JPH09182590A

JPH09182590A - バチルス・スリンギエンシス胞子形成遺伝子

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Publication number: JPH09182590A
Application number: JP8228213A
Authority: JP
Inventors: Nicole Helen Cooper; ニコル・ヘレン・クーパー; Sue S Kalman; スー・ステファニー・カルマン; Mitra Shahabi Reynoso; ミトラ・シャハビ・レイノソ; Takashi Yamamoto; 敬司山本
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1995-08-30
Filing date: 1996-08-29
Publication date: 1997-07-15
Also published as: US5827515A; EP0761815A2; IL119143A0; CA2184301A1; MX9603723A; KR970010971A; EP0761815A3; AU6429796A

Abstract

(57)【要約】【課題】殺虫結晶タンパク質コード遺伝子を胞子形成
遺伝子に挿入すること。【解決手段】ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配
列を有するspoＶＢt１遺伝子； ii）配列番号２に記載のバチルス・スリンギエンシス(B
acillus thuringiensis)胞子形成タンパク質をコードす
るヌクレオチド配列； iii）配列番号２に記載のタンパク質と実質的に同一の
バチルス・スリンギエンシス胞子形成タンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列； iv）配列ｉ）、ii）またはiii）の相補鎖と、ストリン
ジェントなハイブリダイズ条件でハイブリダイズするヌ
クレオチド配列；およびｖ）上記配列ｉ）、ii）、iii）またはiv）の切除ヌク
レオチド(ここで、切除ヌクレオチドは少なくとも３０
０ヌクレオチドを含む)：からなる群から選択される、
単離spoＶＤＮＡ配列。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】今日使用されている全ての生
物殺虫剤の大多数を占めるバチルス・スリンギエンシス
は、胞子形成中に結晶性封入体を形成し、この結晶封入
体は、１個またはそれ以上のδ−内毒素から成り、鱗翅
目、鞘翅目および双翅目の幼虫を含む広範囲の昆虫に対
する毒性を担うことが知られている。

【０００２】

【従来の技術】バチルス・スリンギエンシスを生物学的
殺虫剤として使用することが非常に興味深いため、多く
の研究が、バチルス・スリンギエンシス株における殺虫
性タンパク質およびこれらのタンパク質をコードする遺
伝子の同定について行われている。しかしながら、胞子
形成経路に関する遺伝子についてはほとんど知られてい
ない。胞子形成遺伝子は胞子形成を担うだけでなく、結
晶産生にも関連する。ほとんどの殺虫性結晶タンパク質
は胞子形成中にしか発現されない。従って、胞子形成経
路に関与する遺伝子の同定および特徴付は、結晶形成お
よび胞子形成サイクルの扱いについての我々の知識およ
び能力を増加させ、更に生物学的殺虫剤としてのバチル
ス・スリンギエンシスの効果を増加させる可能性があ
る。

【０００３】バチルス・スリンギエンシス株を組換える
ことによる生存胞子の産生は、バチルス・スリンギエン
シス生産物の使用に関する欠点を有する。全ての商業的
バチルス・スリンギエンシス株は、殺虫性タンパク質と
組み合わさって環境中に放出される胞子を形成し、そし
て胞子は多くの殺虫剤の利点を提供し得るが、それらは
非常に持続性の構造で、厳しい気候条件下でも土壌中で
生存できる。

【０００４】生物殺虫剤における無胞子または少胞子バ
チルス・スリンギエンシスの使用は、これらの生存胞子
の放出を予防または減少させ、バチルス・スリンギエン
シス生物殺虫剤の使用を、既知の殺虫剤の使用の代替と
してより魅力的にする。更に、文献の記載は、あるcry
遺伝子の発現の過発現が、無胞子株で起こることができ
ることを示唆する。例えば、cryIIIＡ遺伝子はバチルス
株の胞子形成変異を増加させることが観察されている。

【０００５】胞子形成中に起こる形態学的および生理学
的変化は、バチルス・サブチリス(Ｂacillus subtilli
s)で広く研究されている。一般に、一度胞子形成が開始
されると、細胞は多くの形態学的変化を受け、胞子形成
は細菌の生合成活性の急激な変化を伴う。胞子形成が開
始すると、染色体は凝縮する。第II段階で、細胞分裂が
おこり、大きさが異なる姉妹細胞を産生する。この小さ
い細胞は娘細胞であり、前胞子(forespore)または前胞
子(prespore)としても知られている。第III段階の間、
母細胞は前胞子を飲み込み、母細胞中の前胞子の回りの
２重膜の形成をもたらす。皮質として知られている細胞
壁の修飾形は第IV段階中に前胞子の内および外膜の間で
合成され、第Ｖ段階中の前胞子の外膜の胞子被覆堆積に
続く。第VI段階は胞子の完全な成熟として定義される。
この段階で、胞子は放射、熱、リソザイムおよび有機溶
媒に対する耐性という特性を発展させる。最後に、第VI
I段階で母細胞が融解し、成熟胞子が放出される。遊離
胞子は屈折性であり、容易に光学顕微鏡で観察できる。

【０００６】胞子形成に必要な遺伝子は、正常の草木成
育は許容するが、胞子形成が遮断された変異を作ること
により認識できる。バチルス・サブチリスにおいて、少
なくとも１００個の胞子形成工程に関与する胞子形成遺
伝子が同定されている。遺伝子は、胞子形成が遮断され
る段階に従って、spo０、spoII、spoIII等と命名されて
いる。バチルス・サブチリスにおける胞子形成の後の工
程に関与する遺伝子はspo Ｖ遺伝子と命名され、spo Ｖ
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅa、Ｅb、Ｇ、Ｉd、ＪおよびＲがデータ
ベースで同定されている。大文字は、同じ表現型を付与
する変異を含むが、異なる染色体位置に位置する座を示
唆する。バチルス・サブチリスにおける胞子形成および
遺伝子発現および制御は、本明細書に参考として包含す
る、Ｅrrington, Ｊeffrey, Ｂavillus subtillis Ｓpo
rulation：Ｒegulation of ＧeneＥxpression and Ｃon
trol of Ｍorphogenesis, Ｍicrobio. Ｒev. 57(1-33)
に更に記載されている。

【０００７】本発明は、宿主バチルス・スリンギエンシ
ス株から第Ｖ胞子遺伝子を単離した最初のものである。
spoＶＢt１と名付けられた本遺伝子は、ヌクレオチドレ
ベルで約６５.５％バチルス・サブチリスspoＶＪ遺伝子
と相同であり、トランスポゾン、Ｔn917をspoＣＢt１の
同定のための道具として使用した。

【０００８】新規spoＶＢt１遺伝子および関連spoＶＤ
ＮＡ(下記に定義にように)は、細菌中に安定に外来性Ｄ
ＮＡを挿入する方法に使用される。本発明のspoＶ配列
は細菌染色体に位置する胞子形成遺伝子のフラグメント
と実質的に相同である。胞子形成遺伝子を含む細菌フラ
グメントは、外来性ＤＮＡおよびspoＶ配列の染色体統
合部位として働く。

【０００９】驚くべきことに、spoＶＢt１遺伝子および
他のspoＶＤＮＡ配列が、例えば、点変異により変異し
た場合、細菌染色体に挿入される外来性ＤＮＡだけでな
く、受容体細菌も変異胞子を形成する。

【００１０】本発明は、配列番号１に示すようなヌクレ
オチド配列を有する単離spoＶＢt１遺伝子に関する。本
発明は、更に、ｉ）上記定義の単離spoＶＢt１遺伝子；
ii）配列番号２に記載のバチルス・スリンギエンシス胞
子形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列；ii
i）配列番号２に記載のタンパク質と実質的に類似のバ
チルス・スリンギエンシス胞子形成タンパク質をコード
するヌクレオチド配列；iv）配列ｉ）、ii）またはii
i）の相補鎖と、ストリンジェントなハイブリダイズ条
件でハイブリダイズするヌクレオチド配列；およびｖ）
上記配列ｉ）、ii）、iii）またはiv）の切除ヌクレオ
チド（ここで、切除ヌクレオチドは少なくとも３００ヌ
クレオチド、更に好ましくは少なくとも５００ヌクレオ
チドを含む)からなる群から選択される、単離spoＶＤ
ＮＡ配列に関する。

【００１１】本発明は、更に、少なくとも１個の殺虫性
結晶タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作業可能に結
合した上記で定義のspoＶＤＮＡ遺伝子を含むＤＮＡセ
グメントに関する。spoＶＤＮＡ配列のコドンは、バチ
ルス・スリンギエンシス染色体ＤＮＡに存在する配列と
実質的に相同なヌクレオチド配列を含み、組換えを可能
にする。このＤＮＡセグメントは、バチルス・スリンギ
エンシスに染色体統合され得る。spoＶＤＮＡ配列と実
質的に相同なバチルス・スリンギエンシス染色体フラグ
メントは、ＤＮＡセグメントの統合部位として働く。こ
の方法において、本発明は細菌中の結晶遺伝子含量の増
加を含む。

【００１２】本発明は、少なくとも１個の殺虫性結晶毒
素タンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合した変異sp
oＶＤＮＡ配列(下記定義)を含むＤＮＡセグメントもま
た含む(ここで変異spoＶＤＮＡ配列のコドンは、バチ
ルス・スリンギエンシス染色体ＤＮＡに存在する胞子形
成遺伝子配列と実質的に相同なヌクレオチド配列を含
み、ＤＮＡセグメントは、細菌染色体胞子形成遺伝子座
に挿入および複製可能であり、更に殺虫性結晶タンパク
質はバチルス宿主で発現でき、宿主は無胞子または少胞
子である)。

【００１３】本発明は、特に、毒素結晶タンパク質は形
質転換宿主により発現されるが、胞子は環境中に放出さ
れる、組換えバチルス・スリンギエンシス株に関する。
従って、加えて、本発明はａ）少なくとも１個で３個以
上ではない殺虫性結晶タンパク質をコードするＤＮＡ配
列に作業可能に結合した変異spoＶＤＮＡ遺伝子を含む
ＤＮＡセグメントを得る；ｂ）上記セグメントを胞子形
成可能なバチルス・スリンギエンシス宿主に挿入する；
ｃ）バチルス・スリンギエンシス宿主中のＤＮＡセグメ
ントと胞子形成遺伝子の実質的に相同なヌクレオチドフ
ラグメントの間で相同組換えを行う(ここで、ＤＮＡセ
グメントは安定にバチルス・スリンギエンシス宿主染色
体に統合され、胞子形成工程を停止する)；およびｄ）
安定に形質転換された無胞子または少胞子バチルス・ス
リンギエンシス宿主を単離する(ここで、安定に形質転
換されたバチルス・スリンギエンシス宿主は挿入殺虫性
結晶タンパク質配列を発現できる)：ことを含む、無胞
子または少胞子殺虫性結晶タンパク質産生バチルス・ス
リンギエンシス宿主の製造法に関する。

【００１４】本発明の更なる目的は、バチルス・スリン
ギエンシス宿主を形質導入ファージにさらす；ファージ
を宿主バチルス・スリンギエンシス中で増殖させる(こ
こで、宿主染色体中に統合された１個から３個の外来性
結晶タンパク質コードＤＮＡ配列をファージに挿入す
る)および外来性結晶タンパク質コードＤＮＡ配列をフ
ァージから受容体バチルス・スリンギエンシスに移す
(ここで、挿入外来性結晶タンパク質コードＤＮＡ配列
は、受容体バチルス・スリンギエンシス染色体に安定に
挿入され、受容体中で発現される)：ことを含む、バチ
ルス・スリンギエンシス宿主の形質導入を含む。受容体
バチルス・スリンギエンシスは、ＤＮＡセグメントによ
って、無胞子または少胞子であったりまたはなかったり
する。

【００１５】この点に関して、本発明は、ＤＮＡセグメ
ントの染色体統合のための座としてのバチルス・スリン
ギエンシス染色体胞子形成遺伝子フラグメントの使用を
含み、ＤＮＡセグメントは少なくとも１個の昆虫結晶タ
ンパク質コード遺伝子、好ましくは１個から３個の昆虫
結晶タンパク質コード遺伝子を含み、遺伝子は安定にバ
チルス・スリンギエンシス染色体に統合される。

【００１６】本発明は、更に、殺虫有効量の本発明の形
質転換バチルス・スリンギエンシスおよび許容可能な担
体を含む、広いスペクトルの殺虫組成物に関する。

【００１７】本発明の他の目的は、バチルス・スリンギ
エンシス宿主の遺伝子工学であり、それにより病原性昆
虫の制御におけるその宿主の使用が、環境的に安全な生
物殺虫剤を提供する(ここで、生存胞子は環境に放出さ
れない)。

【００１８】本発明の更なる目的は、駆除が必要な場所
に本発明の組成物を適用することを含む、穀物の保護法
を含む。本発明の他の態様は、以下の記載および図面か
ら当業者に明白になるであろう。

【００１９】

【図面の説明】図１は、配列番号１に記載し、配列番号
２に対応する、単離spoＶＢt１遺伝子の予測アミノ酸配
列を記載する。図２は、Ｔn９１７で中断されたspoＶＢ
t１遺伝子および配列決定に使用したオリゴヌクレオチ
ドの位置を記載する。図３は、プラスミド、ｐＳＢ９０
１、ｐＢＲ３２２およびｐＳＢ１４０を記載する。図４
は、プラスミドｐＳＢ２１０を記載する。図５は、プラ
スミドｐＳＢ１２０７を記載する。図６は、プラスミド
ｐＳＢ１２０９を記載する。図７は、プラスミドｐＳＢ
１２１８を記載する。

