JP2001518782A

JP2001518782A - 改良ｓａｒ植物形質転換法

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Publication number: JP2001518782A
Application number: JP54185498A
Authority: JP
Inventors: マイケルイー．ホーン; ジェラルドイー．ジュニア．ホール
Original assignee: マイコーゲンプラントサイエンスインク．
Priority date: 1997-03-28
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 2001-10-16
Also published as: CA2283463A1; BR9807899A; EP0970230A1; AR012202A1; AU6871698A; WO1998044139A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、形質転換処理における発現カセットの形質転換効率を向上させるために、マトリックス付着領域（MAR）としても知られている、スカフォールド付着領域（SAR）をそのような発現カセットにおいて使用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】改良SAR植物形質転換法発明の技術分野本発明は、細胞および組織の形質転換における、マトリックス付着領域（Matr ix attachment regions:MAR）としても知られている、スカフォールド付着領域（Scaffold attachment regions:SAR）の使用に関する。発明の背景 SAR/MAR（以後まとめて「SAR」という）は、真核生物のゲノムに存在する、AT に富むゲノムDNA配列である（Boulikas［1993］J．Cell Biochem．52:14を参照のこと）。SARは、構造遺伝子の近傍にある非コードDNA配列で、転写過程を安定させる。SARは、核DNAを含むタンパク質性の骨格物質の特定の構成成分に結合することも知られている。SARは、形質転換された植物において、異種由来の遺伝子の発現を向上させることが分かっている（Allenら［1993］Plant Cell 5:603 ）。発明の概要植物の形質転換法において、植物の発現カセットにSARを使用すると、そのような発現カセットによって安定した形質転換の事象が得られる頻度が上昇するという思わぬ発見がなされている。特に、安定した形質転換事象が約７倍以上までも生じることが観察されているが、同時に一方では、GUS発現の場合には、一過的な形質転換事象は減少することが観察されている。この驚くべき知見によって、安定した形質転換事象が増加するということがいっそう驚きである。本発明は、改良されたエレクトロポレーション形質転換技術において、特に有用である。植物の発現カセットにSARを使用すると、安定して形質転換された植物を回収するために必要とされる時間が都合よく短縮できることも予想外に発見されている。SAR陽性クローンは、SAR陰性クローンに比べてより早く培養液中に一定して出現するため、より早い再生が可能になる。培養時間が短いほど、再生が容易になり、植物体の異常も少なく、稔性も高く、よりよい種子集団が得られる。より迅速な形質転換/再生方法は、時間を短縮することによって事象の処理量を大幅に増加させることができ、商業上の候補植物体がより速く同定できるようになるため、商業的な立場から非常に望ましい。さらに、エレクトロポレーション形質転換法で用いられる植物発現カセットにおけるSARを使用すると、商業的な立場からは非常に望ましい、コピー数の少ない形質転換体の割合が高くなる。コピー数の多い形質転換体は、高頻度で遺伝子サイレンシング（gene silencing）を伴う。トウモロコシ細胞そのもののエレクトロポレーション処理から得られたSAR陽性トウモロコシ形質転換体では、挿入コピー数が多いことを示す、複雑なサザンブロットパターンが見られることはまれである（約10%）。図面の簡単な説明図１は、SAR陽性植物発現カセットで形質転換したトウモロコシのカルス試料のサザンブロットを対照と比較したものである。処理したカルスをビアラホス（ bialaphos）選抜用プレート上にまき、７週間から12週間後にビアラホス抵抗性コロニーが出現した。カルスからDNAを抽出して、材料および方法に記載されているとおりに、アガロースゲル上で分離した。