JPH08509608A

JPH08509608A - 殺虫性蛋白コード化遺伝子含有組込みｄｎａセグメント

Info

Publication number: JPH08509608A
Application number: JP6523840A
Authority: JP
Inventors: カルマン、スーザン・ステファニー
Original assignee: サンド・リミテッド
Priority date: 1993-04-23
Filing date: 1994-04-21
Publication date: 1996-10-15
Also published as: EP0696324A1; HU9503017D0; HUT73739A; CA2159323A1; CZ275195A3; ZA942824B; AU7879694A; PL311205A1; IL109367A0; BR9406536A; KR960702001A; AU685516B2; CN1121733A; WO1994025611A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、バシラス・スリンギエンシス株の殺虫スペクトンおよび／または毒性を増強する方法に係り、それにより外因性結晶毒素コード化ＤＮＡ配列は宿主Ｂ.t.の染色体ＤＮＡに安定に組込まれ、そこで外因性配列が発現し、そしてさらにそこで非活性プラスミド上の結晶コード化ＤＮＡ配列が発現しうる。本発明は、さらに該外因性ＤＮＡ配列を含むＢ.t.宿主、該宿主の製造法、該宿主を含有する殺虫組成物および使用方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】殺虫性蛋白コード化遺伝子含有組込みＤＮＡセグメント本発明は、微生物殺虫剤の分野に、より詳しくは、大きな昆虫毒性と広い昆虫宿主範囲を有するハイブリッド微生物の構築に関する。本発明は昆虫感染から植物を保護するために有用である。近年、バシラス・スリンギエンシス（Ｂ.t.）および植物の昆虫感染の生物学的制御でのそれらの利用にかなりの興味が持たれている。胞子形成の間の毒性の結晶性蛋白由来のこれらの昆虫病原体は副胞子結晶と称した。異なる昆虫宿主スペクトルを有するＢ.t.株は、それらの鞭毛抗原に基づいて異なる抗原型または亜種に分類される。ほとんどのＢ.t.株は、チョウとガの毛虫を含む鱗翅目の幾つかのものの幼虫に対して活性であるが、あるものはそれぞれ蚊の幼虫と甲虫の幼虫を含む双翅目または鞘翅目のものに対して毒性を示す。毒性作用は幾つかの結晶生成株についてはまだ証明されていない。Ｂ.t.の結晶性含有物は幼虫の中腸で溶解し、２７ないし１４０Ｋdの、−またはそれ以上の殺虫性の結晶蛋白またはδ−エンドトキシンを放出する。大部分の結晶蛋白は、昆虫中腸中で小さな毒性ポリペプチドに蛋白分解的に変換されるプロトキシンである。一般に、本技術分野では、結晶蛋白をＣry、そして該蛋白をコード化する遺伝子をcryと称することはよく知られている。４２以上のＢ.t.cry遺伝子を特徴付けた。cry遺伝子に関する分類概要は、ホフテおよびホワイトリィ、1989、マイクロバイオロジカル・レビュース，５３：２４２により公表され、遺伝子は、コード化蛋白の構造類似性と殺虫性スペクトルにより、４つのクラスと幾つかのサブクラスに分けられる。４つの主要クラスは、鱗翅目特異的（Ｉ）、鱗翅目および双翅目特異的（II）、鞘翅目特異的（II I）並びに双翅目特異的（VII）遺伝子を含むものである。鱗翅目特異的遺伝子（cryＩ）は、Ｂ.t.の胞子形成の間に二錐体形（bipyrami dal）結晶性含有物中に貯蓄する１３０ないし１４０Ｋd分子量蛋白をコード化する。cryＩ遺伝子は、配列相同性（＞５０％アミノ酸同一）により、他のcry遺伝子と区別できる。三つのこれら遺伝子、cryＩＡ（a）、cryＩＡ（b）およびcry ＩＡ（c ）は、８０％以上のアミノ酸同一を示し、従って別のサブグループと考えられて来た。より最近に確認されたcryＩＢ、cryＩＣおよびcryＩＤ遺伝子は、互いに、そしてcryＩＡ遺伝子と異なる。結晶製品中のＣryＩＡ、ＣryＩＢおよびＣry ＩＣ蛋白は、ホフテ等（マイクロバイオロジカル・レビュース，５３：２４２− ２５５(1989)）によって示されるように３５モノクローナル抗体を用いることにより、１１抗原型の２９株に分離された。鱗翅目および双翅目特異的クラスは、立方形含有物を形成する６５Kd蛋白をコード化する遺伝子を含む。最初のcryIIＡ遺伝子は、Ｂ.t.亜種クルスタキＨＤ− ２６３からクローン化され、バシラス・メガテリウムに発現した。ＣryIIＡ蛋白を生成する細胞は、鱗翅目種、ヘリオティス・ビレッセンスおよびリマントリア・ディスパー並びに双翅目、アエデス・アエギプチの幼虫に対し毒性であった。鞘翅目特異的クラスは、鞘翅目種に活性である遺伝子生成物をコード化し、蛋白は約７０Ｋdaである。少なくとも３つの鞘翅目特異的Ｂ.t.株、Ｂ.t.テネブリオニス、Ｂ.t.サン・ディエゴおよびＢ.t.ＥＧ２１５８が記載された。株は一つの主要蛋白を含む長斜方形結晶を生成する。 cryIV遺伝子の双翅目特異的クラスは、双翅目特異的結晶蛋白遺伝子のむしろ不均一グループからなる。cytＡおよび４つの他の遺伝子が、Ｂ.t.イスラエレンシスの株に存在する同−７２Ｍダルトン（Ｍｄ）プラスミドから分離された。cr yIVＡ、cryIVＢ、cryIVＣおよびcryIVＤ遺伝子は、それぞれ１３５、１２８、７８および７２Ｋdの蛋白をコード化する。これらの蛋白は、２６Ｋd cytＡ遺伝子生成物と共に卵形結晶錯体にまとまる。同一または類似の蛋白組成物を有する結晶錯体も、Ｂ.t.モリソニＰＧ−１４株に観察された。Ｂ.t.イスラエレンシスあるいは組換えＥ.コリまたはバシラスのいずれかから誘導された、cryIVクラス結晶蛋白の調製物による毒性試験は、種々の程度で、ある蚊種の幼虫に対し毒性である。ホフテおよびホワイトリィによる最初の分類以来、多くの新規なcry遺伝子がクローンされ、それらのヌクレオチド配列が決定されて来た。異なる分類システムが、ヤマモトおよびパウエル、1993、「バシラス・スリンギエンシス・クリスタル・プロテインズpps３−４２イン・アドバンスド・エンジニアード・ペスティサイズ」レオ・キム編集により公表された。Ｂ.t.の商業的調製品を多くの農作物、日よけ用樹木および鑑賞植物に普通に用いて種々の昆虫種を制御し、それらの調製品を化学的殺虫剤の適用に用いられる同一の装置で適用する。噴霧適用範囲を評価する方法は当業者にとって周知である。ハイブリッド細菌を含む組成物は、単独で、あるいは寄生虫、捕食者または他の制御手段、例えば化学的殺虫剤、放射線誘発滅菌、化学不妊剤、フェロモン等と組合せて、スプレー、粉末または毒餌として適用しうる。ストレッサー（stre ssor）は本発明のハイブリッド細菌による病原性または活性化慢性感染を増強しうる。Ｂ．t．の形質転換の既知方法は、プロトプラスト融合法、プロトプラストトランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーションおよび接合様方法を含む。エレクトロポレーションは、その単純性、速さおよび効果からＢ.t.を形質転換するのにしばしば用いられる。Ｂ.t.シャトルベクターも1989年に開発された。本シャトルベクターの有用性は、１３０Ｋd結晶蛋白を発現する得られる被形質転換体で、Ｂ.t.結晶毒素遺伝子を結晶マイナス（Ｃry）Ｂ.t.株に移動させることにより初めて証明された。未変性Ｂ.t.プラスミドから誘導された種々のクローニングおよび発現ベクター、例えばＢ.t.イスラエレンシス３.６５ＭダルトンプラスミドおよびpＢＲ３２２；Ｂ.t.クルスタキＨＤ２６３、ＨＤ７３、ＨＤ１からのプラスミド；Ｂ.t. イスラエレンシスからのプラスミド及びＥ.コリベクターを取り込んでいるシャトルベクターが開発された。そのようなシャトルベクターの一つは、鞘翅目活性毒素遺伝子をＢ.t.イスラエレンシス株に移向して殺虫作用のスペクトルを拡大して双翅目と鞘翅目の両方を含むのに用いられた。この技術の使用に関連する重要な問題は、未変性および外来ブラスミド間の不安定性または非適合性である。しばしば、一またはそれ以上の未変性Ｂ.t.プラスミドは細菌に導入される外来プラスミド（複数もあり）と共存するができず、未変性プラスミドは速やかに分離により失われる。未変性プラスミドが、トランスジェニックＢ.t.株に保存されるべき一またはそれ以上のcry遺伝子を含む場合、困難が起きる。この問題は、組換え（または外来）および未変性プラスミド間の非適合性を起こすＢ.t.プラスミドベクターの蛋白を除去することにより解決できる。外来ＤＮＡを細菌に安定に導入する方法を研究した。Ｂ.t.に基づく、未変性適合ベクターを用いて鞘翅目活性cryIIIＡ遺伝子をＢ.t.クルスタキ株に転移し、得られるトランジェニック株は高レベルの鞘翅目活性を示したが、その野生型鱗翅目活性は依然として維持した。細菌は、また、自律複製ができず、もしプラスミドが宿主クロモゾームの一部分とホモロガスであるＤＮＡのセグメントを運ぶとき、選択可能なマーカーを運ぶプラスミドによって形質転換しうる。上記の例において、プラスミドは、プラスミドおよびホモロガス（homologous）宿主配列を含む単一交差型メカニズムにより宿主と相互に作用することが示された。結果物は、ホモロガスＤＮＡセグメントの直接反復に隣接した組込みプラスミドである。該挿入は、重複セグメントの両端が単一転写単位内に含まれる場合、突然変異誘発性である。デレクルーズ等は、Ｂ.t.イスラエレンシスのcytＡ殺虫性蛋白コード化遺伝子を不活性化するのにホモロガス組換えを適用した（デレクルーズ等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ，１７３：3374−3381(1991)）。部分cytＡ配列含有組込み（integrational）ベクターを構築してＢ.t.イスラエレンシスの７２Ｍダルトン非活性プラスミド上に存在するcytＡ遺伝子でホモロガス組換えした（hom ologously recombine）。さらに、カロゲロ等は、Ｂ.t.クルスタキＨＤ７３の全ＣryＩＡ(c)コード部分を運ぶＢ.スブチリス組込みベクターを構築した（カロゲロ，Ｓ.等、アプライド・アンド・エンビロンメンタル・マイクロバイアル，５５：４４６−４５３(1989)）。プラスミドベクターはＨＤ７３cryＩＡ(c)遺伝子を発現することが判明した。ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３０（ＷＯ／９３／０３６１９）は、殺虫性遺伝子を運ぶシャトルベクターによる組換えＢ.t.細菌と組換え細菌の製造法を記載する。しかしながら、上記の一般的方法も特別な引用文献もＢ.t.安定性の問題を染色体組込みにより解決できることの示唆を全く与えていない。本発明は、cry遺伝子がＢ.t.株のクロモゾームに組み込まれた結晶遺伝子の安定な維持および発現に関する。さらに、発明は広汎な宿主範囲および／または新規な特異性を有するＢ.t.株の構築に関する。特に、発明は高スポドプテラ活性と鱗翅目昆虫に対する持続有効性を有するＢ.t.株の構築に関する。本発明は、Ｂ.t.内に複製し、そして発現することが可能である一またはそれ以上の殺虫剤コード化ＤＮＡ配列およびＤＮＡセグメントのホモロガス組換えによる染色体Ｂ.t.ＤＮＡへの挿入を指令するＤＮＡ配列に関する。本発明は、又、Ｂ.t.内に複製し、そして発現することが可能である一またはそれ以上の殺虫剤コード化ＤＮＡ配列およびＢ.t.ゲノムへの任意な組込みが可能であるＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメントに関する。発明は、また、プラスミドまたはシャトルベクターのようなベクターを含むハイブリッドベクターおよびそれに有効に連結した本発明のＤＮＡセグメントを含む。又、本発明の一部は、そのクロモゾームに少なくとも一つの該ＤＮＡセグメントの殺虫剤コード化ＤＮＡ配列を組込んだハイブリッドＢ.t.宿主である。本発明は、又、染色体Ｂ.t.ＤＮＡ配列とホモロガスなＤＮＡ配列を得ること、および少なくとも一つの殺虫剤コード化ＤＮＡ配列をそれに有効に連結させて、Ｂ.t.がＤＮＡセグメントまたは有効に連結したＤＮＡ配列を有するハイブリッドベクターにより形質転換すると、殺虫剤符号配列が発現すること、の段階を含む本発明のＤＮＡセグメントの製造法に関する。本明細書においては、a）Ｂ.t.クロモゾームＤＮＡに任意に組込むことが可能であるＤＮＡ配列を得ること、b）該ＤＮＡ配列に、Ｂ.t.に複製し、そして発現することが可能である一またはそれ以上の殺虫剤コード化ＤＮＡ配列を有効に連結すること、c）ＤＮＡセグメントを得ること、d）バシラス・スリンギエンシス宿主をＤＮＡセグメント（ＤＮＡセグメントはＢ.ｔ.宿主クロモゾームに任意に組込んでいる）により形質転換すること、およびe）形質転換宿主を分離すること、そしてそこで殺虫剤コード化ＤＮＡ配列が形質転換宿主として発現すること、を含む、さらに他の形質転換Ｂ.t.宿主の製造法を提供する。本発明は、又、上記したＤＮＡセグメントまたはハイブリッドベクターによってＢ.t.宿主を形質転換すること、そしてホモロガス組換えを起こさせ殺虫剤コード化ＤＮＡ配列をＢ.t.クロモゾームに安定に取込まれるようにすること、そして形質転換宿主を分離することによる、少なくとも一つの外因性殺虫剤を発現するハイブリッドＢ.t.宿主の製造を含む。本発明のハイブリッド宿主および所望により他の殺虫性生成物を含む、基剤を含有する広スペクトル殺虫性組成物を本明細書において開示する。一実施態様において、Ｂ.t.の殺虫性範囲は、上記殺虫剤コード化ＤＮＡ配列が発現可能性を維持するようにＢ.t.を形質転換することにより増強しうる。また、植物または植物の周囲の土壌に、有効量の本発明の殺虫性組成物を適用することを含む、昆虫被害から植物を保護する方法を含む。発明は、関連する実施例、図面および配列同定を含む以下の検討からさらに明らかとなるであろう。図面のうち、図１は、グラム陰性基源の複製を含むプラスミドpＳＢ２１０である。図２は、pＳＢ１４７プラスミドおよびそのファミリー木の誘導を示す。図３は、pＳＢ２１０配列を含むプラスミドpＳＢ２１０.１を記載する。図４は、pＳＢ２１０.１配列を含むプラスミドpＳＢ２１０.２を記載する。図５は、pＳＢ２１０.３プラスミドの地図を示す。図６は、pＳＢ１４７プラスミドの地図を示す。図７は、pＳＢ１３６プラスミドの構築を描く。配列同定は表２および表５並びに実施例３、５および１１に示す。本発明は先行技術のＢ.t.の狭い殺虫性範囲を改良する。