【００２０】図８は、プラスミドｐＳＢ１２１９を記載
する。図９は、プラスミドｐＳＢ１２２０を記載する。
図１０は、プラスミドｐＳＢ１３９を記載する。図１１
は、プラスミドｐＳＢ２１０.１を記載する。図１２
は、プラスミドｐＳＢ３２を記載する。図１３は、プラ
スミドｐＳＢ２１９を記載する。図１４は、プラスミド
ｐＳＢ５４８を記載する。図１５は、プラスミドｐＳＢ
１２２１を記載する。

【００２１】バチルス・スリンギエンシスＨＤ１Ｍit::
Ｔn９１７からの胞子形成遺伝子の単離は、実施例１に
充分記載してある。ヌクレオチド配列は配列番号１に示
す。推定タンパク質製品の分子量は、３６.７ｋＤａと
計算される。胞子形成遺伝子はspoＶＢt１と名付ける。
予測アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に示す。推
定リボゾーム結合部位は、配列番号１のヌクレオチド４
５９から４７０を含み、推定転写ターミネーターステム
ループ(stem-loop)はヌクレオチド１４１５から１４２
４および１４３１から１４４０を含む。

【００２２】本発明はまた、配列番号２のタンパク質を
コードするヌクレオチドを含む。当業者は、アミノ酸が
しばしば２個またはそれ以上のコドンによりコードされ
る、例えばアミノ酸ロイシンは以下のコドン、ＴＴＡ、
ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＡ、ＣＴＧおよびＣＴＣによりコ
ードされることを認るであろう。同じアミノ酸をコード
するコドンは、同義コドンと見なす。

【００２３】本発明は、配列番号２に記載のタンパク質
と実質的に類似の胞子形成タンパク質をコードするヌク
レオチドを更にまた含む。配列番号２に記載のタンパク
質と実質的に類似の語は、タンパク質が第Ｖ胞子形成タ
ンパク質であり、アミノ酸配列の、配列番号２との類似
性が好ましくは少なくとも８０％、更に好ましい類似性
は少なくとも８５％および最も好ましい類似性が９５％
である。第Ｖ胞子形成遺伝子をコードするヌクレオチド
配列は、胞子形成工程の遅い事象に含まれる遺伝子を含
む。例えば、遺伝子は、幾つか挙げると、胞子被覆タン
パク質の堆積、発芽工程の発生および有機溶媒、熱およ
びリソザイムに対する耐性の獲得の進行に含まれる。

【００２４】本発明の内容において、少なくとも互いに
８５％の相同性の２個のアミノ酸配列とは、少なくとも
８５％の同一または保存的置換アミノ酸残基を有する。

【００２５】本発明の目的において、保存的置換は、以
下のグループのアミノ酸の間でなされ得る：(ｉ)アラニ
ン、セリンおよびスレオニン；(ii)グルタミン酸および
アスパラギン酸；(iii)アルギニンおよびリジン；(iv)
アスパラギンおよびグルタミン；(ｖ)イソロイシン、ロ
イシン、バリンおよびメチオニン；および(vi)フェニル
アラニン、チロシンおよびトリプトファン。

【００２６】本発明は、更に、上記の核酸配列とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするものに相補的
な核酸配列を更に含む。第２のヌクレオチドに“ストリ
ンジェントなハイブリダイズ条件下でハイブリダイズ”
する第１のヌクレオチドは、第２の配列が支持体に結合
した場合、実質的に第２の配列から分離せず、第１およ
び第２の配列は共に６５℃で２×０.１％(w／v)ドデシ
ル硫酸ナトリウム含有標準食塩水クエン酸と共にインキ
ュベートし、このようにハイブリダイズした配列を、次
いで５０℃で０.５×０.１％(w／v)ドデシル硫酸ナトリ
ウム標準食塩水クエン酸で洗浄する。

【００２７】具体的に、配列番号１に記載のspoＶＢt１
遺伝子は、胞子形成工程の後のほうの段階に関連する遺
伝子である。この点に関して、本発明のヌクレオチド配
列は、spoＶＤＮＡ配列の一般的な標題を適応し、更に
具体的にはｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を
有するspoＶＢt１遺伝子；ii）配列番号２に記載のバチ
ルス・スリンギエンシス胞子形成タンパク質をコードす
るヌクレオチド配列；iii）配列番号２に記載のタンパ
ク質と実質的に類似のバチルス・スリンギエンシス胞子
形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列；iv）配
列ｉ）、ii）またはiii）の相補鎖と、ストリンジェン
トなハイブリダイズ条件でハイブリダイズするヌクレオ
チド配列；およびｖ）上記配列ｉ）、ii）、iii）また
はiv）の切除ヌクレオチド(ここで、切除ヌクレオチド
は少なくとも３００ヌクレオチドおよび更に好ましくは
少なくとも５００ヌクレオチドを含む)として同定され
る。

【００２８】切断spoＶＤＮＡ配列は最も好ましくはは
少なくとも５００ヌクレオチド、特に好ましくはは配列
番号１の塩基対４８８から１４０４(両端を含む)であ
る。この特に好ましい配列は、本明細書で(t)spoＶＢt
１−１と呼ぶ。

【００２９】従って、本発明は、他のＤＮＡ配列に作業
可能に結合した上記で定義のspoＶＤＮＡ配列または以
下で定義の変異spoＶＤＮＡ配列を含む(ここで、ＤＮ
Ａ配列は外来性または異種タンパク質をコードする)。
例えば、好ましい態様において、ＤＮＡセグメントはsp
oＶＤＮＡ配列に加えて、殺虫性結晶タンパク質コード
ＤＮＡを含み得る。好ましくは、ＤＮＡセグメントは１
個から３個の殺虫性タンパク質コード遺伝子を含む。こ
のような配列は、cryＩＡ(ａ)、cryＩＡ(ｂ)、cryＩＡ
(ｃ)、cryＩＢ、cryＩＣ、cryＩＣ(ｂ)、cryＩＤ、cry
ＩＥ、cryＩＦ、cryＩＧ、cryＩＨ、cryIIＡ、cryII
Ｂ、cryIIIＡ、cryIIIＢ、cryIIIＣ、cryIVＡ、cryIV
Ｂ、cryIVＣ、cryIVＤ、cryＶ、これらの混合物および
これらのcry遺伝子の一部から構築される配列を含む
が、これらに限定されない。特に、結晶タンパク質コー
ドＤＮＡ配列は、cryＩＡ(ｂ)、cryＩＡ(ｃ)、cryＩ
Ｃ、cryIIＡおよびcryＩＥを含む。遺伝子の一部から構
築される配列は、２個または３個の異なる結晶コード毒
素のドメインが含まれるハイブリッド結晶タンパク質を
含む。これらのハイブリッド遺伝子は当分野で既知であ
り、例えば、一つの結晶コード遺伝子のドメインＩおよ
びドメインIIおよび他の結晶毒素コード遺伝子のドメイ
ンIIIを含み得る。特に、cryＩＣのドメインIIIが好ま
しい。ハイブリッドＧ２７遺伝子は、遺伝子がcryＩＥ
のドメインＩおよびIIおよびcryＩＣのドメインIIIを含
む、このような例の一つである。タンパク質Ｇ２７は、
その内容を参考として本明細書に包含する、Ｂosch et
al., Ｂiotechnology 12:915-918(1994)に更に記載され
ている。しかしながら、当業者は、ハイブリッド毒素コ
ード遺伝子を含む種々の毒素の組み合わせ、およびこれ
らの組み合わせが本発明に包含されることをを予見でき
る。異種または外来性タンパク質または遺伝子は、当分
野で、宿主細胞以外の他の源から宿主細胞に移植されて
いる遺伝子を意味するものとして使用されている用語で
ある。

【００３０】本発明により、最も好ましい宿主は、バチ
ルス・スリンギエンシス、クルスタキ(kurstaki)、デン
ドロリムス(dendrolimus)、ガレリアエ(galleriae)、エ
ントモチダス(entomocidus)、アイザワイ(aizawai)、モ
リソニ(morrisoni)、トルウォーシ(tolwothi)およびイ
スラエレンシス(israelensis)亜種であり、最も特にバ
チルス・スリンギエンシス・クルスタキが好ましい。

【００３１】ＤＮＡセグメントは、更に、１種またはそ
れ以上のグラム陰性細菌種または取り分けエンテロバク
ター(Ｅnterobacter)、ニトロモモナス(Ｎitrosomona
s)、シュードモナス(Ｐseudomonas)、セラティア(Ｓerr
atia)、リゾビウム(Ｒhizobium)およびアゾバクター(Ａ
zotobacter)属の株由来の複製起点が使用され得る。エ
シェリキア・コリ(Ｅ. coli)のようなグラム陰性細菌中
にＤＮＡセグメントをクローニングし、バチルス・スリ
ンギエンシスを形質転換した後、残る外来性殺虫性ＤＮ
Ａ配列のみが宿主染色体中に統合される。複製のグラム
陰性起点は、バチルス・スリンギエンシス宿主では機能
せず、ＤＮＡセグメントによる形質転換は、ＤＮＡセグ
メントが宿主染色体に統合されない限り、結晶毒素コー
ド遺伝子を複製も発現もしない。

【００３２】ＤＮＡセグメントは、更に、選択可能マー
カーを含む他の核酸配列を含み得る。一般に、医薬耐
性、化学耐性のための選択可能マーカーは、アミノ酸栄
養要求性または原栄養性または変異または組換え生物の
選択または検出に有用な他の表現型変種が使用できる。
好ましくは、ＤＮＡセグメントはグラム陰性細菌由来の
複製起点および選択可能マーカーを含む。

【００３３】他の配列がまたＤＮＡセグメント中に挿入
され得、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、
エンハンサー配列、リボソーム結合部位、転写開始およ
び停止部位等のような結晶性毒素コード配列の宿主細胞
中での転写および翻訳を指示できる制御配列を含むがこ
れらに限定されない。具体例は、ＣryＩＣプロモータ
ー、ＣryＩＡ(ｃ)ターミネーターおよびermＣプロモー
ターを含む。加えて、請求のspoＶＢt１配列に結合して
いる配列もまた含まれ得る。これらの配列は、プロモー
ター配列、下流エンハンサー配列等を含む。

【００３４】本発明の使用に好適なspoＶＤＮＡ配列
は、バチルス・スリンギエンシス染色体のヌクレオチド
フラグメントと実質的に相同である。このフラグメント
は、一般に胞子形成遺伝子の一部であり、細菌ＤＮＡと
の相同組換えによる、本発明のＤＮＡセグメントの宿主
ＤＮＡへの統合部位として働く。本発明のＤＮＡセグメ
ントは環状、閉鎖ＤＮＡセグメントとして提供され得、
相同組換えが一回交差事象または直鎖ＤＮＡセグメント
として起こり、相同組換えが２回交差事象として起こ
る。従って、実質的に相同なＤＮＡ配列は、１個または
２個のフランキングＤＮＡ配列であり得る。spoＶＤＮ
Ａ配列は、約１５−１６００ヌクレオチド塩基、より好
ましくは２００−１２００の範囲で細菌染色体のフラグ
メントと相同である。当業者は、統合部位において多重
挿入が起こることも認識しよう。

【００３５】ヌクレオチドに関して本明細書で使用の相
同の用語は、異なるヌクレオチド分子における配列の間
の同一度を意味する。従って、１００％相同である２個
の核酸は、同一のヌクレオチド配列を有する。実質的に
相同なヌクレオチド配列またはフラグメントは、フラグ
メントの配列が少なくとも９０％および好ましくは９５
％同一であるものである。相同組換えは、かなりの範囲
にわたる相同領域を有する２個の配列の間で起こる一般
の組換えを意味する；配列は異なる分子のものであり得
る。

【００３６】本発明のＤＮＡセグメントは、ファージま
たはベクター上で行い得、好ましいベクターはプラスミ
ド、特に、本明細書に記載されているプラスミドおよび
本明細書に参照して包含する、１９９５年３月１９日公
開のＰＣＴ国際出願、ＷＯ９４２５６１１に記載されて
いるプラスミドである。加えて、ＤＮＡセグメントはグ
ラム陽性細菌について、ハイブリッドシャトルベクター
上で行い得る。好適なベクターは、グラム陰性細菌、酵
母またはグラム陽性細菌に加えて任意の分子性宿主中で
自己複製可能なベクターを含む。このようなシャトルベ
クターは当分野で既知である。

【００３７】その工程中、外来性ＤＮＡが受容体バチル
ス・スリンギエンシスにより取り込まれる、形質転換
は、当分野で既知の技術により行い得、トランスフェク
ション、エレクトロポレーション、形質導入または結合
を含む。特に好ましい方法は、エレクトロポレーション
および形質導入である。宿主単離は、形質転換宿主の選
択可能マーカーを選択することにより行い得る。次い
で、形質転換宿主を既知の技術により増幅し得る。

