列は配列番号２に与えれている。Ｂ.ｔ.亜種ケニヤエ(kenya e)４ＦＩに由来するＣryＩＥ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３に与えれて おり、そして前記ヌクレチオチド配列によってコード化されるタンパク質の対応 アミノ酸の配列は配列番号４に与えられている。これらのタンパク質は鱗翅目に 対し毒性を示すが、しかしこの昆虫の目の範囲内でも各タンパク質は異なった特 異性を持っている。ＣryＩＣは特にタテハマキノメイガ(Ｓ.exigua)とヨトウガ( Ｍ.brassicae)に対し活性である。 本発明によって、第一Ｃryタンパク質のドメインIIIまたはそのドメインの一 部、もしくはそのドメインに実質的に類似するタンパク質を、Ｃ−末端に含むＢ .ｔ.ハイブリッドの毒素フラグメント(ただし、当該フラグメントのＮ−末端領 域は、第二Ｃryタンパク質のＮ−末端領域またはその領域の一部もしくはその領 域に実質的に類似するタンパク質である)が提供される。好ましいフラグメント は、ＣryＩＣのドメインIIIまたはドメインの一部もしくはこのドメインに実質 的に類似のタンパク質をＣ−末端に含む場合、昆虫腸内のＣryＩＣ結合部位と結 合しないもの、または、ＣryＩＡのドメインIIIまたはドメインの一部もしくは このドメインに実質的に類似のタンパク質をＣ−末端に含む場合、ＣryＩＡの結 合部位と結合しないものである。 「実質的類似」とは、本発明によるタンパク質の配列に少なくとも７５％類似 しているアミノ酸配列を持つ純タンパク質を意味する。好ましくは、類似度が少 なくとも８５％であり、より好ましくは少なくとも９０％であり、類似度が少な くとも９５％がさらに好ましい。 本発明に関する言葉の意味について、互いに少なくとも７５％、８５％、９０ ％または９５％類似の二つのアミノ酸配列とは、ギャップ(gaps)については、好 ましくは６ギャップまでを許容して(ただし、総計１５を超えないアミノ酸残基 が影響されるものとする。)、線列させた場合、同様の位置において少なくとも ７５％、８５％、９０％または９５％のアミノ酸残基が同様な位置で同一または 同類置換(conservative replacement)のアミノ酸残基を有する場合を言う。本発 明の目的のためには同類置換は、次のグループ内のアミノ酸の間でなされ得る； (ｉ)セリンとスレオニン； (ii)グルタミン酸とアスパラギン酸； (iii)アルギニンとリシン； (iv)アスパラギンとグルタミン； (ｖ)イソロイシン、ロイシン、バリンとメチオニン； (vi)フェニルアラニン、チロシンとトリプトファン； (vii)アラニンとグリシン； ただし、配列番号６において、ＳerとＴyrは６２０位で同類置換であり、Ａlaと Ｇluは６１８位で同類置換であり、配列番号８において、ＳerとＴyrは６２７位 で同類置換であり、ＡlaとＧluは６２５位で同類置換である。 タンパク質の「部分」または「一部」とは、当該タンパク質に含まれ、その連 続配列の少なくとも８０％を占めるペプチドを意味する。 「結合部位」とは、部位と毒素間の結合が可逆的であり、部位と毒素間のＫa が少なくとも１０⁴dm³mole^-1のオーダーである、分子上の部位を意味する。 毒素フラグメントは、Ｎ−末端に、”Ｃry”または”Ｃyt”として一般に知ら れている、Ｂ.ｔ由来の殺虫性タンパク質(ＣryＩＡ(ａ)、ＣryＩＡ(ｂ)、ＣryＩ Ａ(ｃ)、ＣryＩＢ、ＣryＩＣ、ＣryＩＤ、ＣryＩＥ、ＣryＩＦ、ＣryＩＧ、Ｃry ＩＨ、ＣryIIＡ、ＣryIIＢ、ＣryIIＣ、ＣryIIIＡ、ＣryIIIＢ、ＣryIIIＢ(ｂ) 、ＣryIVＡ、ＣryIVＢ、ＣryIVＣ、ＣryIVＤ、ＣＹＴＡ、ＣryＸ１(IIIＣ)、Ｃr yＸ２(IIIＤ)、ＣryＸ３、ＣryＶ、およびＣryＸ４を含む。)のＮ−末端領域ま たは当該領域の一部もしくは領域に実質的に類似のタンパク質を含み、フラグメ ントのＣ−末端はＣryＩＣのドメインIIIまたは当該ドメインの一部もしくは当 該ドメインに実質的に類似のタンパク質であってよい。 従って、このフラグメントはＣryＩＥ、ＣryＩＢ、ＣryＩＤまたはＣryＩＡの ドメインII、または当該ドメインの一部もしくは当該ドメインに実質的に類似す るタンパク質、およびＣryＩＣのドメインIIIまたは当該ドメインIIIの一部もし くは当該ドメインIIIに実質的に類似するタンパク質からなっていてもよい。フ ラグメントがＣryＩＥ、ＣryＩＢ、ＣryＩＤまたはＣryＩＡのドメインＩおよび IIまたはその一部もしくは前記ドメインに実質的に類似のタンパク質、およびＣ ryＩＣのドメインIIIまたはその一部もしくは前記ドメインIIIに実質的に類似す るタンパク質を含むものが特に好ましい。 毒素フラグメントが、ＣryＩＣのアミノ酸４５４位から６０２位までの配列、 または前記配列に実質的に類似の配列を含む領域を、Ｃ−末端に有するものが更 に好ましい。このフラグメントは、ＣryＩＣのアミノ酸４７８位から６０２位ま での配列または前記配列に実質的に類似の配列を含む領域を、Ｃ−末端に有して いてもよい(ただし、ＣryＩＣの４７８から６０２までのアミノ酸を含む配列が 、ＣryＩＡ、ＣryＩＢ、ＣryＩＤまたはＣryＩＥのドメインIIのＣ−末端に直接 融合している場合には、融合物の折りたたみ(folding)がフラグメントの殺虫性 成分を生ずるに十分であるものとする)。