レーン1：DNA分子量標準；レーン 2〜12：ビアラホス選抜によって得られた選抜コロニー由来のDNA；レーン13：PA T遺伝子を含んでいることが分かっているPAT+対照用カルス由来のDNA；レーン14 ：PAT遺伝子を含んでいないことが分かっているPAT-対照用カルス由来のDNA；レーン15：１コピー分に相当するプラスミドDNA；レーン16：3コピー分に相当するプラスミドDNA。図２は、pAGM607プラスミドDNAによる形質転換により得られたカルス（図１）から再生されたT₀植物体のDNAのサザン解析を示している。レーン1：DNA分子量標準；レーン2：１コピー分に相当するプラスミドDNA；レーン３〜11：無関係；レーン12：PAT遺伝子を含んでいることが分かっているPAT+対照用葉組織由来のD NA；レーン13：PAT遺伝子を含んでいないことが分かっているPAT-対照用葉組織由来のDNA；レーン15〜27：サザン陽性カルスから再生されたT₀植物体の葉のDNA 。図３は、ST2-1由来のT₁世代における、PAT遺伝子について分離している植物の葉組織のDNAのサザン解析を示している。レーン1：DNA分子量標準；レーン2：盲験；レーン３〜11：除草剤に対する感受性ありと判断された植物の葉組織のDNA ；レーン22：PAT遺伝子を含んでいないことが分かっているPAT-対照用葉組織由来のD NA；レーン23：レーン12：PAT遺伝子を含んでいることが分かっているPAT+対照用葉組織由来のDNA；レーン24：１コピー分に相当するプラスミドDNA；レーン25 ：3コピー分に相当するプラスミドDNA；レーン26〜28：無関係。図４は、本発明にしたがって用いることのできるSARポリヌクレオチド配列を示している。図５は、プラスミドpAGM243の制限酵素地図を示している。図６は、プラスミドpAGM285Aの制限酵素地図を示している。図７は、プラスミドpAGM607の制限酵素地図を示している。図８は、プラスミドpAGM608の制限酵素地図を示している。発明の詳細な説明本発明は、植物の形質転換処理において安定した形質転換事象が得られる頻度を増加させ、ならびにコピー数の少ない形質転換体の数を増加させるための方法および材料に関し、また、最初の形質転換体の子孫である後続世代を通じて、遺伝子サイレンシングが起こるのを抑制またはなくすことに関する。本発明の一つの態様において、SARを植物発現カセットに使用して、SAR陰性の植物発現カセットについて得られるよりも高い割合で、安定した形質転換体および低コピー数の形質転換体を製造する植物形質転換法を提供する。一つの態様において、本発明の方法は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする所期のポリヌクレオチドに操作可能なように結合したSARポリヌクレオチド配列によって、細胞または組織を形質転換することを含む。本発明にとって有用なSARには、植物および動物に由来するSARが含まれるが、これらに限定されない。本発明にとって有用な、SARがコードするポリヌクレオチドには、例えば、タバコから単離されたSARが含まれる（Hallら、[1991]Proc．Natl ．Sci．USA 88:9320）。好ましい態様において、本発明を実施する上で有用なSA Rポリヌクレオチドは、図４に示すヌクレオチド配列、またはその機能的な断片もしくは変異配列を含む。好ましくは、SARポリヌクレオチド配列は、適当なベクター上の「発現カセット」の形で提供される。DNAによる形質転換に適したいずれのベクターを用いることができ、そのようなベクターは当技術分野において既知である。非常に好ましい態様において、SARポリヌクレオチドの配列は、所期のポリヌクレオチドの一方および/または両方の末端に操作可能なように結合している。例えば、DNAでコートした微小粒子によるパーティクルガンまたはバイオリスティクス形質転換法、アグロバクテリウムによる形質転換法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、磁気泳動法(magnetophoresis)、炭化ケイ素ウィスカー法（silicon carbide whiskers）、PEGによる形質転換法、およびプロトプラスト形質転換法などを含む既知の方法を用いて形質転換を行うことができる。好ましい態様において、当技術分野において既知の標準的な技術によるエレクトロポレーション法によって、本発明のポリヌクレオチドにより植物細胞を形質転換する。例えば、ペスキテリ（Pescitelli，S．M.）、スカピンダ（S ukhapinda，K.）（1995）「エレクトロポレーションによるトウモロコシII型カルスの安定した形質転換、および稔性のあるトランスジェニック植物の再生（St able Transformation via Electroporation Into Maize Type II Callus and Re generation of Fertile Transgenic Plants）」，Plant Cell Reports 14:712-7 16（その全体が参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと。形質転換された植物細胞を選抜して、形質転換小植物体および形質転換植物を生じさせるために日常的に行われている適当な条件下で培養することができる。本発明のヌクレオチド配列を一部削除、および/または変異させ、その結果得られた元の全長配列の断片および/または変異体のあるものに、全長配列がもつ所望の特徴をもたせることができることは、当技術分野において周知のことである。より大きな核酸分子から断片を作製するのに適した、さまざまな制限酵素が当業者によって周知されている。なお、時間を調節しながらDNAを部分消化させるには、Bal31エキソヌクレアーゼが便利であることも、よく知られている。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、マニアティス（Maniatis）ら（19 82）、分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor） 135〜139ページを参照のこと。また、ウェイ（Wei）ら、（1983）J．Biol．Chem .，258:13006〜13512も参照のこと。Bal31エキソヌクレアーゼ（「一塩基消去（ erase-a-base）」法と広く言われている）を用いることによって、当業者は、対象となる酸の片方または両方の末端からヌクレオチドを除去して、対象とするヌクレオチド配列と機能的に同等な広範な断片を作製することができる。このようにして当業者は、元のSAR分子のあらゆる位置からさまざまな長さに調節された何百もの断片を、半日で作製することができる。当業者は、作製した断片が本明細書に示されているような断片の有用性をもつかどうか、その特徴について日常的な作業として検査またはスクリーニングすることができる。全長配列の変異配列またはそれらの断片が、部位特異的突然変異作製法によって容易に製造可能であることもよく知られている。例えば、ラリオノフ（Larionov，O.A.）およびニキフォロフ（Nikifolov，V．G.）（1982）「特異的突然変異作製法（Directed Mutagen esis）」，Genetika，18(3):349〜59;ショートル、ディマイオ、およびナータン（Shortle，D.，DiMaio，D.，and Nathans，D）（1981）「特異的突然変異作製法（Directed Mutagenesis）」，Annu．Rev．Genet．15:265-94;を参照のこと。両文献とも、参照として本明細書に組み入れられる。当業者は、欠失型、挿入型、または置換型の突然変異を日常的な作業として製造することができ、この変異配列が、野生型全長配列、またはその断片の所望の特徴をもっているかを調べることができる。本発明の一つの態様において、SARポリヌクレオチドと実質的に同一の配列をもつポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするポリヌクレオチドに操作可能なように結合されている。本発明にしたがって、細胞または組織を形質転換するために、どのような所望のポリヌクレオチド配列を用いてもよい。これに関して特に重要なことは、例えば、（i）選抜マーカー（抗生物質および/または除草剤抵抗性遺伝子）、（ii）レポーター遺伝子（例えばGUS）、（iii）殺虫剤抵抗性遺伝子（B.t.デルタエンドトキシン）、および（iv）植物の価値または有用性を向上させるその他の遺伝子など、用いる遺伝子である。このような遺伝子には、グルクロニダーゼ、ホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GF P）、ルシフェラーゼ、Pat/bar、およびグリフォセート抵抗性遺伝子（NPTII、H PT、バイオモキシラ（biomoxila）抵抗性遺伝子、AHAS、ALS、シアノミドヒドロラーゼ（cyanomide hydrolase）、アデニンデアミナーゼ、2,4-Dモノオキシゲナーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。コードされているタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、形質転換される細胞が天然にもっているものでもよいし、または形質転換される細胞にとっては異種由来のものであってもよい。選択的には、例えばポリヌクレオチド配列の転写を調節することができるプロモーター配列のような調節配列を、本発明のポリヌクレオチドに含ませることもできる。