【００３８】従って、本発明の好ましい態様は、ａ）１）所望によりグラム陰性細菌からの複製起点；２）ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するspo
ＶＢt１遺伝子； ii）配列番号２に記載のタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列； iii)配列番号２に記載のタンパク質と実質的に類似のバ
チルス・スリンギエンシス胞子形成タンパク質をコード
するヌクレオチド配列 iv）配列ｉ）、ii）またはiii）の相補鎖と、ストリン
ジェントなハイブリダイズ条件でハイブリダイズするヌ
クレオチド配列；およびｖ）上記配列ｉ）、ii）またはiv）の切除ヌクレオチド
(ここで、切除ヌクレオチドは少なくとも３００ヌクレ
オチドを含む)：からなる群から選択される、spoＶＤ
ＮＡ配列３）１個から３個の殺虫性結晶タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列；を含むＤＮＡセグメントを得る；ｂ）セグメントをバチルス・スリンギエンシス宿主に挿
入する；ｃ）バチルス・スリンギエンシス宿主中において、この
ＤＮＡセグメントと胞子形成遺伝子の実質的に相同なヌ
クレオチドフラグメントの間で相同組換えを行う(ここ
で、ＤＮＡセグメントは安定にバチルス・スリンギエン
シス宿主染色体に統合される)；およびｄ）安定に形質転換されたバチルス・スリンギエンシス
形質転換体を単離する(ここで、安定に形質転換された
バチルス・スリンギエンシスは外来性殺虫性結晶タンパ
ク質を製造可能である)：を含む、１個から３個の外来
性殺虫性結晶タンパク質を発現する形質転換バチルス・
スリンギエンシス宿主の製造法である。

【００３９】形質転換バチルス宿主および形質転換体の
増幅により形成されたその子孫もまた本発明に含まれ
る。

【００４０】胞子形成遺伝子または遺伝子群の変異は、
変異胞子の形成をもたらし得る。本明細書で使用の変異
胞子は、少胞子および無胞子株由来の胞子を含む。無胞
子バチルス・スリンギエンシス株は、株が胞子を形成で
きないため、胞子が形成されないものである。あるい
は、少胞子バチルス・スリンギエンシス株は、胞子は形
成されるが、胞子が種々の理由から生存していないか、
または胞子が生存しているが、熱、冷却または有機溶媒
に感受性であり、それらに暴露することにより生存でき
なくなるものである。しばしば、少胞子バチルス・スリ
ンギエンシスは、当分野で相灰色胞子(phase grey spor
es)として既知のものを産生する。

【００４１】遺伝子の変異は、トランスポゾン等の使用
を含む、化学変異、点変異、欠失、挿入変異を含む、当
分野で既知の多くの方法で起こり得る。

【００４２】本発明の一つの態様は、本発明のＤＮＡセ
グメントの、胞子形成遺伝子をコードする染色体ＤＮＡ
を中断する方法における使用である。

【００４３】変異spoＶＤＮＡ配列は、配列が点変異、
欠失または挿入により変えられている本発明のspoＶＤ
ＮＡ配列である。点変異は、一般に、フレームシフト変
異ならびに塩基転移および塩基転換をもたらすヌクレオ
チドの増加または欠失を含む単一ヌクレオチドの変異の
手段であると理解されている。点変異は種々のコドンで
行うことができる。好ましい点変異は、停止コドンを作
成するために使用され、リボゾーム結合およびメチオニ
ン開始コドンの破壊にも使用し得る。これらの停止コド
ンは、遺伝子のどこででも起こるが、本発明のＤＮＡセ
グメントおよび実質的に相同な染色体胞子形成遺伝子座
の間の組換えを妨害しない。

【００４４】従って、本発明の他の態様は、ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列； ii）配列番号２に記載のバチルス・スリンギエンシス胞
子形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列； iii）配列番号２に記載のタンパク質と実質的に類似の
バチルス・スリンギエンシス胞子形成タンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列； iv）配列ｉ）、ii）またはiii）の相補鎖と、ストリン
ジェントなハイブリダイズ条件でハイブリダイズするヌ
クレオチド配列；およびｖ）上記配列ｉ）、ii）、iii）またはiv）の切除ヌク
レオチド(ここで、切除ヌクレオチドは少なくとも３０
０ヌクレオチドを含む)：(ここで、上記ｉ）、ii）、ii
i）、iv）またはｖ）のヌクレオチド配列は、１個また
はそれ以上の点変異、挿入または欠失を含む)からなる
群から選択される、単離変異spoＶＤＮＡ配列である。

【００４５】変異spoＶＤＮＡ配列は、１から約２５の
停止コドンを含み得るが、２５より多いか２５より少な
い数も使用できる。本発明の具体的変異spoＶＤＮＡ配
列は、ヌクレオチド配列４６５から１２５６(両端を含
む)を含む配列番号１のspoＶＢt１配列の一部であり、
その中で表１に記載のような以下のヌクレオチドが置換
されている。一般に、停止コドンは配列番号１のヌクレ
オチド１４０４の前かまたはspoＶＤＮＡ配列に関連し
てに工作され、受容体宿主細胞中で野生型胞子に戻るの
を予防する。加えて、変異spoＶＤＮＡ配列によりコー
ドされているペプチドは、３０６アミノ酸以下でなけれ
ばならない。最も好ましくは、停止コドンは配列番号１
のヌクレオチド１２５６の前かまたはspoＶＤＮＡ配列
に関連してに工作される。

【００４６】

【表１】ヌクレオチド番号元のコドン置換先４６５ＧＴ４７５ＴＡ４８７ＴＡ４９２ＡＴ８７３ＧＴ８８１ＣＡ１２４３ＴＡ１２５４ＡＴ

【００４７】この具体的変異spoＶＤＮＡ配列を(ｍ)sp
oＶＢt1−８と命名する。

【００４８】変異spoＶＤＮＡ配列は、上記の点変異ま
たは配列４６５から１２５４の非変異コドンと実質的に
相同な配列を含み得る。

【００４９】変異spoＶＤＮＡ配列はまたは、例えば、
挿入が２から１５ヌクレオチドからなる；しかしながら
それ以上のヌクレオチドも使用できる核酸配列の外来性
挿入を有するspoＶＤＮＡをまた含む。

【００５０】好ましい変異spoＶＤＮＡ配列は、配列が
配列番号１の変異であり、変異がヌクレオチド数１４０
４の前の２５の点変異からなるものか、または配列が、
配列番号１の塩基対４６５から１２６５からなる切断変
異ヌクレオチド配列であり、点変異が１から２５の間で
あるものである。

【００５１】好ましいＤＮＡセグメントは、上記で定義
の変異spoＶＤＮＡ；および１個から３個の殺虫性結晶
タンパク質コード遺伝子を含む。

【００５２】更に好ましいＤＮＡセグメントは、上記の
spoＶＤＮＡ配列、殺虫性結晶タンパク質コード遺伝
子；およびグラム陰性細菌の複製起点を含む。

【００５３】従って、本発明の別の好ましい態様は、ａ）１）グラム陰性細菌からの複製起点；２）ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するspo
ＶＢt１遺伝子； ii）配列番号２に記載のタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列； iii)配列番号２に記載のタンパク質と実質的に類似のバ
チルス・スリンギエンシス胞子形成タンパク質をコード
するヌクレオチド配列 iv）配列ｉ）、ii）またはiii）の相補鎖と、ストリン
ジェントなハイブリダイズ条件でハイブリダイズするヌ
クレオチド配列；およびｖ）上記配列ｉ）、ii）またはiv）の切除ヌクレオチド
配列(ここで、切除ヌクレオチドは少なくとも３００ヌ
クレオチドを含む)： vi）ここで、上記配列ｉ）、ii）、iii）、iv）または
ｖ）は１個から３個の点変異、挿入または欠損を有す
る；からなる群から選択される変異spoＶＤＮＡ配列３）少なくとも１個の殺虫性結晶タンパク質をコードす
るＤＮＡ配列；を含むＤＮＡセグメントを得る；ｂ）セグメントを胞子形成バチルス・スリンギエンシス
宿主に挿入する；ｃ）バチルス・スリンギエンシス宿主中のＤＮＡセグメ
ントと胞子形成遺伝子の実質的に相同なヌクレオチドフ
ラグメントの間で相同組換えを行う(ここで、変異spoＶ
ＤＮＡを有するＤＮＡセグメントは安定にバチルス・
スリンギエンシス宿主染色体に統合される)；およびｄ）安定に形質転換されたバチルス・スリンギエンシス
形質転換体を単離する(ここで、安定に形質転換された
バチルス・スリンギエンシスは外来性殺虫性結晶タンパ
ク質を製造可能である)：を含む、変異胞子を伴う殺虫
性結晶タンパク質産生バチルス・スリンギエンシス株の
製造法である。

【００５４】宿主染色体中の実質的に相同な胞子形成遺
伝子フラグメントは、好ましくはspoＶＢt１染色体フラ
グメントである。

【００５５】上記のように産生された形質転換バチルス
・スリンギエンシス宿主もまた提供される。

【００５６】方法は更に形質転換少胞子または無胞子宿
主の使用を含む。

【００５７】形質導入は、一つの宿主細胞(供給体)から
別の細胞(受容体)への宿主ＤＮＡのウイルス媒介転移で
ある。ファージが受容体細胞中で複製する場合、数個の
子孫ビリオンが、ファージＤＮＡに加えて、宿主ＤＮＡ
の断片を包含できる。これらのビリオンは新規宿主細胞
に吸収され、通常法方法でそのＤＮＡに挿入されること
ができる。本発明において、本発明のＤＮＡセグメント
で形質転換された宿主株は、更にファージにより形質転
換できる。ファージに挿入されている宿主(供給体)ＤＮ
Ａは、受容体染色体の相同領域と、遺伝子が安定に遺伝
されるように、組換えが行われる。これは、一般に、当
業者に不偏導入と呼ばれている。ファージは当業者に既
知であり、例えば、ＣＰ−５１およびＣＰ５１st４５お
よびそれらの全ての誘導体のような、バチルス・スリン
ギエンシス株に感染できる全てのファージを含む。

【００５８】従って、本発明の別の態様は、ａ）本発明のバチルス・スリンギエンシス宿主を形質導
入ファージにさらす；ｂ）ファージを宿主中で複製させるか(ここで、宿主染
色体中に統合された１個から３個の外来性結晶タンパク
質コードＤＮＡ配列をファージに挿入する)、またはフ
ァージを宿主バチルス・スリンギエンシス中で複製させ
る(ここで、宿主染色体中に統合された変異spoＶＤＮ
Ａ配列および１個から３個の外来性結晶タンパク質コー
ドＤＮＡ配列をファージに挿入する)；およびｃ）外来性結晶タンパク質コードＤＮＡ配列をファージ
から受容体バチルス・スリンギエンシス株に移す(ここ
で、挿入外来性結晶タンパク質コードＤＮＡ配列は、受
容体バチルス・スリンギエンシス染色体に安定に挿入さ
れ、受容体中で発現されるか、または変異spoＶＤＮＡ
配列および外来性結晶タンパク質コードＤＮＡ配列は、
受容体バチルス・スリンギエンシス染色体に安定に挿入
され、受容体中で発現され、受容体は変異胞子を産生す
る)：ことを含む、上記に記載のいずれかの方法で製造
したバチルス・スリンギエンシス宿主に形質導入するこ
とである。

【００５９】変異spoＶＤＮＡおよび外来性結晶性タン
パク質コードＤＮＡ配列は、好ましくは胞子形成遺伝子
染色体フラグメントに挿入される。

【００６０】宿主染色体に統合されるべきＤＮＡセグメ
ントは、好ましくは、１から２５の点変異を含む配列番
号１のヌクレオチド配列４６５から１２６５を含む切断
変異spoＶＤＮＡ配列および結晶性毒素コードＤＮＡ、
cryＩＡ(ｂ)、cryＩＡ(ｃ)、cryＩＣ、cryIIＡまたはcr
yＩＥおよびそれらの一部から構築される配列を含む。

【００６１】本発明はまた上記のように得られた形質転
換株も提供する。

【００６２】受容体バチルス・スリンギエンシスは、形
質転換宿主に導入したＤＮＡセグメントに使用したspo
ＶＤＮＡに依存して、少胞子または無胞子になり得
る。染色体統合に最も好ましい座は、受容体バチルス・
スリンギエンシス株のspoＶＢt１ヌクレオチドフラグメ
ントである。しかしながら、他の胞子形成遺伝子フラグ
メントも同様に遺伝子座として働く。好ましい胞子形成
遺伝子フラグメントは、spoＶＤＮＡ配列と実質的に相
同なものを含む。

【００６３】本発明のＤＮＡセグメントの宿主染色体へ
の安定な挿入は、多くの世代にわらり、宿主染色体中に
ＤＮＡセグメントが維持されることにより定義される。

【００６４】本発明は、更に、形質転換バチルス・スリ
ンギエンシスまたはバチルス由来のタンパク質を活性成
分として含む、害虫駆除用組成物、好ましくは殺虫性組
成物に関する。本発明の組成物は、１個またはそれ以上
の殺虫性Ｃryタンパク質をコードする無胞子または少胞
子バチルス・スリンギエンシスを含み、殺虫有効量で適
用する。殺虫有効量は、具体的Ｃryタンパク質、駆除す
べき具体的昆虫、処置すべき具体的植物および殺虫活性
組成物の適用法などの因子に依存して変化して定義され
る。

【００６５】本発明の組成物は、微生物約１０⁶から約
１０¹³／グラムca.で含み得る。殺虫性濃度は具体的製
剤の担体に依存して変化する。組成物は、０.１から９
９％の形質転換宿主またはその子孫および０から９９.
９％の固体または液体担体を含む。

【００６６】本発明の殺虫剤は、農業的に許容可能な担
体と共に製剤し得る。製剤組成物は、粉末、顆粒物質、
油または水中の懸濁液、エマルジョンまたは水和剤粉末
の形であり得る。好適な農学的担体は、固体または液体
であり得、当業者に既知である。本明細書で使用の農業
的に許容可能な担体は、殺虫剤製剤技術で通常使用され
ている湿潤剤、散布剤、乳濁剤、分散剤、発泡剤、消泡
剤、浸透液、界面活性剤、溶媒、溶解剤、緩衝剤、固着
剤等、全てのアジュバントを含む。

