CN1121733A - 含有编码杀虫蛋白质的基因的dna片段 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过将外源结晶体毒素编码DNA序列稳定地整合到宿主苏云金芽孢杆菌的染色体DNA中。从而扩大苏云金芽孢杆菌菌株的杀虫谱和/或毒性的方法，其中外源DNA序列被表达，而且也可表达在固有质粒上的结晶体毒素编码DNA序列。本发明还涉及包含有所述外源DNA序列的苏云金芽孢杆菌宿主，制备所述宿主的方法，含所述宿主的杀虫组合物和其使用方法。

Description

含有编码杀虫蛋白质的基因的DNA片段
本发明涉及微生物杀虫剂，具体地说涉及构建具有更大昆虫毒性和更广的昆虫宿主范围的杂种微生物。本发明在保护植物抵御昆虫侵染方面是有用的。
近年来，对苏云金芽孢杆菌(B.t.)和其在生物学防治植物的昆虫侵染方面进行了许多研究。这些来自孢子形成期间毒性结晶体蛋白的昆虫病原体称为类芽孢晶体。
根据其不同的鞭毛抗原，将具有不同昆虫宿主谱的B.t.菌株分为不同的血清型或亚种。大多数B.t.菌株具有抗包括蝴蝶的蠋和蛾在内的某些鳞翅目成员之幼虫的活性，但有些也对分别包括蚊幼虫和甲虫幼虫在内的双翅目或鞘翅目的成员有毒性。尚未证明过几种生产结晶的菌株的毒性。
B.t.的结晶内含物在幼虫的中肠溶解，释放一种或多种27到140kd的杀虫晶体蛋白质，或δ内毒性。大多数结晶体蛋白质是原毒素，在昆虫中肠中经蛋白水解变成较小的有毒多肽。通常，本领域熟知将晶体蛋白质称为Cry，将编码所述蛋白质的基因称为cry。
已描述了42种以上的B.t.cry基因。 Hofte和Whitely(1989，Microbiol，Rev.，53：242)公开了cry基因的分类表，根据所编码蛋白质的结构相似性和杀虫谱将所述基因分成四大类和几个亚类。这四大类包括鳞翅目特异性的(I)，鳞翅目和双翅目特异性的(II)，鞘翅目特异性(III)的和双鞘目特异性(IV)的基因。
鳞翅目特异性基因(cryI)编码在苏云金芽孢杆菌孢子形成期间于双锥形结晶包含体中积聚的分子量为130到140kd的蛋白质。根据序列同源性(＞50％的氨基酸相同)，可以将cryI基因与其它cry基因区别开。这三种基因，cryIA(a)、cryIA(b)和cryIA(c)具有80％以上的氨基酸一致性，并因此认为它们是不同的亚型。最近鉴定的cryIB、cryIC和cryID基因彼此不同，而且与cryIA基因也不同。已使用Hofte等人(Microbiol.Rev.53：242～255(1989))所列的35种单克隆抗体，在11种血清型的29个菌株中分辨出晶体制剂中的CryIA、CryIB、CryIC。
鳞翅目和双翅目特异性类包括编码形成立方形包含体的65kd蛋白质的基因。第一个cryIIA基因自苏云金芽孢杆菌亚种KurstakiHD-263克隆了第一个cryIIA基因，并在巨大芽孢杆菌中表达。生产CryIIA蛋白质的细胞对鳞翅目Heliothis virescens和Lymantriadispar种以及双翅目Aedes aegypti种的幼虫有毒性。
鞘翅目特异性类编码对鞘翅目昆虫有活性的产物并且蛋白质分子量约为70Kda。至少已描述了三个鞘翅目特异性苏云金芽孢杆菌菌株：B.t.tenebrionis，苏云金芽孢杆菌圣地亚哥亚种和B.t.EG2158。这些菌株产生含一种主要蛋白质的偏菱形结晶体。
双翅目特异性类的cryIV基因由一个相当异源的双翅目特异性晶体蛋白质基因组成。从存在于苏云金芽孢杆菌以色列亚种的菌株中的相同72Md质粒中分离了cytA和其它四种基因。cryIVA、cryIVB、cryIVC和cryIVD分别编码135、128、78和72kd的蛋白质。在卵形结晶体复合物中，这些蛋白质与26kd的cytA基因产物组装在一起。已在B.t.inorrisoni亚种PG-14菌株中观察到具有相同或相似蛋白质组成的晶体复合物。用来自B.t.以色列亚种或重组大肠杆菌或芽孢杆菌的cryIV类晶体蛋白制品所作毒性试验表明对一些种蚊子的幼虫有不同程度的毒性。
自从Hofte和Whitely最初分类以来，已经克隆了许多新的cry基因并确定了它们的核苷酸序列。Yamamoto和Powell[1993“Bacillus thuringiensis Crystal Protein pps3-42inAdvanced Engineered Pesticides”ed.Leo Kim]公开了不同的分类系统。
通常将苏云金芽孢杆菌的商业制品用于许多农作物，成荫树木和观赏植物以控制各种昆虫并且可以与使用化学杀虫剂相同的设备来使用这些制品。评估喷洒有效范围的方法是本领域技术人员熟知的。
可以将含杂种细菌的组合物作为喷雾剂，粉剂或饵，单独或与寄生菌，捕食者或其它控制方法如化学杀虫剂辐射诱导的灭菌、化学消毒剂、信息素等结合使用。应激物可以增强致病性或激活由本发明杂种细菌引起的慢性侵染。转化B.t.的已知方法包括原生质体融合、原生质体转染、转导、电穿孔和结合的方法。
由于电穿孔简单，迅速有效，因此常用于转化B.t.。1989年还研制了B.t.穿梭载体。将B.t.晶体毒素基因移至一称为cryB的晶体-(Cry)B.t.菌株中，所得表达130kd晶体蛋白质的转化体，从而首次证明该穿梭载体的实用性。
最近已开发了各种得自天然B.t.质粒的克隆和表达载体，例如掺入B.t.以色列亚种3.65Md质粒和pBR322的穿梭载体；来自B.t.Kurstaki HD263 HD73 HD1的质粒；来自B.t.以色列亚种和大肠杆菌载体的质粒。用上述一种穿梭载体将鞘翅目活性毒素基因移至B.t.以色列亚种菌株中，可将杀虫活性谱扩大到了双翅目和鞘翅目。
使用该技术的一个严重问题是天然和外源质粒间的不稳定性或不相容性。通常，一个或多个天然B.t.质粒不能与导入细菌的外源质粒共存，而使天然质粒通过分离迅速丢失。当天然质粒含一个或多个将保留于转基因B.t.菌株中的cry基因时，就会产生困难。除去引起重组(或外源)和天然质粒间不相容的部分B.t.质粒载体即可克服这一问题。
已经研究了将外源DNA稳定地导入细菌中的方法。用以B.t.为基础的天然相容性载体将鞘翅目活性cryIIIA基因转移到一B.t.Kurstaki菌株中，所得的转基因菌株表现出高水平的鞘翅目活性，同时还保留了其野生型鳞翅目活性。如果所述质粒带有与部分宿主染色体同源的DNA片段，也可以用不能自主复制并携带有选择标记的质粒转化细菌。在上述实例中，已显示质粒通过涉及质粒和同源宿主序列的单一交换机制与宿主相互作用。结果是整合的质粒侧翼接有同源DNA片段的直接重复序列片段。如果复制片段的两个未端均含在一个转录单位内，则所述插入是诱变的。
Delecluse等人利用同源重组使B.t.以色列亚种中的cytA杀虫蛋白编码基因失活(Delecluse et al.，J.Bacteriol，173：3374-3381(1991))。构建含部分cytA序列的整合载体，并与B.t.以色列亚种72Md固有质粒同源重组。另外，Calogero等人构建了携带B.t.Kurstaki HD73的完整CryIA(c)编码区的的枯草芽孢杆菌整合载体(Calogero，S.et al.，Appl.Env.Microbial.55：446-453(1989))。发现该质粒载体表达HD73 cryIA(c)基因。PCT/US91/05930(WO/93/03619)描述了有携带杀虫基因之穿梭载体的重组B.t.以及制备该重组细菌的方法。
然而，上述的一般方法或具体的文献均未对可以通过染色体整合解决B.t.稳定性的问题作任何提示。
本发明涉及晶体基因的稳定保留和表达，其中cry基因被整合到B.t.菌株的染色体中。另外，本发明还涉及构建具有更宽宿主范围和/或新特异性的B.t.菌株。具体地说，本发明涉及构建具有高杀夜蛾活性并保留了抗鳞翅目昆虫效力的B.t.菌株。
本发明涉及DNA片段，所述片段含有一个或多个能在B.t.中复制和表达的编码杀虫剂的DNA序列以及指导所述DNA片段经同源重组插入到B.t.染色体DNA中的DNA序列。
本发明还涉及含有一个或多个能在B.t.中复制并表达的编码杀虫剂的DNA序列和能随机整合到B.t.基因组中的DNA序列的DNA片段。
本发明还包括含有载体(如质粒或穿梭载体)和与之操作相连的本发明DNA片段的杂种载体。
本发明的再一个部分是在其染色体中已整合了所述DNA片段之至少一个编码杀虫剂的DNA序列的杂种B.t.宿主。
本发明还涉及制备本发明DNA片段的方法，该方法包括下列步骤：得到与B.t.染色体DNA序列同源的DNA序列；在其上可操作地连接至少一个编码杀虫剂的DNA序列以便当用该DNA片段或其上可操作地连接有该DNA片段的杂种载体转化B.t.时，即可表达编码杀虫剂的DNA序列。
本文还提供另一种制备转化的B.t.宿主的方法，包括a)得到能随机整合到B.t.染色体DNA中的DNA序列；b)将能在B.t.中复制并表达的一个或多个编码杀虫剂的DNA序列与所述DNA序列可操作地相连；c)得到DNA片段；d)用该DNA片段转化B.t.宿主，其中所述片段随机整合到B.t.宿主染色体中；以及e)分离转化的宿主并且其中编码杀虫剂的DNA序列作为被转化的宿主得以表达。
本发明还包括用上述DNA片段或杂种载体转化B.t.宿主，并使之发生同源重组并将编码杀虫剂的DNA序列稳定地整合到B.t.染色体中，然后分离被转化的宿主以制备表达至少一种外源杀虫剂的杂种B.t.宿主的方法。
本发明公开了一种广谱的，含有本发明杂种宿主和载体，可选择地含有其它杀虫产品的杀虫组合物。在一个实施方案中，如上所述编码杀虫剂的DNA序列仍是可表达的，通过转化B.t.可扩大B.t.的杀虫范围。
本发明还包括保护植物免于昆虫侵害的方法，该方法包括给植物或植物周围的土壤施用有效量的本发明杀虫组合物。
从下文包括有关的实施例，附图和序列鉴定的讨论中会更加清楚地了解本发明。
附图：
图1描述包括革兰氏阴性复制原点的质粒pSB210.