当業者は、ＣryＩＣのＣ−末端領域を 離して殺虫活性になるような方法で折たたまれることができるよう、ドメインII のＣ−末端にペプチド領域を付加することが必要であることを認識できるであろ う。 次のいずれかを含む本発明の毒素フラグメントが特に最も好適である： ｉ)配列番号６の約アミノ酸１から約アミノ酸６２０までのアミノ酸配列、また は配列中に少なくとも次の一つの改変がある配列番号６の約アミノ酸１から約ア ミノ酸６２０までのアミノ酸配列： ６０９位のＩleがＬeuで置換されている； ６１８位のＡlaがＧluで置換されている； ６２０位のＳerがＴyrで置換されている；または ii)配列番号８の約アミノ酸１から約アミノ酸６２７までの配列、または配列中 に少なくとも次の一つの改変がある配列番号８の約アミノ酸１から約６２７まで のアミノ酸配列： ６１６位のＩleがＬeuで置換されている； ６２５位のＡlaがＧluで置換されている； ６２７位のＳerがＴyrで置換されている。 しかしながら、どのようなアミノ酸改変が行われようとも、次の残基のひとつ またはそれ以上は、ＣryＩＣ配列に関し示された方向において、不変である：Ｐ he(501)；Ｖal(478)Ｔrp(479)およびＴhr(486)。 本発明はまた上記フラグメントを含むハイブリッド毒素、またはかかるハイブ リッド毒素に少なくとも８５％類似しており実質的に類似の殺虫活性、或いはレ セプター結合性能を持つ毒素を含む。 本発明はさらに、本発明の毒素フラグメントまたはハイブリッド毒素に少なく とも９０％同一である純タンパク質を含む。 本発明はさらに、上記の毒素またはそのフラグメントのアミノ酸配列を有する タンパク質をコード化した配列からなる組換えＤＮＡを含む。本発明はさらに配 列番号５の約ヌクレオチド１から約ヌクレオチド１８６０までの配列からなる組 換えＤＮＡ、または実質的に類似のタンパク質をコード化するそれに類似のＤＮ Ａ、または配列番号７の約ヌクレオチド１から約ヌクレオチド１８８１までの配 列からなる組換えＤＮＡ、または実質的に類似のタンパク質をコード化するそれ に類似のＤＮＡも含む。 類似のＤＮＡとは、本発明の組換え配列にハイブリッド形成できる試験配列を 意味する。試験または発明配列が二本鎖である場合、試験配列を構成する核酸は 、発明配列のそれの２０℃以内の熱変性温度(ＴＭ)を有するのが好ましい。試験 および発明配列が混合され同時に変性される場合には、配列のＴＭ値は相互に１ ０℃以内であることが好ましい。ハイブリッド形成は、より好ましくは、ストリ ンジェントな条件下で、試験または発明ＤＮＡを支持して行う。すなわち、変性 された試験または発明配列の何れかを好ましくは最初に支持体に結合させ、ハイ ブリッド形成を５０ないし７０℃の温度で、２強度の０.１％ＳＤＳ含有クエン 酸緩衝化生理食塩水中で所定時間かけて行い、次いで同温度ではあるがＳＣ濃度 を減らした緩衝液で支持体を洗浄する。必要なストリンジェント度(degree of s tr ingency)、即ち配列の類似度に依存して、希釈濃度緩衝液は典型的には０.１％ ＳＤＳを含む１(single)強度ＳＣ、０.１％ＳＤＳを含む１／２強度ＳＣ、およ び０.１％ＳＤＳを含む１／１０強度ＳＣである。最大類似度を持つ配列は、そ のハイブリッド形成が希釈濃度緩衝液中で洗浄によって最小の影響にとどめられ ているものである。試験および発明配列が、非常に類似し、それらの間のハイブ リッド形成が０.１％ＳＤＳを含む１／１０強度クエン酸ナトリウム緩衝液中で 洗浄またはインキュベーションによって実質的に影響を受けないのが特に好まし い。 組換えＤＮＡはさらに除草剤耐性、植物成長促進性、抗真菌性(anti-fungal) 、抗細菌性、抗ウイルス性、および／または耐線虫性(anti-nematode)を持つタ ンパク質をコード化することができる。ＤＮＡを異種生物中に導入する場合、既 知のmＲＮＡ不安定モチーフ(たとえばＡＴリッチな領域のような)およびポリア デニル化信号(polyadenylation signals)を取り除き、および／または組み換え ＤＮＡを挿入するべき生物に好適なコドンをが使用し、このように修飾されたＤ ＮＡが該生物内で、ハイブリッド毒素または毒素フラグメントのタンパク質成分 が内在性である生物において非修飾組み換えＤＮＡの発現により与えられるもの と実質的に類似のタンパク質を産生するように修飾されてもよい。 本発明は、本発明の組換えＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリッド 形成するものに対し相補性であるＤＮＡ配列をも含む。 更に本発明には次のものが含まれる：このような組換え(またはそれに相補性 である)ＤＮＡ配列を含んでいるベクター；このようなＤＮＡを含み、その発現 を可能にする植物または微生物；このようなＤＮＡで形質転換された植物；安定 に導入されそしてメンデル法則で遺伝的であるＤＮＡを含むこのような植物の子 孫および／またはこのような植物および子孫の種子。 本発明はさらに前記ＤＮＡの発現に由来するタンパク質、および形質転換され た植物中で組換え型ＤＮＡの発現によって造られた殺虫性タンパク質を含む。 