【００６７】無胞子または少胞子バチルス・スリンギエ
ンシス株および１個またはそれ以上の液体または固体ア
ジュバントを含む製剤は、当業者に既知の方法で製造し
得る。

【００６８】本発明の組成物は、既知の方法により、駆
除が望ましい場所、典型的には保護すべき葉に使用す
る。これらの使用は、当分野で既知である。本発明の製
剤は、胞子約１０⁸から約１０¹⁶／エーカーに広げるこ
とにより使用し得る。少胞子または無胞子組成物では、
胞子は存在し得るが未成熟であるか非生存のいずれかで
ある。組成物は、最良には、植物に連続反復使用による
噴霧剤として使用する。本発明の保護すべき植物は、果
実、マメ科植物、油用植物、野菜植物、落葉樹および針
葉樹、ビート植物、観葉植物を含むが、これらに限定さ
れない。組成物は、鱗翅目昆虫、鞘翅目昆虫および双翅
目昆虫の害虫に対して有効であり得る。

【００６９】本発明の更に別の態様は、バチルス・スリ
ンギエンシス染色体胞子形成遺伝子フラグメントのＤＮ
Ａセグメントの染色体統合のための座としての使用法で
あり、セグメントは１個から３個の殺虫結晶タンパク質
コード遺伝子を含む(ここで、遺伝子は安定にバチルス
・スリンギエンシス染色体に統合される)。

【００７０】染色体遺伝子フラグメントは、好ましく
は、ＤＮＡセグメントの約１５から約１６００ヌクレオ
チドと実質的に相同であり、ＤＮＡセグメントはバチル
ス・スリンギエンシス胞子形成タンパク質をコードする
ＤＮＡを含む。

【００７１】安定な統合は、好ましくはバチルス・スリ
ンギエンシスおよびその子孫を少胞子または無胞子株に
する。バチルスは好ましくはバチルス・スリンギエンシ
ス・クルスタキ株である。

【００７２】本発明の方法は、商業的に入手可能な装置
を使用し、Ｍaniatis et al., Ｍolecular Ｃloning：
ＡＬaboratory Ｍanual, Ｃold Ｓpring Ｈabor Ｌabo
ratory(1991)に含まれる、当業者に既知の遺伝子工学お
よび分子クローニングの技術を使用する。

【００７３】本発明を以下の具体的、非限定的実施例を
参考にして、より詳細に記載する。

【００７４】

【実施例】

実施例１：バチルス・スリンギエンシスspoＶＢt１遺伝
子の同定およびクローニング: Ａ．トランスポゾンＴn９１７運搬プラスミドｐＬＴＶ
１の製造。プラスミドｐＬＴＶ１をバチルス・サブチリス株ＰＹ１
１７７から単離する。株を一晩(１８−２０時間)、０.
５％グルコースおよびＴet¹⁰(１０μg／ml)含有ＴＢＡ
Ｂプレート(３.３％Ｄifco Ｔryptose Ｂlood Ａgar Ｂ
ase)で成育させる。単一コロニー由来の細胞を、０.５
％グルコースおよびＴet¹⁰(１０μg／ml)含有ＬＢ(１％
Ｂacto Ｔryptone、０.５％Ｂacto Ｙeast Ｅxtract、
０.５％ＮａＣｌ、ｐＨ７.０)１０mlの接種に使用す
る。細胞を５時間、３７℃で振盪(３００rpm)しながら
インキュベートし、１８,５００×ｇおよび４℃で１０
分遠心し、続いて一度ＳＥＴ緩衝液[２０％シュークロ
ース、５０mＭエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウ
ム(ＥＤＴＡ)、５０mＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０]１
０mlで洗浄する。ペレットをリソザイム２mg／mlおよび
ＲＮase Ａ(Ｂoehringer Ｍannheim Ｂiochemicals, Ｉ
ndianapolis, ＩＮ)０.４mｇ／ml含有ＳＥＴ溶液５００
μlに再懸濁する。細胞懸濁液を３７℃で１０分インキ
ュベートし、融解混合物[１％ドデシル硫酸ナトリウム
(ＳＤＳ)、２００mＭＮａＯＨ]１mlを添加し、続い
て、前冷却中和緩衝液(１.５Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ
４.８)７２５μlを添加する。次いで、混合物を氷上で
２０分インキュベートする；１８,５００×ｇ、４℃で
１０分遠心する；および上清を新しい管に移す。プラス
ミドＤＮＡを次いでＭini Ｑiagen Ｐlasmid Ｋit(Ｑia
gen Ｉnc., Ｃhatsworth, ＣＡ)を使用して単離する。

【００７５】Ｂ．ｐＬＴＶ１のＥ. coli ＧＭ２１６３
への転移特記しない限り、エシェリキア・コリおよびバチルス・
スリンギエンシス株はそれぞれ３７℃および３０℃で成
育する。

【００７６】プラスミドｐＬＴＶ１は、バチルス・スリ
ンギエンシスの形質転換前にdcm(−)宿主細胞中での条
件付が必要である。これは、ｐＬＴＶ１をdcm(−)エシ
ェリキア・コリＧＭ２１６３(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs,
Ｉnc., Ｂeverly, ＭＡ)に転移することにより達成さ
れる。コンピテントなエシェリキア・コリＧＭ２１６３
細胞を、単一コロニーをＳＯＢ培地(２％Ｂacto Ｔrypt
one、０.５％Ｂacto Ｙeast Ｅxtruct、０.０６％Ｎａ
Ｃｌ、０.０５％ＫＣｌ、１０mＭＭｇＣｌ₂、１０mＭ
ＭｇＳＯ₄)中に接種することにより製造する。細胞を
一晩３００rpm、３７℃でインキュベートする。２Ｌフ
ラスコ中のＳＯＢ培地２００mlに、一晩培養したものを
８ml接種し、３７℃、３００rpmでＯＤ₅₅₀が０.３にな
るまでインキュベートする。培養物を氷上に１５分置
き、４,０００×ｇ、４℃で５分遠心し、ペレットを形
質転換緩衝液１(１.２％ＲｂＣｌ、０.９９％ＭｎＣ
ｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、３０mＭ酢酸カリウム、ｐＨ５.８、０.
２５％ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、１５％グリセロール)６４m
lに穏やかに再懸濁する。１５分氷上でインキュベート
した後、細胞を再び４,０００×ｇで遠心し、最後に形
質転換緩衝液２(１０mＭＭＯＰＳ、ｐＨ７.０、０.１
２％ＲｂＣｌ、１.１％ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、１５％グ
リセロール)１６mlに再懸濁する。コンピテントな細胞
約１５μlおよびＤＮＡ４μlを１.５mlエッペンドルフ
管中で混合し、氷上で１分インキュベートする。細胞お
よびＤＮＡの混合物(バチルス・サブチリス株ＰＹ１１７
７から単離のｐＬＴＶ１)を前冷却０.２cmギャップ電子
キュベット(gap electrode cuvette)に移し、高圧Ｇene
Ｐulserエレクトロポレーション装置を使用してパルス
を発生させる。エレクトロポレーション条件は、２５μ
Ｆ、２.５kＶおよび２００Ωであった。細胞をすぐにＳ
ＯＣ培地(２％Ｂacto Ｔryptone、０.５％Ｂacto Ｙeas
tＥxtruct、０.０６％ＮａＣｌ、０.０５％ＫＣｌ、２
０mＭグルコース)１mlに移し、３７℃、２２５rpmで１
時間インキュベートする。細胞を、Ａmp⁷⁵(７５μg／m
l)含有ＬＢ寒天に置き、一晩３７℃でインキュベートす
る。プラスミドｐＬＴＶ１をＭini Ｑiagen Ｐlasmid
Ｋitを使用してエシェリキア・コリＧＭ２１６３細胞か
ら単離する。

【００７７】Ｃ．ｐＬＴＶ１のバチルス・スリンギエン
シスＣry−Ｂへの転移バチルス・スリンギエンシス株ＨＤ１Ｍit９をトランス
ポゾン変異誘発に使用した。この株はＰurdue Ｕnivers
ityのＡrthur Ｉ. Ａronson博士から得た。バチルス・
スリンギエンシス亜種クルスタキＨＤ１由来の非結晶細
胞であり、僅か１個の４−mＤaプラスミドを含む。

【００７８】Ｅ. coliから単離したプラスミドｐＬＴＶ
は、ＨＤ１Ｍit９中で不安定である。結果として、ＧＭ
２１６３由来のプラスミドＤＮＡを、バチルス・スリン
ギエンシスのプラスミド粗結晶マイナス株(Ｓtahly,
Ｄ. Ｐ., Ｄingmann, Ｄ. Ｗ.,Ｂulla, Ｌ. Ａ. Ａrons
on, Ａ. Ｉ., Ｂiochem. Ｂiophys. Ｒes. Ｃom. 84:58
1-588, 1978)であるＣry^-Ｂ中に形質転換する。コンピ
テント細胞を製造するために、Ｃry^-Ｂを一晩ＬＢプレ
ートで成育させる。個々のコロニーを、１Ｌフラスコ中
のＢＨＩＳ培地(３.７％Ｂrain Ｈeart Ｉnfusion,０.
５Ｍシュークロース)１００mlに接種するために使用す
る。培養物を振盪しながら、３７℃で、ＯＤ₆₀₀が０.２
−０.３になるまでインキュベートする。細胞を前冷却
２５０mlビンに移し、７分、６,５００×ｇ、４℃で遠
心する。ペレットを氷冷ＨＥＰＥＳ(Ｎ−[２−ヒドロキ
シエチル]ピペラジン−Ｎ'−[２−エタンスルホン酸]）
／シュークロース洗浄液(５mＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.
０、０.５Ｍシュークロース)１００mlで１回、１０mlで
２回洗浄する。次いで、細胞をＨＥＰＥＳ／シュークロ
ースおよび５０％グリセロール２.５ml１０ml含有溶液
に再懸濁する。コンピテントバチルス・スリンギエンシ
ス細胞(２００μl)を、前冷却０.２cmギャップ電極Ｇen
e Ｐulser Ｃuvette中でプラスミドＤＮＡｐＬＴＶ１
(１−５μg)と混合し、Ｇene Ｐulserエレクトロポレー
ション装置(Ｂio-Ｒad Ｌaboratories,Ｒichmond, Ｃ
Ａ)で電流にさらす。Ｃry^-Ｂのエレクトロポレーション
のパラメーターは１.０５kＶ、２５μＦ、Ω＝∞であ
る。エレクトロポレーションに続き、細胞をすぐに１２
５mlフラスコ中のＢＨＩＳ５mlに移し、３０℃、２５０
rpmで成育させる。成育３時間後、細胞をＴet¹⁰含有Ｌ
Ｂ寒天プレートに移す。プレートを一晩３０℃でインキ
ュベートし、形質転換、命名Cry^-Ｂ(ｐＬＴＶ１)を新鮮
ＬＢＴet¹⁰プレートに再画線する。

【００７９】Ｄ．バチルス・スリンギエンシス株Ｃry−
ＢからのプラスミドpＬＴＶ１の単離 Cry^-Ｂ(ｐＬＴＶ１)をＬＢＴet¹⁰プレートに再画線す
る。培養物を一晩成育させる。単一コロニーをＳＡプレ
ート(１×Ｓpizizens塩、１％カサミン酸、０.５％グル
コース、０.００５mＭＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、１.５％Ｂa
cto寒天)に再画線し、３−４時間、３７℃でインキュベ
ートする。１×Ｓpizizens塩は０.２％(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、
１.４％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０.６％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.１％クエ
ン酸ナトリウム２Ｈ₂Ｏおよび０.０２％ＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏを含む(Ａnagnostopoulus and Ｓpizizen, 196
1)。成育細胞をプレートから除去し、ＴＥＳＬ(１００m
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１０mＭＥＤＴＡ、
２０％シュークロース、２mg／mlリソザイム)１００μl
に再懸濁し、３７℃で３０−６０分インキュベートす
る。融解溶液(２００mＭＮａＯＨ、１％ＳＤＳ)２０
０マイクロリットルを管に加え、室温で５分インキュベ
ートする。氷冷３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ４.８、１５０
μlの添加後、懸濁液を２０分、１８,５００×ｇ、４℃
で微少遠心する。上清を新しい管に移し、１８,５００
×ｇ、４℃で３０分遠心する。プラスミドＤＮＡを７０
％エタノールで洗浄し、真空下乾燥し、ＴＥ２０μlに
再懸濁する。

【００８０】Ｅ．バチルス・スリンギエンシス株ＨＤ１
Ｍit９へのｐＬＶＴ１の転移Ｃry^-Ｂ(ｐＬＶＴ１)から単離したプラスミドｐＬＶＴ
１を株ＨＤ１Ｍit９に挿入する。バチルス・スリンギエ
ンシス株ＨＤ１Ｍit９細胞(Ａrthur Ｉ. Ａronson博士,
Ｐurde Ｕniversity)をコンピテントにし、上記のＣry
^-Ｂについて記載したのと同じ方法を使用して形質転換
する。プラスミドをＨＤ１Ｍit９(ｐＬＶＴ１)から、Ｃ
ry^-Ｂ(ｐＬＶＴ１)に使用したのと同様の方法で単離す
る。しかしながら、ＨＤ１Ｍit９のエレクトロポレーシ
ョンのパラメーターは、１.２kＶ、３μＦ、Ω＝∞であ
る。ＨＤ１Ｍit９形質転換体中のｐＬＶＴ１の存在は、
制限酵素消化およびポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によ
り確認された。それぞれの実験の結果は、アガロースゲ
ル電気泳動で分析した。ＨＤ１Ｍit９から単離されたｐ
ＬＶＴ１ＤＮＡ(１μg)をＥcoＲＩ(Ｐharmacia Ｂiot
echnology, Ｐiscatawar, ＮＪ)で、製造者が記載の条
件下で消化させる。ＰＣＲ反応に使用した配列番号３の
プライマーＬacＮＨＳ１および配列番号４のＬacＮＨＳ
２を、ＰＣＲ−Ｍate ＤＮＡ合成装置モデル３９１(Ａ
pplied Ｂiosystem, Ｆoster Ｃity,ＣＡ)で合成する。

