MX2014014960A - Metodos para mejorar el rendimiento de plantas de cultivos resistentes a 2,4-d. - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a métodos para mejorar la altura de las plantas y/o el rendimiento de las plantas de cultivo que son resistentes al herbicida 2,4-D mediante el tratamiento de las plantas con 2,4-D con coeficientes de aplicación que no son perjudiciales para las plantas. En particular, se proporciona un método en el que se usa la aplicación de 2,4-D para aumentar el rendimiento de las plantas de cultivo, que expresan el gen AAD-12 para la resistencia al 2,4-D. El método provisto es de particular interés para el tratamiento de plantas de cultivo inclusive maíz, soja, colza de semilla oleaginosa de primavera y de invierno (canola), remolacha azucarera, trigo, girasol, cebada y arroz.

Description

MÉTODOS PARA MEJORAR EL RENDIMENTO DE PLANTAS DE CULTIVOS RESISTENTES A 2,4-D Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional Estadounidense No. 61 /656,546, presentada el 7 de junio de 2012, cuya descripción se incorpora expresamente en la presente a título de referencia, en su totalidad.

Incorporación a Título de Referencia, de Material Presentado Electrónicamente En la presente se incorpora a título de referencia un listado de secuencias legible por computadora, presentado simultáneamente con la presente y que se identifica de la siguiente manera: un archivo de 1 1 ,342 bytes ASCI I (texto) denominado “72747_ST25.txt”, creado el 13 de mayo de 2013. Antecedentes de la Invención Las malezas pueden desproporcionar con rapidez al suelo de los nutrientes valiosos necesarios para los cultivos y otras plantas deseables. Existen muchos tipos diferentes de herbicidas usados actualmente para el control de las malezas. Un herbicida extremadamente popular es el glifosato.

Se han desarrollado cultivos como maíz, soja, cañóla, algodón, remolacha azucarera, trigo, cesped y arroz que son resistentes al glifosato. Por lo tanto, los campos con maíz resistente al glifosato de cultivo activo, por ejemplo, pueden ser rociados para controlar las malezas sin dañar de manera significativa las plantas de maíz.

Con la introducción de cultivos tolerantes al glifosato (GTCs, por sus siglas en ingles) genéticamente diseñados a mediados del siglo pasado, los agricultores recibieron una herramienta simple, conveniente, flexible y económica para controlar un amplio espectro de malezas de hoja ancha e hierbas que no tenía paralelo en la agricultura. En consecuencia, los productores adoptaron rápidamente los GTCs y, en muchos casos, abandonaron muchas de las prácticas agrónomas mejores aceptadas, como rotación de cultivo, rotación del modo de acción del herbicida, mezcla en tanque, incorporación de control mecánico con control químico y control de malezas en cultivos. En la actualidad, la soja, algodón , maíz, y cañóla tolerantes a glifosato se encuentran disponibles a nivel comercial en los Estados Unidos de América y en otras partes del hemisferio occidental. Cada vez más GTCs (por ejemplo, trigo, arroz, remolacha azucarera, césped, etcétera) están en suspenso en cuanto a su introducción, esperando la aceptación del mercado mundial. Muchas otras especies resistentes al glifosato se encuentran en etapa experimental de desarrollo (por ejemplo, alfalfa, caña de azúcar, girasol, remolacha, arvejas, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, frutilla, tomate y tabaco; especies forestales como álamo y liquidámbar; y especies hortícolas, como caléndula, petunia y begonia; ver el sitio web “isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1 .cfm, 2005”). Asimismo, el costo del glifosato ha caído drásticamente en los años recientes hasta el punto de que muy pocos programas convencionales de control de malezas pueden competir efectivamente con el precio y el rendimiento de los sistemas de glifosato en GTC.

El glifosato ha sido usado exitosamente en incineración y otras áreas sin cultivos para el control total de la vegetación durante más de 15 años. En muchos casos, como sucede con los GTCs, el glifosato ha sido usado 1 - 3 veces por año durante 3, 5, 10, hasta 15 años en fila. Estas circunstancias han conducido a un exceso de confianza en el glifosato y la teenología de GTC y han impuesto una presión de selección pesadas sobre las especies de malezas nativas para las plantas que son naturalmente más tolerantes al glifosato o que han desarrollado un mecanismo para resistir la actividad herbicida del glifosato.

El uso extensivo de programas de control de malezas solamente con glifosato está generando la selección de malezas resistentes a glifosato, y está seleccionando la propagación de especies de malezas que son inherentemente más tolerantes al glifosato que la mayoría de las especies objetivo (es decir, cambios en las malezas). (Ng et al. , 2003; Simarmata et al. , 2003; Lorraine-Colwill et al. , 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al. , 2003; Heap, 2005; Murphy et al. , 2002; Martin et al. , 2002). Si bien el glifosato ha sido ampliamente usado en el mundo durante más de 15 años, se ha informado que solamente un grupo de malezas han desarrollado resistencia al glifosato (Heap, 2005); no obstante, la mayoría de ellas han sido identificadas en los últimos 3 a 5 años. Las malezas resistentes incluyen tanto especies de hierbas como de hoja ancha-Lo/Zurn rigidum, Lolium multiflorum, Eleusine indica, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis, y Plantago lanceolata. Asimismo, las malezas que previamente no habían sido un problema agrónomo antes del uso amplio de GTCs ahora están siendo más prevalecientes y difíciles de controlar en el contexto de los GTCs, que comprenden >80% de los acres de algodón y soja en los Estados Unidos de America y >20% de los acres de maíz en los Estados Unidos de América (Gianessi, 2005). Estos cambios en las malezas están ocurriendo predominantemente con (más no exclusivamente) malezas de hoja ancha difíciles de controlar. Algunos ejemplos incluyen las especies Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum y Commelina.

En las áreas donde los agricultores se enfrentan con malezas resistentes al glifosato o un cambio en las especies de malezas más difíciles de controlar, los agricultores pueden compensar la debilidad del glifosato al mezclar en tanque o alternar con otros herbicidas que controlaran las malezas inadvertidas. Un herbicida popular y eficaz que puede adicionarse en la mezcla en tanque a fin de controlar las malezas de hoja ancha en muchos casos ha sido el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). El 2,4-D ha sido usado en la agronomía y en situaciones que no implican cultivos para el control de malezas de hoja ancha de amplio espectro durante más de 60 años. Se han informado casos individuales de especies más tolerantes, pero el 2 ,4-D sigue siendo uno de los herbicidas más ampliamente usados a nivel mundial. Una limitación al uso mayor de 2,4-D es que su selectividad en cultivos de dicotiledóneas como la soja o el algodón es muy deficiente y, por lo tanto, el 2,4-D no se usa típicamente (y, generalmente, tampoco cerca) de cultivos de dicotiledóneas sensibles. Asimismo, el uso de 2,4-D en los cultivos de hierbas es un tanto limitado por la naturaleza de la lesión al cultivo que puede ocurrir. El 2,4-D en combinación con glifosato ha sido usado para brindar un tratamiento de incineración más sólido antes de plantar soja y algodón sin labranza; no obstante, debido a la sensibilidad de estas especies dicotiledóneas a 2,4-D, estos tratamientos de incineración deben ocurrir al menos 14 - 30 días antes de la plantación (Agriliance, 2003).

El 2,4-D se encuentra en la clase de herbicidas de ácido fenoxi, como MCPA. El 2,4-D ha sido usado en muchos cultivos de monocotiledóneas (como maíz, trigo y arroz) para el control selectivo de malezas de hoja ancha sin dañar de manera severa las plantas de cultivo deseadas. El 2,4-D es un derivado de auxina sintetica que actúa para desregular la homeostasis célula-hormona normal e impedir el crecimiento controlado y equilibrado; no obstante, el modo exacto de acción todavía se desconoce.

Triclopir y fluroxipir son herbicidas de ácido piridiloxiacético cuyo modo de acción también es una auxina sintética.

Estos herbicidas tienen diferentes niveles de selectividad sobre ciertas plantas (por ejemplo, las dicotiledóneas son más sensibles que las hierbas). El metabolismo diferencial exhibido por diferentes plantas es una explicación de los diversos niveles de selectividad. En general, las plantas metabolizan el 2,4-D lentamente, por lo que la respuesta diversa de la planta al 2,4-D puede ser más posiblemente explicado por la actividad diferente en el sitio o los sitios objetivo (WSSA, 2002). El metabolismo de la planta del 2,4-D típicamente ocurre por medio de un mecanismo de dos fases, típicamente hidroxilación seguida de conjugación con aminoácidos o glucosa (WSSA, 2002).

Con el tiempo, las poblaciones microbianas han desarrollado una vía alternativa y eficiente para la degradación de esta Xenobiotica particular, que genera la completa mineralización de 2,4-D. Las aplicaciones sucesivas del herbicida seleccionan los microbios que pueden usar el herbicida como fuente de carbono para el crecimiento, dándoles una ventaja competitiva en el suelo. Por esta razón, el 2,4-D actualmente formulado tiene una media vida en el suelo relativamente corta, y no se encuentran efectos remanentes significativos en los posteriores cultivos. Esto suma a la utilidad herbicida del 2,4-D.

Un organismo que ha sido extensamente investigado por su habilidad para degradar el 2,4-D es Ralstonia eutropha (Streber et al. , 1987). El gen que codifica la primera etapa enzimática en la vía de la mineralización es tfdA. Ver la Patente Estadounidense No. 6, 153,401 y Acceso GENBANK No. M 16730. TfdA cataliza la conversión del ácido 2,4-D a diclorofenol (DCP, por sus siglas en ingles) por medio de una reacción de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal et al. , 2001 ). El DCP tiene poca actividad herbicida en comparación con el 2,4-D. TfdA ha sido usado en plantas transgénicas para impartir resistencia a 2,4-D en plantas dicotiledóneas (por ejemplo, algodón y tabaco) normalmente sensibles a 2,4-D (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993), y Patente Estadounidense No. 5,608, 147).

Un gran número de genes del tipo toda que codifican proteínas capaces de degradar 2,4-D han sido identificados del medio ambiente y depositados en una base de datos de Genbank. Muchos homólogos son similares a tfdA (>85% de identidad de aminoácidos) y tienen propiedades enzimáticas similares a tfdA. No obstante, existen numerosos homólogos que tienen una identidad significativamente menor a tfdA (25 - 50%), pero que todavía tienen los residuos característicos asociados con a-cetoglutarato dioxigenasa Fe+2 dioxigenasas. Por lo tanto, no es obvio cuáles son las especificidades de sustrato de estas dioxigenasas divergentes.

Un único ejemplo con baja homología a tfdA (31 % de identidad de aminoácidos) es s dpA de Delftla acidovorans (Kohler et al. , 1999, Westendorf et al. , 2002, Westendorf et al., 2003).

Esta enzima ha demostrado catalizar la primera etapa en (S)-la mineralización de diclorprop (y otros ácido (S)-fenoxipropiónicos) así como tambien 2,4-D (un ácido fenoxiacético) (Westendorf et al. , 2003). La transformación de este gen en plantas, hasta ahora, no ha sido informada.

El desarrollo de nuevas teenolog ías de cultivos tolerantes a herbicidas (HTC, por sus siglas en inglés) ha tenido un éxito limitado debido, en gran medida, a la eficacia, bajo costo y conveniencia de los GTCs. En consecuencia, se ha producido un índice de adopción de los GTCs muy alto entre los productores. Esto creó un incentivo muy bajo para desarrollar nuevas tecnologías de HTC.

Las subestructuras químicas del ariloxialcanoato son una entidad común de muchos herbicidas comercializados, que incluyen los herbicidas de tipo auxina fenoxiacetato (como 2,4-D y diclorprop), auxina piridiloxiacetato (como fluroxipir y triclopir), ariloxifenoxipropionatos (AOPP), inhibidores de acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa) (como haloxifop, quizalofop y diclofop), e inhibidores de protoporfirinógeno IX oxidasa fenoxiacetato 5-sustituidos (como piraflufen y flumiclorac). No obstante, estas clases de herbicidas son, todos, bastante distintos, y no existe evidencia en la literatura actual de vías de degradación comunes entre estas clases químicas. Una enzima multifuncional para la degradación de herbicidas que cubren múltiples modos de acción ha sido descrita recientemente (PCT US/2005/014737; presentada el 2 de mayo de 2005.

Breve Descripción de la Invención Esta invención se refiere a metodos para mejorar la altura de la planta y/o el rendimiento de las plantas de cultivo que son resistentes al herbicida 2,4-D al tratar las plantas con 2,4-D a tasas de aplicación que no son perjudiciales para las plantas. En particular, se proporciona un método que usa la aplicación de 2,4-D para incrementar el rendimiento de las plantas de cultivo que expresan el gen de AAD-12 para la resistencia a 2,4-D. Esta invención también se refiere al uso de 2,4-D para mejorar el rendimiento de las plantas de cultivo que son resistentes a 2,4-D. El método provisto es de particular interés para el tratamiento de plantas de cultivo que incluyen maíz, soja, colza de tipo invierno y de tipo primavera (cañóla), remolacha azucarera, trigo, girasol, cebada y arroz.

En algunas modalidades, las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son plantas de cultivo transgénicas transformadas con una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD por sus siglas en inglés). En otra modalidad, la ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD) es AAD-1 o AAD-12. La AAD-1 ha sido previamente descrita en el documento US 2009/0093366 y la AAD-12 ha sido previamente descrita en el documento WO 2007/053482, cuyos contenidos se incorporan por referencia en su totalidad .

El efecto mejorador del rendimiento del tratamiento de 2,4-D puede observarse a tasas de aplicación de 25 g ae/ha a 5000 g/ha, o de 100 g ae/ha a 2500 g ae/ha, o en particular, de 1000 g ae/ha a 2000 g ae/ha. En una modalidad, se usa de 1000 g ae/ha a 1500 g ae/ha de 2,4-D. En otra modalidad, se usa de 2000 g ae/ha a 2500 g ae/ha. Además, el efecto mejorador del 5 rendimiento del tratamiento de 2,4-D es particularmente pronunciado cuando se aplica 2,4-D en la etapa de hoja 2 a 8 de las plantas de cultivo antes del florecimiento. No obstante, la tasa de aplicación y/o la etapa de hoja de la planta de cultivo necesario varían como función de las plantas, su altura y las ío condiciones climáticas.

El termino “incremento en el rendimiento” se refiere al rendimiento de la planta de hasta 50% o más. En una modalidad, el incremento en el rendimiento es al menos 10%. En otra modalidad, el incremento en el rendimiento es al menos 20%. En 15 otra modalidad, el incremento en el rendimiento es de 10 a 60%.

En otra modalidad, el incremento en el rendimiento es de 20 a 50%. En otra modalidad, el incremento en el rendimiento es significativo a nivel estadístico. La actividad potenciadora del crecimiento del 2,4-D para las plantas de cultivo resistentes a 20 2,4-D se puede medir en ensayos en campo o ensayos en macetas. Por lo general, los herbicidas que tienen diferente modo de acción son conocidos por tener un efecto adverso sobre el rendimiento o por no tener efecto sobre el rendimiento.

En un aspecto, se proporciona un método para mejorar el 25 rendimiento de plantas de cultivo resistentes a 2,4-D, que comprende tratar las plantas con una cantidad estimulante de un herbicida que comprende una fracción de ariloxialcanoato.

En una modalidad, las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son plantas transgenicas transformadas con una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD). En otra modalidad , la ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD) es AAD-1 o AAD-12. En otra modalidad, el herbicida que comprende una fracción de ariloxialcanoato es un herbicida fenoxi o herbicida fenoxiacético. En otra modalidad, el herbicida que comprende una fracción de ariloxialcanoato es 2,4-D. En otra modalidad, el 2,4-D comprende 2,4-D colina o 2,4-D dimetilamina (DMA por sus siglas en inglés).

En una modalidad, las plantas transgénicas transformadas con una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD) se seleccionan entre algodón, soja y cañóla. En otra modalidad, el tratamiento se realiza al menos una vez a una tasa de aplicación de 2,4-D como se usa también para el control de malezas. En otra modalidad, el tratamiento se realiza dos veces a una tasa de aplicación de 2,4-D como se usa también para el control de malezas. En otra modalidad, el 2,4-D se aplica a las etapas de crecimiento V3 y R2 de la soja con tolerancia a 2,4-D. En otra modalidad, el tratamiento se realiza al menos tres veces a una tasa de aplicación de 2,4-D como se usa también para el control de malezas. En otra modalidad, el herbicida que comprende una fracción de ariloxialcanoato alcanza las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D mediante absorción de raíces.

En otra modalidad, las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D tambien son tratadas con un herbicida diferente de 2,4-D para el control de malezas. En otra modalidad, el herbicida diferente de 2.4-D es un fosfo-herbicida o herbicida ariloxifenoxipropiónico. En otra modalidad, el fosfo-herbicida comprende glifosato, glufosinato, sus derivados, o combinaciones de los mismos. En otra modalidad, el fosfo-herbicida está en forma de sal de amonio, sal de isopropilamonio, sal de isopropilamina, o sal de potasio. En otra modalidad , el fosfo-herbicida alcanza las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D mediante absorción de raíces. En otra modalidad, el herbicida ariloxifenoxipropiónico comprende clorazifop, fenoxaprop, fluazifop, haloxifop, quizalofop, sus derivados, o combinaciones de los mismos. En otra modalidad, el herbicida ariloxifenoxipropiónico alcanza las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D mediante absorción de raíces.

En una modalidad, las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son tratadas al menos una vez con 25 g ae/ha a 5000 g ae/ha de 2.4-D. En otra modalidad, las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son tratadas al menos una vez con 100 g ae/ha a 2000 g ae/ha de 2,4-D. En otra modalidad, las plantas de cultivo resistentes a 2.4-D son tratadas al menos una vez con 100 g ae/ha a 2500 g ae/ha de 2,4-D. En otra modalidad , las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son tratadas al menos una vez con 1000 g ae/ha a 2000 g ae/ha de 2,4-D. En otra modalidad , el 2,4-D comprende 2,4-D colina o 2,4-D dimetilamina (DMA).

En una modalidad, se proporciona un metodo para mejorar el rendimiento de las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D. El método comprende: (a) transformar las células de la planta con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD); (b) seleccionar las células transformadas; (c) regenerar las plantas a partir de las células transformadas; y (d) tratar las plantas con una cantidad estimulante de un herbicida que comprende una fracción de ariloxialcanoato.

En una modalidad, la ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD) es AAD-1 o AAD-12. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende un marcador seleccionable que no es una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD). En otra modalidad o modalidad alternativa, el marcador seleccionable es el gen de fosfinotricina acetiltransferasa (pat) o gen de resistencia a bialafos (bar). En otra modalidad , la molécula de ácido nucleico es optimizada en la planta.

En otro aspecto, se proporciona el uso de un herbicida que comprende una fracción de ariloxialcanoato en la fabricación de plantas transgénicas con resistencia a 2,4-D con rendimiento incrementado en comparación con sus plantas párenteles no transgénicas. En una modalidad, el herbicida que comprende una fracción de ariloxialcanoato es 2,4-D. En otra modalidad, el 2,4-D se aplica al menos una vez con 25 g ae/ha a 5000 g/ha de 2,4-D. En otra modalidad, el 2,4-D se aplica al menos una vez con 100 g ae/ha a 2000 g ae/ha de 2,4-D. En otra modalidad, el 2,4-D se aplica al menos una vez con 100 g ae/ha a 2500 g ae/ha de 2,4-D. En otra modalidad , el 2,4-D se aplica al menos una vez con 1000 g ae/ha a 2000 g ae/ha de 2,4-D. En otra modalidad, el 2,4-D comprende 2,4-D colina o 2,4-D dimetilamina (DMA). En otra modalidad, las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son tratadas con 2,4-D al menos dos veces antes del florecimiento. En otra modalidad, las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son plantas transgenicas transformadas con una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD). En otra modalidad, la ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD) es AAD-1 o AAD-12.

Breve Descripción de las Figuras v Secuencias Figura 1 ilustra la reacción química general que es catalizada por las enzimas AAD-12 de la presente invención.

Figura 2 muestra un mapa representativo para el plásmido pDAB4468.

Figura 3 muestra un mapa representativo para el plásmido pDAS1 740.

SEC ID No. : 1 es la secuencia nucleotídica de AAD-12 de Delftia acidovorans.

SEC ID No. : 2 es la secuencia proteica traducida codificada por SEC I D No. : 1 .

SEC I D No. : 3 es la secuencia nucleotídica optimizada en la planta de AAD-12 (v1).

SEC ID No.: 4 es la secuencia proteica traducida codificada por SEC ID No.: 3.

SEC ID No.: 5 es la secuencia nucleotídica optimizada en E. coli de AAD-12 (v2).

SEC ID No.: 6 es la secuencia del cebador directo de M13.

SEC ID No.: 7 es la secuencia del cebador reverso de M13.

SEC ID No.: 8 es la secuencia del cebador directo PTU de AAD-12 (v1 ).

SEC ID No.: 9 es la secuencia del cebador reverso PTU de AAD-12 (v1 ).

SEC ID No.: 10 es la secuencia del cebador directo de PCR codificador para AAD-12 (v1).

SEC ID No.: 11 es la secuencia del cebador reverso de PCR codificador para AAD-12 (v1).

SEC ID No.: 12 muestra la secuencia del cebador de AAD-12 (v1 ) “sdpacodF”.

SEC ID No.: 13 muestra la secuencia del cebador de AAD-12 (v1 ) “sdpacodR”.

SEC ID No.: 14 muestra la secuencia del cebador “Nco1 de Brady”.

SEC ID No.: 15 muestra la secuencia del cebador “Sac1 de Brady”.

Descripción Detallada de la Invención Como se usa en la presente, la expresión “transformado/a” o “transformación” se refiere a la introducción de ADN en una celula. Las frases “transformante” o “transgénica/o” se refiere a las células de la planta, plantas, y similares, que han sido transformadas o se han sometido a un procedimiento de transformación. El ADN introducido usualmente está en la forma de un vector que contiene una pieza insertada de ADN.

Como se usa en la presente, la frase “marcador seleccionare” o “gen marcador seleccionable” se refiere a un gen que se usa opcionalmente en la transformación de la planta para, por ejemplo, proteger las células de la planta de un agente selectivo o proporcionar resistencia/tolerancia a un agente selectivo. Solamente aquellas células o plantas que reciben un marcador seleccionable funcional son capaces de dividirse o crecer bajo condiciones que tienen un agente selectivo. Los ejemplos de agentes selectivos pueden incluir, por ejemplo, antibióticos, que incluyen espectinomicina, neomicina, kanamicina, paromomicina, gentamicina, e higromicina. Estos marcadores seleccionables incluyen el gen para neomicina fosfotransferasa (npt I I), que expresa una enzima que confiere resistencia al antibiótico kanamicina, y genes para los antibióticos relacionados neomicina, paromomicina, gentamicina, y G418, o el gen para higromicina fosfotransferasa (hpt), que expresa una enzima que confiere resistencia a higromicina. Otros genes marcadores seleccionables pueden incluir genes que codifican la resistencia a herbicidas, que incluyen Bar (resistencia contra BASTA® (glufosinato amonio), o fosfinotricina (PPT)), acetolactato sintasa (ALS, resistencia contra inhibidores como sulfonilureas (SUs), imidazolinonas (IM Is), triazolopirimidinas (TPs), pirimidinil oxibenzoatos (POBs), y sulfonilamino carbonil triazolinonas que previenen la primera etapa en la síntesis de los aminoácidos de cadena ramificada), glifosato, 2,4-D, y resistencia o sensibilidad a metales. La frase “marcador-positivas” se refiere a las plantas que han sido transformadas para incluir el gen marcador seleccionable.

Varios marcadores seleccionables o detectables pueden ser incorporados en el vector de expresión seleccionado para permitir la identificación y la selección de plantas transformadas, o transformantes. Existen muchos para confirmar la expresión de marcadores de selección en plantas transformadas, que incluyen, por ejemplo secuenciamiento de ADN y reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) , análisis de inmunotransferencia Southern blotting, análisis de inmunotransferencia RNA blotting, métodos inmunológicos para la detección de una proteína expresada a partir del vector, por ejemplo, proteína precipitada que media la resistencia a fosfinotricina, u otras proteínas como genes informantes b-glucuronidasa (GUS), luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP por sus siglas en inglés), DsRed, b-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), fosfatasa alcalina, y similares (Ver Sambrook, et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, Coid Spring Harbor Press, N .Y. , 2001 , cuyo contenido se incorpora en la presente por referencia en su totalidad).

Los genes marcadores seleccionables se usan para la selección de tejidos o celulas transformadas. Los genes marcadores seleccionables incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, como los que codifican la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina fosfotransferasa (HPT) así como también genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas. Los genes de resistencia a herbicidas codifican una proteína objetivo modificado insensible al herbicida o una enzima que degrada o desintoxica el herbicida en la planta antes de que pueda actuar. Ver DeBlock et al. (1987) EMBO J . , 6:2513-2518; DeBlock et al. (1989) Plant Physiol. , 91 :691 -704; Fromm et al. (1990) 8:833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) 2:603-618). Por ejemplo, la resistencia a glifosato o herbicidas de sulfonilurea se ha obtenido al usar genes que codifican las enzimas objetivo mutantes 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS por sus siglas en inglés) y acetolactato sintasa (ALS por sus siglas en inglés). La resistencia a glufosinato amonio, bromoxinilo y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) se ha obtenido al usar genes bacterianos que codifican la fosfinotricin acetiltransferasa, una nitrilasa, o una 2,4-diclorofenoxiacetato monooxigenasa, que desintoxican los respectivos herbicidas. Las enzimas/genes para resistencia a 2,4-D han sido previamente descritas en los documentos US 2009/0093366 y WO 2007/053482, cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad .

Otros herbicidas pueden inhibir el punto de crecimiento o meristemo, con inclusión de imidazolinona o sulfonilurea. Los genes de ejemplo en esta categoría codifican las enzimas mutantes ALS y AHAS como lo describen, por ejemplo, Lee et al., EMBO J . 7: 1241 (1988); y Miki et al. , Theon. Appl. Genet. 80:449 (1990), respectivamente.

Los genes de resistencia a glifosato incluyen genes de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPs) (por medio de la introducción de ácidos nucleicos recombinantes y/o varias formas de mutagenesis in vivo de genes de EPSPs nativos), genes aroA y genes de glifosato acetil transferasa (GAT, por sus siglas en inglés), respectivamente. Los genes de resistencia para otros compuestos fosfono incluyen genes de glufosinato (fosfinotricin-acetil transferasa (PAT, por sus siglas en inglés) de especies Streptomyces, que incluyen Streptomyces hygroscopicus y Streptomyces viridichromogenes), y ácidos piridinoxi o fenoxi propiónicos y ciclohexonas (genes codificadores de inhibidor de ACCasa), Ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,940,835 a nombre de Shah, et al. y la Patente Estadounidense No. 6,248,876 a nombre de Barry et al. , que describen secuencias nucleotídicas de formas de EPSPs que pueden conferir resistencia a glifosato a una planta. Una molécula de ADN que codifica un gen de aroA mutante se puede obtener bajo el número de acceso ATCC 39256, y la secuencia nucleotídica del gen mutante se describe en la Patente Estadounidense No. 4,769,061 a nombre de Comai, solicitud de patente Europea No. 0 333 033 a nombre de Kumada et al. , y la Patente Estadounidense No. 4,975,374 a nombre de Goodman et al. , que describen secuencias nucleotídicas de genes de glutamina sintetasa que confieren resistencia a herbicidas como L-fosfinotricina. La secuencia nucleotídica de un gen PAT se describe en la solicitud Europea No. 0 242 246 a nombre de Leemans et al. Tambien DeGreef et al. , Bio/Technology 7:61 (1989), describen la producción de plantas transgénicas que expresan genes bar quiméricos que codifican la actividad de PAT. Los genes de ejemplo que confieren resistencia a los ácidos fenoxi propiónicos y ciclohexonas, con inclusión de setoxidim y haloxifop, son los genes Acc1 -S1 , Acc1 -S2 y Acc1 -S3 genes descritos por Marshall et al. , Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992). Los genes GAT capaces de conferir resistencia a glifosato se describen en el documento WO 2005012515 a nombre de Castle et al. Los genes que confieren resistencia a herbicidas 2,4-D, fop y piridiloxi auxina se describen en el documento WO 2005107437 y la solicitud de Patente Estadounidense No. 1 1 /587,893.

Otros herbicidas pueden inhibir la fotosíntesis, con inclusión de triazina (genes psbA y 1 s+) o benzonitrilo (gen nitrilasa). Przibila et al. , Plant Cell 3: 169 (1991 ), describen la transformación de Chlamydomonas con plásmidos que codifican genes psbA mutantes. Las secuencias nucleotídicas para los genes de nitrilasa se describen en la Patente Estadounidense No. 4,810,648 a nombre de Stalker, y moleculas de ADN que contienen estos genes están disponibles bajo los Nos. de acceso ATCC 53435, 67441 y 67442. La clonación y expresión de ADN que codifica una glutationa S-transferasa son descritas por Hayes et al. , Biochem. J . 285:173 (1992).

A los efectos de la presente invención, los genes marcadores seleccionables incluyen, mas no se limitan a, genes que codifican: neomicina fosfotransferasa I I (Fralcy et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science, 4: 1 -25); cianamida hidratase (Maier-Greiner et al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264); aspartato qumasa; dihidrodipicolinato sintasa (Perl et al. (1993) Bio/Technology, 1 1 :715-718); triptófano descarboxilasa (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912); dihidrodipicolinato sintasa y aspartato quinasa desensibilizada (Perl et al. (1993) Bio/Technology, 1 1 :715-718); gen bar (Toki et al. (1992) Plant Physiol. , 100: 1503-1507 y Meagher et al. (1996) y Crop Sci. , 36: 1367); triptófano descarboxilasa (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol. , 22:907-912); neomicina fosfotransferasa (NEO) (Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1 :327; higromicina fosfotransferasa (HPT o HYG) (Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol. , 6:1074); dihidrofolato reductasa (DHFR) (Kwok et al. (1986) PNAS USA 4552); fosfinotricina acetiltransferasa (DeBlock et al. (1987) EMBO J . , 6:2513); ácido 2,2-dicloropropiónico dehalogenasa (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); ácido acetohidroxi sintasa (Anderson et al. , Patente Estadounidense No. 4.761 .373; Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221 :266); 5-enolpiruvil-shikimato-fosfato sintasa (aroA) (Comai et al. (1985) Nature 317:741 ); haloarilnitrilasa (Stalker et al. , solicitud PCT publicada WO87/04181 ); acetil-coenzima A carboxilasa (Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220); dihidropteroato sintasa (sul I) (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 127); y polipeptido de fotosistema II (psbA) de 32 kD (Hirschberg et al. (1983) Science, 222: 1346).

También se incluyen los genes que codifican resistencia a: cloranfenicol (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J . , 2:987-992); metotrexato (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature, 303:209-213; Meijer et al. (1991 ) Plant Mol Bio. , 16:807-820 (1991 ); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. , 5: 103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science, 108:219-227 y Meijer et al. (1991 ) Plant Mol. Bio. 16:807-820); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. , 210:86-91 ); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. , 5: 131 -137); bleomicina (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. , 7: 171 -176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio. , 15: 127-136); bromoxinilo (Stalker et al. (1988) Science, 242:419-423); 2,4-D (Streber et al. (1989) Bio/Technology, 7:81 1 -816); glifosato (Shaw et al. (1986) Science, 233:478-481 ); y fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J . , 6:2513-2518). Todas las referencias citadas en esta descripción se incorporan por referencia en su totalidad a menos que se establezca lo contrario.

La lista anterior de genes marcadores seleccionables e informantes no está destinada a ser restrictiva. Cualquier gen informante o marcador seleccionable está incluido en la presente invención. De ser necesario, tales genes pueden ser secuenciados por los metodos conocidos en la téenica.

Los genes marcadores seleccionables e informantes se sintetizan para la expresión óptima en la planta. Es decir, la secuencia codificadora del gen ha sido modificada para potenciar la expresión en las plantas. El gen marcador sintético está diseñado para ser expresado en las plantas a un nivel superior que genera mayor eficiencia de transformación. Los métodos para la optimización sintética de genes están disponibles en la técnica. De hecho, varios genes han sido optimizados para incrementar la expresión del producto génico en las plantas.

La secuencia del gen marcador se puede optimizar para la expresión en una especie de planta particular o, en forma alternativa, se puede modificar para la expresión óptima en las familias de plantas. Los codones preferidos para plantas se pueden determinar a partir de los codones de mayor frecuencia en las proteínas expresadas en la mayor cantidad en la especie de planta particular de interés. Ver, por ejemplo, EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91 /16432; Perlak ef al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328; y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498; Pat. U .S. No. 5,380,831 ; y Pat. U .S. No. 5,436,391 , que se incorporan en la presente por referencia. De esta manera, las secuencias nucleotídicas se pueden optimizar para la expresión en cualquier planta. Se reconoce que todo o parte de la secuencia genica se puede optimizar o sintetizar. Es decir, las secuencias totalmente optimizadas o parcialmente optimizadas también pueden ser usadas.

Asimismo, varias estrategias de transformación que usan el sistema de transformación mediado por Agrobacterium han sido desarrolladas. Por ejemplo, la estrategia de vector binario se basa en un sistema de dos plásmidos donde el T-ADN está en un plásmido diferente del resto del plásmido Ti. En una estrategia de comtegración , una pequeña porción del T-ADN se coloca en el mismo vector que el gen foráneo, donde el vector posteriormente recombina con el plásmido Ti.

Como se usa en la presente, el término “planta” incluye plantas dicotiledóneas y plantas monocotiledóneas. Los ejemplos de plantas dicotiledóneas incluyen tabaco, Arabidopsis, soja, tomate, papaya, cañóla, girasol, algodón, alfalfa, papa, uva, guisante de Angola, arveja, Brassica, garbanzo, remolacha azucarera, colza, sandía, melón, pimiento, cacahuete, calabaza, radicheta, espinaca, zapallo, brócoli, zanahoria, coliflor, apio, repollo chino, pepino, berenjena y lechuga. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen maíz, arroz, trigo, caña de azúcar, cebada, centeno, sorgo, orquídeas, bambú, banana, espadañas, lilas, avena, cebolla, mijo y triticale.

El desarrollo en cuestión de un gen de resistencia a 2,4-D y s posteriores cultivos resistentes proporciona excelentes opciones para controlar las especies de malezas de hoja ancha, resistentes a glifosato (o altamente tolerantes y cambiadas) para aplicaciones en cultivos. El 2,4-D es un herbicida de amplio espectro, relativamente económico, y fuerte para malezas de hoja 10 ancha que brindaría excelente utilidad para los agricultores si pudiera proporcionarse mayor tolerancia en los cultivos tanto de plantas dicotiledóneas como en plantas monocotiledóneas por igual. Los cultivos de plantas dicotiledóneas transgenicas tolerantes a 2,4-D también tendrían mayor flexibilidad en la ís frecuencia y la tasa de aplicación. Una utilidad adicional del rasgo de tolerancia del herbicida en cuestión para 2,4-D es su utilidad para prevenir el daño a cultivos normalmente sensibles del goteo de 2,4-D, volatilización, inversión (u otro fenómeno de movimiento fuera de lugar) , mal aplicación, vandalismo, y 20 similares. Un beneficio adicional del gen de AAD-12 es que, a diferencia de todos los homólogos de tfdA caracterizados hasta la fecha, la AAD-12 es capaz de degradar las auxinas piridiloxiacetato (por ejemplo, triclopir, fluoroxipir) además de las fenoxi auxinas aquirales (por ejemplo, 2,4-D, MCPA, ácido 4- reacciones químicas catalizadas por la enzima AAD-12 en cuestión se muestra en la Figura 1 . (la adición de O.sub.2 es estereoespecíficas; la descomposición del intermediario en fenol y glioxilato es espontánea). Debería entenderse que las estructuras químicas de la Figura 1 ilustran las estructuras moleculares y que varios grupos R y similares (como las ilustradas en la Tabla 1 ) están incluidos pero no se ilustran necesariamente de manera específica en la Figura 1 . Las múltiples mezclas de diferentes combinaciones de fenoxi auxina han sido usadas mundialmente para tratar el espectro específico de las malezas y las condiciones ambientales en varias regiones. El uso del gen de AAD-12 en las plantas brinda protección a un espectro mucho más amplio de herbicidas de auxina, incrementando de esta manera la flexibilidad y el espectro de las malezas que pueden ser controladas.

Ahora se ha identificado un único gen (AAD-12) que, cuando se diseña geneticamente para la expresión en plantas, tiene las propiedades que permiten el uso de herbicidas de fenoxi auxina en plantas donde la tolerancia inherente nunca existió o no fue lo suficientemente alta para permitir el uso de estos herbicidas. Asimismo, la AAD-12 puede brindar protección en la planta a herbicidas de piridiloxiacetato donde la tolerancia natural tampoco fue suficiente para permitir la selectividad, expandiendo la utilidad potencial de estos herbicidas. Las plantas que contienen AAD-12 solo pueden ser ahora tratadas secuencialmente o mezclas en tanque con uno, dos, O una combinación de varios de herbicidas de fenoxi auxina. La tasa para cada herbicida de fenoxi auxina puede comprender desde 25 a 4000 g ae/ha, y más típicamente desde 100 a 2000 g ae/ha para el control de un amplio espectro de malezas en plantas dicotiledóneas. Asimismo, uno, dos, o una mezcla de varios compuestos de auxina piridiloxiacetato se pueden aplicar a las plantas que expresan AAD-12 con riesgo reducido de lesión a partir de tales herbicidas. La tasa para cada herbicida de piridiloxiacetato puede oscilar entre 25 a 2000 g ae/ha, y más típicamente entre 35 - 840 g ae/ha para el control de malezas adicionales en plantas dicotiledóneas.

El glifosato se usa en forma extensiva porque controla un espectro muy amplio de especies de malezas de hoja ancha e hierbas. No obstante, el uso repetido de glifosato en GTCs y en aplicaciones no destinadas a cultivos lo ha hecho selectivo, y continuará siendolo, para los cambios en las malezas en especies naturalmente más tolerantes o biotipos resistentes a glifosato. Los herbicidas que se adicionan a la mezcla en tanques usados a tasas eficaces que ofrecen control de la misma especie pero que tienen diferentes modos de acción están prescritos por la mayoría de las estrategias de control de resistencia a herbicidas como un método para retardar la aparición de malezas resistentes. El apilamiento de AAD-12 con un rasgo de tolerancia a glifosato (y/o con otros rasgos de tolerancia a herbicidas) podría brindar un mecanismo que permite el control de especies de malezas en plantas dicotiledóneas resistentes a glifosato en GTCs al permitir el uso de glifosato, fenoxi auxinas (por ejemplo, 2,4-D) y herbicidas de auxina piridiloxiacetato (por ejemplo, triclopir)— selectivamente en el mismo cultivo. Las aplicaciones de estos herbicidas podrían realizarse en forma simultánea en una mezcla en tanque que comprende dos o más herbicidas de diferentes modos de acción; aplicaciones individuales de una única composición herbicida en aplicaciones secuenciales como pre-plantación , pre-emergencia o post-emergencia y frecuencia dividida de aplicaciones que oscilan entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 3 meses; o, en forma alternativa, cualquier combinación de cualquier número de herbicidas que representan cada clase química se puede aplicar con cualquier frecuencia dentro de aproximadamente 7 meses de plantación del cultivo hasta la cosecha del cultivo (o el intervalo pre-cosecha para el herbicida individual, cualquiera sea más corto).

Es importante tener flexibilidad al controlar un amplio espectro de malezas de hoja ancha e hierbas en terminos de la frecuencia de las aplicaciones, la tasa de herbicidas individuales, y la habilidad para controlar malezas difíciles o resistentes. Las aplicaciones de glifosato en un cultivo con un gen de resistencia a glifosato/AAD-12 podría comprender desde aproximadamente 250 a 2500 g ae/ha; los herbicidas de fenoxi auxina (uno o más) podrían aplicarse desde aproximadamente 25 a 4000 g ae/ha; y los herbicidas de auxina piridiloxiacetatos (uno o más) podrían aplicarse desde 25 a 2000 g ae/ha. La combinación o combinaciones óptimas y la frecuencia de estas aplicaciones dependerá de la situación, la especie y el ambiente particulares, y será mejor determinada por una persona experto en la teenica del control de malezas y que tiene el beneficio de la invención en cuestión.

Las plántulas son típicamente resistentes en todo el ciclo de crecimiento. Las plantas transformadas típicamente serán resistentes a la aplicación de un nuevo herbicida en cualquier momento en que se expresa el gen. En la presente, la tolerancia a 2,4-D se muestra en el ciclo de vida usando los promotores constitutivos evaluados hasta ahora (principalmente CsVMV y AtUbi 10). Típicamente, esto sería de esperarse, pero es una mejor por sobre otras actividades no metabólicas donde la tolerancia puede ser impactada de manera significativa por la expresión reducida de un mecanismo de resistencia en el sitio de acción, por ejemplo. Un ejemplo es el algodón Roundup Ready, donde las plantas eran tolerantes si se rociaban en forma temprana, pero si se rociaban demasiado tarde, el glifosato se concentraba en los meristemas (porque no se metaboliza y se transloca); los promotores virales que usó Monsanto no se expresan bien en las flores. La presente invención proporciona una mejora al respecto.

Las formulaciones de herbicidas (por ejemplo, formulaciones esteres, ácidos o sales; o concentrado soluble, concentrado emulsionable, o líquido soluble) y los aditivos para mezclas en tanque (por ejemplo, coadyuvantes, agentes tensoactivos, agentes de retardo de goteo, o agentes de compatibilidad) pueden afectar de manera significativa el control de las malezas de un determinado herbicida o combinación de uno o más herbicidas. Cualquier combinación de estos con cualquiera de las químicas de herbicidas mencionadas con anterioridad está dentro del alcance de esta invención.