広い宿主範囲の１以上の殺虫剤コード化遺伝子を有するハイブリッドＢ.t.株は、外来殺虫剤コード化遺伝子を既知の細菌株のクロモゾームに導入することにより構築しうる。従って、本発明は、株により生成される異なる殺虫性結晶蛋白の数を増加することによりＢ.t.株の宿主範囲を増強する方法を提供する。組換えＢ.t.株に導入されたプラスミドは、細胞の非活性プラスミドに対し不安定性を生じ、そして導入されたプラスミド自体も不安定となりうる。このことは、しばしば、細胞中に含まれる結晶遺伝予の発現の損失となる。本発明は、宿主非活性プラスミド上に含まれる、存在する結晶遺伝子を妨害することなく発現用の宿主クロモゾームに結晶遺伝子を導入することにより、その問題を避ける。従って、本発明は、一またはそれ以上の殺虫剤コード化ＤＮＡ配列、およびＢ .t.の染色体ＤＮＡ配列とホモロガスなＤＮＡ配列（クロモゾームに挿入された該殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は該Ｂ.t.で複製し、発現する）を含むＤＮＡセグメントを提供する。殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は、Ｂ.t.細菌中で発現することが可能な殺虫性蛋白をコード化する全てのＤＮＡ配列でありうる。本発明での使用に適した殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は、Ｂ.t.の全ての亜種および／または株のcryＩＡ(a)、cry ＩＡ(b)、cryＩＡ(c)、cryＩＢ、cryＩＣ、cryＩＤ、cryＩＥ、cryＩＦ、cryII Ａ、cryIIＢ、cryIIIＡ、cryIIIＢ、cryIIIＣ、cryIVＡ、cryIVＢ、cryIVＣ、cr yIVＤおよびcytＡ遺伝子並びにＢ.ラルバエおよびＢ.パピラエの全ての株の殺虫性蛋白コード化遺伝子および特にバシラスまたは他のグラム陰性細菌に発現することが既知の全ての他の殺虫性蛋白コード化遺伝子を含むが、これらに限定されない。殺虫剤、特に例えばα−アミラーゼ阻害剤、プロテインナーゼ阻害剤および細菌由来の他の毒素をコード化するＤＮＡ配列も適する。本発明のＤＮＡセグメントでの使用に適するホモロガスＤＮＡ配列は、全てのＢ.t.種または株、例えば上記表１に示したものの全ての染色体ＤＮＡフラグメントと実質的にホモロガスな全てのＤＮＡ配列を含む。ホモロガスＤＮＡ配列は、細菌ＤＮＡによるホモロガス組換えによって本発明のＤＮＡセグメントの宿主ＤＮＡへの組込みを可能にし、そして指令する。本発明のＤＮＡセグメントが、環状の共有結合で閉鎖したＤＮＡセグメントとして提供される場合、ホモロガス組換えは宿主ＤＮＡとホモロガスＤＮＡ配列の間の単一交差型種目（event）の手段により起こりうる。ＤＮＡセグメントが線状ＤＮＡセグメントとして提供される場合、ホモロガス組換えは、宿主のＤＮＡと所望の殺虫剤コード化ＤＮＡに隣接するホモロガスＤＮＡ配列との間の二重交差型種目の手段により起こりうる。即ち、ホモロガスＤＮＡ配列は、一または二の隣接するＤＮＡ配列として提供しうる。さらに、本発明のＤＮＡセグメントは二本鎖形および一本鎖形で提供される。一本鎖形はこの技術分野で知られるように、二本鎖形の熱または化学的変性により得られうる。二本鎖形は、この技術分野で知られるように、所望の配列の酵素制限および連結により得られうる。ホモロガスＤＮＡ配列は、約５塩基ないし約２０k塩基の範囲の細菌クロモゾームのフラグメントにホモロガスである。より好ましくは、配列は約５００塩基ないし約１０k塩基にホモロガスである。約2250塩基の、Ｂ.t.のホスホリパーゼＣコード化部分とホモロガスなＤＮＡ配列も好ましい。内因性殺虫剤コード化遺伝子（複数もあり）を除くＢ.t.宿主クロモゾーム蛋白とホモロガスなＤＮＡ配列は特に好ましい。上記に鑑み、ＤＮＡセグメントが、殺虫性蛋白をコード化する配列の５'および３'の両細菌ＤＮＡに対し、ホモロガスなＤＮＡ配列を含む場合、当業者は殺虫剤コード化部分のいずれかの側のホモロガス部分の大きさを認識するであろう。この方法では、単一の新しい遺伝子の付加によってさらに細菌の殺虫性範囲を増大するであろう。本発明のＤＮＡセグメントは、さらにグラム陰性細菌に関する複製の開始点を含みうる。特に、ネイセリア、ベイロネラ、ブルセラ、パステウレラ、ヘモヒリス、ボルデテラ、エシェリキア、エルウィニア、シゲラ、サルモネラ、プロテウス、エンテロバクター、セラチア、アゾトバクター、リゾブイム、ニトロソモナス、ニトロバクター、チオバシラス、シュードモナス、アセトバクター、ホトバクテリウム、ジモモナス、アエロモナス、ビブリオ、デスルホビブリオまたはスピリルム属の一またはそれ以上のグラム陰性細菌種または株で作用することが可能である複製の全ての開始点が用いうる。グラム陰性細菌、例えばＥ.コリでのＤＮＡセグメントのクローニングおよびバシラス・スリンギエンシスを形質転換後、殺虫性ＤＮＡ配列を延命するだけでこれらは宿主のクロモゾームに組込まれる。複製のグラム陰性開始点はＢ.t.細菌宿主中で作用しないので、ＤＮＡセグメントで形質転換されたＢ.t.宿主は、ＤＮＡセグメントが宿主クロモゾームに組込まれない限り、殺虫剤を複製しないし発現もしない。本発明のＤＮＡセグメントは、また、さらにグラム陽性細菌以外の単細胞微生物中で発現しうる選択マーカー、グラム陽性細菌中で発現しうる選択マーカーおよび／またはグラム陰性およびグラム陽性細菌中で発現しうる選択マーカーを含みうる。グラム陽性細菌以外の単細胞宿主中で発現しうる選択マーカーは、グラム陽性宿主以外の単細胞宿主中で表現型を発現する能力を有する全てのＤＮＡ配列として定義され、それはＤＮＡ配列を運ぶ宿主の検出または選択に有用である。グラム陽性細菌中で発現される能力を有する選択マーカーは、ＤＮＡ配列を運ぶグラム陽性宿主の検出または選択に有用なグラム陽性細菌宿主中に表現型を発現する能力を有する全てのＤＮＡ配列として定義される。グラム陰性およびグラム陽性細菌中に発現されうる能力を有する選択マーカーは、ＤＮＡ配列を運ぶ宿主の検出および選択に有用なグラム陽性およびグラム陰性細菌宿主中に表現型を発現する能力を有する全てのＤＮＡ配列として定義される。一般に、例は、薬剤耐性、化学耐性、アミノ酸栄養要求または原栄養あるいはミュータントまたは組換え微生物の選択または検出に有用な他の表現型変性についてのマーカーである。選択マーカーの存在は、グラム陰性細菌中、本発明のＤＮＡセグメントのクローニングおよび／または維持を増強し、そして本発明のＤＮＡセグメントを運ぶ組換えＢ.t.細菌の選択および／または検出を改良する。本明細書においては、さらに、Ｂ.t.細菌宿主中で複製および発現される能力を有する少なくとも一つの殺虫剤コード化ＤＮＡ配列、並びにＢ.t.宿主のゲノムＤＮＡに任意に組込む能力を有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメントを提供する。本明細書において使用に適する任意に組込むＤＮＡ配列は、それら自体を挿入またはコピーする能力を有する挿入配列またはトランスポゾン配列並びにＢ .t.宿主の染色体またはプラスミドＤＮＡ中の任意な位置で有効に連結したＤＮＡ配列である。例は、トランスポゾン、例えば以下に例示するＴn９１７並びにＴn１５４５およびＴn９１６を含み、これらの全ては、カミリ等（カミリ等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ，１７２：3738−3744(1990)）により記載されるか、またはこの技術分野で既知の他のグラム陽性トランスポゾンである。任意に組込むＤＮＡ配列またはカセットの存在は知られていたが、グラム陽性細菌中、殺虫性遺伝子の挿入に適用されたのは最初である。トランスポゾン配列を含む本発明のＤＮＡセグメントは、プラスミドベクターで適切に運びうる。本明細書において、使用に適したプラスミドは、特に以下に例示するように、pＴＶ５１ＴsおよびpＬＴＶ１を含む。好ましい実施態様では、温度感受性プラスミドを転移宿主細胞を選択するのに用いる。プラスミド、例えばpＴＶ５１ＴsおよびpＬＴＶ１は、一定温度以上で複製するのに用い得ない。即ち、温度感受性プラスミドで運ばれるＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントが宿主ゲノムに転移するのであれば、宿主に非許容温度で維持されるであろう。転位効率は、転移要素、例えば薬剤耐性、アミノ酸栄養要求または原栄養などの内に含まれるマーカーを選択することにより増強しうる。特に好ましい実施態様では、本発明のＤＮＡセグメントは、単一Ｂ.t.宿主内に多重転位事物を産生するのに用いる。ＤＮＡセグメントの宿主ゲノムＤＮＡへの多重挿入は、温度感受性プラスミドベクターの場合、速やかな温度上昇（upsh ift）により得られうる。薬剤耐性マーカーを運ぶ転移要素を用いると、増加した薬物濃度が多重転位事物を励起するであろう。マイトマイシンＣの添加も、転位頻度を増す。別法として、グラム陽性宿主を、各要素がユニークな選択マーカーを運ぶ、異なる転移要素の配置によって形質転換しうる。一実施態様では、本発明の転移要素は、転位した殺虫剤コード化ＤＮＡ配位の宿主細胞発現に必要な全ての制御要素を運ぶ。他の実施態様では、転移要素は、殺虫剤コード化配列が宿主ＤＮＡの転写および／または翻訳制御下に置かれているオペロンまたは遺伝子融合を創製するよう設計しうる。オペロンおよび遺伝子融合は、ヤングマンによって記載されたＴn９１７仲介オペロンおよび遺伝子融合方法または本技術分野での既知の他の方法である（ヤングマン,Ｐ．「プラスミド・ベクターズ・フォー・リカバリング・アンド・エクスプロイッティング・Ｔn９１７・トランスポジションズ・イン・バシラス・アンド・アザー・グラム・ポジティブ・バクテリア」、イン・プラスミズ：ア・プラクティカル・アプローチ、ハンディ,Ｋ.Ｇ.編集、ＩＲＬプレス７９−１０３(1973)）。本発明の転移要素は、Ｂ.t.に複製し、発現される能力を有する少なくとも一つの殺虫剤コード化ＤＮＡ配列を有効に連結してＤＮＡセグメントを得、それにより、Ｂ.t.がＤＮＡセグメントにより形質転換すると、殺虫剤コード化ＤＮＡ配列はＢ.t.クロモゾーム中に組込まれ、そして発現しうること、バシラス・スリンギエンシス宿主をＤＮＡセグメントにより形質転換してＤＮＡセグメントをＢ.t.クロモゾーム中に任意に組込ませること、そして形質転換宿主を分離することによる、少なくとも一つの外因性殺虫剤を発現する形質転換Ｂ.t.宿主の製造に用いうる。Ｂ.t.ゲノムに任意に組込む能力を有する転移要素またはＤＮＡ配列は、酵素制限、連結、クローニングおよび／または化学合成を含む、本技術分野で既知の方法により得られうる。殺虫性遺伝子またはＤＮＡ配列は、本技術分野で既知の方法により得られ、そして任意に組込んでいるＤＮＡ配列に、同様に有効に連結しうる。形質転換は、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクションまたは接合により実施しうる。宿主分離は、形質転換宿主の選択マーカーから選択することにより実施しうる。本発明の実施態様において、任意組込みＤＮＡはＴn９１７トランスポゾンを含む。Ｂ.t.の殺虫性範囲は、外因性殺虫剤コード化ＤＮＡ配列の発現を維持すること、そして一またはそれ以上の外因性殺虫性遺伝子を、Ｂ.t.クロモゾームに取込まれうる転移要素に有効に連結することにより増強しうる。本発明のＤＮＡセグメントはハイブリッドプラスミドとして提供しうる。本発明のＤＮＡセグメントを運ぶのに適する全てのプラスミド配列がハイブリッドプラスミドの構築に用いうることが理解されよう。本発明での使用に特に適するのは、なかでも実施例１、６および１１で下記するプラスミドpＳＢ２１０.１、p ＳＢ２１０.２、pＳＢ２１０.３、pＳＢ１３６およびpＳＢ１４７である。本発明のＤＮＡセグメントは、また、グラム陽性細菌用のハイブリッドシャトルベクターとして提供しうる。適切なベクターはグラム陽性細菌に加えてグラム陰性細菌、酵母または全ての単細胞宿主で自己複製する能力を有する全てのベクターを含む。そのようなシャトルベクターは本技術分野において周知である。本シャトルベクターの有用性は、Ｂ.t.結晶毒素遺伝子をcryＢと称される結晶マイナスＢ.t.株に動かすことにより初めて証明された。得られる形質転換体は１３０Ｋd結晶蛋白を発現した。さらに、レレクルス等は、pＨＴ１０３０Ｂ.t.プラミドおよびpＵＣ１８を取込でいる他のシャトルベクターを構築してＢ.t.４０７から分離したcryＩＡ(a)遺伝子をcryＢ株に動かした（レレクルス,Ｄ.等、ＦＥＭＳマイクロバイオル・レト.，４９：４１７(1988)）。４０７株のCry誘導体に転移すると、本毒素の発現のレベルは野生型株で見られるものよりも有意に増加し、遺伝子コピー数の増加結果かも知れない。ミテバ等は、Ｂ.t.イスラエレンシスの３.６５ＭダルトンプラミドとpＢＲ３２２を取込むことによりシャトルベクターを構築した（ミテバ,Ｖ.Ｉ.等、アーカイブス・オブ・マイクロバイオロジィ，１５０：４９６(1988)）。Ｂ.t.クルスタキＨＤ２６３、ＨＤ７３、ＨＤ１からのＢ.t.プラミドを用いて構築したシャトルベクター並びにＢ.t.イスラエレンシスおよびＥ.コリのベクターも記載された。一つのそのようなシャトルベクターを用い鞘翅目活性毒素遺伝子をＢ.t.イスラエレンシス株に動かし、殺虫性作用のスペクトルを拡大して双翅目と鞘翅目の両者を含めるようにした（クリックモア,Ｎ.等、バイオケミカル・ジャーナル，２７０：１３０(1990)）。本明細書においては、また、そのクロモゾームに安定に取込まれた本発明の少なくとも一つの殺虫性ＤＮＡ配列を含むＢ.t.宿主を提供する。適切なＢ.t.宿主は、表１に示されるＢ.t.亜種およびその株並びに以下に実施されるものさらに本技術分野で既知の全ての他のＢ.t.亜種または株を含む。本明細書で用いられるように、用語「宿主」は、栄養および胞子形の両者のＢ.t.細菌を含む。本発明のＤＮＡセグメントの宿主クロモゾームへの安定な取込みは、多くの世代の後代による、そしてＢ.t.宿主の胞子形成および発芽相による、宿主クロモゾーム内でのＤＮＡセグメントの維持として定義される。好ましい実施態様では、形質転換Ｂ.t.宿主は、そのクロモゾームに安定に組込まれた多重外因性発現性殺虫剤コード化ＤＮＡ配列を含む。多重配列は、同一殺虫剤コード化配列の多重コピーを含む、上記殺虫剤コード化配列の全ての組合せを含みうる。特に好ましい実施態様では、宿主は、二またはそれ以上の異なる殺虫性蛋白を発現する能力を有する。本発明のＤＮＡセグメントは、全ての外因性ＤＮＡ配列をＢ.t.