【００８１】

【表２】プライマー番号配列(５'−３') 配列番号ＬacＮＨＳ１ GGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGC ３ＬacＮＨＳ２ CCAGACCAACTGGTAATGGTAGCGACCGGC ４

【００８２】単一バチルス・スリンギエンシスコロニー
を滅菌水１５μlに再懸濁し、沸騰水浴に１０分置き、
ついて５分間遠心する。各ＰＣＲ反応は沸騰細胞由来の
上清２μl、１×ＰＣＲ緩衝液[１００mＭトリス緩衝
液ＨＣｌ、ｐＨ８.３、５００mＭＫＣｌ、１５mＭ
ＭｇＣｌ₂、０.１％(wt/vol)ゼラチン]、２００μＭデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸(ｄＮＴＰ'；１.２５m
ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ)、
１μＭＬacＨＮＳ１プライマー、１μＭＬａｃＨＮ
Ｓ２プライマー、および２．５単位ＡmpliＴaq ＤＮＡ
ポリメラーゼ(Ｐerkin-Ｅlmer Ｃetus, Ｎorwalk, Ｃ
Ｔ)から成る。反応をＤＮＡＴhermal Ｃycler(Ｐerki
n-Ｅlmer Ｃetus)でそれぞれ２５サイクル行う。各サイ
クルは、１分、９４℃(変性)、２分、５５℃(ハイブリ
ダイゼーション)および３分、７２℃(伸長)から成る。
ＰＣＲ生産物をアガロースゲル電気泳動で分析する。
１.５kbのＰＣＲ産生フラグメントは、クローンがｐＬ
ＴＶ１プラスミドを含むことを示唆する。

【００８３】Ｆ．Ｔｎ９１７挿入ライブラリーの製造ライブラリーを製造するために、ＨＤ１Ｍit９(ｐＬＴ
Ｖ１)をＴet¹⁰含有ＬＢプレートで成育させる。２から
３個のコロニーを、Ｅry^0.15含有Ｐenassayブロス(１.
７５％Ｄifco Ａntibiotic Ｍedium ３)１０mlへの接種
に使用する。９０分、３０℃および３００rpmで成育さ
せた後、培養物中の抗生物質濃度をＥry¹およびＬｍ²⁵
に増加させる。培養物のＯＤ₅₉₅が０.５に到達した場
合、１００μl分を、Ｅry¹およびＬｍ²⁵含有新鮮Ｐenas
sayブロス１０mlに添加する。１９時間、３９℃および
３００rpmで成育させた後、培養物をＥry¹およびＬｍ²⁵
含有Ｐenassay１０mlで１：１５に希釈し、３９℃で穏
やかに振盪しながらＯＤ₅₉₅が２.０になるまで成育させ
る。細胞を遠心(４,０００×ｇ、４℃)してペレットに
しＥry¹および３０％グリセロール含有Ｐenassayブロス
に再懸濁し、ドライアイスで凍結する。ライブラリー希
釈(１０^-3および１０^-4)をＰenassay Ｅry⁵ブロスに置
き、３９℃で１６時間インキュベートする。個々のコロ
ニーを、異なった抗生物質(Ｔet¹⁰、Ｌｍ²⁵、Ｅry⁵)含
有ＬＢプレート上にパッチ形成し、一晩３０℃で成育さ
せる。ＬＢＬｍ²⁵およびＬＢＥry⁵でのみ成育する
がＬＢＴet¹⁰では成育しないコロニーがＴｎ９１７挿
入を含む。これらのコロニーはＣＹＳプレート(１％カ
シトン、０.５％グルコース、０.２％Ｂacto Ｙeast Ｅ
xtract、０.１％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.５ｍＭＭｇＣｌ₂、
０.０５ｍＭＭｎＣｌ₂、０.０５ｍＭＺｎＳＯ₄、
０.０５ｍＭＦｅＣｌ₂、０.２ｍＭＣａＣｌ₂、１.
５％バクトアガー)で成育させ、その胞子形成能力を顕
微鏡で試験する。１×１０⁴コロニー以上をトランスポ
ゾン挿入についてスクリーニングする。染色体挿入を有
する６３コロニーが得られる。３つのコロニーのみ(挿
入変異体の５％)が胞子形成欠損である。胞子形成変異
体を更に分析する。

【００８４】栄養要求およびクエン酸サイクル欠損コロ
ニーを同定するために、バチルス・スリンギエンシス胞
子形成変異体をグルコース最少および乳酸最少プレート
で１−２日成育し、ＨＤ１Ｍit９と成育を比較する。グ
ルコース最少寒天は、１×塩溶液[１リットル；５.６ｇ
Ｋ₂ＨＰＯ₄、２.４ｇＫＨ₂ＰＯ₄、１.２ｇ (Ｎ
Ｈ₄)₂ＳＯ₄、０.４ｇクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.
０]、０.００５mＭＦｅＣＬ₂、０.２５mＭＭｇＣｌ
₂、０.９６％グルコース、０.０００２mＭＭｎＣ
ｌ₂、０.０００１２％チアミン−Ｂ１および１.５％バ
クトアガーから作る。乳酸最少培地は、０.２％乳酸お
よび２５mＭグルタメートをグルコースおよびクエン
酸ナトリウムの代わりに有する。３胞子形成変異体はグ
ルコースおよび乳酸最少培地で良く成育し、栄養要求ま
たはクエン酸サイクル酵素欠損でないことを示唆する。

【００８５】Ｇ．バチルス・スリンギエンシス胞子形成
変異体からのＤＮＡの単離胞子形成変異株、ＨＤ１Ｍit９::Ｔｎ９１７を一晩、２
００rpmでＬＢ培地２ml上成育させる。一晩培養物を、
ＬＢ１００mlへの接種(１％接種)に使用する。細胞をＯ
Ｄ₆₀₀が０.７−１.０になるまで３００rpmで成育させ、
遠心(３,８４０×ｇ、５分、４℃)により回収し、ＴＥ
Ｓ(２５mＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、２５mＭＥ
ＤＴＡ、２５％シュークロース)５mlに再懸濁する。細
胞懸濁液をＴＥＳ溶液中１０mｇ／mlのリソザイム０.５
５mlと混合し、３７℃で６０分インキュベートする。Ｓ
ＤＳを２％重量／容量添加し、続いて１５分、５０℃で
インキュベートする。懸濁液を５ＭＮａＣｌ１.５２m
lと混合し、５０℃で５分インキュベートする。サンプ
ルを０℃で１時間インキュベートし、１０分、１８,５
００×ｇ、４℃で遠心し、懸濁液を新しい管に移す。Ｄ
ＮＡをタンパク質から精製するために、上清をフェノー
ルおよびクロロホルムで処理する。最初に、ＴＥ平衡化
フェノール５mlと混合し、続いて１５分間５０℃でイン
キュベートし、次いでフェノール／クロロホルム(１：
１)５mlと混合し、最後のクロロホルム５mlと混合す
る。各工程で、水性相を有機相から遠心(４,０００×
ｇ、５分)により分離する。ＤＮＡをイソプロパノール
４.６mlを添加し、遠心(１８,５００×ｇ、３０分、４
℃)することにより沈殿させる。空気乾燥ＤＮＡペレエ
ットをＴＥ２mlに溶解し、−２０℃で貯蔵した。

【００８６】Ｈ．トランスポゾン挿入に結合している染
色体ＤＮＡのクローニングバチルス・スリンギエンシス染色体ＤＮＡを、エシェリ
キア・コリＤＨ５α(Ｇibco ＢＲＬ, Ｇrand Ｉsland,
ＮＹ)またはＨＢ１０１(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs, Ｉn
c.)株中にクローン化し、保持する。制限酵素、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼおよび反応緩衝液をＮew Ｅngland Ｂio
labs, Ｉnc.、Ｐharmacia Ｂiotechnology(Ｐiscatawa
y, ＮＪ)またはＧibco ＢＲＬから購入する。コンピテ
ントエシェリキア・コリ細胞を以下のように製造した。
株をＬＢ寒天プレートで１６−１８時間インキュベート
する。幾つかのコロニーを、１Ｌエレンマイヤーフラス
コ中のＬＢ１００mlに接種するのに使用する。液体培養
物を３７℃、３００rpmで成育させる。培養物が、ＯＤ
₆₀₀が０.２に到達したら、氷上に１５分置き、次いで１
０分、５,５００×ｇ、４℃で遠心する。細胞を０.０５
ＭＣａＣｌ₂ ５０ml(１／２容量)に再懸濁し、氷上
で２０分インキュベートし、上記のように遠心する。コ
ンピテント細胞を２０％グリセロール含有５０mＭＣ
ａＣｌ₂ ５ml(１／２０容量)に溶解し、微少遠心管に
入れる(１００μl／管)。

【００８７】バチルス・スリンギエンシス染色体ＤＮＡ
(１１−１４μg)を以下のように制限酵素で消化する。
反応物は３０−５０単位の酵素を１×反応緩衝液中に含
み、一晩３７℃でインキュベートする。１０×反応緩衝
液はＲＥact ２(５００mＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.
０、１００mＭＭｇＣｌ₂、５００mＭＮａＣｌ)、Ｒ
Ｅact ３(５００mＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１
００mＭＭｇＣｌ₂、１ＭＮａＣｌ)およびＮＥＢ３
[５００mＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１００mＭ
ＭｇＣｌ₂、１０mＭジチオスレイトール(ＤＴＴ)、１
ＭＮａＣｌ]を含む。ＲＥact ２、ＲＥact ３およ
びＮＥＢ３緩衝液はＸbal、ＥcoＲＩおよびＢspＥＩ酵
素にそれぞれ使用する。酵素を７０℃、４０分で加熱す
ることにより不活性化する。消化ＤＮＡを、１６単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび５×リガーゼ反応緩衝液
[５０mＭＭｇＣｌ₂、２５％(wt/vol)ポリエチレング
リコール８０００、５mＭ、ＡＴＰ、５mＭＤＴＰ、２
５０mＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６]を使用して１０
０μl容量中にライゲートし、一晩１６℃でインキュベ
ートする。ライゲート混合物をエシェリキア・コリＨＢ
１０１コンピテント細胞１００μリットルを形質転換す
るのに使用する。アンピシリン耐性形質転換コロニーを
Ａmp⁷⁵含有ＬＢ寒天で１６時間成育させた後に単離す
る。プラスミドＤＮＡをＨＢ１０１形質転換体から単離
し、エシェリキア・コリＤＨ５αまたはＧＭ２１６３に
移し、次いで制限エンドヌクレアーゼ消化により分析す
る。

【００８８】Ｉ．spoＶＢt１のヌクレオチド配列の決定クローン化遺伝子の両方の鎖を、ＰＣＲ−Ｍate ＤＮ
Ｎ合成装置モデル３９１で合成した第２表に列記のプラ
イマーを使用して配列決定する。オリゴヌクレオチドの
位置は図２に示す。Ｓequance Ｖersion 2.0 ＤＮＡＳ
equencing Ｋit(Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical, Ｃlea
veland, ＯＨ)をクローン化バチルス・スリンギエンシ
ス染色体フラグメントの配列決定に、製造者の記載のよ
うに使用した。spoＶＢt１遺伝子の配列は配列番号１に
示す。spoＶＢt１遺伝子生産物の分子量は、３６.７kＤ
aである。

【００８９】

【表３】第２表バチルス・スリンギエンシス spoＶＢt１遺伝子の配列決定に使用されるプライマープライマー番号配列(５'−３') 配列番号ＭＳ１ GAGAGATGTCACCGTCAAG ５ＭＳ２ CCCTGTACCTGGATTCCC ６ＭＳ３ GGGAATCCAGGTACAGGG ７ＭＳ４ CCATCCCAACAAGCTTCCC ８ＭＳ５ GGGAAGCTTGTTGGGATGG ９ＭＳ６ CCTGTCCCCCTTGTAAATGC １０ＭＳ７ GCATTTACAAGGGGGACAGG １１ＭＳ８ CGCCGTCTACTTACAAGCAGC １２ＭＳ９ GGTGGTGGGACTATGGAG １３ＭＳ１０ CTCCATAGTCCCACCACC １４ＭＳ１１Ａ CGAGGAGGAGAGAAGGAC １５ＭＳ１１Ｂ GTCCTTCTCTCCTCCTC １６ＭＳ１２Ａ CGAAGTGTACGGTCTGG １７ＭＳ１２Ｂ CACGATGCATCG １８ＭＳ１３Ａ CGAAAGAGGCTGAATGG １９ＭＳ１３Ｂ GGGCGGTATGTACGG ２０ＭＳ１３Ｃ CCGTACATACCGCCC ２１ＭＳ１４ GCATCAAATCCATACTCGATATTCC ２２ＭＳ１４Ａ CGAGTATGGATTTGATGCTCG ２３ＭＳ１６ GGACACGATCCTAATTCAGC ２４ＭＳ１６Ａ GCTGAATTAGGATCGTGTCC ２５