La persona experto en la teenica vería también el beneficio de combinar dos o más modos de acción para incrementar el espectro de las malezas controladas y/o para el control de especies de malezas naturalmente más tolerantes o resistentes. Esto se podría extender a las químicas para las cuales se alcanzó la tolerancia a herbicidas en cultivos a través de la intervención humana (ya sea transgénicamente o no transgénicamente) más allá de los GTCs. De hecho, los rasgos que codifican la resistencia a glifosato (por ejemplo, planta resistente o EPSPS bacteriano, glifosato oxidoreductasa (GOX), GAT), resistencia a glufosinato (por ejemplo, Pat, bar), resistencia a herbicida inhibidor de acetolactato sintasa (ALS) (por ejemplo, imidazolinona, sulfonilurea, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos, y otras químicas =AHAS, Csr1 , SurA, et al ), resistencia a bromoxinilo (por ejemplo, Bxn), resistencia a inhibidores de enzima HPPD (4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa), resistencia a inhibidores de fitoeno desaturasa (PDS, por sus siglas en ingles), resistencia a herbicidas que inhiben el fotosistema I I (por ejemplo, psbA), resistencia a herbicidas que inhiben el fotosistema I , resistencia a herbicidas que inhiben la protoporfirinógeno oxidasa IX (PPO) (por ejemplo, PPO-1 ), resistencia a herbicidas de fenilurea (por ejemplo, CYP76B1 ), enzimas dicamba-degradantes (ver, por ejemplo, US 20030135879), y otros podrían apilarse en forma individual o en múltiples combinaciones para brindar la habilidad de controlar o prevenir de manera efectiva cambios en malezas y/o resistencia a cualquier herbicida de las clases mencionadas con anterioridad. La EPSPS modificada in vivo se puede usar en algunas modalidades preferidas, así como también los genes de resistencia a glifosato de Clase I , Clase I I y Clase II I .

Con respecto a los herbicidas adicionales, algunos inhibidores de ALS preferidos adicionales incluyen, mas no se limitan a sulfonilureas (como clorsulfurón, halosulfurón, nicosulfurón, sulfometurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón), imidazoloninonas (como imazamox, imazetapir, imazaquma), triazolopirimidina sulfonanilidas (como cloransulam-metil, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam y penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (como bispiribac y piritiobac), y flucarbazona. Algunos inhibidores de HPPD preferidos incluyen mas no se limitan a mesotriona, isoxaflutol y sulcotriona. Algunos inhibidores de PPO preferidos incluyen mas no se limitan a flumiclorac, flumioxazina, flufenpir, piraflufen , flutiacet, butafenacilo, carfentrazona, sulfentrazona y los difenil eteres (como acifluorfeno, fomesafeno, lactofeno y oxifluorfeno).

Asimismo, la AAD-12 sola o apilada con uno o más rasgos de HTC adicionales se puede apilar con uno o más rasgos adicionales de entrada (por ejemplo, resistencia a insectos, resistencia a hongos o tolerancia a estrés, entre otros) o salida (por ejemplo, rendimiento incrementado, perfil de aceite mejorado, calidad de fibra mejorada, entre otros). Por lo tanto, la presente invención se puede usar para brindar un paquete agrónomo completo de mejor calidad de cultivo con la habilidad para controlar flexiblemente y efectivamente en términos de costos cualquier número de pestes agrícolas.

La presente invención se refiere, en parte, a la identificación de una enzima que no solamente es capaz de degradar 2,4-D, sino que también, sorprendentemente, posee propiedades novedosas, que distinguen la enzima de la presente invención de las proteínas tfdA previamente conocidas, por ejemplo. A pesar de que esta enzima tiene muy baja homología con tfdA, los genes de la presente invención todavía pueden ser clasificados generalmente en la misma familia global de dioxigenasas dependientes de a-cetoglutarato. Esta familia de proteínas está caracterizada por tres residuos de histidina conservados en un motivo “HX(D/E)X23-26(T/S)X1 14-183HX10-13R” que comprende el sitio activo. Las histidinas coordinan el ion Fe + 2 en el sitio activo que es esencial para la actividad catalítica (Hogan et al., 2000). Los experimentos de expresión in vitro preliminares analizados en la presente se adecuaron para ayudar a seleccionar atributos novedosos. Estos experimentos tambien indican que la enzima AAD-12 es única de otra enzima dispar de la misma clase, descrita en una solicitud de patente previamente presentada (PCT US/2005/014737; presentada el 2 de mayo de 2005). La enzima AAD-1 de esa solicitud comparte sólo aproximadamente 25% de identidad de secuencia con la proteína AAD-12 de la presente.

Más específicamente, la presente invención se refiere, en parte, al uso de una enzima que no sólo es capaz de degradar 2,4-D, sino también herbicidas de piridiloxiacetato. Nunca antes se había informado sobre una enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que tenga la habilidad de degradar herbicidas de diferentes clases químicas y modos de acción. Las enzimas y los genes preferidos para uso de acuerdo con la presente invención se refieren en la presente como “genes y proteínas AAD-12 (AriloxiAlcanoato Dioxigenasa)”.

Las proteínas de la presente resultaron positivas en cuanto a la conversión de 2,4-D en 2,4-diclorofenol (“DCP”; inactivo a nivel herbicida) en los ensayos analíticos. Las proteínas parcialmente purificadas de la presente invención pueden convertir rápidamente 2,4-D en DCP in vitro. Una ventaja adicional que las plantas transformadas AAD-12 brindan es que el o los herbicidas parentales son metabolizados a formas inactivas, reduciendo de esta manera el potencial para cosechar residuos herbicidas en granos o rastrojo.

La presente invención tambien incluye métodos para controlar malezas en donde dichos métodos comprenden aplicar un herbicida de piridiloxiacetato y/o a fenoxi auxina a las plantas que comprenden un gen de AAD-12.

A la luz de estos descubrimientos, ahora se proporcionan plantas novedosas que comprenden un polinucleótido que codifica este tipo de enzima. Hasta ahora, no había motivación alguna de producir tales plantas y no había expectativa de que tales plantas pudieran producir efectivamente esta enzima para tornar las plantas resistentes no solamente a herbicidas de ácido fenoxi (como 2,4-D) sino también a herbicidas de piridiloxiacetato. Por lo tanto, la presente invención brinda muchas ventajas que hasta el momento no se pensaba que fueran posibles en la téenica.

Las cepas públicamente disponibles (depositadas en colecciones de cultivos como ATCC o DSMZ) pueden ser adquiridas y analizadas usando las técnicas descritas en la presente, para detectar genes novedosos. Las secuencias descritas en la presente se pueden usar para amplificar y clonar los genes homólogos en un sistema de expresión recombinante para su detección y evaluación de acuerdo con la presente invención.

Como se analizó con anterioridad en la sección de los Antecedentes, un organismo que ha sido extensamente investigado por su habilidad para degradar 2,4-D es Ralstonia eutropha (Streber et al. , 1987). El gen que codifica la primera enzima en la vía de degradación es tfdA. Ver la Patente Estadounidense No. 6, 153,401 y el acceso No. M 16730 de GENBANK. El TfdA cataliza la conversión de ácido 2,4-D en DCP inactivo a nivel herbicida mediante una reacción de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal et al. , 2001 ). El TfdA ha sido usado en plantas transgenicas para impartir resistencia a 2,4-D en plantas dicotiledóneas (por ejemplo, algodón y tabaco) normalmente sensibles a 2,4-D (Streber et al. , 1989; Lyon et al. , 1989; Lyon et al., 1993). Un gran número de genes de tipo tfdA que codifican proteínas capaces de degradar 2,4-D han sido identificados en el medio ambiente y depositados en la base de datos de Genbank. Muchos homólogos son bastante similares a tfdA (>85% de identidad de aminoácidos) y tienen propiedades enzimáticas similares a tfdA. No obstante, una pequeña colección de homólogos de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato se identifica actualmente que tienen un bajo nivel de homología con tfdA.

La presente invención se relaciona, en parte, con los descubrimientos sorprendentes de nuevos usos para, y funciones de, una enzima distantemente relacionada, sdpA, de Delftia acidivorans (Westendorf et al. , 2002, 2003) con baja homología con tfdA (31 % de identidad de aminoácidos). Se ha demostrado previamente que esta enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato purificada en su forma nativa degrada 2,4-D y S-diclorprop (Westendorf et al. , 2002 y 2003). No obstante, nunca se ha informado sobre una enzima dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato que tenga la habilidad para degradar herbicidas de la clase química del piridiloxiacetato. SdpA nunca se ha expresado en plantas, ni tampoco ha existido motivación de hacerlo en parte porque el desarrollo de nuevas teenologías de HTC ha sido limitado en gran medida a causa de la eficacia, el costo bajo y la conveniencia de los GTCs (Devine, 2005).

A la luz de la actividad novedosa, las proteínas y los genes de la presente invención se denominan en la presente “proteínas y genes AAD-12”. Se confirmó en la presente que la AAD-12 degrada una variedad de herbicidas de auxina fenoxiacetato in vitro. No obstante, se encontró de manera sorprendente que esta enzima, como se informó por primera vez en la presente, tambien es capaz de degradar sustratos adicionales de la clase de moléculas de ariloxialcanoato. Los sustratos de importancia agrónoma significativa incluyen los herbicidas de auxina piridiloxiacetato. Este descubrimiento altamente novedoso es la base de las oportunidades de los rasgos de cultivo tolerante a herbicidas (HTC) significativo y marcador seleccionable. Esta enzima es única en su habilidad para suministrar actividad degradativa herbicida a un intervalo de espectro amplio de herbicidas de hoja ancha (auxinas fenoxiacetato y piridiloxiacetato).

Por lo tanto, la presente invención se refiere, en parte, a la degradación del ácido 2,4-diclorofenoxiacetico, otros herbicidas de tipo auxina fenoxiacéticos, y herbicidas de piridiloxiacetato mediante una enzima ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-12) expresada en forma recombinante. Esta invención también se relaciona, en parte, con la identificación y los usos de genes que codifican una enzima de degradación ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-12) capaz de degradar herbicidas de fenoxi y/o piridiloxi auxina.

La presente enzima permite la expresión transgénica, que genera tolerancia a combinaciones de herbicidas que controlarían casi todas las malezas de hoja ancha. La AAD-12 puede servir como un rasgo excelente de cultivo tolerante a herbicida (HTC) para apilarse con otros rasgos de HTC [por ejemplo, resistencia a glifosato, resistencia a glufosinato, resistencia a inhibidores de ALS (por ejemplo, imidazolinona, sulfonilurea, triazolopirimidina sulfonanilida), resistencia a bromoxinilo, resistencia a inhibidores de HPPD, resistencia a inhibidores de PPO, entre otros], y rasgos de resistencia a insectos (Cry1 F, Cryl Ab, Cry 34/45, otras proteínas Bt. , o proteínas insecticidas de origen distinto de Bacillis, entre otros) por ejemplo. Asimismo, la AAD-12 puede servir como un marcador seleccionable para ayudar a la selección de transformantes primarios de plantas diseñadas genéticamente con un segundo gen o grupo de genes.

Asimismo, el presente gen microbiano ha sido rediseñado de tal manera que la proteína es codificada por codones que tienen una inclinación hacia el uso de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (hemicotiledóneas). Se ha transformado Arabidopsis, maíz, tabaco, algodón, soja, cañóla y arroz con construcciones que contienen AAD-12 y han demostrado altos niveles de resistencia tanto a herbicidas de fenoxi y piridiloxi auxina. Por lo tanto, la presente invención tambien se relaciona con genes en “plantas optimizadas” que codifican proteínas de la presente invención.

Los grupos oxialcanoato son útiles para introducir funcionalidad de ácido estable en herbicidas. El grupo ácido puede impartir movilidad en el floema mediante “atrapamiento de ácido”, un atributo deseado para la acción herbicida y, por lo tanto, podría incorporarse en herbicidas nuevos a los efectos de la movilidad. Los aspectos de la presente invención también brindan un mecanismo de creación de HTCs. Existen muchos herbicidas comerciales y experimentales potenciales que pueden servir como sustratos para AAD-12. En consecuencia, el uso de los presentes genes también puede generar tolerancia a esos otros herbicidas.

Los rasgos de los HTC de la presente invención se pueden usar en combinaciones novedosas con otros rasgos de los HTC (que incluyen, mas no se limitan a, tolerancia a glifosato). Estas combinaciones de rasgos dan origen a métodos novedosos para controlar especies de malezas (y similares), debido a la resistencia recientemente adquirida o la tolerancia inherente a herbicidas (por ejemplo, glifosato). Por lo tanto, además de los rasgos de los HTC, los metodos novedosos para controlar las malezas usando herbicidas, para los cuales la tolerancia a herbicidas fue creado por dicha enzima en cultivos transgénicos, se encuentran dentro del alcance de la invención.

Esta invención se puede aplicar en el contexto de comercializar un rasgo de resistencia a 2,4-D apilado con los rasgos actuales de resistencia a glifosato en la soja, por ejemplo. Por lo tanto, esta invención proporciona una herramienta para combatir cambios en especies de malezas de hoja ancha y/o selección de malezas de hoja ancha resistentes a herbicidas, que culmina con la confianza extremadamente alta por parte de los agricultores en el glifosato para el control de malezas con varios cultivos.

La expresión transgénica de los presentes genes AAD-12 se ejemplifica en , por ejemplo, Arabidopsis, tabaco, soja, algodón, arroz, maíz y cañóla. La soja es un cultivo preferido para la transformación de acuerdo con la presente invención . No obstante, esta invención se puede usar en múltiples plantas monocotiledóneas distintas (como pasto o césped) y cultivos de plantas dicotiledóneas como alfalfa, trébol, especies de árboles, entre otras. En forma similar, el 2,4-D (u otros sustratos de AAD-12) se puede usar más positivamente en cultivos de hierbas donde la tolerancia es moderada, y tolerancia incrementada por medio de este rasgo brindarían a los agricultores la oportunidad de usar estos herbicidas a tasas más eficaces y en una frecuencia de aplicación más amplia sin riesgo de lesión al cultivo.

Incluso más, la presente invención proporciona un único gen que puede brindar resistencia a herbicidas que controlan malezas de hoja ancha. Este gen se puede usar en múltiples cultivos para permitir el uso de una combinación de herbicidas de amplio espectro. La presente invención tambien puede controlar malezas resistentes a químicos actuales, y ayuda al control del espectro de malezas que cambian generado de las prácticas agrónomas actuales. El presente AAD-12 también se puede usar con el intento de desentoxicar efectivamente sustratos herbicidas adicionales en formas no herbicidas. Por lo tanto, la presente invención posibilita el desarrollo de rasgos de los HTC adicionales y/o teenología de marcadores seleccionables.

En forma separada o adicionada, usando los presentes genes para producir HTCs, los presentes genes también se pueden usar como marcadores seleccionables para seleccionar de manera exitosa transformantes en cultivos celulares, invernaderos, y en campo. Existe un alto valor inherente por los presentes genes simplemente como un marcador seleccionable para proyectos de biotecnología. La promiscuidad de la AAD-12 por otros herbicidas de tipo auxina ariloxialcanoato brinda muchas oportunidades de usar este gen a los efectos de HTC y/o marcador seleccionable.

No es posible mencionar con facilidad el termino “resistencia” sin usar el verbo “tolerar” o el adjetivo “tolerante”. La industria ha pasado innumerables horas debatiendo los Cultivos Tolerantes a Herbicidas (HTC) versus los Cultivos Resistentes a Herbicidas (HRC). HTC es un término preferido en la industria. No obstante, la definición oficial dada por la Weed Science Society of America de “resistencia” es “la habilidad heredada de una planta para sobrevivir y reproducirse después de la exposición a una dosis de herbicida normalmente letal para el tipo silvestre”. En una planta, la resistencia puede tener origen natural o ser inducida por téenicas como diseño genético o selección de variantes producidas por cultivo tisular o mutagenesis. Como se usa en la presente, a menos que se indique lo contrario, la “resistencia” a herbicidas es heredable y permite que una planta crezca y se reproduzca en presencia de un típico tratamiento efectivo a nivel herbicida por un herbicida para una planta determinada, como lo sugiere la edición actual de The Herbicida Handbook a partir de la presentación de la presente invención. Como lo reconocen las personas expertos en la técnica, una planta puede todavía ser considerada “resistente” a pesar de que exista cierto grado de lesión a la planta derivado de la exposición al herbicida. Como se usa en la presente, el término “tolerancia” es más amplio que el término “resistencia,” e incluye “resistencia” como se define en la presente, la capacidad mejorada de una planta particular de soportar los diversos grados de lesión inducida a nivel herbicida que típicamente genera plantas de tipo silvestre del mismo genotipo en la misma dosis de herbicida.

La transferencia de la actividad funcional a la planta o los sistemas bacterianos puede implicar una secuencia de ácido nucleico, que codifica la secuencia de aminoácidos para una proteína de la presente invención , integrada en un vector de expresión de proteína apropiado para el huesped en el cual el vector residirá. Una forma de obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína con actividad funcional es aislar el material genético nativo de las especies bacterianas que producen la proteína de interés, usando información deducida de la secuencia de aminoácidos de la proteína, como se describe en la presente. Las secuencias nativas se pueden optimizar para expresión en plantas, por ejemplo, como se describe en mayor detalle más adelante. Un polinucleótido optimizado también puede diseñarse sobre la base de la secuencia de proteínas.

Existe un número de métodos para obtener proteínas para uso de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos para las proteínas que se describen en la presente se pueden usar para identificar y aislar otras proteínas de una mezcla de proteínas. Específicamente, los anticuerpos pueden desarrollarse para las porciones de las proteínas que son más conservadas o más distintas, en comparación con otras proteínas relacionadas. Estos anticuerpos pueden usarse despues para identificar específicamente proteínas equivalentes con la actividad característica por inmunoprecipitación , ensayo de inmunoabsorbencia ligado a enzimas (ELISA), o inmunotransferencia. Los anticuerpos para las proteínas que se describen en la presente, o proteínas equivalentes, o fragmentos de estas proteínas, se pueden preparar fácilmente usando procedimientos estándares. Tales anticuerpos son un aspecto de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, preferentemente producidos en respuesta a una proteína ejemplificada o sugerida.

La persona experto en la téenica reconocería con facilidad que las proteínas (y genes) de la presente invención pueden obtenerse de una variedad de fuentes. Así como se conoce que los operones de degradación de herbicidas enteros son codificados en elementos transponibles como plásmidos, así como también genómicamente integrados, las proteínas de la presente invención pueden obtenerse de una amplia variedad de microorganismos; por ejemplo, con inclusión de bacterias recombinantes y/o de tipo silvestre.

Los mutantes de aislados bacterianos pueden formarse mediante procedimientos que son ampliamente conocidos en la técnica. Por ejemplo, los mutantes asporógenos pueden obtenerse a través de la mutagenesis de etilmetano sulfonato (EMS) de un aislado. Las cepas mutantes también pueden crearse usando luz ultravioleta y nitrosoguanidina mediante procedimientos ampliamente conocidos en la téenica.

Una proteína “de” u “obtenible a partir de” cualquiera de los aislados en cuestión que se enuncian o sugieren en la presente hace referencia a que la proteína (o una proteína similar) puede ser obtenida del aislado o alguna otra fuente, como otra cepa bacteriana o una planta. “Derivada de” también tiene esta connotación, e incluye proteínas obtenibles a partir de un determinado tipo de bacteria que están modificadas para expresión en una planta, por ejemplo. La persona experto en la técnica reconocerá fácilmente que, dada la descripción de una proteína y gen bacteriano, es posible diseñar una planta que produzca la proteína. Las preparaciones de anticuerpos, las sondas de ácido nucleico (ADN , ARN, o PNA, por ejemplo), y similares se pueden preparar usando las secuencias de polinucleótidos y/o aminoácidos descritas en la presente y usadas para detectar y recuperar otros genes relacionados de otras fuentes (naturales).

Las técnicas de biología molecular estándares pueden ser usadas para clonar y secuenciar las proteínas y los genes descritos en la presente. La información adicional puede encontrarse en Sambrook et al. , 1989, que se incorpora en la presente por referencia.

Polinucleótidos y sondas: la presente invención proporciona, además, secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas para uso de acuerdo con la presente invención. La presente invención tambien proporciona métodos para identificar y caracterizar genes que codifican proteínas que tienen la actividad herbicida deseada. En una modalidad , la presente invención proporciona secuencias nucleotídicas únicas que son útiles como sondas de hibridación y/o cebadores para téenicas de PCR. Los cebadores producen fragmentos génicos característicos que se pueden usar en la identificación, caracterización y/o aislamiento de genes específicos de interés. Las secuencias nucleotídicas de la presente invención codifican proteínas que son distintas de las proteínas previamente descritas.

Los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para formar “genes” completos para codificar proteínas o péptidos en una célula huésped deseada. Por ejemplo, como la persona experto en la técnica reconocería con facilidad, los polinucleótidos en cuestión pueden ser ubicados apropiadamente bajo el control de un promotor en un huésped de interés, como se conoce en la técnica. El nivel de expresión génica y expresión temporal/específica de tejido puede impactar en gran medida sobre la utilidad de la invención. Por lo general, los niveles superiores de expresión de proteína de un gen degradativo generarán una degradación más rápida y más completa de un sustrato (en este caso, un herbicida objetivo). Será deseable que los promotores expresen el gen objetivo a niveles altos a menos que la expresión alta tenga un impacto negativo consecuente sobre la salud de la planta. Típicamente, sería deseable que el gen de AAD-12 fuera constitutivamente expresado en todos los tejidos para la completa protección de la planta en todas las etapas de crecimiento. No obstante, se podría usar, en forma alternativa, un gen de resistencia expresado a nivel vegetativo; esto permitiría el uso del herbicida objetivo en el cultivo para el control de malezas y posteriormente controlaría la reproducción sexual del cultivo objetivo mediante la aplicación durante la etapa de florecimiento. Asimismo, los niveles y los tiempos deseados de expresión tambien pueden depender del tipo de planta y el nivel de tolerancia deseado. Algunas modalidades preferidas usan promotores constitutivos fuertes combinados con potenciadores de la trascripción y similares para incrementar los niveles de expresión y para potenciar la tolerancia a los niveles deseados. Algunas de estas aplicaciones se analizan en mayor detalle a continuación, antes de la sección de los Ejemplos.

Como es de conocimiento para la persona experto en la téenica, el ADN típicamente existe en forma de dos hebras. En esta disposición, una cadena es complementaria con la otra cadena y viceversa. Al tiempo que el ADN se replica en una planta (por ejemplo), se producen hebras complementarias adicionales de ADN. La “hebra codificadora” con frecuencia se usa en la técnica para hacer referencia a la cadena que se une con la cadena antisentido. El ARNm se transcribe de la cadena “antisentido” de ADN . La cadena “sentido” o “codificadora” tiene una serie de codones (un codón tiene tres nucleótidos que se pueden leer como una unidad de tres residuos para especificar un aminoácido particular) que puede ser leído como un marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en ingles) para formar una proteína o un péptido de interés. A fin de producir una proteína ¡n vivo, una cadena de ADN típicamente se transcribe en una cadena complementaria de ARNm que se usa como el molde para la proteína. Por lo tanto, la presente invención incluye el uso de los polinucleótidos ejemplificados ilustrados en listado de secuencias adjunto y/o equivalentes que incluyen las hebras complementarias. El ARN y PNA (ácidos nucleicos peptídicos) que son funcionalmente equivalentes a las moléculas de ADN ejemplificadas están incluidos en la presente invención.

Las proteínas y los genes para uso de acuerdo con la presente invención se pueden identificar y obtener usando sondas de oligonucleótidos, por ejemplo. Estas sondas son secuencias nucleotídicas detectables que pueden ser detectables en virtud de un marcador apropiado o pueden ser hechas inherentemente fluorescentes como se describe en la solicitud internacional No. WO 93/16094. Las sondas (y los polinucleótidos de la presente invención) pueden ser ADN, ARN , o PNA. Además de adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y uracilo (U ; para moléculas de ARN), sondas sintéticas (y polinucleótidos) de la presente invención tambien pueden tener inosina (una base neutra capaz de aparearse con todas las cuatro bases; a veces usada en lugar de una mezcla de todas las cuatro bases en sondas sintéticas) y/u otras bases sintéticas (no naturales). Por lo tanto, cuando un oligonucleótido sintético, degenerado, se menciona en la presente, y “N” o “n” se usa genéricamente, “N” o “n" puede ser G, A, T, C, o inosina. Los códigos de ambigüedad como se usan en la presente concuerdan con las convenciones estándares de nomenclatura de la IUPAC al momento de la presentación de esta solicitud (por ejemplo, R significa A o G, Y significa C o T, etcétera).

Como es ampliamente conocido en la téenica, si una molécula de sonda se híbrida con una muestra de ácido nucleico, es posible asumir de manera razonable que la sonda y la muestra tienen homología/similitud/identidad sustancial. Preferentemente, la hibridación del polinucleótido se realiza primero seguido de lavados bajo condiciones de rigurosidad baja, moderada o alta, por medio de técnicas ampliamente conocidas en la técnica, como se describe en, por ejemplo, Keller, G. H. , M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, Nueva York, N.Y. , páginas 169-170. Por ejemplo, como se establece en ese documento, las condiciones rigurosidad baja se pueden alcanzar primero al lavar con 2 x SSC (citrato en solución salina estándar o Standard Satine Cítrate)/O % SDS (Dodecil Sulfato de Sodio) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Típicamente se realizan dos lavados. La rigurosidad más alta despues se puede alcanzar al disminuir la concentración de sal y/o al elevar la temperatura. Por ejemplo, el lavado descrito con anterioridad puede ser seguido de dos lavados con 0.1 x SSC/0.1 % SDS durante 15 minutos cada uno a temperatura ambiente seguido de posteriores lavados con 0.1 x SSC/0.1 % SDS durante 30 minutos cada uno a 55°C. Estas temperaturas se pueden usar con otros protocolos de hibridación y lavado establecidos en la presente y como sería conocido por una persona experto en la téenica (es posible usar SSPE como la sal en lugar de SSC, por ejemplo). Se puede preparar 2 x SSC/0.1 % SDS al agregar 50 mi de 20 x SSC y 5 mi de 10% SDS a 445 mi de agua. Se puede preparar 20 x SSC al combinar NaCI (175.3 g/0.150 M), citrato de sodio (88.2 g/0.015M), y agua, ajustando el pH a 7.0 con NaOH 10N , después ajustando el volumen a 1 litro. Se puede preparar SDS 10% al disolver 10 g de SDS en 50 mi de agua autoclavada, y después diluir a 100 mi.

La detección de la sonda brinda un medio para determinar de manera conocida si se ha mantenido la hibridación. Tal análisis de la sonda brinda un método rápido para identificar los genes de la presente invención. Los segmentos de nucleótidos usados como sondas de acuerdo con la invención se pueden sintetizar usando un sintetizador de ADN y procedimientos estándares. Estas secuencias nucleotídicas también se pueden usar como cebadores de PCR para ampliar los genes de la presente invención.

Las características de hibridación de una molecula se pueden usar para definir los polinucleótidos de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención incluye polinucleótidos (y/o sus complementos, preferentemente sus complementos completos) que se hibridan con un polinucleótido ejemplificado en la presente. Es decir, una forma de definir un gen (y la proteína que codifica), por ejemplo, es mediante su habilidad para hibridarse (bajo cualquiera de las condiciones específicamente descritas en la presente) con un gen conocido o específicamente ejemplificado.

Como se usa en la presente, las condiciones “rigurosas” para la hibridación se refiere a las condiciones que alcanzan el mismo grado -o un grado similar- de especificidad de hibridación que las condiciones usadas por los presentes solicitantes. Específicamente, la hibridación del ADN inmovilizado sobre transferencia Southern con sondas específicas de genes marcados con 32P puede ser realizada a través de métodos estándares (ver, por ejemplo, Maniatis et al. 1982). En general, la hibridación y los posteriores lavados se pueden llevar a cabo bajo condiciones que permiten la detección de secuencias objetivo. Para las sondas de genes de ADN de cadena doble, la hibridación se puede llevar a cabo toda la noche a 20 - 25°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en 6 x SSPE, 5 x solución de Denhardt, 0.1 % SDS, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado.

Los lavados se pueden llevar a cabo típicamente de la siguiente manera: (1 ) dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1 x SSPE, 0.1 % SDS (lavado de baja rigurosidad); y (2) una vez a Tm-20°C durante 15 minutos en 0.2 x SSPE, 0.1 % SDS (lavado de rigurosidad moderada).

Para las sondas de oligonucleótidos, la hibridación se puede llevar a cabo toda la noche a 10 - 20°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido en 6. veces. SSPE, 5 x solución de Denhardt, 0.1 % SDS, 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado.

Los lavados se pueden llevar a cabo típicamente de la siguiente manera: (1 ) dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos 1 x SSPE, 0.1 % SDS (lavado de baja rigurosidad); y (2) una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1 x SSPE, 0.1 % SDS (lavado de rigurosidad moderada).

En general, la sal y/o temperatura se puede alterar para cambiar la rigurosidad. Con un fragmento de ADN marcado de >70 o más bases de longitud, es posible usar las siguientes condiciones: (1 ) baja: 1 o 2 x SSPE, temperatura ambiente; (2) baja: 1 o 2 x SSPE, 42°C. ; (3) moderada: 0.2 x o 1 x SSPE, 65°C o (4) alta: 0.1 x SSPE, 65°C.

La formación de dúplex y la estabilidad dependen de la complementariedad sustancial entre las dos hebras de un híbrido y, como se destacó con anterioridad, se puede tolerar cierto grado de discordancia. Por lo tanto, las secuencias de sonda de la presente invención incluyen mutaciones (tanto individuales como múltiples), deleciones, inserciones de las secuencias descritas, y combinaciones de las mismas, en donde tales mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formación de híbridos estables con el polinucleótido objetivo de interes. Las mutaciones, inserciones y deleciones se pueden producir en una determinada secuencia polinucleotídica de muchas maneras, y estos métodos son conocidos para la persona medianamente experto en la téenica. Otros métodos pueden llegar a conocerse en el futuro.

Tecnolog ía de PCR: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una síntesis repetitiva, enzimática, cebada de una secuencia de ácido nucleico. Este procedimiento es ampliamente conocido y comúnmente usado por las personas expertos en esta técnica (ver Mullís, Pat. U.S. Nos. 4,683, 195, 4,683,202 y 4,800, 159; Saiki et al. , 1985). La PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de interés que es flanqueado por dos cebadores de oligonucleótidos que se hibridan con hebras opuestas de la secuencia objetivo. Los cebadores están preferentemente orientados con los extremos 3' apuntando uno hacia otro. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del molde, recocido de los cebadores a sus secuencias complementarias, y extensión de los cebadores recocidos con una ADN polimerasa generan la amplificación del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de PCR. El producto de extensión de cada cebador puede servir como molde para el otro cebador, de tal manera que cada ciclo esencialmente duplica la cantidad del fragmento de ADN producido en el ciclo previo. Esto genera la acumulación exponencial del fragmento objetivo específico, hasta varios millones de veces en pocas horas. Al usar una ADN polimerasa termoestable como Tag polimerasa, aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus , el proceso de amplificación puede ser completamente automatizado. Otras enzimas que se pueden usar son conocidas para las personas expertos en la teenica.

Las secuencias de ADN ejemplificadas, o sus segmentos, pueden ser usados como cebadores para amplificación por PCR. Al llevar a cabo la amplificación por PCR, puede tolerarse cierto grado de falta de correspondencia entre el cebador y la plantilla. Por lo tanto, las mutaciones, las eliminaciones y las inserciones (en especial los agregados de nucleótidos en el extremo 5') de los cebadores ejemplificados se encuentran dentro del alcance del objeto de la invención. Las mutaciones, las inserciones y las eliminaciones pueden llevarse a cabo en un cebador dado a través de métodos conocidos para cualquier experto en la técnica.

Modificación de genes v proteínas: Los genes y las proteínas objeto pueden ser fundidos con otros genes y proteínas para producir proteínas quiméricas o de fusión. Los genes y las proteínas útiles de acuerdo con el objeto de la invención incluyen no solo las secuencias especialmente ejemplificadas de longitud completa sino tambien porciones, segmentos y/o fragmentos (incluso fragmentos contiguos e internos y/o eliminaciones terminales comparadas con las moléculas de longitud completa) de sus secuencias, variantes, mutaciones, quiméricos y fusiones. Las proteínas de la presente invención pueden presentar aminoácidos sustituidos siempre y cuando mantengan la actividad funcional conveniente. Los genes “variantes” tienen secuencias de nucleótidos que codifican las mismas proteínas o proteínas equivalentes con actividad equivalente o similar a una proteína ilustrativa.

Los dos mejores resultados de las búsquedas BLAST con la secuencia de nucleótidos de AAD-12 nativo muestran un nivel razonable de homología (aproximadamente 85%) de más de 120 pares base de secuencia. Podría esperarse que la hibridación bajo determinadas condiciones incluya estas dos secuencias. Ver GENBANK Acc. Nos. DQ406818.1 (89329742; Rhodoferax) y AJ6288601 .1 (44903451 ; Sphingomonas). Rhodoferax es muy similar a Delftia pero Sphingomonas es una clase completamente diferente desde el punto de vista filogenético.

Los términos “proteínas variantes” y “proteínas equivalentes” hacen referencia a proteínas con la misma actividad biológica/funcional, o esencialmente la misma, respecto de los sustratos objetivos y de las secuencias equivalentes como las proteínas ilustrativas. De la forma usada en la presente, el término “secuencia equivalente” hace referencia a secuencias con sustituciones, eliminaciones, agregados o inserciones de aminoácidos que mejoran o no afectan la actividad de manera adversa hasta cierto punto significativo. Los fragmentos que mantienen la actividad tambien son incluidos en esta definición. Los fragmentos y otros equivalentes que mantienen la misma función o actividad o una función o actividad similar como un fragmento correspondiente de una proteína ilustrativa se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los cambios, como las sustituciones o los agregados de aminoácidos, pueden llevarse a cabo por varios motivos, como ser aumentada (o reducir) la estabilidad de la proteasa de la proteína (sin reducir en forma material/sustancial la actividad funcional de la proteína), eliminar o agregar un sitio de restricción, etcétera. Las variantes de los genes pueden ser construidas con facilidad mediante el uso de téenicas estándar por ejemplo, para mutaciones puntuales.

Además, la Patente Estadounidense 5,605,793, por ejemplo, describe métodos para generar una diversidad molecular adicional a través del uso de remontaje de ADN después de una fragmentación aleatoria o específica. Esto puede hacerse referencia como “barajado” de genes, que implica, típicamente, la combinación de fragmentos (de un tamaño conveniente) de dos o más moléculas diferentes de ADN , seguido de varias renaturalizaciones. Esto puede mejorar la actividad de una proteína codificada por un gen de partida. El resultado es una proteína quimérica con una actividad mejorada, una especificidad de sustrato alterada, una estabilidad enzimática mayor, una estereoespecificidad modificada u otras características.

El “barajado” puede ser diseñado y especificado despues de obtener y examinar las coordenadas atómicas 3D (tridimensionales) y la estructura cristalina de una proteína en cuestión. De esta forma, el “barajado específico” puede estar dirigido a ciertos segmentos de una proteína que resulten ideales para modificar, como los segmentos expuestos a la superficie, y de preferencia, no los segmentos internos que están involucrados con el pliegue de proteínas y la integridad estructural tridimensional fundamental.

Los cambios específicos al “sitio activo” de la enzima pueden llevarse a cabo de forma que afecten la funcionalidad inherente respecto de la actividad o de la estereoespecificidad. Muller et al. (2006). La estructura cristalina tauD conocida se usó como un modelo dioxigenasa para determinar residuos del sitio activo mientras está unida a su taurina sustrato inherente. Elkins et al. (2002) “X-ray crystal structure of Escherichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous ¡ron and substrates,” Biochemistry 41 (16):5185-5192. En cuanto a la optimización de la secuencia y la capacidad de designación de sitios activos de la enzima, ver Chakrabarti et al. , PNAS, (23 de agosto de 2005), 102 (34): 12035-12040.

Los fragmentos de los genes de longitud completa se pueden producir usando exonucleasas o endonucleasas disponibles en el mercado según procedimientos estándar. Por ejemplo, las enzimas como Bal31 o mutagenesis dirigida al sitio pueden ser usadas para separar nucleótidos en forma sistemática de los extremos de estos genes. Asimismo, los genes que codifican fragmentos activos pueden obtenerse usando una variedad de enzimas de restricción . Las proteasas pueden usarse para obtener directamente fragmentos activos de estas proteínas.

Dentro del alcance de la invención, como se describe en la presente, se encuentran las proteínas que se pueden truncar y que todavía conservan la actividad funcional. Por “proteína truncada”, se hace referencia a que una porción de una proteína puede ser segmentada mientras que la proteína truncada restante conserva y exhibe la actividad deseada después de la segmentación . La segmentación se puede lograr a través de diversas proteasas. Además, las proteínas segmentadas en forma efectiva pueden ser producidas usando téenicas de biología molecular donde las bases de ADN que codifican dicha proteína son eliminadas ya sea a través de la digestión con endonucleasas de restricción u otras técnicas disponibles para el experto en la técnica. Después del truncamiento, tales proteínas pueden ser expresadas en sistemas heterólogos como E. coli, baculovirus, sistemas virales basados en plantas, levaduras, y similares, y después, son colocadas en ensayos con insectos como se describe en este documento para determinar la actividad. Es bien conocido en la técnica que las proteínas truncadas pueden ser producidas con exito para que conserven la actividad funcional, mientras que con menos de toda la secuencia de longitud completa. Por ejemplo, las proteínas Bt se pueden usar en una forma truncada (proteína de núcleo) (ver, por ejemplo, Hofte et al. (1989), y Adang et al. (1985)). Como se usa aquí, el término “proteína” puede incluir truncamientos funcionalmente activos.

A menos que se lo especifique de otra forma, como se usa en este documento, el porcentaje de identidad de secuencia y/o similitud de dos ácidos nucleicos se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, modificado como en Karlin y Altschul, 1993. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. , 1990. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se realizan con el programa N BLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12. Gapped BLAST se puede usar como se describe en Altschul et al. , 1997. Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, (NBLAST y XBLAST) se usan los parámetros por defecto de los programas respectivos. Ver el sitio web NCBI/NI H . Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, se usó la función AlignX del Vector NTI Suite 8 (InforMax, Inc. , North Bethesda, MD, EE.UU .), usando los parámetros por defecto. Estos eran: una penalidad de apertura Gap de 15, una penalidad de extensión de Gap de 6.66, y un intervalo de penalidad de separación de Gap de 8.

Tabla 1 Clase de aminoácido Ejemplos de aminoácidos no polar Ala, Val, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp polar sin carga Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn , Gln ácido Asp, Glu básico Lys, Arg , His Varias propiedades y características tridimensionales de la proteína tambien pueden ser cambiadas sin afectar en forma negativa la actividad/funcionalidad de la proteína. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden ser toleradas/pueden ser realizadas de forma de no afectar de manera negativa la actividad y/o la configuración tridimensional de la molécula. Los aminoácidos pueden ser colocados en las siguientes clases: no polares, polares sin carga, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las cuales un aminoácido de una clase es reemplazado por otro aminoácido del mismo tipo se encuentran dentro del alcance de la presente invención siempre que la sustitución no sea adversa a la actividad biológica del compuesto. La Tabla 1 proporciona una lista de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase. En algunos casos, también pueden realizarse sustituciones no conservadoras. Sin embargo, las sustituciones de preferencia no disminuyen en forma significativa la actividad funcional/biológica de la proteína.

Como se usa en la presente, la referencia a polinucleótidos “aislados” y/o proteínas “purificadas” indica estas moleculas cuando no están asociadas con las otras moléculas con las que se encuentran en la naturaleza. Por lo tanto, la referencia a “aislado” y/o “purificado” significa la participación de la “mano del hombre”, como se describe en la presente. Por ejemplo, un “gen” bacteriano de la presente invención puesto en una planta para su expresión es un “polinucleótido aislado”. Del mismo modo, una proteína derivada de una proteína bacteriana y producida por una planta es una “proteína aislada”.

Debido a la degeneración/redundancia del código genético, una variedad de diferentes secuencias de ADN puede codificar las secuencias de aminoácidos descritas en la presente. En la experiencia de una persona entrenada en la téenica se encuentra la creación de secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas proteínas o esencialmente las mismas. Estas secuencias de ADN variantes están dentro del alcance de la presente invención. Esto también se analiza en mayor detalle a continuación en la sección titulada “Optimización de la secuencia para la expresión en plantas”.

Optimización de la secuencia para la expresión en plantas: Para obtener una alta expresión de genes heterólogos en plantas, en general, se prefiere rediseñar los genes para que se expresen de manera más eficiente en (el citoplasma de) las células de la planta. El maíz es una de estas plantas en las que puede ser preferible volver a diseñar el o los genes heterólogos antes de la transformación para aumentar su nivel de expresión en dicha planta. Por lo tanto, una etapa adicional en el diseño de genes que codifican una proteína bacteriana es el nuevo diseño de un gen heterólogo para una expresión óptima, usando la preferencia de codones más estrechamente alineados con la secuencia objetivo de la planta, ya sea una especie dicotiledónea o monocotiledónea. Las secuencias tambien pueden ser optimizadas para la expresión en cualquiera de los tipos más particulares de plantas analizados en otra parte de la presente.

Huéspedes transgénicos: Los genes que codifican la proteína de la presente invención pueden ser introducidos en una amplia variedad de microbios o plantas huésped. La presente invención incluye células de plantas transgénicas y plantas transgénicas. Las plantas de preferencia (y las células de plantas) son maíz, Arabidopsis, tabaco, soja, algodón, cañóla, arroz, trigo, césped, forrajes de leguminosas (por ejemplo, alfalfa y trébol), pastos, y similares. También pueden producirse otros tipos de plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención, como frutas, hortalizas, plantas ornamentales y árboles. Más en general, pueden usarse dicotiledóneas y/o monocotiledóneas en diversos aspectos de la presente invención.

En modalidades de preferencia, la expresión del gen da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular (y mantenimiento) de la o las proteínas de interés. Las plantas pueden ser transformadas en resistentes a los herbicidas de esta manera. Tales huespedes pueden ser mencionados como células y/o huéspedes transgénicos, recombinantes, transformados y/o transfectados. En algunos aspectos de esta invención (en los casos de clonación y preparación del gen de interés, por ejemplo), las células microbianas (de preferencia bacterianas) pueden ser producidas y usadas de acuerdo con las téenicas estándar, con el beneficio de la presente descripción.