本発明はさらに本発明の１またはそれ以上の毒素フラグメントまたはそれらか らなる毒素を含んでいる殺虫性組成物；このようなフラグメントまたは毒素また は組成物に昆虫を曝すことからなる昆虫を退治する方法、および、殺虫性タンパ ク質を含む有機物質を温浸し溶媒抽出することからなる抽出方法を含む。 本発明はさらに、添付の図面および配列表と共に、本発明のＢ.ｔ.ハイブリッ ド毒素の製造をのべる以下の記載からも明らかになるであろう。 第１図は、インビボ組換えを経るハイブリッド結晶タンパク質遺伝子の産生を 示している。二つの切断された結晶タンパク質遺伝子を直接反復配向(orientaio n)に有するタンデムプラスミド(pBD560およびpBD650)が構築されている。５'位 置の遺伝子(白抜き線(open bar))はプロトキシンコード化領域(実線(soid bar)) を欠いており、そして領域をコード化しているドメインＩの３'位置の遺伝子(破 線(dash bar))部分が欠失している。相同領域(ドメインIIおよびIII)間のイン ビボ組換えはrecＡ+菌種ＪＭ１０１で起きている。ＮotＩおよびＢamＨＩによる 消化による非組換えの選択およびこれに続く転位がハイブリッド結晶性タンパク 質をコード化する一組のプラスミドをもたらす。 第２図は、ＣryＩＥとＣryＩＣのアミノ酸残基の配列４２０から６３０を示し ている。ドメインIIとIIIの境界が示されている。ＣryＩＥと異なるＣryＩＣの アミノ酸残基だけ記載し、同一残基は点で示す。本発明のＣryＩＥ−ＣryＩＣの ハイブリッド毒素フラグメントの乗換え（Ｇ２７、Ｈ１３、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ１７ およびＨ２１）の位置を図面上に示す。 第３図は、ＣryＩＥおよびＣryＩＣのアミノ酸残基４２０から６３０の配列を 示している。ドメインIIおよびIIIの境界が示されている。ＣryＩＥと異なるＣr yＩＣのアミノ酸残基だけ記載しており、同一残基は点で示す。ＣryＩＣ−Ｃry ＩＥのハイブリッド毒素フラグメントの乗換え(Ｆ５９、Ｆ７１、Ｆ２６、およ びＥ７)の位置を図面上に示す。 第４図は、いくつかの異種の競合試験の結果を示す。ビオチニル化ＣryＩＣ( パネルＡ)およびＧ２７(パネルＢ)は示された過剰の非標識タンパク質の非存在 下または存在下でタテハマキノメイガ(S.exigua)ＢＢＭＶ小胞(vesicle)ととも にインキュベートする。インキュベート後、小胞を洗浄し、ＳＤＳポリアクリル アミドゲルに上に置き、さらにニトロセルロース膜にブロットする。小胞と共に 再 分離されたビオチニル化結晶タンパク質は、ストレプタビジン(streptavidin)− パーオキシダーゼ結合体を使って可視化され、これを図面上に矢印で示す。 第５図は、Ｇ２７ハイブリッド毒素フラグメントをコード化し、結晶性毒素マ イナス株Ｂ.t.５１を形質転換するために使われるpSB456のプラスミドマップを 示す。 配列番号１は、Ｂ.ｔ.亜種エントモシダス６０.５に由来するＣryＩＣ遺伝子 のヌクレオチド配列を示す。 配列番号２は、配列番号１に示されたＣryＩＣ遺伝子によってコード化された タンパク質のアミノ酸配列を示す。 配列番号３は、Ｂ.t.亜種ケニヤエ４ＦＩに由来するＣryＩＥ遺伝子のヌクレ オチド配列を示す。 配列番号４は、配列番号３に示されたＣryＩＥ遺伝子によってコード化された タンパク質のアミノ酸配列を示す。 配列番号５は、本発明の好適なＣryＩＥ／ＣryＩＣＢ.ｔ.ハイブリッド毒素フ ラグメントをコード化するヌクレオチド配列を示す。 配列番号６は、配列番号５に示されたヌクレオチドによってコード化されたタ ンパク質のアミノ酸配列を示す。 配列番号７は、本発明のＣryＩＡ／ＣryＩＣハイブリッド毒素フラグメントの ヌクレオチド配列を示す。 配列番号８は、配列番号７に記載されたヌクレオチドによってコード化された タンパク質のアミノ酸配列を示す。 ハイブリッド毒素フラグメントをコード化するプラスミドの生成 ＣryＩＣまたはＣryＩＥ遺伝子を担持するプラスミドの生成には、プラスミド 宿主として、ＪＭ１０１がrecＡ+バックグランドとして使用される場合を除き、 エシェリキア・コリ(Escherichia coli)ＸＬＩ−blue(Stratagene Inc.)が使用 される。エシェケリキア・コリにおける結晶タンパク質の発現のためのベクター はpKK233-2(Pharmacia LKB Biotechnology)に由来する。pKK233-2のサイズはテ トラサイクリン耐性をコード化する遺伝子を担持するＥcoＲＩ−ＰvuIIフラグメ ントを欠失することにより減少させる。次いで６bpＸhoＩリンカーがＨindIII部 位に連結されて(ligated)pBD10が得られる。プラスミドＫＢ＋はＢglIIリンカー をＢluescriptSK+(Stratagene Inc.)のＳacＩ部位に挿入して作られる。ＢglII からＸholIまでのＢＫ＋ポリリンカーはpBD10のＮcoＩ−ＸholI部位の間に導入 される。得られた発現ベクターpBD11は高度に発現されたtrcプロモーター、lac Ｚリボソーム結合部位およびＡＴＧ開始コドンを含む。