【００９０】Ｊ．胞子形成変異株ＨＤ１Ｍit９::Ｔｎ９
１７由来胞子の特徴付ＨＤ１Ｍit９の変異および野生型胞子の熱、リソザイム
および有機溶媒に対する耐性を比較する。野生型および
変異株をＣＹＳ培地１００ml中で生存させる。培養物
を、静止相に到達した４８時間後に回収する。胞子形成
培養物を種々の処理にさらし、０.１％ペプトン中の連
続希釈をＬＢ寒天に置き、一晩３０℃でインキュベート
する。発芽胞子から発生したコロニーを計数する。胞子
の熱、リソザイムおよび有機溶媒に対する耐性を測定す
る。熱処理：培養物を０.１％滅菌ペプトンで１：１０
に希釈し、２等量部に分ける。１部を５５℃で、他方を
６５℃で４５分間、時々撹拌しながらインキュベートす
る。リソザイム処理：培養物を２５０μｇ／mlリソザイ
ム含有０.１％ペプトンで１：１００に希釈し、３７℃
で１５分間インキュベートする。有機溶媒処理：サンプ
ルをトルエン、１−オクタノールおよびクロロホルム
で、以下のプロトコールを使用して処理する。培養物１
mlを０.１％ペプトン７mlおよび有機溶媒２mlと混合す
る。次いで、混合物を１分間ボルテックスにかける。ア
セトン処理のために、培養物をアセトンで１：１０に希
釈し、室温で１５分間インキュベートする。変異胞子は
熱および有機溶媒に感受性であり、リソザイムに耐性で
ある。胞子形成変異株から形成される胞子の相対的耐性
は、最も耐性から少ない耐性で、下記の通りである：リ
ソザイム、熱、トルエン、クロロホルム、アセトンおよ
び１−オクタノール。

【００９１】実施例２：染色体統合Ａ．spoＶＢt１ＤＮＡ配列および変異spoＶＤＮＡ
配列の製造 spoＶＢt１ＤＮＡ配列を上記実施例１のように製造す
る。プライマーＭＳ１８、ＭＳ１９Ａ、ＭＳ１９Ｂおよ
びＭＳ２０を、天然spoＶＢt１を鋳型として使用する変
異spoＶ遺伝子増幅ＰＣＲに使用する。プライマーは、
推定リボゾーム結合部位および開始コドンが破壊され、
多重停止コドンがspoＶＢt１配列に挿入されるように幾
つかの点変異を含む。変異spoＶＤＮＡ配列は配列番号
１のヌクレオチド４６５から１２５６に対応し、表１に
示唆の置換を有する。具体的変異spoＶＤＮＡ配列は、
(ｍ)spoＶＢt１−８と命名する。

【００９２】

【表４】プライマー番号配列(５'−３') 配列番号ＭＳ１８ GATGTGATTGTAAGGAACAATCGAAGCGATAGAAAAAC ２６ＭＳ１９Ａ GATCTTGTATGAGAGTAAATCGGCCATACAGC ２７ＭＳ１９Ｂ GCTGTATGGCCGATTTACTCTCATACAAGCTC ２８ＭＳ２０ CTATACAGCATGTTAATGATCCC ２９

【００９３】(ｍ)spoＶＢt１-８遺伝子を得るために、
２個のＰＣＲ反応を含む。２個の遺伝子フラグメント
は、配列の３'および５'半分で、各ＤＮＡ鎖にＭＳ１９
ＡおよびＭＳ１９Ｂに対応する３２bpオーバーラップを
含む。５'半分は、プライマーＭＳ１８およびＭＳ１９
Ｂを使用して増幅し、３'半分はプライマーＭＳ１９Ａ
およびＭＳ２０を使用して増幅する。２個のフラグメン
トを混合し、変性し、アニールする。完全(ｍ)spoＶＢt
１-８遺伝子がプライマーＭＳ１８およびＭＳ２０を使
用して増幅される。

【００９４】Ｂ．(ｔ)spoＶＢt１−１と共に、spoＶ遺
伝子Ｂt１部位への結晶遺伝子の染色体統合結晶遺伝子を、バチルス・スリンギエンシス染色体にｐ
ＳＢ１２０９プラスミド(図６)を使用して統合する。プ
ラスミドｐＳＢ９０１(図３)を構築し、エリスロマイシ
ン耐性遺伝子、ermＣを提供する。ermＣ遺伝子を、Ｍon
od et al.[Ｍonod et al., Ｊ. Ｂacteriol. 167:138-1
47(1986)]に記載のｐ１Ｍ１３バチルス・サブチリスプ
ラスミドからＨindIII／ＣlaＩフラグメントとして単離
する。ermＣＨindIII／ＣlaＩフラグメントを、Ｈind
IIIおよびＡccＩで切断したｐＵＣ１８にライゲートす
る。ｐＢＲ３２２(図３)のテトラサイクリン耐性遺伝子
(tet^r)とｐＳＢ９０１のermＣ遺伝子を置換するため
に、ｐＢＲ３２２をＡvaＩで消化し、直線化ベクターを
エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフ
ラグメントで処理し、平滑末端を作成する。クレノー処
理に続き、ｐＢＲ３２２をＨindIIIで消化し、大フラグ
メントをtet^r遺伝子フラグメントから精製除去する。プ
ラスミドｐＳＢ９０１をＳmaＩ、続いてＨindIIIで消化
し、ermＣＳmaＩ−ＨindIIIフラグメントを有するフ
ラグメントを精製する。ermＣ遺伝子をｐＢＲ３２２
ＨindIII大フラグメントとライゲートし、ｐＳＢ１４０
(図３)を産生する。

【００９５】

【表５】プライマー番号配列(５'−３') 配列番号ＫＫ１４ AGCTTGCGGCCGCGTCGACCCCGGGCCATGGGGGCCCG ３０ＫＫ１４Ｂ AATTCGGGCCCCCATGGCCCGGGGTCGACGCGGCCGCA ３１ＭＳ１７ GCGAAAGAAAAACAACAATC ３２

【００９６】ＰＣＲプライマー、配列番号２２のＭＳ１
４、配列番号３２のＭＳ１７を使用して、(ｔ)spoＶＢt
１−１遺伝子をバチルス・スリンギエンシスＨＤ７３株
から増幅する。９１６bpＰＣＲ産物は、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩクレノーフラグメントを使用して両端は平滑に
し、プラスミドｐＵＣ１８のＳmaＩ部位にクローン化す
る。(ｔ)spoＶＢt１−１は配列番号１の塩基対４８８か
ら１４０４に対応する。得られるプラスミドをｐＳＢ１
２０７(図５)と呼ぶ。

【００９７】(ｔ)spoＶＢt１−１遺伝子をｐＳＢ１２０
７からＥcoＲＩおよびＨincII制限酵素を使用して単離
し、両端をクレノーフラグメントを使用して平滑にし
た。ｐＳＢ２１０をＨindIII酵素を使用して直線化し、
クレノーで平滑にし、ウシ腸管アルカリホスファターゼ
(ＣＩＰ)を使用して脱リン酸化する。単離(ｔ)spoＶＢt
１−１遺伝子を、次いで、直線化ｐＳＢ２１０プラスミ
ドにライゲートする。得られるプラスミドをｐＳＢ１２
０９(図６)と呼ぶ。種々の結晶遺伝子がｐＳＢ１２０９
のＡpaＩおよびＮotＩ部位でクローン化され、バチルス
・スリンギエンシス染色体にspoＶＢt１部位で統合され
る。

【００９８】Ｃ．(ｍ)spoＶＢt１−８を使用したspoＶ
遺伝子Ｂt１部位への結晶遺伝子の染色体統合 (ｍ)spoＶＢt１−８フラグメントをバチルス・スリンギ
エンシスＨＤ７３株からＰＣＲ技術を使用して増幅す
る。０.８kbＰＣＲ産物を、クレノーフラグメントを使
用して両端を平滑にし、プラスミドｐＵＣ１９のＳmaＩ
部位にクローン化する。得られるブラスミドをｐＳＢ１
２１８(図７)と呼ぶ。

【００９９】(ｍ)spoＶＢt１−８フラグメントをｐＳＢ
１２１８のＫpnＩおよびＢamＨＩ部位で単離する。フラ
グメントをＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して両端を
平滑にし、プラスミドｐＳＢ２１０のＭscＩ部位にクロ
ーン化する。得られるプラスミドはｐＳＢ１２１９(図
８)およびｐＳＢ１２２０(図９)である。クローン化
(ｍ)spoＶＢt１−８フラグメントは、ｐＳＢ２１０(ｐ
ＳＢ１２１９)内のermＣ遺伝子と同じ配向であるか、ま
たはermＣ開放読み取り枠(ｐＳＢ１２２０)と反対の配
向のいずれかである。ＣryＩＣ／ＣryＩＥハイブリッド
結晶タンパク質をコードするＧ２７遺伝子を以下の工程
を使用してｐＳＢ１２１９にクローン化する:

【０１００】ｐＳＢ２１０.１プラスミド(図１１)を構
築するために、ホスホリラーゼＣ“plc”遺伝子をｐＳ
Ｂ２１０に加える。バチルス・スリンギエンシス株ＡＴ
ＣＣ１０７９２のplc領域のＤＮＡ配列をＧenbank(Ａcc
ession番号Ｘ１４１７８)から得、それはＬechner et a
l.[Ｌechner, Ｍ et al., Ｍol. Ｍicrobiol. 3:621-6
26(1989)]に記載されている。plc領域をＨＤ７３全遺伝
子から、プライマーＰhos１およびＰhos４を使用してＰ
ＣＲにより増幅する。

【０１０１】

【表６】プライマー番号配列(５'−３') 配列番号Ｐhos１ GGAACGCTACATACTAGTGATAGAGTAG ３３Ｐhos４ GCTTGTACACCGCAACTGTTTTCGCATG ３４

【０１０２】ＰＣＲ産物をｐＵＣ１８のＳmaＩ部位にク
ローン化し、ｐＳＢ１３９(図１０)を構築する。plc標
的領域をｐＳＢ１３８由来の２.２kb平滑−ＫpnＩに単
離し、ＢamＨＩフラグメントゲル精製し、ＭscＩおよび
ＢamＨＩで消化し、製造者の指示に従ってＧeneclean
Ｋit(Ｂio１０１)を使用して精製したｐＳＢ２１０にラ
イゲートする。得られるプラスミドをｐＳＢ２１０.１
(図１１)と命名する。

【０１０３】バチルス・スリンギエンシス・アイザワイ
由来の正基準cryＩＡ(ｂ)遺伝子を有するプラスミドｐ
ＳＢ３２(図１２)をＡpaＩおよびＮotＩで切断し、cry
ＩＡ(ｂ)遺伝子を含む４.２kbフラグメントを遊離させ
る。本プラスミドは、pＢlueＳcriptＫＳ⁺、cryＩＡ
(ｂ)遺伝子の発現を制御するcryＩＣプロモーターおよ
びcryＩＡ(ｃ)ターミネーターも含み得る。単離cryＩＡ
(ｂ)フラグメントを、ＡpaＩおよびＮotＩで切断したｐ
ＳＢ２１０.１にライゲートし、cryＩＡ(ｂ)、plcおよ
びermＣ遺伝子を含むｐＳＢ２１９(図１３)を産生す
る。

【０１０４】Ｇ２７毒素コード領域を含む３.９kb Ａp
aＩ／ＮotＩフラグメントをｐＳＢ２１９由来の３.６kb
ＡpaＩ／ＮotＩフラグメントとライゲートする。得ら
れるプラスミドをｐＳＢ４５８(図１４)と呼ぶ。

【０１０５】Ｇ２７をＡpaＩおよびＮotＩ消化を使用
してｐＳＢ４５８から単離し、ｐＳＢ１２１９のＡpaＩ
／ＮotＩ部位にライゲートする。得られるプラスミドを
ｐＳＢ１２２１(図１５)と呼ぶ。このプラスミドを、以
下に記載の、spoＶＢt１領域と相同で、同時にその部位
で変異が起こるバチルス・スリンギエンシス染色体で、
形質転換によりＧ２７を統合するのに使用する。

【０１０６】他の結晶遺伝子をまたｐＳＢ１２１９およ
びｐＳＢ１２２０のＡpaＩおよびＮotＩにクローン化
し、次いでspoＶＢt１領域と相同で、同時にその部位で
変異が起こるバチルス・スリンギエンシス染色体に統合
する。