好ましい態様において、SARポリヌクレオチド配列は、適当なベクター上の発現カセットのポリヌクレオチド成分になっている。本発明のSARポリペプチドにとって有用なベクターは、当技術分野において既知であり、標準的な技術によって調製および/または選択することができる。本発明の方法および材料を用いて、あらゆる生物、好ましくは真核生物由来の細胞または組織を形質転換することができる。好ましい態様において、細胞は植物細胞である。本発明において、形質転換される植物細胞成分は、いかなるものでも用いることができる。容易に全植物体として再生できるような植物細胞を用いることが好ましい。適当な植物細胞には、胚形成懸濁細胞、非胚形成懸濁細胞（これらの細胞が再生不能なトウモロコシを除く）、植物外植片、生殖系列細胞（花粉、胚珠、茎頂分裂組織（meristem domes）、大胞子細胞、胚細胞、卵細胞、および胚嚢）、小胞子細胞およびカルス組織細胞（固いカルス、柔らかいカルスとも）。好ましい細胞には、胚形成細胞、懸濁細胞（胚形成懸濁細胞）、およびカルス化した未熟な接合体胚などがある。特に好ましい植物細胞は、約３〜14 日目、好ましくは５〜10日目の初期の胚形成懸濁細胞および初期カルス（まだ接合体胚に付着している）細胞である。エレクトロポレーションを行う前に、植物細胞を傷つけること、および/または植物細胞を処理することは不必要で、実際、明らかに回避できる。胚形成懸濁組織を用いる場合には、胚形成細胞を傷つけないように穏やかに組織をばらばらにして、できるだけ小さな集塊または非常に小さな集塊にすることが好ましい。これは、例えば組織をスパチュラまたは乳棒で押して1,000ミクロンの網目を通過させるなどにより行うことができる。損傷を受けていない集塊または懸濁細胞が細かくなればなるほど、本方法が効果的になる。本発明の有用な植物組織には、カルス、分裂組織、葉、芽、根、および胚形成組織などがあるが、これらに限定されない。本発明は、被子植物（双子葉植物、単子葉植物）、および裸子植物など、いかなる植物種にも適用可能である。適当な作物には、トウモロコシ、コムギ（特に、C型コムギカルス）、ソルガム、イネ、パールミレット、サトウキビ、オーチャードグラス、およびその他のイネ科植物；ダイズ、ラッカセイ、アルファルファ、およびその他のマメ科植物；ワタ、ケナフ、およびその他のアオイ科植物；ケシ、およびその他のケシ科植物；タイマ、およびその他のアサ科植物；チャ、およびその他のツバキ科植物；ナタネ（キャノーラ）、蔬菜、および油料作物、ならびにその他のナタネ科植物；ヒマワリ、ベニバナ、およびその他のキク科植物；コーヒー、およびその他のアカネ科植物；カカオ、セオブロマ（theobroma）およびその他のアオギリ科植物；果物、野菜、木本、果樹作物、および芝草などがある。好ましい作物には、ワタ、トマト、サトウダイコン、バレイショ、ラッカセイ、アルファルファ、イネ、コムギ、および特にトウモロコシ（メイズ）などがある。好ましい態様において、本発明で用いられるポリヌクレオチド配列は、植物の中で発現させることのできるような5'側プロモーター領域、構造遺伝子領域、および3'側非翻訳領域（ポリアデニル化部位）の任意の配列を含んでいる。このポリヌクレオチド配列は、遺伝子発現を阻害しない限り、どのような方法で改変してもよい（コドンの付加、コドンの欠失、コドンの置換など）。本発明に係る植物に挿入されたポリヌクレオチドは、自然界に存在する真核生物または原核生物に由来する任意の所望の遺伝子を含むことができる。通常、農業的な目的のために、１個よりも多い遺伝子が植物細胞の中に挿入して形質転換される。遺伝子の一つは典型的には、形質転換されていない細胞から形質転換体を容易に検出するための選抜用マーカー遺伝子（抗生物質抵抗性遺伝子または除草剤抵抗性遺伝子）である。付加的な性質を付与し、現にある性質を抑制し（「アンチセンス」機構によって）、または植物細胞およびそれから再生した全植物体の既知の性質を増幅するために、その他の遺伝子を植物細胞のゲノムに付加することもできる。これらの遺伝子は、組織特異的なプロモーターを使用することによって、特異的な組織で発現させることができる。これらの遺伝子は、当業者に周知の技術によって構築することができる。遺伝子構築物は、プロモーター、構造遺伝子コード配列、およびポリ-アデニン（ポリ-A）残基の付加を可能にする配列を含む、一遺伝子発現カセットとして存在してもよい。プロモーターは、構造遺伝子をコードするDNAからRNAへの転写を開始するために必要である。プロモーターは、形質転換される細胞で機能するかぎり、さまざまなものに由来するものでよく、また配列を付加または欠失することによって、発現を促進させるために改変してもよい。