图2显示pSB147质粒的衍生及其家族树。
图3描述包括pSB210序列的质粒pSB210.1。
图4描述包括pSB210.1序列的质粒pSB210.2。
图5显示pSB210.3质粒的基因图谱。
图6显示pSB147质粒的基因图谱。
图7描述pSB136质粒的构建。
序列鉴定列于表2和5以及实施例3、5和11中。
本发明扩大了现有技术中B.t.的狭窄的杀虫范围。将外来编码杀虫剂的基因导入已知细菌菌株的染色体，可以构建含有一个以上有更宽宿主范围之编码杀虫剂的基因的杂种B.t.菌株。因此，本发明通过增加菌株产生的不同杀虫结晶体蛋白质的数目，提供了增加B.t.菌株宿主范围的方法。
在重组B.t.菌株中导入的质粒会导致细胞中固有质粒的不稳定性，而被导入的质粒自身也可能不稳定。这常常引起细胞中所含结晶体基因表达的损失。本发明通过将结晶体基因导入宿主染色体以在不会干扰宿主固有质粒上所含的现存结晶体基因的情况下表达之，从而避免了这一问题。
因此，本发明提供了包含一个或多个编码杀虫剂的DNA序列的DNA片段；和与B.t.的染色体DNA序列同源的DNA序列，其中在所述B.t.中复制并表达插入染色体中的所述编码杀虫剂的DNA序列。
编码杀虫剂的DNA序列可以是任何能在B.t.细菌中表达的编码杀虫蛋白质的DNA序列。适用于本发明的编码杀虫剂的DNA序列包括但不限于B.t.任何亚种和/或菌株的cryIA(a)、cryIA(b)、cryIA(c)、cryIB、cryIC、cryID、cryIE、cryIF、cryIIA、cryIIB、cryIIIA、cryIIIB、cryIIIC、cryIVA、cryIVB、cryIVC、cryIVD和cytA基因及任何幼虫芽孢杆菌(B.larvae)和日本甲虫(B.papillae)菌株编码杀虫蛋白质的基因，以及已知在杆菌或尤其是其他革兰氏阳性细菌中表达的所有其他编码杀虫蛋白质的基因。另外编码杀虫剂如α淀粉酶抑制剂，蛋白酶抑制剂以及来自细菌的任何其他毒素的DNA序列也是适用的。
适用于本发明DNA片段的同源DNA序列包括与如上文所列的任何B.t.菌种或菌株的任何染色体DNA片段基本上同源的DNA序列。同源DNA序列允许并指导本发明的DNA片段通过其与细菌DNA的同源重组而整合到宿主的DNA中。当本发明的DNA是作为环状的共价闭合DNA片段被提供时，可借助宿主DNA和同源DNA序列间的单一交换过程发生同源重组。当DNA片段作为线性DNA片段被提供时，则可借助宿主DNA与所需编码杀虫剂的DNA侧翼的同源DNA序列间的双交换过程发生同源重组。因此，同源DNA序列可以作为一个或两个侧翼DNA序列提供。此外，可以以双股和单股形式提供本发明的DNA片段。可用本领域已知的方法，将双股形式加热或化学变性制得到单股形式。可用本领域已知的酶限制性消化所需的序列，并连接后得到双股形式。
同源DNA序列在大约5个碱基到约20kb的范围内与细菌染色体片段同源。优选的是所述序列与约500个碱基到约10kb的片段同源。更优选的是与约2250个碱基的B.t.磷脂酶C编码区同源。特别优选的是DNA序列与外源杀虫剂生产基因外的B.t.宿主染色体部分同源。若DNA片段含有同源于编码杀虫蛋白质之细菌DNA5′和3′的DNA序列，从上述事实看，本领域专业人员可以了解杀虫剂编码区任一侧同源区的大小。用这种方法，甚至可加入一个新基因来扩大细菌的杀虫范围。
本发明的DNA片段还可含有用于革兰氏阴性细菌的复制原点。可以使用能够在奈瑟氏球菌属、韦荣氏菌属、布鲁氏菌属、巴斯德菌属、嗜血菌属、博德特氏菌属、埃希氏菌属、欧氏杆菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、变形菌属、肠杆菌、沙雷氏菌属、固氮菌属、根瘤菌属、亚硝化单胞菌属、硝化杆菌属、硫杆菌属、假单胞菌属、醋杆菌属、发光杆菌属、发酵单胞菌属、气单胞菌属、弧菌属、脱硫弧菌属或螺菌属等的一种或多种革兰氏阴性菌种或菌株中发挥功能的复制原点。将DNA片段克隆到革兰氏阴性菌如E.coli中并转化苏云金芽孢杆菌后将只保留下DNA序列将那些整合到宿主染色体中的杀虫DNA序列。由于革兰氏阴性复制原点不能在B.t.宿主中起作用，所以除非DNA片段整合到宿主染色体中，否则用该DNA片段转化的B.t.宿主既不复制也不表达杀虫活性。
本发明的DNA片段还可包含有可以在除革兰氏阳性菌外的单细胞生物体中表达的可选择标记，可在革兰氏阳性菌中表达的可选择标记，和/或可在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中表达的可选择标记。可在除革兰氏阳性菌以外的单细胞宿主中表达的可选择标记的定义是能够在除革兰氏阳性宿主以外的单细胞宿主中表达一种表型以用于检测或筛选携带该DNA序列之宿主的任何DNA序列。能够在革兰氏阳性菌中表达的可选择标记的定义是能够在革兰氏阳性菌中表达一种表型，以用于检测或筛选携带所述DNA序列的革兰氏阳性宿主的任何DNA序列。能够在革兰氏阴性和革兰氏阳性菌中表达的可选择标记的定义是能够在革兰氏阴性和革兰氏阳性菌中表达一种表型，以用于检测或筛选携带所述DNA序列之宿主的任何DNA序列。一般说来，实例有药物抗性、化学抗性、氨基酸营养缺陷型或原养型标记，或在筛选或检测突变或重组生物时有用的其它表型变异体标记。可选择标记的存在有利于在革兰氏阴性菌中克隆和/或保持本发明的DNA片段并改善对携带本发明DNA片段之重组B.t.细菌的筛选和/或检测。
本发明还提供至少含有一个能在B.t.细菌宿主中复制并表达的编码杀虫剂的DNA序列，和能随机整合到B.t.宿主基因组DNA中之DNA序列的DNA片段。适用于本发明的随机整合DNA序列是能插入或自我复制的插入序列或转座子序列以及可操作地连接到B.t.宿主染色体或质粒DNA中随机位置上的DNA序列。实例包括转座子，如下文举证的Tn917和Tn1545和Tn916(所有这些均是由Camilli等人描述的，参见Camilli et al.，J.Bacterial，172：3738-3744(1990))或本领域已知的其它革兰氏阳性转座子。尽管已经知道存在随机整合DNA序列或盒，但这是首次应用于将杀虫基因插入革兰氏阳性细菌中。
可以在质粒载体上携带包含有转座子序列的本发明的DNA片段。适用于本发明的质粒包括下文列举的pTV51T和pLTV1。在优选的实施方案中，用温度敏感型质粒筛选转座的宿主细胞。质粒如pTV51T和pLTV1在高于某一温度时不能复制。因此，只有当DNA片段转座到宿主基因组中，温度敏感型质粒所携带的DNA片段才能在非允许的温度下保留于宿主中。可通过筛选可转座元件内所含的标记如药物抗性，氨基酸营养缺陷型或原养型等来提高转座效率。
在特别优选的实施方案中，用本发明的DNA片段在B.t.宿主中产生多个转座过程。就温度敏感型质粒载体来说，可通过迅速升高温度使DNA片段多次插入到宿主基因组DNA中。如果使用携带药物抗性标记的可转座元件，则提高的药物水平将有利于多转座过程。加入丝裂霉素C也会提高转座效率。另外，可以用一大批其中每个元件携带有一独特可选择标记的可转座元件转化革兰氏阳性宿主。
在一个实施方案中，本发明的可转座元件带有对于宿主细胞表达转座的编码杀虫剂的DNA序列必需的所有控制元件。在另一实施方案中，可以设计可转座元件以产生一操纵子或基因融合体，其中编码杀虫剂的序列处于宿主DNA的转录和/或转译控制下。可按照Youngman描述的Tn917介导的操纵子和基因融合方法或本领域已知的其它方法(Youngman，P.“Plasmid Vectors for Recovering andExploiting Tn917 Transpositions in Bacillus and otherGram Positive Bacteria”In Plasmids：A Practical Approach，Handy，K.G.ed.IRLPress79-103(1973))构建操纵子和基因融合。
可利用本发明的可转座元件制备至少表达一种外源杀虫剂的被转化的B.t.宿主，方法是在其上可操作地连接至少一个能在B.t.中复制并表达编码杀虫剂的DNA序列以得到一DNA片段，以便当用该DNA片段转化B.t.时，编码杀虫剂的DNA序列即被整合到B.t.染色体中并可被表达，用所得的DNA片段转化B.t.宿主并使DNA片段随机整合到B.t.染色体中，然后分离被转化的宿主。
可用本领域已知的方法包括酶限制消化、连接、克隆和/或化学合成法制得能随机整合到B.t.基因组中的可转座元件或DNA序列。同样，可用本领域已知的方法得到杀虫基因或DNA序列并且与随机整合的DNA序列可操作地连接。
例如可用转染、电穿孔、转导或接合等方法完成转化。可通过筛选转化宿主上的可选择标记进行宿主分离。在本发明的实施方案中，随机整合的DNA含有Tn917转座子。
可通过维持外源编码杀虫剂的DNA序列的表达并将一个或多个外源杀虫基因与可掺入到B.t.染色体中的可转座元件可操作地连接来扩大B.t.的杀虫范围。
本发明的DNA片段可作为杂种质粒被提供。应懂得可以用任何适于携带本发明之DNA片段的质粒序列构建杂种质粒。特别适用于本发明的是下文实施例1、6和11中描述的pSB210.1、pSB210.2、pSB210.3、pSB136和pSB147。
本发明的DNA片段也可作为革兰氏阳性细菌的杂种穿梭载体被提供。适宜的载体包括任何能在革兰氏阴性菌、酵母、或除革兰氏阳性菌以外的单细胞宿主中自我复制的载体。所述穿梭载体是本领域熟知的。通过将B.t.结晶体毒素基因移入称为cryB的结晶体(-)B.t.菌株中而首次证明了该穿梭载体的实用性。所得的转化体表达130kd结晶体蛋白质。另外，Lereclus等人构建了另一个掺入pHT1030B.t.质粒和pUC18的穿梭载体以将从B.t.407中分离的cryIA(a)基因移入CryB菌株中(Lereclus，D.et al.，FEMS MicrobiolLett.，49：417(1988))。当转移到407菌株的Cry衍生物中时。该毒素的表达水平明显高于在野生型菌株中所见到的水平，这可能是基因拷贝数增加的结果。Miteva等人通过掺入B.t.以色列亚种的3.65Nd质粒和pBR322而构建了一种穿梭载体(Miteva，V.I.etal.，Arch.Microbiol 150：496(1988))。也已描述过使用来自B.t.Kurstaki HD263 HD73 HD1和B.t.以色列亚种的B.t.质粒和E.coil载体构建的穿梭载体。用上述这种穿梭载体将鞘翅目活性毒素基因移入B.t.以色列变种菌株中，以将杀虫活性谱扩宽到包括双翅目和鞘翅目(Crickmore，N.，et al.，Biochem.J.270：133(1990))。
本文还提供了包含至少一个稳定地掺入其染色体中之本发明杀虫DNA序列的B.t.宿主。适宜的B.t.宿主包括上文所列的和下文举证的B.t.亚种和其菌株，以及本领域已知的其它B.t.亚种或菌株。本文所用的术语“宿主”包括B.t.细菌的营养和孢子形式。本发明的DNA片段稳定地掺入宿主染色体是指经过B.t.宿主的许多子代和经过孢子形成和萌发期，DNA片段仍保留在宿主染色体内。
在一优选的实施方案中，被转化的B.t.宿主包含有多个稳定地整合到其染色体中的外源可表达的编码杀虫剂的DNA序列。多序列可含有上述编码杀虫剂的序列的任何组合，包括多拷贝的相同编码杀虫剂的序列的任何组合。在一特别优选的实施方案中，宿主能表达2个或多个不同的杀虫蛋白质。
应明确的是，可以用本发明的DNA片段将任何外源DNA序列稳定地掺入B.t.宿主的染色体。外源DNA是指在整合到宿主染色体中后改变B.t.宿主之染色体DNA的任何DNA。可以以与本文所述的编码杀虫剂的DNA序列相似的方式将所需的DNA导入B.t.中。因此，本发明包括在其染色体中掺入了能由宿主复制并表达的外源DNA序列的B.t.宿主。
通过得到一与B.t.细菌的染色体DNA序列同源的DNA序列，将至少一个编码杀虫剂的DNA序列与其可操作地连接以便当用DNA片段转染B.t.时表达编码杀虫剂的DNA序列，从而制备本发明的DNA片段。
可经筛选B.t.生物体的已知基因组文库得到同源DNA序列。如果没有所需B.t.的基因组文库，则可用本领域已知的方法构建之。筛选方法也是本领域已知的。一旦确定了所需序列，就可用限制酶对其进行切割。如果DNA或肽序列是已知的，就可以用本领域已知的方法合成DNA片段。另外，如果DNA或肽序列是未知的，则可以用基因组限制片段随机克隆同源片段。
可通过连接DNA序列将编码杀虫剂的DNA序列与同源DNA序列可操作地连接，以便在同源重组并将杀虫DNA整合到宿主染色体中后，能够在B.t.中表达编码杀虫剂的DNA。在一个实施方案中，DNA片段含有能指导编码杀虫剂的DNA在B.t.宿主中转录并转译的调节序列。所述调节序列可以包括启动子、操纵基因、阻遏物和/或增强子序列、转录起始和终止位点、核糖体结合位点、转译起始和终止密码子、和/或本领域已知的其它调节序列。例如，可将编码杀虫剂的DNA序列与在其天然细菌宿主内控制编码杀虫剂的DNA表达的调节序列可操作地连接。
在本发明范围内还包括经设计以在宿主DNA内产生操纵子或基因融合体的DNA片段。在操纵子融合体的情况下，DNA片段可包含能指导编码杀虫剂的mRNA转译的控制元件。可以设计同源DNA序列以便将编码杀虫剂的DNA序列整合到宿主DNA内的操纵子中，以便当插入到宿主染色体后，使编码杀虫剂的DNA序列处于宿主操纵子的转录控制下。在基因融合体的情况下，可以设计同源DNA以便将编码杀虫剂的DNA整合到宿主染色体中的结构基因内，从而使宿主的控制元件指导编码杀虫剂的DNA序列的转录和转译。Sambrook等人(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.&Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1989)描述了构建操纵子和基因融合体的技术。
一旦完成构建，即可使用本领域已知的方法如离心或琼脂糖凝胶电泳法分离本发明的DNA片段。
制备本发明DNA片段的方法还可包括一可选择标记，所述可选择标记选自能在除革兰氏阳性宿主外的单细胞宿主中表达的标记，能在革兰氏阳性宿主中表达的标记，以及能在革兰氏阳性和革兰氏阴性宿主中表达的标记。利用单细胞生物体的可选择标记克隆并纯化所述生物体中的DNA片段。
通过将可选择标记与DNA片段连接，或将革兰氏阳性可选择标记插入DNA片段中以便在插入B.t.宿主染色体后，可选择标记不会干扰编码杀虫剂的DNA序列在B.t.宿主中的表达，从而可将本发明的可选择标记与DNA片段可操作地连接在一起。另外，革兰氏阳性可选择标记的连接不应干扰克隆生物体(非革兰氏阳性宿主)之可选择标记的功能而应是在B.t.宿主中可表达的。在一个实施方案中，革兰氏阳性中选择标记携带有所有其表达所需的控制元件。可按与已述者相似的方法设计革兰氏阳性可选择标记。以使之在宿主DNA内的操纵子或基因融合体中发挥功能。