【０１０７】Ｄ．バチルス・スリンギエンシス形質転換コンピテントＨＤ７３およびＷ４Ｄ２３バチルス・スリ
ンギエンシス細胞を製造するために、株をＢＨＩＳ培地
(５０％ブレイン・ハート・インフュージョンブロス、
５０％１Ｍシュークロース)５０ml中で、３７℃、３０
０rpmでＯＤ₆₀₀が０.２−０.３に到達するまで成育す
る。Ｗ４Ｄ２３はＨＤ７３の結晶マイナス誘導体であ
る。細胞を１容量、１／２容量および１／４容量の氷冷
ＨＥＰＥＳ／シュークロース溶液で連続して洗浄する。
細胞を最後に１／２０溶液のＨＥＰＥＳ／シュークロー
ス溶液に再懸濁する。バチルス・スリンギエンシスのコ
ンピテント細胞(０.１cmのキュベットに４０μlおよび
０.２cmのキュベットに２００μl)を、前冷却電極Ｇene
Ｐulser Ｃuvette中の５−２０μlのＤＮＡ(２−１０
μg)と混合し、Ｇene Ｐulserエレクトロポレーション
装置中で電流にさらす。エレクトロポレーションのパラ
メーターは、０.１cmキュベットについて０.９kＶ、３
μＦおよびＲ＝６００、０.２cmキュベットについて１.
２５kＶ、３μＦおよびΩ＝６００である。細胞をすぐ
に４００μlまたは１.８mlのＢＨＩＳに移し、３７℃で
４時間、２５０rpmで成育させる。この期間中、ベクタ
ーｐＳＢ１２２１は、細菌染色体上の相同spoＶＢt１配
列および統合ベクター間の相同組換え(単一交差)により
染色体に挿入される。これは、統合ＤＮＡセグメントの
両端の２個のspoＶＢt１遺伝子形成をもたらす。４時間
成育後、細胞を好適な抗生物質含有ＬＢプレートに移
す。プレートを一晩３０℃でインキュベートし、形質転
換体を新鮮プレートに再画線する。コロニーをＰＣＲで
スクリーニングし、０.３kbフラグメントまで増幅する
ためにプライマーＰＧ２およびＰＧ４を使用して、erm
Ｃ遺伝子の存在を確認する。ｐＳＢ１２２１のspoＶＢt
１染色体座への統合は、プライマーＭＳ１２Ａを使用し
たｐＳＢ１２２１統合ベクターを含まないspoＶＢt１の
上流と、プライマーｐＢＲ４を使用したｐＳＢ１２２１
のｐＢＲ３２２部位との間に産生された１２６１bpのＰ
ＣＲ増幅により確認される。結果は結晶コードタンパク
質がバチルス・スリンギエンシス中染色体に含まれるこ
とを示唆する。

【０１０８】

【表７】プライマー番号配列(５'−３') 配列番号ＰＧ２ GAAATCGGCTCAGGAAAAGG ３５ＰＧ４ AGCAAACCCGTATTCCACG ３６ＰＢＲ４ GCACGATCATGCGCACCC ３７

【０１０９】ｐＳＢ１２２１の統合がもたらす変異胞子
は、野生型に戻らず、液体または固体細菌培地中に貯蔵
した場合、２週間以内に本質的に分解した。

【０１１０】実施例３：統合ＤＮＡを別のバチルス・ス
リンギエンシス宿主へ移動させるための一般形質導入統合は、供給株の統合ベクターのＤＮＡセグメントの両
端および受容株の染色体上のその相同領域の間の相同組
換え(２重交差)により起こる。統合ベクターを含む供給
株をＬＢＥry⁵プレート上、３０℃で一晩(１６−１８
時間)成育させる。一晩培養物の約１００μlを、０.４
％グリセロール含有ＬＢ１０mlへの接種に使用する。次
いで、培養物を３０℃、３００rpmで、ＯＤ₆₀₀が１−２
になるまでインキュベートする。細胞をＣＰ−５１ts４
５(Ｃurtis Ｂ. Ｔhorne博士, ＡmherstのＵnibersity
of Ｍassachusettsから得た)で感染させるために、異な
る量、１×１０⁵から５×１０⁶プラーク形成単位(ＰＦ
Ｕ)のファージ融解物を、予め５０℃で平衡化したＰhag
e Ａssay(ＰＡ)軟寒天(０.８％栄養ブロス、０.５％Ｎ
ａＣｌ、０.０２％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０.００５％Ｍ
ｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、０.０１５％ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、ｐ
Ｈ６.０、０.５％Ｂacto Ａgar)３ml中の２×１０⁷細胞
に加える。次いで、混合物をＰＡプレート(１.５％Ｂac
to Ａgar含有ＰＡ培地)に注ぎ、固まらせ、３０℃で１
６時間インキュベートする。細胞の絨毯中に数百のプラ
ークを含む寒天上部を、３−６mlのＰＡ培地中に回収す
る。ファージ融解物を１６℃、３−４時間保持し、遠心
(４,０００×ｇ、５分、１６℃)し、上清を０.４５μＭ
フィルター(ＶＷＲＳcientific)を使用して濾過滅菌す
る。ファージ融解物を長期間貯蔵のために１６℃で貯蔵
する。ファージ融解物の力価は約１×１０⁹から１×１
０¹⁰ＰＦＵ／mlである。

【０１１１】一般的形質導入のために、Ｇ２７殺虫遺伝
子、エリスロマイシンマーカー遺伝子および(ｍ)spoＶ
Ｂt１−８を、通常cryＩＡ(ｃ)、ＩＡ(ｂ)およびＩＡ
(ｃ)遺伝子を有するバチルス・クルスタキ株の非変異sp
oＶＢt１染色体座に移動する。受容株をＬＢ１０ml中で
３０℃、１６−１８時間成育させる。ＬＢ２００mlを２
−３mlの一晩培養物に接種し、３０℃、３００rpmでＯ
Ｄ₆₀₀が１まで成育させる。細胞を遠心(７,５２０×
ｇ、４℃、１５分)し、ＬＢに約２×１０⁹コロニー形成
単位(ＣＦＵ)／ml(約１００倍濃縮)の濃度で再懸濁す
る。８×１０⁸受容細胞およびファージ融解物から４.９
×１０⁸から８×１０⁸ＰＦＵを含む形質導入混合物を３
７℃、２５０rpmで３０分インキュベートする。細胞／
ファージ懸濁液をＨＡミリポア膜(Ｍillipore Ｃorpora
tion, Ｂedford, ＭＡ)に広げ、Ｅry^0.15含有ＬＢプレ
ートに置き、３７℃で３−４時間インキュベートする。
膜を次いでＥry⁵含有ＬＢプレートに置き、３７℃で１
８−２０時間インキュベートする。

【０１１２】形質導入単離物を上記のようにＰＣＲを使
用し、変形胞子表現型を顕微鏡で確認する。各単離物の
タンパク質の量をＳＤＳパージおよびトリコプルシア・
ニ(T. ni)およびスポドプテラ・エクシグア(Ｓ. exigu
a)に対する生物検定により測定する。単離物は１３５Ｋ
ダルトンの殺虫結晶タンパク質を産生する。

【０１１３】

【配列表】

（２)配列番号１の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１６６２塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：二本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ＤＮＡ(genomic) (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (ix)配列の特徴： (Ａ)特徴を表す記号：ＣＤＳ (Ｂ)存在位置：474..1427 (Ｄ)他の情報：/開始コドン＝４７４ (xi)配列の記載：配列番号1： CAGGTGAAAT GAAATCTTCG TTACGAAGTG TACGGTCTGG TTGAATAGAT ATCTCCATAT 60 TTTTCAATGG ATTAGGAATG TTTAGAAAAT GATGCATTCT ATTTAGTACA ATAAATACAC 120 GATGCATCGT TTTTTCTGAG TAATGTCGAT TCGTTTTAAA TCGGAAAAGT AATCTTCGTA 180 GTCTTTTGTA CAAAGTGTAG CCCATATATT ACTGGAAGGG AGCTTTTTGT TTTTTTCTAA 240 CCAATGTCCG AAGTCTTCAA CGTCATAAAC ATAACGTTTA ATAGTTGAGG GTTTTCGGCC 300 TTTATTCAAT AAAAAAATAG AAAAGGCTTG TATTGTATCA TGGAATTCCG TTGTCTCCAT 360 AGTCCCACCA CCTTAATTAT TTCTTATATT ATAGCAAACT TTTCTGAAAA TAGGCATTTA 420 CAAGGGGGAC AGGAATAATA ATATTTGGTG AGTGGATAAA ATGAGGTGAT TGT ATG 476 Met 1 GAA CAA TCG ATG CGA AAG AAA AAC AAC AAT CAA ATT AAT ATT GTG TTA 524 Glu Gln Ser Met Arg Lys Lys Asn Asn Asn Gln Ile Asn Ile Val Leu 5 10 15 AAC CAT CGA AAG AAA ATT TCT TTG CCA GCC GCA GAA AAT AAA ACG GTA 572 Asn His Arg Lys Lys Ile Ser Leu Pro Ala Ala Glu Asn Lys Thr Val 20 25 30 ATT TCA AAT GAA ACT GCA ATT AAA CAT GAA ATG CTG CAG AGA ATT GAA 620 Ile Ser Asn Glu Thr Ala Ile Lys His Glu Met Leu Gln Arg Ile Glu 35 40 45 GAA GAG ATG GGG AAG CTT GTT GGG ATG GAT GAT ATA AAA AAG ATA ATA 668 Glu Glu Met Gly Lys Leu Val Gly Met Asp Asp Ile Lys Lys Ile Ile 50 55 60 65 AAA GAA ATA TAT GCT TGG ATT TAT GTG AAT AAA AAA AGA CAA GAG AAG 716 Lys Glu Ile Tyr Ala Trp Ile Tyr Val Asn Lys Lys Arg Gln Glu Lys 70 75 80 GGA TTG AAG TCA GAG AAG CAA GTA CTT CAT ATG CTG TTT AAA GGG AAT 764 Gly Leu Lys Ser Glu Lys Gln Val Leu His Met Leu Phe Lys Gly Asn 85 90 95 CCA GGT ACA GGG AAG ACA ACT GTT GCT AGA ATG ATA GGG AAA TTG CTG 812 Pro Gly Thr Gly Lys Thr Thr Val Ala Arg Met Ile Gly Lys Leu Leu 100 105 110 TTT GAG ATG AAT ATT CTA TCG AAA GGC CAC TTG GTT GAA GCT GAA CGT 860 Phe Glu Met Asn Ile Leu Ser Lys Gly His Leu Val Glu Ala Glu Arg 115 120 125 GCT GAT CTT GTA GGA GAG TAC ATC GGC CAT ACA GCT CAA AAA ACA AGA 908 Ala Asp Leu Val Gly Glu Tyr Ile Gly His Thr Ala Gln Lys Thr Arg 130 135 140 145 GAC TTA ATA AAA AAA GCA ATG GGA GGT ATT TTG TTT ATT GAT GAG GCG 956 Asp Leu Ile Lys Lys Ala Met Gly Gly Ile Leu Phe Ile Asp Glu Ala l50 155 160 TAT TCT TTA GCT CGA GGA GGA GAG AAG GAC TTT GGA AAA GAA GCA ATT 1004 Tyr Ser Leu Ala Arg Gly Gly Glu Lys Asp Phe Gly Lys Glu Ala Ile 165
170 175 GAT ACG CTT GTA AAA CAT ATG GAA GAT AAA CAA CAT GGT TTT GTA TTG 1052 Asp Thr Leu Val Lys His Met Glu Asp Lys Gln His Gly Phe Val Leu 180 185 190 ATT TTA GCT GGA TAT TCA AGA GAG ATG AAT CAC TTT CTT TCA TTA AAT 1100 Ile Leu Ala Gly Tyr Ser Arg Glu Met Asn His Phe Leu Ser Leu Asn 195 200 205 CCA GGG CTG CAA TCT CGT TTT CCA TTT ATT ATT GAA TTT GCG GAT TAC 1148 Pro Gly Leu Gln Ser Arg Phe Pro Phe Ile Ile Glu Phe Ala Asp Tyr 210 215 220 225 TCG GTA AAT CAG TTG TTG GAA ATT GGG AAA AGA ATG TAT GAA GAT CGT 1196 Ser Val Asn Gln Leu Leu Glu Ile Gly Lys Arg Met Tyr Glu Asp Arg 230 235 240 GAA TAT CAG TTA TCG AAA GAG GCT GAA TGG AAA TTT AGG GAT CAT TTA 1244 Glu Tyr Gln Leu Ser Lys Glu Ala Glu Trp Lys Phe Arg Asp His Leu 245 250 255 CAT GCT GTA AAG TAT TCG TCG CAA ATT ACA TCG TTT AGT AAT GGG CGG 1292 His Ala Val Lys Tyr Ser Ser Gln Ile Thr Ser Phe Ser Asn Gly Arg 260 265 270 TAT GTA CGG AAT ATT GTT GAA AAA TCA ATT CGT ACA CAG GCG ATG CGG 1340 Tyr Val Arg Asn Ile Val Glu Lys Ser Ile Arg Thr Gln Ala Met Arg 275 280 285 TTG TTG CAA GAA GAT GCC TAT GAT AAA AAT GAT TTA ATT GGA ATA TCG 1388 Leu Leu Gln Glu Asp Ala Tyr Asp Lys Asn Asp Leu Ile Gly Ile Ser 290 295 300 305 AGT ATG GAT TTG ATG CTC GAA GAG GAG ACG CAC AGT ACA TAAACTGTGC 1437 Ser Met Asp Leu Met Leu Glu Glu Glu Thr His Ser Thr 310 315 GTCGATTTTT GTGTATAAGT TCGTTTACTC TTTTTTTTCT TTTTCTTGGT GTACTTCATG 1497 GAAGTGTTCC ATTTTAGCGC TCTTTTCGTG TGCTGAATTA GGATCGTGTC CAAATTGATT 1557 TACTGAGCTT TTTTGAGCTC CTTTATTAAC GTGGTTTGTC ATTTGTATTC ACCTCACTTT 1617 AAAAATTAGT ATAAACATTA TATAAAGAAA AAATCGTTAG AAAGA 1662 (２)配列番号２の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：３１８アミノ酸 (Ｂ)配列の型：アミノ酸 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号２： Met Glu Gln Ser Met Arg Lys Lys Asn Asn Asn Gln Ile Asn Ile Val 1 5 10 15 Leu Asn His Arg Lys Lys Ile Ser Leu Pro Ala Ala Glu Asn Lys Thr 20 25 30 Val Ile Ser Asn Glu Thr Ala Ile Lys His Glu Met Leu Gln Arg Ile 35 40 45 Glu Glu Glu Met Gly Lys Leu Val Gly Met Asp Asp Ile Lys Lys Ile 50 55 60 Ile Lys Glu Ile Tyr Ala Trp Ile Tyr Val Asn Lys Lys Arg Gln Glu 65 70 75 80 Lys Gly Leu Lys Ser Glu Lys Gln Val Leu His Met Leu Phe Lys Gly 85 90 95 Asn Pro Gly Thr Gly Lys Thr Thr Val Ala Arg Met Ile Gly Lys Leu 100 105 110 Leu Phe Glu Met Asn Ile Leu Ser Lys Gly His Leu Val Glu Ala Glu 115 120 125 Arg Ala Asp Leu Val Gly Glu Tyr Ile Gly His Thr Ala Gln Lys Thr 130 135 140 Arg Asp Leu Ile Lys Lys Ala Met Gly Gly Ile Leu Phe Ile Asp Glu 145 150 155 160 Ala Tyr Ser Leu Ala Arg Gly Gly Glu Lys Asp Phe Gly Lys Glu Ala 165 170 175 Ile Asp Thr Leu Val Lys His Met Glu Asp Lys Gln His Gly Phe Val 180 185 190 Leu Ile Leu Ala Gly Tyr Ser Arg Glu Met Asn His Phe Leu Ser Leu 195 200 205 Asn Pro Gly Leu Gln Ser Arg Phe Pro Phe Ile Ile Glu Phe Ala Asp 210 215 220 Tyr Ser Val Asn Gln Leu Leu Glu Ile Gly Lys Arg Met Tyr Glu Asp 225 230 235 240 Arg Glu Tyr Gln Leu Ser Lys Glu Ala Glu Trp Lys Phe Arg Asp His 245 250 255 Leu His Ala Val Lys Tyr Ser Ser Gln Ile Thr Ser Phe Ser Asn Gly 260 265 270 Arg Tyr Val Arg Asn Ile Val Glu Lys Ser Ile Arg Thr Gln Ala Met 275 280 285 Arg Leu Leu Gln Glu Asp Ala Tyr Asp Lys Asn Asp Leu Ile Gly Ile 290 295 300 Ser Ser Met Asp Leu Met Leu Glu Glu Glu Thr His Ser Thr 305 310 315 (２)配列番号３の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：３０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号３： GGCTTTCGCT ACCTGGAGAG ACGCGCCCGC 30 (２)配列番号４の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：３０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号４： CCAGACCAAC TGGTAATGGT AGCGACCGGC 30 (２)配列番号５の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１９塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号５： GAGAGATGTC ACCGTCAAG 19 (２)配列番号６の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号６： CCCTGTACCT GGATTCCC 18 (２)配列番号７の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号７： GGGAATCCAG GTACAGGG 18 (２)配列番号８の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１９塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号８： CCATCCCAAC AAGCTTCCC 19 （２)配列番号９の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１９塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号９： GGGAAGCTTG TTGGGATGG 19 (２)配列番号１０の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号１０： CCTGTCCCCC TTGTAAATGC 20 (２)配列番号１１の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号１１： GCATTTACAA GGGGGACAGG 20 (２)配列番号１２の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２１塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号１２： CGCCGTCTAC TTACAAGCAG C 21 (２)配列番号１３の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号１３： GGTGGTGGGA CTATGGAG 18 (２)配列番号１４の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号１４： CTCCATAGTC CCACCACC 18 (２)配列番号１５の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号１５： CGAGGAGGAG AGAAGGAC 18 (２)配列番号１６の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１７塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号１６： GTCCTTCTCT CCTCCTC 17 (２)配列番号１７の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１２塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号１７： CACGATGCAT CG 12 (２)配列番号１８の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１２塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号１８： CACGATGCAT CG 12 (２)配列番号１９の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１７塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号１９： CGAAAGAGGC TGAATGG 17 (２)配列番号２０の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１５塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号２０： GGGCGGTATG TACGG 15 (２)配列番号２１の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１５塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号２１： CCGTACATAC CGCCC 15 (２)配列番号２２の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２５塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号２２： GCATCAAATC CATACTCGAT ATTCC 25 (２)配列番号２３の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２１塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号２３： CGAGTATGGA TTTGATGCTC G 21 (２)配列番号２４の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号２４： GGACACGATC CTAATTCAGC 20 (２)配列番号２５の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号２５： GCTGAATTAG GATCGTGTCC 20 (２)配列番号２６の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：３８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号２６： GATGTGATTG TAAGGAACAA TCGAAGCGAT AGAAAAAC 38 (２)配列番号２７の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：３２塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号２７： GATCTTGTAT GAGAGTAAAT CGGCCATACA GC 32 (２)配列番号２８の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：３２塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号２８： GCTGTATGGC CGATTTACTC TCATACAAGC TC 32 (２)配列番号２９の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２３塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号２９： CTATACAGCA TGTTAATGAT CCC 23 (２)配列番号３０の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：３８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号３０： AGCTTGCGGC CGCGTCGACC CCGGGCCATG GGGGCCCG 38 (２)配列番号３１の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：３８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号３１： AATTCGGGCC CCCATGGCCC GGGGTCGACG CGGCCGCA 38 (２)配列番号３２の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状： (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号３２： GCGAAAGAAA AACAACAATC 20 (２)配列番号３３の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号３３： GGAACGCTAC ATACTAGTGA TAGAGTAG 28 (２)配列番号３４の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号３４： GCTTGTACAC CGCAACTGTT TTCGCATG 28 (２)配列番号３５の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：２０塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号３５： GAAATCGGCT CAGGAAAAGG 20 (２)配列番号３６の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１９塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号３６： AGCAAACCCG TATTCCACG 19 (２)配列番号３７の情報： (ｉ)配列の特徴： (Ａ)配列の長さ：１８塩基対 (Ｂ)配列の型：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (iii)ハイポセティカル：ＮＯ (iv)アンチセンス：ＮＯ (xi)配列の記載：配列番号３７： GCACGATCAT GCGCACCC 18