Las células vegetales transfectadas con un polinucleótido de la presente invención se pueden regenerar en plantas completas. La presente invención incluye cultivos de células, incluso cultivos de tejidos celulares, cultivos líquidos y cultivos en placas. Las semillas producidas plantas y/o las usadas para generar plantas de la presente invención también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Otros tejidos de las plantas y sus partes también se incluyen en la presente invención. La presente invención incluye, asimismo, métodos de producción de plantas o células que comprenden un polinucleótido de la presente invención. Un método de producción de preferencia de tales plantas es logra al sembrar una semilla de la presente invención.

Aunque las plantas pueden ser de preferencia, la presente invención también incluye la producción de AAD-12 recombinante altamente activa, por ejemplo, en una cepa huésped de Pseudomonas fluorescens (Pf). El presente invención incluye temperaturas preferidas de crecimiento para el mantenimiento de AAD-12 activa soluble en este huesped, un estado de fermentación donde se produce AAD-12 como más del 40% de proteína celular total, o al menos 10 g/l; los resultados de un proceso de purificación de alta recuperación de AAD-12 activa 5 recombinante a partir de un huésped Pf; un esquema de purificación que produce al menos 10 g de AAD-12 activa por kilogramo de células; un esquema de purificación que puede producir 20 g de AAD-12 activas por kilogramo de células; un proceso de formulación que puede almacenar y restaurar la ío actividad de AAD-12 en solución, y un proceso de liofilización que puede retener la actividad de AAD-12 para su almacenamiento a largo plazo y la vida útil.

Inserción de genes para formar huéspedes transgénicos: Un aspecto de la presente invención es la 15 transformación/transfección de plantas, células de plantas, y otras células huésped con los polinucleótidos de la presente invención que expresan proteínas de la presente invención. Las plantas transformadas de esta manera pueden pasar a ser resistentes a una gran variedad de herbicidas con diferentes 20 modos de acción.

Se dispone de una amplia variedad de métodos para la introducción de un gen que codifica una proteína conveniente en el huésped objetivo en condiciones que permiten el mantenimiento estable y la expresión del gen. Estos métodos son 25 bien conocidos por los expertos en la téenica y se describen, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5, 135,867.

Los vectores que comprenden un polinucleótido AAD-12 se incluyen en el alcance de la presente invención. Por ejemplo, un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las celulas transformadas están disponibles para la preparación de la inserción de genes foráneos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, la serie pUC, la serie M 13 mp, pACYC184, etcétera. Por consiguiente, la secuencia que codifica la proteína puede ser insertada en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante es usado para la transformación en E. coli. Las células de E. coli son cultivadas en un medio nutriente adecuado, después, se las recoge y se las somete a tisis. El plásmido es recuperado mediante purificación a partir de ADN genómico. El análisis de secuencia, el análisis de restricción, la electroforesis y otros métodos biológicos bioquímico-moleculares se llevan a cabo generalmente como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada puede ser digerida por restricción y puede ser unida a la siguiente secuencia de ADN . Cada secuencia de plásmido puede ser clonada en el mismo plásmido o en otros. Según el método de inserción de genes conveniente en la planta, pueden necesitarse otras secuencias de ADN . Si, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri es usado para la transformación de la célula vegetal, entonces al menos el borde derecho, pero a menudo el borde derecho y el izquierdo del plásmido Ti o R¡ de ADN-T, tiene que estar unido como debe estar insertada la región flanqueante de los genes. El uso de ADN-T para la transformación de celulas vegetales ha sido intensamente investigado y descrito en el documento EP 120,516; Hoekema (1985); Fralcy et al. (1986), y An et al. (1985).

Se encuentra disponible un gran número de téenicas para insertar ADN en una célula huésped vegetal. Esas técnicas incluyen la transformación con ADN-T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección , biolística (bombardeo de micropartículas), filamentos de carburo de silicio, radiación de aerosol, PEG, o la electroporación , así como otros métodos posibles. Si se usan agrobacterias para la transformación , el ADN a ser insertado tiene que ser clonado en plásmidos especiales, a saber, ya sea en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homóloga debido a secuencias que son homologas a las secuencias en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermedios no pueden replicarse en agrobacterias. El vector intermedio puede ser transferido a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse tanto en E. coli como en agrobacterias. Comprenden un gen marcador de selección y un ligador o poliligador que están enmarcados por las regiones límites del ADN-T derecho e izquierdo. Pueden ser transformados directamente en agrobacterias (Holsters, 1978). La agrobacteria usada como celula huésped debe comprender un plásmido que lleva una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T en la célula vegetal. Pueden contener ADN-T adicional. La bacteria así transformada es usada para la transformación de las células vegetales. Pueden cultivarse explantes de las plantas en forma ventajosa con Agrobacterium tumefaciens o con Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal. Después, pueden regenerarse plantas enteras a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para su selección. Pueden realizarse ensayos en las plantas así obtenidas para comprobar la presencia del ADN insertado. No hay exigencias especiales para los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible usar plásmidos comunes, como, por ejemplo, derivados de pUC.

Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera usual. Pueden formar células germinales y transmitir el o los rasgos transformados a plantas de la progenie. Tales plantas pueden ser cultivadas de la manera normal y pueden ser cruzadas con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes. En algunas modalidades preferidas de la invención, los genes que codifican la proteína bacteriana son expresados a partir de unidades transcripcionales insertadas en el genoma de la planta. De preferencia, tales unidades transcripcionales son vectores recombinantes capaces de una integración estable en el genoma de la planta y permiten la selección de líneas de plantas transformadas que expresan ARNm que codifica las proteínas.

Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma, es relativamente estable allí (y no volverá a salir). Como resulta normal, contiene un marcador de selección que confiere a las celulas vegetales transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico, como kanamicina, G418, bleomicína, higromicina, o cloranfenicol, entre otros. Los marcadores de plantas susceptibles de ser seleccionados también pueden proporcionar, de forma típica, resistencia a varios herbicidas como glufosinato (por ejemplo, PAT/bar), glifosato (EPSPS), inhibidores de ALS (por ejemplo, imidazolinonas, sulfonilureas, triazolopirimidina sulfonanilida, et al.), bromoxinilo, resistencia al inhibidor de HPPD, inhibidores de PPO, inhibidores de la ACC-ase, y muchos otros. En consecuencia, el marcador usado en forma individual debe permitir la selección de células transformadas en vez de células que no contienen el ADN insertado. El o los genes de interes son expresados, de preferencia, ya sea por activadores constitutivos o inducibles en la célula de la planta. Una vez expresado, el ARNm se traduce en proteínas, incorporando así los aminoácidos de interés en la proteína. Los genes que codifican una proteína expresada en las células de la planta pueden estar bajo el control de un activador constitutivo, un activador de tejido específico, o un activador inducible.

Existen varias téenicas para introducir vectores recombinantes foráneos en células vegetales, y para obtener plantas que se mantienen estables y expresan el gen introducido. Tales técnicas incluyen la introducción de material genético revestido sobre micropartículas directamente en las células (Patente Estadounidense No. 4,945,050 de Cornell y 5, 141 , 131 de DowEIanco, ahora Dow AgroSciences, LLC). Además, las plantas pueden transformarse usando la tecnología de Agrobacterium, ver la Patente Estadounidense No. 5, 177,010 de la Universidad de Toledo y la 5, 104,310 de Texas A&M, la Solicitud de Patente Europea No. 0131624B1 , las solicitudes de patente europea No. 120,516, 159418B1 y 176, 1 12 de Schilperoot, las Patentes Estadounidenses No. 5, 149,645, 5,469,976, 5,464,763 y 4,940,838 y 4,693,976 de Schilperoot; las solicitudes de patente europea No. 1 16718, 290799, 320500, todas de Max Planck, las solicitudes de patentes europeas 604662 y 627752, y la Patente Estadounidense No. 5,591 ,616, de Japan Tobacco, las solicitudes de patentes europeas 0267159 y 0292435, y la Patente estadounidense No. 5,231 ,019, todas a Ciba Geigy, hoy Syngenta, las Patentes Estadounidenses No. 5,463, 174 y 4,762,785, ambas de Calgene, y las Patentes Estadounidenses No. 5,004,863 y 5, 159, 135, ambas de Agracetus. Otra teenología de la transformación incluye la tecnología de los filamentos. Ver las Patentes Estadounidenses No. 5,302,523 y 5,464, 765, ambas de Zeneca, ahora Syngenta. Otra tecnología de la transformación de la administración directa de ADN incluye la tecnología de radiación de aerosol. Ver la Patente Estadounidense No. 6,809,232. La tecnología de electroporación tambien ha sido usada para transformar plantas. Ver el documento WO 87/06614del Instituto Boyce Thompson; las Patentes Estadounidenses No. 5,472,869 y 5,384,253, ambas de Dekalb, y los documentos WO 92/09696 y WO 93/21335, ambos de Plant Genetic Systems. Además, los vectores virales también pueden ser usados para producir plantas transgénicas que expresan la proteína de interés. Por ejemplo, las plantas monocotiledóneas pueden transformarse con un vector viral usando los métodos descritos en la Patente Estadounidense No. 5,569,597 de Mycogen Plant Science y Ciba-Geigy (ahora Syngenta), así como en las Patentes Estadounidenses No. 5,589,367 y 5,316,931 , ambas de Biosource, ahora Large Scale Biology.

Como se mencionó con anterioridad , la manera en la que se introduce el constructo de ADN en la planta huésped no es fundamental para esta invención. Puede usarse cualquier método que proporciona una transformación eficiente. Por ejemplo, en la presente se describen diversos metodos para la transformación de células de plantas y se incluye el uso de plásmidos Ti o Ri y similares para llevar a cabo la transformación mediada por Agrobacterium. En muchos casos, resultará conveniente contar con el constructo usado para la transformación bordeada en uno o ambos lados por los límites de ADN-T, más específicamente, por el borde derecho. Esto es particularmente útil cuando el constructo usa Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como modo para la transformación, aunque los bordes del ADN-T pueden encontrar uso con otros modos de transformación. Cuando se usa Agrobacterium para la transformación de la célula vegetal, puede usarse un vector que puede ser introducido en el huésped para la recombinación homóloga con ADN-T o el plásmido Ti o Ri presente en el huésped. La introducción del vector puede llevarse a cabo a través de la electroporación, apareamiento triparental y otras téenicas para transformar bacterias gram-negativas que son conocidas para los expertos en la técnica. La forma de transformación del vector en la Agrobacterium huésped no es fundamental para esta invención. El plásmido Ti o Ri que contiene el ADN-T para la recombinación puede ser capaz o incapaz de provocar la formación de agallas, y no es fundamental para dicha invención , siempre que los genes vir estén presentes en dicho huésped.

En algunos casos en los que se usa Agrobacterlum para la transformación, el constructo de expresión que se encuentra dentro de los límites del ADN-T se inserta en un vector de amplio espectro, como pRK2 o sus derivados como se describe en Ditta et al. (1980) y EPO 0 120 515. Dentro del constructo de expresión y del ADN-T se encontrarán incluidos uno o más marcadores como se describe en este documento, que permiten la selección de Agrobacterium transformada y celulas vegetales transformadas. El marcador particular usado no es esencial para esta invención, donde el marcador de preferencia depende del huésped y de la construcción usada.

Para la transformación de células vegetales usando Agrobacterium, los explantes pueden combinarse y pueden ser incubados con la Agrobacterium transformada durante un tiempo suficiente para permitir su transformación . Después de la transformación, las Agrobacterias son eliminadas por la selección con el antibiótico apropiado y las células vegetales son cultivadas en el medio selectivo apropiado. Una vez que se forman callos, la formación de brotes puede estimularse mediante el uso de las hormonas de plantas apropiadas de acuerdo con métodos bien conocidos en la téenica del cultivo de tejido vegetal y la regeneración de plantas. Sin embargo, una etapa intermedia de callo no siempre es necesaria. Después de la formación de brotes, tales células vegetales pueden ser transferidas a un medio que estimule la formación de raíces completando con ello la regeneración vegetal. Las plantas pueden ser cultivadas a continuación para que den semillas y tales semillas pueden ser usadas para establecer las generaciones futuras. Independientemente de la teenica de transformación, el gen que codifica una proteína bacteriana se incorpora, de preferencia, a un vector de transferencia del gen adaptado para expresar dicho gen en una célula vegetal incluyendo en el vector, un elemento regulador activador de la planta, así como en las regiones de terminación de la transcripción no traducidas 3' como Nos y similares.

Además de las numerosas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes foráneos puede variar también. Tal tejido incluiría, pero sin limitarse al tejido embriogénico, tejido de callo de tipos I , I I , y I I I, hipocotilo, meristema, tejido de raíz, tejidos para la expresión en el floema, y similares. Casi todos los tejidos vegetales pueden transformarse durante la desdiferenciación usando técnicas apropiadas descritas en la presente.

Como se mencionó con anterioridad, una variedad de marcadores susceptibles de ser seleccionados pueden ser usados, de resultar conveniente. La preferencia por un marcador particular queda a criterio del experto, pero cualquiera de los siguientes marcadores susceptibles de ser seleccionados puede ser usada junto con cualquier otro gen no listado en este documento, que podría funcionar como un marcador seleccionare. Tales marcadores seleccionables incluyen, pero sin limitarse al gen de aminoglucósido fosfotransferasa del transposón Tn5 (Aph I I) que codifica resistencia a la los antibióticos kanamicina, neomicina y G41 ; resistencia a la higromicina, resistencia al metotrexato, asi como a aquellos genes que codifican para la resistencia o tolerancia a glifosato; fosfinotricina (bialafos o glufosinato); herbicidas inhibidores de ALS (imidazolinonas, sulfonilureas y herbicidas de triazolopirimidina), inhibidores de la ACC-asa (por ejemplo, airiloxipropionatos o ciclohexanodionas), y otros como bromoxinilo, y los inhibidores de HPPD (por ejemplo, mesotriona) y el similares.

Además de un marcador seleccionable, puede resultar conveniente usar un gen indicador. En algunos casos, un gen indicador puede ser usado con o sin un marcador seleccionable. Los genes indicadores son genes que típicamente no se presentan en el organismo o tejido receptor y típicamente codifican para las proteínas resultantes en algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Ejemplos de tales genes se proporcionan en Weising et al. , 1988. Los genes indicadores de preferencia incluyen la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli, el gen de cloranfenicol acetil transferasa de Tn9 de E. coli, la proteína fluorescente verde de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria, y los genes de luciferasa de luciernaga Photinus pyralis. Un ensayo para detectar la expresión del gen indicador puede entonces llevarse a cabo en un momento adecuado despues de que dicho gen haya sido introducido en las células receptoras. Un ensayo de preferencia como este implica el uso del gen que codifica beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli como se describe en Jefferson et al. , (1987) para identificar las células transformadas.

Además de los elementos reguladores del activador de plantas, pueden usarse de manera eficiente elementos reguladores activadores procedentes de una variedad de fuentes en las células vegetales para expresar genes foráneos. Por ejemplo, pueden usarse los elementos reguladores del activador de origen bacteriano, como el activador de octopina sintasa, el activador de nopalina sintasa, el activador de manopina sintasa; activadores de origen viral, como el virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S), 35T (que es un activador rediseñado 35S, ver la Patente Estadounidense No. 6, 166,302, en especial el Ejemplo 7E) y similares. Los elementos reguladores activadores de plantas incluyen, pero sin limitarse, ribulosa-1 ,6-bisfosfato (RUBP) carboxilasa de la subunidad pequeña (ssu), activador de beta-conglicinina, activador de beta-faseolina, activador de ADH, activadores de choque térmico y activadores específicos de tejido. Otros elementos como regiones de fijación de matriz, regiones de unión al andamiaje, intrones, potenciadores, secuencias de poliadenilación y similares pueden estar presentes y por lo tanto, pueden mejorar la eficacia de la transcripción o la integración del ADN . Tales elementos pueden o no pueden ser necesarios para la función del ADN , aunque pueden proporcionar una mejor expresión o funcionamiento del ADN al afectar la transcripción, la estabilidad del mRNA, y similares. Tales 5 elementos pueden estar incluidos en el ADN como se desee para obtener un rendimiento óptimo del ADN transformado en la planta. Los elementos típicos incluyen, pero sin limitarse, Adh-intrón 1 , Adh-intrón 6, la secuencia guía de la proteína de recubrimiento del virus de mosaico de la alfalfa, las secuencias de osmotina ío UTR, la secuencia guía de la proteína de recubrimiento del virus de estrías del maíz, así como otras disponibles para un experto en la teenica. También pueden usarse elementos reguladores activadores constitutivos dirigiendo de ese modo la expresión génica continua en todos los tipos de células y en todo momento 15 (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S, y similares). Los elementos reguladores activadores específicos de tejido son responsables de la expresión génica en células específicas o tipos de tejidos, como las hojas o las semillas (por ejemplo, zeína, oleosina, napina, ACP, globulina y similares) y éstos 0 también pueden ser usados.

Los elementos reguladores activadores también pueden ser activos (o inactivos) durante una cierta etapa de desarrollo de la planta, así como activos en los tejidos y órganos vegetales. Ejemplos de estos incluyen , pero sin limitarse, elementos 5 reguladores activadores específicos del polen, específicos del embrión, específicos de la barba del choclo, específicos de fibra de algodón, específicos de la raíz, específicos del endosperma de la semilla, o específicos de la etapa vegetativa y similares. Bajo ciertas circunstancias, puede ser deseable usar un elemento regulador activador inducible, que es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, como: estímulo físico (genes de choque termico), luz (RUBP carboxilasa), hormona (Em), metabolitos, productos químicos (sensibles a la tetracielina), y el estrés. Se pueden usar otros elementos de transcripción y traducción convenientes que funcionan en las plantas. Numerosos vectores específicos de la planta de transferencia de genes son conocidos en la téenica.

Los sistemas basados en virus de ARN de planta también pueden ser usados para expresar la proteína bacteriana. De este modo, el gen que codifica una proteína puede ser insertado en la región del activador de recubrimiento de un virus de planta adecuado que pueda infectar la planta huésped de interés. La proteína puede expresarse entonces proporcionando una protección de la planta al daño del herbicida. Los sistemas basados en virus de ARN de planta se encuentran descritos en la Patente Estadounidense No. 5,500,360 de Mycogen Plant Sciences, Inc. y en las Patentes Estadounidenses No. 5,316,931 y 5,589,367 de Biosource, ahora Large Scale Biology.

Medios para aumentar aún más la tolerancia o los niveles de resistencia. Se muestra en este documento que pueden impartirse nuevos rasgos de resistencia a herbicidas a las plantas de la presente invención sin efectos adversos observables sobre el fenotipo incluyendo el rendimiento. Tales plantas están dentro del alcance de la presente invención. Las plantas ejemplificadas y sugeridas en esta descripción pueden soportar niveles de aplicación típicos 2, 3, 4 y 5 veces mayores, por ejemplo, de al menos un herbicida sujeto. Las mejoras en estos niveles de tolerancia están dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, diversas teenicas son conocidas en la técnica, y previsiblemente, pueden ser optimizadas y desarrolladas aún más, para incrementar la expresión de un gen dado.

Uno de tales métodos incluye el aumento del número de copias de los genes sujeto AAD-12 (en casetes de expresión y similares). También pueden seleccionarse eventos de transformación para los que tienen múltiples copias de los genes.

Pueden usarse fuertes activadores y potenciadores para “sobrecargar” la expresión. Ejemplos de tales activadores incluyen el activador 35T de preferencia que usa potenciadores 35S. 35S, ubiquitina de maíz, ubiquitina de Arabidopsis, A. T. actina y activadores CSMV se encuentran incluidos para tales usos. También se prefieren otros activadores virales fuertes. Los potenciadores incluyen 4 OCS y el potenciador doble 35S. También pueden usarse regiones de unión a la matriz (MAR) para aumentar la eficiencia de transformación y expresión de los transgénes.

Tambien pueden usarse factores de barajado (evolución dirigida) y de transcripción para modalidades de acuerdo con la presente invención.

Las proteínas variantes también pueden ser diseñadas de forma que difieran en el nivel de secuencia, pero manteniendo la misma estructura general esencial o similar en tres dimensiones, la distribución de carga de superficie, y similares. Ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 7,058,515; Larson et al., Protein Sci 2002 1 1 :2804-2813, “Thoroughly sampling sequence space: Large-scale protein design of structural ensembles”; Crameri et al. , Nature Biotechnology 15, 436-438 (1997), “Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling”; Stemmer, W. P. C. 1994. “DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution” Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 91 : 10747-10751 ; Stemmer, W. P. C. 1994. “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling” Nature 370: 389-391 ; Stemmer, W. P. C. 1995. Searching sequence space. Bio/Technology 13: 549-553; Crameri, A. , et al. 1996. “Construction and evolution of antibody-phage librarles by DNA shuffling” Nature Medicine 2: 100-103; and Crameri, A. , et al. 1996. “Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling” Nature Biotechnology 14: 315-319.

La actividad de los polinucleótidos recombinantes insertados en células de plantas puede depender de la influencia de ADN vegetal endógeno adyacente a la inserción. Por lo tanto, otra opción es aprovechar de los que ya se saben son excelentes lugares en un genoma de la planta para las inserciones. Ver, por ejemplo, el documento WO 2005/103266 A1 , en relación con eventos de algodón cry1 F y Cryl Ac; el gen AAD-12 sujeto puede ser sustituido en los loci del genoma en lugar de las inserciones cry1 F y/o Cryl Ac. Por lo tanto, la recombinación homologa dirigida, por ejemplo, puede ser usada de acuerdo con la presente invención. Este tipo de teenología es el objeto, por ejemplo, del documento WO 03/080809 A2 y de la correspondiente solicitud estadounidense publicada No. 20030232410, en relación con el uso de dedos de zinc para la recombinación específica. Tambien se conoce el uso de recombinasas (cre-10 x flp y frt, por ejemplo).

Se considera que la desintoxicación de AAD-12 se produce en el citoplasma. Por lo tanto, los medios para estabilizar aún más esta proteína y ARNm (incluyendo el bloqueo de la degradación de ARNm) se incluyen en los aspectos de la presente invención, y pueden aplicarse las técnicas conocidas en la técnica en consecuencia. Las proteínas en cuestión pueden ser diseñadas para resistir la degradación por proteasas y similares (los sitios de segmentación de la proteasa pueden ser eliminados con eficacia mediante el nuevo diseño de la secuencia de aminoácidos de la proteína). Tales modalidades incluyen el uso de estructuras de bucle madre 5 'y 3' como UTRs de osmotina, y per5 (secuencias 5' ricas en AU no traducidas). Tambien pueden usarse grupos de 5 tapas como 7-metilo o 2'-O-metilo, por ejemplo, residuo de ácido 7-metilguanílico. Ver, por ejemplo: Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU . Vol. 74, No. 7, páginas 2734 a 2738(julio de 1977) “Importance of 5'-terminal blocking structure to stabilize mRNA in eukaryotic protein synthesis”. También pueden usarse complejos de proteínas o grupos de bloqueo del ligando. Asimismo, puede llevarse a cabo un diseño en computadora de UTR 5 ' o 3' más adecuado para AAD-12 (horquillas sintéticas) dentro del ámbito de la invención objeto. Los modelos computarizados en general, así como de barajados de genes y evolución dirigida, son analizados en este documento más adelante. En forma más específica, con respecto modelado por computadora y UTRs, las téenicas de modelado por computadora para su uso en la predicción/evaluación de UTR 5 'y 3' de los derivados de la presente invención incluyen, pero sin limitarse, las siguientes: MFoId versión 3.1 comercializada por Genetics Corporation Group, Madison, Wl (ver Zucker et al, Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. In RNA Biochemistry and Biotechnology, 1 1 -43, J . Barciszewski & B. F. C. Clark, eds. , NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999); Zucker et al. , Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure. J. Mol. Biol. 288, 91 1 -940 (1999); Zucker et al. , RNA Secondary Structure Prediction. En “Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry” S. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D. Glick y R. A. Jones eds. , John Wilcy & Sons, Nueva York, 1 1 .2.1 -1 1 .2.10, (2000)), COVE (“RNA structure analysis using covariance models (stochastic context free grammar methods)”) v. 2.4.2 (Eddy & Durbin, Nucí. Acids Res. 1994, 22: 2079-2088) de libre distribución en código fuente y que se puede descargar accediendo a la página web genetics.wust1 .edu/eddy/software/ y FOLDALIGN, tambien de distribución gratuita y disponible para su descarga en la página web biomf.au.dk. FOLDALIGN / (ver Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences. J . Gorodkin, L. J. Heyer and G. D. Stormo. Nucleic Acids Research, Vol. 25, no. 18 pp 3724-3732, 1997; Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences. J. Gorodkin, L. J . Heyer, and G. D. Stormo. ISMB 5; 120-123, 1997).

Las modalidades de la presente invención pueden ser usadas junto con mutantes evolucionados de forma natural o químicamente inducida (los mutantes pueden ser seleccionados por medio de téenicas de detección, después transformados con AAD-12 y posiblemente otros genes). Las plantas de la presente invención pueden ser combinadas con la resistencia a ALS y/o resistencia al glifosato evolucionado. La resistencia a Aminopyralid, por ejemplo, también puede ser combinada o “apilada” con un gen AAD-12.

Las teenicas tradicionales de reproducción también pueden ser combinadas con la presente invención para combinar, llevar a cabo una introgresión y mejorar significativamente los rasgos deseados.

Otras mejoras también incluyen el uso con protectores apropiados para proteger aún más las plantas y/o para añadir resistencia cruzada a más herbicidas. Los protectores normalmente actúan para aumentar el sistema inmunológico de las plantas mediante la activación/expresión de cP450. Los protectores son agentes químicos que reducen la fitotoxicidad de los herbicidas a las plantas de cultivo por un mecanismo fisiológico o molecular, sin comprometer la eficacia de control de malezas.

Los protectores de herbicidas incluyen benoxacor, cloqumtocet, ciometrinil, diclormid , diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, isoxadifen, mefenpir, mefenato, anhídrido naftálico y oxabetrinilo. Los activadores de plantas (una nueva clase de compuestos que protegen a las plantas mediante la activación de sus mecanismos de defensa) también se pueden usar en modalidades de la presente invención. Estos incluyen acibenzolar y probenazol.

Pueden usarse protectores comercializados en el mercado para la protección de los cultivos de hierbas de semillas grandes, como el maíz, el sorgo de grano y el arroz sembrado en agua, contra herbicidas incorporados previo a la siembra o herbicidas aplicados antes de una emergencia de las familias tiocarbamato y cloroacetanilida. Los protectores tambien se han desarrollado para proteger los cultivos de cereales de invierno, como el trigo, contra aplicaciones posteriores a una emergencia de herbicidas de ariloxifenoxipropionato y sulfonilurea. También se establece el uso de protectores para la protección del maíz y del arroz contra herbicidas de sulfonilurea, imidazolinona, ciclohexanodiona, isoxazol y tricetona. Una mejora inducida por un protector de desintoxicación de herbicida en plantas con protección es ampliamente aceptada como el principal mecanismo implicado en la acción protectora. Los protectores inducen cofactores como las enzimas glutatión y desintoxicantes de herbicidas como la glutatión S-transferasa, las monooxigenasas del citocromo P450 y glucosilo transferasas. Hatzios K. K. , Burgos N (2004) “Metabolism-based herbicide resistance: regulation by safeners”, Weed Science: Vol. 52, No. 3, páginas 454 a 467.

El uso de un gen de citocromo P450 monooxigenasa apilado con AAD-12 es una modalidad de preferencia. Hay P450 involucradas en el metabolismo de los herbicidas; cP450 puede ser de origen mamífero o vegetal, por ejemplo. En las plantas superiores, se sabe que la citocromo P450 monooxigenasa (P450) lleva a cabo un metabolismo secundario. También juega un papel importante en el metabolismo oxidativo de los xenobióticos en cooperación con la NADPH-citocromo P450 oxidorreductasa (reductasa). La resistencia a algunos herbicidas ha sido reportada como un resultado del metabolismo de P450, así como la glutatión S-transferasa. Se ha caracterizado una cantidad de especies de P450 microsomales involucradas en el metabolismo de xenobióticos en los mamíferos mediante clonación molecular. Se informó que algunos de ellos metabolizan varios herbicidas de manera eficiente. Por lo tanto, las plantas transgenicas con plantas o P450 de mamíferos pueden mostrar resistencia a varios herbicidas.

Una modalidad de preferencia de lo anterior es el uso de cP450 para la resistencia a acetoclor (los siguientes son productos a base de acetoclor: Surpass®, Keystone®, Keystone LA, FulTime® y TopNotch®, todos ellos, herbicidas) y/o trifluralina (como ser Treflan®). Tal resistencia en la soja y/o maíz está incluida en algunas modalidades de preferencia. Para un asesoramiento adicional con respecto a tales modalidades, ver, por ejemplo, Inui et al. , “A selectable marker using cytochrome P450 monooxygenases for Arabidopsis transformation”, Plant Biotechnology 22, 281 -286 (2005) (en relación con un sistema de selección para la transformación de Arabidopsis thaliana mediante Agrobacterium tumefaciens que usa citocromo P450 monooxigenasas humanas que metabolizan herbicidas; los plantines resistentes a los herbicidas fueron transformados y seleccionados con los herbicidas acetoclor, amiprofos-metilo, clorprofam, clorsulfurón, norflurazón y pendimetalina); Siminszky et al, “Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobáceo enhances the metabolism of phenylurea herbicides,” PNAS Vol. 96, Issue 4, 1750-1755, Feb. 16, 1999; Sheldon et al, Weed Science: Vol. 48, No. 3, páginas 291 a 295, “A cytochrome P450 monooxygenase cDNA (CYP71 A10) confers resistance to linuron in transgenic Nicotiana tabacum”; y “Phytoremediation of the herbicides atrazine and metolachlor by transgenic rice plants expressing human CYP1 A1 , CYP2B6, and CYP2C 19,” J Agrie Food Chem. 2006 Abril 19; 54(8):2985-91 (en relación con las pruebas de citocromo P450 monooxigenasa humana de arroz donde las plantas de arroz al parecer mostraron una alta tolerancia a la cloroacetamidas (acetocloro, alacloro, metoacloro, pretilacloro y tenilcloro), oxiacetamidas (mefenacet), piridazinonas (norflurazón), 2,6-dinitroanalinas (trifluralina y pendimetalina), fosfamidatos (amiprofos-metilo, tiocarbamatos (piributicarb) y ureas (clortolurón)). También existe la posibilidad de alterar o usar diferentes químicos de 2,4-D para que los genes AAD-12 objeto sean más eficientes. Tales cambios posibles incluyen la creación de mejores sustratos y mejores grupos de partida (mayor electronegatividad). Los inhibidores del transporte de auxina (por ejemplo, diflufenzopir) también pueden ser usados para aumentar la actividad herbicida con 2,4-D.

Salvo que se lo indique expresa o implícitamente, los términos “un”, “una”, “la” y “el” significa “al menos uno”, como se usa en la presente. Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes provisionales y publicaciones a las que se refiere la presente o fueran citadas en este documento, se incorporan a modo de referencia en su totalidad en la medida en que no sean incompatibles con las enseñanzas explícitas de esta memoria.

A continuación, se presentan ejemplos que ilustran los procedimientos para la práctica de la invención. Estos ejemplos no deben ser interpretados como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezclas de solventes son en volumen a menos que se lo indique de otra manera.

Ejemplos Ejemplo 1 Metodo para la identificación de genes que imparten resistencia a 2,4-D en plantas Como una manera de identificar los genes que poseen actividades de degradación de herbicidas en plantas, es posible extraer bases de datos públicas actuales, como del NCBI (Centro Nacional de Información de Bioteenología). Para comenzar con el proceso, es necesario contar con una secuencia de gen funcional ya identificado que codifique una proteína con las características deseadas (es decir, la actividad de a-cetoglutarato dioxigenasa). Esta secuencia de la proteína se usa entonces como la entrada para BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997) que es un algoritmo para comparar secuencias de proteínas NCBI disponibles ddeeppoossiittaaddaass.. CCoonn llaa configuración predeterminada, esta búsqueda vuelve, en forma ascendente, 100 secuencias de proteínas homologas en diferentes niveles. Estos van desde altamente identico (85 - 98%) hasta de muy baja identidad (23 - 32%) en el nivel de aminoácidos. Se esperarían tradicionalmente que sólo secuencias con alta homología retengan propiedades similares a la secuencia de entrada. En este caso, se seleccionaron sólo secuencias con ³ 50% de homología. Como se ejemplifica en este documento, la clonación y la expresión recombinante de homólogos con tan poco como 31 % de conservación de aminoácidos (en relación con TFDA de Ralstonia eutropha) pueden ser usadas para impartir niveles comerciales de resistencia no sólo al herbicida previsto, sino también a los sustratos nunca probados con anterioridad con estas enzimas.

Un solo gen (AEPD) fue identificado a partir de la base de datos del NCBI (ver el sitio web ncbi.nlm. nih.gov; código de acceso AF516752) como un homólogo con sólo el 31 % de identidad de aminoácidos con TFDA. El porcentaje de identidad se determinó traduciendo en primer lugar tanto la secuencia de ADN SDPA como la secuencia de ADN TFDA depositadas en la base de datos para las proteínas, y después, usando ClustalW en el paquete de software VectorNTI para llevar a cabo la alineación de secuencias múltiples.

Ejemplo 2 Optimización de la secuencia para la expresión en plantas y bacterias Para obtener niveles más altos de expresión de genes heterólogos en plantas, puede ser preferible rediseñar la secuencia que codifica la proteína de los genes de forma que se expresen de manera más eficiente en las celulas vegetales. El maíz es una de estas plantas en las que puede ser preferible volver a diseñar la región de codificación de la proteína heteróloga antes de la transformación para aumentar el nivel de expresión del gen y el nivel de proteína codificada en la planta. Por lo tanto, una etapa adicional en el diseño de genes que codifican una proteína bacteriana es el nuevo diseño de un gen heterólogo para una expresión óptima.

Tabla 2 : Recopilación del contenido de G + C de las regiones de codificación de proteínas de los genes de maíz Clase de proteína3 Intervalo % G + C Media % G + CD Enzimas Metabólicas (76) 44.4-75.3 59.0 (±8.0) Proteínas Estructurales 48.6-70.5 63.6 (±6.7) (1 8) Proteínas Regulatorias (5) 57.2-68.8 62.0 (±4.9) Proteínas no 41 .5-70.3 64.3 (±7.2) Caracterizadas (9) Todas las Proteínas (108) 44.4-75.3 60.8 (±5.2)c cantidad de genes en la clase entre paréntesis. b desviaciones estándar entre paréntesis. c media de grupos combinados ignorada en el cálculo de la media.

Una de las razones para el nuevo diseño de una proteína bacteriana para su expresión en el maíz es el contenido no óptimo de G + C del gen nativo. Por ejemplo, el muy bajo contenido de G + C de muchos genes bacterianos nativos (y la consiguiente inclinación hacia el alto contenido de A + T) tiene como resultado la generación de secuencias que imitan o duplican las secuencias de control de genes de plantas que se sabe que son altamente ricas en A + T. La presencia de algunas secuencias ricas en A + T dentro del ADN del o de los genes introducidos en las plantas (por ejemplo, regiones de caja TATA que se encuentran normalmente en los activadores de genes) puede dar como resultado la transcripción aberrante del o de los genes. Por otro lado, la presencia de otras secuencias reguladoras que residen en el ARNm transcrito (por ejemplo, secuencias de señal de poliadenilación (AAUAAA), o secuencias complementarias a ARN nucleares pequeños involucrados en el corte y empalme de pre-ARNm) puede conducir a la inestabilidad del ARN . Por lo tanto, un objetivo en el diseño de genes que codifican una proteína bacteriana para la expresión de maíz, mencionada de mayor preferencia como gen o genes optimizados de plantas, es generar una secuencia de ADN que presente un mayor contenido de G + C, y de preferencia, uno cercano al de los genes de maíz que codifican enzimas metabólicas. Otro objetivo en el diseño optimizado del o de los genes de la planta que codifican una proteína bacteriana es generar una secuencia de ADN en la que las modificaciones de secuencia no dificulten la traducción. La Tabla 2 muestra que tan alto es el contenido de G + C en el maíz. Para los datos de la Tabla 2, las regiones codificantes de los genes fueron extraídas de entradas del GenBank (publicación 71 ), y las composiciones base fueron calculadas usando el programa MacVector™ (Accelerys, San Diego, CA). Secuencias. Las secuencias de intrones fueron ignoradas en los cálculos.

Debido a la plasticidad otorgada por la redundancia/degeneración del código genético (es decir, algunos aminoácidos son especificados por más de un codón), la evolución de los genomas en diferentes organismos o clases de organismos ha dado como resultado el uso diferencial de los codones redundantes. Esta “preferencia codónica” se refleja en la composición base media de las regiones de codificación de proteínas. Por ejemplo, los organismos con contenidos de G + C relativamente bajos usan codones que tienen A o T en la tercera posición de los codones redundantes, mientras que los que tienen mayores contenidos de G + C usan codones que tienen G o C en la tercera posición. Se cree que la presencia de codones “menores” dentro de un ARNm puede reducir la velocidad de traducción absoluta de ese ARNm, en especial cuando la abundancia relativa del ARNt cargado que corresponde al codón de menor importancia es baja. Una extensión de esto es que la disminución de la velocidad de traducción por los codones menores individuales sería al menos aditiva para múltiples codones menores. Por lo tanto, los ARNm que tienen contenidos relativos elevados de codones menores tendrían velocidades de traducción bajas, en comparación. Esta velocidad se refleja en los bajos niveles subsiguientes de la proteína codificada.

Tabla 3. Codones de aminoácidos de preferencia expresados en el maíz Aminoácido Codón* alanina GCC/GCG cisteína TGC/TGT ácido aspártico GAC/GAT ácido glutámico GAG/GAA fenilalanina TTC/TTT glicina GGC/GGG histidina CAC/CAT isoleucina ATC/ATT licina AAG/AAA leucina CTG/CTC metionina ATG asparagina AAC/AAT prolina CCG/CCA glutamina CAG/CAA arginina AGG/CGC serina AGC/TCC treonina ACC/ACG valina GTG/GTC triptófano TGG trirosina TAC/TAT stop TGA/TAG Al diseñar genes que codifican una proteína bacteriana de expresión del maíz (u otra planta, como el algodón o la soja), se determina la preferencia codónica de la planta. La preferencia codónica para el maíz es la distribución estadística de codones que usa la planta para codificar sus proteínas y el uso del codón de preferencia se muestra en la Tabla 3. Despues de determinar la preferencia, se determina el porcentaje de frecuencia de los codones en el o los genes de interés. Los codones principales preferidos por la planta deben ser determinados, así como las segunda, la tercera y la cuarta opciones de codones de preferencia cuando existen múltiples alternativas. Una nueva secuencia de ADN puede entonces ser diseñada para que codifique la secuencia de aminoácidos de la proteína bacteriana, pero la nueva secuencia de ADN difiere de la secuencia de ADN bacteriano nativo (que codifica la proteína) por la sustitución de los codones (preferidos en primero, segundo, tercero o cuarto lugar) de plantas para especificar el aminoácido en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Se analiza entonces la nueva secuencia en busca de los sitios de enzimas de restricción que podrían haberse creado por la modificación. Los sitios identificados son modificados en forma adicional mediante la sustitución de los codones con los codones seleccionados preferidos en primero, segundo, tercero o cuarto lugar. Otros sitios en la secuencia que podrían afectar a la transcripción o traducción del gen de interés son las uniones de exón:intrón (5' o 3'), las señales de adición de poli A o las señales de terminación de polimerasa de ARN . La secuencia es analizada en forma adicional y se la modifica para reducir la frecuencia de dobletes TA o GC. Además de los dobletes, los bloques de secuencia G o C que tienen más de alrededor de cuatro residuos que son los mismos pueden afectar la transcripción de la secuencia. Por lo tanto, estos bloques tambien son modificados mediante la sustitución de los codones de la primera o segunda elección, etcétera. , con el siguiente codón de elección preferido.

Se prefiere que el o los genes optimizados de planta que codifican una proteína bacteriana contenga alrededor de 63% de codones de primera elección, entre alrededor de 22% y alrededor de 37% de codones de segunda elección, y entre alrededor de 15% y alrededor de 0% de codones de tercera o cuarta elección, donde el porcentaje total es 100%. Los porcentajes de mayor preferencia de todos respecto del o de los genes optimizados de planta son de alrededor del 63% de los codones de primera elección, de al menos alrededor del 22% de codones de segunda elección, de alrededor del 7.5% de codones de tercera elección y de alrededor de 7.5% de codones de cuarta elección, donde el porcentaje total es 100%. El método descrito anteriormente le permite a un experto en la téenica modificar el o los genes que son foráneos a una planta en particular por lo que los genes se expresan de manera óptima en las plantas. El método se ilustra con más detalle en la solicitud PCT WO 97/13402. Por lo tanto con el fin de diseñar genes optimizados de plantas que codifican una proteína bacteriana, se diseña una secuencia de ADN para codificar la secuencia de aminoácidos de dicha proteína usando un código genetico redundante establecido a partir de una tabla de preferencia codónica compilada a partir de las secuencias de genes para la o las plantas particulares. La secuencia de ADN resultante tiene un mayor grado de diversidad de codones, una composición base conveniente, puede contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción colocados en forma estratégica, y carece de secuencias que pudieran interferir con la transcripción del gen, o con la traducción del ARNm producto. Por lo tanto, los genes sintéticos que son funcionalmente equivalentes a las proteínas/genes de la presente invención pueden ser usados para transformar huéspedes, incluyendo plantas. Puede encontrarse un asesoramiento adicional con respecto a la producción de genes sintéticos, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5,380,831 .