本发明的方法还可包括可操作地连接到上述DNA片段上的其被克隆于其中之单细胞生物体的复制原点。该生物体可以是昆虫细胞、CHO细胞、革兰氏阴性细菌、酵母等。通过将原点放在DNA片段内它不会破坏DNA片段中任何其它元件之功能的位置上，例如杀虫DNA和同源DNA序列之外，而将如上所述的复制原点与本发明的DNA片段可操作地连接。
可按下述方法制备已在其染色体中稳定地掺入了编码至少一个杀虫剂的DNA片段的B.t.宿主：
a)得到本发明的DNA片段；
b)用所述DNA片段转化B.t.宿主；
c)使之发生同源重组并使编码杀虫剂的DNA序列稳定地掺入宿主染色体中；以及
d)分离被转化的宿主。
可以利用本领域技术人员熟知的方法如电穿孔、转染、转导和接合等方法或这些方法的任何组合，用DNA片段转化B.t.宿主。
本文还提供广谱杀虫组合物，其含有杀虫有效量的本发明杂种宿主和其载体。
组合物可含有约106到约1013个杂种微生物/克载体，优选的约1010到约1011个微生物/克载体。但其它量也是适用的。
B.t.宿主可以以营养或孢子形式存在于组合物中。适宜的载体是本领域已知的，而且技术人员可以选择适用于本发明目的的载体。一般地说，载体是既不与杀虫组合物中的宿主也不与将处理的植物相互作用的惰性化合物或组合物。但某些载体可以被植物或土壤生物体代谢并因此是可生物降解的。加入载体如扩展剂、固着剂、湿润剂，包括玉米粉饵、Loco_(硬脂酸胺)喷雾添加剂，Plyac_，TritonB-1956，聚丁烯L-100和H-35，玉米油、Triton B-1946和Cellosize QP4400，硼酸，表面活性剂油，Pinolene_和本领域已知的其它辅剂，可提高杀虫剂组合物的效力和持久性。可按本领域已知的方法将各组分混合和复合在一起，并以粉末液体或气溶胶的形式提供组合物。最好是在低温下制备杂种宿主并在使用前融解之。
本发明的杀虫组合物还可含有其它杀虫化合物。已知包括B.t.的组合物是与各种化学杀虫剂(如由Herfe和Pflaanzenkrankh(Herfs，W.，and Pflanzenkrahkh，Z.，Pflanzenshutz 72(10)：584-599(1965))报告的那些)相容的。因此本发明的杀虫组合物可含有一种或多种由Herfs鉴定的杀虫剂或本领域已知的其它杀虫B.t.宿主或其按本发明制备的杂种。
本发明还提供保护植物免于昆虫损害的方法，包括给植物或植物周围的土壤施用有效量的本发明杀虫组合物。本领域中已知用于施用市售杀虫微生物制品的方法，也适用于施用本发明的杀虫组合物。
一般说来，可经喷洒约108到约1016个杂种微生物/英亩，更好喷洒是约1013到约1014个杂种微生物/英亩来施用本发明组合物。最好经喷洒植物来施用所述组合物，而且随后可再次施用。
除非特别说明，下文描述的具体实施例仅用于说明目的而不是为了限制本发明或其任何实施方案。
                    实施例实施例1：构建质粒
用Alexander的方法(Alexander，D.C.，“A Methad forCloning Full-Length cDNA in Plasmid Vectors”，In Wu，R.and Grossman，L.，Eds.，Recombinant DNA part E.Meth.Enzymol，154：41-63(1987))制备感受态E.coli DH5a(GibcoBRL)和GM2163(New England Biolabs)。用Birnboim和Doly的方法(Birnboim and Doly，“A Rapid Alkaline ExtractionProcedure for Screening Recombinant Plasmid DNA”，Nucl.Acids，Res，7：1513-1523(1979))从E.coli中提取质粒。用3步骤方法构建pSB210.2质粒，该质粒携带有cryIC基因，红霉素抗性的枯草芽孢杆菌ermC基因和作为整合靶的由Lechner等人所述的磷脂酶C区域(Lechner et al.，“Molecular Characterizationand Sequence of Phoshpatidyl inositol-SpecificPhospholipase C of Bacillus thuringiensis，Mol.Microbiol，3：621-626(1989))。首先，通过在EcoRI和HindIII位点加入多克隆位点(MCS)而从图2中所示和实施例2中描述的pSB140质粒构建图1中所示的pSB210质粒。将使用Applied Biosystems的寡核苷酸纯化试剂盒(cartridges)，按制造商的说明书纯化的寡核苷酸KK14和KK14B(其序列列于下文表2中)退火，以制得MCS。
                    表2寡核苷酸的序列名称：序列(5’-3’)
                                             杂交基因   SEQ
                                                        ID No.Phos1   GGAACGCTACATACTAGTGATAGAGTAG             磷脂酶C    1Phos4   GCTTGTACACCGCAACTGTTTTCGCATG             磷脂酶C    2KK14B   AGCTTGCGGCCGCGTCGACCCCGGGCCATGGGGGCCG    (MCS)      3KK14    AATTCGGGCCCCCATGGCCCGGGGTCGACGCGGCCGCA   (MCS)      4GalP1   CCACAGTTACAGTCTGTAGCTCAATTACC            cryIC      5GalP2   CCGCTACTAATAGAACCTGCACCA                 cryIC      6NHS20   CAATACATTATCCATGGAAAATTCCTCCTTAAATATCATG cryIIA     7NHS39   GAGCAATGAAAGAGTTAGGGCCCTGTTTAAGGTGTCATG  cryIIA     8NHS42   GAGTGAATTATGGGGG                         cryIIA     9NHS43   ATTTTGTATTAAACGG                         cryIIB     10cryIIA1 ACTATTTGTGATGCGTATAATGTA                 cryIIA     11cryIIA2 AATTCCCCATTCATCTGC                       cryIIA     12PG2     GAAATCGGCTCAGGAAAAGG                     ermC       13PG4     CCTTAAAACATGCAGGAATTGACG                 ermC       14PG5     CTATTGGTTGGAATGGCGTG                     ermC       15TYLAA   GAGCCAAGCAGCTGGAGGAGTTTACACC             cryIA(a)   16TYLAC   TCACTTCCCATCGACATCTACC                   cryIA(c)   17TYIUN12 ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC        cryI-type5 18TY6     GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC            cryI-type  19TY13    ACAGAAGAATTGCTTTCATAGGCTC                cryI-type  20TY14    GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC                  cryI-type  21Tet3    CAACAAACGGGCCATAAGCTTGTATAAG             tet        22Tet4    GCCGTCTGTAACGGTACCTAAGG                  tet        23CPO1.Rev  CACCCAGTTTGTACTTCGCAGG                 tet        24
在第二步骤中，将phosC基因加到pSB210中。已使用上面表2中描述的引物Phos1和Phos4经PCR从HD73的总DNA扩增了phosC区域。将PCR产物克隆到pUC18的Smal位点以构建pSB139。从pSB139的2.2kb平头Kpn1，BamHI片段上分离phosC靶区域。经凝胶纯化，然后连接到已用MscI和BamHI消化并用Geneclean药盒(Bio101)按制造商的说明书纯化的pSB210中。所得质粒称为pSB210.1并示于图3中。
最后的步骤是加入结晶体基因、pS8210.2质粒在来自下文实施例3中所述的pSB619的4.2kb ApaI-NotI片段上含有cryIC基因。用ApaI和NotI消化pSB619，然后分离4.2kb的ApaI-NotI片段。将4.2kb的ApaI-NotI片段与用ApaI和NotI消化的pSB210.1连接以形成图4中所示的pSB210.2。pSB210.3质粒在来自用ApaI和NotI消化的pSB013(下文实施例4所述的)的6kb片段上含有分离的cryIC基因。经电洗脱纯化6kb ApaI-NotI片段并与用ApaI切割的pSB210.1相连接以形成图5中所示的pSB210.3。pSB210.3不同于pSB210.2，在于cryIC基因位于cryIIA启动子而不是见于pSB210.2中的天然cryIC启动子之后。在两个质粒中，cryIC基因后均有cryIA(c)终止子。按下文实施例5中所述方法构建质粒pSB147。它携带有作整合靶的磷脂酶C区域，cryIIA操纵子及赋予红霉素抗性的ermC基因。
从GM2163，dam-、dcm-、E.coli菌株(Woodcock，D.M.，Nucleic Acid Res.17：3469(1989))中纯化电穿孔实验中所使用的质粒DNA。实施例2：构建pSB140质粒
构建pSB901质粒以提供红霉素抗性基因ermC。为了构建pSB901，分离作为来自Monod等人所述的枯草芽孢杆菌质粒plM13(Monod etal.，J.Bacteriol，167：138-147(1986))的HindIII/ClaI片段ermC基因。将ermC HindIII/ClaI片段与用HindIII和AccI切割的pUC18连接。为了用来自pSB901的ermC基因取代pBR322中的tetr基因，先用AvaI消化pBR322，然后用E.coli DNA聚合酶I的klenow片段处理线性化的载体以产生平头末端。经用klenow片段处理后，用HindIII消化pBR322，从tet基因片段中纯化出大片段，先用SmaI然后用HindIII消化质粒pSB901，并纯化携带ermC SmaI-HindIII片段的片段。将ermC基因连接到pBR322的HindIII大片段中以得到pSB140。pSB140的衍生示于图2中。实施例3：构建pSB619质粒
将作为8kb EcoRI DNA片段分离的cryIC基因克隆到从Stratagene得到的λZAPII载体的EcoRI位点中。为了分离该基因，用EcoRI消化从USDA得到的苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种HD229(B.t.aizawai HD229)的质粒制品，经凝胶电泳分离片段，并从凝胶上分离出约8kb的片段。另外，可按Honee等人描述的克隆方法(Honee，G.，vanderSalm，T.，和Visser，B.，Nucl.Acids Res.16：6240(1988))得到cryIC基因。以两个不同的反应消化cryIC克隆，一个用HindIII和KpnI，另一个用KpnI和EcoRI。消化产生了含启动子和N末端cryIC序列的2.6kb HindIII-KpnI片段和含C末端序列及终止子的2.3kb KpnI-EcoRI片段。在从Pharmacia得到的pT219R中，将2.6kb的HindIII-KpnI片段与2.3kb的KpnI-EcoRI片段相连接，从而再构建cryIC基因。在cryIC基因的转译起始位点工程化修饰产生特有的NcoI位点。还正好在终止密码子后也产生一个附加的EcoRI位点。这些限制位点能裂解一连续片段中的cryIC完整编码区域。然后将含cryIC启动子和完整蛋白质编码区的3.8kb HindIII-EcoRI片段克隆到带有PCR产生的350bp cryIA(c)终止子的pBluescript载体中。
使用基于已公开的cryIA(c)序列合成的如下两个引物经PCR得到cryIA(c)终止子：
引物1：GTCTCATGCAAACTCAGG，SEQ ID NO.：25
引物2：CTCTGGCGCTCCATCTAC，SEQ ID NO.：26
用从B.t.kurstaki亚种HD73克隆的cryIA(c)基因作为模板。在与T3启动子相同的方向上将PCR产生的终止子克隆到pBluescriptKS＋(Stratagene)的XbaI位点，用klenow处理后修成平头末端。然后将含cryIC启动子和编码区的HindIII-EcoRI片段克隆到pBluescriptKS＋的HindIII-EcoRI位点中。Adang等人(Adang，M.J.，Staver，M.J.，Rocheleau，T.A.，Leighton，J.Barker，R.F.andThompson，D.V.“Characterized Full-leugth and TruncatedPlasmid Clones of the Crystal Protein of Bacillusthuringiensis subsp，kurstaki HD-73 and their Toxicityto Manduca sexta”，Gene 36：289-300(1985))描述了cryIA(c)的克隆和测序方法。该构建体被称为pSB619。实施例4：构建pSB013质粒
苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种的HD-1菌株是从USDA得到的。按Boehringer Mannheim推荐的方法用ASAP试剂盒从HD-1中提取总DNA。在PCR反应中用上文表4中激酶活化的寡核苷酸NHS39和NHS20作为引物以便从B.t.kurstaki亚种HD-1的总DNA得到合完整CryIIA操纵子的1800bp片段，按制造商的说明书(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)使用Vent聚合酶。从凝胶中分离PCR产物并且连接至已用HindII消化过的pTZ19R中。用连接产物转化感受态E.coli DH5α。在含75μg/ml氨苄青霉素(bmp)和40mM Xgal的LB平板上筛选转化体。经用ApaI和NcoI消化来筛选质粒DNA，并用AflIII消化来确定pTZ19R多克隆位点内1800bp PCR片段的方向。将具有预期1800bp片段方向的克隆称为pSB009。
pSB070是一个与pSB619相似的质粒，其含有cryIIIA而不是CryIC的编码区域。为了构建pSB070，按Herrnstadt等人所述方法(Herrnstadt，C.，Gilroy，T.E.，Sobieski，D.A.，Bennett，B.D.，and Gaertner，F.H.，Gene57：37-46(1987))克隆来自B.t.tenebrionis亚种或B.t.san diego亚种的CryIIIA基因。
将含cryIIIA的3.0kb HindIII克隆到pTZ18R(Pharmacia)中，筛选含有cryIIIAC末端编码区域的克隆，所述编码区域与含EcoRI位点的多克隆位点序列相连。为了在pSB070中克隆cryIIIA，利用ATG密码子在转译起始位点产生一特有的NcoI位点。产生NcoI位点后，用NcoI和EcoRI从pTZ18R中切出cryIIIA编码区域，然后克隆到已从中除去了cryIC编码区的pSB619中
用ApaI和NcoI消化含有pTZ19R之中cryIIA操纵子片段的pSB009和含有cryIIIA编码区连同cryIC启动子和cryIA(c)终止子的pSB070。分离pSB070的5667bp片段和来自含cryIIA操纵子之pSB009的1800bp片段。将各片段连接在一起。转化感受态E.coli DH5α细胞.然后在含75μg/ml氨苄青霉素的LB平板上于37℃保温过夜筛选集落。用AfIII＋NotI消化来自12个集落的DNA以鉴定含所需操纵子盒的分离物。该质粒被称为pSB010。
将cryIC基因克隆到pSB010的cryIIA操纵子盒中，按上文实施例3所述方法得到pSB619。用NcoI、EcoRI和BgIII消化pSB619得到全长cryIC编码区并分离3900bp的NcoI、EcoRI片段。用NcoI＋EcoRI消化操纵子盒载体pSB010，然后纯化之。将3900bp的cryIC片段连接到适宜的pSB010NcoI-EcoRI片段上。用连接反应产物转化DH5α，然后在含75μg/ml氨苄青霉素的LB平板上筛选菌落。根据限制性消化产物(AfIII＋EcoRI和AfIII＋BgIII)分析来自12个菌落的质粒DNA。将含育cryIIA操纵子之全长cryIC基因下游区的质粒盒称为pSB013。实施例5：构建pSB304质粒
克隆来自苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(B.t.galleriae HD232)(得自USDA)HD232的cryIIA操纵子以得到pSB304。为了克隆操纵子，用HindIII消化来自B.t.蜡螟亚种HD232的DNA。并经凝胶电泳纯化约5kb的片段。将凝胶纯化的片段与HindIII切割的pTZ18R(pharmacia)相连接，然后转染到E.coli DH5α中。用cryIIA特异性寡核苷酸(CCCATGGATAATGTATTGAATAGTGGAAG)，SEQ.ID.：27检测含cryIIA的克隆。筛选在同方向上含有CryIIA和LacZ基因的克隆。从筛选的克隆中纯化DNA，然后除去含不想要的cryIIA操纵子之上游序列的BamHI片段以得到pSB304。可在Widner等人的文章(Windner，W.R.，and Whiteley，H.R.，“Two Highly RelatedInsecticidal Crystal Protein of Bacillus thuringiensissubsp.kurstaki Prossess Different Host RangeSpecificities”，J.Bacteriol17：965-974(1989))中找到有关cryIIA操纵子和其5′区序列的进一步的资料。实施例6：构建pSB147质粒
按上文实施例2中所述方法得到pSB140。然后将cryIIA操纵子加到pSB140中。cryIIA操纵子的来源是上文实施例5中所述的质粒pSB304。pSB304含有作为BamHI/HindIII片段克隆到pTZ18R中的来自B.t.蜡螟亚种HD232的cryIIA操纵子。用EcoRI和HindIII消化质粒pSB30和质粒pSB140。纯化pSB140大片段，然后将cryIIA操纵子EcoRI-HindIII片段与pSB140大片段相连以得到pSB141。
下一步骤是将一整合靶位点加到载体中。靶位点是携带B.t.kurstaki亚种HD73菌株(得自USDA)的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因(plc)的DNA片段。用聚合酶链反应从HD73总DNA中分离该DNA片段。按Boehringer Mannheim推荐的方法用ASAP盒从B.t.kurstakiHD73中提取总DNA。
B.t.菌株ATCC10792之plc区的DNA序列得自Genbank(登记号×14178)并由Lechner等人作过描述(Lechner.M.et.al.，Mol.Microbiol3：621-626(1989))。除plc基因外，该2254bp序列还含有plc基因上游的454bp和下游的810bp。设计上文表2所述的两个引物Phos1和Phos4，以便与plc基因两测的序列杂交。在用HD73总DNA为模板的聚合酶链反应中使用这些引物以得到携带HD73plc区的2.2kb片段，用E.coli DNA聚合酶I的klenow片段处理PCR产物，然后克隆到用Smal切割的pUC18中以得到pSB139。
用KpnI和BamHI消化质粒pSB139，然后从载体序列中分离plc区。再用KpnI和BamHI切割质粒pSB141，然后将所得的片段与分离的plc区连接。所得的构建体pSB141.5带有质粒pSB141的pBR322区和pSB139的plc区。
接着，用质粒pSB141和pSB141.5得到含有ermC，plc区和cryIIA操纵子的质粒。用BamHI消化质粒pSB141.5。用BamHI消化质粒pSB141并分离带有cryIIA操纵子和ermC基因的片段。将cryIIA/ermC BamHI片段与线性化的pSB141.5连接以形成pSB147。pSB147的酶切图谱示于图6中，pSB147的衍生示于图2。实施例7：用电穿孔法将杂合质粒导入苏云金芽孢杆菌中
通过电穿孔质粒(电转化)而将结晶体基因整合到B.t.细胞中。这些质粒不是含有在细胞中进行复制所必需的革兰氏阳性复制原点，而是携带一个称为phosC区域的DNA区，该区域可作为整合入染色体的靶；并且这些质粒还携带一个提供红霉素抗性的可选择标记。借助于单一交换过程迫使这些已以高浓度被电穿孔的质粒整合到染色体中，从而使该靶位点复制成双。采用该技术以及使用质粒pSB147和pSB210.2获得了HD73菌株的染色体整合体。但是对其他菌株进行检验后发现无法对其电穿孔，并且不能够进行高效率的转化而使之发生染色体整合。用未曾使用过的一次性用菌环从新鲜的培养过夜的LB平板上刮取一菌环细胞接种到含有0.5M蔗糖的100ml脑心灌注液培养基(Difco)(BHIS)中，制备感受态细胞。在1个有档板的烧瓶中，将这些细胞于37℃和300rpm的转速下培养至在600nm处的OD值达到0.2，然后将细胞置于冰上。使用的所有洗涤溶液应是冷却的。将细胞转移到无菌的250ml瓶中并以6000rpm离心7分钟形成团块。将该细胞团用1倍体积的0.5M蔗糖、5mM HEPES(pH7)洗一次，并用1/10体积的相同溶液洗涤2次。将该细胞团重新悬浮于HEPES-蔗糖溶液中至终体积为10ml。将新鲜制备的细胞用于整合性质粒的电穿孔。
将质粒DNA与200μl的感受态细胞混合。对于HD73细胞使用的脉冲参数是kV＝1.25，μF＝3以及Ω＝∞。脉冲发出之后，将细胞转移到置于125ml烧瓶中的5ml BHIS中，并将其于30℃下用250rpm的转速振荡3小时以使细胞复原。对于整合性载体样品，以7,000rpm的转速离心5分钟使该培养物沉淀，然后涂布于含有10μg/ml红霉素的LB平板上。
用pSB098作为测定电穿孔步骤中转化效率的对照质粒DNA。pSB098是一种含有pTZ19R(pharmacia)和pBC16.1的穿梭质粒。pBC16.1是由Kreft(Kreft，J.，Mol，Gen.Genet.162：59(1978))构建的蜡质芽孢杆菌(B.cereus)载体。用EcoRI消化pTZ19R和pBC16.1。将这两个线性化的质粒连接成一个质粒pSB098，在该质粒中氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因有相反的极性。
用从dam-、dcm-菌株GM2163中分离出来的质粒DNA电转化HD73菌株的感受态细胞。结果显示于下列表3中。另外，用质粒210.1转化HD1-51菌株(未给出数据)。
  表3苏云金芽孢杆菌kurstaki HD73的转化效率质粒      数量    数量    转染子数目    效率(转化体/μg
     (μg)   (μl)                   pSB098  DNA
                     HD73菌株pSB210.2   9      10        3             3.5×106pSB147    15      10        8               2×106
对于每个实验，均通过电穿孔0.51μg pSB098细胞并计算出每μgDNA获得的菌落形成单位数而测出表中最后一栏中给出的效率。可根据转化效率估测出细胞对电穿孔条件的反应程度如何。没有得到pSB210.3的转化体。
B.t.kurstaki亚种的HD73菌株得自USDA。(苏云金芽孢杆菌培养物可得自U.S.Deporrtment of Agriculture，USDA/ARSAgriculture Review and Manuals：ARM-S-30 Octomber1982)采用PCR法分析转化体(也称作为重组体和转染体)中的基因内含物。利用引物galp1和galp2，根据cryC基因的存在筛选含有pSB210.2序列的HD73重组体(HD73∷pSB210.2)，并使用引物PG2和PG4筛选存在ermC基因的转化体。使用引物cryIIA1和cryIIA2证实8个HD73∷pSB147克隆中有两个克隆含有cryIIA基因，并且用PG2和PG4证实这两个克隆含有ermC基因。上面表4中列出了这些引物序列。从质粒线图显示HD73∷pSB210.25重组体相同于其亲本菌株HD73。实施例8：用于包裹杂合质粒的噬菌体的制备
按照Thorne(1978)的方法(见上文)，从浸渍了蜡质芽孢杆菌菌株569之被感染孢子的滤纸圆片中得到噬菌体CP51，用一个滤纸片接种含有0.4％甘油的25ml NBY(8克Difco营养肉汤，3克Difco酵母抽提物/L)培养液并在37℃培养16小时，使该菌株复更生，收获该培养物，以10,000rpm离心去除细胞碎片，并使该噬菌体裂解产物通过(0.45μM滤纸过滤灭菌并且贮存于16℃。以不含噬菌体的569菌株分离物作为本底检验测定裂解产物的效价。用1％蛋白胨将该裂解产物稀释10倍和100倍。将569菌株的大约106个细胞与100μl经稀释的噬菌体混合，并加到2ml的TBAB(Difco胰蛋白胨血琼脂基质)软琼脂中。将该混合物铺覆于已在室温下干燥过夜的噬菌体检验(PA)平板(8gDifco营养培养液，5gNaCl，0.2g MgSO47H2O，0.05gMnSO4H2O，0.15gCaCl2·2H2O/1，pH5.9-6.0)上。将该平板在30℃保温过夜，并计数噬菌斑数目。
为了试验对噬菌体感染的易感性，将需要试验的每个菌株(SA11、SA12、S287和HD73)的大约106个细胞铺覆于PA平板上。用一个醮有噬菌体原液的接种环轻触琼脂表面，并将平板在30℃保温。第二天观察所有四个菌株的菌苔上空白区。实施例9：噬菌体的繁殖
用HD73∷pSB210.2的新鲜过夜培养平板上的细胞接种在20mm试管内的6ml LB中。将该培养物在37℃培养4-6小时，检测其光密度值，并用LB将细胞稀释至浓度为3×106个细胞/ml。将添加了0.5ml CP51噬菌体(含4×106个PEU)原液以及1×106或3×106个细胞的4mlNBY软琼脂铺覆于NBYG平板上。将该平板在30℃保温过夜，并将噬菌体收集于5mlPA培养液中。将上层琼脂浸于PA培养液中，并转移到18mm塑料管中。离心沉淀细胞碎片。使标记有CP210.2的裂解物通过0.45μm滤膜灭菌并贮存于15℃。
为了测定效价，将5×106CFU的HD73菌株与100μlCP210.2裂解产物的10-2和10-4稀释液混合，并与2mlNBY软琼脂一起平覆于PA平板上。在30℃保温过夜后，10-4平板上有1200个噬菌斑，估测其效价为1.2×108PFU/ml。实施例10：确定转导条件
使用基于Thorne(1978)(见上文)所述方法建立处理噬菌体的方法。用连续稀释法测出每毫升各B.t.菌株的菌落形成单位以及以噬菌斑形成单位(PFU)表示的每毫升噬菌体原液的效价。
按下述方式测定CP51噬菌体原液的效价。向2mlPA软琼脂中加入0.1ml用1％蛋白胨稀释的噬菌体以及蜡质芽孢杆菌569的约2×107个孢子，并将该已接种的软琼脂铺覆于PA琼脂平板上。将该已铺覆的平板在30℃下保温16-20小时。计数噬菌斑数，根据所使用的稀释度测出噬菌体原液的PFU/ml。采用本领域内使用的标准方法测出B.t.培养物的细胞浓度。结果显示于下列表4中。
表4苏云金芽孢杆菌细胞的菌落(CFU)
   和噬菌体原液效价(PFU)的检测
     CFU            CFU/ml
蜡质芽孢杆菌569     5×107
苏云金芽孢杆菌
HD73              8.6×108
SA11和SA12        2.6×109