この開始コドンはＮcol 部位と重複し、ポリリンカーが続き、ベクターへの挿入を容易にする。転写はrr nＢ転写ターミネーターによって停止する。 Ｂ.ｔ.亜種エントモシダス６０.５とケニヤエ４ＦＩにそれぞれ由来するＣry 等、１９９０(Appl.Environ.Microbiol.56、pp823-825)；Ｖisser等１９９０(J. Bacteriol.172、pp6783-6788))。クローニングの目的のためにＣryＩＣの出発コ ドンと重複しているＮcoＩ部位をインビトロ変異誘発によって作る。BglII部位 は部位指向性変異誘発によってＣryＩＣの翻訳停止コドンの下流に直接つくられ 、配列ＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴ(停止コドンはアンダーライン引き)が得られる 。ＣryＩＣコード化領域を含むＮcolＩ−ＢglIIフラグメントはpB11に連結され 、ＣryＩＣ発現プラスミドpBD150が得られる。pBD155はpBD150の誘導体であり、 ここでＣryＩＣのポリリンカー配列３'が欠失している。 完全ＣryＩＥ遺伝予を含むpEM14(Ｖisser等、１９９０)からのＤraＩフラグメ ントは、ＳＫ＋のＥcoＲＶ部位にクローン化され、プラスミドpEM15が得られる 。次いでＮcolＩ部位は部位指向性変異誘発によって遺伝子の開始コドンに導入 され、ＣryＩＥはＮcoＩ−ＸhoＩフラグメントとしてpBD11に移行し、ＣryＩＥ 発現プラスミドpBD160となる。 ＣryＩ遺伝子の領域をコード化している毒素フラグメントだけを担持するプラ スミドが構築される。ＢglIIリンカーはＣryＩＣの１８３５bp位に存在するＸmn Ｉ部位、およびＣryＩＥの１８３９位でＨgiＡＩ部位に連結される。次いで、毒 素フラグメントＣryＩＣ(１８３５bp)およびＣryＩＥ(１８３９bp)コード化領域 を含むＮcoＩ−ＢglIIフラグメントはpBD11に連結され、それぞれ以下に述べら れるようにpBD151とpBD161となる。 ＣryＩＣ−ＣryＩＥハイブリッド遺伝子の生成に使用されるタンデムプラスミ ドは次のようにして構築される。ＢamＨＩリンカーは、ＨpaＩで分解されたpBD1 60に連結される。このＤＮＡをＢamＨＩおよびＸhoIと一緒にインキュベートし 、７４０bpから伸びる切断されたＣryＩＥ遺伝子がpBD151に連結され、pBD560が 得られる。ＣryＩＥ−ＣryＩＣハイブリッドの生成のためのタンデムプラスミド を作るために、pBD155がＮsiＩおよびＸhoＩで消化される。２６６bpから伸びる 切断されたＣryＩＣ遺伝子を担持するフラグメントは、ＰstＩ／ＸhoＩ消化pBD1 61に連結され、プラスミドpBD650が得られる。ポリリンカー配列によって、特異 なＮotＩとＢamＨＩ制限部位が、タンデムプラスミドpBD560とpBD650間で切断さ れたＣryＩ遺伝子に存在する。 ＤＮＡ操作およびハイブリッド毒素の構築 全ての組換えＤＮＡ技術は、Ｓambrook等１９８９(Molecular Cloning，A Lab oratory Manual:Cold Spring Harbour Press，Cold Spring Harbour)に記述され ており、ＤＮＡ配列はジデオキシ三リン酸法によりジデオキシヌクレオチドに蛍 光色素を結合して実施される。分析はアプライドバイオシステムズ３７０Ａヌク レオチド配列分析器を使用することにより自動化する。 ＣryＩ遺伝子間に存在する相同性は、インビボ分子内組換えを許容する。二つ のタンデムプラスミドは、それぞれドメインIIとIIIのみで重複している切断さ れた結晶タンパク質遺伝子を担持することで生成される。従って、組換えはドメ インIIとIIIをコード化する領域内だけで起こる。制限酵素消化により選択され るフレーム組換えでは、フルサイズ１４０kDaハイブリッドプロトキシンを発現 するプラスミドを生成する。インビボ組換え体を生成するために、タンデムプラ スミド(pBD560またはpBD650のいずれか；第２図)がＪＭ１０１に転換される。５ μgのＤＮＡが個々に生成され組換え体から単離され、非組換え体に対して選別 するために二つの切断された遺伝子の間を切るＮotＩおよびＢamＨＩ消化し、こ のＤＮＡをエスケリチア・コリＸＬＩ−blueに形質転換する。５つの単独コロニ ーが成長しタンパク質様式とプラスミド含量が分析される。 ＣryＩＣ−ＣryＩＥおよびＣryＩＥ−ＣryＩＣハイブリッド毒素は前記のよう にそれぞれrecＡ＋バックグランドにおいて組み替えられたタンデムプラスミドp BD560およびpBD650を使用して生成され、ＤＮＡを単離し、分解し、そしてrecＡ −株形質転換する。 ２０の別の実験の１００コロニーをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。これらのク ローンの８５％は、それぞれＣryＩＣおよびＣryＩＥ、ならびにＣryＩＥおよび ＣryＩＣ間のフレーム組み替えを示唆する１４０kDaタンパク質を生成する。エ シェリキア・コリにおいては、ＣryＩタンパク質はインビトロで高ｐＨで溶解で きる結晶として生成する。上記のようにして生成されたハイブリッド毒素の約１ ５％は高ｐＨで溶解される。