宿主のクロモゾームに安定に取込むのに用いうることが認識されるであろう。外因性ＤＮＡは、宿主のクロモゾームへの組込みによりＢ.t.宿主の染色体ＤＮＡを変える全てのＤＮＡとして定義される。望ましいＤＮＡ配列が、本発明において記載された殺虫剤コード化ＤＮＡ配列と同じ手段でＢ.t.に導入しうる。従って、本発明は、宿主により複製されそして発現される能力を有する外因性ＤＮＡ配列がそのクロモゾームに取込まれたＢ.t.宿主を含む。本発明のＤＮＡセグメントは、少なくとも一つの殺虫剤コード化ＤＮＡ配列を有効に連結する、Ｂ.t.細菌の染色体ＤＮＡ配列とホモロガスなＤＮＡ配列を得ることによって製造し得、それによりバシラス・スリンギエンシスがＤＮＡセグメントにより移行（transfect）されると、殺虫剤コード化ＤＮＡ配列が発現する。ホモロガスＤＮＡ配列は、Ｂ.t.微生物の既知のゲノムライブラリィをスクリーニングすることにより得られうる。もしゲノムライブラリィが問題のＢ.t.細菌を有しない場合は、この技術分野で既知の方法により構築しうる。スクリーニング方法も本技術分野で既知である。一度、問題の配列が決定されると、それらは制限酵素によって切断しうる。ＤＮＡまたはペプチド配列が既知であると、ＤＮＡフラグメントは、この技術分野で既知の方法により合成しうる。別法として、ＤＮＡまたはペプチド配列が知られていない場合は、ゲノム制限フラグメントがホモロガスフラグメントを任意にクローンするのに用いることができる。殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の連結によりホモロガスＤＮＡ配列に有効に連結され、それにより、殺虫性ＤＮＡの宿主のクロモゾームへのホモロガス組換えおよび組込みによって、殺虫剤コード化ＤＮＡはバシラス・スリンギエンシス内で発現できる。一実施態様では、ＤＮＡセグメントは、Ｂ.t.宿主内で殺虫剤コード化ＤＮＡの複製および翻訳を指令することができる調整配列を含む。そのような調整配列は、プロモーター、オペレーター、レプレッサーおよび／またはエンハンサー配列、転写開始および停止部位、リボゾーム結合部位、翻訳開始および停止コドンおよび／または本技術分野で既知の他の調整配列を含みうる。例えば、殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は、その未変性細菌宿主内での殺虫剤コード化ＤＮＡの発現を制御する調整配列に有効に連結し得た。宿主のＤＮＡ内でオペロンまたは遺伝子融合を創生するよう設計されたＤＮＡセグメントも、本発明の範囲内にある。オペロン融合の場合、ＤＮＡセグメントは、殺虫剤コード化mＲＮＡの翻訳を指令することができる制御要素を含みうる。ホモロガスＤＮＡ配列は、宿主ＤＮＡ内で、殺虫剤コード化ＤＮＡ配列をオペロンに組込むよう設計し得、かくして宿主のクロモゾーム内の挿入により、殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は宿主オペロンの転写制御下に置かれる。遺伝子融合の場合、ホモロガスＤＮＡは、宿主クロモゾーム中の構造遺伝子に殺虫剤コード化ＤＮＡを取込むよう設計し得、それにより、宿主の制御要素は殺虫剤コード化ＤＮＡ配列の複製および翻訳の両者を指令する。オペロンおよび遺伝子融合を構築する技術は、サンブルック等により記載されている（サンブルック,Ｊ.、フリッツ ,Ｅ.Ｆ.およびマニアティス,Ｔ.、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリィ・アニュマル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ、ＮＹ(198 9)）。本発明の構築されたＤＮＡセグメントは、特に例えば遠心またはアガロースゲル電気泳動のような本技術分野で既知の方法により分離しうる。本発明のＤＮＡセグメントの製造法は、さらに、グラム陽性宿主以外の単細胞宿主で発現できるもの、グラム陽性宿主で発現できるもの、およびグラム陽性とグラム陰性の宿主の両方で発現できるものから成る群から選択される選択マーカーを含む。単細胞微生物用の選択マーカーは、そのような微生物のＤＮＡセグメントをクローンし、そして精製するのに利用される。本発明の選択マーカーは、選択マーカーをＤＮＡセグメントに連鎖状にする（ concatenate）こと、またはグラム陽性選択マーカーをＤＮＡセグメントに挿入することによりＤＮＡセグメントに有効に連結し、Ｂ.t.宿主のクロモゾームへの挿入により、選択マーカーはＢ.t.宿主中、殺虫剤コード化ＤＮＡ配列の発現を妨害しない。さらに、グラム陽性選択マーカーのリンケージは、クローニング微生物（非グラム陽性宿主）に関する選択マーカーの機能を妨げるべきでなく、Ｂ.t.宿主で発現できるべきである。一実施態様では、グラム陽性選択マーカーはその発現に必要な全ての制御要素を運ぶ。グラム陽性選択マーカーは、また、記載したと同様の方法で、オペロンで、または宿主ＤＮＡ内の遺伝子融合で作用するよう設計しうる。本発明の方法は、さらに、そこでそれがクローンされる単細胞微生物についての複製のオリジンを上記したＤＮＡセグメントに有効に連結することを含む。本微生物は、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、グラム陰性細菌、酵母などでありうる。上記したもののような複製オリジンは、そこでそれが例えば殺虫性ＤＮＡおよびホモロガスＤＮＡ配列以外のＤＮＡセグメント中の全ての他の要素の作用（fanction ing）を崩壊させないであろうＤＮＡセグメント内の位置にオリジンを置くことにより、本発明のＤＮＡセグメントに有効に連結しうる。そのクロモゾームに少なくとも一つの殺虫剤をコード化するＤＮＡセグメントを安定に取込んだＢ.t.宿主は、 a）本発明のＤＮＡセグメントを得ること、 b）Ｂ.t.宿主をＤＮＡセグメントで形質転換すること、 c）ホモロガス組換えを起こさせて殺虫剤コード化ＤＮＡ配列を宿主のクロモゾームに安定に組込ませること、そして d）形質転換宿主を分離すること、により製造しうる。Ｂ.t.宿主は、エレクトロポレーション、トランスフェクションおよび接合またはこれらの方法の組合せを含む、当業者によく知られた方法によってＤＮＡセグメントで形質転換しうる。さらに、本明細書においては、殺虫有効量の本発明のハイブリッド宿主およびその基剤を含む広範囲殺虫性組成物を提供する。組成物は、約１０⁶ないし約１０¹³ハイブリッド微生物／g基剤、そしてより好ましくは約１０¹⁰ないし約１０¹¹微生物／g基剤を含みうる。しかしながら、その外の量も適当である。Ｂ.t.宿主は、栄養または胞子形のいずれかで組成物中に存在しうる。適切な基剤はこの技術分野で既知であり、技術者は本目的に適したものを選択することできる。典型的には、基剤は殺虫性組成物中の宿主とも、また、処理される植物とも相互作用しない不活性化合物または組成物である。しかしながら、ある種の基剤は、植物または士壊生物によって代謝され、従って生分解性である。殺虫性組成物の効果および持続性は、基剤、例えば展着剤、固着剤、湿潤剤、およびトウモロコシ粉バイト、ロコ（商標）（ステアリン酸アミン）スプレー添加剤、プライアク（商標）、トリトンＢ−1956、ポリブテンＬ−１００およびＨ−３５、トウモロコシ油、トリトンＢ−1946、およびセロサイズＱＰ4400、ホウ酸、界面活性油、ピノレン（商標）およびこの技術分野で既知の他の補助剤の添加によって増強される。成分は、この技術分野で知られている通りに混合され、配合され、そして組成物は粉末、液体またはエーロゾル形で提供される。ハイブリッド宿主は、低温で製造し、使用前に解凍するのが最もよいであろう。本発明の殺虫性組成物は、さらに他の殺虫化合物を含みうる。Ｂ.t.を含む組成物は、広範囲の化学的殺虫剤、例えばハーフスおよびプフランゼンクランク（ハーフス,Ｗ.およびプフランゼンクランク,Ｚ、プフランゼンシュッツ７２(１０ )：５８４−５９９(1965)）により報告されたものと適合であることが知られている。従って、本発明の殺虫性組成物は、一またはそれ以上の、ハーフスにより確認された殺虫剤またはこの技術分野で知られた他の殺虫性Ｂ.t.宿主、または本発明によって製造されるそのハイブリッドを含みうる。本発明は、また、植物または植物の周囲の士壊に有効量の本発明の殺虫性組成物を適用することを含む、昆虫被害から植物を防る方法を提供する。商業的殺虫性微生物調製物の適用に関し、この技術分野で既知の方法は、本発明の殺虫性組成物を適用するのに適している。典型的には、本組成物は、約１０⁸ないし１０¹⁶ハイブリッド微生物／エーカー、そしてより好ましくは約１０¹³ないし１０¹⁴ハイブリッド微生物／エーカーを散布することにより適用しうる。組成物は、植物にスプレーするのが最もよく、続く再適用も受けうる。以下に例示の目的のために特別の実施例を記載するが、そのように明確にしない限り、本発明またはその如何なる実施態様を限定することを意図しない。実施例実施例１：プラスミドの構築コンピテントＥ.コリＤＨ５a（ジブコＢＲＬ）およびＧＭ２１６３（ニュー・イングランド・バイオラブス）をアレキサンダーの方法（アレキサンダー,Ｄ.Ｃ .、「ア・メソード・フォー・クローニング・フルーレングス・cＤＮＡ・イン・プラスミド・ベクターズ」、ワ,Ｒ.およびグロスマン,Ｌ.編集、リコンビナントＤＮＡパートＥ.メス.エンザイモル，１５４：４１−６３(1987)）により製造した。プラスミドは、ビーンボイムおよびドリィの方法（ビーンボイムおよびドリィ、「ア・ラピッド・アルカリン・エクストラクション・プロシーディア・フォー・スクリーニング・リコンビナント・プラスミドＤＮＡ」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，７５：1513−1523(1979)）によりＥ.コリから抽出した。 cryＩＣ遺伝子、エリスロマイシン耐性に関するＢ.サブチリスermＣ遺伝子およびレックナー等により組込み用の標的として記載されるホスファターゼＣ部分（レックナー等、「モレキュラー・キャラクタライゼイション・アンド・シーケンス・オブ・ホスファチジルイノシトール−スペシフィック・ホスフォリパーゼＣ・オブ・バシラス・スリンギエンシス、モレキュラー・マイクロバイオロジィ，３：６２１−６２６(1986)）を運ぶpＳＢ２１０.２プラスミドは３段階方法で構築した。第一に、図１に示されるpＳＢ２１０プラスミドを、図２に示され、そして実施例２で以下に記載されるpＳＢ１４０プラスミドから、EcoＲＩおよびＨindIII部位に多重クローニング部位（ＭＣＳ）を付加することにより構築した。ＭＣＳは、その配列が以下の表２に記載され、製造者の指示に従ってアプライド・バイオシステムズ由来のオリゴヌクレオチド精製カートリッジを用い精製したオリゴヌクレオチドＫＫ１４およびＫＫ１４Ｂをアニーリングすることにより創生した。第二段階で、phosＣ遺伝子をpＳＢ２１０に加えた。phosＣ部分は、上記表２に記載されるプライマーＰhos１およびＰhos４を用いるＰＣＲによりＨＤ７３全ＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ生成物はpＵＣ１８のSmal部位にクローンしてpＳＢ１３９を構築した。phosＣ標的部分をpＳＢ１３９から２.２kbブラントＫpnl、ＢamＨＩ・フラグメント上に分離し、ゲル生成し、そして、MsclおよびＢamＨＩで消化し、製造者の指示に従ってジェネクリーンキット（バイオ１０１）を用い精製したpＳＢ２１０に結合した。得られるプラスミドはpＳＢ２１０.１と称され、図３に示す。最終段階は結晶遺伝子を加えることであった。pＳＢ２１０.２プラスミドは実施例３で以下に記載されるpＳＢ６１９由来の４.２kd ＡpaＩ−ＮotＩフラグメント上のcryＩＣ遺伝子を含む。pＳＢ６１９をＡpaＩおよびＮotＩで消化し、４ .２kd ＡpaＩ−ＮotＩフラグメントを分離した。４.２kg ＡpaＩ−ＮotＩフラグメントを、ＡpaＩおよびＮotＩでカットしたpＳＢ２１０.１に結合して図４に示すpＳＢ２１０.２を形成した。pＳＢ２１０.３プラスミドは、ＡpaＩおよびＮot Ｉでカットした、（実施例４で下記する）pＳＢ０１３由来の６kbフラグメント上で分離したcryＩＣ遺伝子を含む。６kb ＡpaＩ−ＮotＩフラグメントは、電気溶出により精製し、ＡpaＩおよびＮotＩでカットしたpＳＢ２１０.１に結合して図５に示すpＳＢ２１０.３を形成した。pＳＢ２１０.３は、cryＩＣ遺伝子がpＳＢ２１０.２に見られる未変性cryＩＣプロモータよりもむしろcryIIＡプロモーターの後に置かれている点で、pＳＢ２１０.２と異なる。両プラスミド共、cry ＩＣ遺伝子はcryＩＡ(c)ターミネータに続く。プラスミドpＳＢ１４７は実施例５で下記するように構築した。それは組込み標的としてホスホリパーゼＣ部分、 cryIIＡオペロン、およびエリスロマイシンに対する耐性を伝えるermＣ遺伝子を運ぶ。エレクトロポレーション実験で用いたプラスミドＤＮＡは、ＧＭ２１６３、da m−、dcm−、Ｅ.コリ株（ウッドコック,Ｄ.Ｍ.、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，１７：3469(1989)）から精製した。実施例２：pＳＢ１４０プラスミドの構築エリスロマイシン耐性遺伝子ermＣを提供するためpＳＢ９０１プラスミドを構築した。pＳＢ９０１を構築するため、ermＣ遺伝子をモノド等（モノド等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ，１６７：１３８−１４７(1986)）により記載されるplＭ１３バシラス・ズブチリスプラスミド由来のＨindIII／ＣlaＩとして分離した。ermＣＨindIII／ＣlaＩフラグメントは、ＨindIIIおよびＡccＩでカットしたpＵＳ１８に結合した。pＢＲ３２２中のtetr遺伝子をpＳＢ９０１由来のermＣ遺伝子で置換するために、pＢＲ３２２をＡvalで消化し、線状ベクターをＥ.コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理してブラント末端を産生した。クレノウ処理に続き、pＢＲ３２２をＨindIIIで消化して、大きなフラグメントをtet'遺伝子フラグメントから精製除去した。プラスミドpＳＢ９０１をＳmal、次いでＨindIIIで消化し、ermＣＳmaＩ−ＨindIIIフラグメントを運ぶフラグメントを精製した。ermＣ遺伝子をpＢＲ３２２ＨindIII大フラグメントに結合してpＳＢ１４０を産生した。pＳＢ１４０プラスミドの誘導は図２に示す。