S287              1.1×107
PFU                 PFU/ml
CP51                8×106
CP210.2           1.2×108实施例11：构建pSB136质粒
pSB136(如图7中所述)是一种整合载体，该载体有助于将cryIC基因插入到B.t.染色体中。该pSB136载体携带cryIC基因，整合靶位点，四环素抗性基因，以及pBR322载体的一部分。克隆B.t.aizawai亚种HD229的cryIC基因与蜡质芽孢杆菌pSC16-1质粒的四环素抗性基因(tetr)。整合靶位点是一段来自B.t.kurstaki HD1cryB染色体的未知功能的DNA片段。
可以用pSB136质粒将cryC基因放在已经不是四环素抗性的任何B.t.菌株的染色体中。但是，为了发生整合，受体菌株必须具有与整合靶位点同源的序列，并且该菌株必须被高效率地转化(每毫克被转化DNA≥104个转化体)。
采用Alexander的方法(Alexander(1987)，见上文)制备感受态大肠杆菌DH5α。利用具形成文库效能的DH5α感受态细胞(Gibco，BRL Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)，按本领域熟知的方法完成转化。
在含有75μg/ml氨苄青霉素的LB上选择转化体。采用Maniatis等人介绍的方法进行限制性酶消化、连接、乙醇沉淀、苯酚提取、激酶反应以及用T4DNA聚合酶，小牛肠道碱性磷酸酶以及大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段处理DNA(Maniatis，T.，et al.，“MolecularCloning：A Laboratory Manual”，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1982))。
B.t.kurstaki HD1cry-B是一种由Stably等人描述的质粒加工过的HD1菌株(Stably，D.P.，et al.，Biochem，Biophys，Res，Comm.84：581(1978))用下列方法从B.t.kurstakiHD-1 cry-B中分离总DNA。用B.t.接种200ml的2XTY，并在30℃下以200rpm的转速振荡培养过夜。用2ml的上述培养物接种200ml的2XTY，在30℃下以300rpm振荡培养。在4℃下以10,000rpm离心5分钟收集细胞，直至培养物的光密度值OD600＝0.8至1.0。用TES(TE＋100mM NaCl)洗细胞并悬浮于18ml的25％蔗糖＋25mM Tris HCl(pH8)＋25mM EDTA中。向该蔗糖溶液中加入2ml的10mg/ml的溶菌酶并缓慢混合之。将该混合物在37℃下保温30至60分钟，并检查形成的原生质体。加入2.2ml 20％的SDS，缓慢地混合并于50℃下保温15分钟。然后加入5.5ml的5MNaCl，缓慢地混合后在50℃保温5分钟，并在4℃放置过夜。将该混合物在4℃以10,000rpm离心10分钟，并将上清放入2个试管中。加入28ml的冷乙醇(总体积为56ml)，缓慢地混合，于-20℃保温过夜后以13,000rpm离心30分钟。回收沉淀物并用70％乙醇洗涤。然后将沉淀物溶解于10ml的1M NaCl的TE溶液中(总体积20ml)并在4℃下保温过夜。然后将两个试管合并为一个试管。加入200μl的1mg/ml RNase和1200μl的10mg/ml蛋白酶K并将该混合物在37℃保温30分钟，加入20ml的苯酚/氯仿，并离心该混合物。收集水相层并用20ml的苯酚/氯仿洗两次以上。向该水相层中加入20ml氯仿并离心。收集水相层并在2000ml的TE中透析过夜。
通过碱裂解(Birnboim，H.C.and Doly，J.，“A RapidAlkaline Extraction Procedure for Screening RecombinantPlasmid DNA”，Nucl.Acids Res，7：1513-1523(1979))或用购自Qiagen Inc.的Qiagen柱从大肠杆菌细胞中分离出用于克隆的质粒DNA。
pSB136的构建分为4个部分(参照图7)。在第一步骤中，用在芽孢杆菌中发挥功能的tetr基因替代来自pBR322的四环素抗性基因(其在大肠杆菌中有功能活性)然后，加入整合靶位点，并从HD1cryB基因组中分离出一未知功能的DNA。在第三步骤中，加入一个NotI接头以有利于cryIC基因的克隆。在最后的克隆步骤中，将cryIC基因加到整合载体中。下文将对上述各个步骤作更详细地描述。
将来自pBC16的tetr基因(Bernhard，K.，et al.，J.Bacteriol.，133：897-903(1978)克隆到pUC18中以构建质粒pSB206。采用Kreft等人的方法(Kreft.J.，et al.，Mol.Gen.Genet.，162：59-67(1978))通过将EcoRI片段除去可由pBC16质粒产生质粒pBC16-1。使用聚合酶链反应以及上表4中描述的引物Tet3和Tet4从pBC16-1中分离出tetr基因。引物Tet3在tetr基因上游导入一个HindIII位点，引物Tet4在tetr基因下游导入一个KpnI位点。将PCR产物插入到pUC18的多接头盒的HindIII位点处。
为了除去tetr基因，用SmaI和HindIII消化pSB206质粒。为了从pBR322中除去tetr基因，用AvaI切割该质粒，用大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段处理以产生平齐末端，然后用HindII消化。纯化所需的片段，将pBR322载体与pSB206的tetr基因连接以产生pSB131。
然后将整合靶位点加入到pSB131中。该靶位点来源于分离自Hd1cryB基因组的1.1kb DNA片段。将该片段克隆到pUC18中，并将该构建体定名为pSB132。按如下方法从HD1 cryB中分离出1.1kb DNA片段。用HaeIII或EcoRV消化HD1 cryB总DNA，将两消化产物混合，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。从该凝胶上切下三种不同大小的15个片段：(1)0.5kb-0.9kb；(2)0.9kb-1.8kb；(3)1.8kb-2.7kb。
纯化DNA片段(1)和(2)。将片段(2)的DNA连接到用Smal切割的pUC18上，得到以EcoRI/HindIII消化产物为特征的克隆。称之为pSB132的质粒有一个1.1kb的插入段。
然后将pSB132的1.1kb cryB片段转移到pSB131上。用EcoRI消化pSB132质粒，再用大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段经25次处理而填充其末端，并用HindIII消化。用SspI和HindIII切割质粒pSB131并与从质粒pSB132纯化的1.1kb片段相连接从而产生质粒pSB134。
将一个NotI接头加到pSB134上以有利于加入cryIC基因。NotI接头的序列是pAGCGGCCGCT(New England Biolabs#1125，SEQ IDNO：28)。用BamHI消化pSB134质粒，用大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段处理而产生平头末端。然后以200∶1摩尔比将NotI接头连接到线性化的pSB134上，得到称为pSB134.5的构建体。
最后一步是将cryIC基因加到pSB134.5上。cryIC来源于上面实施例3中描述的pSB6I9质粒。pSB619携带来自B.t.aizawai HD229的cryIC基因，该基因的前面是其固有启动子，该基因之后是B.t.kurstaki10 HD73 cryIA(c)终止子。将带有启动子和终止子的cryIC基因作为ApaI/NotI表达盒克隆至bluescript KS(＋)中。为了分离出cryIC，用ApaI切割pSB619，并用T4DNA聚合酶填充，再用NotI消化。用EcoRI切割pSB134.5质粒，经15大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段处理填充末端，然后用NotI切割。从pSB619的载体部分中纯化出cryIC表达盒，并连接到pSB134.5中以产生pSB136。实施例12：将cryIC基因导入到B.t.kurstaki菌株HD1 cryB和
            HD73中
按上面实施例11中描述的方法构建质粒pSB136。该质粒含有cryIC基因，编码来自pBC16.1之四环素抗性的基因，以及来自功能未知的HD1 CryB染色体的起着整合靶位点的作用一部分DNA。将这些片段连接到pBR322质粒中。
按照上面实施例6中描述的BHIS方法制备感受态B.t.kurstakiHD1 cryB和HD73细胞。在发出电脉冲后，于37℃在5ml BHIS中将细胞复原3小时。对于HD1 CryB细胞，脉冲参数是1.05kV，25μF，R＝∞。对于HD73细胞的脉冲参数量是1.25kV，3μF，R＝∞。在进行电穿孔之后，离心沉淀整个培养物，以小体积重新悬浮并置于选择性培养基上。用pSB098 DNA作为检测转化效率的标准物，每个试验均以每μg pSB098质粒的菌落形成单位(CFU)表示转化效率。
对于HD1 CryB细胞，当将7.5μg的pSB136质粒电穿孔到细胞中时得到一个四环素抗性菌落。细胞转化的总效率是6×105CFU/μg(使用pSB098)。采用下文实施例13中描述的PCR分析法证明该新的重组菌株CryB∷pSB136含有四环素抗性基因以及cryIC基因。
在CYS培养基中培养CryB∷pSB136使之形成孢子。它含有4×108个孢子/ml，而以同一试验培养HD1 CryIB后得到5×108个孢子/ml。通过孢子形成和繁殖步骤后四环素抗性基因有98％是稳定的。
对于HD73细胞，在一个总效率为2×106CFU/μg DNA的试验中，当将15μg的质粒pSB136电穿孔到细胞中时得到两个菌落。用下文实施例13中描述的PCR方法分析这两个定名为HD73∷pSB136的菌落表明其为cryIC基因和四环素抗性基因阳性的。实施例13：PCR法筛选CryB∷pSB136和HD73∷pSB136重组菌株
用PCR方法证实在CryB∷pSB136和HD73∷pSB1365个重组菌株中存在被导入的cryIC基因和四环素抗性标记。将从新鲜培养过夜的平板上的细胞在8μl含有溶于1×Taq多聚酶缓冲液中的必需引物(0.5μl的20μM原液)以及dNTP混合物(1.6μl的1.25mM原液)的溶液中煮沸过夜。沉淀细胞碎片，并加入2μl含有溶于1×Taq聚合酶缓冲液中之0.05单位Taq聚合酶的溶液。用两套引物筛选四环素抗性基因。Tet3和Tet4一起使用时产生一个约1.4kb的片段，而Tet3和CP01.Rev一起使用时产生一段大小约0.35kb的片段。为了筛选cryIC基因，用引物galP1和galP2制备一个0.8kb大小的片段。上文表2中列出了引物序列。实施例14：将cryIC和cryIIA基因导入B.t.kurstaki HD73菌
株中
按上文实施例5中描述的方法构建pSB304质粒。从pSB304中分离作为NotI-EcoRI片段的cryIIA基因。按上文实施例10中描述的方法构建pSB134.5。将cryIIA NotI-EcoRI片段连接到用NotI和EcoRI切割的pSB134.5上以形成质粒pSB134.5.2。
根据上文实施例6中描述的BHIS方法制备感受态HD73细胞。在发出电脉冲后，于37℃在5m1 BHIS中将细胞复原3小时。对于HD73细胞，使用的脉冲参数量是1.25kV，3μF，R＝∞。在进行电穿孔后，沉淀整个培养物，以小体积重新悬浮并铺敷于选择性培养基上。如上述实施例12所述，以pSB098 DNA作为测定转化效率的标准物，每μg pSB098 DNA的菌落形成单位(CFU′S)数表示转化效率。
将20μg的pSB134.5.2质粒电穿孔到HD73细胞中后得到10个菌落。转化效率为1×106CFU/μgDNA。采用下文实施例15中描述的PCR分析法证实两个转染体四环素抗性和cryIIA基因阳性。将这两个转染体命名为HD73∷pSB134.5.2。实施例15：PCR法筛选HD73∷pSB134.5.2重组菌株
用实施例13中描述的PCR法证实HD73∷pSB134.5.2重组体中存在被导入的cryIIA基因和四环素抗性标志。为了筛选cryIIA基因，用cryIIA1和cryIIA2引物制备0.57kb片段。上面表4中给出了引物序列。实施例16：苏云金芽孢杆菌的转导
进行普通适用的转导操作将已整合到一个菌株的染色体中的结晶体基因转移到用电穿孔法不容易被转化的菌株的染色体中。在这些情况下，以含有一个被整合之结晶体基因的菌株HD73∷pSB210.2作为DNA供体，转导包括SA11，SA12和S287菌株在内的几个B.t.菌株。
普遍使用的转导法已被广泛地用作遗传交换的手段，并由Margolin鉴定了其可用于大肠杆菌和沙门氏杆菌的特性，以及由Thorne描述了其在苏云金芽孢杆菌遗传交换中的适用性(1978)(Margolin，“Escherichia coli and Salmonella typhimurium”，Cell.and Mol.Biol.，(1987)；Thorne.，“Transduction inBacillus thuringiensis”，Applied and EnvironmentalMicrobiology，35：1109-115(1978))。
从土壤中分离到的并被用于蜡质芽孢杆菌染色体图谱分析试验中的普遍使用的转导噬菌体CP51是从Thorne，C.B.处得到的(Thorne，C.B.，“Transducing Bacteriophage for Bacillus cereus”，J.of Virol.，2：657-662(1968)and“Transduetion ofBacillus cereus and Bacillus anthracis”，BacteriologicalReviews，32：358-361(1968))。Thorne等人进一步检测了该噬菌体抗芽孢杆菌其他菌株，包括由Thorne(1978)描述的苏云金芽孢杆菌(见上文)菌株的能力。
按照上文实施例8中描述的方法培养SA11，SA12，S287和HD73的细胞并稀释到约107CFU/ml。