可溶性ハイブリッド毒素を生成する組み換え体は最 初に制限酵素を使用して分類され、次いで各クラスで選択されたハイブリッドの 乗り換え位置がＤＮＡ配列分析によって決定される。可溶性ハイブリッド毒素に 生じた全ての乗り換えはドメインIIIの中または近接して起きている。 タンパク質の精製および分析 結晶タンパク質は、基本的にConvents等(J.Biol.Chem.265,pp1369-1375;Eur.J .Biochem，195,pp631-635)に記述されている方法で単離する。簡単には、組み換 えエシェリキア・コリを３０℃でＴＢ培地２５０ml中で１０−１５のＯＤ₆₆₀ま で生育させる。エシェリキア・コリ溶菌物から単離された結晶は、３７℃で、２ ０mM Ｎａ₂ＣＯ₃、１０mMジチオスレイトール、１００mM ＮａＣｌ中で２時間 培養される間に溶解される。溶液のｐＨはＴris−ＨＣｌで８まで下げ、トリプ シンと共に培養する。毒素溶液を、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ，１００mM Ｎａ Ｃｌ ｐＨ９に対して透析する。次いで毒素フラグメントを、高速タンパク質液 体クロマトグラフィー(ＦＰＬＣ)システム(Pharmacia LKB Biotechnology)につ ながれているモノＱ５／５カラムで精製する。タンパク質を、７.５％ドデシル 硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。 生化学的分析および６５kDa毒素フラグメントの単離 精製ＣryＩＣ、ＣryＩＥおよびハイブリッドタンパク質の単離された結晶を高 ｐＨで可溶化し、トリプシンと共に培養する。ＣryＩＣやＣryＩＥのように、ド メインIIIで乗り換えしているすべての可溶性ハイブリッド毒素は安定な６５kDa に転換される。６５kDaフラグメントは、アニオン交換クロマトグラフィーで親 タンパク質と類似の条件下で精製できる。ドメインIIに乗り換えを持つハイブリ ッド体Ｆ５９とＦ７１は、トリプシンで完全に分解される。明らかに、これらの ハイブリッド体は不溶性凝集物として沈殿はしないけれども、親タンパク質に埋 まっているトリプシン開裂部位がトリプシンに曝されることになる。この現象の ためにＦ５９及びＦ７１から単離される６５kDaフラグメントはない。 第１表はそれらが由来するＣryＩＣおよびＣryＩＣタンパク質に関して、５Ｃ ryＩＥ−ＣryＩＣハイブリッド毒素(Ｇ２７、Ｈ８、Ｈ１７、Ｈ１３、Ｈ７およ びＨ２１)および４ＣryＩＣ−ＣryＩＥハイブリッド毒素(Ｆ５９、Ｆ７１、Ｆ２ ６、Ｅ７)の構造を示す。ＣryＩＥ−ＣryＩＣ毒素のアミノ酸配列は、ＣryＩＣ 親タンパク質のアミノ酸１１８９まで伸びている本発明の毒性フラグメントを含 む。ＣryＩＣ−ＣryＩＥハイブリッド毒素のアミノ酸配列は、ＣryＩＥ親タンパ ク質のアミノ酸１１７１まで伸びる。第１表は、ＣryＩＣおよびＣryＩＥタンパ ク質に関し、種々のハイブリッド毒素の相対的殺虫効力も示している。 第１表：親タンパク質に関するハイブリッド毒素の構造および毒性。殆どの生 物検定法は精製毒素フラグメントで行われた。ＣryＩＣの場合これらは約aa２８ から約aa６２７まで、ＣryＩＥの場合には６２１まで及ぶ。完全なプロトキシン の長さは括弧内に示した。 ＣryＩＣ／ＣryＩＥハイブリッド遺伝子生成物の昆虫毒性検定および殺虫性活 性 細菌培養液をＯＤ₆₆₀６.０まで濃縮し、１００μlを２４ウエル組織培養皿中 、２cm²人工食餌にスポットする。別法として精製毒素の希釈試料を食餌に適用 する。タテハマキノメイガとヨトウガまたはエム・セクスタ(M.sexta)のどれか の第２齢の幼虫を、この食餌(１６／サンプル希釈)で５日間飼育し、後で幼虫体 重を測定する。相対的成長(ＥＣ５０、５０％成長減少をもたらす濃度)を、毒素 をいれた食餌で成長した幼虫の平均体重と毒素をいれていない食餌で成長した対 照幼虫の体重との比率を計算することによって決定する。エム・セクスタの卵種 (e gg layer)はCarolina Biological Supply Company，North Carolina,US.から供 給される。 ハイブリッド遺伝子生成物によりコード化される毒性フラグメントは、前記の 様に３種類の異なった昆虫種に対する活性を試験する。エム・セクスタはＣryＩ ＣとＣryＩＥの両方に感受性である。トリプシンに対する感受性から予測される ように、ハイブリッド体Ｆ５９およびＦ７１はこの昆虫に対しては活性が無い( 第１表)。 Ｈ７がトリプシンで安定な６５kDaタンパク質に転換されてはいるが、エム・ セクスタに対しては毒性はない。第１表の他のハイブリット体のすべては毒性で あり、明らかに天然で生体学的に活性形態である。 ＣryＩＣのＤ６５kDaフラグメントは、タテハマキノメイガとヨトウガに対し ては強い毒性を示すがＣryＩＥは示さない。ドメインIIとドメインIIIの結合点 で乗り換えているＣryＩＥ−ＣryＩＣハイブリッドであるＧ２７(第１表；第２ 図)は、両方の昆虫に活性がある。これは、ＣryＩＣのドメインIIIが、タテハマ キノメイガとヨトウガに対して完全な活性を与える事を証明する。Ｇ２３とは単 に３つのアミノ酸残基(第３図参照)が違っているだけのハイブリッドＨ８は、エ ム・セクスタに対して活性であるが、りタテハマキノメイガとヨトウガに対して は活性でない。 