Análisis de reconstrucción de AAD 12- de planta: Un análisis amplio de los 876 pares bases (pb) de la secuencia de ADN de la región de codificación de AAD-12 nativo (SEC ID No. : 1 ) describió la presencia de varios motivos de secuencia que se cree que es perjudicial para la expresión óptima de la planta, así como una composición no óptima de codón. La proteína codificada por la SEC I D No.: 1 (AAD-12) se presenta como SEC I D No. : 2. Para mejorar la producción de la proteína recombinante tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas, se desarrolló una secuencia de ADN “optimizada para plantas” AAD-12 (v1 ) (SEC I D No.: 3) que codifica una proteína (SEC ID No.: 4) que es la misma que la SEC I D No. : 2 nativa excepto por el agregado de un 5 residuo de alanina en la segunda posición (subrayada en la SEC ID No.: 4). El codón de alanina adicional (GCT; subrayado en la SEC ID No.: 3) codifica parte de un sitio de reconocimiento de enzima de restricción Ncol (CCATGG) que comprende el codón ATG de inicio de la traducción. Por lo tanto, sirve al doble ío propósito de facilitar las operaciones de clonación posteriores al tiempo que mejora el contexto de la secuencia que rodea el codón de inicio ATG para optimizar el comienzo de la traducción. Las proteínas codificadas por las regiones de codificaciones nativas y optimizadas para plantas (v1 ) son identicas en un 99.3% , y 15 difieren sólo en el aminoácido número 2. Por el contrario, las secuencias de ADN nativas y optimizadas para plantas (v1 ) de las regiones codificantes son sólo idénticas en un 79.7%.

La Tabla 4 muestra las diferencias en las composiciones de codones de las secuencias nativas (Columnas A y D) y de las 0 secuencias optimizadas para plantas (columnas B y E), y permite la comparación con una secuencia optimizada para plantas teórica (columnas C y F).

Resulta evidente a partir del examen de la Tabla 4 que las regiones codificantes nativas y optimizadas para plantas, 5 mientras codifican proteínas casi idénticas, son sustancialmente diferentes entre sí. La versión optimizada para plantas (v1 ) imita estrechamente la composición de codones de una región codificante optimizada para plantas teórica que codifica la proteína de AAD-12.

. Comparaciones de la composición de codones de regiones ntes de AAD- Í2 nativo. Versión optimizada de planta (v1 ) y versión optimizada de planta teórica.

Tabla 4. Comparaciones de la composición de codones de regiones codificantes de AAD- 12 nativo. Versión optimizada de planta (v1 ) y versión optimizada de planta teórica.

Reconstrucción para la expresión de E. coli\ Con frecuencia, las cepas de Escherichia coli y los sistemas de vectores asociados diseñados especialmente son usados para producir cantidades relativamente grandes de proteínas para estudios bioquímicos y analíticos. A veces, se descubre que un gen nativo que codifica la proteína deseada no es muy adecuado para una expresión en E. coli de alto nivel, a pesar de que el organismo fuente para el gen puede ser de otro genero de bacterias. En tales casos, es posible y conveniente volver a diseñar la región de codificación de la proteína del gen para que sea más adecuada para la expresión en E. coli. Los genes de E. coli de clase I I son definidos como aquellos que son altamente expresados y en forma continua durante la fase de crecimiento exponencial de células de E. coli. (Henaut, A. y Danchin, A. (1996) en la biología molecular y celular de Escherichia coli y Salmonella typhimurium, vol. 2, páginas 2047 a 2066. Neldhardt, F. , Curtiss III , R. , Ingraham, J. , Lin, E., Low, B. , Magasanik, B. , Reznikoff, W. Rilcy, M . , Schaechter, M. y Umbarger, H . (eds.) de la Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC). A través del examen de las composiciones de codones de las regiones codificantes de los genes de E. coli de clase II , se puede diseñar una composición promedio de codones para estas regiones codificantes de genes de clase I I de E. coli.

Se cree que una región de codificación de la proteína que tiene una composición promedio de codón que imita la de los genes de clase I I se verá favorecida para la expresión durante la etapa de crecimiento exponencial de E. coli. Al hacer uso de estos lineamientos generales, se diseñó una nueva secuencia de ADN que codifica la proteína de AAD-12 (SEC I D No. : 4); incluyendo la alanina adicional en la segunda posición, como se mencionó con anterioridad), de acuerdo con la composición promedio de codones de las regiones que codifican el gen E. coli de Clase I I. Además, la secuencia inicial, cuyo diseño se basó solo en la composición del codón, fue diseñada para que incluya determinadas secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción adecuadas para la clonación en vectores de expresión de E. coli. Se evitaron características de secuencia perjudiciales como las estructuras de horquilla altamente estables, como lo eran las secuencias homólogas intragenicas respecto del extremo 3' de los ARN 16S ribosomal (secuencias de L e. Shine Dalgarno). La secuencia de optimizada para E. coli (v2) es descrita como SEC ID No. : 5 y codifica la proteína descrita en la SEC ID No. : 4.

Las secuencias de ADN nativas y optimizadas para E. coli (v 2) son idénticas en un 84.0%, mientras que las secuencias de ADN optimizadas para plantas (v1 ) y optimizadas para E. coli (v2) son idénticas en un 76.0%. La Tabla 5 presenta las composiciones de codones de la región nativa codificadora de AAD-12 (columnas A y D), una región que codifica AAD-12 optimizada para la expresión en E. coli (v2; las columnas B y E) y la composición de un codón de la región de codificación teórica para la proteína AAD-12 que tiene una composición de codón óptima de genes de E. coli de Clase II (columnas C y F).

Resulta evidente a partir del examen de la Tabla 6 que las regiones de codificación nativas y optimizadas para E. coli, mientras que codifican proteínas casi identicas, son sustancialmente diferentes entre sí. La versión optimizada para E. coli (v2) imita estrechamente la composición de codones de una región de codificación teórica optimizada para E. coli que codifica la proteína AAD-12.

Tabla 5. Comparaciones de composiciones de codones de regiones codificantes de AAD-12 nativo, versión optimizada de E. coli (v2) y versión optimizada de clase I I teórica de E. coli.

Tabla 5. Comparaciones de composiciones de codones de regiones codificantes de AAD- 12 nativo, versión optimizada de E. coli (v2) y versión optimizada de clase I I teórica de E. coli.

Diseño de una secuencia de ADN de preferencia codónica de la soja que codifica una EPSPS de soja que tiene mutaciones que confieren tolerancia al glifosato. Este ejemplo enseña el diseño de una nueva secuencia de ADN que codifica una 5-enolpiruvoilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de soja mutada, pero está optimizada para la expresión en celulas de soja. La secuencia de aminoácidos de una EPSPS de soja triplemente mutada es descrita como SEC ID No. : 5 del documento WO 2004/009761 . Los aminoácidos mutados en la secuencia descrita de esta forma se encuentran en el residuo 183 (treonina de la proteína nativa reemplazada por isoleucina), en el residuo 186 (arginina en la proteína nativa reemplazada por lisina), y en el residuo 187 (prolina en la proteína nativa reemplazada por serina). Por lo tanto, se puede deducir la secuencia de aminoácidos de la proteína EPSPS de soja nativa mediante la sustitución de los aminoácidos sustituidos de la SEC ID No. : 5 del documento WO 2004/009761 con los aminoácidos nativos en las posiciones apropiadas. Tal secuencia de la proteína nativa se da a conocer como SEC I D No. : 20 de PCT/US2005/014737 (presentada el 2 de mayo de 2005). Una secuencia de proteína de EPSPS de soja doblemente mutada, que contiene una mutación en el residuo 183 (treonina de la proteína nativa reemplazada por isoleucina), y en el residuo 187 (prolina en la proteína nativa reemplazada por serina) es descrita como SEC I D No. : 21 de PCT/US200 5/014737.

Se obtuvo una tabla de uso de codones para las secuencias de codificación de proteína de soja Glycine max), calculadas a partir de 362,096 codones (alrededor de 870 secuencias de codificación), en el sitio web de “kazusa.or.jp/codon”. Esos datos fueron reformateados como se muestra en la Tabla 6. Las columnas D y H de la Tabla 6 presentan las distribuciones (en % de uso de todos los codones para ese aminoácido) de codones sinónimos para cada aminoácido, como se encuentran en las regiones de codificación de proteínas de genes de soja. Es evidente que algunos codones sinónimos para algunos aminoácidos (un aminoácido puede ser especificado por 1 , 2, 3, 4 o 6 codones) están presentes rara vez en las regiones de codificación de proteínas de soja (por ejemplo, compare el uso de los codones GCT y GCG que especifican alanina). Se calculó el uso de codones de soja de preferencia a partir de los datos de la Tabla 6. Los codones que se encuentran en los genes de soja de menos de alrededor de 10% de los casos totales para el aminoácido particular fueron ignorados. Para equilibrar la distribución de las selecciones de codones restantes para un aminoácido, se calculó una representación media ponderada para cada codón, a traves del uso de la siguiente fórmula: Porcentaje ponderado % de C1 = 1/(% C1 + %C2 + %C3 + etcétera) x %C1 x 100 donde C1 es el codón en cuestión, C2, C3, etcétera, representan los codones sinónimos restantes, y los valores del porcentaje de los codones relevantes fueron tomados de las columnas D y H de la Tabla 6 (haciendo caso omiso de los valores de codones poco comunes en negrita).

El valor del porcentaje ponderado para cada codón está dado en las columnas C y G de la Tabla 6. Se eligió TGA en forma arbitraria como codón de terminación de la traducción. Las frecuencias de uso de codones de preferencia fueron despues introducidas en una tabla especializada de código genético para ser usada por el programa de diseño de genes OptGene™ (de Ocimum Biosolutions LLC, Indianápolis, I n d . ) .

Tabla 6. Representación de codones sinónimas en secuencias codificantes de proteína de soja, y cálculo de una representación de codones sesgada establecida para el diseño de genes sintéticos optimizados de soja.

Tabla 6. Representación de codones sinónimas en secuencias codificantes de proteína de soja, y cálculo de una representación de codones sesgada establecida para el diseño de genes sinteticos optimizados de soja.

Tabla 6. Representación de codones sinónimas en secuencias codificantes de proteína de soja, y cálculo de una representación de codones sesgada establecida para el diseño de genes sinteticos optimizados de soja.

Para derivar una secuencia de ADN optimizada para soja que codifica la proteína EPSPS doblemente mutada, la secuencia de la proteína de SEC ID No. : 21 de PCT/US2005/014737 fue traducida en forma inversa por el programa OptGene™ usando el código genético de preferencia de soja obtenido anteriormente. La secuencia de ADN inicial así obtenida fue entonces modificada por cambios de codón compensadores (al tiempo que se conservó la representación media ponderada general para los codones) para reducir los números de dobletes CG y TA entre los codones adyacentes, aumentar el número de dobletes CT y TG entre los codones adyacentes, eliminar estructuras secundarias intracadenas altamente estables, suprimir o añadir los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, y eliminar otras secuencias que podrían ser perjudiciales para manipulaciones de clonación o expresión del gen diseñado. Se hicieron nuevos refinamientos de la secuencia para eliminar los posibles sitios de empalme de intrones, largas carreras de residuos de A/T o C/G , y otros motivos que podrían interferir con la estabilidad del ARN , la transcripción o traducción de la región de codificación en las celulas vegetales. Otros cambios fueron realizados para eliminar los largos marcos de lectura abiertos internos (marcos distintos de +1 ). Estos cambios se hicieron todos dentro de las limitaciones de retención de la composición de codón de preferencia de soja como se describió con anterioridad, y preservando al mismo tiempo la secuencia de aminoácidos descrita como SEC I D No. : 21 de PCT/US2005/014737.

La secuencia de ADN de preferencia de soja que codifica la proteína EPSPS de la SEC ID No. : 21 es descrita como bases 1 -1575 de SEC I D No. : 22 de PCT/US2005/014737. Se llevó a cabo la síntesis de un fragmento de ADN que comprende la SEC I D No. : 22 de PCT/US2005/014737 a traves de un proporcionador comercial (PicoScript, Houston TX).

Ejemplo 3 Clonación de vectores de expresión y de transformación Construcción de E. coli, vector de expresión de pET: Al usar las enzimas de restricción correspondientes a los sitios agregados con los conectores de clonación adicionales (Xba 1 , Xho 1 ), se extrajo AAD-12 (v2) del vector picoscript, y se lo unión a un vector resistente de pET280 estreptomicina/espectinomicina. Los productos ligados fueron después transformados en E. coli TOP10F', y fueron sembrados en caldo de Luria + 50 mg/ml en placas de agar de estreptomicina y espectinomicina (LB S/S).

Para diferenciar entre AAD-12 (v2): ligaduras pET280 y pCR2.1 : pET280, se recogieron alrededor de 20 colonias aisladas en 6 mi de LB-S/S, y se cultivaron a una temperatura de 37°C durante 4 horas con agitación. A continuación, se colocó cada cultivo sobre placas de LB + kanamicina de 50 pg/ml, que fueron incubadas a una temperatura de 37°C durante la noche. Se supone que las colonias que crecieron en el LB-K tienen el vector pCR2.1 unido, y fueron descartadas. Se aislaron los plásmidos a partir de los cultivos restantes de la misma forma que antes, y se verificó la corrección con la digestión por Xbai/Xhol. Al constructo de expresión final se le dio la designación de PDAB3222.

Construcción del vector de expresión de Pseudomonas: Inicialmente, se clonó el marco de lectura abierto de AAD-12 (v2) en el vector de expresión de pET modificado (Novagen), “pET280 S/S”, como un fragmento de Xbal-Xhol . El plásmido pDAB725 resultante fue confirmado con la digestión con enzimas de restricción y reacciones de secuenciación. El marco de lectura abierto de AAD-12 (v2) de pDAB725 fue transferido al vector de expresión de Pseudomonas, pMYC1803, como un fragmento de Xbal-Xhol . Las colonias positivas fueron confirmadas mediante la digestión con enzimas de restricción. Se transformó el constructo completado pDAB739 en las cepas de expresión de Pseudomonas MB217 y MB324.

Finalización de vectores binarios: El gen optimizado para plantas AAD-12 (v1 ) fue recibido de Picoscript (se completó el diseño de reconstrucción de gen (ver más arriba) y se subcontrató a Picoscript para la construcción) y se verificó la secuencia (SEC I D No. : 3) en forma interna, para confirmar que no había alteraciones de la secuencia esperada. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo con los cebadores M13 directo (SEC ID No. : 6) y M 13 inverso (SEC I D No. : 7) usando el kit de reactivos de Beckman Coulter “Dye Terminator Cycle Sequencing Kit” de inicio rápido como en los casos anteriores. Se analizaron los datos de secuencia y los resultados indicaron que no había anomalías presentes en la secuencia de ADN de AAD-12 (v1 ) optimizada para plantas. El gen AAD-12 (v1 ) fue clonado en pDAB726 como un fragmento de Neo l-Sac I . El constructo resultante fue denominado pDAB723, que contiene: [activador AtUbM O: Nt OSM 5'UTR: AAD-12 (v1 ): Nt OSM3'UTR: ORF1 poli A 3'UTR] (verificado con digestiones de restricción Pvul l y Not I). Un fragmento Not l-Not I que contiene el casete descrito fue despues clonado en el sitio Not I del vector binario pDAB3038. El vector binario resultante, pDAB724, que contiene el siguiente casete [activador AtU bi 10 : Nt OSMS'UTR: AAD-12 ( v 1 ) : Nt OSM 3'UTR: ORF1 poli A 3'UTR: activador CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR ] fue digerido por restricción (con Bam H I , Neo I , Not I , Sac I y Xmn I) para la verificación de la orientación correcta. El constructo completado verificado (pDAB724) fue usado para su transformación en Agrobacterium.

Clonación de los constructos adicionales de transformación: Todos los otros constructos creados para su transformación en especies de plantas apropiadas fueron construidos usando procedimientos similares a los descritos previamente en este documento, y otros métodos de clonación molecular estándar (Maniatis et al, 1982.).

Ejemplo 4 Transformación en Arabidopsis y su selección Condiciones de crecimiento de Arabidopsis thaliana: Se suspendió una semilla de Arabidopsis de tipo salvaje en una solución de agarosa al 0.1 % (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO).

La semilla suspendida fue almacenada a una temperatura de 4°C durante 2 días para completar los requisitos de latencia y asegurar la germinación síncrona de semillas (estratificación).

Se cubrió el producto Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, Washington) con una fina vermiculita y se lo subirrigó con solución de Hoagland hasta humedecerlo. Se dejó drenar la mezcla de suelo durante 24 horas. Se sembró la semilla estratificada sobre la vermiculita y se la cubrió con bóvedas de humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canadá) durante 7 días.

Las semillas fueron germinadas y las plantas fueron cultivadas en un Conviron (modelos CMP4030 y CMP3244, Controlled Envirornments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) bajo condiciones de día largo (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) a una intensidad de luz de 120 a 150 pmoles/m2 segundos bajo condiciones constantes de temperatura (22°C) y humedad (40 - 50%). Las plantas fueron regadas inicialmente con solución de Hoagland y despues, con agua desionizada para mantener el suelo húmedo, pero no mojado.

Transformación de Agrobacterium: Se usó una placa de agar + LB con eritromicina (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) (200 ml/l) o espectinomicina (100 mg/l) que contiene una colonia DH5a estriada para proporcionar una colonia e inocular minicultivos de preparación de 4 mi (líquido LB + eritromicina). Los cultivos fueron incubados durante la noche a una temperatura de 37°C con agitación constante. Se usó Qiagen (Valencia, CA) de Spin Mini Preps, siguiendo las instrucciones del fabricante, para purificar el ADN de plásmido.

Se prepararon celulas de Agrobacterium tumefaciens electro-competentes (cepas Z707s, EHA101 S, y LBA4404s) usando un protocolo de Weigel y Glazebrook (2002). Las células de Agrobacterium competentes fueron transformadas usando un método de electroporación adaptado de Weigel y Glazebrook (2002). Se descongelaron 50 mI de agrocélulas competentes en hielo y se añadieron 10 - 25 ng del plásmido deseado a las células. Se agregó la mezcla de ADN y células a cubetas de electroporación previamente refrigeradas (2 mm). Se usó un electroporador Eppendorf modelo 2510 para la transformación bajo las siguientes condiciones: voltaje: 2.4 kV; duración del impulso: 5 mseg.

Después de la electroporación, se agregó 1 mi de caldo YEP (por litro: 10 g de extracto de levadura, 10 g de Bacto-peptona, 5 g de NaCI) a la cubeta, y se transfirió la suspensión de células y YEP a un tubo de cultivo de 15 mi. Las células fueron incubadas a una temperatura de 28°C en un baño de agua con agitación constante durante 4 horas. Después de la incubación, se colocó el cultivo en placas sobre agar + YEP con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) (250 mg/l). Las placas fueron incubadas durante 2 - 4 días a una temperatura de 28°C .

Se seleccionaron las colonias y se las sembró en agar fresco + YEP con eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 s mg/l) y estreptomicina (250 mg/l) y las placas fueron incubadas a una temperatura de 28°C durante 1 - 3 días. Se seleccionaron colonias para análisis de PCR con el fin de verificar la presencia del inserto del gen mediante el uso de cebadores específicos del vector. Se usaron Qiagen Spin Mini Preps, según las ío instrucciones del fabricante, para purificar el ADN plásmido de las colonias de Agrobacterium seleccionadas con la siguiente excepción: se usaron 4 mi alícuotas de un minicultivo de preparación de 15 mi durante la noche (YEP líquido + eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l)) y estreptomicina (250 15 mg/l)) para purificar el ADN. Una alternativa al uso de ADN Qiagen Spin Mini Prep fue la lisis de las celulas de Agrobacterium transformadas, suspendidas en 10 ml de agua, a una temperatura de 100°C durante 5 minutos. El ADN plásmido a partir del vector binario usado en la transformación por Agrobacterium se incluyó 20 como un control. La reacción de PCR fue completada usando Taq ADN polimerasa de Takara Mirus Bio Inc. (Madison, Wl) según las instrucciones del fabricante, a concentraciones de 0.5 x. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un MJ Research Peltier Thermal Cycler programado con las siguientes condiciones: 1 ) a 5 una temperatura de 94°C durante 3 minutos; 2) a una temperatura de 94°C durante 45 segundos; 3) a una temperatura de 55°C durante 30 segundos; 4) a una temperatura de 72°C durante 1 minuto, durante 29 ciclos despues del ciclo 1 a una temperatura de 72°C durante 10 minutos. Se mantuvo la reacción a una temperatura de 4°C tras los ciclos. Se analizó la ampliación por electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se visualizó por tinción con bromuro de etidio. Se seleccionó una colonia cuyo producto de PCR era idéntico al plásmido de control.

Transformación de Arabidopsis: Se transformó Arabidopsis usando el método de inmersión floral. La colonia seleccionada fue usada para inocular uno o más de cultivos previos de 15 - 30 mi de caldo YEP que contenía eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l). Se incubaron el o los cultivos durante la noche a una temperatura de 28°C con agitación constante a 220 rpm. Cada cultivo previo fui usado para inocular dos cultivos de 500 mi de caldo YEP que contenía eritromicina (200 mg/l) o espectinomicina (100 mg/l) y estreptomicina (250 mg/l) y se incubaron los cultivos durante la noche a una temperatura de 28°C con agitación constante. Se sedimentaron las células a alrededor de 8700 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se descartó el sobrenadante resultante. Se volvió a suspender el sedimento celular con cuidado en un medio de infiltración de 500 mi con ½ x sales de Murashige y Skoog/vitaminas B5 de Gamborg , 10% (p/v) de sacarosa, 0.044 mM bencilamino purina (10 mI/litro de 1 mg/ml de caldo en DMSO) y 300 mI/litro de Silwet L-77. Se sumergieron las plantas de alrededor de 1 mes de vida en el medio durante 15 segundos, asegurándose de sumergir la inflorescencia más nueva. Despues, se apoyó las plantas por uno de sus lados y fueron tapadas (con un elemento transparente u opaco) durante 24 horas, para después lavarlas con agua y colocarlas en posición vertical. Las plantas fueron cultivadas a 22°C, con un fotoperíodo de luz diurna de 16 horas y 8 horas de oscuridad. Aproximadamente 4 semanas después de la inmersión , se recogieron las semillas.

Selección de plantas transformadas: se dejó secar la semilla T1 recién cosechada [gen 12-AAD (v1 )] durante 7 días a temperatura ambiente. Se sembró la semilla T1 en bandejas de germinación de 26.5 x 51 cm (T. O. Plastics I nc. , Clearwater, M N), donde cada una recibe una alícuota de 200 mg de semillas T1 estratificada (alrededor de 10,000 semillas) que anteriormente habían sido suspendidas en 40 mi de solución de agarosa al 0.1 % y fueron almacenadas a una temperatura de 4°C durante 2 días para completar los requisitos de latencia y asegurar la germinación síncrona de las semillas.

Se cubrió el producto Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc. , Bellevue, Washington) con vermiculita fina y fue subirrigado con solución de Hoagland hasta humedecer; después, se dejó drenar por gravedad. Cada alícuota de 40 mi de la semilla estratificada fue sembrada de manera uniforme sobre la vermiculita con ayuda de una pipeta y fue cubierta con bóvedas de humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canadá) durante 4-5 días. Las cúpulas fueron retiradas 1 día antes de la selección transformante inicial usando pulverización despues del brote con glufosinato (seleccionando para el gen PAT transformado en forma conjunta).

Siete días después de la siembra (DAP) y de nuevo a los 1 1 días después de la siembra, se pulverizaron las plantas T1 (en etapa de cotiledón y 2-4-1 f, respectivamente) con una solución al 0.2% de herbicida Liberty (200 g de ia/l de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) en un volumen de pulverización de 10 ml/bandeja (703 l/ha) con una boquilla de aire comprimido DeVilbiss para ofrecer una velocidad efectiva de 280 g ai/ha de glufosinato por aplicación. Los sobrevivientes fueron identificados (las plantas en crecimiento activo) 4 - 7 días después de la pulverización final y fueron trasplantados uno por uno en macetas de 3 pulgadas (7.62 cm) preparadas con tierra para macetas (Metro Mix 360). Se cubrieron las plantas trasplantadas con cúpulas de humedad durante 3 - 4 días y fueron colocadas en una cámara de crecimiento a una temperatura de 22°C como en el caso anterior o fueron trasladadas directamente al invernadero. Con posterioridad, se retiraron las cúpulas y se dejaron desarrollar las plantas en el invernadero (22°C ± 5°C, 50% ± 30% de humedad relativa, 14 horas de luz, 10 horas de oscuridad, mínimo 500 mE/m2 s1 luz natural + luz complementaria) al menos 1 día antes de la prueba de capacidad de AAD-12 (v1 ) (gen optimizado para plantas) para proporcionar resistencia a los herbicidas de fenoxi auxina.

Despues, se asignaron al azar plantas T1 a diferentes índices de 2,4-D. Para Arabidopsis, 50 g ae/ha de 2,4-D es una dosis eficaz para distinguir las plantas sensibles de las que tienen niveles significativos de resistencia. También se aplican índices elevados para determinar los niveles relativos de resistencia (50, 200, 800, o 3200 g ae/ha).

Todas las aplicaciones de herbicidas de auxina se hicieron usando el pulverizador DeVilbiss como se describió anteriormente para aplicar un volumen de pulverización de 703 l/ha (0.4 mi de solución/recipiente de 3 pulgadas (7.62 cm)) o fueron aplicadas por un pulverizador de pistas en un volumen de pulverización de 187 l/ha. El 2,4-D usado fue disuelto en grado téenico (Sigma, St.

Louis, MO) en DMSO y diluido en agua (< 1 % de concentración final de DMSO) o en la formulación de sal de dimetilamina comercial (456 g ae/l, NuFarm, St Joseph, MO). El diclorprop usado fue de calidad comercial formulado como sal de potasio de R-diclorprop (600 g ia/l, AH Marks). Como los índices de herbicidas aumentaron más allá de 800 g ea/ha, el pH de la solución de pulverización se hizo excesivamente ácido, lo que quemó las hojas jóvenes y tiernas de plantas de Arabidopsis y complicó la evaluación de los efectos primarios de los herbicidas. Se convirtió en una práctica estándar la aplicación de estos altos índices de herbicidas en 200 mM de tampón H EPES, con un pH de 7.5.

Se sometieron algunos individuos T1 a los herbicidas comerciales alternativos en lugar de a una fenoxi auxina. Un 5 punto de interes fue determinar si los herbicidas de piridiloxiacetato auxina, triclopir y fluoroxipir, podrían ser efectivamente degradados en la planta. Los herbicidas fueron aplicados a plantas T1 con el uso de un pulverizador de pistas en un volumen de pulverización de 187 l/ha. Se accedió en forma ío adicional a las plantas T1 que exhibieron tolerancia al 2,4-D DMA en la generación T2.

Resultados de la selección de las plantas transformadas: Las primeras transformaciones de Arabidopsis se realizaron usando AAD-12 (v1 ) (gen optimizado para plantas). En primer 15 lugar, se seleccionaron transformantes de T1 desde la base de la semilla no transformada usando un esquema de selección de glufosinato. Se seleccionaron más de 300,000 semillas T1 y se identificaron 316 plantas resistentes al glufosinato (gen PAT), lo que equivale a una frecuencia de transformación/selección de 0 0.10% que se encuentra en el intervalo normal de la frecuencia de selección de constructos donde se usó PAT + Liberty para la selección. Con posterioridad, se trasplantaron las plantas T1 seleccionadas con anterioridad, en macetas individuales, y se las pulverizó con diversas proporciones de herbicidas de 5 ariloxialcanoato comerciales.

Tabla 7. Respuesta de Arabidopsis transformada por AAD-12 v1 (optimizada en planta) a un rango de tasas de 2,4-D aplicadas posemergencia en comparación con una población resistente homocigota a AAD-1 v3 (T4), control transformado con Pat-Cry1 F, sensible a auxina.

En la Tabla 7 se compara la respuesta de ADD-12 (v1 ) y de genes de control para impartir una resistencia a la 2,4-D a los transformantes de Arabidopsis T1 . La respuesta se presenta en terminos de % de lesión visual lesión 2 WAT. Los datos se presentan en forma de un histograma de los individuos que presentan poca o ninguna lesión (< 20%), lesión moderada (20-40%), o una lesión grave (> 40%). Dado que cada T1 es un evento de transformación independiente, cabe prever una variación significativa de las respuestas T1 individuales dentro de un coeficiente dado. Tambien se indica una media aritmética y la desviación estándar para cada tratamiento. El intervalo en respuesta individual también se indica en la última columna para cada coeficiente y transformación. Arabidopsis transformado por PAT/Cry1 F sirvió como un control transformado sensible a auxina. El gen AAD-12 (v1 ) impartió una resistencia a los herbicidas a plantas individuales de Arabidopsis T1 . Dentro de un tratamiento dado, el nivel de respuesta de las plantas variaba considerablemente y puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformación independiente.

Es importante observar que para cada tipo de 2,4-D ensayado, hubo individuos que no fueron afectadas, mientras que algunos se vieron gravemente afectados. Un promedio de lesiones en la población general por coeficiente se presenta en la Tabla 7 simplemente para demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con AAD-12 (v1 ) en comparación con el tipo salvaje o los controles transformados con PAT/Cry1 F. Los niveles de las lesiones tienden a ser mayores y la frecuencia de las plantas no lesionadas fue menor con coeficientes elevados de hasta 3,200 g de ae/ha (o ~ 6 x el coeficiente de campo). Tambien con estos elevados coeficientes, la solución de pulverización se convierte en muy ácida a menos que se tamponen. Las plantas de Arabidopsis cultivadas en su mayoría en la cámara de crecimiento tienen una cutícula muy fina y los efectos de quema graves pueden complicar los ensayos hechos con estos coeficientes elevados. No obstante, muchos individuos han sobrevivido a 3,200 g de ea/ha de 2,4-D con poca o ninguna lesión.

En la Tabla 8 se muestra una respuesta a las dosis, llevada a cabo de manera similar, de T1 Arabidopsis al ácido fenoxipropiónico, diclorprop. Los datos muestran que el isómero con actividad herbicida (R-) de diclorprop no sirve como un sustrato adecuado para AAD-12 (v1 ). El hecho de que AAD-1 metabolizará el R-diclorprop lo suficientemente bien como para impartir una tolerancia comercialmente aceptable, es una característica distintiva que separa los dos genes. (Tabla 8). AAD-1 y AAD-12 se a-cetoglutarato dioxigenasas específicas para R-y S- respectivamente.

AAD-12 (v1 ) como un marcador seleccionable: la capacidad de usar AAD-12 (v1 ) como un marcador seleccionable usando 2,4-D como el agente de selección se analizó inicialmente con Arabidopsis transformada como se describe en lo que precede. Aproximadamente 50 semillas de Arabidopsis de generación T4 (homocigotos para AAD-12 (v1 )) fueron tachonadas en aproximadamente 5,000 semillas de tipo salvaje (sensible). Se compararon varios tratamientos; cada bandeja de plantas recibió sea una sea dos temporizaciones de aplicación de 2,4-D en una de los siguientes esquemas de tratamiento: 7 DAP, 1 1 DAP, o 7 seguido de 1 1 DAP. Dado que todos los individuos tambien contenían el gen PAT en el mismo vector de transformación, el AAD-12 seleccionado con 2,4-D se pudo comparar directamente con PAT seleccionado con glufosinato.

Los tratamientos se aplicaron con una punta de boquilla de pulverización DeVilbiss como descrito anteriormente. Las plantas fueron identificadas como 17 DAP resistente o sensible. El tratamiento óptimo fue de 75 g ae/ha de 2,4-D aplicado a los 7 y 1 1 días después de la plantación (DAP), fue igualmente eficaz en la frecuencia de selección, y dio lugar a una menor lesión por herbicida en los individuos transformados que el esquema de selección Liberty. Estos resultados indican que el AAD-12 (v1 ) puede usarse eficazmente como un marcador selectivo alternativo para una población de Arabidopsis transformada.

Heredabilidad : una variedad de eventos T1 fueron autopolinizadas de manera de producir semillas T2. Estas semillas fueron ensayadas en progenie mediante la aplicación de 2,4-D (200 g ae/ ha) a 100 hermanos T2 aleatorios. Cada planta T2 individual fue trasplantada a macetas de 7.5 cm cuadrados antes de la aplicación por rociado (pulverizadora de pista con coeficientes de aplicación de 187 l/ha). Setenta y cinco por ciento de las familias T1 (plantas T2) se segregadas en el modelo 1 sensible resistente 3 previsto para un único locus de predominantemente heredado con herencia mendeliana determinada mediante análisis de Chi cuadrado (P> 0.05).

Se recogieron semillas de 12 a 20 individuos T2 (semillas T3). Veinticinco hermanos T3 de cada uno de ocho familias T2 seleccionados al azar fueron ensayados en cuanto a progenie, como se ha descrito previamente. Aproximadamente un tercio de las familias T2 previstos para ser homocigóticos (poblaciones no segregante) fueron identificadas en cada linaje. Estos datos muestran que el AAD-12 (v1 ) está integrado de forma estable y se hereda de forma mendeliana hasta por lo menos tres generaciones.

Tabla 9. Comparación entre las respuestas de plantas de Arabidopsis T2 AAD-12 (v1 ) y de control transformadas, frente a diversos herbicidas auxínicos aplicados foliarmente.

Auxinas piridiloxiaceticas T ratamiento con g T riclopir 560 g ae/ha de 58 T riclopir 1 120 g ae/ha de 0 75” T riclopir 2240 g ae/ha de 75* T riclopir 280 g ae/ha de 0 75* Fluroxipir 560 g ae/ha de 2 75* Fluroxipir 1 120 g ae/ha de 3 75* Fluroxipir 2240 g ae/ha de 5 75* Fluroxipir Tabla 9. Comparación entre las respuestas de plantas de Arabidopsis T2 AAD-12 (v1 ) y de control transformadas, frente Resistencia a herbicidas por aplicaciones foliares adicionales en AAD-12 de Arabidopsis : La capacidad de AAD-12 (v1 ) para proporcionar resistencia a otros herbicidas de auxina ariloxialcanoato en Arabidopsis transgénica se determinó por aplicación foliar de varios sustratos. Las semillas T2 de Arabidopsis se estratificaron y sembraron en placas de selección al igual que la de Arabidopsis. Una línea de control transformada que contiene PAT y el gen de resistencia a insectos Cry1 F se plantó de una manera similar. Las plántulas se transfirieron a macetas individuales de 3 pulgadas (7.62 cm) en el invernadero. Todas las plantas se pulverizaron con el uso de un pulverizador automático ajustado a 187 l/ha. Las plantas se pulverizaron con una serie de herbicidas piridiloxiacetato: 280-2240 g ea/ha triclopir (Garlón 3A, Dow AgroSciences) y 280-2240 g ea/ha de fluoroxipir (Starane, Dow AgroSciences), y el metabolito 2,4-D resultantes de la actividad de AAD-12, 2.4-diclorofenol (DCP, Sigma) (en un equivalente molar a 280 a 2240 g ea/ha de 2,4-D, se usó DCP de grado teenico). Todas las aplicaciones se formularon en agua. Cada tratamiento se repitió 3-4 veces. Las plantas se evaluaron a los 3 y 14 días después del tratamiento.

Análisis molecular de AAD-12 (v1 ) Arabidopsis. El ensayo Invader (procedimiento del kit Third Wave Agbio) para el análisis del número de copias del gen PAT se realizó con el ADN total obtenido del kit Qiagen DNeasy de múltiples líneas homocigotas AAD-12 (v1 ) para determinar la integración estable de la unidad de transformación de planta que contiene PAT y AAD-12 (v1 ). El análisis supone la unión física directa de estos genes ya que estaban contenidos en el mismo plásmido.

Los resultados mostraron que todas las plantas resistentes a 2,4-D analizadas, contenían PAT (y, en consecuencia, por inferencia, AAD-12 (v1 )). El análisis del número de copias mostró insertos totales que variaron de 1 a 5 copias. Esto se correlaciona, tambien , con los datos de expresión de proteínas de DAA-12 (v1 ) que indican que la presencia de la enzima produce niveles significativamente altos de resistencia a todos los ácidos fenoxiacéticos y piridiloxiacético disponibles en el comercio.

Arabidopsis transformadas con apilamiento molecular de DAA-12 (v1 ) y un gen de resistencia al glifosato: Se produjeron semillas T1 de Arabidopsis, como se describió anteriormente, que contienen el plásmido pDAB3759 (AAD-12 (v1 ) + EPSPS) que codifica un rasgo de resistencia a glifosato putativo. Los transformantes T1 se seleccionaron usando AAD-12 (v1 ) como el marcador seleccionable como se describe. Las plantas T1 (eventos transformados individualmente fueron recuperados del primer intento de selección y se transfirieron a macetas de tres pulgadas en el invernadero como se describió anteriormente. Tres líneas de Arabidopsis control diferentes también se analizaron: Columbia-0 tipo salvaje, líneas homocigotas AAD-12 (v1 ) + PAT T4 (transformado con pDAB724) y líneas homocigotas PAT + Cry1 F (control transformado). Las plantas transformadas con pDAB3759 y pDAB724 se preseleccionaron en la etapa de plántula para tolerancia 2,4-D. Cuatro días después del trasplante, las plantas se dividieron para recibir en forma uniforme para el tratamiento foliar con pulverizador automático como se describió anteriormente con 0, 26,25, 105, 420, o 1680 g ea/ha de glifosato (Glyphomax Plus, Dow AgroSciences) en agua.

Todos los tratamientos se repitieron 5 a 20 veces. Las plantas se evaluaron a los 7 y 14 días despues del tratamiento.

La evaluación de la resistencia inicial indicó que las plantas tolerantes al 2,4-D fueron posteriormente tolerantes a glifosato cuando se compararon con la respuesta de las tres líneas de control. Estos resultados indican que se puede impartir resistencia a dos herbicidas con diferentes modos de acción, que incluyen tolerancia a 2,4-D y glifosato, lo que permite la aplicación de ambos herbicidas despues de la emergencia. Además, AAD-12 + 2,4-D se usó efectivamente como un marcador seleccionable para una verdadera selección de resistencia.

AAD-12 Arabidopsis genéticamente apilada con AAD-1 para dar un espectro más amplio de la tolerancia a los herbicidas: las plantas AAD-12 (v1 ) (pDAB724) y AAD-1 (v3) (pDAB721 ) se cruzaron recíprocamente y se recolectaron las semillas F1 . Ocho semillas F1 se plantaron y dejaron crecer para producir semillas. Se tomaron muestras de tejido de las ocho plantas F1 y se sometieron a análisis de Western para confirmar la presencia de ambos genes. Se concluyó que todas las 8 plantas ensayadas expresaron ambas proteínas AAD-1 y AAD-12. Las semillas se agruparon y dejaron secar durante una semana antes de la siembra.

Un centenar de semillas F2 se sembraron y se aplicaron 280 g ai/ha de glufosinato. Noventa y seis plantas F2 sobrevivieron a la selección de glufosinato con ajuste de una relación de segregación esperada para dos locus de ordenamiento independiente para la resistencia al glufosinato (15 R: 1 S). Las plantas resistentes a glufosinato despues se trataron con 560 g ae/ha R-diclorprop + 560 g ae/ha de triclopir, aplicado a las plantas bajo el mismo régimen de pulverización que se usaron para la otra prueba. Las plantas se clasificaron en 3 y 14 DAT. Sesenta y tres de las 96 plantas que sobrevivieron a la selección de glufosinato también sobrevivieron a la aplicación del herbicida. Estos datos son compatibles con un patrón de segregación esperada (9R: 6S) de dos rasgos dominantes de ordenamiento independiente donde cada gen da resistencia a solo uno de los herbicidas auxínicos (o bien R-diclorprop o triclopir). Los resultados indican que AAD-12 (pDAB724) se pueden apilar con éxito con AAD-1 (pDAB721 ), de este modo aumenta los herbicidas del espectro que se pueden aplicar al cultivo de interés [(2,4-D + R-diclorprop) y (2,4-D + fluoroxipir + triclopir), respectivamente].

Esto podría ser útil para llevar la tolerancia de 2,4-D a una especie muy sensible a través del apilamiento convencional de dos genes de resistencia a 2,4-D separados. Además, si se usara cualquiera de los genes como un marcador seleccionable para el tercer y cuarto gen de interés a través de actividades de transformación independientes, después cada par de genes se podría reunir mediante actividades de mejoramiento genético convencional y, posteriormente, se selecciona en la generación F1 a través de pulverizadores apareados con herbicidas que son exclusivos entre las enzimas AAD-1 y AAD-12 (como se muestra con R-diclorprop y triclopir para AAD-1 y AAD-12, respectivamente).

Otras pilas AAD tambien están dentro del alcance de la presente invención. La proteína TfdA descrita en otra parte de la presente (Streber et al.), por ejemplo, se puede usar junto con los presentes genes AAD-12 genes para impartir espectros de resistencia a herbicidas en plantas transgénicas de la presente invención.

Ejemplo 5 Transformación mediada por WHISKERS de maíz usando la selección de imazetapir Clonación de DAA-12 ( v 1 ) : El gen AAD-12 ( v 1 ) es escindido del vector pDAB3283 intermedio como un fragmento Nco1/Sac1. Este se ligó en forma direccional en el vector pDAB3403 cortado de forma similar que contiene el promotor de monocotiledónea Zmllbil . Los dos fragmentos se ligaron entre sí usando ADN T4 ligasa y se transformaron en células DH5a. Se realizaron miniprep en las colonias resultantes usando el kit de mini prep de Q IA Spin de Qiagen, y las colonias se digirieron para verificar la orientación. Este primer constructo intermedio (pDAB4100) contiene el casete ZmUbM : DAA-12 (v1 ). Este constructo se digirió con Not1 y Pvu1 para liberar el casete del gen y digerir el esqueleto no deseado. Este se ligó a pDAB2212 cortado con Not1 , que contiene el marcador seleccionable de AHAS dirigido por el promotor de la actina del arroz OsActl . El constructo final se designó pDAB4101 o pDAS1863, y contiene ZmUbi1 /AAD-12 (v1 )/ZmPer5: :OsAct1/AHAS/LZmLip.