用分离物编号为2的重组菌株HD73∷pSB210.2繁殖噬菌体CP51。估计所得到的称为CP210.2的裂解产物的效价为1.2×108噬菌斑形成单位(CFU)/ml。将无菌H A滤膜(Millipore)置于LB平板表面，然后将噬菌体裂解产物CP210.2和细胞各100μl吸移到该滤膜上，用一无菌金属丝分散器缓慢地混合。将该平板在37℃保温3小时。将滤膜转移到含有红霉素(10μg/ml)的LB平板上，放回37℃，使其生长36小时。下列表5中给出了平板转导的结果。
     表5转导实验结果菌株    铺板的CFU  感染的    Eryr    效率
               复样性    菌落HD73    1×106      10       2    1.6×10-7SA11    4×106       3       4    3×10-7SA12    4×106       3       2    1.6×10-7S287    1×106      40       3    2×10-8
以每个噬菌斑形成单位得到的红霉素抗性菌落的数目表示转化效率。对于HD73，SA11以及SA12，将1.2×107个噬菌斑形成单位涂布于平板上。对于S287则铺敷4×107个PFU。实施例17：聚合酶链反应法筛选重组菌株
按照实施例13中所利用完整细胞，以PCR法筛选所有重组菌株。用PCR方法分析以缩写字“CP”表示的红霉素抗性菌落的基因内含物并与野生型菌株相比较。结果显示于下列表6中。
表6PCR检测转导体的基因内含物菌株     IA(a) IA(b) IA(c) IIA  IC  ermCSA11WT     +    +     +     +   -    -SA11CP1    +    +     +     +   +    +SA11CP2    +    +     +     +   +    +SA11CP3    +    +     +     +   +    +SA11CP4    +    +     +     +   +    +SA12WT     +    +     +     +   -    -SA12CP1    +    +     +     +   +    +SA12CP2    +    +     +     +   +    +S287WT     +    +     +     +   -    -S287CP1    +    +     +     +   +    +S287CP2    +    +     +     +   +    +
重组体保留了见于亲代菌株中的一系列晶体基因。只有重组体菌株对所导入之cryIC和ermC基因的特异性引物呈阳性。当筛选cryIA(b)基因时，最初合用TY6和TY14探针(上表2中描述)，但这对探针显示与只含有cryIC基因的对照质粒pSB210.2有某些交叉反应，在随后的试验中，用上表中描述的TY13替代TY14。实施例18：野生型和重组苏云金芽孢杆菌菌株质粒的比较
采用上文中描述的Birnboim和Doly(1979)的碱裂解步骤作如下所述修改后分离重组B.t.菌株的质粒。将菌株在LB＋四环素培养基上划线，并在30℃培养过夜，再在新鲜的SA(1×Spizizen盐，1％酪氨酸，5％葡萄糖，0.0005mM MnSO4·H2O)平板上划线并在37℃培养3-4小时。对于每一个菌株，将2-3菌环细胞悬浮于在冰上的100μl TESL(100mM Tris PH8，10mM EDTA，20％蔗糖，2mg/ml溶菌酶)中，并在37℃保温15分钟。加入200μl裂解溶液(0.2N NaOH，1％SDS)，颠倒试管以细心地混合之，将混合物于室温下放置5分钟。加入150μl冰冷的醋酸钾溶液，通过颠倒试管以混合之。接着将该混合物于4℃以15000rpm离心20分钟。用一次性使用的大管径移液管回收上清液，然后加到1ml100％乙醇中并颠倒试管以混合之。将混合物于4℃下以15000rpm离心20分钟。采用吸移法除去上清，将沉淀物重悬于1ml 70％乙醇中，颠倒试管以混合之，并在室温下离心5分钟。用吸管吸出上清液，并将沉淀物放在Speedvac中真空干燥2分钟。将干燥的沉淀物悬浮于20μl TE中，在冰上放置15分钟，然后轻拍试管侧面小心地混合。
在1×TAE、0.8％琼脂糖中将该DNA以70V/32mAmp电泳3小时。电泳后显示出的这些重组体的质粒图谱与野生型亲代菌株相同，证明它们测有携带不需要的质粒。实施例19：野生型和杂交苏云金芽孢杆菌菌株染色体DNA的比较
经用DNA与DNA的杂交试验分析HD73菌株中整合体，以及菌株SA11，SA12和HD73中转导体的染色体DNA。三个探针片段是从pSB139中分离的。
(a)一个通用的磷脂酶C(phosC)探针，即从已知phosC序列的BamHI延伸至ClaI之间的1800bp。
(b)从BamHI延伸至EcoRI的850bp的Eeo左引物(EL)。
(c)Eco右引物(ER)，即1427bp EcoRI片段。
实施例11中描述的野生型HD73的染色体DNA是从2XTY培养基(5克酵母提取物，5克胰蛋白胨，2.5克NaCl/L)中培养的100ml培养物样品中分离的。
按照制造商推荐的方法，使用从Boehringer Mannheim的ASAP药盒从野生型SA11，SA12和HD73以及相应的转导体中分离染色体DNA。按照Sambrook等人所述的方法(Sambrook等人，“MolecularCloning：A Laboratory Mannal，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))。用EcoRI或ApaI充分消化染色体DNA，并于0.8％琼脂糖凝胶以及含有EtBr的TBE缓冲液中分离，脱嘌呤，变性，中和并在2D×SSC中通过毛细管吸印过夜转移到Hy-Bond尼龙膜上。使用0.4M NaOH处理20分钟而将DNA固定到该膜上。使用Amersham ECL药盒按其说明指定的方法进行Southern杂交。
利用phosC大探针，对EcoRI消化的HD73和HD73∷pSB210.2的DNA进行DNA杂交法分析结果显示有预期的来自整合载体pSR210.2的2.4kb和4.3kb内部片段，但未能明确地显示在整合位点任何一侧存在染色体区域或侧翼区域。各个内部载体带的强度的不同以及后来被确定为侧接区域的带产生的强度的差异之间存在很大的不一致性，表明已发生了多次整合。利用EL探针对同一滤膜作进一步分析，结果不仅显示了预期的内部EcoRI片段，而且还存在位于整合体和野生型样品之染色体DNA中的1.8kb带，这一结果表明在phosC基因内存在有EcoRI的EcoRI位点1.8kb上游区。与ER探针杂交后显示了整合体样品中的内部片段，以及在整合体和野生型DNA中的一条约9kb的带，从而鉴别为内部phosC EcoRI位点的下一个EcoRI位点下游区。
在野生型和所有整合体中都存在位于phosC EcoRI位点上游和下游的同样的EcoRI位点证明，正如所期望的在染色体磷脂酶C区域发生了整合。
用ApaI消化上述相同的DNA样品后进行的类似的Southern印迹分析证明，发生了多次整合。已发生某一整合的分离体的染色体DNA将显示有两条谱带，分别分应于从整合载体pSB210.2的ApaI位点延伸到整合位点上游或下游的野生型染色体的ApaI位点的ApaI片段。发生多次整合也产生同样的上游和下游带以及另一个内部序列带，该内部序列带对应于由两个串联整合载体导入的ApaI位点之间的DNA序列。
Southern分析结果显示，有一个相当于整合质粒之全长的10.4kb片段，表明在该区域已发生了多次整合。但是，既没有观察到侧翼ApaI染色体片段，也没有观察到是否已发生了两次以上的整合。使用EL和ER探针对来自转导体SA11CP1，SA11CP2，SA12CP1和SA12CP2的经EcoRI消化的DNA进行Southern分析，结果显示有2.4kb和4.3kb内部EcoRI带，表明转导颗粒中携带的DNA来源于预期的整合的phosC位点。这些内部带并不存在于含野生型SA11和SA12 DNA的泳道上。正如在野生型HD73，HD1-51以及相应的整合体中发生的，这些探针也与同样大小的侧翼带，即1.8kb和约9kb DNA杂交。SA11，SA12，HD73和HD1-51上的phosC区域是相似的。利用这些探针无法测出发生交换的精确位置。实施例20：杂交苏云金芽孢杆菌菌株的稳定性和存活性
分析重组菌株SA11CP1和SA12CP2的稳定性。在没有抗生素选择条件下培养菌株生长至孢子形成和发芽阶段以测定已导入之基因的稳定性。
将重组体SA11CP1和SA12CP2以及野生型SA11和SA12菌株在LB平板上划线，并于30℃下培养过夜。将各个平板上形成的单一菌株分别接种到500ml带档板培养瓶中的100ml CYS培养物中。在30℃下以300rpm进行旋转培养。当培养物达到A600为0.8时按1∶10稀释之。每隔半小时监测培养物的生长以确定生长曲线。在从对数生长期过渡到稳定期后，将培养物继续培养48小时。对各个产生孢子的培养物进行1∶10稀释，并将稀释液在65℃加热45分钟。
推测样品含有约109个孢子/ml。稀释样品并涂布于LB平板上。重组菌株的发芽孢子数目相当于野生型的孢子数。将50-100个菌落影印到含红霉素的LB平板上以及单独LB平板上，并在30℃培养过夜。根据存活的菌落数目确定含有选择性标记的菌落百分数。
如根据其对红霉素的持续抗性以及以PCR法检测cryIC和ermC基因的存在所证实的，发现经过孢子形成和发芽阶段后新导入的基因是100％稳定的。没有获得自发的红霉素抗性菌落。这些重组体在CYS上的生长速率在起始的8小时期间基本上与其亲本菌株相同。对于SA11(WT)和重组体SA11CP1，估计其每ml培养液中分别含有9.3×107以及1.5×108个孢子；而对于SA12(WT)和重组体SA12CP2，估计其每ml中含有分别为3.5×107和3.4×107个孢子。所导入的基因对重组菌株的存活性没有产生有害影响。实施例21：基因产物在杂合苏云金芽孢杆菌菌株中的表达
为了检测基因表达，使重组体和亲代菌株的各10ml CYS(10克酪蛋白胨、5克葡萄糖，2克酵母抽提物，1克KH2PO4，1ml50mM MgCl2，1ml 50mM MnCl2，1ml 50mM ZnSO4，1ml 50mM FeCl3，1ml 200mM CaCl2/L)培养物在30℃下生长36小时。取50μl培养物与等体积的2X上样缓冲液(0.125MI Tris-HCl pH8，4％SDS，0.005％溴酚蓝，20％(v/v)甘油，4％(v/v)β-巯基乙醇)混合，并立即煮沸5分钟，取2.5，5以及10μl样品加样于10％丙烯酰胺凝胶(Novex)上并以125伏电泳1.5小时。
通过将所有重组菌株在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳可以明显地检测到被导入之结晶体基因的表达。就HD73∷pSB147而言，除看到在野生型菌株也存在的一个130kd带以外，还检测到一条大约65kd的新带。65kd是预期的CryIIA蛋白质的大小。对于HD73∷pSB210.2，SA11CP1，SA11CP2，SA11CP3，SA11CP4，SA12CP1，SA12CP2，S287CP1和S287CP2，看到的另一条在135kd处迁移的带，即，预期相当CryIC蛋白质的带，而在野生型HD73，SA11，SA12和S287菌株中则未看到该带。如由在130kd处迁移的带所确定的，重组菌株连续表达由其亲代野生型菌株表达的其他CryI型蛋白质。实施例22：杂合苏云金芽孢杆菌的致死性生物检测
对于大多数的生物检测，将样品于30℃在500ml带档板培养瓶内的100ml Fishmeal(5.5％Fishmeal，4％淀粉，0.1％NH4Cl，0.125％KH2PO4，0.05％MgSO4，0.001％FeSO4，0.001％MnCl2/L)中以300rpm旋转培养72小时。对于No.1087生物检测，使样品再次于30℃下在500ml带档板瓶内的100ml Fish Meal中生长。但是使用从已用一菌环从新鲜斜面上刮取孢子接种并在30℃生长6小时的100ml Fish Meal种子培养物获得的5％接种物。41小时之后收集SA11样品(对照)及其重组体，而SA12样品(对照)及其重组体则在生长47小时之后收集。用水作1∶10稀释后如上文实施例18中描述的CYS培养物一样处理以检测所有样品中的蛋白质表达。收获后，将培养物于4℃下贮存。
按下述步骤检测在Fishmeal培养基上生长的重组SA11，SA12和S287菌株抗粉纹夜蛾(Trichopulsia ni)以及Spodoptera exigua的能力。将重组菌株的样品与含有132克/升麦胚，28克/升酪蛋白，11克/升维生素混合物(Moorehead&Co.Van Nuys，CA)，8.8克/升盐混合物(BioServ，Frenchtown，NJ)，2.3克/升山梨酸，1.1克/升对羟基苯甲酸，13克/升琼脂以及1.5ml/L戊二醛的人工昆虫食物混合。然后将该混合物喂饲在25℃保温的晚期第三期令幼虫。4天之后记录死亡率，采用本领域内已知的概率单位分析法确定LC50。
所有重组体菌株均比其亲本野生型菌株具有更高的抗S.exigua活性。抗Spodoptera exigua的活性提高约1.6-2.2倍。
使用噬菌体裂解产物电转化和转导的技术，将cryIC基因导入到几个苏云金芽孢杆菌不同菌株之染色体的已知位点上。对于由转导产生的重组菌株，采用SDS-PAGE法检测cryIC基因的表达，并测知CryIC蛋白质提供了抗S.exigua的生物活性。将cryIC导入到染色体中并未导致已存质粒的不稳定，并且在经过孢子形成和发芽阶段之后该基因本身仍保持稳定。实施例23：确定抑制pLTV1在苏云金芽孢杆菌中复制的温度
由Camilli等人描述的枯草杆菌PY1177(pLTV1)从Dr.PhilYoungman处得到(Camilli et al.，J.Bacteriol 172：3738-3744(1990))。按照Birnboim and Doly(1979)的方法(见上文)从PY1177中分离pLTV1 DNA。按上文实施例7中描述的电穿孔法用pLTV1 DNA转化B.t.kurstaki HD73，将转化体命名为HD73＋pLTV1。