Ｇ２７の相反(reciprocal)ハイブリッドであるＦ２６(第１表；第３図)は、Ｃ ryＩＣのドメインIIIがＣryＩＥのドメインIIIと交換されており、タテハマキノ メイガとヨトウガに対しては活性でない。明らかに、このタンパク質はエム・セ クスタに対しては毒性であるが、アミノ酸２８−４６２に及ぶＣryＩＣ配列はタ テハマキノメイガとヨトウガを殺すには不十分である。ＣryＩＣ配列がハイブリ ッド体(Ｅ７)においてアミノ酸残基６０２まで存在している場合に限って、これ らの昆虫に対する活性が回復される。本明細書は、ＣryＩＣの４７８−６０２に 由来するアミノ酸残基が、ＣryＩＥにタテハマキノメイガとヨトウガに対する高 い殺虫性を与えることを示している。 結晶タンパク質のビオチニル化および結合検定 ビオチニル化は、基本的に製造者(Amersham)によって記載されるように、ビオ チン−Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステルを使用して行われる。結晶タンパク 質１mgを５０mM ＮａＨＣＯ₃、１５０mM ＮａＣｌ、ビオチニル化試薬４０μl 中で、ｐＨ８で２０℃、１時間インキュベートする。この溶液を、０.１％ＢＳ Ａを含む同じ緩衝液で平衡化したセファデックス２５カラムに入れ、結合できな かったビオチンを分離し、このフラクションの試料をニトロセルロース膜にスポ ットする。ビオチニル化結晶タンパク質を含むフラクションを、ルミノールの酸 化を触媒するストレプタビジン−パーオキシダーゼ接合体(Amersham)で可視化し 、化学ルミネッセンス(ELC,Amersham)を得、貯蔵する。 刷子縁膜胞は、膜胞が０.１％トゥイン(Tween)−２０を含む単離緩衝液で一回 余計に洗浄される点を除き、Wolfersberger等により記述されている(１９８７)( Comp.Biochem.Physiol.86a，pp301-308)ように単離される。ビオチニル化結晶タ ンパク質の刷子縁膜胞(１００μg／ml)への結合は、１％ＢＳＡ、０.１％トゥイ ン−２０(ｐＨ７.６)を含むＰＢＳ１００μl中で行われる。膜胞(２０μg膜胞タ ンパク質)を、１０ng／ｌビオチニル化結晶タンパク質と、１０００倍過剰の非 標識結晶タンパク質の存在下または不存在下で、２０℃１時間インキュベートす る。次いでこの膜胞をエッペンドルフ遠心分離機で１４,０００ｇで１０分間遠 心分離して再単離し、結合緩衝液で２回洗浄し、試料緩衝液に再懸濁させ、加熱 変性し７.５％ポリアクリルアミドゲル上に乗せる。電気泳動後、タンパク質を ニトロセルロース膜にブロットし、次いで膜胞と共に再単離されている結晶タン パク質をビオチニル化し、ルミノールの酸化を触媒し、化学ルミネッセンス(ELC ,Amersham)を生ずる、ストレプタビジン−パーオキシダーゼ接合体(Amersham)と 、ニトロセルロースをインキュベートして可視化する。 上皮腸細胞への結合が結晶タンパク質の作用形態の重要な段階であるので、タ テハマキノメイガの刷子縁膜胞への結晶タンパク質の結合を異種競合実験で調べ る。競合実験は、標識化ＣryＩＣ(第４Ａ図、レーンａ)および標識化Ｆ２６(示 されていない)の結合は、過剰の非標識化ＣryＩＣ(レーンｂ)またはＦ２６(レー ンｅ)により打ち負かされる(outcompeted)が、過剰のＧ２７(レーンｃ)またはＣ ryＩＥ(レーンｄ)により打ち負かされないことを証明する。さらに、標識化Ｇ２ ７（第４Ｂ図、レーンａ）および標識化ＣryＩＥ(示されていない)は、過剰のＧ ２７(レーンｂ)またはＣryＩＥ(レーンｄ)により打ち負かされるが、過剰のＣry ＩＣ(レーンａ)またはＦ２６(レーンｅ)により打ち負かされない。これらの結果 から、Ｇ２７およびＣryＩＥはタテハマキノメイガの中腸膜上の同一の結合部位 を認識し、しかもＣryＩＣおよびＦ２６によって認識される部位はこれと異なる ことが結論付けられる。毒性と結合検定法を組み合わせて、Ｇ２７はＣryＩＣと 同様に毒性であるが、しかしそれと異なるレセプターに結合することを証明して いる。昆虫は、結晶タンパク質に対する耐性をレセプター結合特性を変えること で発達させることができるので、ＣryＩＣの代替物としてＧ２７は耐性管理プロ グラムに使用することができる。 異種システムにおけるＣryＩＥ／ＣryＩＣハイブイッド毒素遺伝子の発現 Ｇ２７ＣryＩＥ／ＣryＩＣハイブリッド毒素遺伝子をエシェケリキア・コリに 発現し、遺伝子生成物はＣryＩＣと少なくとも同一の殺虫活性を(少なくともス ポドプテラ(spodoptera)に対して)を示す。さらに、前述の生成物はバチラス・ スリンギエンシス株に(後記参照)に発現された場合には、増強されたこのような 活性を示す。Ｇ２７ハイブリッド毒素をコード化しているこの遺伝子は、適当な シャトルベクターシステムに導入され、その後適切なＢ.ｔ.宿主に導入される。 このような形質転換細胞を培養し、得られる全培養物および精製結晶の殺虫性を 検定する。 シャトルベクターを含むＧ２７の構築、Ｂｔ５１の形質転換および得られる毒 素タンパク質の精製 ハイブリッドＧ２７コード化している遺伝子(３.４kbb)を、pKK233エシェケリ キア・コリ発現プラズミドからＮcolおよびＸholを用いて切断する。