I niciación del callo/suspensión: Para obtener embriones inmaduros para la iniciación de cultivo de callo, se realizaron cruzamientos F1 entre los progenitores A y B Hi-ll cultivados en invernadero (Armstrong et al. 1991 ). Cuando los embriones tenían 1 .0 - 1 .2 mm de tamaño (aproximadamente 9-10 días despues de la polinización), se recolectaron las espigas y se esterilizaron en superficie por depuración con jabón Liqui-Nox ®, se sumergieron en etanol 70% durante 2 - 3 minutos, después se sumergieron en lavandina comercial 20% (0.1 % de hipoclorito de sodio) durante 30 minutos.

Las espigas se enjuagaron en agua destilada estéril, y los embriones cigóticos inmaduros se extirparon asépticamente y se cultivaron en medio 15Ag 10 (medio N6 (Chu et al. , 1975), 1 .0 mg/l de 2,4-D, 20 g/l de sacarosa, 100 mg/l de hidrolizado de caseína (digesto enzimático), 25 mM de L-prolina, 10 mg/l de AgN03, 2.5 g/l de Gelrite, pH 5.8) durante 2 - 3 semanas con el escutelo orientado al media. El tejido que muestra la morfología adecuada (Welter et al. , 1995) se transfirió selectivamente a intervalos bisemanales en un medio fresco 15Ag10 durante aproximadamente 6 semanas, después se transfirió al medio 4 (medio N6, 1 .0 mg/l de 2,4-D, 20 g/l de sacarosa, 100 mg/l de hidrolizado de caseína (digesto enzimático), 6 mM de L-prolina, 2.5 g/l de Gelrite, pH 5.8) a intervalos bisemanales durante aproximadamente 2 meses.

Para iniciar los cultivos embriogenicos en suspensión, aproximadamente 3 mi de volumen de concentrado celular (PCV) del tejido de callo procedente de un solo embrión se añadieron a aproximadamente 30 mi de medio líquido H9CP + (mezcla de sales básales MS (Murashige y Skoog, 1962), vitaminas MS modificado que contienen 10 veces menos de ácido nicotíníco y 5 veces más de tiamina-HCI, 2.0 mg/l de 2,4-D, 2.0 mg/l de ácido a-naftalenacético (NAA), 30 g/l de sacarosa, 200 mg/l de hidrolizado de caseína (digesto ácido), 100 mg/l de mio-inositol, 6 mM de L-prolina, 5% v/v de agua de coco (añadido justo antes de subcultivo), pH 6.0). Los cultivos en suspensión se mantuvieron en condiciones de oscuridad en matraces Erlenmcyer de 125 mi en un agitador de temperatura controlada a 125 rpm a 28°C. Las líneas celulares normalmente se establecieron dentro de 2 a 3 meses después de la iniciación. Durante el establecimiento, las suspensiones se subcultivaron cada 3.5 días mediante la adición de 3 mi de PCV de las células y 7 mi de medio acondicionado a 20 mi de medio líquido fresco H9CP + usando una pipeta de calibre ancho. Una vez que el tejido empezó a duplicarse en el cultivo, las suspensiones aumentaron de escala y se mantuvieron en matraces de 500 mi a través de los cuales 12 mi de PCV de las células y 28 mi de medio acondicionado se transfirieron a 80 mi de medio H9CP +. Una vez que las suspensiones se establecieron completamente, se crioconservaron para su uso futuro.

Crioconservación y descongelación de suspensiones: Dos días despues de subcultivo, 4 mi de PCV de las células en suspensión y 4 mi de medio condicionado se añadieron a 8 mi de crioprotector (disuelto en medios H9CP + sin agua de coco, 1 M de glicerol, 1 M de DMSO, 2M de sacarosa, esterilizado por filtración) y se dejó agitar a 125 rpm a 4°C durante 1 hora en un matraz de 125 mi. Después de 1 hora se añadieron 4.5 mi a un frasco crio Corning de 5.0 mi frío. Una vez llenos los frascos individuales se mantuvieron durante 15 minutos a 4°C en un congelador de velocidad controlada, después se dejaron congelar a una tasa de -0.5°C/minuto hasta alcanzar una temperatura final de -40°C. Después de alcanzar la temperatura final, los frascos se transfirieron a cajas de las gradillas dentro de una unidad de almacenamiento 4 CryoPlus (Form a Scientific) cargado con vapores de nitrógeno líquido.

Para la descongelación, los frascos se retiraron de la unidad de almacenamiento y se colocaron en un recipiente de hielo seco cerrado, y después se sumergió en un baño de agua mantenido a 40 - 45°C hasta la disminución del “punto de ebullición”. Cuando se descongeló, los contenidos se vertieron sobre una pila de ~ 8 papeles de filtro Whatman estériles de 70 mm (No. 4) en placas de Petri 100 x 25 mm cubiertas. Se dejó absorber el líquido en los filtros durante varios minutos, después el filtro superior que contiene las células se transfirió al medio GN6 (medio N6, 2.0 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sacarosa, 2.5 g/l de Gelrite, pH 5.8) durante 1 semana. Después de 1 semana, sólo el tejido con una morfología prometedora se transfirió fuera del papel de filtro directamente en el medio fresco GN6. Este tejido se subcultivo cada 7 - 14 días hasta que se dispuso de 1 a 3 gramos para la iniciación de la suspensión en aproximadamente 30 mi de medio H9CP + en 125 mi de matraces Erlenmcyer. Tres mililitros de PCV se subcultivaron en medio H9CP+ fresco cada 3.5 días hasta que se obtuvo un total de 12 mi de PCV, en tal punto el subcultivo se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente.

Transformación estable: Aproximadamente 24 horas antes de la transformación, 12 mi de PCV de las celulas embriogénicas de maíz en suspensión previamente criopreservados más 28 mi de medio condicionado se subcultivaron en 80 mi de medio líquido GN6 (medio GN6 que carece de Gelrite) en un matraz Erlenmeyer de 500 mi, y se colocó en un agitador a 125 rpm a 28°C. Esto se repitió 2 veces usando la misma línea celular de manera que un total de 36 mi de PCV se distribuyó a través de 3 matraces. Después de 24 horas el medio líquido GN6 se retiró y reemplazó con 72 mi de medio osmótico GN6 S/M (medio N6, 2.0 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sacarosa, 45.5 g/l sorbitol, 45.5 g/l manitol, 100 mg/l de mio-inositol, pH 6.0) por matraz con el fin de plasmolizar las células. Los matraces se colocaron en un agitador, y se agitó a 125 rpm en la oscuridad durante 30 - 35 minutos a 28°C, y durante este tiempo se preparó una suspensión de whiskers de carburo de silicio de 50 mg/ml de mediante la adición del volumen apropiado de 8.1 mi de medio líquido GN6 S/M a ~ 405 mg de whiskers de carburo de silicio esteriles pre-tratada en autoclave (Advanced Composite Materials, I nc.).

Después de la incubación en GN6 S/M, los contenidos de cada matraz se combinaron en un frasco de centrífuga de 250 mi. Una vez que todas las células decantaron en el fondo, se extrajo el total excepto ~ 44 mi de líquido GN6 S/M y se recolectó en un matraz de 1 I estéril para su uso futuro. La suspensión pre humedecida de los whiskers se agitó en vórtex durante 60 segundos a la velocidad máxima y después se añadieron 8.1 mi al frasco, al que se añadieron 170 mg de ADN como última etapa. El frasco se colocó inmediatamente en un mezclador de pintura comercial Red Devil 5400 modificado y se agitó durante 10 segundos. Después de la agitación , se añadió el cóctel de células, medios, whiskers y el ADN a los contenidos del matraz de 1 L junto con 125 mi de medio líquido fresco GN6 para reducir el agente osmótico. Se dejó recuperar las células en un agitador a 125 RPM durante 2 horas a 28°C antes de filtrarse en papel de filtro Whatman # 4 (5.5 cm) usando una unidad recolectora de células de vidrio que estaba conectado a una línea de vacío doméstica.

Aproximadamente 2 mi de la suspensión dispersa se pipetearon sobre la superficie del filtro a medida que se extrajo el vacío. Los filtros se colocaron en placas de 60 mm x 20 del medio GN6. Las placas se cultivaron durante 1 semana a 28°C en una caja oscura.

Después de 1 semana, los papeles de filtro se transfirieron a placas de 60 x 20 mm de medio GN6 (3P) (medio N6, 2.0 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sacarosa, 100 mg/l de mio-inositol, 3 mM de imazetapir de Pursuit® DG, 2.5 g/l Gelrite, pH 5.8). Las placas se colocaron en cajas y se cultivaron durante una semana adicional.

Dos semanas después de la transformación, el tejido se incrustó mediante el estriado de todas las células sobre la placa en 3.0 mi de medio de agarosa GN6 fundido (medio N6, 2.0 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sacarosa, 100 mg/l de mio-inositol, 7 g/l de agarosa Sea Plaque, pH 5.8, autoclavado durante solo 10 minutos a 121 °C) que contiene 3 mM de imazetapir de Pursuit® DG. El tejido se disgregó y se vertieron 3 mi de agarosa y tejido uniformemente sobre la superficie de una placa de 100 x 15 mm de GN6 (3P). Esto se repitió para todas las placas restantes. Una vez incrustado, las placas se sellaron individualmente con Nescofilm® o Parafilm M ®, y después se cultivaron hasta la aparición de cepas putativas.

Protocolo para aislar la recuperación y regeneración: Los eventos transformados putativamente se aislaron de las placas incrustadas que contiene Pursuit® aproximadamente 9 semanas después de la transformación mediante la transferencia al medio de selección fresco de la misma concentración en placas de 60 x 20 mm. Si el crecimiento sostenido fue evidente después de aproximadamente 2 - 3 semanas, el evento se consideró resistente y se envió para el análisis molecular.

La regeneración se inició mediante la transferencia de tejido de callo a un medio de inducción basado en citoqumina, 28 (3P), que contiene 3 mM imazetapir de Pursuit. RTM . DG, sales y vitaminas MS, 30.0 g/l de sacarosa, 5 mg/l de BAP, 0.25 mg/l de 2,4-D, 2.5 g/l de Gelrite, pH 5.7. Las celulas se dejaron crecer en condiciones de luz baja (13 mEhtG2 s 1) durante una semana, despues con mayor luz (40 pEm 2 s 1) durante otra semana, antes de ser transferido al medio de regeneración, 36 (3P), que fue idéntico a 28 (3P), excepto que este carecía de los reguladores del crecimiento de plantas. Las plántulas pequeñas (3 - 5 cm) se retiraron y colocaron en tubos de cultivo de 150 x 25-mm que contienen medio SHGA libre de selección (sales básales y vitaminas Schenk y Hildebrandt, 1972; 1 g/l de mio-inositol, 10 g/l de sacarosa, 2.0 g/l de Gelrite, pH 5.8). Una vez que las plántulas desarrollaron un sistema de raíces y brote suficiente, se trasplantaron al suelo en el invernadero.

De los 4 experimentos, las plántulas completas, compuestas de brote y raíz se formaron in vitro sobre las placas de selección incrustadas en condiciones oscuras, sin experimentar una fase de callo tradicional. Los tejidos foliares de nueve de estos “regeneradores tempranos” se sometieron a PCR de la región codificadora y la PCR de Unidad de Transcripción de planta (PTU) para el gen AAD-12 y el casete del gen , respectivamente. Todos tenían una región codificadora de AAD-12 intacta, mientras que 3 no tenían una PTU de longitud completa (Tabla 1 1 ). Estos “regeneradores tempranos” se identificaron como 4101 eventos para diferenciarlos de los eventos derivados tradicionalmente, los cuales se identificaron como eventos de “1283”. Las plantas de 19 eventos adicionales, obtenidos a través de la selección y regeneración estándar, se enviaron al invernadero, cultivaron hasta la madurez y se sometieron a polinización cruzada con una línea endogámica patentada para producir semillas T1 . Algunos de los eventos parecen ser clones unos de otros debido a los patrones de bandas similares despues de transferencia Southern, de este modo solo estuvieron representados 14 eventos únicos. Las plantas T0 de los eventos fueron tolerantes a 70 g/ha de imazetapir. El análisis Invader (gen AHAS) indicó la complejidad de inserción que varía de 1 a> 10 copias. Trece eventos contenían la región codificadora para competir por AAD-12, sin embargo, un análisis posterior indicó que la unidad de transformación de planta completa no ha sido incorporada por nueve eventos. Ninguno de los 1863 eventos comprometidos avanzó más allá de la fase T1 y la posterior caracterización usó los eventos 4101 .

Análisis Molecular - Materiales y métodos de maíz: Recolección de tejido para aislamiento y cuantificación de ADN. El tejido fresco se coloca en tubos y se liofiliza a 4°C durante 2 días. Después de que el tejido está totalmente seco, se coloca una microesfera de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras se someten a 1 minuto de molienda en seco usando un molino de bola Kelco. Después se sigue el procedimiento de aislamiento de ADN estándar DNeasy (Qiagen, DNeasy 69109). Una alícuota del ADN extraído después se tiñe con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leen en el fluorómetro (BioTek) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/mI.

Análisis del ensayo Invader: Las muestras de ADN se diluye a 20 ng/mI, despues se desnaturalizaron por incubación en un termocielador a 95°C durante 10 minutos. La mezcla de sondas señal después se prepara usando la mezcla provista de oligo y MgCI2 (Third Wave Technologies) usando la mezcla de oligo provista y MgCI2 (Third Wave Technologies). Una alícuota de 7.5 ml se colocó en cada pocilio de la placa de ensayo Invader seguido de una alícuota de 7.5 mI de controles, estándares y muestras desconocidas diluidas 20 ng/l. Cada pocilio se revistió con 15 mI de aceite mineral (Sigma). Las placas después se incubaron a 63°C durante 1 .5 horas y se lcyeron en el fluorómetro (Biotek). El cálculo del % de señal respecto del umbral para la sonda objetivo dividido por el % de señal respecto de la sonda de control interno umbral calculará la relación. La relación de los estándares de copia conocida se desarrolló y validó con el análisis de transferencia Southern para identificar la copia estimada de los eventos desconocidos.

Reacción en cadena de la polimerasa: Un total de 100 ng de ADN total se usa como el molde. Se usan 20 m de cada cebador con el kit de polimerasa PCR Takara Ex Taq (Mirus TAKRR001 A). Los cebadores para la PTU AAD-12 (v1 ) son delanteros GAACAGTTAG ACATGGTCTA AAGG (SEC ID No. : 8) e inverso GCTGCAACAC TGATAAATGC CAACTGG (SEC ID No. : 9). La reacción de PCR se lleva a cabo en el termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C. durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 63°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minuto y 45 segundos, seguido por 72°C durante 10 minutos.

Los cebadores para la PCR de la región codificadora AAD-12 (v1 ) son delanteros ATGGCTCAGA CCACTCTCCA AA (SEC ID No. : 10) e inverso AGCTGCATCC ATGCCAGGGA (SEC I D No.: 1 1 ). La reacción de PCR se lleva a cabo en el termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minute y 45 segundos seguido por 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizan por electroforesis en un gel de azarosa 1 % teñido con EtBr.

Análisis de transferencia Southern: El análisis de transferencia Southern se realiza con el ADN genómico obtenido de kit de Qiagen DNeasy. Un total de 2 g de ADN foliar genómico o 10 mg de ADN genómico de callo se somete a una digestión de durante la noche usando enzimas de restricción BSM I y SWA I para obtener los datos de PTU .

Despues de la digestión durante la noche se corre una alícuota de ~ 100 ng en un gel de 1 % para asegurar una digestión completa. Después de esta garantía las muestras se corren en un gel de agarosa grande 0.85% durante la noche a 40 voltios. El gel después se desnaturaliza en NaOH 0.2M , NaCI 0.6M durante 30 minutos. El gel después se neutraliza en Tris HCI 0.5M, NaCI 1 .5M , pH de 7.5 durante 30 minutos. Despues se monta un aparato de gel que contiene 20 x SSC para obtener una transferencia por gravedad del gel a una membrana de nylon ( i 11 i p ore INYC00010) durante la noche. Después de la transferencia durante la noche, la membrana después se somete a la luz UV a través de un agente de reticulación (Stratagene UV Stratalinker 1800) a 1200 x 100 microjoule. La membrana se lava a continuación en 0.1 % de SDS, 0.1 SSC durante 45 minutos. Después del lavado de 45 minutos, la membrana se hornea durante 3 horas a 80°C y después se almacena a 4°C hasta la hibridación. El fragmento del molde de hibridación se prepara usando la PCR de región codificadora anterior usando ADN de plásmido. El producto se corre en un gel de agarosa 1 % y se corta y después se extrae en gel usando el procedimiento de extracción de gel de Qiagen (28706). La membrana después se somete a una etapa de pre-hibridación a 60°C durante 1 hora en amortiguador Hyb Perfect (Sigma H7033). El procedimiento de rxn marcado con dCTP Prime it RMT (Stratagene 300392) se usa para el desarrollo de la sonda basada en p32 (Perkin Elmer). La sonda se limpia mediante las columnas Quant Probe. G50 (Amersham 27-5335-01 ). Se usan dos millones de cuentas de CPM para hibridar las transferencias Southern durante la noche. Después de la hibridación durante una noche las transferencias después se someten a dos lavados de 20 minutos a 65°C en 0.1 % de SDS, 0.1 SSC. Las transferencias después se exponen a la película durante la noche, con incubación a -80°C.

Tolerancia a herbicidas posterior a emergencia en maíz TO transformado por AAD-12: Se dejó que cuatro eventos TO se aclimaten en el invernadero y se cultivaron hasta 2 - 4 hojas nuevas de apariencia normal habían salido del verticilo (es decir, las plantas habían pasado de condiciones de cultivo de tejidos al crecimiento en invernadero). Las plantas se cultivaron a 27°C en condiciones de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad en el invernadero. Las plantas se trataron despues con las formulaciones comerciales de Pursuit® (imazetapir) o 2,4-D amina 4. Pursuit® se pulverizó para demostrar la función del gen marcador seleccionable presente dentro de los eventos analizados. Las aplicaciones de herbicidas se hicieron con un pulverizador automático con un volumen de pulverización de 187 l/ha, altura de pulverización de 50 cm. Las plantas se pulverizaron con una dosis letal de imazetapir (70 g ea/ha) o una tasa de sal 2 ,4-D DMA capaz de lesiones significativas en las líneas de maíz no transformadas (2240 g ea/ha). Una dosis letal se define como la tasa que causa > 95% de lesiones para la línea endogámica Hi-l l . Hi-l l es el ancestro genético de los transformantes de la presente invención.

Varios individuos fueron antídotos de los herbicidas para los cuales los respectivos genes eran para proporcionar resistencia. El clon individual ?01 ' del evento “001” (aka, 4101 (0) -001 -001 ), sin embargo, incurrió en lesión menor, pero se recuperó en 14 DAT. Tres de los cuatro eventos avanzaron y los individuos se cruzaron con 5XH751 y se llevó a la siguiente generación. Cada planta tolerante al herbicida fue positiva para la presencia de la región codificadora AAD-12 (ensayo de PCR) o la presencia del gen de AHAS (ensayo Invader) para plantas tolerantes a de 2,4-D e imazetapir, respectivamente. La proteína AAD-12 se detectó en todos los eventos de plantas TO tolerantes a 2,4-D que contienen una región codificadora intacta. El número de copias del transgen (s) (AHAS, y por inferencia AAD-12) varió significativamente de 1 a 15 copias. Las plantas TO individuales se cultivaron hasta la madurez y se sometieron a polinización cruzada con una línea endogámica patentada con el fin de producir semillas T1 .

La verificación de alta tolerancia a 2,4-D en maíz T1 : las semillas T1 AAD-12 (v1 ) se plantaron en macetas de 3 pulgadas (7.62 cm) que contienen medios de mezcla Metro y 2 etapas de hoja se pulverizaron con 70 g ae/ha de imazetapir para eliminar los nulos. Las plantas sobrevivientes se trasplantaron a macetas de 1 galón que contienen medios de mezcla Metro y se colocaron en las mismas condiciones de crecimiento como antes. En la etapa V3-V4 las plantas se pulverizaron en el pulverizador automático ajustado a 187 l/ha a 560 o 2240 g ea/ha de 2,4-D DMA. Las plantas se clasificaron en 3 y 14 DAT y se compararon con las plantas de control 5XH751 x H¡ I I . Una escala de calificación de 0 a 10 (sin daño para daño de auxina extremo) fue desarrollada para distinguir la lesión de la raíz de sostén. Se tomaron las calificaciones de la raíz de sosten en 14DAT para mostrar la tolerancia de 2,4-D. 2,4-D provoca malformación de la raíz de sostén, y es un indicador coherente de la lesión de los herbicidas auxínicos en el maíz. Los datos de la raíz de sostén 5 (como se ve en la siguiente tabla) demuestra que 2 de los 3 eventos analizados fueron fuertemente tolerantes a 2240 g ae/ha de 2,4-D DMA. El evento “pDAB4101 (0) 001 .001” fue aparentemente inestable, sin embargo, los otros dos eventos fueron fuertemente tolerantes al 2,4-D y 2,4-D + imazetapir o 2,4-ío D + glifosato (ver Tabla 12).

Una escala de 0-10, 10 es la más alta, se usó para calificar la lesión 2,4-D DMA. Los resultados son un promedio visual de cuatro repeticiones por tratamiento. 25 Heredabilidad AAD-12 (v1 ) en maíz: Tambien se realizó una prueba de progenie en siete familias T1 AAD-12 (v1 ) que se habían cruzado con 5XH751 . Las semillas se plantaron en macetas de tres pulgadas (7.62 cm) como se describió anteriormente. En la etapa de 3 hojas, todas las plantas se pulverizaron con 70 g ea/ha de imazetapir en el pulverizador automático como se ha descrito anteriormente. Después de 14 DAT, se contaron las plantas resistentes y sensibles. Cuatro de las seis líneas analizadas se segregaron como un locus único, el rasgo mendeliano dominante (1 R: 1 S) se determinó por análisis de Chi cuadrado. Las plantas que sobrevivieron se pulverizaron posteriormente con 2,4-D y todas las plantas fueron consideradas tolerantes a 2,4-D (tasas de ³ 560 g ea/ha). AAD-12 es heredable como un gen de resistencia robusta a auxina ariloxialcanoato en múltiples especies cuando se cruzaron recíprocamente con un híbrido comercial.

Apilamiento de AAD-12 (v1 ) para aumentar el espectro de herbicidas: AAD-12 (v1 ) (pDAB4101 ) y línea endogámica elite Roundup Ready (BE1 146RR) se cruzaron recíprocamente y se recolectaron semillas F1 . Las semillas de dos líneas F1 se plantaron y trataron con 70 g ae/ha de imazetapir en la etapa V2 para eliminar los eventos nulos. En las plantas sobrevivientes, se separaron los reps y se trataron con 1 120 g ae/ha de 2,4-D DMA + 70 g ae/ha de imazetapir (para confirmar la presencia del gen AHAS) o 1 120 g ae/ha 2,4-D DMA 1680 g ea/ha de glifosato (para confirmar la presencia del gen Round Up Ready) en un pulverizador automático ajustado a 187 l/ha. Las plantas se clasificaron 3 y 16 DAT. Los datos de pulverización mostraron que AAD-12 (v1 ) se puede apilar de forma convencional con un gen de 5 tolerancia a glifosato (como el gen CP4-EPSPS Roundup) o de otros genes de tolerancia a herbicidas para proporcionar un mayor espectro de herbicidas que se pueden aplicar con seguridad al maíz. Asimismo se observó tolerancia a imidazolinona + 2,4-D + glifosato en plantas F1 y no se mostró un ío fenotipo negativo mediante las combinaciones o de mejora genetica por apilamiento de estos múltiples transgénes. 25 Tolerancia en el campo de plantas de maíz transformadas pDAB4101 a herbicidas 2,4-D, Triclopir y Fluoroxipir: Las pruebas de tolerancia en el campo se realizaron en dos eventos AAD-12 (v1 ) pDAB4101 (4101 (0)003. R.003. AF y 4101 (0)005. R001 .AF) y un híbrido de control Roundup Ready (RR)(2P782) Fowler, Ind. and Wayside, Miss. Las semillas se plantaron con plantador de cono en hileras de 40 pulgadas separación en Wayside y 30 pulgadas separación en Fowler. El diseño experimental fue un diseño de bloque completo aleatorizado con 3 repeticiones. Los tratamientos con herbicida fueron 2,4-D (sal dimetilamina) a 1 120, 5 2240 y 4480 g ae/ha, triclopir a 840 g ae/ha, fluoroxipir a 280 g ae/ha y un control no tratado. Los eventos AAD-12 (v1 ) contenían el gen AHAS como un marcador seleccionable. Los eventos de maíz F2 se segregaron de modo que las plantas AAD-12 (v1 ) se trataron con imazetapir a 70 g ae/ha para eliminar las plantas ío nulas. Los tratamientos herbicidas se aplicaron cuando el maíz alcanzó la etapa V6 usando un pulverizador de mochila de aire comprimido que suministra 187 l/ha de volumen de portador a 130 - 200 kpa de presión. Las calificaciones de lesión visual se tomaron a 7, 14 y 21 días despues del tratamiento. Las ís calificaciones de Lesión de la raíz de sostén a 28 DAT en una escala de 0 - 10 con 0 - 1 como fusión ligera de raíz de sostén, 1 - 3 como raíces de sostén abultadas/sinuosas y proliferación de raíz moderadas, 3 - 5 como fusión de raíz de sostén moderada, 5 - 9 fusión y malformación de raíz de sostén moderadas y 10 como 20 inhibición total de las raíces de sostén.

La respuesta del evento AAD-12 (v1 ) a 2,4-D, triclopir, y fluoroxipir a los 14 días después del tratamiento se muestran en la Tabla 14. La lesión del cultivo fue más grave a los 14 DAT. El maíz de control RR (2P782) fue gravemente dañado (44% a 14 25 DAT) por 2,4-D a 4480 g ae/ha, que es 8 veces (8 x) la tasa de uso normal en el campo. Todos los eventos AAD-12 (v1 ) demostraron excelente tolerancia a 2,4-D a 14 DAT con 0% de lesión a las tasas de 1 , 2 y 4 x, respectivamente. El maíz control (2P782) fue gravemente dañado (31 % a 14 DAT) por la tasa 2 x de triclopir (840 g ae/ha). Los eventos AAD-12 (v1 ) demostraron tolerancia a las tasas 2 x de triclopir con un promedio de 3% de lesión a 14 DAT en los dos eventos. Fluoroxipir a 280 g ae/ha causó 1 1 % de lesión visual en el maíz tipo salvaje a 14 DAT. Los eventos AAD-12 (v1 ) demostraron aumento de tolerancia con un promedio de 8% de lesión a 5 DAT.

Las aplicaciones de herbicidas auxínicos al maíz en la etapa de crecimiento V6 puede causar la malformación de las raíces de sosten. La Tabla 15 muestra la gravedad de la lesión de la raíz de sostén causada por 2,4-D, triclopir, y fluoroxipir. Triclopir a 840 g ae/ha causó la fusión y malformación más grave de la raíz de sostén que dio como resultado una puntuación promedio de la lesión de la raíz de sostén de 7 en el maíz tipo control 2P782.

Ambos eventos de maíz AAD-12 (v1 ) no mostraron lesión de la raíz de sostén frente al tratamiento con triclopir. La lesión de la raíz de sosten en el maíz 2P782 aumentó con las tasas crecientes de 2,4-D. A 4480 g ae/ha de 2,4-D, los eventos AAD-12 no mostraron lesión de la raíz de sostén; mientras que, se observó fusión y malformación de la raíz de sostén grave en el híbrido 2P782. Fluoroxipir solo causó abultamiento y sinuosidad moderada de la raíz de sostén en el maíz tipo salvaje con los eventos AAD-12 (v1 ) que no muestran lesión de la raíz de sostén.

Estos datos muestran claramente que AAD-12(v1 ) trasmite alto nivel de tolerancia en el maíz al 2,4-D, triclopir y fluoroxipir a tasas que exceden mucho las que se usan comercialmente y que causan lesión visual y de la raíz de sostén grave del maíz no AAD-12 (v1 ).

Ejemplo 6 Transformación del tabaco La transformación del tabaco con Agrobacterium tumefaciens se llevó a cabo por un método similar, pero no idéntico a los métodos publicados (Horsch et al. , 1988). Para proporcionar el tejido fuente para la transformación , las semillas de tabaco se esterilizaron en superficie (Nicotiana tabacum cv. KY 160) y se plantaron en la superficie del medio TOB, medio de Murashige y Skoog libre de hormona (Murashige y Skoog, 1962) solidificado con agar. Las plantas se cultivaron durante 6-8 semanas en una sala del incubador iluminada a 28 - 30°C y las hojas se recolectaron en forma estéril para usar en el protocolo de transformación. Los trozos de aproximadamente un centímetro cuadrado se cortaron en forma esteril de estas hojas, excluyendo la nervadura del medio. Los cultivos de las cepas de Agrobacterium (EHA101 S que contienen pDAB3278, aka pDAS1580, AAD-12 (v1 ) + PAT), se cultivaron durante la noche en un agitador ajustado a 250 rpm a 28°C., se sedimentaron en una centrífuga y se resuspendieron en sales Murashige & Skoog estériles y se ajustaron a una densidad óptica final de 0.5 a 600 nm. Los trozos de hoja se sumergieron en esta suspensión bacteriana durante aproximadamente 30 segundos, después se transfirieron secos sobre toallas de papel estéril y se colocaron del lado derecho hacia arriba sobre el medio TOB + (medio Murashige y Skoog que contiene 1 mg/l de ácido indolacético y 2.5 mg/l de benciladenina) y se incubaron en la oscuridad a 28°C. Dos días después los trozos de hojas se movieron al medio TOB + que contiene 250 mg/l de cefotaxime (Agri-Bio, North Miami, Fia.) y 5 mg/l de glufosinato de amonio (ingrediente activo en Basta, Bayer Crop Sciences) y se incubaron a 28 - 30°C a la luz. Los trozos de hojas se trasladaron al medio TOB+ fresco con cefotaxime y Basta dos veces por semana durante las primeras dos semanas y una vez por semana a partir de este momento. Cuatro a seis semanas después los trozos de hojas se trataron con las bacterias, se extrajeron las plantas pequeñas que surgen de los focos transformados de esta preparación de tejido y se plantaron en el medio TOB que contiene 250 mg/l de cefotaxime y 10 mg/l de Basta en los recipientes Phytatray™ I I (Sigma). Estas plántulas se cultivaron en una sala incubadora iluminada. Despues de 3 semanas, se tomaron cortes del tallo y se enraizaron de nuevo en el mismo medio. Las plantas estuvieron listas para enviar al invernadero después de 2 - 3 semanas 5 adicionales.

Las plantas se trasladaron al invernadero mediante el lavado del agar de las raíces, se trasplantaron en el suelo en macetas de 13,75 cm cuadrado, se colocaron en la maceta en una bolsa Ziploc® (SC Johnson & Son , I nc.), se colocó agua de la ío canilla en la parte inferior de la bolsa y se coloca en luz indirecta en un invernadero a 30°C durante una semana. Después de 3 - 7 días, la bolsa se abrió; las plantas se fertilizaron y se dejaron crecer en la bolsa abierta hasta que las plantas se aclimataron en el invernadero, en este momento se retiró la bolsa. Las plantas se ís cultivaron en las condiciones de invernadero cálidas habituales (30°C., 16 horas diurnas, 8 horas de noche, luz natural mínima + suplementaria =500 mE/m2 s1).

Antes de la propagación, las plantas TO se muestrearon para el análisis de ADN para determinar el número de copias del 20 inserto. El gen PAT que está unido en forma molecular al AAD-12 (v1 ) se analizó por conveniencia. El tejido fresco se colocó en tubos y se liofilizó a 4°C durante 2 días. Después de que el tejido se secó por completo, se colocó una microesfera de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras se sometieron a 1 minuto de 25 molienda seca usando un molino de bola Kelco. Después se siguió el procedimiento de aislamiento de ADN DNeasy estándar (Qiagen, DNeasy 69109). Una alícuota del ADN extraído despues se tiñó con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se lcyó en el fluorómetro (BioTek) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/mI.

Las muestras de ADN se diluyeron a razón de 9 ng/mI y después se desnaturalizaron por incubación en un termocielador a 95°C durante 10 minutos. Después se preparó la mezcla Signal Probe usando la mezcla de oligo provista y MgCI2 (Third Wave Technologies). Una alícuota de 7.5 mI se colocó en cada pocilio de la placa de ensayo I nvader seguido de una alícuota de 7.5 mI de controles, estándares y muestras desconocidas diluidas 20 ng/l. Cada pocilio se revistió con 15 mI de aceite mineral (Sigma). Las placas después se incubaron a 63°C durante 1 .5 horas y se leyeron en el fluorómetro (Biotek). El cálculo del % de señal respecto del umbral para la sonda objetivo dividido por el % de señal respecto de la sonda de control interno umbral calculará la relación . La relación de los estándares de copia conocida se desarrolló y validó con el análisis de transferencia Southern para identificar la copia estimada de los eventos desconocidos.

Todos los eventos también se analizaron para determinar la presencia del gen AAD-12 (v1 ) por PCR usando las mismas muestras de ADN extraídas. Un total de 100 ng de ADN total se usó como molde. Se usaron 20 mM de cada cebador con el kit de PCR polimerasa Takara Ex Taq PCR. Los cebadores para la unidad de transcripción de la planta (PTU) PCR AAD-12 fueron (SdpacodF: ATGGCTCATG CTGCCCTCAG CC) (SEC ID No. : 12) y (SdpacodR: CGGGCAGGCC TAACTCCACC AA) (SEC I D No. : 13). La reacción PCR se llevó a cabo en el termocielador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 64°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minute y 45 segundos seguido por 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa 1 % teñido con EtBr. Cuatro a 12 linajes clónales de cada uno de los 18 eventos positivos de PCR con 1 - 3 copias del gen PAT (y supuestamente AAD-12 (v1 ) debido a que estos genes están físicamente unidos) se regeneraron y movieron al invernadero.

Tabla 16. Eventos TO de tabaco transformados con pDAS1 580 (AAD-1 2 (v1 ) + PAT) @EI desempeño de tolerancia al herbicida distintivo de los eventos requirió la eval uación de la tolerancia relativa cuando se trató con 560 g ae/ha de fluroxipir cuando la tolerancia fue variable entre los eventos.

Tolerancia al herbicida despues de la emergencia en tabaco TO transformado por AAD-12 (v1 ): Las plantas TO de cada uno de los 19 eventos se expusieron a un intervalo amplio de 2,4-D, triclopir, o fluoroxipir pulverizado sobre las plantas que tenían 3 -4 pulgadas (7.62 - 10.16 cm) de alto. Las aplicaciones de spray se realizaron como se describió previamente usando un pulverizador automático a un volumen de pulverización de 187 l/ha. La sai dimetilamina 2,4-D (Riverside Corp) se aplicó a 0, 140, 560, o 2240 g ae/ha a los clones representativos de cada evento mezclado en agua desionizada. Fluoroxipir también se aplicó a 35, 140, o 560 g ae/ha. Triclopir se aplicó a 70, 280, o 1 120 g ae/ha. Cada tratamiento se repitió 1 - 3 veces. Las calificaciones de lesión se registraron 3 y 14 DAT. Cada evento analizado fue más tolerante a 2,4-D que la línea control no transformada KY160. En varios eventos, alguna epinastía relacionada con el herbicida auxínica inicial se produjo a las dosis de 560 g ae/ha 2,4-D o menos. Algunos eventos no estaban lesionados a 2 ,4-D aplicados a 2240 g ae/ha (equivalente a tasa 4 x de campo). En general, los eventos AAD-12 (v1 ) fueron más sensibles a fluoroxipir, seguido por triclopir, y menos afectados por 2,4-D. La calidad de los eventos con respecto a la magnitud de la resistencia se apreció usando las respuestas de la planta T0 a 560 g ae/ha de fluoroxipir. Los eventos se clasificaron en “bajo” (>40% de lesión 14 DAT), “medio” (20-40% de lesión), “alta” (<20% de lesión). Algunos eventos fueron de respuesta incompatible entre las repeticiones y se consideraron “variables”.

Verificación de tolerancia alta a 2,4-D en tabaco T1 : Se guardaron dos a cuatro individuos T0 que sobreviven a tasas altas de 2,4-D y fluoroxipir de cada evento y se dejaron autofertilizar en el invernadero para dar origen a las semillas T1 . Las semillas T1 se estratificaron y sembraron en las placas de selección al igual que la de Arabidopsis, seguido por la eliminación selectiva de nulos no transformados en esta población de segregación con 560 g ai/ha de glufosinato (selección del gen PAT). Los sobrevivientes se transfirieron a macetas de 3 pulgadas (7.62 cm) individuales en el invernadero. Estas líneas proporcionaron altos niveles de resistencia a 2,4-D en la generación TO. Se preve un aumento de consistencia de la respuesta en las plantas T1 que no provienen directamente del cultivo de tejidos. Estas plantas se compararon contra tabaco KY160 tipo salvaje. Todas las plantas se pulverizaron con un pulverizador automático ajustado a 187 l/ha. Las plantas se pulverizaron a partir de un intervalo de 140-2240 g ae/ha sal dimetilamina 2,4-D (DMA), 70 - 1 120 g ae/ha de triclopir o 35 -560 g ae/ha de fluoroxipir. Todas las aplicaciones se formularon en agua. Cada tratamiento se repitió 2 - 4 veces. Las plantas se evaluaron a los 3 y 14 días después del tratamiento. A las plantas se les asignó una calificación de lesión con respecto a atrofia, clorosis, y necrosis. La generación T1 es segregante, de modo que se espera alguna respuesta variable debido a la diferencia en la cigosidad.

Tabla 17. Respuesta de las plantas T1 de tabaco AAD- 12 segregantes a los herbicidas fenoxi y piridiloxi auxina NO se observó lesión a la tasa de campo 4 x (2240 g ae/ha) para 2,4-D o menor. Se observó alguna lesión con los tratamientos de triclopir en una línea del evento, pero la lesión mayor se observó con fluoroxipir. La lesión por fluoroxipir fue de corta duración y el nuevo crecimiento en un evento fue casi indistinguible del control no tratado por 14 DAT (Tabla 17). Es importante destacar que el tabaco no transformado es extremadamente sensible a fluoroxipir. Estos resultados indicaron que se puede proporcionar una tolerancia 2,4-D de nivel comercial con AAD-12 (v1 ), incluso en un cultivo dicotiledóneo muy sensible a auxina como tabaco. Estos resultados tambien muestran que se puede impartir resistencia a los herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopir y fluoroxipir. Tener la capacidad de prescribir tratamientos en un cultivo tolerante a los herbicidas protegido por AAD-12 con varios ingredientes activos que tienen variados espectros de control de malezas es muy útil para los agricultores.

Heredabilidad AAD-12 (v1 ) en tabaco: También se realizó una prueba de 100 plantas de progenie en siete líneas T1 de líneas AAD-12 (v1 ). Las semillas se estratificaron, sembraron y trasplantaron con respecto al procedimiento anterior con la excepción de que las plantas nulas no se eliminaron por la selección con Liberty. Todas las plantas después se pulverizaron con 560 g ae/ha de 2,4-D DMA como se describió previamente. Después de 14 DAT, se contaron las plantas resistentes y sensibles. Cinco de las siete líneas analizadas se segregaron como un locus único, el rasgo Mendeliano dominante (3R: 1 S) se determinó por análisis de chi cuadrado. AAD-12 es heredable como un gen de resistencia fuerte a auxina ariloxialcanoato en múltiples especies.

Tolerancia en el campo de las plantas de tabaco pDAS1580 a herbicidas 2,4-D, Dicloprop, Triclopir y Fluoroxipir: Las pruebas de tolerancia de nivel de campo se realizaron en tres líneas AAD-12 (v1 )(eventos pDAS1580-[1 ]-018.001 , pDAS1580-[1 ]-004.001 y pDAS1 580-[ 1 ]-020.016) y una línea tipo salvaje (KY160) en las estaciones de campo de Indiana y Miss. Los trasplantes de tabaco se cultivaron en el invernadero por la plantación de las semillas T1 en semilleros de trasplante de 72 cavidades (Hummert Internacional) que contienen medio Metro 360 de acuerdo con las condiciones de cultivo indicadas anteriormente. Las plantas nulas se retiraron selectivamente por selección con Liberty como se describió previamente. Las plantas del trasplante se transportaron a las estaciones de campo y se plantaron separadas por 14 o 24 pulgadas usando plantadores de vegetales industriales. Se usaron irrigación por goteo en el sitio de Mississippi e irrigación aerea en el sitio Indiana para mantener a las plantas en crecimiento vigoroso.

El diseño experimental fue un diseño de parcela dividida con 4 replicaciones. La principal parcela fue el tratamiento con herbicida y la sub-parcela fue la línea de tabaco. Los tratamientos herbicidas fueron 2,4-D (sal dimetilamina) a 280, 560, 1 120, 2240 y 4480 g ae/ha, triclopir a 840 g ae/ha, fluoroxipir a 280 g ae/ha y un control no tratado. Las parcelas tenían una hilera de 25-30 ft. Los tratamientos herbicidas se aplicaron 3 - 4 semanas después del trasplante usando un pulverizador de mochila con aire comprimido que suministra 187 l/ha de volumen portador a 130-200 kpa de presión. La calificación visual de lesión, inhibición del crecimiento, y epinastía se tomaron 7, 14 y 21 días despues del tratamiento. . l . .

Las respuestas del evento AAD-12 (v1 ) a 2,4-D, triclopir, y fluoroxipir se muestran en la Tabla 18. La línea de tabaco no transformada fue gravemente dañada (63% a 14 DAT) por 2,4-D a 560 g ae/ha que se considera 1 vez la tasa de aplicación en el campo. Todas las líneas AAD-12 (v1 ) demostraron tolerancia excelente a 2,4-D a 14 DAT con lesión promedio de 1 , 4, y 4% de lesión observada a las tasas de 2, 4 y 8 veces, respectivamente. La línea de tabaco no transformada fue gravemente lesionada (53% a 14 DAT) por la tasa 2 x de triclopir (840 g ae/ ha); mientras que las líneas AAD-12 (v1 ) demostraron tolerancia con un promedio de 5% de lesión a 14 DAT en las tres líneas. Fluoroxipir a 280 g ae/ha causó lesión grave (99%) en la línea no transformada a 14 DAT. Las líneas AAD-12 (v1 ) demostraron aumento de tolerancia con un promedio de 1 1 % de lesión a 14 DAT.