実施例３：pＳＢ６１９プラスミドの構築８kb ＥcoＲＩＤＮＡフラグメントとして分離されたcryＩＣは、ストラタジーンから得たラムダＺＡＰIIベクターのＥcoＲＩ部位にクローンした。遺伝子を分離するため、ＵＳＤＡから得たバシラス・スリンギエンシス・アイザワイＨＤ２２９のプラスミド調製物をＥcoＲＩで消化し、フラグメントをゲル電気泳動により分離して、約８kbのフラグメントをゲルから分離した。別法として、cryＩＣ遺伝子はホニー等により記載されたクローニングプロトコール（ホニー,Ｇ.、ファン・デア・ソーム,Ｔ.およびビッサー,Ｂ.、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，１６：6240(1988)）に従って得ることができた。cryＩＣクローンは、二つの分離反応、一つはＨindIIIとＫpnＩにより、そしてもう一つはＫpnＩとＥco ＲＩによる、で消化した。消化は、プロモーターとＮ末端cryＩＣ配列を含む２. ６kb ＨindIII−ＫpnＩフラグメントおよびＣ末端配列とターミネーターを含む２.３kb ＫpnＩ−ＥcoＲＩフラグメントを生じた。cryＩＣ遺伝子は、ファルマシアから得たpＴＺ１９Ｒ中の２.３kb ＫpnＩ−ＥcoＲＩフラグメントに２.６kb ＨindIII−ＫpnＩフラグメントを連結することにより再構築した。ユニークなＮcoＩ部位は、cryＩＣ遺伝子の翻訳開始部位に設計した。付加的ＥcoＲＩ部位も、停止コドンのすぐ後に設計した。これらの制限部位は、一連続フラグメント中のcr yＩＣの全コード化部分の切断を可能にする。次いでcryＩＣプロモーターと全蛋白コード化部分を含む３.８kb ＨindIII−ＥcoＲＩフラグメントを、ＲＣＲ産生３５０bp cryＩＡ（c）ターミネーターによりpＢluescriptベクターにクローンした。 cryＩＡ（c）ターミネーターは、以下の公表されたcryＩＡ（c）配列に基づいて合成された二つのプライマーを用いるＰＣＲにより得た。プライマー１：ＧＴＣＴＣＡＴＧＣＡＡＡＣＴＣＡＧＧ、配列番号：２５プライマー２：ＣＴＣＴＧＧＣＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＣ、配列番号：２６Ｂ.t.クルスタキＨＤ７３からクローンしたcryＩＡ（c）遺伝子を鋳型として用いた。ＰＣＲ産生ターミネーターは、それをブラント末端にするクレノウによる処理後、Ｔ₃プロモーターと同一定位でpＢluescript ＫＳ＋（ストラタジーン）のＸbal部位にクローンした。次いでcryＩＣプロモーターとコード化部分を含むＨindIII、ＥcoＲＩフラグメントをpＢluescriptＫＳ＋のＨindIII−ＥcoＲＩ部位にクローンした。cryＩＡ（c）のクローニングとシーケシングは、アダング等により記載されている（アダング,Ｍ.Ｊ.、ステイバー,Ｍ.Ｊ.、ロケロウ,Ｔ. Ａ.、レイトン,Ｊ.、バーカー,Ｒ.Ｆ.およびトンプソン,Ｄ.Ｖ.、「キャラクタライズド・フル−レングス・アンド・トランケイテッド・プラスミド・クローンズ・オブ・ザ・クリスタル・プロテイン・オブ・バシラス・スリンギエンシス・サブスピーシズ・カースタキＨＤ−７３・アンド・ゼア・トキシティ・トゥ・マンズカ・セクスタ」、ジーン，３６：２８９−３００(1985)）。本構築物はpＳＢ６１９と呼ばれた。実施例４：pＳＢ０１３プラスミドの構築Ｂ.t.クルスタキのＨＤ−１株はＵＳＤＡから得た。全ＤＮＡをベーリンガー・マンハイムからのプロトコールに従って、ＡＳＡＰキットを用いＨＤ−１から抽出した。表４で上記したキナーゼ処理（kinased）オリゴヌクレオチドＮＨＳ３９およびＮＨＳ２０をＰＣＲ反応においてプライマーとして用い、Ｂ.t.クルスタキＨＤ−１全ＤＮＡから全cryIIＡオペロンを含有する１８００bpフラグメントを産生した。ベント（vent）ポリメラーゼは製造者の勧告（ニュー・イングランド・バイオラブズ、ベバリィ、ＭＡ）に従って用いた。ＰＣＲ反応生成物をゲルから分離し、ＨindIIで消化したpＴＺ１９Ｒに連結した。連結生成物を用いてコンピテントＥ.コリＤＨ５αを形質転換した。被転換体は、７５μg／mlアンピシリン（amp）と４０mＭＸgalを含むＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡをＡpaＩおよびＮcoＩ消化によりスクリーンし、pＴＺ１９Ｒマルチクローニング部位内の１８００bpＰＣＲフラグメントの定位をＡflIII消化により決定した。所望の１８００bpフラグメント定位はpＳＢ００９と名付けた。 pＳＢ０７０は、ＣryＩＣの代わりにcryIIIＡのコード化部分を含む、pＳＢ１９と類似のプラスミドである。pＳＢ０７０を構築するために、Ｂ.t.テネブリオニスまたはＢ.t.サン・ジエゴ由米のＣryIIIＡ遺伝子をヘルンシュタッド,Ｃ.等（ヘルンシュタッド,Ｃ.、ギルロイ,Ｔ.Ｅ.、ソビースキ,Ｄ.Ａ.、ベネット,Ｂ. Ｄ.およびガートナー,Ｆ.Ｈ.、ジーン，５７：３７−４６(1987)）によって記載されるようにクローンした。 cryIIIＡを含む３.０kb ＨindIIIをpＴＺ１８Ｒ（ファルマシア）中でクローンした。ＥcoＲＩ部位を含有するマルチクローニング部位配列に連結したcryIII ＡＣ末端コード化部分を有するクローンを選択した。pＳＢ０７０中でcryIIIＡをクローンするために、ユニークなＮcoＩ部位を、ＡＴＧコドンを用い、翻訳開始部位に設計した。ＮcoＩ部位を設計後、cryIIIＡコード化部分をＮcoＩおよびＥcoＲＩによりpＴＺ１８Ｒから切断し、ＣryＩＣコード化部分が除去されたpＳＢ６１９にクローンした。 pＴＺ１９ＲにcryIIＡオペロンフラグメントを含むpＳＢ００９およびcryＩＣプロモーターとcryＩＡ（c）ターミネーターと共にcryIIIＡコード化部分を含む pＳＢ０７０の両者を、ＡpalおよびＮcolで消化した。pＳＢ０７０の５６６７bp フラグメントとcryIIＡオペロンを含むpＳＢ００９由来の１８００bpフラグメントを分離した。フラグメントを互いに連結した。コンピテントＥ.コリＤＨ５α 細胞を形質転換して、コロニーを７５μg／mlアンピシリン含有ＬＢプレート上、３７℃で一晩、選択した。１２コロニー由来のＤＮＡをＡfIII＋ＮotＩで消化して所望のオペロンカセットを含む分離物を確認した。プラスミドはpＳＢ０１０と名付けた。 cryＩＣ遺伝子をpＳＢ０１０cryIIＡオペロンカセットにクローンした。pＳＢ６１９を実施例３で上記したように得た。全長cryＩＣコード化部分は、ＮcoＩ、ＥcoＲＩおよびＢgIIIによりpＳＢ６１９を消化すること、および３９００bp ＮcoＩＥcoＲＩフラグメントを分離することによって得た。オペロンカセットベクター、pＳＢ０１０をＮcoＩ＋ＥcoＲＩで消化し、精製した。連結反応生成物を用いＤＨ５αを形質転換し、コロニーを７５μg／mlアンピシリン含有ＬＢプレート上で選択した。１２コロニー由来のプラスミドＤＮＡを制限消化（ＡfI II＋ＥcoＲＩおよびＡfIII＋ＢgIII）により分析した。cryIIＡオペロンの下流に全長cryＩＣ遺伝子を含むプラスミドカセットをpＳＢ０１３と名付けた。実施例５：pＳＢ３０４プラスミドの構築 pＳＢ３０４は、ＵＳＤＡから入手可能なＢ.t.株、Ｂ.t.ガレリアエＨＤ２３２由来のcryIIＡをオペロンクローニングすることによって得た。オペロンをクローニングするために、Ｂ.t.ガレリアエＨＤ２３２由来のＤＮＡをＨindIIIで消化し、約５kbのフラグメントをゲル電気泳動により精製した。ゲル精製フラグメントをＨindIIIカットpＴＺ１８Ｒ（ファルマシア）と連結し、Ｅ.コリＤＨ５ αに移入した。cryIIＡを含むクローンをcryIIＡ特異的オリゴヌクレオチド（ＣＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＧＡＡＴＡＧＴＧＧＡＡＧ）、配列番号：２７でプローブした。同一定位にcryIIＡおよびlacＺ遺伝子を含むクローンを選択した。ＤＮＡは選択したクローンから精製し、cryIIＡオペロンの所望しない上流配列を含むＢamＨＩフラグメントを除去してpＳＢ３０４を生成した。cryIIＡオペロンおよびその５'部分の配列上のさらなる情報は、ワイドナー等（ワイドナー,Ｗ.Ｒ.およびホワイトレイ,Ｈ.Ｒ.、「ツゥ・ハイリィ・リレイテッド・インゼクティサイダル・クリスタル・プロテインズ・オブ・バシラス・スリンギエンシス・サブスピーシズ・クルスタキ・ポゼス・ディファレント・ホスト・レインジ・スペシフィシティーズ」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ，１７１：９６５−９７４(1989)）に見出すことができる。実施例６：pＳＢ１４７プラスミドの構築 pＳＢ１４０は実施例２で上記したように得た。次いで、cryIIＡオペロンをp ＳＢ１４０に加えた。cryIIＡオペロンの起源は実施例５で上記したプラスミドp ＳＢ３０４であった。pＳＢ３０４は、pＴＺ１８Ｒ中ＢamＨＩ／ＨindIIIフラグメントとしてクローンされたＢ.t.ガレリアエＨＤ２３２由来のcryIIＡオペロンを含む。プラスミドpＳＢ３０およびプラスミドpＳＢ１４０をＥcoＲＩおよびＨ indIIIで消化した。大きなpＳＢ１４０フラグメントを精製し、cryIIＡオペロンＥcoＲＩ−ＨindIIIフラグメントを大きなpＳＢ１４０フラグメントに連結してp ＳＢ１４１を得た。次の段階は組込み標的部位をベクターに加えることであった。標的部位は、ＵＳＤＡから得られたＢ.t.クルスタキのＨＤ７３株由来のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ遺伝子（plc）を運ぶＤＮＡのフラグメントであった。本ＤＮＡフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応を用い、ＨＤ７３全ＤＮＡから分離した。全ＤＮＡは、ベーリンガー・マンハイムからのプロトコールに従って、ＡＳＡＰキットを用いＢ.t.クルスタキから抽出した。Ｂ.t.株ＡＴＣＣ１０７９２由来のplc部分のＤＮＡ配列は、ジーンバンク（受け入れ番号Ｘ１４１７８）から得られ、レクナー等により記載されている（レクナー,Ｍ.等、モレキュラー・マイクロバイオロジィ，３：６２１−６２６(1989) ）。plc遺伝子の外に、本２２５４bp配列は、plc遺伝子の４５４bp上流および８１０bp下流を含有した。表２に上記した２つのプライマー、Ｐhos１およびＰhos ４はplc遺伝子に隣接する配列にハイブリダイズするよう設計した。これらのプライマーは、ＨＤ７３全ＤＮＡ鋳型によるポリメラーゼ連鎖反応に用いてＨＤ７３plc部分を運ぶ２.２kbフラグメントを産生した。ＰＣＲ生成物はＥ.コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理し、ＳmalでカットしたpＵＣ１８にクローンしてpＳＢ１３９を産生した。プラスミドpＳＢ１３９をＫpnＩおよびＢamＨＩで消化し、plc部分をベクター配列から分離した。プラスミドpＳＢ１４１もＫpnＩおよびＢamＨＩでカットし、得られるフラグメントを分離したplc部分と連結した。得られる構築物、pＳＢ１４１.５は、プラスミドpＳＢ１４１のpＢＲ３２２部分およびpＳＢ１３９由来の plc部分を運んだ。次に、プラスミドpＳＢ１４１およびpＳＢ１４１.５を用い、ermＣ、plc部分およびcryIIＡオペロンを含むプラスミドを産生した。プラスミドpＳＢ１４１. ５をＢamＨＩで消化した。pＳＢ１４１をＢamＨＩで消化し、cryIIＡオペロンおよびermＣ遺伝子を運ぶフラグメントを分離した。cryIIＡ／ermＣＢamＨＩフラグメントを線状pＳＢ１４１.５に連結してpＳＢ１４７を形成した。pＳＢ１４７の地図を図６に示し、pＳＢ１４７の誘導を図２に示す。実施例７：エレクトロポレーションによるハイブリッドプラスミドのＢ.t.への導入プラスミドを電気せんこうすることによりＢ.t.細胞に組込んだ（エレクトロトランスフォーメーション）。プラスミドは細胞中での複製に必要なグラム陽性起源を含まなかった。その代わりに、それらはクロモゾームへの組込みの標的として作用するＤＮＡの部分であるphosＣ部分、およびエリスロマイシンに対する耐性を与える選択マーカーを運んだ。高濃度の、電気せんこうされたプラスミドは、単一交差型事物（event）を経てクロモゾームに入り込み、そしてそれは標的部位の複写を生じる。プラスミドpＳＢ１４７とpＳＢ２１０.２を用いるＨＤ７３株の染色体組込み体は、本技術を用いて得られた。しかしながら、他の株はエレクトロポレーションに対しレカルシトラント（recalcitrant）を与え、高い効率で形質転換して染色体組込みを起こさせることができなかった。コンピテント細胞は、０.５Ｍシュークロースを含有する１００mlのブレーンハートインフュージョン培地（ジフコ）（ＢＨＩＳ）に新鮮な一夜Ｌ.Ｂ.プレートからの細胞の白色ディスポーザブルプールを接種することにより製造した。細胞は１バッフルフラスコ中、３７℃ および３００rpmで、６００nmで０.２の吸光度まで生育し、この時点以後、細胞を氷上に保持した。用いた全ての洗浄液は冷却した。細胞を無菌の２５０mlビンに移し、６０００rpm、７分間でペレット化した。細胞ペレットを１容量の０.５Ｍシュークロース、５mＭＨＥＰＥＳ、pＨ７で１回洗浄し、１／１０容量で２回洗浄した。ペレットを１０mlの最終容量のＨＥＰＥＳ−シュークロース溶液中に再懸濁した。新しく調製した細胞を組込みプラスミドのエレクトロホレーションに用いた。プラスミドＤＮＡを２００μlのコンピテント細胞と混合した。ＨＤ７３細胞に関するパルスパラメーターはkＶ＝１.２５、μＦ＝３およびΩ＝∞であった。パルスを送達後、細胞を１２５mlフラスコ中の５ml ＢＨＩＳに移し、３０℃、２５０rpmで３時間振盪して回収した。組込みプラスミド試料については、培養物を７,０００rpm、５分間でペレット化し、１０μg／mlエリスロマイシンを有するＬＢ上に置いた。 pＳＢ０９８を対照プラスミドＤＮＡとして用いてエレクトロポレーション手段の形質転換効率を測定した。pＳＢ０９８はpＴＺ１９Ｒ（ファルマシア）とp ＢＣ１６.１を含むシャトルベクターである。pＢＣ１６.１はクレフト（クレフト,Ｊ.、モル・ジェン・ジェネト，１６２：５９(1978)）により構築されたＢ. セレウスベクターである。pＴＺ１９ＲおよびpＢＣ１６.１はいずれもＥcoＲＩで消化した。線状プラスミドを、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子が逆の極性を有する一つのプラスミド、pＳＢ０９８に連結した。