在两种不同温度下进行连续的热处理以测定在B.t.kurstakiHD73中消除pLVT1的复制所需的温度，按照Bohall的方法第一次热处理在液体培养基中进行，而第二次在固体培养基中进行(Bohall，N.A.，J.Bacteriology167：716-718(1986))。用HD73＋pLTV1的单一菌落接种含有10ml的LB tet10的培养瓶。使该初级培养物于30℃，300rpm转速生长至OD600＝0.4。离心后收集细胞，用LB(不含抗生素)洗细胞以便除去四环素并重悬于没有抗生素的10mlLB中。用重新悬浮的细胞接种(1％)预加热到30、37、40和42℃的10ml LB培养液中。接种后将培养物维持于各自的温度下直到培养物的OD600值达到0.6-0.8。然后将培养物稀释104-107倍，并将100μl稀释液等分样品涂布在LBery0.05平板上。将各平板在对应于初级培养物的保温温度下保温过夜。过夜保温后，将从LBery0.05平板上得到的菌落影印转接到不含抗菌素的四个不同的LB平板以及LBery10，LBcm12和LBtet10平板上。将这些平板在30℃保温过夜，在第二天评价其对抗菌素的敏感性。
初级培养物在含有四环素的LB液体培养基中生长的试验得到下述结果。在pLTV1复制允许温度为30℃时，所检测的菌落中有20％对红霉素、氯霉素以及四环素敏感，表明由于复制受到抑制而丢失了质粒。在37℃时，98％的菌落对所有三种抗菌素敏感。在40℃时，94％的菌落对所有三种抗菌素敏感。在42℃时，100％的菌落敏感。不含四环素的液体初级培养物在同样温度下丢失了热诱导的质粒。在30℃的允许温度下，不含四环素的培养物有38％失去质粒(明显高于在30℃时LB＋tet培养物所显示的20％质粒损失率)。无四环素培养物于37℃、40℃和42℃保温时，质粒损失率分别为94％，90％和99％。因此，可以得到结论：在本研究使用的实验条件下于37℃或更高温度下保温pLTV1质粒的复制受到抑制。由于即使在其复制容许温度下质粒也会失去，因而该pLTV1质粒是不稳定的。实施例24：确定pLTV1衍生的Tn917转导的苏云金芽孢杆菌中的条件
用一种三天的三步骤方法收回被转座的菌落。该方法首先检测HD73＋pLTV1。首先，用含有pLTV1的HD73单一菌落接种10ml含有ery1，cm5和tet5的LB液体培养基，并在30℃下以300rpm振荡培养到OD600＝0.7。然后离心将该初级培养物用10mlLB洗沉淀的细胞以除去抗生素。用100μl经洗涤的初级培养物接种两个装有含ery1和cm6(但没有tet)之100ml LB的次级培养瓶中。将其中一个培养瓶于30℃(容许温度)培养，另一个培养瓶在37℃(非容许温度)以300rpm旋转培养过夜。
在生长过夜之后，稀释两种培养物并铺敷于单纯LB平板及LBery1cm5平板上。将平板于相应于上述次级培养瓶的同样温度下保温过夜。在该第二次过夜加热处理之后，将37℃在含ery1cm5的LB平板上培养的单个菌落影印到仅含LB，含ery1cm5的LB，含ery10的LB，含cm7的LB和含tet10的LB平板上，用于检测对红霉素、氯霉素有抗性但对四环素敏感之菌落的百分数，以指示已经发生的转座。将得到的eryrcmrtetr菌落命名为HD73∷pLTV1。
正如所期望的，从用pLTV1进行的试验得到的HD73菌落几乎100％显示pLTV1的lacZ基因发生了转座。使用引物LACNHS1和LACNHS2对eryrcmrtetsHD73菌落进行PCR分析，结果表明在各种情况下pLTV1的lacZ基因都发生了转座。使用引物TY6和TY7作进一步PCR分析，结果表明被转座的40个菌落中有38个保留了天然的cryIA(c)基因。下表7中列出了引物序列。
            表7寡聚核苷酸的序列
                                        SEQ.ID No.LACNHS1 GGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGC      29LACNHS2 CCAGACCAACTGGTAATGGTAGAGACCGGC      30TY6     GGTCGTGGCTATATCATTCGTGTCACAGC       31TY7     CCACGCTATCCACGATGAATGTTCCTTC        32NHS21   GATATTTTAGCTCATGATCTTTTCCTCCTATTAAC 33NHS37   CATTACGCATTTGGAATACC                34
为了将B.t.galleriae HD232的cryIIA操纵子导入HD73基因组中，装配质粒pSB050。B.t.galleriae HD232菌株从USDA获得。从实施例5中描述的pSB304中分离HD232之完整cryIIA操纵子4kbBamHI HincII片段。用限制性酶Smal和BamHI切割pLTV1质粒以产生一个20.6kb片段，并将片段连接在一起以形成pSB050。用连接产物转染dam-，dcm-GM2163大肠杆菌菌株。首先在LBamp75上筛选含有所需构建体的单个GM2163菌落，然后影印铺板在一系列琼脂平板上，这些平板或者不含抗菌素，或者含amp75，cm7，ery10或tet10。在所检查的55个菌落中，有5个菌落对四环素，氨苄青霉素以及红霉素有抗性，表明这5个菌落没有pLTV1。经PCR扩增LACNHS1和LACNHS2引物之间的1400bp产物进一步筛选抗性菌落。这对引物的序列示于表7中，并相当于包含在pLTV1中的lacZ基因内的序列。用具有上文表7中所示序列的NHS37和NHS21引物进行PCR扩增，产生一个从红霉素基因到cryIIA操纵子之第一个开放式阅读框架末端的区域。用BgIII限制性酶分析抗性菌落的DNA，产生预期的PCR结果以及显示有2kb，5.3kb和16kb BgIII片段的那些菌落被认为含有命名为pSB050的质粒。
以1.2kV，3μF和∞欧姆电阻，将从GM2163分离的5μg pSB050DNA电穿孔到宿主细胞中而实现用pSB050质粒转化HD73。在30℃的容许温度下，在BHIS培养基中以300rpm振荡培养3小时以使细胞复原。然后浓缩细胞，涂布于含10μg/ml四环素的LB平板上并于30℃保温过夜。利用LACNHS1和LACNHS2引物(1400bp产物)以及NHS37和NHS21引物(600bp产物)，在Perkin Elmer-Cetus推荐的条件下进行PCR分析，证实在四环素抗性菌落HD73中存在pSB050。将这些分离物命名为HD73＋pSB050。实施例26：使pSB050衍生的Tn917发生转座以将CryIIA导入到苏云
      金芽孢杆菌HD73的50Md质粒中
使用上文实施例25中描述的几个HD73＋pSB050分离物使pSB050的cryIIA操纵子转座到HD73的一个大的居留质粒上。在非容许温度下培养HD73＋pSB050分离物，并筛选氯霉素和红霉素抗性以及四环素敏感的菌落。将所获得的表明已经发生了转座的eryrcmrtets菌落命名为HD73∷050。对位于NHS37和NHS21引物之间预期的600bp(ery基因至cryIIA)以及LACNHS1和LACNHS2引物之间的1400bp产物进行PCR扩增，证实发生了转座。用TY6和TY7引物(其序列列于上表7中)进行PCR扩增也证实存在一个完整的cryIA(c)编码区。实施例27：CryIA(c)和CryIIA基因在被转座的苏云金芽孢杆菌HD73
      ∷050菌株中的表达
用1000×放大倍数的显微镜观察HD73＋pSB050和HD73∷050，结果可看到两菌株均产生两种结晶体类型。在HD73＋pSB050和HD73∷050细胞中观察到HD73的双棱锥体的CryIA(c)结晶体以及长方体的CryIIA结晶体。而在野生型HD73细胞中没有看到这样的立方体结晶体。
经SDS-PAGE分析CryIA(c)和CryIIA在HD73∷050中表达的蛋白质。离心沉淀已形成孢子的培养物的100μl样品(生长了40至50小时)，重悬于10mM EDTA中在冰上与2×SDS载样缓冲液以1∶1的比例混合并煮沸3分钟。在10％的预固化的Novex凝胶上电泳并用考马斯亮蓝染色。
SDS-PAGE分析结果显示存在有135kd CryIA(c)和65kd CryIIA蛋白质。利用特定的抗CryIA(c)或CryIIA的抗血清在两块单独的印迹上进行的Western印迹分析进行证实了上述结果。实施例28：苏云金芽孢杆菌HD73∷050菌株的孢子计数以及稳定性
作为培养物相对健康的一个总的指标，比较下列B.t.菌株的每ml样品的孢子数：HD73野生型，和HD73＋pLTV1，HD73＋pSB050以及HD73∷050杂交株。将形成孢子的培养物在65℃下处理45分钟以杀死任何剩下的有生长能力细胞。将系列稀释液涂布于LB琼脂平板上，并在第二天计数菌落数。将上面使用的孢子稀释液涂布于含10μg/ml四环素，1μg/ml红霉素以及7μg/ml氯霉素的LB琼脂平板或没有抗生素的LB平板上培养，以检测HD73∷050中转座DNA的稳定性。经过选择后生长的菌落数与未经选择的生长的菌落数相当。HD73∷050的孢子数比野生型HD73的孢子数稍微低。孢子数在1-2×108孢子数/ml范围内。大多数(即97-100％)的HD73∷050保留了适当的eryrcmrtets抗生素抗性，表明被转座的区域并未变得不稳定并在转座之后从DNA上被删除。实施例29：苏云金芽孢杆菌HD73∷050菌株的质粒分布图
检测HD73∷050的质粒内含物以估计HD73的染色体或大质粒上是否发生了转座。所使用的质粒制备方法是上文实施例18中描述的略作改动的Birnboim和Doly的碱溶解方法(Birnboim，H.C.and Doly(1979)，见上文)。对HD73∷050和野生型HD73的DNA制剂进行的质粒分布图分析显示转座子已插入到存在于天然HD73菌株中的两个50Md质粒中。凝胶电泳结果显示质粒谱带的分子量增加，这样便使之与被转座的DNA的分子量相一致。在一些HD73∷050分离株中，携带cryIA(c)基因的高拷贝数的50Md质粒是转座靶。而在其他分离株中，低拷贝数的50Md质粒是转座靶。通常也存在于HD73中的HD73∷050内的其他所有质粒均未显示表观分子量的变化。实施例30：对苏云金芽孢杆菌菌株HD73∷050和HD73∷pLTV1中转座
      的Southern分析
按照Bochringer Mannheim的方法，使用ASAP试剂盒制备野生型HD73，HD73∷pLTV1和HD73∷050的总DNA。用过量BamHI或EcoRI将DNA消化过夜，在20cm的0.8％TBE琼脂糖凝胶上电泳18小时，并通过在20×SSC中毛细管吸印过夜而转移到购自Bio-Rad公司的Zeta-Probe膜上。然后按Amersham ECL试剂盒中规定的方法对该膜进行处理并探测。用上文实施例25中描述的1400bp的lacZ基因的PCR产物探测被转移的DNA。相当于HD73∷050DNA的带与相当于野生型HD73之DNA的带匹配。
Southern印迹分析显示转座子已整合到50Md质粒的不同位点上。没有观察到优选的转座位点。对pLTV1的限制性图谱分析显示，HD73∷pLTV1的DNA含有与探针杂交的9kb或更大的BamHI片段。该大小的谱带代表在一个50Md质粒中pLTV1的转座部分。同样，HD73∷pLTV1 DNA含有与探针杂交的14kb或更大EcoRI片段。在所有情况下，Southern分析结果均显示预期的带发生了杂交。未杂交的带具有同样的大小，因此证明在HD73基因组内的随机位置上发生了pLTV1转座。
HD73∷0.50分离株的Southern印迹分析结果显示，经BamHI消化后产生预期的12kb或更大的带，而经EcoRI消化后则产生17kb或更大的带。HD73∷pLTV1和HD73∷050之间杂交带大小的差异是由于在HD73∷050的转座区域内存在有cryIIA基因。这一结果证实经转座的cryIIA基因随机地插入到HD73基因组内。实施例31：苏云金芽孢杆菌HD73∷050菌株的致死性
将HD73∷050和野生型HD73的新鲜过夜菌落分别接种到500mlYamamoto所述的CYS培养基中，并将其在30℃，以300rpm振荡培养55小时(Yamamoto，T.1990.ACSSymposium Series432：46-60)，然后离心收获细胞。将细胞重悬于1/20体积的A缓冲液(5mM Tris pH8.0，0.25％Triton)中并将细胞裂解产物在8％Novex SDS-PAGE凝胶上电泳。采用密度计扫描检测CryIA(c)蛋白质的浓度。用A缓冲液制备19份2倍稀释液，计算每份稀释液的CryIA(c)量(以ppm表示)。将已知量的蛋白质与昆虫食物混合，并喂养晚期第三期令的Trichoplusia ni和Spodoptera exigua幼虫，将幼虫在25℃保温4天，然后记录它们的死亡率。
生物测定结果表明HD73∷050杂合体比野生型HD73有更高的活性。用分纹夜蛾(T.ni)检测结果证明野生型HD73显示LC50＝3.5ppm，而HD73∷050的LC50＝2ppm。用S.exigua检测的结果证明对野生型HD73的LC50＝475ppm，而对HD73∷050的LC50＝225ppm。
本发明可用下列第1和2两段文字加以总结并由其后的待批权利要求所限定。
1.DNA片段，它含有
a)能在苏云金芽孢杆菌中复制并表达的一个或多个编码杀虫剂的DNA序列以及与一个苏云金芽孢杆菌的染色体DNA同源的DNA序列，从而使所述同源DNA序列指导所述DNA片段插入到染色体中，并且所述编码杀虫剂的DNA序列插入到苏云金芽孢杆菌染色体DNA中：或者
b)一个或多个能在苏云金芽孢杆菌中复制并表达的编码杀虫剂的DNA序列以及一个能随机地整合到苏云金芽孢杆菌染色体DNA中的DNA序列，其中所述DNA片段稳定地整合到含有所述编码杀虫剂的DNA序列的染色体DNA中。
2.制备被转化的苏云金芽孢杆菌宿主的方法，
包括a)获得与苏云金芽孢杆菌DNA同源或能随机地整合到苏云金芽孢杆菌染色体DNA中的染色体DNA序列；
b)将所述DNA序列可操作地连接到一个或多个编码杀虫剂的DNA序列上；
c)获得DNA片段；
d)转化苏云金芽孢杆菌菌株，从而使该DNA片段掺入到染色体DNA中，以及
e)分离被转化的宿主，其中编码杀虫剂的DNA序列稳定地整合到宿主染色体DNA中并且能在所述宿主中表达和复制。
                 序列表(1)一般资料：
(i)申请人：
  (A)名称：Sandoz Ltd
  (B)街道：Lichtstrasse35
  (C)城市：Basel
  (D)州：  BS
  (E)国家：Switzerland
  (F)邮编(ZIP)：CH-4002
  (G)电话：061-324-1111
  (H)传真：061-322-7532
  (I)电传：96 50 50 55
  (A)名称：Sandoz Patent GmbH
  (B)街道：Humboldstrasse 3
  (C)城市：Loerrach
  (E)国家：Germany
  (F)邮编(ZIP)：D-79540