Estos resultados indican que las líneas del evento transformadas AAD-12 (v1 ) presentaron un alto nivel de tolerancia a 2,4-D, triclopir y fluoroxipir en múltiplos de las tasas de uso comercial que fueron letales o causaron malformaciones epinásticas graves en el tabaco no transformado en condiciones de campo representativas.

Protección de AAD-12 (v1 ) contra tasas de 2,4-D elevadas: Los resultados que muestran protección de AAD-12 (v1 ) contra tasas elevadas de 2,4-D DMA en el invernadero se muestran en la Tabla 19. Las plantas T1 AAD-12 (v1 ) de un evento que segrega 3R: 1 S cuando se selecciona con 560 g ai/ha de Liberty usando el mismo protocolo que se describió previamente. Las semillas T1 AAD-1 (v3) tambien se plantaron para los controles de tabaco transformados (ver PCT/US2005/014737). KY160 no transformado actuó como control sensible. Las plantas se pulverizaron usando un pulverizador automático ajustado a 187 l/ha a 140, 560, 2240, 8960, y 35840 g ae/ha de 2,4-D DMA y calificado 3 y 14 DAT.

AAD-12 (v1 ) y AAD-1 (v3) protegieron efectivamente al tabaco contra la lesión de 2,4-D a las dosis hasta 4 x las tasas de uso comercial. AAD-12 (v1 ), sin embargo, demostró claramente una marcada ventaja respecto de AAD-1 (v3) al proteger hasta 64 x las tasas de campo estándares.

Tabla 19. Resultados que demuestran protección provistos por AAD-12 (v1 ) y AAD-1 (v3) contra tasas elevadas de 2,4-D.

Apilamiento de AAD-12 para aumentar el espectro herbicida: Las plantas homocigotas AAD-12 (v1 ) (pDAS1580) y AAD-1 (v3) (pDAB721 ) (ver PCT/US2005/014737 para esta última) se cruzaron recíprocamente y se recolectaron semillas F1 . Las semillas F1 de dos cruzas recíprocas de cada gen se estratificaron y trataron 4 repeticiones de cada cruza con el mismo régimen de pulverización que se usó para las otras pruebas con uno de los siguientes tratamientos: 70, 140, 280 g ae/ha de fluoroxipir (selectivo para el gen AAD-12 (v 1 )) ; 280, 560, 1 120 g ae/ha de R-dicloroprop (selectivo para el gen AAD-1 (v3)); o 560, 1 120, 2240 g ae/ha de 2,4-D DMA (para confirmar la tolerancia a 2,4-D). Las plantas T2 homocigotas de cada gen tambien se plantaron para usar como controles. Las plantas se calificaron a 3 y 14 DAT. Los resultados de la pulverización se muestran en la Tabla 20.

Los resultados confirman que AAD-12 (v1 ) se puede apilar con éxito con AAD-1 (v3), de este modo aumenta el espectro de herbicidas que se puede aplicar al cultivo de interés (ácidos fenoxiacéticos + ácidos fenoxipropiónico versus ácidos fenoxiacéticos + ácidos piridiloxiacéticos para AAD-1 y AAD-12, respectivamente). La naturaleza complementaria de los patrones de resistencia cruzada a herbicidas permite el uso conveniente de estos genes como marcadores seleccionables de campo complementarios y apilables. En los cultivos en que la tolerancia con un gen único puede ser marginal, los expertos en la téenica reconocen que se puede aumentar la tolerancia por apilamiento de un segundo gen de tolerancia para el mismo herbicida. Esto se puede realizar usando el mismo gen con promotores iguales o diferentes; sin embargo, como se observa en la presente, el apilamiento y seguimiento de dos rasgos complementarios se puede facilitar mediante la protección cruzada distintiva para ácidos fenoxipropiónicos [de AAD-1 (v3)] o ácidos piridilooxiacéticos [AAD-12 (v1 )].

Tabla 20. Comparación de tolerancia cruzada a herbicidas auxínicos de plantas T2 AAD-12 (v 1 ) (pDAS 1 580) y AAD-1 (v3) (pDAB721 ) en comparación con cruza F 1 AAD- 12 x AAD- 1 F 1 y tipo salvaje T ratamiento Promedio % de lesión 14 DAT KY160 , , l Ejemplo 7 Transformación de soja La mejora de la soja por medio de teenicas de transferencia de genes se ha obtenido para rasgos como tolerancia (Padgette et al. , 1995), modificación de aminoácidos (Falco et ai. , 1995), y resistencia a insectos (Parrott et al. , 1994). La introducción de rasgos extraños en las especies de cultivo requiere métodos que permitirán la producción de rutina de líneas transgénicas usando secuencias del marcador seleccionable, que contienen insertos simples. Los transgenes se deberían heredar como un locus funcional único a fin de simplificar el mejoramiento genético. Se ha informado la administración de genes extraños en la soja cultivada por bombardeo de microproyectiles de ejes de embriones cigóticos (McCabe et al. , 1988) o cultivos embriogénicos somáticos (Finer y McMullen, 1991 ), y transformación mediada por Agrobacterium de explantes cotiledonarios (Hinchee et al. , 1988) o embriones cigóticos (Chee et al. , 1989).

Los transformantes derivados de transformaciones mediadas por Agrobacterium tienden a poseer insertos simples con número de copias bajo (Birch, 1991 ). Existen beneficios y desventajas asociados con cada uno de los tres tejidos objetivo investigados para la transferencia de genes en la soja, ejes embrionarios cigóticos (Chee et al., 1989; McCabe et al. , 1988), cotiledón (Hinchee et al. , 1988) y cultivos embriogénicos somáticos (Finer y McMullen, 1991 ). Estos últimos se han estudiado exhaustivamente como tejido objetivo para la transferencia génica directa. Los cultivos embriogénicos tienden a ser relativamente prolíficos y se pueden mantener durante un período prolongado. Sin embargo, la esterilidad y las aberraciones cromosómicas de los transformantes primarios se han asociado con la edad de las suspensiones embriogénicas (Singh et al. , 1998) y por lo tanto la iniciación continua de los nuevos cultivos parece ser necesaria para los sistemas de transformación de soja que usan este tejido.

Este sistema necesita un alto nivel de concentración de 2,4-D, 40 mg/l, para iniciar el callo embriogenico y esto plantea un problema fundamental en el uso del gen AAD-12 (v1 ) ya que el locus transformado no se puede desarrollar más con 2,4-D en el medio. Así, la transformación basada en meristemo es ideal para el desarrollo de plantas resistentes a 2,4-D usando AAD-12 (v1 ).

Clonación Gateway de constructos binarios: La secuencia codificadora AAD-12 (v1 ) se clonó en cinco vectores dadores Gateway diferentes que contienen diferentes promotores de planta. Los casetes de expresión de planta de AAD-12 (v1 ) resultantes se clonaron posteriormente en un vector binario de destino Gateway por medio de la reacción clonasa LR (Invitrogen Corporation, Carlsbad Calif. , Cat #1 1791 -019).

Un fragmento Ncol-Sacl que contiene la secuencia codificadora AAD-12 (v1 ) se digirió de DASPIC012 y se ligó en los correspondientes sitios de restricción Ncol-Sacl dentro de los siguientes vectores dadores Gateway: pDAB3912 (attL 1 //promotor CsVMV//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB3916 (attL1 //promotor AtUbil 0//AtuORF23 3’UTR//attL2); pDAB4458 (attL1 //promotor AtUbi3//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB4459 (attL1 //promotor ZmUbi1 //AtuORF23 3'UTR//attL2); y pDAB4460 (attL1 //promotor AtAct2//AtuORF23 3'UTR//attL2). Se diseñaron los constructos resultantes que contienen los siguientes casetes de expresión de planta: pDAB4463 (attL1 //promotor CsVMV//AAD-1 2 (v1 )//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB4467 (attL1 //promotor AtUbi10//AAD-12 (v1 )//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB4471 (attL1 //promotor AtUbi3//AAD-12 (v1 )//AtuORF23 3'UTR//attL2); pDAB4475 (attL1 //promotor ZmUbil //AAD-12 (v1 )//AtuORF23 3'UTR//attL2); y pDAB4479 (attL1 //promotor AtAct2//AAD-12 (v1 )//AtuORF23 3'UTR//attL2). Estos constructos se confirmaron por medio de digestión con enzimas de restricción y secuenciación.

Los casetes de expresión de planta se recombinaron en el vector binario de destino Gateway pDAB4484 (RB7 MARv3//attR1 -ccdB-resistencia a cloranfenicol-attR2//promotor CsVMV//PATv6//AtuORF1 3'UTR) por medio de la reacción de clonasa Gateway LR. La teenología Gateway usa una recombinación específica de sitio basada en fago lambda en vez de endonucleasa de restricción y ligasa para insertar un gen de interes en un vector de expresión. Invitrogen Corporation, Gateway Technology: A Universal Technology to Clone DNA Sequences for Functional Analysis and Expression in múltiple Systems, Technical Manual, Catalog #'s 12535-019 and 12535-027, Gateway Technology Versión E, Sep. 22, 2003, #25-022. Las secuencias de recombinación del ADN (attL, y attR,) y la mezcla enzimática de clonasa LR permite que cualquier fragmento de ADN flanqueado por un sitio de recombinación sea transferido en cualquier vector que contiene un sitio correspondiente. El sitio att L 1 del vector dador corresponde con attR1 del vector binario. Asimismo, el sitio attL2 del vector dador corresponde con attR2 del vector binario. Mediante la teenología Gateway el casete de expresión de planta (del vector dador) que está flanqueado por los sitios attL se puede recombinar en los sitios attR del vector binario. Los constructos resultantes que contienen los siguientes casetes de expresión de planta se rotularon como: pDAB4464 (RB7 MARv3//pro motor CsVMV//AAD-1 2 (v1 )//AtuORF23 3'UTR//promotor CsVMV//PATv6 AtuORFI 3'UTR); pDAB4468 (RB7 MARv3//promotor AtUbM 0//AAD-12 (v1 )//AtuORF23 3'UTR//promotor CsVMV//PATv6//AtuORF1 3'UTR); pDAB4472 (RB7 MARv3//promotor AtUbi3//AAD-12 (v1 )//AtuORF23 3'UTR//promotor CsVMV//PATv6//AtuORF1 3'UTR); pDAB4476 (RB7 MARv3//promotor ZmUbi1 //AAD-12 (v1 )//AtuORF23 3'UTR//promotor CsVMV//PATv6 AtuORFI 3'UTR); y pDAB4480 (RB7 MARv3//promotor AtAct2//AAD-12 (v1 )//AtuORF23 3'UTR//promotor CsVMV//PATv6//AtuORF1 3'UTR). Estos constructos se confirmaron por medio de digestión con enzimas de restricción y secuenciación.

Metodo de transformación 1 - transformación mediada por Agrobacterium: Los primeros informes de transformación soja se dirigió a las células meristemáticas de la región del nodo cotiledonar (Hinchee et al. , 1988) y mutiplicación de brotes de los meristemas apicales (McCabe et al. , 1988). En el método del nodo cotiledonar basado en A. tumefaciens, la preparación del explante y la composición del medio de cultivo estimulan la proliferación de los meristemos auxiliares en el nodo (Hinchee et al. , 1988). Aún no está claro si un cultivo de callo verdaderamente desdiferenciado pero totipotente, se inicia mediante estos tratamientos. La recuperación de los múltiples clones de un evento de transformación de un explante único y la poco frecuente recuperación de plantas quimericas (Clemente et al. , 2000; Olhoft et al. , 2003) indica un origen celular único seguido por multiplicación de la célula transgénica para producir un cultivo meristemático transgénico proliferante o un brote transformado uniformemente que experimenta la multiplicación de brotes adicional. El método de multiplicación de brotes de soja, basado originalmente en el bombardeo de microporiyectiles (McCabe et al. , 1988) y, más recientemente, adaptado para transformación mediada por Agrobacterium (Martinell et al., 2002), aparentemente no experimenta el mismo nivel o tipo de desdiferenciación que el método del nodo cotiledonar ya que el sistema se basa en la identificación exitosa de quimeras de la línea germinal. Asimismo, este no es un protocolo basado en 2,4-D que puede ser ideal para el sistema de selección 2,4-D. En consecuencia, el método del nodo cotiledonar puede ser el método de elección para desarrollar cultivares de soja resistentes a 2,4-D.

Producción por transformación de planta de fenotipos tolerantes a AAD-12 (v1 ). Se usaron las semillas derivadas de los explantes de “Maverick” y el protocolo de transformación del nodo cotiledonar mediado por Agrobacterium para producir plantas transgenicas AAD-12 (v1 ).

Preparación e inoculación de Agrobacterium: la cepa de Agrobacterium EHA101 (Hood et al. 1986), que porta cada uno de los cinco vectores binarios pDAB (Tabla 8) se usó para iniciar la transformación. Cada vector binario contiene el gen AAD-12 (v1 ) y un casete del gen seleccionable de planta (PAT) dentro de la región del ADN-T. Los plásmidos se movilizaron en la cepa EHA101 de Agrobacterium por electroporación. Las colonias seleccionadas después se analizaron para determinar la integración de los genes antes del tratamiento con Agrobacterium de los explantes de soja. Las semillas Maverick se usaron en todos los experimentos de transformación y las semillas se obtuvieron de la University of Missouri, Columbia, Mo.

Se llevó a cabo la transformación mediada por Agrobacterium de soja (Glycine max) usando el gen PAT como un marcador seleccionable acoplado con el herbicida glufosinato como agente selectivo. Las semillas germinaron en medios básales B5 (Gamborg et al. 1968) solidificado con 3 g/l Phytagel (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.). Los brotes seleccionados después se transfirieron al medio de enraizamiento. El esquema de selección óptimo fue el uso de glufosinato a razón de 8 mg/l en las primera y segunda etapa de iniciación de brotes en el medio y 3 - 4 mg/l durante la elongación del brote en el medio.

Antes de transferir los brotes alargados (3 - 5 cm) al medio de enraizamiento, el extremo escindido de los entrenudos se sumergió en 1 mg/l de ácido indol 3-butírico durante 1 - 3 minutos para promover el enraizamiento (Khan et al. 1994). Los brotes echaron raíces en 25 tubos de cultivo de vidrio de 100 mm que contenían medio de enraizamiento y despues se transfirieron a la 5 mezcla de tierra para la aclimatación de las plántulas en Metro- mix 200 (Hummert International, Earth City, Mo.) en cajas de Magenta abiertas en Convirons. Se usó el glufosinato, el ingrediente activo del herbicida Liberty (Bayer Crop Science), para la selección durante la iniciación y elongación de los brotes ío Las plántulas enraizadas se aclimataron en cajas Magenta abiertas durante varias semanas antes de analizarlas y transferirlas al invernadero para la aclimatación y el establecimiento posteriores.

Ensayo de plántulas transformadas putativamente y análisis 15 de las plantas T0 establecidas en el invernadero: Las hojuelas terminales de las hojas seleccionadas de estas plántulas se pintaron en la hoja con 50 mg/l de glufosinato dos veces con un intervalo de una semana para observar los resultados para identificar los transformantes putativos. Las plántulas 20 identificadas después se transfirieron al invernadero y después de la aclimatación las hojas se pintan con glufosinato nuevamente para confirmar el estado de tolerancia de estas plántulas en el GH y se consideraron transformantes putativos.

Las plantas que se transfieren al invernadero se pueden 25 analizar para determinar la presencia de un gen PAT activo adicional de una manera no destructiva mediante la pintura de una sección de la hoja del transformante primario TO, o su progenie, con una solución de glufosinato [0.05 - 2% v/v de herbicida Liberty, con preferencia 0.25 - 1.0% (v/v), = 500-2000 ppm de glufosinato, Bayer Crop Science]. De acuerdo con la concentración usada, se puede realizar la evaluación de la lesión de glufosinato 1 - 7 días despues del tratamiento. Las plantas también se pueden analizar para determinar la tolerancia a 2,4-D de una manera no destructiva por la aplicación selectiva de una solución de 2,4-D en agua (0.25 - 1 % v/v de formulación comercial de sal dimetilamina 2,4-D, con preferencia 0.5% v/v= 2280 ppm 2,4-D ae) en la hojuela terminal de los uno o dos, con preferencia dos nudos trifoliolados de reciente expansión debajo del trifoliolado emergente más nuevo. Este ensayo permite la evaluación de las plantas sensibles a 2,4-D 6 horas a varios días después de la aplicación mediante la evaluación del volteo o rotación de las hojas >90 grados del plano de las hojuelas adyacentes. Las plantas tolerantes a 2,4-D no responderán a 2,4-D. Las plantas T0 se dejarán autofecundarse en el invernadero para originar las semillas T1 . Las plantas T1 (mientras que se produzcan suficientes clones de planta T0) se pulverizarán con una variedad de dosis herbicidas para determinar el nivel de protección herbicida suministrado por AAD-12 (v1 ) y los genes PAT en la soja transgénica. Las tasas de 2,4-D usadas en las plantas T0 normalmente comprenderán una o dos tasas selectivas en el intervalo de 100 - 1 120 g ae/ha usado un pulverizador automático como se describió previamente. Las plantas T1 se tratarán con una dosis de herbicida más amplia que varía de 50-3200 g ae/ha 2,4-D. Asimismo, las plantas T0 y T1 se pueden detectar por la resistencia al glufosinato en el tratamiento despues de la emergencia con 200 - 800 y 50 - 3200 g ae/ha de glufosinato, respectivamente. La resistencia al glifosato (en las plantas transformadas con constructos que contienen EPSPS) u otro gen de tolerancia al glifosato se puede evaluar en la generación T1 por aplicaciones posemergencia de glifosato con un intervalo de dosis de 280 - 2240 g ae/ha de glifosato. Las plantas T0 individuales se evaluaron para determinar la presencia de la región codificadora del gen de interés (AAD-12 (v1 ) o PAT v6) y número de copia. La determinación de la herencia de AAD-12 (v1 ) se realizará usando la segregación de la progenie T1 y T2 con respecto a la tolerancia al herbicida descrita en los ejemplos.

Un subconjunto de los transformantes iniciales se evaluó en la generación T0 de acuerdo con los métodos anteriores. Cualquier planta confirmada como portadora de la región codificadora de AAD-12 (v1 ), independientemente del promotor que dirige el gen no respondió a la pintura de la hoja con 2,4-D mientras que las sojas tipo salvaje de Maverick lo hicieron. Las plantas transformadas solo con PAT respondieron igual a las plantas tipo salvaje a las aplicaciones de pintura foliar de 2,4-D.

Se aplicó 2,4-D a un subconjunto de plantas que eran de similar tamaño a las plantas tipo salvaje control con 560 o 1 120 g ae de 2,4-D. Todas las plantas que contienen AAD-12 (v1 ) fueron claramente resistentes a la aplicación de herbicida versus las sojas tipo salvaje de Maverick. Se observó un nivel leve de lesión (2 DAT) para las plantas AAD-12 (v1 ), sin embargo, la lesión fue temporaria y no se observó lesión 7 DAT. Las plantas tipo salvaje control estaban gravemente dañadas 7-14 DAT a 560 g ae/ha de 2,4-D y destruidas a 1 120 g ae/ha. Estos datos son compatibles con el hecho de que AAD-12 (v1 ) puede impartir alta tolerancia (>2 veces las tasas de campo) a un cultivo sensible como la soja. Las plantas identificadas despues se muestrearon para realizaron los análisis molecular y bioquímico para la confirmación de la integración de los genes AAD12 (v1 ), número de copia, y niveles de expresión génica.

Análisis molecular - soja: Recolección de tejido para aislamiento y cuantificación de ADN . El tejido fresco se coloca en tubos y se liofiliza a 4°C durante 2 días. Después de que el tejido está totalmente seco, se coloca una microesfera de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras se someten a 1 minuto de molienda en seco usando un molino de bola Kelco. Después se sigue el procedimiento de aislamiento de ADN estándar DNeasy (Qiagen, DNeasy 69109). Una alícuota del ADN extraído después se tiñe con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se leen en el fluorómetro (BioTek) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/pl.

Reacción en cadena de polimerasa: Se usa un total de 100 ng de ADN se usa como molde. Se usan 20 mM de cada cebador con el kit de polimerasa PCR Takara Ex Taq (Mirus TAKRR001 A). Los cebadores para la PTU de AAD-12 (v1 ) son (delantero-ATAATGCCAG CCTGTTAAAC GCC) (SEC I D No. : 8) e (inverso-CTCAAGCATA TGAATGACCT CGA) (SEC I D No. : 9). La reacción de PCR se lleva a cabo en el termocielador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 63°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minute y 45 segundos seguido por 72°C durante 10 minutos. Los cebadores de la PCR de la región codificadora AAD-12 (v1 ) son (delantero-ATGGCTCATG CTGCCCTCAG CC) (SEC ID No. : 10) e (inverso-CGGGCAGGCC TAACTCCACC AA) (SEC ID No.: 1 1 ). La reacción de PCR se lleva a cabo en el termociclador 9700 Geneamp (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 1 minute y 45 segundos seguido por 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizan por electroforesis en un gel de agarosa 1 % teñido con EtBr.

Análisis de transferencia Southern: El análisis de transferencia Southern se realiza con el ADN total obtenido de kit de Qiagen DNeasy. Un total de 10 mg de ADN genómico se somete a una digestión de durante la noche para obtener los datos de integración. Despues de la digestión durante la noche se corre una alícuota de ~ 100 ng en un gel de 1 % para asegurar una digestión completa. Despues de esta garantía las muestras se corren en un gel de agarosa grande 0.85% durante la noche a 40 voltios. El gel después se desnaturaliza en NaOH 0.2M , NaCI s 0.6M durante 30 minutos. El gel después se neutraliza en Tris HCI 0.5M, NaCI 1 .5M, pH de 7.5 durante 30 minutos. Después se monta un aparato de gel que contiene 20 x SSC para obtener una transferencia por gravedad del gel a una membrana de nylon (Millipore I NYC00010) durante la noche. Después de la ío transferencia durante la noche, la membrana después se somete a la luz UV a través de un agente de reticulación (Stratagene UV Stratalinker 1800) a 1200 x 100 microjoule. La membrana se lava a continuación en 0.1 % de SDS, 0.1 SSC durante 45 minutos. Después del lavado de 45 minutos, la membrana se hornea ís durante 3 horas a 80°C y después se almacena a 4°C hasta la hibridación. El fragmento del molde de hibridación se prepara usando la PCR de región codificadora anterior usando ADN de plásmido. El producto se corre en un gel de agarosa 1 % y se corta y después se extraje en gel usando el procedimiento de 20 extracción de gel de Qiagen (28706). La membrana después se somete a una etapa de pre-hibridación a 60°C durante 1 hora en amortiguador Hyb Perfect (Sigma H7033). El procedimiento de rxn marcado con dCTP Prime it RMT (Stratagene 300392) se usa para el desarrollo de la sonda basada en p32 (Perkin Elmer). La sonda 25 se limpia mediante las columnas Quant Probe. G50 (Amersham 27-5335-01 ). Se usan dos millones de cuentas de CPM para hibridar las transferencias Southern durante la noche. Despues de la hibridación durante una noche las transferencias después se someten a dos lavados de 20 minutos a 65°C en 0.1 % de SDS, 5 0.1 SSC. Las transferencias después se exponen a la película durante la noche, con incubación a -80°C.

Análisis bioquímico - Soja: Muestreo de tejido y extracción de proteína AAD-12 (v1 ) de las hojas de soja. Aproximadamente 50 a 100 mg de tejido foliar se muestreó de las hojas N-2 que ío estaban pintadas en las hojas con 2,4-D, pero después de 1 DAT.

La hojuela N-2 terminal se retiró y cortó en trozos pequeños o discos de hoja perforados con agujero simple 2 (~0.5 cm de diámetro) y se congelaron en hielo seco instantáneamente. El análisis de proteína (análisis ELISA y Western) se completó en 15 consecuencia.

Evaluación de progenie T1 : las plantas T0 se dejarán autofecundar para derivar las familias T1 . La prueba de progenie (análisis de segregación) se realizará usando glufosinato a 560 g ai/ha como agente de selección aplicado en la etapa de 0 crecimiento V1 -V2. Las plantas sobrevivientes se analizarán adicionalmente para determinar la tolerancia a 2,4-D en una o más etapas de crecimiento de V2-V6. La semilla se producirá a través de la autofertilización para permitir una prueba de herbicidas más amplia sobre la soja transgénica. 5 Las plantas de soja transgénica AAD-12 (v1 ) Maverick se han generado a traves del sistema de transformación mediada por Agrobacterium. Las plantas TO obtenidas toleraron hasta niveles 2 x de las aplicaciones de campo de 2,4-D y desarrollaron semillas fértiles. La frecuencia de las plantas de soja transgénica fértiles 5 fue hasta 5.9% . La integración del gen AAD1 -12 (v1 ) en el genoma de la soja se confirmó por análisis de transferencia Southern. Este análisis indicó que la mayor parte de las plantas transgénicas contenían un número bajo de copias. Las plantas detectadas con anticuerpos AAD-12 (v1 ) fueron positivas para el ío ELISA y presentaron la banda apropiada en el análisis Western .

Método de transformación 2 - Transformación mediada por rayo-aerosol del tejido del callo de soja embriogénico: El cultivo del tejido del callo de soja embriogénico y posterior radiación se puede obtener como se describe en la Patente Estadounidense 15 No. 6,809,232 (Held et al.) para crear transformantes usando constructos provistos en la presente.

Método de transformación 3 - Bombardeo biolístico de la soja: Esto se puede obtener usando semilla madura derivada del meristemo de los ejes embrionarios (McCabe et al. (1988)). 20 Después de los métodos establecidos de bombardeo biolístico, se puede esperar la recuperación de las plantas de soja transformadas.

Método de transformación 4 - Transformación mediada por Whiskers: La preparación del whiskers y transformación de 25 whiskers se puede realizar de acuerdo con los métodos previamente descriptor por Terakawa et al. (2005)). Despues de los métodos establecidos de bombardeo biolístico, se puede esperar la recuperación de las plantas de soja transformadas.

Las semillas Maverick se esterilizaron en superficie en 70% de etanol durante 1 minutos seguido por inmersión en 1 % de hipoclorito de sodio durante 20 minutos y después se lavaron tres veces en agua destilada estéril. Las semillas se sumergieron en agua destilada durante 18 - 20 horas. Los ejes embrionarios se escindieron de las semillas, y los meristemos apicales se expusieron al retirar las hojas primarias. Los ejes embrionarios se ubicaron en el medio de bombardeo [BM: medio de sales básales MS (Murashige y Skoog 1962), 3% de sacarosa y 0.8% de fitagel Sigma, pH 5.7] con la región apical dirigida hacia arriba en placas de cultivo de 5 cm que contienen 12 mi de medio de cultivo.

Método de transformación 5 - La transformación mediada por bombardeo de partículas para el tejido del callo embrionario se puede optimizar de acuerdo con los métodos previos (Khaiafalla et al. , 2005; El-Shemy et al. , 2004, 2006).

Ejemplo 8 AAD-12 (v1 ) en algodón Protocolo de transformación de algodón: Las semillas de algodón (genotipo Co310) se esterizan en superficie en 95% de etanol durante 1 minuto, se lavan, esterilizan con 50% de lavandina comercial durante veinte minutos, y después se enjuagan tres veces con agua destilada estéril antes de germinar en el medio G (Tabla 21 ) en recipientes Magenta GA-7 y se mantienen bajo intensidad luminosa alta de 40 - 60 mE/m2, con un fotoperíodo ajustado a 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad a 28°C. 5 Los segmentos de cotiledón (~5 mm) cuadrados se aíslan de plántulas de 7 - 10 días en medio líquido M (Tabla 21 ) en placas de Petri (Nunc, artículo #0875728). Los segmentos cortador se tratan con una solución de Agrobacterium (durante 30 minutos) despues se transfieren a medio M semisólido (Tabla 21 ) y se ío somete a co-cultivo durante 2 - 3 días. Después del cocultivo, los segmentos se transfieren al medio MG (Tabla 21 ). Carbenicilina es el antibiótico usado para matar el Agrobacterium y glufosinato- amonio es el agente de selección que puede permitir solo el crecimiento de las células que contienen el gen transferido. 15 Preparación de Agrobacterium : se inoculan 35 mi de media Y (Tabla 21 ) (que contiene estreptomicina (patrón 100 mg/ml) y eritromicina (patrón 100 mg/ml)), con una ansa de la bacteria para cultivar durante la noche en la oscuridad a 28°C. , mientras se agita a 150 rpm. Al día siguiente, se vierte la solución de 0 Agrobacterium en un tubo oakridge estéril (Nalge-Nunc, 3139- 0050), y se centrifuga en Beckman J2 - 21 a 8,000 rpm durante 5 minutos. Se retira el sobrenadante y se resuspende el pellet en 25 mi de líquido M (Tabla 21 ) y se agita en vórtex. Se coloca una alícuota en un tubo de cultivo de vidrio (Fisher, 14-961 -27) para 5 la lectura Klett (Klett-Summerson, modelo 800-3). Se diluye la nueva suspensión usando medio líquido M hasta la lectura en un medidor Klett de 108 unidades formadoras de colonia por mi con un volumen total de 40 mi.

Despues de tres semanas, los callos de los segmentos del cotiledón se aíslan y transfieren al medio MG fresco. El callo se transfiere durante 3 semanas adicionales al medio MG. En una comparación lado a lado, el medio MG se puede suplementar con diclorprop (añadido al medio en una concentración de 0.01 y 0.05 mg/l) para suplementar la degradación de 2,4-D, ya que diclorprop no es un sustrato para la enzima AAD-12, sin embargo diclorprop es más activo sobre el algodón que 2,4-D. En una comparación separada, los segmentos que se sembraron en el medio MG que no contiene regulador de crecimiento en comparación con el medio MG estándar, mostraron formación de callo reducida, pero aún hay crecimiento del callo. El callo después se transfiere al medio CG (Tabla 21 ), y se transfiere de nuevo a medio de selección fresco después de tres semanas. Después de otras tres semanas el tejido dei callo se transfiere al medio D (Tabla 21 ) que carece de reguladores del crecimiento para la inducción del callo embriogénico. Después de 4 - 8 semanas en este medio, se forma el callo embriogénico y se puede distinguir del callo no embriogénico por su color amarillento-objetivo y las células granulares. Los embriones comienzan a regenerarse poco después y son de color verde distinto. El algodón puede tardar en regenerarse y formar embriones, una de las maneras de acelerar este proceso es estresar el tejido. La desecación es una manera común para lograr esto, por medio de cambios en el microambiente del tejido y la placa, por medio del uso de menos medio de cultivo y/o adopción de varios modos de cierre de la placa (cinta versus parafilm).

Los embriones bien desarrollados, más grandes se aíslan y transfieren al medio DK (Tabla 21 ) para el desarrollo de los embriones. Despues de 3 semanas (o cuando los embriones se han desarrollado), los embriones germinados se transfieren al medio fresco para el desarrollo de brotes y ralees. Después de 4-8 semanas, algunas plantas bien desarrolladas se transfieren a la tierra y se cultivan hasta la madurez. Después de un par de meses, la planta se cultiva hasta un punto en que se puede pulverizar para determinar si tiene resistencia a 2,4-D.

Transformación de células: Se iniciaron varios experimentos en que los segmentos de cotiledón se trataron con Agrobacterium que contiene pDAB724. Más de 2000 de los segmentos resultantes se trataron usando varias opciones de auxina para la proliferación del callo de algodón pDAB724, sea: 0.1 o 0.5 mg/l de R-diclorprop, concentración de 2,4-D estándar y sin tratamiento con auxina. El callo se seleccionó con glufosinato-amonio, debido a la inclusión del gen PAT en el constructo. El análisis de la línea de callo en forma de PCR e Invader se usará para determinar si es seguro que el gen estaba presente en la etapa de callo; después las líneas de callo que son embriogénicos se enviarán para el análisis Western. El callo embriogénico del algodón se sometió a estrés usando téenicas de desecación para mejorar la calidad y cantidad de tejido recuperado. Casi 200 eventos de callo se han analizado para determinar la PTU intacta y la expresión usando análisis Western para el gen AAD-12 (v1 ).

Regeneración de plantas: Las líneas de algodón AAD-12 (v1 ) que ha producido las plantas de acuerdo con el protocolo anterior se enviarán al invernadero. Para demostrar que el gen AAD-12 (v1 ) proporciona resistencia a 2,4-D en algodón, la planta 5 de algodón AAD-12 (v1 ) y plantas de algodón tipo salvaje se pulverizarán con un pulverizador automático que suministra 560 g ae/ha de 2,4-D a un volumen de pulverización de 187 l/ha. Las plantas se evaluarán a los 3 y 14 días despues del tratamiento. Las plantas que sobreviven a una tasa selectiva de 2,4-D se ío autopolinizarán para crear semillas T1 o se cruzan en forma exogámica con una línea de algodón elite para producir semillas F1 . La posterior semilla producida se plantará y evaluará para determinar la resistencia a herbecidas como se describió previamente. Los eventos AAD-12 (v1 ) se pueden combinar con 15 otros rasgos HT o I R deseados.

Ejemplo 9 Transformación con Agrobacterium de otros cultivos A la luz de la presente descripción, cultivos adicionales se pueden transformar de acuerdo con la presente invención usando 0 téenicas que son conocidas en la técnica. Para transformación mediada por Agrobacterium del centeno, ver, por ejemplo, Popelka y Altpeter (2003). Para la transformación mediada por Agrobacterium de soja, ver, por ejemplo, Hinchee et al. , 1988. Para la transformación mediada por Agrobacterium de sorgo, ver, 5 por ejemplo, Zhao et al. , 2000. Para la transformación mediada por Agrobacterium de cebada, ver, por ejemplo, Tingay et al., 1997. Para la transformación mediada por Agrobacterium de trigo, ver, por ejemplo, Cheng et al. , 1997. Para la transformación mediada por Agrobacterium de arroz, ver, por ejemplo, Hiei et al., 1997.

Los nombres latinos de estas y otras plantas se dan a continuación . . Debe quedar claro que estas y otras teenicas de transformación (no Agrobacterium) se pueden usar para transformar AAD-12 (v1 ), por ejemplo, en estas y otras plantas, que incluyen pero sin limitación maíz (Zea mays), trigo (Triticum spp .), arroz (Oryza spp. y Zizania spp.), cebada (Hordeum spp.), algodón (Abroma augusta y Gossypium spp.), soja (Glycine max), azúcar y remolacha de mesa (Beta spp.), caña de azúcar ( Arenga pinnata), tomate (Lycopersicon esculentum y otras spp. , Physalis ixocarpa, Solanum incanum y otras spp. , y Cyphomandra betacea), papa (Solanum tubersoum), batata (Ipomoea betatas), centeno (Secale spp.), pimientos (Capsicum annuum, sinense y frutescens), lechuga (Lactuca sativa, perennis y pulchella), repollo (Brassica spp), apio (Apium graveolens), berenjena (Solanum melongena), maní (Arachis hipogeos), sorgo (todas las especies Sorghum), alfalfa (Medicago sativua), zanahoria (Daucus carota), porotos (Phaseolus spp. y otros géneros), avena (Avena sativa y strigosa), arvejas (Pisum, Vigna y Tetragonolobus spp.), girasol (Helianthus annuus), calabaza (Cucúrbita spp.), pepino (Cucumis sativa), tabaco (Nicotiana spp.), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Cesped (Lolium, Agrostis, Poa, Cynadon y otros géneros), trébol (Tifolium), algarroba (Vicia). Estas plantas, con 12-AAD (v1 ) los genes, por ejemplo, se incluyen en la presente invención.

AAD-12 (v1 ) tiene el potencial de aumentar la aplicabilidad de los herbicidas auxínicos clave para su uso en la temporada en muchos sistemas de cultivos madereros caducifolios y perennes. Las especies de madera resistentes a triclopir, 2,4-D, y/o fluoroxipir pueden aumentar la flexibilidad de uso excesivo de estos herbicidas sin problemas de lesiones. Estas especies podrían incluir, pero sin limitación: aliso (Alnus spp.), fresno (Fraxinus spp.), especies de álamo temblón y álamo (Populus spp.), haya (Fagus spp.), abedul (Betula spp.), cereza ( Prunus spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), nogal (Carya spp.), arce (Acer spp.), roble (Quercus spp) y pino (Pinus spp.) El uso de la resistencia a la auxina para el control selectivo de malezas en especies ornamentales y frutales está también dentro del alcance de esta invención. Algunos ejemplos pueden incluir, pero sin limitación, rosa (Rosa spp.), zarza ardiente (Euonymus spp.), petunia (Petunia spp), begonia (Begonia spp.), rododendro (Rhododendron spp), manzano silvestre o manzana (Malus spp .), pera (Pyrus spp.), durazno (Prunus spp), y maravillas (Tagetes spp.).

Ejemplo 10 Evidencia adicional de resultados sorprendentes: AAD-12 versus AAD-2 Clonación inicial de AAD-2 (v1 ): Se identificó otro gen de la base de datos de NCBI (ver el sitio web ncbi. nlm. nih .gov; acceso #AP005940) como un homólogo con solo 44% de identidad de aminoácido con tfdA. Este gen se denomina en la presente AAD-2 (v1 ) para mantener la coherencia. Se determinó el porcentaje de identidad primero por la traducción de las secuencias de ADN de AAD-2 y tfdA (SEC ID No. ; 12 de PCT/US2005/014737 y acceso GENBANK No. M 16730, respectivamente) a proteínas (SEC ID No.: 13 de PCT/US2005/014737 y acceso GENBANK No. M 16730, respectivamente), despues se usa ClustalW en el paquete informático de VectorNTI para realizar el alineamiento de secuencia múltiple.

La cepa de Bradyrhizobium japonicum que contiene el gen AAD-2 (v1 ) se obtuvo de Northern Regional Research Laboratory (NRRL, cepa #B4450). La cepa liofilizada se revivió de acuerdo con el protocolo NRRL y se almacenó a -80°C en 20% de glicerol para uso interno como la cepa Dow Bacterial DB 663. De este patrón congelado, después se retiró una placa de agar de soja tríptico con un ansa de siembra de células para el aislamiento y se incubó a 28°C durante 3 días. Se usó una colonia única para inocular 100 mi de caldo de soja trítico en un matraz con triple separación de 500 mi, que se incubó durante la noche a 28°C en agitador de piso a 150 rpm. De este, se aisló el ADN total con el protocolo gramnegativo del kit DNeasy de Qiagen (Qiagen cat. #69504). Los siguientes cebadores se diseñaron para amplificar el gen objetivo de ADN genómico ADN , delantero: 5' ACT AGT AAC AAA GAA GGA GAT ATA CCA TGA CGA T 3' [(brjap 5'(spel) SEC ID No. : 14 of PCT/US2005/014737 (sitio de restricción Spe I y sitio de unión de ribosoma añadido (RBS))] e Inverso: 5' TTC TCG AGC TAT CAC TCC GCC GCC TGC TGC TGC 3' [(br jap 3' (xhol) SEC ID No. : 15 of PCT/US2005/014737 (se añadió un sitio Xho I)].

Se montaron reacciones de cincuenta microlitros de la siguiente manera: amortiguador Fail Safe 25 ml, cebador ea. 1 pl (50 ng/mI), gADN 1 mI (200 ng/mI), H.sub.20 21 mI, Taq polimerasa 1 mI (2.5 unidades/mI). Se usaron tres amortiguadores Buffers Fail Safe A, B, y C en tres reacciones separadas. Después se llevó a cabo la PCR en las siguientes condiciones: 95°C 3.0 minutos del ciclo de desnaturalización térmica; 95°C 1 .0 minuto, 50°C 1 .0 minuto, 72°C 1 .5 minutos, durante 30 ciclos; seguido por un ciclo final de 72°C 5 minutos, usando el sistema de PCR FailSafe (Epicenter cat. #F599100). El producto de PCR resultante de ~1 kb se clonó en pCR 2.1 (I nvitrogen cat. #K4550-40) siguiendo el protocolo incluido, con TOP10F' E. coli químicamente competentes como cepa huésped, para la verificación de las secuencia de nucleótidos.

Diez de las colonias blancas resultantes se recolectaron en 3 mI de caldo Luria + 1000 mg/ml de ampicilina (LB Amp), y se cultivaron durante la noche a 37°C con agitación . Los plásmidos se purificaron de cada cultivo usando el kit Nucleospin Plus Plasmid Miniprep (BD Biosciences cat. #K3063-2) y se siguió el protocolo incluido. La digestión por restricción del ADN aislado se completó para confirmar la presencia del producto de PCR en el vector pCR2.1 . El ADN del plásmido se digirió con la enzima de restricción EcoRI (New England Biolabs cat. #R0101 S). Se llevó a cabo la secuenciación con el kit Beckman CEQ Quick Start (Beckman Coulter cat. #608120) usando los cebadores M 13 delantero [5‘ GTA AAA CGA CGG CCA G 3'] (SEC ID No. : 6) e inverso [5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3'] (SEC ID No. : 7), según las instrucciones del fabricante. Se dio una nueva denominación general a esta secuencia del gen y su correspondiente proteína AAD-2 (v1 ) por coherencia interna.