Ｘhol部位 をエシェケリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを使って 満たす。得られたフラグメントをＮcoＩ／Ｓma１消化pSB635(pBluescriptKS+,P_{c ryIC} 、およびＣryＩＡ(ｃ)転写ターミネーター)に連結する。得られたプラスミ ド、pSB453はＡpalおよびＮotlで分解されプロモーターを担持する４.２kbpのフ ラグメント、ハイブリッドＧ２７orfおよびターミネーターを生ずる。このフラ グメントを、Ｎcol／Ｓmal消化pSB634(pＢＣ１６.１およびpBluescriptKS+を含 む)に分解されpSB456(第５図参照)を生ずる。エシェケリキア・コリＤＨ１０Ｂ から単離されたプラスミドＤＮＡは、結晶毒素マイナスＢ.ｔ.菌種、ＢＴ５１を 形質転換するために使われる。陽性単離物はテトラサイクリン耐性であり、pSB4 56の存在を示し、そして１３５kDaタンパク質(ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定さ れているように)に相当する大きな封入体を含む。Ｇ２７ハイブリッド毒素試料 は、ＣＹＳ−Ｔｃ¹⁰培地から胞子形成を経て３０℃で成長させた形質転換Ｂ.ｔ. ５１の培養物から製造する。殺虫性生体検定(第２表)は、全培養物と洗浄した結 晶タンパク質調製品の両方について行う。対照はＣryＩＣ毒素含有Ｂｔ５１(pSB 440)、およびＣryＩＥ含有Ｂｔ５１(pSB636)を含む。毒素濃度をＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅによって評価する。 第２表 ＣryＩＣおよびＣryＩＥと比較したハイブリッドＧ２７の生体検定 試料数は括弧内に示す。ハイブリッド毒素Ｇ２７は、少なくともスポンドプテ ラ種に対する毒性でＣryＩＥまたはＣryＩＣの何れよりも約５０％以上高い効果 がある。 本発明は、特にＧ２７ハイブリッド毒素の生成に関して記述しているが、当業 者は改良された殺虫性をもつ多くの他のハイブリッド毒素を、本明細書に従って 製造し得る事を十分に認識できるであろう。例えば、配列番号７と８は、改良さ れた殺虫性を有する本発明の更なるハイブリッド毒素を記載している。ハイブリ ッド毒素は、ＣryＩＣのドメインIIIおよび他の任意のＣryタンパク質のＮ−末 端を含むことにより生成できる。生体検定に関しては、被形質転換体をもつハイ ブリッド毒素を検定方法を早くし、必要材料量を少なくするためにＳＯＰ培地で 生育させることができる。さらに、Ｇ２７をコード化する遺伝子および／または 本発明の他のハイブリッド毒素は、毒素コード化Ｂ.ｔ.株中に形質転換でき、お よび／または選択されたＢ.ｔ.株の染色体の中に統合されることもでき、或いは 、本来の場所である植物それ自体内に殺虫性を備えさせる為に、植物ゲノムに実 際に導入することができる。この点に関して、毒素コード化組み換えＤＮＡが、 このように修飾されたＤＮＡの発現が、植物中で、ハイブリッド毒素または毒素 フラグメントのタンパク質成分が内在性である生物中で非修飾組み換えＤＮＡの 発現で得られるタンパク質に実質的に類似のタンパク質を生成するように、組み 換えＤＮＡが挿入されるべき植物に好適なコドン内で修飾されて使われるのが特 に好ましい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 19/00

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第一Ｃryタンパク質のドメインIIIもしくはそのドメインの一部またはそ のドメインに実質的に類似するタンパク質をＣ−末端に含むＢ.ｔ.ハイブリッド 毒素フラグメント(ただし、フラグメントのＮ−末端領域は第二Ｃryタンパク質 のＮ−末端領域またはその領域の一部もしくはその領域に実質的に類似のタンパ ク質である)。 ２．ドメインIIIが由来するタンパク質が結合する部位とは異なる昆虫腸内の 結合部位に結合するものである、請求項１記載のＢ.ｔ.ハイブリッド毒素フラグ メント。 ３．ＣryＩＣ結合部位に結合せず、ＣryＩＣのドメインIIIまたはそのドメイ ンの一部もしくはそのドメインに実質的に類似のタンパク質をＣ−末端に含むか 、またはＣryＩＡ結合部位に結合せず、ＣryＩＡのドメインIIIまたはそのドメ インの一部もしくはそのドメインに実質的に類似のタンパク質をＣ−末端に含む 、請求項２記載のＢ.ｔ.ハイブリッド毒素フラグメント。 ４．Ｎ−末端に、ＣryＩＡ(ａ)、ＣryＩＡ(ｂ)、ＣryＩＡ(ｃ)、ＣryＩＢ、Ｃ ryＩＣ、ＣryＩＤ、ＣryＩＥ、ＣryＩＦ、ＣryＩＧ、ＣryＩＨ、ＣryIIＡ、Ｃry IIＢ、ＣryIIＣ、ＣryIIIＡ、ＣryIIIＢ、ＣryIIIＢ(ｂ)、ＣryIVＡ、ＣryIVＢ 、ＣryIVＣ、ＣryIVＤ、ＣＹＴＡ、ＣryＸ１(IIIＣ)、ＣryＸ２(IIIＤ)、ＣryＸ ３、ＣryＶおよびＣryＸ４から選択されるタンパク質のＮ−末端領域；またはそ の領域の一部もしくはその領域に実質的に類似のタンパク質を含む、請求項１か ら３のいずれかに記載の毒素フラグメント。 ５．