DNAは、タンパク質に関するコード領域の外側、または内側にイントロン配列を含んでいることがある。これらのイントロンを除去して、ポリA配列を付加すれば、それに対応するタンパク質への翻訳が可能な成熟メッセンジャーRNA（mRNA）が産生される。遺伝子発現カセットは、２個以上の群をまとめて結合させることもできる。一つのmRNA が１個よりも多数のタンパク質をコードしているポリシストロニックな発現カセットを用いることもできる。さらに、発現カセットを用いて、タンパク質をコードするDNA鎖の反対鎖となるDNA鎖を転写させた「アンチセンス」RNAを産生させることもできる。植物の中で活性のあるプロモーターの例としては、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Christensen et al.，[1992]Plant Molecular Biology 18:675-6 89）などがある。第１イントロンを含む、トウモロコシのユビキチン遺伝子の非翻訳リーダー配列を、特に単子葉類で用いるために組み込むことができる。カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Murray et al.，[1991]Plant Mo lecular Biology 16:1035-1050）、またはマンノピンシンターゼ遺伝子のT-DNA のMas2プロモーター（Leung et al.，[1991]Molecular & General Genetics 230 :463-474）を用いることもできる。35Sプロモーターは、上流エンハンサー配列および非翻訳リーダー配列中にイントロンを持ちながら、欠失があってもよく（ Last et al.,[1991]Theoretical & Applied Genetics 81:581-588）、Mas2プロモーターは、発現を促進させるための欠失があってもよい（Leung et al.，前記）。構造遺伝子の例としては、GUSすなわちグルクロニダーゼをコードするようなレポーター遺伝子（Jefferson et al.，[1987]EMBO Journal 6:3901-3907）、市販の除草剤バスタ（Basta）（Droge et al.，[1992]Planta 187:142-151）の有効成分に対して抵抗性を付与する、PATすなわちホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼをコードするような選抜用マーカー遺伝子、または付加価値的な表現形質の発現をもたらす遺伝子などがある。後者の型の遺伝子の例としては、鱗翅目（Adang et al.，[1985]Gene 36:289-300）、または鞘翅目（Bradfisch e t al.,欧州特許第0 500 311 A2号、および米国特許第5,208,017号）などの昆虫に抵抗性を付与し、図1でB.t.2、およびB.t.3と名付けられている、バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（B.t.）に由来する遺伝子などがある。植物細胞での発現を促進するために、B.t.遺伝子を改変することもできる（Adang et al.，1995年1月10日発行の米国特許第5,380,831号）。除草剤抵抗性遺伝子は、形質転換体を選抜する目的に役立つ一方で、その遺伝子をもたず、除草剤感受性である作物を植えてある圃場において除草剤を使用することを可能にし、および/または雑草防除のために除草剤が予め使用されている圃場に植えられた、その遺伝子をもたず、除草剤感受性である作物に対する被害（除草剤の持ち越し）を予防するという農業的に価値のある目的のために役立ちうる。植物で用いる価値のある遺伝子のさらに別のタイプには、バチルス・チューリンギエンシスから単離されたデルタエンドトキシンをコードする遺伝子、またはそれらを一部欠失したものおよび/もしくはそれらの合成誘導体；真菌類抵抗性遺伝子；脂肪生合成遺伝子；アンチセンス遺伝子、ならびに栄養成分および/または繊維の性質に関係する遺伝子などがある。好ましくは、等浸透圧である適当な緩衝培地の中で、本発明に係るDNAおよび細胞を反応させる。例えば、ワン（Wong）およびノイマン（Neumann）のF-培地、Biochemistry and Biophysics Research Communications，Vol．107，pp．584 -587，1982;クレンズ（Krens）ら、[1981]Nature 296:72-74を参照のこと。好ましい緩衝培地は、EPR緩衝液（555mMのグルコース、4mMのCaCl₂、10mMのHepes緩衝液、pH7.2）。本方法を行う場合、新鮮な植物細胞を反応用容器に加えてから、DNAおよび緩衝培地の混合液を加える。