ＨＤ７３株のコンピテント細胞は、dam−、dcm−株ＧＭ２１６３から分離したプラスミドＤＮＡでエレクトロトランスフォームした。結果は以下の表３に示す。さらに、ＨＤ１−５１株をプラスミド２１０.１で形質転換した（データ示さず）。表の最終欄に与えた効率は、０.５１μg pＳＢ０９８をせんこうすること、そしてμgＤＮＡ当り得られたコロニー形成単位の数を計算することにより、各実験について測定した。これは細胞がどううまくエレクトロポレーションの条件に応答したかの評価を与えた。pＳＢ２１０.３の被転換体は得られなかった。Ｂ.t.クルスタキのＨＤ７３株はＵＳＤＡから得た（米国農務省から入手可能なバシラス・スリンギエンシス培養物、ＵＳＤＡ／ＡＲＳアグリカルチュラル・レビュース・アンド・マニュアル：ＡＲＭ−Ｓ−３０ 1982年１０月）。また、組換え体またはトランスフェクタントとして引用した被転換体は、遺伝子量についてＰＣＲにより分析した。pＳＢ２１０.２配列を含むＨＤ７３の組換体（ＨＤ７３::pＳＢ２１０.２）は、プライマーgalp１およびgalp２を用いcry ＩＣ遺伝子の、また、プライマーＰＧ２およびＰＧ４を用いてermＣ遺伝子の存在をスクリーンした。８つのＨＤ７３::pＳＢ１４７クローンの２つは、プライマーcryIIＡ１およびcryIIＡ２を用いcryIIＡ遺伝子を、そしてＰＧ２およびＰＧ４によりermＣ遺伝子を有することが確認された。プライマー配列は上記表４に示す。プラスミドのプロフィールは、ＨＤ７３::pＳＢ２１０.２５組換え体がその親株、ＨＤ７３と同一であることを示した。実施例８：ハイブリッドプラスミドのカプセル化のためのファージの調製ファージＣＰ５１は、トーンの方法(1978)上掲に従って、Ｂ.セレウス株５６９の感染胞子を注入したフィルターディスク中に得た。株は、０.４％グリセロールを含む２５ml ＮＢＹ（８gジフコ普通ブロス、３gジフコ酵母エキス／Ｌ）ブロスにディフコの一つを接種し、３７℃で１６時間生育することにより復活させた。培養物を集め、細胞残骸を10,000rpmで回転除去し、ファージ溶解質を０. ４５μＭフィルターを通過させることにより滅菌し、１６℃で貯蔵した。溶解質の力価は、５６９株のファージフリーの分離物に対しアッセイすることにより測定した。溶解質を１％ペプトン中、１０および１００倍に希釈した。５６９の約１０⁶細胞を１００μlの希釈ファージと混合し、２mlのＴＢＡＢ（ジフコ・トリプトーズ血液寒天ベース）軟寒天に添加した。これを、室温で一晩乾燥させたファージアッセイ（ＰＡ）プレート（８gジフコ普通ブロス、５９ＮaＣl 、０.２g ＭgＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ、０.０５g ＭnＳＯ₄Ｈ₂Ｏ、０.１５g ＣaＣl₂２Ｈ₂ Ｏ／l、pＨ５.９−６.０）上に上敷き（overlay）として塗布した。プレートを３０℃で一晩インキュベートして、プラークを計数した。ファージによる感染に対する感受性を試験するため、問題の（ＳＡ１１、ＳＡ１２、Ａ２８７およびＨＤ７３）各株の約１０⁶細胞をＰＡプレート上に上敷きとして塗布した。寒天の表面をファージストックの接種用ループでゆっくりと接触し、プレートを３０℃でインキュベートした。次の日に、透徹（clearing）を全四株の細胞ローン上で観察した。実施例９：ファージの繁殖ＨＤ７３::pＳＢ２１０.２の新鮮な一晩プレート由来の細胞を、２０mm管中、６mlＬＢを接種するのに用いた。培養物を３７℃で４ないし６時間生育させ、その吸光度を測定し、細胞をＬＢで３×１０⁶細胞／mlの濃度に希釈した。ＮＢＹＧプレートを、４×１０⁶ＰＦＵおよび１×１０⁶または３×１０⁶細胞のいずれかを含む０.５mlＣＰ５１ファージストックを伴う４ml ＮＢＹ軟寒天で被覆した。プレートを３０℃で一晩インキュベートし、ファージを５ml ＰＡブロスに集めた。上部（top）寒天をＰＡブロス中で組織解離し、１８mmプラスチック管に移した。細胞残骸をペレット化した。溶解質、標識ＣＰ２１０.２は０.４５μmフィルターを濾過させて滅菌し、１５℃で蓄えた。力価を測定するために、５×１０⁶ＣＦＵのＨＤ７３株を溶解質ＣＰ２１０.２の１０^-2および１０^-4希釈液１００μlと混合し、２ml ＮＢＹ軟寒天を含むＰＡプレート上に上敷きとして注いだ。３０℃で一晩インキュベーション後、１０^-4 プレートは１２００プラークを有し、力価は１.２×１０⁸ＰＦＵ／mlであると決定された。実施例１０：トランスダクション用の条件決定ファージを扱うのに用いる方法は、ソーン(1978)上掲、により記載されたものに基づいた。各Ｂ.t.株のml当りのコロニー形成単位（ＣＦＵ）およびml当りのプラーク形成単位（ＰＦＵ）中のファージストックの力価を系列希釈により測定した。ＣＰ５１ファージストックの力価は以下のように測定した。１％ペプトンに希釈したファージ０.１mlおよびＢ.セレウス５６９の約２×１０⁷胞子を２mlのＰＡ軟寒天に加えて、接種した軟寒天をＰＡ寒天プレート上に被覆した。被覆プレートを３０℃で１６ないし２０時間インキュベートした。プレートを計数してＰＦＵ／ファージストックのmlは用いた希釈液から測定した。Ｂ.t.培養物の細胞濃度は、本技術分野で用いられる標準的方法により測定した。結果は以下の表４に示す。実施例１１：pＳＢ１３６プラスミドの構築 pＳＢ１３６（図７に記載）は、cryＩＣ遺伝子のＢ.t.クロモゾームへの挿入を促進する組込みベクターである。pＳＢ１３６ベクターは、cryＩＣ遺伝子、組込み標的部位、テトラサイクリン耐性遺伝子およびpＢＲ３２２ベクターの部分を運ぶ。cryＩＣＢ.t.アイザワイＨＤ２２９遺伝子およびpＢＣ１６−１Ｂ.セレウスプラスミドテトラサイクリン耐性遺伝子（tet^r）をクローンした。組込み標的部位はＢ.t.クルスタキＨＤ１cryＢクロモゾーム由来の未知機能のＤＮＡのフラグメントであった。 pＳＢ１３６プラスミドは、既にテトラサイクリン耐性ではない全てのＢ.t.株のクロモゾーム中にcryＩＣ遺伝子を置くのに用いうる。しかしながら、生じるべき組込み用に、レシピエント株は組込み標的とホモロガスな配列を有しなければならず、そして株は効果的に形質転換されなければならない（ＤＮＡを形質転換する微生物当り≧１０⁴被転換体）。コンピテントＥ.コリＤＨ５αは、アレキサンダーの方法（アレキサンダー(19 87)、上掲）により調製した。形質転換は、ライブラリィ・エフィシエンシィＤＨ５αコンピテント細胞（ジブコ、ＢＲＬ、ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド、ゲイザースバーグ、ＭＤ）を用いるこの技術分野でよく知られた方法により構築した。被転換体の選択は７５μg／mlアンピシリンを含むＬＢ上で実施した。制限酵素消化、連結、エタノール沈澱、フェノール抽出、キナーゼ反応並びにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、仔ウシ腸内アルカリフォスターゼおよびＥ.コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによるＤＮＡの処理は、マニアティス等の方法（マニアティス,Ｔ.等、「モレキュラー・クローニング；ア・ラボラトリィ・マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ(1982)）により実施した。Ｂ.t.クルスタキＨＤ１cry−Ｂは、スターリィ等により記載されたＨＤ１のプラスミド回復(cured)株である（スターリィ,Ｄ.Ｐ.等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ，８４：５８１(1978)）。全ＤＮＡは以下の方法によりＢ.t.クルスタキＨＤ１cry−Ｂより分離した。２００mlの２ＸＴＹはＢ.t.を接種し、２００rpmで撹拌しながら３０℃で一晩インキュベートした。２００mlの２ＸＴＹを２mlの上記培養物により接種し、３００ rpmで撹拌しながら３０℃でインキュベートした。細胞は、培養物の吸光度がＯＤ₆₀₀＝０.８ないし１に達したとき、４℃で10,000rpm、５分の遠心により収集した。細胞は、ＴＥＳ（ＴＥ＋１００mＭＮaＣl）で洗浄し、２５％シュクロース＋２５mＭトリスＨＣl（pＨ８）＋２５mＭＥＤＴＡ１８ml中に懸濁した。２mlの１0mg／mlリゾチームをシュクロース溶液に加えてゆるやかに混合した。混合物を３７℃で３０ないし６０分間インキュベートし、プロトプラストをチェックした。２.２mlの２０％ＳＤＳを加えてゆるやかに混合し、５０℃で１５分間インキュべートした。次いで５.５mlの５ＭＮaＣlを加え、ゆるやかに混合し、５０℃で５分間、そして４℃で一晩インキュベートした。混合物を４℃、10,0 00rpmで１０分間、遠心し、上清を２つの管に入れた。２８ml（全体で５６ml）の冷ＥtＯＨを加え、ゆるやかに混合し、−２０℃で一晩インキュベートし、次いで13,000rpmで３０分間遠心した。沈澱を回収し、７０％ＥtＯＨ中で洗浄した。次いで沈澱を１０ml（全２０ml）のＴＥ中の１ＭＮaＣlに溶解し、４℃で一晩インキュベートした。次いで２つの管を一つに合わせた。２００μlの１mg／m l ＲＮアーゼと１２００μlの１０mg／mlプロテインナーゼＫを加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。２０mlのフェノール／クロロホルムを加え、混合物を遠心した。水性層を集めて２０mlのフェノール／クロロホルムで２回以上、洗浄した。２０mlのクロロホルムを水性層に加えて遠心した。水性層を集めて２０００μlのＴＥで一晩、透析した。クローニング用のプラスミドＤＮＡは、アルカリ溶解（ビーンボイム,Ｈ.Ｃ. およびドリィ,Ｊ.、「ア・ラピッド・アルカリン・エクストラクション・プロシディア・フォー・スクリーニング・リコンビナント・プラスミドＤＮＡ」ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，７：1513−1523(1979)）により、またはキエイジン・インコーポレイテッドから得られるキエイジンカラムでＥ.コリ細胞から分離した。 pＳＢ１３６の構築は４つの部分に分けて行った（表示は図７になす）。第一段階では、（Ｅ.コリ中で作用する）pＢＲ由来のテトラサイクリン耐性遺伝子をバシラス中で機能的なtet^r遺伝子で置き換えた。次に、組込み標的部位を加え、未知機能のＤＮＡの一片をＨＤ１cryＢゲノムから分離した。第三段階で、Ｎot Ｉリンカーを加えてcryＩＣ遺伝子をクローニングするのを促進した。最終クローニング段階では、cryＩＣ遺伝子を組込みベクターに加えた。これらの段階の各々は以下により詳細に記載される。プラスミドpＳＢ２０６は、pＢＣ１６（バーンハード,Ｋ.等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ，１３３：８９７−９０３(1978)）由来のtet^r遺伝子をp ＵＣ１８にクローニングすることにより構築した。プラスミドpＢＣ１６−１は、クレフト等の方法（クレフト,Ｊ.等、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス，１６２：５９−６７(1978)）によりＥcoＲＩフラグメントの除去によってプラスミドpＢＣ１６から産生した。tet^r遺伝子は、上記表４に記載されるプライマーＴet３およびＴet４とのポリメラーゼ連鎖反応を用い、pＢＣ１６−１から分離した。プライマーＴet３はtet^r遺伝子の上流にＨindIII部位を導入し、プライマーＴet４はtet^r遺伝子の下流にＫpnＩ部位を導入した。ＰＣＲ生成物を、ポリリンカーカートリッジＨindII部位で、pＵＣ１８に挿入した。 tet^r遺伝子を除去するために、プラスミドpＳＢ２０６をＳmaＩおよびＨindII Iで消化した。tet^r遺伝子をpＢＲ３２２から除くために、本プラスミドをＡvaＩでカットし、Ｅ.コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理してブラント末端を産生させ、次いでＨindIIIで消化した。所望のフラグメントを精製し、pＢＲ３２２ベクターをpＳＢ２０６由来のtet^r遺伝子と連結してpＳＢ１３１を産生した。次いで組込み標的部位をpＳＢ１３１に加えた。標的部位の起源は、１０ＨＤ１cryＢゲノムから分離された１.１kb ＤＮＡフラグメントであった。本フラグメントをpＵＣ１８にクローンし、構築物をpＳＢ１３２と名付けた。ＨＤ１cry Ｂ由来の１.１kb ＤＮＡフラグメントを以下のように分離した。全ＨＤ１cryＢＤＮＡはＨaeIIIまたはＥcoＲＶで制限され、２つの消化物を混合し、０.８％アガロースゲル上で電気泳動に付した。３つの大きさ１５フラクションを、ゲルからカットした：(1)０.５kb−０.９kb；(2)０.９kb−１.８kb；(3)１.８kb−２. ７kb。ＤＮＡフラグメント(1)および(2)を精製した。フラクション(2)からのＤＮＡはＳmaＩでカットしたpＵＣ１８に連結し、得られるクローンはＥcoＲＩ／Ｈind III消化により特徴づけられた。pＳＢ１３２と呼ばれるプラスミドは１.１kb挿入体を有した。次いで、１.１kb cryＢフラグメントをpＳＢ１３２からpＳＢ１３１に移した。プラスミドpＳＢ１３２をＥcoＲＩで消化し、Ｅ.コリＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウフラグメントによる２５処理によって満し、ＨindIIIで消化した。プラスミドpＳＢ１３１をＳspＩとＨindIIIでカットし、プラスミドpＳＢ１３２由来の精製１.１kbフラグメントと連結してプラスミドpＳＢ１３４を得た。ＮotＩリンカーをpＳＢ１３４に加えてcryＩＣ遺伝子の付加を増強した。Ｎot Ｉリンカーの配列はpＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ（ニュー・イングランド・バイオラブス数１１２５、配列番号２８）であった。プラスミドpＳＢ１３４をＢamＨＩで消化して、ブラント末端をＥ.コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによる処理により産生した。次いでＮotＩリンカーを線状pＳＢ１３４に２００：１モル比で連結し、得られる構築物をpＳＢ１３４.５と名付けた。最終段階は、cryＩＣ遺伝子をpＳＢ１３４.５に付加することであった。cryＩＣの起源は、実施例３で上記したプラスミドpＳＢ６１９であった。