フラグメントのＣ−末端がＣryＩＣまたはＣryＩＡのドメインIIIまたは そのドメインの一部もしくはそのドメインに実質的に類似のタンパク質である、 請求項１から４のいずれかに記載の毒素フラグメント。 ６．ＣryＩＥ、ＣryＩＢ、ＣryＩＤまたはＣryＩＡのドメインIIまたはそのド メインの一部もしくはそのドメインに実質的に類似のタンパク質、およびＣryＩ ＣのドメインIIIまたはそのドメインIIIの一部もしくはそのドメインIIIに実質 的に類似のタンパク質を含む、請求項１から５のいずれかに記載の毒素フラグメ ント。 ７．ＣryＩＥ、ＣryＩＢ、ＣryＩＤ、もしくはＣryＩＡのドメインＩおよびII またはドメインの一部もしくはそのドメインに実質的に類似のタンパク質および ＣryＩＣのドメインIIIまたはそのドメインIIIの一部もしくはそのドメインIII に実質的に類似のタンパク質を含む、請求項１から６のいずれかに記載の毒素フ ラグメント。 ８．ＣryＩＣのアミノ酸４５４位から６０２位までの配列またはその配列に実 質的に類似の配列を含む領域をＣ−末端に含む、請求項１から７のいずれかに記 載の毒素フラグメント。 ９．ＣryＩＣのアミノ酸４７８位から６０２位までの配列またはその配列に実 質的に類似の配列を含む領域をＣ−末端に含む、請求項１から８のいずれかに記 載の毒素フラグメント。 １０．配列番号６の約アミノ酸１から約アミノ酸６２０までのアミノ酸配列を 含む毒素フラグメント、または配列番号６の約アミノ酸１から約アミノ酸６２０ までの配列を有し、当該配列について少なくとも一つの次の改変が存在する配列 を有する毒素フラグメント： ６０９位のＩleがＬueで置換されている； ６１８位のＡlaがＧluで置換されている； ６２０位のＳerがＴryで置換されている。 １１．配列番号８の約アミノ酸１から約アミノ酸６２７までのアミノ酸配列を 含む毒素フラグメント、または配列番号８の約アミノ酸１から約アミノ酸６２７ までの配列を有し、少なくとも一つの次の改変が存在する配列を有する毒素フラ グメント： ６１７位のＩleがＬueで置換されている； ６２５位のＡlaがＧluで置換されている； ６２７位のＳerがＴryで置換されている。 １２．請求項１から１１のいずれかに記載のフラグメントを含むハイブリッド 毒素、または実質的に類似の殺虫性活性またはレセプター結合性能を有する、こ のようなハイブリッド毒素に少なくとも８５％類似する毒素。 １３．請求項１から１２のいずれかに記載の毒素フラグメントまたはハイブリ ッド毒素に少なくとも９０％相同である、純タンパク質。 １４．請求項１から１３のいずれかに記載されているタンパク質のアミノ酸配 列を有するタンパク質をコード化している配列を含む、組み換えＤＮＡ。 １５ ．配列番号５の約ヌクレオチド１から約ヌクレオチド１８６０までの配列を含む 組み換えＤＮＡまたは実質的に類似のタンパク質をコード化するそれに類似のＤ ＮＡ、もしくは配列番号７の約ヌクレオチド１から約ヌクレオチド１８８１まで の配列を含む組み換えＤＮＡまたは実質的に類似のタンパク質をコード化するそ れに類似のＤＮＡ。 １６．除草剤耐性、植物成長促進性、抗真菌性、抗細菌性、抗ウイルス性およ び／または耐線虫類特性を有するタンパク質をさらにコード化する、請求項１４ または１５記載の組み換えＤＮＡ。 １７．既知のｍＲＮＡ不安定モチーフまたはポリアデニル化信号を除き、およ び／または組み換えＤＮＡを挿入さるべき生物に好適なコドンを使用し、修飾さ れたＤＮＡが該生物内で発現して、ハイブリッド毒素または毒素フラグメントの タンパク質成分が内在性である生物において非修飾組み換えＤＮＡの発現により 得られるものと実質的に類似のタンパク質を産生するように修飾された、請求項 １４から１６のいずれかに記載の組み換えＤＮＡ。 １８．請求項１４から請求項１７のいずれかに記載のＤＮＡとストリンジェン トな条件下でハイブリダイズされたものに相補的である、ＤＮＡ配列。 １９．請求項１４から１８のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含む、ベクター。 ２０．請求項１４から１８のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項１９に記載 のベクターを含み、および発現できる植物または微生物。 ２１．請求項１４から１８のいずれかに記載の組み替えＤＮＡで転換された植 物、安定に導入されしかもメンデルの法則で遺伝するＤＮＡを含むこのような植 物の子孫、および／またはこのような植物およびこのような子孫の種子。 ２２．請求項１４から１８のいずれかに記載のＤＮＡ発現に由来するタンパク 質、および請求項２１に記載の植物内の組み換えＤＮＡの発現により作られた殺 虫性タンパク質。 ２３．請求項１から１３および請求項２２のいずれかに記載のタンパク質の１ つまたはそれ以上を含む、殺虫性組成物。 ２４．請求項１から１３、請求項２２および２３のいずれかに記載のタンパク 質または組成物、または請求項２０の微生物に、昆虫をさらすことを含む昆虫を 退治する方法。 ２５．物質が微生物であることを特徴とし、物質の温浸および溶媒抽出を行う ことからなる、殺虫性タンパク質を含む有機物質から、請求項１から１３または 請求項２２のいずれかに記載の殺虫性タンパク質を得るための抽出方法。