Terminación del vector binario AAD-2 (v1 ): El gen AAD-2 (v1 ) se amplificó por PCR del pDAB3202. Durante la reacción de PCR se realizaron alteraciones dentro de los cebadores para introducir los sitios de restricción Afll l l y Sacl en el cebador 5' y cebador 3', respectivamente. Ver PCT/US2005/014737. Los cebadores “Ncol de Brady” [5' TAT ACC ACA TGT CGA TCG CCA TCC GGC AGC TT 3'] (SEC ID No. : 14) y “Sacl de Brady” [5' GAG CTC CTA TCA CTC CGC CGC CTG CTG CTG CAC 3'] (SEC I D No.: 15) se usaron para amplificar un fragmento de ADN usando el sistema de PCR Fail Safe (Epicentre). El producto de PCR se clonó en el vector de clonación pCR2.1 TOPO TA (Invitrogen) y se verificó la secuencia con los cebadores M 13 delantero y M13 inverso usando los reactivos de secuenciación de Beckman Coulter “Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit”. Los datos de secuencia identificaron un clon con la secuencia correcta (pDAB716). El fragmento del gen Afll l l/Sacl AAD-2 (v1 ) despues se clonó en el vector Ncol/Sacl pDAB726. El constructo resultante (pDAB717); promotor AtUbM O: Nt OSM 5'UTR: AAD-2 (v1 ): Nt OSM3'UTR: ORF1 poIyA 3'UTR se verificó con los digestos de restricción (con Ncol/Sacl). Este constructo se clonó en el vector binario pDAB3038 como un fragmento de ADN Notl-Notl . El constructo resultante (pDAB767); promotor AtUbM O: Nt OSM5'UTR: AAD-2 (v1 ): Nt OSM 3'UTR: ORF1 poIyA 3'UTR: promotor CsVMV: PAT: ORF25/26 3'UTR se digirió por restricción (con Nod, EcoRI , HinDI I I , Ncol , Pvull , y Salí) para la verificación de la orientación correcta. El constructo completo (pDAB767) después se usó para la transformación en Agrobacterium.

Evaluación de Arabidopsis transformados: Las semillas T1 recién recolectadas transformadas con un gen de planta AAD-12 (v1 ) optimizado o AAD-2 (v1 ) nativo se plantaron y seleccionaron para determinar la resistencia al glufosinato como se describió previamente. Las plantas después se asignaron aleatoriamente a varias tasas de 2,4-D (50 - 3200 g ae/ha). Las aplicaciones de herbicida se aplicaron con pulverizador automático en un volumen de pulverización de 187 l/ha. Se usó 2,4-D como la formulación comercial de sal dimetilamina (456 g ae/L, NuFarm, St Joseph, Mo.) mezclada en amortiguador Tris 200 mM (pH 9.0) o amortiguador HEPES 200 mM (pH7.5).

AAD-12 (v1 ) y AAD-2 (v1 ) proporcionaron resistencia a 2,4-D detectable versus las líneas control transformadas y no transformadas; sin embargo, los constructos individuales fueron muy variables en su capacidad de impartir resistencia a 2,4-D a las plantas T1 de Arabidopsis individuales. De modo sorprendente, los transformantes AAD-2 (v1 ) y AAD-2 (v2) eran mucho menos resistentes a 2,4-D que el gen AAD-12 (v1 ), tanto de una frecuencia de plantas muy tolerantes así como de la lesión promedio global. No hay plantas transformadas con AAD-2 (v1 ) que sobrevivieron a 200 g ae/ha de 2,4-D no lesionadas relativamente (<20% de lesión visual), y la lesión de la población global fue de aproximadamente 83% (ver PCT/US2005/014737). A la inversa, AAD-12 (v1 ) presentó una lesión de la población promedio de aproximadamente 6% cuando se trató con 3,200 g ae/ha 2,4-D. La tolerancia mejoró ligeramente para AAD-2 (v2) optimizado en la planta versus el gen nativo; sin embargo, la comparación de los genes optimizados en la planta AAD-12 y AAD-2 indica una ventaja significativa para AAD-12 (v1 ) en la planta.

Estos resultados son inesperados debido a que la comparación in vitro de AAD-2 (v1 ) (ver PCT/US2005/014737) y AAD-12 (v2) indicó que ambos eran muy eficaces para degradar 2,4-D y ambos compartían una especificidad tipo S con respecto a los sustratos de ariloxialcanoato quirales. AAD-2 (v1 ) se expresa en las plantas T1 individuales en niveles variados; sin embargo, esta proteína expresada suministra poca protección frente a la lesión de 2,4-D. No fue evidente una diferencia sustancial en el nivel de expresión de proteína (en planta) para los genes AAD-2 nativo y optimizado en planta (ver PCT/US2005/014737). Estos datos corroboran los hallazgos preliminares que obtienen la expresión funcional de AAD-12 (v1 ) en la planta, y la inesperada resistencia a herbicidas resultante para los herbicidas 2,4-D y piridiloxiacetato.

Ejemplo 1 1 Uso en cultivo de herbicidas fenoxi auxinas en soja, algodón, y otros cultivos dicotiledóneos transformados solo con AAD-12 (v1 ) AAD-12 (v1 ) puede permitir el uso de herbicidas de fenoxi auxina (por ejemplo, 2,4-D y MCPA) y piridiloxi auxinas (triclopir y fluoroxipir) para el control de un amplio espectro de malezas de hoja ancha directamente en cultivos normalmente sensibles al 2,4-D. La aplicación de 2,4-D a 280 hasta 2240 g ea/ha puede controlar la mayoría de las especies de malezas de hoja ancha presentes en ambientes agronómicos. Más generalmente, se usan 560 - 1 120 g ae/ha. Para triclopir, las tasas de aplicación normalmente varían de 70 hasta 1 .120 g ae/ha, más típicamente de 140 a 420 g ea/ha. Para fluoroxipir, las tasas de aplicación normalmente varían de 35 hasta 560 g ae/ha, más típicamente de 70 a 280 ae/ha.

Una ventaja de esta herramienta adicional es el costo extremadamente bajo del componente herbicida de hoja ancha y el potencial control residual de malezas de vida corta provisto por las tasas más altas de 2,4-D, triclopir y fluoroxipir cuando se usa a tasas más altas, mientras que un herbicida no residual como el glifosato no puede proporcionar el control de las malezas que germinan más tarde. Esta herramienta tambien proporciona un mecanismo para combinar los modos de acción herbicida con la conveniencia de HTC como una resistencia a los herbicidas integrados y la estrategia de manejo de cambio de malezas.

Una ventaja adicional que proporciona esta herramienta es la capacidad de mezclar en tanque los herbicidas de control de malezas de hoja ancha de amplio espectro (por ejemplo, 2,4-D, triclopir y fluoroxipir) con herbicidas de control de malezas residuales comúnmente usadas. Estos herbicidas se aplican típicamente antes o durante la plantación, pero a menudo son menos efectivos en las malezas establecidas, emergidas que puedan existir en el campo antes de la siembra. Al extender la utilidad de estos herbicidas de ariloxi auxina para incluir aplicaciones en la planta, antes de la emergencia o antes de la plantación, se aumenta la flexibilidad de los programas de control de malezas residuales. Los expertos en la téenica pueden reconocer que el programa herbicida residual será diferente sobre la base del cultivo de interés, pero los programas típicos pueden incluir herbicidas de las familias de herbicidas de cloroacetamida y dinitroanilina, pero tambien incluir herbicidas como clomazona, sulfentrazona, y una variedad de herbicidas inhibidores de ALS, inhibidores de PPO e inhibidores de HPPD.

Otros beneficios podrían incluir la tolerancia al 2,4-D, triclopir o fluoroxipir requerida antes de plantar después de la aplicación de herbicidas auxina ácido ariloacético (ver el ejemplo anterior), y menos problemas de lesión por contaminación a los cultivos de dicotiledóneos resultantes de los tanques a granel limpiados en forma incompleta que habían contenido 2,4-D, triclopir o fluoroxipir. Dicamba (y muchos otros herbicidas) todavía se pueden usar para el control posterior de cultivos de dicotiledóneas voluntarias transformadas por DAA-12 (v1 ).

Los expertos en la téenica también reconocerán que el ejemplo anterior se puede aplicar a cualquier cultivo sensible a de 2,4-D (u otro herbicida ariloxi auxina) que estaría protegidos por el gen AAD-12 (v1 ) si está transformado en forma estable. Los expertos en la técnica de control de malezas ahora reconocerán que el uso de varios herbicidas comerciales fenoxi o piridiloxi auxina solos o en combinación con un herbicida está permitido por la transformación de AAD-12 (v1 ). Las tasas específicas de otros herbicidas representativos de estas reacciones químicas se pueden determinar mediante las etiquetas de los herbicidas compilados en el libro CPR (Crop Protection de referencia) o recopilación similar o cualquiera de las referencias de protección de cultivos comerciales o académicas, como la Guía de Protección de Cultivos de Agriliance (2005). Cada herbicida alternativo permitido para usar en los HTC por AAD-12 (v1 ), si se usa solo, mezclado en tanque o de forma secuencial, se considera dentro del alcance de esta invención .

Ejemplo 12 Uso en cultivo de herbicidas fenoxi auxina y piridiloxi en maíz, arroz, y otras especies monocotiledóneas solo transformadas en AAD-12 (v1 ) En una forma análoga, la transformación de las especies de pasto (como, pero sin limitación, maíz, arroz, trigo, cebada, pasto o cesped y pastos) con AAD-12 (v1 ) permitiría el uso de fenoxi piridiloxi auxinas muy eficaces en cultivos en los que normalmente la selectividad no está determinada. La mayoría de las especies de gramíneas tienen una tolerancia natural a los herbicidas auxínicos como las fenoxi auxinas (es decir, 2,4-D.). Sin embargo, un nivel relativamente bajo de selectividad de los cultivos ha producido la disminución de utilidad en estos cultivos debido a una ventana corta del momento de la aplicación o el riesgo de daño inaceptable. Los cultivos de monocotiledóneas transformados con AAD-12 (v1 ) permitirían , por lo tanto, el uso de una combinación similar de los tratamientos descritos para los cultivos de dicotiledóneas, como la aplicación de 2,4-D en 280 hasta 2240 g ea/ha para el control de la mayor parte de las especies de malezas de hoja ancha. Más generalmente, se usan 560 - 1 120 g ae/ha. Para triclopir, las tasas de aplicación pueden variar normalmente de 70 hasta 1 120 g ae/ha, más típicamente de 140 a 420 g ea/ha. Para fluoroxipir, las tasas de aplicación pueden variar de 35 hasta 560 g ae/ha, más típicamente de 70 a 280 ae/ha.

Una ventaja de esta herramienta adicional es el costo extremadamente bajo del componente herbicida de hoja ancha y el potencial de lograr un control de malezas de corta duración provisto por las tasas más altas de 2,4-D, triclopir o fluoroxipir. En contraste, un herbicida no residual como glifosato no proporcionaría control de las malezas de germinación tardía. Esta herramienta tambien puede proporcionar un mecanismo para rotar los modos de acción herbicida con la conveniencia de HTC como una estrategia de resistencia a los herbicidas integrada y de manejo del cambio de malezas en una estrategia de combinación de cultivo tolerante a glifosato/AAD-12 (v1 ) HTC, se rote o no las especies de cultivo.

Una ventaja adicional que proporciona esta herramienta es la capacidad de mezclar en tanque los herbicidas de control de malezas de hoja ancha de amplio espectro (por ejemplo, 2,4-D, triclopir y fluoroxipir) con herbicidas de control de malezas residuales comúnmente usadas. Estos herbicidas se aplican típicamente antes o durante la plantación , pero a menudo son menos efectivos en las malezas establecidas, emergidas que puedan existir en el campo antes de la siembra. Al extender la utilidad de estos herbicidas de ariloxi auxina para incluir aplicaciones en la planta, antes de la emergencia o antes de la plantación, se aumenta la flexibilidad de los programas de control de malezas residuales. Los expertos en la teenica pueden reconocer que el programa herbicida residual será diferente sobre la base del cultivo de interés, pero los programas típicos pueden incluir herbicidas de las familias de herbicidas de cloroacetamida y dinitroanilina, pero también incluir herbicidas como clomazona, sulfentrazona, y una variedad de herbicidas inhibidores de ALS, inhibidores de PPO e inhibidores de HPPD.

El aumento de la tolerancia de maíz, arroz, y otras monocotiledóneas a los fenoxi o piridiloxi auxinas deberá permitir el uso de estos herbicidas en el cultivo sin restricciones etapa de crecimiento o el potencial para el cultivo inclinado, fenómenos de despliegue como “rat-tailing”, cultivo inclinado, fragilidad del tallo inducida por el regulador de crecimiento en maíz o raíces de sostén deformes. Cada herbicida alternativo permitido para usar en los HTC por AAD-12 (v1 ), si se usa solo, mezclado en tanque o de forma secuencial, se considera dentro del alcance de esta invención.

Ejemplo 13 AAD-12 (v1 ) en arroz Descripción de los medios: Los medios de cultivo usados se ajustaron a pH 5.8 con 1 M KOH y se solidificaron con 2.5 g/l de Phytagel (Sigma). Los callos embriogénicos fueron cultivados en discos de Petri de 100 x 20 mm que contenían 40 mi de medio semisólido. Las plántulas de arroz se cultivaron en 50 mi de medio en cajas Magenta. Las suspensiones de celulas se mantuvieron en matraces cónicos de 125 mi que contenían 35 mi de medio líquido y se hicieron rotar a 125 rpm. La inducción y el 5 mantenimiento de los cultivos embriogénicos se realizaron en la oscuridad a 25 - 26°C, y la regeneración de la planta y el cultivo de la planta entera se realizaron en un fotoperíodo de 16 horas (Zhang et al. 1996).

La inducción y el mantenimiento de callos embriogénicos se ío realizó en medio basal NB como se describió previamente (Li et al. 1993), pero adaptado para contener 500 mg/l de glutamina. Los cultivos de las suspensiones se iniciaron y mantuvieron en medio líquido SZ (Zhang et al. 1998) con la inclusión de 30 g/l de sacarosa en lugar de maltosa. El medio osmótico (NBO) consistía 15 en medio NB con la adición de 0.256M cada uno de manitol y sorbitol. Los callos resistentes a higromicina B fueron seleccionados en medio NB suplementado con 50 mg/l de higromicina B durante 3 a 4 semanas. La pre-regeneración se realizó en un medio (PRH50) que consistía en medio NB sin ácido 20 2.4-diclorofenoxiacético (2,4-D), pero con la adición de 2 mg/l de 6-bencilaminopurina (BAP), 1 mg/l de ácido a-naftalenoacético (NAA), 5 mg/l de ácido abscísico (ABA) y 50 mg/l de higromicina B durante 1 semana. La regeneración de las plántulas siguió a través de cultivo en un medio de regeneración (RNH50) que 5 comprendía medio NB sin 2,4-D, y suplementado con 3 mg/l de BAP, 0.5 mg/l de NAA, y 50 mg/l de higromicina B hasta que se regeneraron los brotes. Los brotes se transfirieron a medio de enraizamiento con sales básales de Murashige y Skoog de media concentración y vitaminas B5 de Gamborg, suplementado con 1 % de sacarosa y 50 mg/l de higromicina B (1 /2MSH50).

Desarrollo del cultivo de tejido: Semillas desecadas maduras de Oryza sativa L. japónica cv. Taipei 309 fueron esterilizadas como se describió en Zhang et al. 1996. Los tejidos embriogenicos fueron inducidos cultivando semillas de arroz maduras estériles en medio NB en la oscuridad. Callos primarios de aproximadamente 1 mm de diámetro fueron removidos del escutelo y usados para iniciar la suspensión celular en medio líquido SZ. Las suspensiones se mantuvieron después como se describió en Zhang 1995. Los tejidos embriogénicos derivados de la suspensión fueron removidos del cultivo líquido 3 a 5 días después del subcultivo previo y colocados en medio osmótico NBO para formar un círculo de aprox. 2.5 cm a través en un disco de Petri y cultivados durante 4 horas antes del bombardeo. Dieciséis a 20 hs después del bombardeo, los tejidos fueron transferidos del medio NBO a un medio de selección de higromicina B NBH50, asegurándose de que la superficie bombardeada estaba orientada hacia arriba, y se incubaron en la oscuridad durante 14 - 17 días. Los callos recién formados se separaron después de los explantes bombardeados originales y se colocaron cerca en el mismo medio. Después de 8 - 12 días adicionales, se identificaron visualmente callos opacos, relativamente compactos, y se transfirieron a medio de pre regeneración PRH50 durante 7 días en la oscuridad. Los callos cultivados, que se tornaban más compactos y opacos fueron subcultivados despues sobre medio de regeneración RN H50 durante un período de 14 - 21 días bajo un fotoperíodo de 16 horas. Los brotes que se regeneraban fueron transferidos a cajas Magenta que contenían medio 1 /2MSH50. Las múltiples plantas regeneradas de un solo explante eran consideradas hermanas y fueron tratadas como una línea de plantas independientes. Una planta se evaluaba como positiva para el gen hph si producía raíces blancas, gruesas y crecía vigorosamente en medio 1/2MSH50. Una vez que las plántulas alcanzaron la parte superior de las cajas Magenta, fueron transferidas al suelo en una maceta de 6 cm bajo 100% de humedad durante una semana, después se trasladaron a una cámara de cultivo con un período de luz de 14 hs a 30°C y en la oscuridad a 21 °C durante 2 a 3 semanas antes de trasplantarlas a macetas de 13 cm en el invernadero. Las semillas fueron recogidas y secadas a 37°C durante una semana antes del almacenamiento.

Bombardeo con microproyectiles: Todos los bombardeos fueron realizados con el sistema Biolistic PDS-1000/He™ (Bio-Rad, Laboratories, I nc.). Tres miligramos de partículas de oro de 1.0 micrón de diámetro se lavaron una vez con 100% de etanol, dos veces con agua destilada estéril y se volvieron a suspender en 50 mI de agua en un tubo de Eppendorf siliconado. Cinco microgramos de ADN plásmido que representaba una relación molar de 1 :6 entre pDOW3303 (vector que contiene Hpt) y pDAB4101 (AAD-12 (v1 )+AHAS), 20 ml de espermidina (0.1 M) y 50 mI de cloruro de calcio (2.5M) se agregaron a la suspensión de oro. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 10 min, se formaron pellets a 10000 rpm durante 10 s, se volvieron a suspender en 60 mI de etanol al 100% frío y 8-9 mI se distribuyeron en cada macrovehículo. Muestras de tejidos se bombardearon a 1 100 psi y 27 pulgadas de Hg de vacío como describieron Zhang et al. (1996).

Tolerancia a herbicidas postemergencia en arroz T0 transformado con AAD-12 (v1 ): Plántulas de arroz en el estado de 3 a 5 hojas fueron rociadas con una dosis letal de una solución al 0.16% (v/v) de Pursuit (para confirmar la presencia del gen AHAS) que contenía 1 % de Sunit I I (v/v) y 1 .25% de UAN (v/v) usando un rociador de pista calibrado a 187 l/ha. La evaluación con respecto a la sensibilidad o resistencia se realizó 36 días despues del tratamiento (DAT). Diez de los 33 eventos enviados al invernadero fueron robustamente tolerantes al Pursuit; otros sufrieron diversos niveles de lesiones por el herbicida. Se tomaron muestras de las plantas y se realizó la caracterización molecular que identificó siete de estos 10 eventos como conteniendo el AAD-12 (v1 ) PTU y toda la región codificadora de AHAS.

Heredabilidad de AAD-12 (v1 ) en arroz T1 : Se realizó un test de progenie de 100 plantas en cinco líneas T1 de líneas AAD-12 (v1 ) que contenían el AAD-12 (v1 ) PTU y la región codificadora AHAS. Las semillas fueron plantadas con respecto al procedimiento arriba mencionado y se rociaron con 140 g ae/ha de imazetapir usando un rociador de pista como se describió previamente. Despues de 14 DAT, se contaron las plantas resistentes y sensibles. Dos de las cinco líneas testeadas se segregaron como un solo locus, el rasgo dominante Mendeliano (3R: 1 S) como se determinó por el análisis de Chi cuadrado. El AAD-12 se cosegregó con el marcador seleccionable AHAS como se determinó por el test de tolerancia de 2,4-D indicado más abajo.

Verificación de alta tolerancia de 2,4-D en arroz T1 : Las siguientes líneas de T1 AAD-12 (v1 ) que se segregaban como un solo locus fueron plantadas en macetas de 3 pulgadas que contenían medio Metro Mix: pDAB41 01 (20)003 y pDAB41 01 (27)002. En el estadio de 2 a 3 hojas se rociaron con 140 g ae/ha de imazetapir. Se eliminaron los nulos y los individuos fueron rociados en el estadio V3-V4 en el conjunto de rociador de pista fijado a 187 l/ha a 1 120, 2240 o 4480 g ae/ha de 2,4-D DMA (tasas de uso comercial típicas 2 x, 4 x, y 8 x, respectivamente). Las plantas fueron clasificadas a los 7 y 14 DAT y comparadas con un cultivar de arroz comercial no transformado, Lamont’ como plantas de control negativo.

Los datos de lesiones (Tabla 22) muestran que las líneas transformadas AAD-12 (v1 ) son más tolerantes a altas tasas de 2,4-D DMA que los controles no transformados. La línea pDAB41 01 (20)003 era más tolerante a altos niveles de 2,4-D que la línea pDAB4101 (27)002. Los datos tambien demuestran que la tolerancia de 2,4-D es estable durante por lo menos dos generaciones.

Cosecha de tejidos, aislamiento de ADN y cuantificación: Tejido fresco fue colocado en tubos y liofilizado a 4°C durante 2 días. Despues que el tejido se secó completamente, se colocó una perla de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras fueron 5 sometidas a 1 minuto de molido en seco usando un molino de perlas Kelco. Después se siguió el procedimiento de aislamiento de ADN DNeasy estándar (Qiagen, Dneasy 69109). Una alícuota del ADN extraído se tiñó después con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se escaneó en el fluorómetro (BioTek) con ío estándares conocidos para obtener la concentración en ng/mI.

Expresión de AAD-12 ( v 1 ) : Las 33 líneas de arroz transgénico T0 y 1 control no transgénico fueron analizados con respecto a la expresión de AAD-12 usando la transferencia ELISA. Se detectó AAD-12 en los clones de 20 líneas, pero no en 15 la planta control de la línea Taipai 309. Doce de las 20 líneas que tenían algunos de los clones tolerantes a imazetapir que expresaban la proteína AAD-12, eran positivos con respecto a AAD-12 PCR PTU y positivos con respecto a la región codificadora AHAS. Los niveles de expresión oscilaban entre 2,3 20 y 1092.4 ppm de la proteína soluble total.

Tolerancia de campo de plantas de arroz pDAB4101 a los herbicidas 2,4-D y Triclopir: Se realizó un ensayo de tolerancia a nivel de campo con AAD-12 (v1 ) evento pDAB4101 [20] y un arroz de tipo salvaje (Clearfield 131 ) en Wayside, Miss. (una variedad 25 resistente a imidazolinona no transgénica). El diseño experimental era un diseño en bloques completo aleatorizado con una sola replica. Los tratamientos con herbicidas eran 2 x dosis de 2,4-D (sal de dimetilamina) a 2240 g ae/ha y triclopir a 560 g ae/ha más un control no tratado. En cada tratamiento con herbicida, dos filas de la generación T1 de pDAB4101 [20] y dos filas de arroz Clearfield fueron plantadas usando una pequeña perforadora para parcelas con espaciado entre filas de 8 pulgadas. El arroz pDAB4101 [20] contenía el gen AHAS como un marcador seleccionable para el gen AAD-12(v1 ). Se aplicó Imazetapir en el estadio de una hoja como agente de selección para remover cualesquiera plantas de AAD-12 (v1 ) nulo de las parcelas. Los tratamientos con los herbicidas se aplicaron cuando el arroz alcanzó el estadio de 2 hojas usando un rociador de mochila de aire comprimido que suministraba 187 l/ha de volumen de vehículo a 130 - 200 kpa de presión. Las evaluaciones visuales de lesiones se realizaron a los 7, 14 y 21 días después de la aplicación.

La respuesta del evento AAD-12 (v1 ) a 2,4-D y triclopir se muestra en la Tabla 23. La línea de arroz no transformada (Clearfield) fue severamente lesionada (30% a 7DAT y 35% a 15DAT) por 2,4-D a 2240 g ae/ha que es considerada 4 x la dosis de uso comercial. El evento AAD-12 (v1 ) demostró una excelente tolerancia a 2,4-D sin lesiones observadas a 7 o 15DAT. El arroz no transformado fue lesionado significativamente (15% a 7DAT y 25% a 15DAT) por 2 x la dosis de triclopir (560 g ae/ha). El evento AAD-12 (v1 ) demostró una excelente tolerancia a 2 x la dosis de triclopir sin lesiones observadas a 7 o 15DAT.

Estos resultados indican que el arroz transformado AAD-12 (v1 ) presentó un alto nivel de resistencia a 2,4-D y triclopir a dosis que causaron lesiones visuales severas al arroz Clearfield. Tambien demuestra la capacidad para apilar múltiples genes de tolerancia a herbicidas con múltiples especies AAD-12 I para proporcionar resistencia a un espectro más amplio de químicos efectivos.

Ejemplo 14 AAD-12 (v1 ) en cañóla Transformación de cañóla: El gen AAD-12 (v1 ) que confiere resistencia a 2,4-D se usó para transformar Brassica napus var. Nexera*710 con transformación mediada por Agrobacterium y plásmido pDAB3759. El constructo contenía el gen AAD-12 (v1 ) dirigido por el promotor CsVMV y el gen Pat dirigido por el promotor AtUbil O y el rasgo de resistencia al glifosato EPSPS dirigido por el promotor AtUbil O.

Las semillas fueron esterilizadas en superficie con 10% de blanqueador comercial durante 10 minutos y enjuagadas 3 veces con agua destilada esteril. Las semillas fueron colocadas después en un medio basal MS de media concentración (Murashige y Skoog, 1962) y mantenidas bajo un régimen de cultivo ajustado a 25°C, y un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad.

Segmentos de hipocótilos (3-5 mm) fueron extirpados de plantines de 5 a 7 días y colocados en un medio de inducción de callos K1 D1 (medio MS con 1 mg/l de cinetina y 1 mg/l de 2,4-D) durante 3 días como pre-tratamiento. Los segmentos se transfirieron después a una placa de petri, se trataron con Agrobacterium Z707S o la cepa LBA4404 que contenía pDAB3759. El Agrobacterium se cultivó durante la noche a 28°C en la oscuridad en un agitador a 150 rpm y subsiguientemente se volvió a suspender en el medio de cultivo.

Después de 30 minutos de tratamiento de los segmentos de hipocótilos con Agrobacterium , estos fueron colocados de nuevo en medio de inducción de callos durante 3 días. Después del cocultivo, los segmentos se colocaron en K1 D1 TC (medio de inducción de callos que contiene 250 mg/l de carbenicilina y 300 mg/l de timentina) durante una semana o dos semanas de recuperación. Alternativamente, los segmentos se colocaron directamente en medio de selección K1 D1 H 1 (encima del medio con 1 mg/l Herbiace). Carbenicilina y timentina eran los antibióticos usados para eliminar el Agrobacterium. El agente de selección Herbiace permitió el crecimiento de las celulas transformadas.

Los segmentos de hipocótilos con callos se colocaron después en un medio de regeneración de brotes B3Z1 H 1 (medio MS, 3 mg/l de bencilamino purina, 1 mg/l de zeatina, 0.5 gm/l de MES ácido 2-(N-morfolino) etano sulfónico], 5 mg/l de nitrato de plata, 1 mg/l de Herbiace, carbenicilina y timentina). Después de 2 a 3 semanas los brotes comenzaron a regenerarse. Los segmentos de hipocótilos junto con los brotes son transferidos a medio B3Z1 H3 (medio MS, 3 mg/l de bencilamino purina, 1 mg/l de zeatina, 0.5 gm/L de MES [ácido 2-(N-morfolino) etano sulfónico], 5 mg/l de nitrato de plata, 3 mg/l de Herbiace, carbenicilina y timentina) durante otras 2 a 3 semanas.

Los brotes fueron extirpados de los segmentos de hipocótilos y transferidos al medio de alargamiento de brotes MESH5 o MES10 (MS, 0.5 gm/l de MES, 5 o 10 mg/l de Herbiace, carbenicilina, timentina) durante 2 - 4 semanas. Los brotes alargados fueron cultivados para la inducción de las raíces en MSI .1 (MS con 0.1 mg/l de ácido indolbutírico). Una vez que las plantas tenían un sistema de raíces bien establecido, estas fueron trasplantadas al suelo. Las plantas fueron aclimatadas bajo condiciones ambientales controladas en el Conviron durante 1 a 2 semanas antes de la transferencia al invernadero.

Análisis molecular - Materiales de cañóla y metodos: Cosecha de tejidos, aislamiento del ADN y cuantificación. Tejido fresco fue colocado en tubos y liofilizado a 4°C durante 2 días. Después que el tejido se secó completamente, se colocó una perla de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras se sometieron a 1 minuto de molido en seco usando un molino de perlas Kelco. Después se siguió el procedimiento de aislamiento de ADN DNeasy estándar (Qiagen, DNeasy 69109). Una alícuota del ADN extraído se tiñó después con Pico Green (Sondas Moleculares P7589) y se lcyó en el fluorómetro (BioTek) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/pl.

Reacción en cadena de polimerasa: Un total de 100 ng de ADN total se usó como molde. Se usaron 20 M de cada cebador con el kit Takara Ex Taq PCR Polymerase kit (Mirus TAKRR001 A). Los cebadores para la región codificadora PCR AAD-12 (v1 ) eran (SEC I D No.: 10) (directa) y (SEC ID No. : 1 1 ) (inversa). La reacción de PCR se llevó a cabo en el 9700 Geneamp thermocycler (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, y 72°C durante 2 minutos seguido por 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % teñido con EtBr. 35 muestras de las 35 plantas con eventos AAD-12 (v1 ) dieron un resultado del test positivo. Tres muestras de control negativo dieron un resultado de test negativo.

ELISA: Usando el ELISA establecido descripto en la sección previa, se detectó la proteína AAD-12 en 5 diferentes eventos de plantas de transformación de cañóla. Los niveles de expresión oscilaron entre 14 y más de 700 ppm de la proteína soluble total (TSP). Tres diferentes muestras de plantas no transformadas fueron testeadas en paralelo sin que se detectaran señales, indicando que los anticuerpos usados en el ensayo tienen mínima reactividad cruzada con la matriz celular de cañóla. Estas muestras tambien fueron confirmadas positivas por análisis Western . Un resumen de los resultados se presenta en la Tabla 24.

Tolerancia al herbicida posemergencia en cañóla TO transformada con AAD-12(v1 ): Cuarenta y cinco eventos TO de las transformadas con el constructo pDAB3759, fueron enviadas al invernadero en un período de tiempo y se dejaron aclimatar en el invernadero. Las plantas se cultivaron hasta que emergieron 2 a 4 hojas nuevas, de aspecto normal (es decir, las plantas habían realizado la transición desde cultivo de tejido a condiciones de cultivo en invernadero). Las plantas fueron tratadas despues con una dosis letal de las formulaciones comerciales de 2,4-D Amina 4 a una tasa de 560 g ae/ha. Las aplicaciones de herbicidas se realizaron con un rociador de pista a un volumen de rociado de 187 l/ha, altura de rociado 50 cm. Una dosis letal se define como la tasa que causa >95% de lesiones en los controles no transformados.

Veinticuatro de los eventos eran tolerantes a la aplicación del herbicida 2,4-D DMA. Algunos eventos sufrieron algunas lesiones menores pero se recuperaron al 14 DAT. Los eventos progresaron a la generación T1 (y la generación T2) por autopolinización bajo condiciones controladas, embolsadas.

Heredabilidad de AAD-12 (v1 ) en cañóla: Se realizó también un test de progenie en 100 plantas en 1 1 líneas T1 de AAD-12 (v1 ). Las semillas se sembraron y trasplantaron a macetas de 3 pulgadas (7.62 cm) llenas con medio Metro Mix. Todas las plantas se rociaron despues con 560 g ae/ha de 2,4-D DMA como se describió previamente. Después de 14 DAT, se contaron las plantas resistentes y sensibles. Siete de las 1 1 líneas testeadas se segregaron como un solo locus, el rasgo dominante 5 Mendeliano (3R: 1 S) según se determinó por el análisis de Chi cuadrado. AAD-12 es heredable como un gen de resistencia a ariloxialcanoato auxina robusto en múltiples especies y puede ser apilado con uno o más genes de resistencia a herbicidas adicionales. ío Heredabilidad de AAD-12 (v1 ) en cañóla: Se realizó también un test de progenie de 100 plantas en 1 1 líneas T1 de AAD-12 (v1 ). Las semillas fueron sembradas y trasplantadas a macetas de 3 pulgadas llenas con medio Metro Mix. Todas las plantas fueron rociadas después con 560 g ae/ha de 2,4-D DMA como se 15 describió previamente. Después de 14 DAT, se contaron las plantas resistentes y sensibles. Siete de las 1 1 líneas testeadas se segregaron como un solo locus, rasgo dominante Mendeliano (3R: 1 S) como se determinó por el análisis de Chi cuadrado. AAD-12 es heredable como un gen de resistencia a 0 ariloxialcanoato robusto en múltiples especies y puede ser apilado con uno o más genes de resistencia a herbicidas adicionales.

Verificación de alta tolerancia a 2,4-D en T1 cañóla: Para T1 AAD-12 (v1 ), 5 - 6 mg de semillas fueron estratificadas, 5 sembradas y se agregó una fina capa de medio Sunshine Mix #5 como una capa superior de suelo. Las plantas emergentes fueron seleccionadas con 560 g ae/ha de 2,4-D a 7 y 13 días despues de plantarlas.

Las plantas que sobrevivieron fueron trasplantadas en macetas de 3 pulgadas (7.62 cm) que contenían medio Metro Mix. Las plantas que sobrevivieron de las progenies de T1 , que fueron seleccionadas con 560 g ae/ha de 2,4-D, también fueron trasplantadas en macetas de 3 pulgadas llenas con suelo Metro Mix. En el estadio de 2 a 4 hojas las plantas fueron rociadas con o bien 280, 560, 1 120 o 2240 g ae/ha de 2,4-D DMA. Las plantas se clasificaron a los 3 y 14 DAT y se compararon con las plantas control no transformadas. Una muestra de los datos de lesiones del evento T1 de 14DAT se puede ver en la Tabla 25. Los datos sugieren que múltiples eventos son robustamente resistentes a 2240 g ae/ha de 2,4-D, mientras que otros eventos demostraron una tolerancia menos robusta hasta 1 120 g ae/ha de 2,4-D. Las plantas que sobrevivieron fueron trasplantadas a macetas de 51 /4" que contenían medio Metro Mix y se colocaron en las mismas condiciones de cultivo que antes y se auto-polinaron para producir sólo semillas homocigotas.

Tolerancia de campo de las plantas de cañóla pDAB3759 a los herbicidas 2,4-D, dicloprop, triclopir y fluoroxipir: Se realizó un ensayo de tolerancia a nivel de campo en dos eventos de AAD-12 (v1 ) 3759(20)018.001 y 3759(18)030.001 y una cañóla de tipo salvaje (Nex710) en Fowler, I nd. El diseño experimental era un diseño de bloques completo aleatorizado con 3 replicas. Los tratamientos con herbicidas eran 2,4-D (sal de dimetilamina) a 280, 560, 1 120, 2240 y 4480 g ae/ha, triclopir a 840 g ae/ha, fluoroxipir a 280 g ae/ha y un control no tratado. Dentro de cada tratamiento con herbicidas, se plantaron filas de 20 pies/evento para el evento 3759(18)030.001 1 , 3759(18)018.001 y la línea de tipo salvaje (Nex710) con un perforador de 4 filas en un espaciado de filas de 8 pulgadas. Los tratamientos con herbicidas fueron aplicados cuando la cañóla alcanzó el estadio de 4 a 6 hojas usando un rociador de mochila de aire comprimido que suministraba 187 l/ha de volumen de vehículo a una presión de 130 - 200 kpa. Se determinaron las tasas de lesiones visualmente a los 7, 14 y 21 días después de la aplicación .

La respuesta de carióla a 2,4-D, triclopir y fluoroxipir se muestra en la Tabla 26. La cañóla de tipo salvaje (Nex710) tenían lesiones severas (72% a 14DAT) por la 2,4-D a 2240 g ae/ha lo que se considera 4 x la dosis. Todos los eventos de AAD-12 (v1 ) demostraron excelente tolerancia a 2,4-D a 14DAT con una lesión promedio de 2, 3 y 2% observada a las dosis 1 , 2 y 4 x, respectivamente. La cañóla de tipo salvaje tenía severas lesiones (25% a 14DAT) por la dosis 2 x de triclopir (840 g ae/ha). Los eventos de AAD-12 (v1 ) demostraron una tolerancia a dosis 2 x de triclopir con un promedio de 6% de lesiones a 14DAT en los dos eventos. Fluoroxipir a 280 g ae/ha causó lesiones severas (37%) en la línea no transformada a 14DAA. Los eventos AAD-12 (v1 ) demostraron una mayor tolerancia con un promedio de 8% de lesiones a 5DAT.

Estos resultados indican que los eventos transformados con AAD-12 (v1 ) presentaron un alto nivel de resistencia a 2,4-D, triclopir y fluoroxipir a dosis que eran letales o que causaban severas malformaciones epinásticas a la cañóla no transformada. La AAD-12 ha demostrado tener una eficacia relativa de 2,4-D > triclopir > fluoroxipir.

Ejemplo 15 Transformación y selección del evento de soja AAD-12 DAS-68416-4 El evento de soja transgenica ( Glycine max) DAS-68416-4 fue generado a través de transformación mediada por Agrobacterium de explantes de nodos cotiledonarios de soja. La cepa de Agrobacterium desarmada EHA101 (Hood et al. , 2006), que llevaba el vector binario pDAB4468 (Figura 2) con el marcador seleccionable (pat) y el gen de interes (AAD-12) dentro de la región de ADN de cadena T, se usó para iniciar la transformación.

Se realizó la transformación mediada por Agrobacterium. En resumen, semillas de soja (cv Maverick) fueron germinadas en medio básales y nodos cotiledonarios se aislaron e infectaron con Agrobacterium. La iniciación de los brotes, la elongación de los brotes y el medio de enraizamiento fueron suplementados con cefotaxima, timentina y vancomicina para la remoción de Agrobacterium. La selección de glufosinato se usó para inhibir el crecimiento de los brotes no transformados. Los brotes seleccionados fueron transferidos a medio de enraizamiento para el desarrollo de las raíces y después se transfirieron a una mezcla de suelo para aclimatación de las plántulas.

Las hojuelas terminales de las plántulas seleccionadas fueron pintadas con glufosinato para explorar los transformantes putativos. Las plántulas que se exploraron fueron transferidas al invernadero, se dejaron aclimatar y después se pintaron con glufosinato para reconfirmar la tolerancia y se consideró que eran transformantes putativos. Las plantas que se exploraron fueron muestreadas y se llevaron a cabo análisis moleculares para la confirmación del gen marcador seleccionable y/o el gen de interés. Las plantas T0 se dejaron auto-fertilizar en el invernadero para dar lugar a semillas T1 .

Las plantas T1 fueron retrocruzadas e introgresadas en germoplasma elite (Maverick). Este evento, el evento de soja DAS-68416-4, fue generado a partir de un aislado transformado independiente. El evento fue seleccionado en base a sus características únicas como único sitio de inserción, segregación Mendeliana normal y expresión estable, y una combinación superior de eficacia, incluyendo tolerancia a herbicidas y performance agronómica en amplios antecedentes de genotipos y a traves de múltiples ubicaciones ambientales. La descripción adicional del evento de soja DAS-68416-4 fue descrita en la WO 201 1 /066384, que se incorpora por referencia en su totalidad . Ejemplo 16 Generación de datos agronómicos en 2008 Un estudio agronómico con el Evento DAS-68416-4 de soja y un control no transgénico (var. Maverick) se realizó en el 2008 en seis sitios localizados en lowa, Hlinois, Indiana, Nebraska y Ontario, Canadá (2 sitios). Los determinantes agronómicos, incluyendo el conteo de stand/población, vigor de plantón/planta, altura de la planta, encamado, incidencia de enfermedades, daño por insectos y días hasta la floración fueron evaluados para investigar la equivalencia del Evento DAS-68416-4 de soja (con y sin tratamientos con herbicidas) en comparación con la línea de control Maverick. Este estudio es denominado Experimento Agronómico S1 .

Tabla 27. Parámetros agronómicos evaluados en el Experimento Agronómico S1 .

Tiempo de Descripción Rasgo evaluación de los datos Escala Población VC-V2 Número de Conteo real por temprana plantas que parcela emergieron en filas de cada parcela Vigor del VC-V2 Estimación Clasificación de plantón visual del 1 -10 en base al vigor crecimiento de promedio de las sojas no las plantas transformadas que 10 emergieron Equivalencia de por parcela crecimiento con las no transformadas 9 = Salud de la planta es 90% en comparación con la no transformada, etcetera.

Tabla 27. Parámetros agronómicos evaluados en el Experimento Agronómico S1 .

Tiempo de Descripción Rasgo evaluación de los datos Escala Vigor de la Despues de la Lesión por Clasificación de planta / aplicación de las 1 -10 en base al lesión herbicidas post- aplicaciones crecimiento de emergencia de las sojas no herbicidas transformadas 10 Equivalencia de crecimiento con la no transformada 9 = Salud de la planta es 90% en comparación con la no transformada, etcétera.

Altura de la Aproximadamente Altura de la Altura en cm planta R6 superficie (promedio de 10 del suelo a plantas por la punta de parcela) la hoja más alta cuando se extiende con la mano Tabla 27. Parámetros agronómicos evaluados en el Experimento Agronómico S1 .

Tiempo de Descripción Rasgo evaluación de los datos Escala Encamado Aproximadamente Estimación Estimación R8 visual de la visual en una severidad escala de 0- del 100% en base encamado al número de plantas alojadas Población Aproximadamente Él número Conteo real por final R8 de plantas parcela que incluyendo las permanecen plantas en filas de removidas cada durante el parcela muestreo previo Las semillas de la soja de prueba y de control se plantaron a una tasa de sembrado de aproximadamente 1 12 semillas por fila de 25 pies con un espaciado de filas de aproximadamente 30 pulgadas (75 cm). En cada sitio, se establecieron tres replicas de parcelas de cada tratamiento, consistiendo cada parcela en filas de 2 - 25 pies. Las parcelas fueron dispuestas en un diseño de bloque completo aleatorizado (RCB), con una aleatorización en cada sitio. Cada parcela de soja fue rodeada por dos filas de una soja no transgenica de madurez similar. Todo el sitio del ensayo estaba rodeado por un mínimo de 10 pies de una soja no transgénica de madurez relativa similar.