  (A)名称：Sandoz Erfindungen Verwaltungs GmbH
  (B)街道：Brunnerstrasse59
  (C)城市：Vienna
  (E)国家：Austria
  (F)邮编(ZIP)：A-1235
(ii)发明题目：含有编码杀虫蛋白的基因的DNA片段
(iii)序列数：34
(iv)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容
  (C)操作系统：PC-DOS/NS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：28个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
GGAACGCTAC ATACTAGTGA TAGAGTAG    28(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：28个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
GCTTGTACAC CGCAACTGTT TTCGCATG             28(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：37个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
AGCTTGCGGC CGCGTCGACC CCGGGCCATG GGGGCCG    37(2)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：38个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
AATTCGGGCC CCCATGGCCC GGGGTCGACG CGGCCGCA    38(2)SEQ ID NO：5的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：29个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
CCACAGTTAC AGTCTGTAGC TCAATTACC             29(2)SEQ ID NO：6的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
CCGCTACTAA TAGAACCTGC ACCA                        24(2)SEQ ID NO：7的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：40个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
CAATACATTA TCCATGGAAA ATTCCTCCTT AAATATCATG     40(2)SEQ ID NO：8的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：39个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
GAGCAATGAA AGAGTTAGGG CCCTGTTTAA GGTGTCATG    39(2)SEQ ID NO：9的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：16个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
GAGTGAATTA TGGGGG                              16(2)SEQ ID NO：10的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：16个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
ATTTTGTATT AAACGG                              16(2)SEQ ID NO：11的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
ACTATTTGTG ATGCGTATAA TGTA                   24(2)SEQ ID NO：12的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
AATTCCCCAT TCATCTGC                           18(2)SEQ ID NO：13的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
GAAATCGGCT CAGGAAAAGG                          20(2)SEQ ID NO：14的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
CCTTAAAACA TGCAGGAATT GACG                      24(2)SEQ ID NO：15的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
CTATTGGTTG GAATGGCGTG                        20(2)SEQ ID NO：16的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：28个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
GAGCCAAGCA GCTGGAGGAG TTTACACC                28(2)SEQ ID NO：17的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
TCACTTCCCA TCGACATCTA CC                22(2)SEQ ID NO：18的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：33个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
ATCACTGAGT CGCTTCGCAT GTTTGACTTT CTC    33(2)SEQ ID NO：19的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：29个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
GGTCGTGGCT ATATCCTTCG TGTCACAGC             29(2)SEQ ID NO：20的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：25个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
ACAGAAGAAT TGCTTTCATA GGCTC                  25(2)SEQ ID NO：21的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：23个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
GAATTGCTTT CATAGGCTCC GTC                  23(2)SEQ ID NO：22的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：28个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
CAACAAACGG GCCATAAGCT TGTATAAG              28(2)SEQ ID NO：23的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：23个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
GCCGTCTGTA ACGGTACCTA AGG                  23(2)SEQ ID NO：24的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
CACCCAGTTT GTACTCGCAG G                     21(2)SEQ ID NO：25的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
GTCTCATGCA AACTCAGG                      18(2)SEQ ID NO：26的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：18个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：
CTCTGGCGCT CCATCTAC                      18(2)SEQ ID NO：27的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：29个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
CCCATGGATA ATGTATTGAA TAGTGGAAG       29(2)SEQ ID NO：28的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：10个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：
AGCGGCCGCT                             10(2)SEQ ID NO：29的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：30个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQID NO：29：
GGCTTTCGCT ACCTGGAGAG ACGCGCCCGC    30(2)SEQ ID NO：30的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：30个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：
CCAGACCAAC TGGTAATGGT AGAGACCGGC    30(2)SEQ ID NO：31的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：29个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：
GGTCGTGGCT ATATCATTCG TGTCACAGC               29(2)SEQ ID NO：32的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：28个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：
CCACGCTATC CACGATGAAT GTTCCTTC                28(2)SEQ ID NO：33的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：35个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：
GATATTTTAG CTCATGATCT TTTCCTCCTA TTAAC        35(2)SEQ ID NO：34的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：
CATTACGCAT TTGGAATACC                  20

Claims (9)

1.一种线性DNA片段，含有至少一个能在苏云金芽孢杆菌中复制并表达的编码杀虫剂的DNA序列，其中所述序列的5′和3′区均含有与苏云金芽孢杆菌染色体DNA序列同源的核苷酸序列，以便使所述编码杀虫剂的DNA序列能插入细菌染色体DNA中，或
一种环状DNA片段，含有至少一个能在苏云金芽孢杆菌中复制并表达的编码杀虫剂的DNA序列，其中所述序列的5′或3′区含有与苏云金芽孢杆菌染色体DNA序列同源的核苷酸序列，以便使所述编码杀虫剂的DNA序列能插入细菌染色体DNA中。
2.根据权利要求1的DNA片段，还包括来自革兰氏阴性细菌的复制原点和可选择标记。
3.含有权利要求1和2的DNA片段的杂种载体。
4.含有前述权利要求之DNA片段的苏云金芽孢杆菌宿主。
5.含有杀虫有效量的权利要求4的宿主和其载体的杀虫组合物。
6.制备转化的苏云金芽孢杆菌宿主的方法，该方法包括以下步骤：将权利要求3的载体或权利要求1或2的DNA片段导入苏云金芽孢杆菌菌株中，然后分离所得的转化体，其中所述编码杀虫剂的DNA序列被稳定地整合到宿主染色体DNA中并能在其中表达和复制。
7.根据权利要求6的方法，还包括转导被转化的宿主并制备受体苏云金芽孢杆菌，包括
a)将权利要求6的苏云金芽孢杆菌暴露于转导噬菌体；
b)使所述噬菌体在所述宿主中复制，其中在宿主染色体DNA中整合的一个或多个编码杀虫剂的DNA序列被掺入所述噬菌体中；以及c)将来自所述噬菌体的编码杀虫剂的DNA序列导入受体苏云金芽孢杆菌中，其中所述被导入的编码杀虫剂的DNA序列被稳定地掺入所述受体的染色体DNA中并被表达。
8.根据权利要求6和7的方法，其中苏云金芽孢杆菌宿主和受体选自苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种的菌株。
9.根据权利要求6、7或8的方法，其中编码杀虫剂的DNA序列是cryIC序列或与其同源的序列。
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