pＳＢ６１９は、その未変性プロモーター、および続くＢ.t.クルスタキ１０ＨＤ７３cryＩＡ (c)ターミネーターの後のＢ.t.アイザワイＨＤ２２９由来のcryＩＣ遺伝子を運ぶ。プロモーターとターミネーターを伴うcryＩＣ遺伝子は、bluescriptＫＳ(＋ )中ＡpaＩ／ＮotＩカセットとしてクローンした。cryＩＣを分離するために、p ＳＢ６１９をＡpaＩでカットし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで満たし、ＮotＩで消化した。プラスミドpＳＢ１３４.５をＥcoＲＩでカットし、１５Ｅ.コリＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントによる処理により満たし、次いでＮotＩでカットした。cryＩＣカセットを、pＳＢ６１９のベクター部分から精製し、pＳＢ１３４.５に連結してpＳＢ１３６を産生した。実施例１２：cryＩＣ遺伝子の、Ｂ.t.クルスタキ株ＨＤ１cryＢおよびＨＤ７３への導入プラスミドpＳＢ１３６は上記、実施例１１で記載したように構築した。それは、cryＩＣ遺伝子、pＢＣ１６.１由来のテトラサイクリン耐性をコード化する遺伝子、および取込み標的部位として作用する未知機能のＨＤ１ＣryＢクロモゾーム由来のＤＮＡの部分を含む。これらのフラグメントをプラスミドpＢＲ３２２に連結した。コンピテントＢ.t.クルスタキＨＤ１cryＢおよびＨＤ７３細胞を、上記実施例６に記載したＢＨＩＳプロトコールに従って調製した。電気パルスを伝達後、細胞を５ml ＢＨＩＳ中３７℃で３時間、修復した。ＨＤ１cryＢ細胞に関するパルスパラメーターは、１.０５kＶ、２５μＦ、Ｒ＝∞であった。ＨＤ７３細胞に関するパルスパラメーターは、１.２５kＶ、３μＦ、Ｒ＝∞であった。エレクトロポレーション後、全培養物をペレット化し、小容量で再懸濁し、選択培地上に塗布した。pＳＢ０９８ＤＮＡは、形質転換効率を測定するための標準として用い、各実験例について効率をpＳＢ０９８プラスミドのμg当りのコロニー成形単位（ＣＦＵ）として表した。ＨＤ１ＣryＢ細胞において、７.５μgのプラスミドpＳＢ１３６を細胞に電気せんこうしたとき、一つのテトラサイクリン耐性コロニーが得られた。細胞の形質転換の全体の効率は６×１０⁵ＣＦＵ／μg（pＳＢ０９８を用い）であった。本新規組換え株、ＣryＢ::pＳＢ１３６は、実施例１３で下記するＰＣＲ分析により、テトラサイクリン耐性遺伝子およびcryＩＣ遺伝子を含むことを示した。ＣryＢ::pＳＢ１３６は、胞子形成のためにＣＹＳ培地で生育した。それは、同一実験でのＨＤ１ＣryＩＢについての５×１０⁸胞子／mlに比べ、４×１０⁸胞子／mlを有した。テトラサイクリン耐性遺伝子は、胞子形成および産生を通じて９８％安定であった。ＨＤ７３細胞では、全体効率が２×１０⁶ＣＦＵμgＤＮＡであった実験で、１５μgのプラスミドpＳＢ１３６を細胞に電気せんこうしたとき、２つのコロニーが得られた。ＨＤ７３::pＳＢ１３６と呼ばれる両コロニーは、以下の実施例１３に記載されるように、ＰＣＲによりcryＩＣ遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子に陽性であった。実施例１３：ＣryＢ::pＳＢ１３６およびＨＤ７３::pＳＢ１３６組換え株のＰＣＲスクリーニングＣryＢ::pＳＢ１３６およびＨＤ７３::pＳＢ１３６５組換え株中の導入cry ＩＣ遺伝子およびテトラサイクリン耐性マーカーの存在は、ＰＣＲにより確認した。新鮮な一晩プレートからの細胞を、１×Ｔaqポリメラーゼ緩衝液中、必要なプライマー（０.５μlの２０μＭストック溶液）とdＮＴＰミックス（１.６μlの１. ２５mＭストック溶液）を含む８μlの溶液に、１０分間ボイルした。細胞残骸をペレット化し、１×Ｔaqポリメラーゼ緩衝液中０.０５単位Ｔaqポリメラーゼを含む２μlの溶液を加えた。２つのプライマーセットを用い、テトラサイクリン耐性遺伝子をスクリーンした。Ｔet３とＴet４の組合せは約１.４kbフラグメントを生成し、Ｔet３とＣＰ０１.Ｒevの組合せは約０.３５kbの大きさのフラグメントを与えた。cryＩＣ遺伝子をスクリーンするために、プライマーgalＰ１およびgalＰ２を用いて０.８kb径フラグメントを生成した。プライマー配列は上記表２に示す。実施例１４：cryＩＣおよびcryIIＡ遺伝子のＢ.t.クルスタキ株ＨＤ７３への導入プラスミドpＳＢ３０４は上記実施例５に記載したように構築した。cryIIＡ遺伝子をＮotＩ−ＥcoＲＩフラグメントとしてpＳＢ３０４から分離した。pＳＢ１３４.５は上記実施例１０に記載したように構築した。cryIIＡＮot−ＥcoＲＩフラグメントを、ＮotＩ−ＥcoＲＩでカットしたpＳＢ１３４.５に連結してプラスミドpＳＢ１３４.５.２を形成させた。コンピテントＨＤ７３細胞は上記実施例６に記載されるＢＨＩＳプロトコールに従って調製した。電気パルス伝達後、細胞は５mlＢＨＩＳ中３７℃で３時間、回復した。ＨＤ７３細胞についてのパルスパラメーターは、１.２５kＶ、３μＦ、Ｒ＝∞であった。エレクトロポレーション後、全培養物をペレット化し、小容量で再懸濁し、選択培養上に塗布した。上記実施例１２におけるように、pＳＢ０９８ＤＮＡは形質転換効率測定の標準であり、形質転換効率は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）／pＳＢ０９８ＤＮＡのμgとして表された。１０コロニーが、２０μgのpＳＢ１３４.５.２プラスミドによるＨＤ７３のエレクトロポレーションが得られた。形質転換効率は１×１０⁶ＣＦＵ／μgＤＮＡであった。以下の実施例１５に記載するＰＣＲ分析により、二つのトランスフェクタントは、テトラサイクリン耐性およびcryIIＡ遺伝子に陽性を示した。二つのトランスフェクタントはＨＤ７３::pＳＢ１３４.５.２と名付けた。実施例１５：ＨＤ７３::pＳＢ１３４.５.２組換え株のＰＣＲスクリーニングＨＤ７３::pＳＢ１３４.５.２組換え体中の導入cryIIＡ遺伝子およびテトラサイクリン耐性マーカーの存在は、実施例１３に記載されるようにＰＣＲにより確認した。cryIIＡ遺伝子をスクリーンするために、プライマーcryIIＡ１およびcr yIIＡ２を用いて０.５７kbフラグメントを生成した。プライマー配列は上記表４に示す。実施例１６：Ｂ.t.株の形質導入一般化形質導入は、一つの株のクロモゾームに組込まれた結晶遺伝子をエレクトロポレーションにより容易に形質転換しない株のクロモゾームに移すことによって構築した。これらの例では、組込まれた結晶遺伝子、ＨＤ７３::pＳＢ２１０. ２を含む一つの株をＤＮＡ用ドナーとして用い、株ＳＡ１１、ＳＡ１２およびＳ２８７を含む幾つかのＢ.t.株を形質導入した。遺伝的変換の手段としての一般的形質導入は、広く用いられてマーゴリンによりＥ.コリおよびＳ.チフィムリウムをよく特徴づけ、そしてソーン(1978)により記載されるようにある程度、バシラス・スリンギエンシスに用いられた（マーゴリン、「エシェリキア・コリ・アンド・サルモネラ・ティフィムリウム」、セルラー・アンド・モレキュラー・バイオロジー(1987)：ソーン、「トランスダクション・イン・バシラス・スリンギエンシス」、アプライド・アンド・エンビロンメンタル・マイクロバイオロジィ，３５：1109−115(1978)）。土壊から分離され、バシラス・セレウス染色体マッピング実験で用いられる一般的形質導入ファーシＣＰ５１は、ソーン,Ｃ.Ｂ.から得た（ソーン,Ｃ.Ｂ.、「トランスジューシング・バクテリオファージ・フォー・バシラス・セレウス」、ジャーナル・オブ・バイロロジィ，２：６５７−６６２(1968)および「トランスダクション・オブ・バシラス・セレウス・アンド・バシラス・アンスラシス」、バクテリオロジカル・レビュース，３２：３５８−３６１(1968)）。ソーン等は、ソーン(1978)上掲により記載されるように、Ｂ.スリンギエンシスを含むバシラスの他の株に対して、さらにファージを試験した。株ＳＡ１１、ＳＡ１２、Ｓ２８７およびＨＤ７３の細胞は、上記実施例８に記載した方法に従って生育して、約１０⁷ＣＦＵ／mlに希釈した。組換え株ＨＤ７３::pＳＢ２１０.２、分離物番号２を用い、ファージＣＰ５１を繁殖させた。ＣＰ２１０.２と名付けられた得られる溶解質の力価は、ml当り１.２×１０⁸プラーク形成単位（ＰＦＵ）であることが決定した。滅菌ＨＡフィルター（ミリポア）をＬＢプレート表面上に置き、次いで１００μlの各ファージ溶解質ＣＰ２１０.２および細胞をピペットでフィルター上に取り、滅菌ウィヤースプレッダーを用いゆるやかに混合した。プレートを３７℃で３時間インキュベートした。フィルターをエリスロマイシン（１０μg／ml）を含むＬＢプレートに移し、３７℃にもどし、３６時間、生育させた。プレート形質導入の結果を以下の表５に示す。効率は、プラーク形成単位当り得られたエリスロマイシン耐性コロニーの数として表す。ＨＤ７３、ＳＡ１１およびＳＡ１２については、１.２×１０⁷プラーク形成単位をプレートした。Ｓ２８７については、４×１０７ＰＦＵをプレートした。実施例１７：組換え株のポリメラーゼ連鎖反応スクリーニング全ての組換え株のＰＣＲスクリーニングは、実施例１３に記載したように全細胞を用いて行った。略称「ＣＰ」で表示される、エリスロマイシン耐性コロニーは、野生型株に比べての遺伝子含量のＰＣＲにより分析した。結果は以下の表６に示す。組換体は、親株に見られた結晶遺伝子の配置を維持した。組換え株のみが、導入されたcryＩＣおよびermＣ遺伝子に特異的なプライマーに陽性であった。cry ＩＡ(b)遺伝子をスクリーニングする際、（表２で上記した）ＴＹ６およびＴＹ１４プローブの組合せを初めに用いたが、この対は、cryＩＣ遺伝子のみを含むコントロールプラスミドpＳＢ２１０.２と幾らかの交差反応を示した。続く実験では、上記表２に記載したＴＹ１３を、ＴＹ１４と置き換えた。実施例１８：野生型と組換えＢ.t.株プラスミドの比較組換えＢ.t.株のプラスミドは、以下のような修飾した、バーンボインおよびドリィ(1979)、上掲、のアルカリ溶解操作により分離した。株をＬＢ＋テトラサイクリン上で画線し、３０℃で一晩生育し、新鮮なＳＡ（１Ｘスピジゼン塩、１％カザミノ酸、５％グルコース、０.０００５mＭＭnＳＯ₄Ｈ₂Ｏ）プレート上で再び画線し、３７℃で３ないし４時間生育した。各株について、２−３ループの細胞を、氷上（１００μlＴＥＳＬ１００mＭトリスpＨ８、１０mＭＥＤＴＡ、２０％シュークロース、２mg／mlリゾチーム）中に懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートした。２００μl溶解溶液（０.２ＮＮaＯＨ、１％ＳＤＳ）を加え、管反転により静かに混合し、混合物を室温で５分間インキュベートした。１５０μlの氷冷酢酸カリウム溶液を加え、管反転により混合した。次に、溶液を４ ℃、１５０００rpmで２０分間、遠心した。上清を使い捨ての広い口径のホールピペットで回収し、次いで１mlの１００％エタノールに加え、管反転により混合した。次いで、混合物を４℃、１５０００rpmで２０分間遠心した。上清を吸引により除去し、ペレットを１mlの７０％エタノールに再懸濁し、管反転により混合し、次いで室温で５分間遠心した。上清を吸引により除去し、次いでペレットをスピードバグ中、２分間、真空乾燥した。乾燥ペレットを２０μlのＴＥ中に再懸濁し、氷上で約１５分間インキュベートし、管の側面をたたくことにより静かに混合した。ＤＮＡを１×ＴＡＥ、０.８％アガロース中、７０Ｖ／３２mＡmpで３時間、電気泳動した。これらの組換体のプラスミドプロフィールは、それらがそれらの野生型の親株と同一であることを示し、それらが所望しないプラスミドを運ばないことを確認した。実施例１９：野生型とハイブリッドＢ.t.株染色体ＤＮＡの比較ＨＤ７３株中の組込み体（integrant）、並びに株ＳＡ１１、ＳＡ１２およびＨＤ７３中のトランスダクションの染色体ＤＮＡをＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験により分析した。３つのプローブフラグメントをpＳＢ１３９から分離した。（a）既知phosＣ配列のＢamＨＩからＣlaＩに１８００bp伸ばす一般的ホスフォリラーゼＣ（phosＣ）プローブ。（b）ＢamＨＩからＥcoＲＩに８５０bp伸ばすＥco left（Ｅ_L）。（c）Ｅco right(ＥＲ)、１４２７bpＥcoＲＩフラグメント。実施例１１に記載した通りの野生型ＨＤ７３からの染色体ＤＮＡを２ＸＴＹ培地（５g酵母エキス、５gトリプトン、２.５g ＮaＣl／Ｌ）中、培養物の１００m l試料から分離した。野生型ＳＡ１１、ＳＡ１２およびＨＤ７３並びに対応するトランスダクタントの染色体ＤＮＡをベーリンガー・マンハイムのＡＳＡＰキットを用い、製造者の指示に従って分離した。染色体ＤＮＡは、サンブロック等の方法（サンブロック等、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリィ・マニュアルン、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ・プレス(1989)）に従って、ＥcoＲＩまたはＡpaＩで完全に消化し、ＥtＢr含有ＴＢＥ緩衝液中、０.８％アガロース上で分離し、脱プリンし、変性し、中和し、２０×ＳＳＣ中、一晩毛細管ブロッティッングによりハイボンドナイロン膜に移した。ＤＮＡは０.４ＭＮaＯＨを用い、２０分間、膜に固定した。サザンハイブリダイゼーションは、アマーシャムＥＣＬキットを用い、プロトコールに従って実施した。大きなphosＣプローブを用いるＨＤ７３由来のＥcoＲＩ消化ＤＮＡとＨＤ７３ ::pＳＢ２１０.２のＤＮＡハイブリダイゼーションによる分析は、組込みベクター、pＳＢ２１０.２から期待された２.４kbおよび４.３kb内部フラグメントを明らかにしたが、組込み部位または隣接部分のいずれかで染色体部分を明確に示さなかった。内部ベクターバンドと隣接する部分であることが後に測定されたバンドの強度の違いの大きな矛盾は、多重組込み事件が生じたかも知れないことを示した。Ｅ_Lプローブを用いる同一フィルターのさらなる分析は、組込み体および野生型試料の染色体ＤＮＡ中期待された内部ＥcoＲＩフラグメントだけでなく、１.８kbバンドをも明らかにした。この結果は、phosＣ遺伝子内に存在するＥco ＲＩの１.８kb上流にＥcoＲＩ部位があることを示す。Ｅ_Rプローブとのハイブリダイゼーションは、組込み試料中の内部フラグメント並びに組込み体および野生型ＤＮＡ双方で、内部phosＣＥcoＲＩ部位から下流の次のＥcoＲＩ部位を確認する、約９kbバンドを示した。