Los tratamientos con herbicidas se aplicaron con un volumen de rociado de aproximadamente 20 galones por acre (187 l/ha). Estas aplicaciones fueron diseñadas para replicar la tasa de marca máxima de las prácticas comerciales. Se aplicó 2,4-D como tres aplicaciones sobre la parte superior “broadcast” para un total estacional de 3 Ib ae/A. Las aplicaciones individuales de 1 .0 Ib ae A (1 , 120 g/ha) se realizaron en la preemergencia y aproximadamente en los estadios de crecimiento V4 y R2. Se aplicó glufosinato como dos aplicaciones sobre la parte superior “broadcast” para un total estacional de 0.74 Ib ai/A (828 g ai/ha). Se realizaron aplicaciones individuales de 0.33 Ib ai/A y 0.41 Ib ai/A (374 y 454 g ai/ha) a aproximadamente los estadios de crecimiento V6 y R1 .

Se realizó un análisis de variancia en los sitios de campo para los datos agronómicos usando un modelo mixto (SAS Versión 8; SAS Institute 1999). La entrada era considerada un efecto fijo, y el lugar, el bloque dentro del lugar, el lugar por entrada y la entrada por bloque dentro del lugar fueron designados efectos aleatorios. La significancia de un efecto de tratamiento general se estimó usando un test F. Los contrastes apareados se realizaron entre el control y el Evento DAS-68416-4 de soja no rociado (no rociado), el Evento DAS-68416-4 de soja rociado con glufosinato (Evento DAS-68416-4 de soja + glufosinato), el Evento DAS-68416-4 de soja rociado con 2,4-D (Evento DAS-68416-4 de soja + 2,4-D) y el Evento DAS-68416-4 de soja rociado con glufosinato y 2,4-D (Evento DAS-68416-4 de soja + ambos) entradas transgenicas usando tests t. Los valores P ajustados también se calcularon usando la Tasa de Falso Descubrimiento (FDR) para controlar la multiplicidad (Benjamini y Hochberg, 1995).

Se realizó un análisis de los datos agronómicos recogidos del control, el Evento DAS-68416-4 de soja no rociado, el Evento DAS-68416-4 de soja + 2,4-D, el Evento DAS-68416-4 de soja + glufosinato y el Evento DAS-68416-4 de soja + ambos herbicidas. No se observaron diferencias estadísticamente significativas para el conteo del stand, la población temprana, el vigor de los plantines, la lesión después de aplicación, el encamado, el conteo del stand final o los días hasta la floración (Tabla 28). Para la altura, se observó un test t apareado significativo entre el control y el Evento DAS-68416-4 de soja + 2,4-D rociado. Sin embargo, no se observó un efecto del tratamiento general significativo, las diferencias eran muy pequeñas entre el tratamiento del Evento DAS-68416-4 de soja y el control, y las diferencias no fueron compartidas entre los diferentes tratamientos del Evento DAS-68416-4 de soja. En base a estos resultados, el Evento DAS-68416-4 de soja era agronómicamente equivalente al control no transgénico casi isogénico.

Tabla 28. Análisis de las características agronómicas del Experimento Agronómico S1.

Glufosinato Ambos Efecto general del No rociado 2,4-D rociado rociado rociados Analito tratamiento Control (valor P,b (valor P, (valor P, (valor P, (Pr>F)a Adj. P)° Adj. P) Adj. P) Adj. P) Conteo del stand 0.774 170 ?72 175 173 ?75 (no. de plantas) (0.709.0.824) (0.311.0.575) (0.476.0.672) (0.269.0.575) Población temprana 0.714 76.7 .TIA 7971. .79.0. 7974. (% de emergencia)0 (0.738.0.824) (0.301.0.575) (0.327.0.575) (0.256.0.575) Vigor deí piantín6 0.547 9.72 .9.39. .9750. §744 . 9739 (0.146.0.575) (0.326.0.575) (0.222.0.575) (0.146.0.575) Vigor/Lesión 0.511 10.0 .9.86. §7789. §783 97767.

Ap. 2e (0.461.0.671) (0.555.0,718) (0.378.0.611) (0.087.0.575) Vigor/Lesión 0.462 ? Ó.Ó . io7o . . §7789 . 9.83 . 9789.

Ap. 3e (1.000.1.000) (0.320.0.575) (0.141.0.575) (0.320.0.575) Vigor/Lesión 0.43? 9.94 .9789 . 9.78. §767. .9778.

Ap. 5e (0.721.0.824) (0.289.0.575) (0.085.0.575) (0.289.0.575) Áítura (cm) ?.?44 ? 0 i .9871. . §72. 9671. .9772 (0.145.0.575) (0.390.0.611) (0.020.0.575) (0.062.0.575) Encamado (%) 0.948 17.2 .1872. .2?73...72077 . 2?T7 (0.885.0.904) (0.551.0.718) (0.606.0.746) (0.511.0.700) Conteo del stand final 0.268 156 .154. .161. 155 . 163. (no. de plantas) (0.770.0.840) (0.335.0.575) (0.817.0.853) (0.127.0.575) Días hasta la floración' 0.452 49. Ó 4975 4§T4 . 74877 .4972. (0.261.0.575) (0.395.0.611) (0.568.0.718) (0.668.0.801) a Efecto general del tratamiento estimado usando un test F. b Comparación de los tratamientos rociados y no rociados al control usando un test t. c Valores P ajustados usando un procedimiento de Tasa de Falso Descubrimiento (FDR). d Escala 0-100%; (Conteo del stand dividido por el no. de semillas plantadas) * 100. e Estimación visual en la escala 1 -10; 10 = crecimiento equivalente a las plantas no transformadas. f Estimación visual en una escala 0-100%; 0% = sin daño. f El número de días desde el tiempo de la plantación hasta la floración .

Los valores P en negrita son significativos (<0.05).

Ejemplo 17 Generación de datos agronómicos de 2009 Se realizó un estudio agronómico con el Evento DAS-68416- 4 de soja y un control no transgenico (var. Maverick) en 2009 en 8 sitios localizados en Arkansas, lowa, Hlinois, I ndiana, Missouri y Nebraska. Los determinantes agronómicos, incluyendo el conteo de stand/población, vigor de plantón/planta, altura de la planta, incidencia de enfermedades, daño por insectos y días hasta la floración fueron evaluados para investigar la equivalencia de las sojas del Evento DAS-68416-4 de soja (con y sin tratamientos con herbicidas) y el control (Tabla 29).

Tabla 29. Datos recogidos en ensayos agronómicos y de rendimiento, 2009.

Característica T i e m p o d e Unidades Descripción evaluación informadas est Conteo de stand en una Emergencia sección de fila de 1 metro VC - V2 % dividido por el número de semillas plantadas por metro Tabla 29. Datos recogidos en ensayos agronómicos y de rendimiento, 2009.

Tiempo de Unidades Característica Descripción e S( * evaluación informadas vigor aei i Dajo; a V 1 - V3 Vigor general de los plantines plantón 10 (alto) Lesión visible 1 d ía post Post V3 Lesión visible aplicación del herbicida en el % aplicación estadio V3 Lesión visible 7 d ías post Post V3 Lesión visible aplicación del herbicida en el % JQ aplicación estadio V3 Lesión visible 14 dias post Post V3 Lesión visible aplicación del herbicida en el % aplicación estadio V3 Número de días desde la Días hasta la plantación hasta cuando 50% días 15 floración de las plantas se encuentran en R 1 Conteo de N úmero de plantas en una R2 stand sección de fila de un metro Lesión visible 1 día post Post R2 Lesión visible aplicación del herbicida en el % aplicación 20 estadio R2 Lesión visible 7 d ías post Post R2 Lesión visible aplicación del herbicida en el % aplicación estadio R2 Lesión visible 14 días post Post R2 Lesión visible aplicación del herbicida en el % aplicación estadio R2 25 Tabla 29. Datos recogidos en ensayos agronómicos y de rendimiento, 2009.

Tiempo de U nidades Característica Descripción evaluación informadas est * Nota oportunista sobre I ncidencia de -R6 cualquier enfermedad que % enfermedades haya ocurrido en el lugar Nota oportunista sobre Daño por ~R6 cualquier daño por insectos % insectos que ocurrió en el lugar Altura de las R8 Altura final de la parcela a R8 cm plantas Número de días desde la plantación a cuando el 95% Madurez R8 de las plantas en la parcela días alcanzaron su color de madurez Grado de encamado en una 1 (ninguna) Encamado R8 parcela - 5 (plana) Peso de las semillas Rendimiento R8 bu/acre producidas por la parcela Peso de 100 Peso de 100 semillas al azar R8 g semillas de la parcela cosechada * B - Tests rociados y no rociados, S - Tests rociados solamente Se usó un diseño de bloque completo aleatorizado para los ensayos. Las entradas eran el Evento DAS-68416-4 de soja, una línea de control Maverick y líneas de soja no transgenicas disponibles comercialmente. Las semillas de soja de prueba, de control y de referencia fueron plantadas a una tasa de siembra de aproximadamente 1 12 semillas por fila con un espaciado de fila de aproximadamente 30 pulgadas (75 cm). En cada sitio, se establecieron 4 parcelas de replica de cada tratamiento, consistiendo cada parcela en filas de 2 - 25 pies. Cada parcela de soja estaba rodeada por 2 filas de una soja no transgénica (Maverick). Todo el sitio del ensayo estaba rodeado por un mínimo de 4 filas (o 10 pies) de soja no transgénica (Maverick). Se aplicaron prácticas apropiadas de control de insectos, malezas y enfermedades para producir un cultivo agronómicamente aceptable.

Los tratamientos con herbicidas se aplicaron para replicar las prácticas comerciales de tasa de marca máxima. Los tratamientos consistían en un control no rociado y aplicaciones de herbicidas de 2,4-D, glufosinato, 2,4-D/glufosinato aplicados en los estadios de crecimientos especificados. Para las aplicaciones de 2,4-D, el herbicida fue aplicado a una tasa de 1 .0 Ib ae /A (1 , 120 g ae/ha) en los estadios de crecimiento V4 y R2. Para los tratamientos con glufosinato, las aplicaciones se realizaron a plantas en los estadios de crecimiento V4 y V6-R2. Para ambas aplicaciones, el glufosinato fue aplicado a una tasa de 0.33 Ib ai/A (374 g ai/ha) y 0.41 Ib ai/A (454 g ai/ha) para las aplicaciones a V4 y V6-R2, respectivamente. Las entradas para ambas aplicaciones de herbicidas eran el Evento DAS-68416-4 de soja y los controles incluyendo la no transgénica Maverick. Se esperaba que las parcelas con Maverick murieran despues de la aplicación del herbicida.

El análisis de variancia se realizó en los sitios de campo para los datos agronómicos usando un modelo mixto (SAS Versión 8; SAS Institute 1999). La entrada se consideraba un efecto fijo, y el lugar, el bloque dentro del lugar, el lugar por entrada y la entrada por bloque dentro del lugar se designaban efectos aleatorios. El análisis en lugares individuales se realizó de una manera análoga con la entrada como un efecto fijo y el bloque y la entrada por bloque como efectos aleatorios. Los datos no fueron redondeados para análisis estadístico. Las diferencias significativas fueron declaradas al nivel de confianza de 95%, y la significancia de un efecto general de tratamiento se estimó usando un test F. Los contrastes apareados se realizaron entre las entradas transgénicas AAD-12 no rociada (no rociada), AAD-12 rociada con glufosinato (AAD- 12 + glufosinato), AAD-12 rociada con 2,4-D (AAD-12 + 2,4-D) y AAD- 12 rociada con ambos glufosinato y 2,4-D (AAD-12 + 2,4-D + glufosinato) y la entrada control usando los tests T.

Debido al gran número de contrastes hechos en este estudio, la multiplicidad era un tema. La multiplicidad es un tema cuando se realiza un gran número de comparaciones en un solo estudio para detectar efectos inesperados. Bajo estas condiciones, la probabilidad de declarar falsamente diferencias en base a los valores p en forma comparativa es muy alta (1 - 0 ggnúmero de comparaciones^ º fí e ste e st u d ¡ 0 s e realizaron Cuatro comparaciones por analito (16 tipos de observación analizados para los agronómicos), dando por resultado 64 comparaciones para agronómicos. Por lo tanto, la probabilidad de declarar una o más diferencias falsas en base a valores p no ajustados era de 99% para agronómicos (1 - 0.9564.) Se realizó un análisis de los datos agronómicos recogidos de las entradas de control, AAD-12 no rociada, AAD-12 + glufosinato, AAD-12 + 2,4-D, y AAD-12 + 2,4-D + glufosinato. Para el análisis en el sitio, no se observaron diferencias estadísticamente significativas para el vigor de los plantines, la población final, el vigor de la planta/lesión (V4, Rl), el encamado, la incidencia de enfermedades, el daño por insectos, los días hasta la floración, los días hasta la madurez, el número de vainas, el número de semillas, el rendimiento y la altura de las plantas. Para el conteo de stand y la población temprana, se observó un test-t apareado significativo entre la entrada de control y la de AAD-12 + glufosinato, pero no fue acompañada por un efecto del tratamiento general significativo o un valor p ajustado por FDR. Para el vigor/lesión de la planta (R2), se observaron tests t apareados significativos y un efecto del tratamiento general significativo entre las entradas de control y de ambas, la AAD-12 + glufosinato y la AAD-12 + 2,4-D + glufosinato, pero no fue acompañado por un valor p ajustado por FDR significativo. Los resultados medios para todas estas variables tambien se encontraban dentro del intervalo hallado para las líneas de referencia testeadas en este estudio.

Ejemplo 18 Transformación y selección del Evento AADI pDAS 1740-278 5 El evento AADI, pDAS 1740-278, fue producido por transformación mediada por WHISKER de una línea de maíz Hi-l l. El método de transformación usado se describe en la solicitud de patente US No. 20090093366. Un fragmento Fspl del plásmido pDAS1740 (Figura 3), también denominado pDAB3812, fue ío transformado en la línea del maíz. Este constructo de plásmido contiene el casete de expresión de plantas que contiene el RB7 MARv3 : : promotor de Ubiquitina 1 de Zea mays v2 // AADI v3 // la unidad de transcripción de plantas de Zea mays PER5 3'UTR :: RB 7 MARv4 (PTU). 15 Se produjeron numerosos eventos. A los eventos que sobrevivieron y produjeron tejido de callos sanos, resistentes a haloxifop se les asignaron códigos de identificación únicos que representaban los eventos de transformación putativos, y se transfirieron continuamente a medio de selección fresco. Las 0 plantas fueron regeneradas a partir de tejido derivado de cada evento único y transferidas al invernadero.

Se tomaron muestras de hojas para el análisis molecular para verificar la presencia del transgén AAD-I por transferencia Southern , confirmación del límite de ADN y confirmación asistida 5 por el marcador genómico. Las plantas TO positivas fueron polinizadas con líneas consanguíneas para obtener la semilla de TI. Las plantas TI del Evento pDAS 1470-278-9 (DAS-40278-9) fueron seleccionadas, autopolinizadas y caracterizadas para cinco generaciones. Mientras tanto, las plantas TI fueron retrocruzadas e introgresadas en germoplasma elite (XHH 13) a traves de la selección asistida por un marcador para varias generaciones. Este evento fue generado a partir de un aislado transformado independiente. El evento fue seleccionado en base a sus características únicas como sitio de inserción único, segregación Mendeliana normal y expresión estable, y una combinación superior de eficacia, incluyendo la tolerancia a herbicidas y la performance agronómica en amplios antecedentes de genotipos y a través de múltiples ubicaciones ambientales. La descripción adicional con respecto al Evento pDAS-1740-278-9 del maíz fue descrita en la WO 201 1 /022469, que se incorpora por referencia en su totalidad.

Ejemplo 19 Aplicación de herbicidas y datos agronómicos Los tratamientos con herbicidas fueron aplicados con un volumen de rociado de aproximadamente 20 galones por acre (187 l/ha).

Estas aplicaciones fueron diseñadas para replicar las prácticas comerciales de tasa de marca máxima. Se usaron Weedar 64 (026491 -0006) a una concentración de 39%, 3.76 Ib ae/gal, 451 g ae/l y Assure I I (106155) a una concentración de 10.2%, 0.87 Ib ai/gal, 104 g ai/g.

Se aplicó 2,4-D (Weedar 64) como 3 aplicaciones sobre la parte superior “broadcast” a las Entradas de Prueba 4 y 5 (total estacional de 3 Ib ae/A). Las aplicaciones individuales eran en la pre-emergencia y aproximadamente los estadios V4 y V8 -V8.5. Las tasas de aplicación objetivo Individuales eran 1 .0 Ib ae/A para Weedar 64 o 1 120 g ae/ha. Las tasas de aplicación reales oscilaban entre 1096 - 1231 g ae/A.

Se aplicó quizalofop (Assure II) como una sola aplicación sobre la parte superior “broadcast” a las Entradas de Prueba 3 y 5. El tiempo de aplicación era de aproximadamente el estadio de crecimiento V6. La tasa de aplicación objetivo era de 0.0825 Ib ai/A para Assure I I o 92 g ai/ha. Las tasas de aplicación reales oscilaban entre 90.8 - 103 g ai/ha. Las características agronómicas fueron registradas para todas las entradas de prueba dentro de los Bloques 2, 3, y 4 en cada lugar. La Tabla 30 presenta una lista de las características que se midieron.

Se realizó un análisis de los datos agronómicos recogidos del control, de aad-l no rociada, aad-l + 2,4-D, aad-\ + quizalofop, y aad-\ + ambas entradas para el análisis de a través del sitio, no se observaron diferencias estadísticamente significativas para los valores de la población temprana (VI y V4), el vigor, la población final, la lesión de los cultivos, el tiempo hasta la formación de la barba, el tiempo hasta emitir polen , el encamado de los tallos, el encamado de las raíces, la incidencia de enfermedades, el daño por insectos, los días hasta la madurez, la altura de la planta y la viabilidad del polen (forma y color) en el análisis resumido a traves de la localización. Para la extensión del verdor y la altura de la espiga, se observaron tests t apareados significativos entre el control y las entradas de aad-l + quizalofop, pero no fueron acompañados por efecto del tratamiento general significativos o valores p ajustados por Tasas de Falso Descubrimiento (FDR) (Tabla 31 ). a Efecto general del tratamiento estimado usando un test F. b Comparación de los tratamientos de rociado y no rociado al control usando el test t. c Valor p ajustado usando el procedimiento de Tasa de Falso Descubrimiento (FDR). d Estimación visual en la escala 1 -9; 9 = plantas altas con grandes hojas robustas. e Escala 0-100%; con 0 = sin lesiones y 100 = planta muerta. f El número de unidades termicas que se han acumulado desde el tiempo de la plantación. 9 Escala 0-100% ; con % de granos de polen con paredes colapsadas. h Escala 0-100%; con % de granos de polen con color amarillo intenso.

' Estimación visual en la escala 1 -9 con 1 tejido verde no visible.

J Estimación visual en la escala 1 -9 con 1 como poca resistencia a las enfermedades. k Estimación visual en la escala 1 -9 con 1 como poca resistencia a insectos.

' NA = Análisis estadístico no realizado ya que no hubo variabilidad en las réplicas o el tratamiento. m Diferencia estadística indicada por el valor P <0.05.

Ejemplo 20 Ensayos agronómicos adicionales Las características agronómicas de la línea de maíz 40278 comparada con una línea de maíz casi isolínea fueron evaluadas en diversos ambientes. Los tratamientos incluían 4 híbridos geneticamente distintos y sus híbridos control casi isolíneas apropiados testeados en un total de 21 lugares.

Los cuatro híbridos de prueba eran híbridos de madurez mediana a tardía que oscilaban entre 99 y 1 13 días de madurez relativa. El Experimento A testeó el evento DAS-40278-9 en el antecedente genético Consanguíneo C x conversión BC3S1. Este híbrido tiene una madurez relativa de 109 días y fue testeado en 16 lugares (Tabla 32). El Experimento B testeó el híbrido con antecedente Consanguíneo E x conversión BC3S1 , un híbrido de madurez relativa de 1 13 días. Este híbrido fue testeado en 14 lugares, usando un conjunto de lugares levemente diferente que el Experimento A. Los Experimentos C y D testearon los antecedentes de híbridos conversión BC2S1 x Consanguíneo D y conversión BC2S1 x Consanguíneo F, respectivamente. Ambos híbridos tienen una madurez relativa de 99 días y fueron testeados en los mismos 10 lugares.

Para cada ensayo se usó un diseño de bloques completos aleatorizados con dos réplicas por lugar y parcelas de dos filas. La longitud de la fila era de 20 pies y cada fila fue sembrada con 34 semillas por fila. Se usaron las prácticas agronómicas regionales estándar en el manejo de los ensayos.

Los datos fueron recogidos y analizados para ocho características agronómicas; altura de la planta, altura de la espiga, encamado de los tallos, encamado de las raíces, población final, humedad de los granos, peso de prueba, y rendimiento. Los parámetros altura de la planta y altura de la espiga proporcionan información acerca del aspecto de los híbridos. Las características agronómicas del porcentaje de encamado de tallos y encamado de raíces determina la capacidad de cosecha de un híbrido. El conteo de la población final mide la calidad de la semilla y las condiciones de cultivo estacionales que afectan el rendimiento. La humedad del grano por ciento en la cosecha define la madurez del híbrido, y el rendimiento (bushels/aere ajustado para la humedad) y el peso de prueba (peso en libras de un bushel de maíz ajustado a 15.5% de humedad) describe la capacidad reproductiva del híbrido.

El análisis de la variancia se realizó en los sitios de campo usando un modelo lineal. La entrada y el lugar fueron incluidos en el modelo como efectos fijos. Los modelos mixtos que incluyen lugar y lugar por entrada como efectos aleatorios fueron explorados, pero el lugar por entrada explicaba sólo una pequeña porción de variancia y su componente de variancia frecuentemente no era significativamente diferente de cero. Para el encamado de tallos y raíces se usó una transformación logarítmica para estabilizar la variancia, sin embargo se informan medias e intervalos en la escala original. Las diferencias significativas fueron declaradas al nivel de confianza de 95% . La significancia de un efecto general del tratamiento fue estimada usando un test t.

Los resultados de estos ensayos de caracterización agronómica se pueden hallar en la Tabla 32. No se hallaron diferencias estadísticamente significativas para cualquiera de los cuatro híbridos 40278 en comparación con los controles de isolínea (a p<0.05) para los parámetros de altura de la espiga, encamado de los tallos, encamado de las raíces, humedad del grano, peso de prueba, y rendimiento. El conteo de la población final y la altura de la planta fueron estadísticamente diferentes en los Experimentos A y B, respectivamente, pero no se observaron diferencias similares en comparaciones con los otros híbridos 40278 testeados. Algunas de las variaciones observadas pueden deberse a bajos niveles de variabilidad genetica que permanecen del retrocruzamiento del evento DAS-40278-9 en las líneas consanguíneas de elite. El intervalo general de valores para los parámetros medidos se encuentra dentro del intervalo de valores obtenidos para híbridos de maíz tradicionales y no llevarían a una conclusión de mayor presencia de malezas. En resumen, los datos de la caracterización agronómica indican que el maíz 40278 es biológicamente equivalente al maíz convencional.

Las características agronómicas de maíz híbrido que contiene el evento DAS-40278-9 en comparación con maíz casi isolínea fueron recogidas de múltiple ensayos de campo en diversos ambientes geográficos para una estación de cultivo. Los resultados para las líneas de maíz híbrido que contienen el evento DAS-40278-9 en comparación con las plantas nulas se indican en la Tabla 33.

Las características agronómicas para las líneas de maíz híbrido que contienen el evento DAS-40278-9 y plantas cero rociadas con los herbicidas quizalofop (280 g ae/ha) en el estadio V3 de desarrollo y 2,4-D (2,240 g ae/ ha) rociadas en el estadio V6 de desarrollo se presentan en la Tabla 34.

Ejemplo 21 2.4-D aumenta el crecimiento de la soja resistente al 2,4-D La soja transgenica con el transgén AAD-12 proporciona protección a la planta de soja mientras que las malezas son destruidas por la aplicación de 2,4-D. Se observó inesperadamente que el 2,4-D también aumenta el crecimiento en la soja con tolerancia al 2,4-D. Este mayor crecimiento ha dado por resultado aumentos en la altura de la planta y/o el rendimiento de parcelas rociadas en comparación con parcelas no rociadas.

El aumento del crecimiento de la planta y/o el rendimiento que resulta de la aplicación de 2,4-D se describe para plantas de soja manipuladas por ingeniería genética para ser tolerantes al 2.4-D. Los ensayos se realizaron en múltiples lugares que cubrían la región de cultivo de soja de Norteamérica. Las entadas incluían líneas de elite en las cuales se había introgresadas el evento DAS-68416-4 (que condiciona la tolerancia al 2,4-D). Los tratamientos consistían en un tratamiento no rociado y rociado con 2,4-D aplicado en los estadios de crecimiento V3 y R2. Las parcelas se midieron con respecto a varias características agronómicas durante la estación, incluyendo la altura de la planta y el rendimiento de granos. Las malezas fueron controladas durante la estación en las parcelas rociadas y en las no rociadas para eliminar cualquier efecto de competencia. Al final del ensayo, el análisis de los datos midió un aumento significativo de la altura y el rendimiento para las entradas que habían sido rociadas con 2,4-D en comparación con las que no recibieron tratamiento. Un aumento del rendimiento es un beneficio adicional al del control de las malezas suministrado por 2,4-D en sojas resistentes al 2,4-D.

Se realizaron ensayos de campo en 2011 para comparar las características agronómicas del evento DAS-68416-4 de soja (solicitud de patente internacional No. 201 1/066384) que había sido rociado con 2,4-D, con las características agronómicas del evento DAS-68416-4 de soja no rociado. Los ensayos de campo contenían entradas de 4 líneas de soja de elite en las cuales se había introgresadas el evento DAS-68416-4 de soja, y las isolíneas cero respectivas de las 4 líneas de soja de elite que no contenían el evento DAS-68416-4 de soja. Los ensayos se realizaron en diferentes lugares geográficos (diez lugares en total). El experimento se preparó como una parcela dividida modificada con dos replicas por lugar. Las parcelas enteras eran tratamientos y las subparcelas eran entradas. Cada parcela consistía de dos filas, de 12.5 pies de longitud, plantadas con una separación de 30 pulgadas. Las parcelas rociadas fueron tratadas con 2,4-D (1 120 g ae/ha) rociado en los estadios de crecimiento V3 y R2. Durante la estación se mantuvieron las parcelas de campo bajo las prácticas agronómicas normales y se mantuvieron libres de malezas. Se midieron varias características agronómicas para las plantas de soja para determinar cómo afectó la aplicación de 2,4-D a la performance de las características agronómicas de la soja. Las características agronómicas testeadas y el estadio de crecimiento cuando se recogieron los datos se indica n en la lista de la Tabla 35.

Al final de la estación de cultivo de soja se combinaron los datos de todos los lugares y se realizó un análisis a traves de los lugares. El análisis de los datos se llevó a cabo usando JMP® Pro 9.0.3 (SAS, Cary, NC). Las medias de los cuadrados mínimos del análisis se informan en la Tabla 28. La aplicación de 2,4-D en el evento DAS-68416-4 de soja que contiene el transgén AAD-12 dio por resultado un efecto acondicionador de mayor crecimiento. El mayor crecimiento culminó en mediciones del rendimiento y de la altura de la planta significativamente mayores en las parcelas de campo rociadas con 2,4-D en comparación con las parcelas de campo no rociadas con 2,4-D. Estos aumentos se podían verificar cuando se analizaban los datos acumulativamente en todos los lugares. Por contraste, el mayor rendimiento para el evento DAS-68416-4 de soja rociado con 2,4-D fue disminuido por un lugar por la interacción con el tratamiento. La altura y el rendimiento promedio aumentaron alrededor de 5% por las aplicaciones de 2,4-D en la Tabla 36.

Como se muestra en la Tabla 37, por lo menos uno de los diez lugares (Lugar #a3) informó cosechas con un rendimiento significativamente mayor para las plantas del evento DAS-68416- 4 de soja no rociadas en comparación con las plantas del evento DAS-68416-4 de soja rociadas con 2,4-D. Cuando los resultados de todos los lugares fueron acumulados, la aplicación de 2,4-D sobre el evento DAS-68416-4 de soja que contiene el transgen 5 AAD-12 indicó un efecto acondicionador que da por resultado un mayor crecimiento. Por ejemplo, el rendimiento de las plantas del evento DAS-68416-4 de soja rociadas con 2,4-D fue de 56.4 bu/acre, lo que es considerablemente mayor que el rendimiento de las plantas del evento DAS-68416-4 de soja no rociadas, que ío fue de 53.7 bu/acre. Igualmente, la altura de las plantas del evento DAS-68416-4 de soja rociadas con 2,4-D fue de 81 cm, lo que es considerablemente mayor que la altura de las plantas del evento DAS-68416-4 de soja no rociada, que fue de 77 cm. 25 Ejemplo 22 El 2,4-D aumenta el crecimiento de la soja resistente al 2,4-D en la combinación de 2,4-D/glifosato Se realizaron ensayos de campo similares como en el Ejemplo previo en el año 2010 pero con dos aplicaciones de 2,4-D en combinación con glifosato. Los resultados muestran que el mayor crecimiento de la soja resistente al 2,4-D, en la altura de la planta y/o el rendimiento de las parcelas rociadas, comparado con las parcelas no rociadas, se debe a la aplicación de 2,4-D.

Se observaron efectos significativos del tratamiento para una cantidad de parámetros medidos. Se rociaron ambos, el 2,4-D y el glifosato en los estadios de crecimiento V3 y R2. Los ensayos fueron plantados en diferentes lugares geográficos (seis lugares en total). Las características agronómicas testeadas y el estadio de crecimiento cuando se recogieron los datos se indican en la lista en la Tabla 30. La altura promedio aumentó 6% y el rendimiento promedio aumentó 17% para la soja rociada en la Tabla 38. Además, el peso de las semillas promedio aumentó 6% para la soja rociada.

Como se muestra en la Tabla 39, se observaron tambien algunas variaciones geográficas en este ejemplo. El rendimiento promedio aumentó 21 ,6% para la soja rociada en la Tabla 39.

Tabla 39. Medias de mínimos cuadrados para el rendimiento de los lugares específicos de la soja tolerante al 2,4-D que fue rociada con 2,4-D más glifosato con respecto a las plantas no rociadas.

Ejemplo 23 Resultados del ensayo de rendimiento comparando los tratamientos con rociado y sin rociado Las plantas de cultivo transgenicas resistentes al 2,4-D transformadas con una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD) dieron por resultado un mayor rendimiento cuando se trataron con una cantidad estimulante de herbicida que comprende una parte de arioxialcanoato. Los eventos de soja que comprenden un casete de expresión del gen AAD-12 fueron testeados en ensayos de rendimiento replicados bajo condiciones de rociado y no rociado. Había una serie de experimentos que contenía sojas tempranas adaptadas a las latitudes del norte y otra serie de experimentos que contenía las sojas tardías adaptadas a latitudes más al sur. En los experimentos previos hubo casos en los que las entradas de soja que comprendían un casete de expresión del gen AAD-12 que fueron tratadas con 2,4-D durante la estación de cultivo presentaron y aumentaron el rendimiento con relación a los controles no rociados.

Un diseño de parcela dividida modificada con 2 replicas se usó para los ensayos. Cada parcela tenía dos filas de ancho con un espacio entre filas de 30 pulgadas (76.2 cm) y 12.5 pies de longitud. Había un pasaje entre parcelas de 2.5 a 3 pies plantadas extremo a extremo para permitir el movimiento dentro del ensayo durante la estación. Los bloques rociados fueron rociados secuencialmente (dos veces) durante la estación de cultivo con 2,4-D colina + glifosato (premezcla) a 2185 g ae/ha + AMS a 2% peso por peso.

La primera aplicación fue en el estadio de crecimiento V3 y la segunda aplicación en el estadio de crecimiento R2. Tanto los ensayos experimento como los ensayos de campo de control se mantuvieron libres de malezas durante la estación mediante el uso de herbicidas convencionales o por extracción de malezas manualmente. Se recogieron los datos sobre emergencia, vigor de los plantines, lesiones de los cultivos, fecha de floración, conteo del stand en R2, incidencia de enfermedades, daño por insectos, altura de la planta, fecha de madurez, encamado, rotura, peso de 100 semillas y rendimiento. Los datos fueron analizados usando JMP® Pro 9.0.3. La Tabla 40 presenta una lista de los lugares que se usaron en el análisis final. Algunos lugares que fueron plantados no se incluyeron en los análisis debido a la variabilidad dentro de la parcela.

Se realizaron los análisis de los lugares tanto para los ensayos tempranos como los tardíos. Las Tablas 41 y 42 muestran el análisis de variancia de rendimiento para los ensayos temprano y tardío, respectivamente.

Tanto para los ensayos tempranos como para los tardíos hubo un efecto de nombre significativo (P=0.05). Esto se esperaba ya que cada línea de soja de elite en la cual se introgresó un evento era de un antecedente genetico diferente.

Se midió el efecto significativo del tratamiento para el ensayo temprano indicando que los tratamientos de rociado y no rociado diferían con respecto al rendimiento. Para el ensayo tardío no había un efecto de tratamiento significativo lo que indica que las parcelas rociadas y no rociadas no diferían para el rendimiento.

. Para los ensayos temprano y tardío el nombre por el efecto de interacción del tratamiento no fue significativo indicando que el efecto del tratamiento (o falta de un efecto) era el mismo para cada entrada en un ensayo particular.

La Tabla 43 muestra el rendimiento promedio para cada entrada por la combinación del tratamiento en el ensayo temprano, en donde HOMO significa homocigota. Los valores seguidos por la misma letra (dentro de una variedad dada) no son diferentes de acuerdo con la t de Student a P = 0.05. Hubo cuatro entradas que presentaron mayor rendimiento cuando fueron rociadas secuencialmente en V3 y R3 con 2,4-D colina + glifosato (premezcla) at 2185 g ae/ha + AMS.

La Tabla 44 muestra el rendimiento promedio para cada entrada por la combinación del tratamiento. Los valores seguidos por la misma letra (dentro de una variedad dada) no son diferentes de acuerdo con el t de Student a P = 0.05. Como se informó más arriba no hubo un efecto de tratamiento significativo o tratamiento por efecto de entrada para el ensayo tardío, de modo que no se llevó a cabo una separación media. Las letras en la tabla indican que no hubo diferencia entre los tratamientos de rociado y no rociado en el test tardío.

Tabla 44. Tabla de medias de rendimiento de mínimos cuadrados del ensayo de rendimiento tardío de 2012.

Rendimiento Tratamiento número (bu/acre) 348[3](HOMO),No rociado 51 .1 A 348[3](HOMO), Rociado 54.5 A 4075433-15(HOMO), No rociado 59.6 A 4075433-15(HOMO), Rociado 60.4 A 75226-1 (HOMO), No rociado 52.1 A 75226-1 (HOMO), Rociado 55.2 A 75226-2(HOMO), No rociado 51 .1 A 75226-2(HOMO), Rociado 52.2 A 75505(HOMO), No rociado 50.1 A 755Q5(HOMO), Rociado 54.6 A 99753-81 (HOMO), No rociado 56.1 A 99753-81 (HOMO), Rociado 55.4 A 75358-72(HOMO),No rociado 50.7 A 75358-72(HOMO), Rociado 53.8 A 75358-72[1 ](HOMO), No rociado 48.4 A 75358-72[1 ](HOMO), Rociado 50.1 A 99753-75 [4] (HOMO), No rociado 52.1 A 99753-75[4](HOMO), Rociado 53.4 A Control-1 ,No rociado 49.2 A Control-1 .Rociado 51 .4 A Control-2, No rociado 49.6 A Control-2, Rociado 52.0 A Los resultados de los ensayos de rendimiento en este ejemplo muestran nuevamente que en algunos medios ambientes para algunos genotipos de soja puede haber un aumento del rendimiento despues de la aplicación de 2,4-D. En los últimos dos años se observó tal aumento del rendimiento en ensayos de rendimiento que se realizaron en una región de cultivo MG 2. Ejemplo 24 Comparación entre soja y maíz Los resultados del rendimiento de los ensayos de campo en soja que comprendía el transgén AAD-12 indican que una aplicación de 2,4-D puede aumentar el rendimiento de la soja en algunos medios ambientes para algunos genotipos de soja. Estos resultados son sorprendentes cuando se comparan con los eventos de maíz transgénicos que comprenden un transgén AAD-1. El rendimiento de las plantas de maíz transgénicas con AAD-1 no muestra en forma consistente un aumento estadísticamente significativo en el rendimiento después del rociado con 2,4-D. Estas plantas de maíz transgénicas con AAD-1 son biológicamente equivalentes al maíz convencional. Los estudios de campo adicionales en diversos lugares geográficos fueron completados desde 2010 a 2012 en líneas de maíz híbrido. En estos estudios de campo el rendimiento de las líneas de maíz rociadas con 2,4-D (2, 185 g ae/ha y 4,370 g ae/ha) fue comparado con las líneas de maíz control no tratadas (por ejemplo, no rociada con 2,4-D). Los resultados de estos experimentos substancian además que las plantas de maíz que contienen el transgen AAD-1 no dan por resultado un aumento significativo en rendimiento como resultado del tratamiento con un spray de 2,4-D. Comparativamente, se ha demostrado un aumento del rendimiento en algunos genotipos de soja después de una aplicación de 2,4-D. El aumento de rendimiento observado en los genotipos de soja que se muestra después de la aplicación de 2,4-D es una mejora inesperada que se puede aplicar para aumentar el rendimiento de las plantas de cultivo. El método divulgado puede ser desplegado para usar un tratamiento con 2,4- D para aumentar el rendimiento de las plantas de cultivo transgénicas, por ejemplo que expresan un gen AAD-12.

Aunque la invención precedente se ha descripto con algunos detalles a modo de ilustración y ejemplo a los fines de mayor claridad de comprensión es evidente que se podrán realizar algunos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un metodo para mejorar el rendimiento de plantas de cultivo resistentes a 2,4-D, que comprende tratar las plantas con una cantidad estimuladora de un herbicida que comprende una parte ariloxialcanoato. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son plantas transgénicas transformadas con una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD). 3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD) es AAD-12. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el herbicida que comprende una parte ariloxialcanoato es un herbicida fenoxi o un herbicida fenoxiacético. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el herbicida que comprende una parte ariloxialcanoato es 2,4-D. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el 2,4-D comprende 2,4-D colina o 2,4-D dimetilamina (DMA). 7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el tratamiento se lleva a cabo por lo menos una vez con un coeficiente de aplicación de 2,4-D como también se usa para el control de las malezas. 8. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde se lleva a cabo el tratamiento dos veces con un coeficiente de aplicación de 2,4-D como tambien se usa para el control de las malezas. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el 2,4-D se aplica en las etapas de cultivo V3 y R2 de la soja con 5 una tolerancia al 2,4-D. 10. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde se lleva a cabo el tratamiento por lo menos tres veces con un coeficiente de aplicación de 2,4-D como también se usa para el control de malezas. ío 1 1 . El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde las plantas de cultivo resistentes al 2,4-D se hallan bajo estrés. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde las plantas de cultivo resistentes al 2,4-D también son tratadas con un herbicida diferente del 2,4-D para el control de malezas. 15 13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el herbicida diferente del 2,4-D es un herbicida fosforado o un herbicida a riloxifenoxi propión ico. 14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el herbicida fosforado comprende glifosato, glufosinato, sus 20 derivados, o sus combinaciones. 15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el herbicida fosforado se halla presente en forma de sal de amonio, sal de isopropilamonio, sal de isopropilamina, o sal potásica. 25 16. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el herbicida ariloxifenoxipropiónico comprende clorazifop, fenoxaprop, fluazifop, haloxifop, quizalofop, sus derivados, o sus combinaciones. 17. El metodo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde 5 las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son tratadas al menos una vez con 25 g ae/ha a 5000 g ae/ha de 2,4-D. 18. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son tratadas al menos una vez con 100 g ae/ha a 2500 g ae/ha de 2,4-D. ío 19. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el herbicida que comprende una parte ariloxialcanoato llega a las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D por absorción en las raíces. 20. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el herbicida fosforado llega a las plantas de cultivo resistentes a 15 2,4-D por absorción en las raíces. 21 . El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el herbicida ariloxifenoxipropiónico llega a las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D por absorción en las raíces. 22. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde 20 las plantas transgénicas transformadas con una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD) se seleccionan entre algodón, soja y cañóla. 23. Un método para mejorar el rendimiento de plantas de cultivo resistentes a 2,4-D, que comprende: (a) transformar las células de plantas con una molécula de 25 ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD); (b) seleccionar celulas transformadas; (c) regenerar las plantas a partir de las células transformadas; y 5 (d) tratar las plantas con una cantidad estimuladora de un herbicida que comprende una parte ariloxialcanoato. 24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD) es AAD-12. 25. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en ío donde la molécula de ácido nucleico comprende un marcador seleccionable que no es una ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD). 26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el marcador seleccionable es el gen fosfinotricina acetiltransferasa (pat) o el gen de la resistencia al bialafos (bar). 15 27. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la molécula de ácido nucleico está optimizado en función de la planta. 28. El uso de 2,4-D en la obtención de plantas transgénicas con una resistencia al 2,4-D con un rendimiento que 20 es mayor en comparación con sus plantas progenitoras no transgénicas. 29. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, en donde se aplica el 2,4-D por lo menos una vez a razón de 25 g ae/ha a 5000 g/ha de 2,4-D. 25 30. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, en donde se aplica el 2,4-D por lo menos una vez a razón de 100 g ae/ha a 2500 g ae/ha de 2,4-D. 31 . El uso de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el 2,4-D comprende 2,4-D colina o 2,4-D dimetilamina (DMA). 32. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, en donde las plantas de cultivo resistentes a 2,4-D son tratadas con 2,4-D por lo menos dos veces antes de su floración.