【図面の簡単な説明】

【図１】配列番号１に記載し、配列番号２に対応す
る、単離spoＶＢt１遺伝子の予測アミノ酸配列。

【図２】Ｔn９１７で中断されたspoＶＢt１遺伝子およ
び配列決定に使用したオリゴヌクレオチドの位置。

【図３】プラスミドｐＳＢ９０１、ｐＢＲ３２２およ
びｐＳＢ１４０。

【図４】プラスミドｐＳＢ２１０。

【図５】プラスミドｐＳＢ１２０７。

【図６】プラスミドｐＳＢ１２０９。

【図７】プラスミドｐＳＢ１２１８。

【図８】プラスミドｐＳＢ１２１９。

【図９】プラスミドｐＳＢ１２２０。

【図１０】プラスミドｐＳＢ１３９。

【図１１】プラスミドｐＳＢ２１０.１。

【図１２】プラスミドｐＳＢ３２。

【図１３】プラスミドｐＳＢ２１９。

【図１４】プラスミドｐＳＢ５４８。

【図１５】プラスミドｐＳＢ１２２１。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者ミトラ・シャハビ・レイノソアメリカ合衆国95132カリフォルニア州サンノゼ、オンスロー・ウェイ3384番 (72)発明者山本敬司アメリカ合衆国94539カリフォルニア州フレモント、ニドゥ・コート・42959番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配
列を有するspoＶＢt１遺伝子； ii）配列番号２に記載のバチルス・スリンギエンシス(B
acillus thuringiensis)胞子形成タンパク質をコードす
るヌクレオチド配列； iii）配列番号２に記載のタンパク質と実質的に類似の
バチルス・スリンギエンシス胞子形成タンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列； iv）配列ｉ）、ii）またはiii）の相補鎖と、ストリン
ジェントなハイブリダイズ条件でハイブリダイズするヌ
クレオチド配列；およびｖ）上記配列ｉ）、ii）、iii）またはiv）の切除(trun
cated)ヌクレオチド配列(ここで、切除ヌクレオチドは
少なくとも３００ヌクレオチドを含む)：からなる群か
ら選択される、単離spoＶＤＮＡ配列。
【請求項２】請求項１記載のspoＶＤＮＡ遺伝子およ
び少なくとも１個の殺虫性結晶タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメント。
【請求項３】更にグラム陰性細菌の複製起点および選
択可能マーカーを含む、請求項２記載のＤＮＡセグメン
ト。
【請求項４】ＤＮＡ配列がハイブリッド毒素タンパク
質をコードし、ハイブリッドタンパク質が２個または３
個の異なる結晶コード毒素の領域を含むものである、請
求項２記載のＤＮＡセグメント。
【請求項５】ａ）請求項２記載のＤＮＡセグメントを
得る；ｂ）上記セグメントをバチルス・スリンギエンシス宿主
に挿入する；ｃ）バチルス・スリンギエンシス宿主中において、この
ＤＮＡセグメントと胞子形成遺伝子の実質的に相同なヌ
クレオチドフラグメントの間で相同組換えを行う(ここ
で、ＤＮＡセグメントは安定にバチルス・スリンギエン
シス宿主染色体に統合される)；およびｄ）安定に形質転換されたバチルス・スリンギエンシス
宿主を単離する(ここで、安定に形質転換されたバチル
ス・スリンギエンシス宿主は外来性結晶タンパク質を製
造可能である)：を含む、１個から３個の外来性結晶タ
ンパク質を発現する形質転換バチルス・スリンギエンシ
ス宿主の製造法。
【請求項６】請求項５で製造したバチルス・スリンギ
エンシス宿主を殺虫有効量含む、殺虫組成物。
【請求項７】ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配
列； ii）配列番号２に記載のバチルス・スリンギエンシスタ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列； iii）配列番号２に記載のタンパク質と実質的に類似の
バチルス・スリンギエンシス胞子形成タンパク質をコー
ドするヌクレオチド配列； iv）配列ｉ）、ii）またはiii）の相補鎖と、ストリン
ジェントなハイブリダイズ条件でハイブリダイズするヌ
クレオチド配列；およびｖ）上記配列ｉ）、ii）、iii）またはiv）の切除ヌク
レオチド配列であり、切除ヌクレオチドは少なくとも３
００ヌクレオチドを含む(ここで、上記ヌクレオチド配
列ｉ）、ii）、iii）、iv）またはｖ）は、１個または
それ以上の点変異、挿入または欠失を有する)。からな
る群から選択される、単離変異spoＶＤＮＡ配列。
【請求項８】請求項７記載の変異spoＶＤＮＡ配列お
よび１個から３個の殺虫性結晶タンパク質コード遺伝子
を含む、ＤＮＡセグメント。
【請求項９】請求項７記載の変異spoＶＤＮＡ配列、
殺虫性結晶タンパク質コード遺伝子およびグラム陰性細
菌の複製起点を含む、ＤＮＡセグメント。
【請求項１０】ａ）請求項９記載のＤＮＡセグメント
を得る；ｂ）上記セグメントを胞子形成バチルス・スリンギエン
シス宿主に挿入する；ｃ）宿主バチルス・スリンギエンシス染色体中におい
て、このＤＮＡセグメントと実質的に相同な胞子形成遺
伝子フラグメントの間で相同組換えを行う(ここで、変
異spoＶＤＮＡ配列を有するＤＮＡセグメントは安定に
バチルス・スリンギエンシス宿主染色体に統合され
る)；およびｄ）安定に形質転換されたバチルス・スリンギエンシス
形質転換体を単離する(ここで、安定に形質転換された
バチルス・スリンギエンシス宿主は変異胞子を産生し、
外来性結晶毒素タンパク質を製造可能である)：ことを
含む、変異胞子を有する殺虫性結晶タンパク質産生バチ
ルス・スリンギエンシス株の製造法。
【請求項１１】請求項１０で製造したバチルス・スリ
ンギエンシス株を殺虫有効量含む、殺虫組成物。
【請求項１２】ａ）バチルス・スリンギエンシス宿主
を形質導入ファージにさらす；ｂ）ファージを宿主バチルス・スリンギエンシス中で複
製させる(ここで、宿主染色体中に統合された１個から
３個の外来性結晶タンパク質コードＤＮＡ配列をファー
ジに挿入する)；およびｃ）外来性結晶タンパク質コードＤＮＡ配列をファージ
から受容体バチルス・スリンギエンシスに移す(ここ
で、挿入外来性結晶プロキシン(proxin)コードＤＮＡ配
列は、受容体バチルス・スリンギエンシス染色体に安定
に挿入され、受容体中で発現される)：ことを含む、更
に形質転換バチルス・スリンギエンシス宿主に形質導入
することを含む、請求項５記載の方法。
【請求項１３】ａ）バチルス・スリンギエンシス宿主
を形質導入ファージにさらす；ｂ）ファージを宿主バチルス・スリンギエンシス中で増
殖させる(ここで、変異spoＶＤＮＡ配列および宿主染
色体中に統合された１個から３個の外来性結晶タンパク
質コードＤＮＡ配列をファージに挿入する)；およびｃ）外来性結晶毒素コードＤＮＡ配列をファージから受
容体バチルス・スリンギエンシスに移す(ここで、変異s
poＶＤＮＡ配列および外来性結晶タンパク質コードＤ
ＮＡ配列は、受容体バチルス・スリンギエンシス染色体
に安定に挿入され、受容体中で発現され、受容体は変異
胞子を産生する)：ことを含む、更にバチルス・スリン
ギエンシス宿主に形質導入することを含む、請求項７記
載の方法。
【請求項１４】セグメントが１個から３個の殺虫性結
晶タンパク質コード遺伝子を含み、遺伝子が安定にバチ
ルス・スリンギエンシス染色体に統合されている、ＤＮ
Ａセグメントの染色体統合座としてバチルス・スリンギ
エンシス染色体胞子形成遺伝子フラグメントを使用する
方法。