野生型および全組込み体双方のphosＣＥcoＲＩ部位の上流および下流の同一ＥcoＲＩバンドの存在は、組込みが期待通りに染色体ホスフォリパーゼＣ部分に生じたことを証明する。ＡpaＩで消化した同一ＤＮＡ試料の同様のサザンブロット分析は、多重組込みが生じたことを示した。単一組込み事件が生じた分離体由来の染色体ＤＮＡは、おのおのが組込みベクター、pＳＢ２１０.２内のＡpaＩ位から組込み部位の下流または上流のいずれかに、クロモゾームの野生型ＡpaＩ部位に伸びるＡpaＩフラグメントに対応する、二つのバンドを正しく示す。多重組込みは、同一の上流および下流バンド並びに２つの縦列組込みベクターにより導入されたＡpaＩ部位間に伸びるＤＮＡに対応する付加的内部バンドを生成する。サザン分析は、多重組込み事件が部分内で生じたことを示す、組込みプラスミドの全長に対応する１０.４kbフラグメントを示した。しなしながら、隣接するＡpaＩ染色体フラグメントは、もし二以上の組込み事件が生じると、観察されなかったし測定もできなかった。Ｅ_LおよびＥ_Rプローブを用いる、被導入体ＳＡ１１ＣＰ１、ＳＡ１１ＣＰ２、ＳＡ１２ＣＰ１およびＳＡ１２ＣＰ２由来のＥcoＲＩ消化ＤＮＡのサザン分析も、２.４kbおよび４.３kb内部ＥcoＲＩバンドを明らかにし、形質導入粒子内に運ばれたＤＮＡが所望する組込まれたphosＣ部位から誘導されたことを示した。これらの内部バンドは野生型ＳＡ１１およびＳＡ１２ＤＮＡを含むレーンには存在しなかった。プローブは、また、それらが野生型ＨＤ７３、ＨＤ１−５１および対応する組込み体中で行ったと同様に、同一の大きさの隣接バンドにハイブリッド形成した。ＳＡ１１、ＳＡ１２、ＨＤ７３およびＨＤ１−５１のクロモゾームはphosＣ領域で類似する。交差型事件の現実の（ac tual）部位は、これらのプローブを用いて測定できない。実施例２０：ハイブリッドＢ.t.株の安定性および生存度組換え株ＳＡ１１ＣＰ１およびＳＡ１２ＣＰ２を安定性について分析した。導入遺伝子の安定性は、胞子形成および発芽を通じて抗生物質選択なしに株を生育することにより測定した。組換えＳＡ１１ＣＰ１およびＳＡ１２ＣＰ２並びに野生型ＳＡ１１およびＳＡ１２株をＬＢプレート上に画線し、３０℃で一晩インキュベートした。各プレートからの単一コロニーを用いて５００ml撹拌（baffled）フラスコ中、分離１００mlＣＹＳ培養物を接種した。培養物を３００rpmで撹拌しながら３０℃で生育した。培養物が０.８のＡ₆₀₀に達すると、それらを１：１０に希釈した。培養物の生育を半時間ごとにモニターして生育曲線を測定した。対数期から定常期までのトランジション後、培養物をさらに４８時間生育させた。各胞子形成培養物について、１：１０希釈を行ない、希釈物を６５℃で４５分間加熱した。試料は約１０⁹胞子／mlを含有することが仮定された。試料を希釈し、ＬＢ上に塗布した。組換え株の発芽胞子の数を野生株について得たものと比較した。５０ないし１００のコロニーをエリスロマイシンを含むＬＢ上およびＬＢのみ上にレプリカ培養し、３０℃で一晩インキュベートした。選択マーカーを保持するコロニーの百分率を生存コロニーの数に対して測定した。新しく導入した遺伝子は、エリスロマイシンに対する連続耐性により、およびＰＣＲによって検出されたcryＩＣおよびermＣ遺伝子の存在により測定されるように、胞子形成および発芽を通じて１００％安定であることが判った。自然エリスロマイシン耐性コロニーは得られなかった。ＣＹＳ中、これらの組換え体の生育速度は、開始８時間にわたりそれらの親株と実質的に同一であった。ml当り９ .３×１０⁷および１.５×１０⁸胞子がＳＡ１１（ＷＴ）および組換えＳＡ１１ＣＰ１についてそれぞれ決定された。ml当り３.５×１０⁷および３.４×１０⁷胞子が、ＳＡ１２（ＷＴ）および組換え体ＳＡ１２ＣＰ２について、それぞれ決定された。導入遺伝子は、組換え株の生存度に対し有害な影響はなかった。実施例２１：ハイブリッドＢ.t.株中、遺伝子生成物の発現遺伝子発現について試験するため、組換体および親株の１０mlＣＹＳ（１０g カシトン、５gグルコース、２g酵母エキス、１g ＫＨ₂ＰＯ₄、１ml ５０mＭＭg Ｃl₂、１ml ５０mＭＭnＣl₂、１ml ５０mＭＺnＳＯ₄、１ml ５０mＭＦeＣl₃ 、１ml ２００mＭＣaＣl₂／Ｌ）培養物を３０℃で３６時間生育した。５０μl を等容量の２×試料負荷緩衝液（０.１２５ＭＩトリス−ＨＣｌ pＨ８、４％ＳＤＳ、０.００５％ブロムフェノールブルー、２０％（v／v）グリセロール、４％(v／v)Ｂメルカプトエタノール）と混合し、直ちに５分間煮沸した。２.５、５および１０μlアリコートを１０％アクリルアミドゲル（ノベックス）上に乗せて１２５ボルトで１.５時間、電気泳動した。導入結晶遺伝子の発現は、全ての組換え株のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により明確に検出できた。ＨＤ７３::pＳＢ１４７の場合、新しいバンドが、約６５Ｋdで、野生型株に見られる１３０Ｋdでのバンドの外に検出した。６５ＫdはＣryIIＡ蛋白として予期された大きさである。ＣryＩＣ蛋白として予期された大きさの１３５Ｋdで見られた付加的バンドは、ＨＤ７３::pＳＢ２１０ .２、ＳＡ１１ＣＰ１、ＳＡ１１ＣＰ２、ＳＡ１１ＣＰ３、ＳＡ１１ＣＰ４、ＳＡ１２ＣＰ１、ＳＡ１２ＣＰ２、Ｓ２８７ＣＰ１およびＳ２８７ＣＰ２について見られ、野生型ＨＤ７３、ＳＡ１１、ＳＡ１２およびＳ２８７株については見られなかった。組換え株は、それらの親野生型株により発現される、１３０Ｋdで見られるバンドとして検出される他のＣryＩ型蛋白を発現し続けた。実施例２２：ハイブリッドＢ.t.株致死率バイオアッセイ大部分のバイオアッセイについて、試料は５００ml撹拌フラスコ中、１００ml フィッシュミール（５.５％フィッシュミール、４％スターチ、０.１％ＮＨ₄Ｃl 、０.１２５％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.０５％ＭgＳＯ₄、０.００１％ＦeＳＯ₄、０.００１％ＭnＣl₂／Ｌ）に、３０℃、３００rpmで７２時間生育した。バイオアッセイ番号１０８７では、試料は、５００ml撹拌フラスコ内で１００mlフィッシュミール中、３０℃で生育したが、新鮮な傾斜からの一ループの胞子を接種し、３０℃ で６時間生育した１００mlのフィッシュミールスターターからの５％接種材料を用いた。ＳＡ１１試料（コントロール）およびその組換え体は４１時間後、収集し、ＳＡ１２試料（コントロール）およびその組換え体は、生育の４７時間後、収集した。全試料は、水で１：１０に希釈することにより蛋白発現について試験し、次いで実施例１８で上記したＣＹＳ培養物として処理した。収集後、培養物は４℃で貯蔵した。フィッシュミール培地に生育した組換えＳＡ１１、ＳＡ１２およびＳ２８７株を、以下のプロトコールに従って、トリコプルシア・ニおよびスポドプテラ・エクシグアについてアッセイした。組換え株の試料は１３２g／Ｌコムギ麦芽、２８g／Ｌカゼイン、１１g／Ｌビタミンミックス（ムーアヘッド・アンド・カンパニー、バン・ヌイス、ＣＡ）、８.８g／Ｌ塩ミックス（バイオサーブ、フレンチタウン、ＮＪ）、２.３g／Ｌアスコルビン酸、１.１g／Ｌメチルパラベン、１３ g／Ｌ寒天および１.５ml／Ｌホルムアルデヒドを含む人工昆虫試料と混合した。次いで混合物を２５℃でインキュベートした後期三齢幼虫に与えた。４日後、死亡率を記録し、ＬＣ₅₀を技術分野で既知であるプロビット分析により測定した。全ての組換え株は、それらが誘導された野生型株よりもＳ.エクシグアに対し高い活性を有した。スポドプテラ・エクシグアに対する活性の増加は、１.６ないし２.２倍に及んだ。 cryＩＣ遺伝子は、ファージ溶解質によるエレクトロトランスフォーメーションおよびトランスダクションの技術を用い、バシラス・スリンギエンシスの幾つかの異なる株のクロモゾームに、既知の部位で導入した。トランスダクションにより生成した組換え株については、cryＩＣ遺伝子の発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出し、ＣryＩＣ蛋白は、Ｓ.エクシギアに対する生体活性に寄与した。クロモゾームへのcryＩＣの導入は、非活性プラスミドの不安定性を生じさせず、胞子形成および発芽を通じてそれ自体安定に保持する。実施例２３：Ｂ.t.でのpＬＴＶ１複製の阻害に関する温度の測定Ｂ.ズブチリスＰＹ１１７７（pＬＴＶ１）は、フィル・ヤングマン博士から得られ、カミリ等により記載される（カミリ等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ，１７２：3738−3744(1990)）。pＬＴＶ１ＤＮＡは、バーンボインおよびドリィの方法(1979)、上掲に従ってＰＹ１１７７から分離し、Ｂ.t.クルスタキＨＤ７３は上記実施例７に記載されるようにエレクトロポレーションによりpＬＴＶ１ＤＮＡで形質転換し、被転換体はＨＤ７３＋pＬＴＶ１と名付けた。Ｂ.t.クルスタキＨＤ７３中pＬＶＴ１の複製を終わらせるのに要する温度は、異なる温度での二つの引き続く熱処理、ボホールの方法（ボホール,Ｎ.Ａ.、ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ，１６７：７１６−７１８(1986)）に従って、液体培地中の第一、および固体培地での第二により測定した。１０mlのＬＢte t₁₀を含むフラスコはＨＤ７３＋pＬＴＶ１の単一コロニーを接種した。この一次培養物を３０℃、３００rpmで撹拌しながらＯＤ₆₀₀＝０.４まで生育した。細胞を遠心により回収し、（抗生物質を含まない）ＬＢ中で洗浄してテトラサイクリンを除去し、抗生物質を含まない１０mlのＬＢ中に再懸濁した。再懸濁細胞を用いて、予め３０、３７、４０および４２℃に加温した（１％）１０ml ＬＢ培養物に接種し、培養物は、培養物が０.６ないし０.８の間のＯＤ₆₀₀値に達するまで、それらの関連温度に維持した。次いで、培養物を１０⁴ないし１０⁷の因子により希釈し、希釈液の１００μlアリコートをＬＢery_0.05プレート上に拡げた。各プレートを対応する一次培養のインキュベーション温度で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、ＬＢery_0.05プレートからのコロニーを、抗生物質を含まない４つの異なるＬＢプレート並びにＬＢery₁₀、ＬＢcm₁₂およびＬＢtet₁₀プレート上にレプリカパッチ（replica-patch）した。プレートを３０ ℃で一晩インキュベートし、翌日、抗生物質感受性を計数した。一次培養物をテトラサイクリンを含むＬＢ液体中で生育した実験は、以下の結果を生じた。３０℃のpＬＴＶ１複製許容温度で試験したコロニーの２０％は、エリスロマイシン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンに感受性で、複製の阻害によるプラスミドの損失を示した。３７℃で、９８％のコロニーが３つの抗生物質の全てに感受性であった。４０℃で、９４％のコロニーが３つの抗生物質の全てに感受性で、そして４２℃で、１００％のコロニーが感受性であった。液体一次培養物がテトラサイクリンを含まない実験は、同一温度で熱誘発プラスミド損失を示した。３０℃の許容温度で、テトラサイクリンフリーの培養物は、３８％プラスミド損失（３０℃でインキュベートしたＬＢ＋tet培養物により示される２０％損失より有意に高い）を示した。３７℃、４０℃および４２℃ でインキュベートしたテトラサイクリンフリーの培養物は、それぞれ９４％、９０％および９９％のプラスミド損失を示した。従って、pＬＴＶ１のプラスミド複製は、本研究で用いた実験条件下、３７℃またはそれ以上で阻害されると決定された。それはその複製許容温度でさえ失われうるので、pＬＴＶ１プラスミドはいくらか不安定であるように見える。実施例２４：Ｂ.t.中のpＬＴＶ１産生Ｔn９１７の転座についての条件決定転移コロニーを回収するのは３日、３段階操作である。この方法は、始めにＨＤ７３＋pＬＴＶ１で試験した。まず、ery₁、cm₆およびtet₅を含む液体ＬＢ１０ mlにpＬＴＶ１を含有するＨＤ７３の単一コロニーを接種し、３００rpmで撹拌しながら３０℃でＯＤ₆₀₀＝０.７まで生育した。次いで、この一次培養物を遠心し、ペレット化細胞を１０mlＬＢ中で洗浄して抗生物質を除去した。ery₁とcm₆（しかしtetなし）を含む１００mlＬＢを入れた二つの二次フラスコに１００μlの洗浄した一次培養物を接種した。これらのフラスコの一つを３０℃（許容）で、一方、他のものは３７℃（非許容）で、３００rpmで一晩インキュベートした。一晩生育後、両培養物を希釈し、ＬＢのみ、およびＬＢ ery₁ cm₅プレート上に塗布した。プレートを、対応する第二フラスコをインキュベートしたのと同じ温度で一晩インキュベートした。この第二の一晩加温処理後、３７℃ ery₁、 cm₅含有ＬＢプレート由来の各コロニーを、ＬＢのみ、ery₁ cm₅含有ＬＢ、ery₁ ₀ 含有ＬＢ、cm₇含有ＬＢおよびtet₁₀含有ＬＢプレート上にレプリカパッチし、転座が起きたことを示す、何パーセントのコロニーが、エリスロマイシン、クロラムフェニコールに耐性であるがテトラサイクリンには感受性であるかを測定した。得られたery^rcm^rtet^sコロニーはＨＤ７３::pＬＴＶ１と名付けられた。 pＬＴＶ１によるこれらの実験から誘導されたＨＤ７３コロニーのほとんど１００％が、予期した通り、pＬＴＶ１由来のlacＺ遺伝子の転座を示した。プライマーＬＡＣＮＨＳ１およびＬＡＣＮＨＳ２を用いるery^rcm^rtet^sＨＤ７３コロニーのＰＣＲ分析は、pＬＴＶ１由来のlacＺ遺伝子が全ての場合に存在することを示した。プライマーＴＹ６およびＴＹ７を用いるさらなるＰＣＲ分析は、４０中３８の転移コロニーが未変性cryＩＡ(c)遺伝子を維持することを示した。プライマー配列を以下の表７に与える。Ｂ.t.ガレリアエＨＤ２３２由来のcryIIＡオペロンをＨＤ７３ゲノム上に導入するために、pＳＢ０５０プラスミドを組立てた。Ｂ.t.ガレリアエ株ＨＤ２３２はＵＳＤＡから得た。ＨＤ２３２由来の全cryIIＡオペロンは、実施例５に記載されるpＳＢ３０４から４kb ＢamＨＩＨincIIフラグメントとして分離した。プラスミドpＬＴＶ１を制限酵素ＳmalおよびＢamＨＩでカットして２０.６kbフラグメントを生成し、フラグメントを互いに連結してpＳＢ０５０を形成させた。連結生成物を用いてdam−、dcm-ＧＭ２１６３Ｅ.コリ株を遺伝子導入（transf ect）した。所望の構造物を含む個々のＧＭ２１６３コロニーをまずＬＢamp₇₅上で選択し、次いで各抗生物質不含の、amp₇₅、cm₇、ery₁₀またはtet₁₀含有の、一連の寒天プレート上にレプリカパッチした。試験した５５コロニーの５つは、正しいフラグメントが連結されたことを示す、テトラサイクリン、アンピシリンおよびエリスロマイシン耐性であった。他の全ては、pＬＴＶ１の欠損を示す、テトラサイクリンに感受性であった。耐性コロニーは、ＬＡＣＮＨＳ１とＬＡＣＮＨＳ２プライマーの間の１４００bp生成物のＰＣＲ増幅によりさらにスクリーンした。これらのプライマーの配列は表７に上記され、pＬＴＶ１に含まれるlacＺ遺伝子内にある配列に一致した。ＰＣＲによる増幅並びに、その配列が上記表７に示される、ＮＨＳ３７およびＮＨＳ２１プライマーは、エリスロマイシン遺伝子からcryIIＡオペロンの第一読み取り枠の末端までの部分を生成した。耐性コロニー由来のＤＮＡをＢgIIIによる制限分析により分析して、予期したＰＣＲ結果を示すこれらのコロニー並びに２kb、５.３kbおよび１６kb ＢgIIIフラグメントがpＳＢ０５０と名付けられたプラスミドを含むと考えられた。 pＳＢ０５０プラスミドによるＨＤ７３の形質転換は、１.２kＶ、３μＦおよび∞オームの抵抗で、ＧＭ２１６３から分離したpＳＢ０５０ＤＮＡ５μgによる宿主細胞のエレクトロポレーションにより達成した。細胞は、ＢＨＩＳ培地中、３００rpmで撹拌させながら３０℃の許容温度で３時間で回収した。次いで細胞を濃縮し、１０μg／mlテトラサイクリン含有ＬＢプレート上に塗布し、３０ ℃で一晩インキュベートした。テトラサイクリン耐性ＨＤ７３コロニー中のpＳＢ０５０の存在は、パーキン・エルマー−シータスにより推奨された条件下、ＬＡＣＮＨＳ１およびＬＡＣＮＨＳ２プライマー（１４００bp生成物）並びにＮＨＳ３７およびＮＨＳ２１プライマー（６００bp生成物）を用いるＰＣＲ分析により確認した。これらの分離物はＨＤ７３＋pＳＢ０５０と名付けられた。実施例２６：pＳＢ０５０−産生Ｔn９１７の転座によるＢ.t.ＨＤ７３の５０ＭダルトンプラスミドへのＣryIIＡの導入上記実施例２５で記載したように得られる幾つかのＨＤ７３＋pＳＢ０７０分離物を用い、pＳＢ０５０由来のcryIIＡオペロンをＨＤ７３の大きな非活性プラスミド上に転移した。ＨＤ７３＋pＳＢ０５０分離物は非許容温度でインキュベートし、クロラムフェニコールおよびエリスロマイシン耐性並びにテトラサイクリン感受性について選択した。得られるery^rcm^rtet^sコロニーはＨＤ７３::０５０と名付けられ、転座事件が起きたことを示した。転座は、ＮＨＳ３７とＮＨＳ２１プライマー間の予期した６００bpフラグメント（cryIIＡへのery遺伝子）およびＬＡＣＮＨＳ１とＬＡＣＮＨＳ２プライマーとの間の１４００bp生成物のＰＣＲ増幅により確認した。無傷のcryＩＡ（Ｃ）コード化部分の存在は、その配列が上記表７に与えられている、ＴＹ６とＴＹ７プライマーによるＰＣＲ増幅によって確認した。実施例２７：転移Ｂ.t.株ＨＤ７３::０５０中のCryＩＡ(c)およびＣryIIＡ遺伝子の発現ＨＤ７３＋pＳＢ０５０およびＨＤ７３::０５０の１０００×倍率での顕微鏡観察は、両株が二つの結晶型を生成することを示した。ＨＤ７３の二錐体形Ｃry ＩＡ(c)結晶および立方形ＣryIIＡ結晶が、共にＨＤ７３＋pＳＢ０５０およびＨＤ７３::０５０細胞に観察された。そのような立方形結晶は野生型ＨＤ７３細胞には見られなかった。ＨＤ７３::０５０中のＣryＩＡ(c)およびＣryIIＡの蛋白発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。胞子形成培養物（４０−５０時間令）の１００μl試料をペレット化し、１０mＭＥＤＴＡ中に再懸濁し、氷上で２×ＳＤＳ充填物（l oading）と１対１混合し、３分間煮沸した。１０％プレカスト（pre-cast）ノベックスゲルを流し、クーマシーブルーで染色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、１３５ＫｄＣryＩＡ(c)および６５ＫｄＣryIIＡ蛋白の存在を明らかにした。これらは、二つの分離ブロット上、ＣryＩＡ(c)またはＣryIIＡに対して作られた特異抗血清を用いるウエスタンブロット分析により確認した。実施例２８：Ｂ.t.株ＨＤ７３::０５０の胞子計数よび安定性培養物の相対健康の全体表示として、培養物のミリリットル当りの胞子数を、以下のＢ.t.株の試料：ＨＤ７３野生型並びにＨＤ７３＋pＬＴＶ１、ＨＤ７３＋ pＳＢ０５０およびＨＤ７３::０５０ハイブリッドで比較した。胞子形成培養物を６５℃で４５分間処理し、全ての残っている増殖細胞を死滅した。系列希釈液をＬＢ寒天プレートに塗布し、コロニーを翌日、計数した。ＨＤ７３::０５０中の転移ＤＮＡの安定性は、上で用いた胞子希釈液を、１０μg／mlテトラサイクリン、１μg／mlエリスロマイシンおよび７μg／mlクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天または抗生物質を含まないＬＢ上に塗布することにより測定した。選択による生育コロニーの数を、選択しない生育コロニーの数と比較した。ＨＤ７３::０５０についての胞子計数は、野生型に関するものよりわずかに低かった。それらは１ないし２×１０⁸胞子／mlに及んだ。ほとんど（９７−１００％）のＨＤ７３::０５０は、転移部分が不安定にならず、転座後ＤＮＡから切断したことを示す、正しいery^rcm^rtet^s抗生物質耐性を維持した。実施例２９：Ｂ.t.株ＨＤ７３::０５０のプラスミドプロフィルＨＤ７３::０５０のプラスミドを含量を測定して、転座事件がＨＤ７３のクロモゾームまたは大型のプラスミド上で起きたか否かを評価した。用いたプラスミド調製操作は、実施例１８で記述した通りのバーボインおよびドリィのアルカリ溶解質プロトコール（バーボイン,Ｈ.Ｃ.およびドリィ(1979)、上掲）のわずかな改良であった。ＨＤ７３::０５０および野生型ＨＤ７３からのＤＮＡ調製物のプラスミドプロフィール分析は、トランスポゾンが天然ＨＤ７３株に存在する二つの５０Ｍダルトンプラスミドに挿入されたことを示した。ゲルは、プラスミドバンドの分子量の増加を示し、それらは転移ＤＮＡの分子量と一致する。幾つかのＨＤ７３::０５０分離物では、cryＩＡ(c)遺伝子を運ぶ高コピー数プラスミド５０Ｍダルトンプラスミドは転座標的であった。他の分離物では、低コピー数５０Ｍダルトンプラスミドが転座標的であった。それらがＨＤ７３にも正常に存在する、ＨＤ７３::０５０内の全ての他のプラスミドは、分子量で、明らかな変化を示さなかった。実施例３０：Ｂ.t.株ＨＤ７３::０５０およびＨＤ７３::pＬＴＶ１での転座のサザン分析野生型のＨＤ７３、ＨＤ７３::pＬＴＶ１およびＨＤ７３::０５０由来の全てのＤＮＡ試料は、ＡＳＡＰキットを用い、ベーリンガー・マンハイムのプロトコールに従って調製した。ＤＮＡは過剰のＢamＨＩまたはＥcoＲＩで一晩消化し、２０cm０.８％ＴＢＥアガロースゲル上で１８時間電気泳動し、２０×ＳＳＣ中、一晩の毛細管ブロットによりバイオ−ラドからのゼタ−プローブ膜に移した。次いで膜は、アマーシャムＥＣＬキットに記載されるように処理し、プローブした。上記実施例２５に記載される１４００bp lacＺ遺伝子ＰＣＲ生成物を用いて転移ＤＮＡをプローブした。ＨＤ７３::０５０ＤＮＡに対応するバンドを野生型ＨＤ７３由来のＤＮＡに対応するバンドと比較した。サザンブロット分析は、転座が５０Ｍダルトンプラスミドの異なる位置に組込まれたことを示した。好ましい転座部位は観察されなかった。pＬＴＶ１の制限地図は、ＨＤ７３::pＬＴＶ１由来のＤＮＡが、プロープにハイブリダイズする９kbまたはそれより大のＢamＨＩフラグメントを含むことを示した。この大きさのバンドは、５０Ｍダルトンプラスミドの一つでのpＬＴＶ１の転移部分を示す。同様に、ＨＤ７３::pＬＴＶ１ＤＮＡは、プローブにハイブリダイズする１４kbまたはそれより大のＥcoＲＩフラグメントを含んだ。全ての場合に、予期したバンドはサザン分析でハイブリダイゼーションを示した。ハイブリッド化バンドは同一の大きさではなく、従って、pＬＴＶ１転座事件がＨＤ７３ゲノム内の任意の所で起きたことを確認した。ＨＤ７３::０５０分離物のサザンブロット分析は、ＢamＨＩ消化についての１２kbまたはそれより大の、およびＥcoＲＩ消化についての１７kbまたはそれより大の予期したバンドを示した。ＨＤ７３::pＬＴＶ１とＨＤ７３::０５０の間のハイブリッド化バンドの大きさの相違は、ＨＤ７３::０５０の転移部分内のcryI IＡ遺伝子の存在による。これは、転移cryIIＡ遺伝子がＨＤ７３ゲノム内に任意に挿入されたことを裏付ける。実施例３１：Ｂ.t.株ＨＤ７３::０５０致死率ＨＤ７３::０５０および野生型ＨＤ７３の新鮮な一晩のコロニーをヤマモトにより記載されたＣＹＳ培地５００ml中に別々に接種し、遠心により収集し、３００rpmで撹拌しながら３０℃で５５時間、生育した（ヤマモト,Ｔ.、1990、ＡＣＳシンポジウム・シリーズ，４３２：４６−６０）。細胞を１／２０容量の緩衝液Ａ（５mＭトリスpＨ８．０、０.２５％トリトン）中に再懸濁し、細胞溶解質を８％ノベックスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。ＣryＩＡ(c)蛋白の濃度を自記濃度記録計走査により測定した。１９の２倍希釈液を緩衝液Ａで作り、ＣryＩＡ(c)のppm量を各希釈液について計算した。既知量の蛋白を昆虫の餌と混合し、三齢後半のトリコプルシア・ニおよびスポドプテラ・エキシグア幼虫に与え、幼虫は２５℃で４日間インキュベートし、次いでそれらの死亡率を計数した。バイオアッセイ結果は、ＨＤ７３::０５０ハイブリッドが野生型ＨＤ７３よりも高い活性を有することを示した。Ｔ.ニによる結果は、野生型ＨＤ７３はＬＣ₅ ₀ ＝３.５ppmを、一方、ＨＤ７３::０５０はＬＣ₅₀＝２ppmを示すことを示した。Ｓ.エクシグアによる結果は、野生型ＨＤ７３についてはＬＣ₅₀＝４７５ppmおよびＨＤ７３::０５０についてＬＣ₅₀＝２２５ppmを示した。本発明は、以下の数字１および２が付された条項により要約され、そして以下に付加される請求の範囲により定義される。１．a）バシラス・スリンギエンシス中で複製でき、そして発現できる一またはそれ以上の殺虫剤コード化ＤＮＡ配列並びに染色体バシラス・スリンギエンシスＤＮＡとホモロガスなＤＮＡ配列（そして該ホモロガスＤＮＡ配列は、該ＤＮＡセグメントのクロモゾームへの挿入を指令し、それにより該殺虫剤コード化ＤＮＡ配列はバシラス・スリンギエンシス染色体ＤＮＡに挿入される）、または b）バシラス・スリンギエンシス中で複製でき、そして発現できる一またはそれ以上の殺虫剤コード化ＤＮＡ配列および染色体バシラス・スリンギエンシスＤＮＡに任意に組込むことができるＤＮＡ配列（そして該ＤＮＡ配列は、該殺虫剤コード化ＤＮＡ配列を含む染色体ＤＮＡに安定に組込まれる）、を含むＤＮＡセグメント。２．a）染色体バシラス・スリンギエンシスＤＮＡにホモロガスであるか、または染色体バシラス・スリンギエンシスＤＮＡに任意に組込むことができるＤＮＡ配列を得ること、 b）該ＤＮＡ配列に一またはそれ以上の殺虫剤コード化ＤＮＡ配列を有効に連結すること、 c）ＤＮＡセグメントを得ること、 d）バシラス・スリンギエンシス株を形質転換すること（それによりＤＮＡセグメントが染色体ＤＮＡに取込まれる）、および e）形質転換宿主（殺虫剤コード化ＤＮＡ配列が宿主染色体ＤＮＡに安定に取込まれ、宿主内で発現し、そして複製できる）を得ること、を含む、形質転換バシラス・スリンギエンシス宿主の製造法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．バシラス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）中で複製でき、そして発現できる、少なくとも一つの殺虫剤コード化ＤＮＡ配列を含む線状ＤＮＡセグメント（該配列の５'および３'両部分はバシラス・スリンギエンシス染色体ＤＮＡに存在する配列とホモロガスな（homologous）ヌクレオチド配列を含み、それにより該殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は細菌染色体ＤＮＡに挿入することができる）、またはバシラス・スリンギエンシス中で複製でき、そして発現できる、少なくとも一つの殺虫剤コード化ＤＮＡ配列を含む環状ＤＮＡセグメント（該配列の５'または３'のいずれかの部分はバシラス・スリンギエンシス染色体ＤＮＡに存在する配列とホモロガスなヌクレオチド配列を含み、それにより該殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は、細菌染色体ＤＮＡに挿入することができる）。２．グラム陰性細菌からの複製の起源および選択マーカーをさらに含む、請求項１のＤＮＡセグメント。３．請求項１および２のＤＮＡセグメントを含むハイブリッドベクター。４．先行請求項のＤＮＡセグメントを含むバシラス・スリンギエンシス宿主。５．殺虫有効量の請求項４の宿主およびそのための基剤を含む殺虫組成物。６．請求項３のベクター或は請求項１または２のいずれかのＤＮＡセグメントをバシラス・スリンギエンシス株に導入すること、および得られる被転換体を分離すること（殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は宿主染色体ＤＮＡに安定に組立てられ、そこで発現でき、そして複製できる）の段階を含む、形質転換バシラス・スリンギエンシス宿主の製造法。７．ａ）請求項６のバシラス・スリンギエンシス宿主を形質導入ファージにさらすこと、ｂ）該ファージを該宿主中で複製させること（宿主染色体ＤＮＡ中で組込まれた、一またはそれ以上の殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は該ファージに取込まれる）、およびｃ）該殺虫剤コード化ＤＮＡ配列をファージからレシピエントバシラス・スリンギエンシスに導入すること（該導入殺虫剤コード化ＤＮＡ配列は該レシピエントの染色体ＤＮＡに安定に取込まれ、発現する）、を含む、形質転換宿主を形質導入すること、およびレシピエントバシラス・スリンギエンシスを調製することをさらに含む、請求項６の方法。８．バシラス・スリンギエンシス宿主およびレシピエントがバシラス・スリンギエンシス・クルスタキの株から選択される、請求項６および７の方法。９．殺虫剤コード化ＤＮＡ配列がcryＩＣ配列またはそれとホモロガスの配列である、請求項６、７または８の方法。