材料を添加する順序は重要ではない。エレクトロポレーション処理を行う温度は重要ではないが、電場をかける前後にはすぐに、DNA/植物細胞混合液を冷やすことが好ましい。培養または再生の段階はいずれも、当業者に周知の条件（温度を含む）下で行う。DNAおよび植物細胞の混合液の、37℃で10分間のヒートショック処理を行うこともできる。本発明のエレクトロポレーションの段階は、周知の技術にしたがって、DNA/細胞混合液に電場をかけることによって行われる。任意の電場を用いることが可能である。電気パルスは、用いる電流に応じて、25〜5,000ボルト（V）、またはそれ以上に上げることができる。好ましい方法としては、方形パルス発生システム、およびキャパシター放電システムなどがある。キャパシター放電システムは、指数的に電圧が低下するパルスを作り出す。本発明を実施するときは、DNAおよび植物細胞をともに、少なくとも約10分間、好ましくは20〜90分間室温でインキュベートする。次に、DNA/細胞混合液を等量液にしてエレクトロポレーション用キュベットに移し、選択的に電場をかける前に氷上で冷やしておく。電場の強さは、例えば、形質転換する具体的な植物種、形質転換処理に用いられる細胞の具体的な型（年齢を含む）、植物細胞に電場をかける時間の長さを含む用いる電場の型、DNAの濃度および型、その他さまざまな要素によって変えることができる。当業者は、日常的に行われる滴定実験を用いることによって、最適な処理条件を容易に決定することができる。トウモロコシのカルス細胞の形質転換においてキャパシター放電システムを用いるときに好ましいエレクトロポレーションの条件としては、250〜1500μFキャパシター、25〜500またはそれ以上のボルト数、および50〜500msecのパルス時間などがある。放電は、25〜500ボルトでなければならない。特に好ましい条件は8 50μF、150V、Nおよび200msecのパルス時間である。電場をかけた直後、エレクトロポレーションキュベットを選択的に、約10分間氷上に置いてもよい。そしてこのキュベットを、少なくとも約５分間室温に置き、そこに細胞培養培地の少量の等量液を加える。次に、キュベットからサンプルをピペットで吸い出して、６穴培養皿のウエルに入れた2mlの培地の中に入れる。処理した細胞は、培養して維持し、標準的な培養および植物再生技術を用いて再生させる。本発明の範囲に含まれると考えられるSARポリヌクレオチドには、SARの機能的な断片、およびその対立遺伝子変異を含む既知のSARが含まれ、また本明細書において例示されているSARと実質的に同一の生物学的活性を保持しているかぎりは、将来同定されるであろうSARも含まれよう。SARは天然物から調製したり、または自動DNA合成機など、当技術分野において既知の標準的な技術を用いて合成することができる。本発明のSARポリヌクレオチドはまた、天然の配列中に変異を含む変異配列を含む。これらの変異には、その変異SAR配列が本発明の天然のSAR配列と実質的に同一の生物学的活性を保持しているかぎりは、例えば、ヌクレオチド置換、挿入、および欠失などが含まれる。本発明は、また、本発明の方法を用いて形質転換された細胞および組織にも関する。本明細書で説明されている方法にしたがって異種由来の遺伝子を発現させるために形質転換した植物体、小植物体、および植物種子も、本発明の範囲内にあると考えられる。本明細書全体で引用されているすべての参考文献を開示したものは、参照として本明細書に組み入れられる。材料および方法 PAT-ELISA ヌンク（Nunc）社製Maxisorb微量滴定用プレートは、コーティング緩衝液の中で、室温で2時間ゆっくり振とうしながら、プロテインA精製した1μg/mlのウサギ抗-PAT IgG、100μlで被覆した。コーティング溶液を捨てた後、400μlのブロッキング溶液を加え、プレートを４℃でゆっくり振とうしながら、一晩ブロッキングを行った。そしてこのプレートを、スカトロンスキャンウォッシャー（Skat ron Skan Washer）プレート洗浄器で洗浄し、ウェルに100mlの抗原または細胞抽出物を加え、ゆっくりと振とうしながら、室温で２時間インキュベートた。抽出物は、カルス材料については５倍容量の植物抽出緩衝液（Plant Extraction Buf fer）（PEB）中で、葉材料については１０倍容量の植物抽出緩衝液（Plant Extr action Buffer）（PEB）中で、〜100mgfwの組織を磨砕し、粗抽出物を５分間遠心分離して作製した。次に上清を移して、もう一度５分間遠心分離した。そして微量滴定用プレートに加える前に、磨砕用緩衝液で抽出物を10倍に希釈した。プレートを洗浄した後、Ab緩衝液（Ab Buffer）中1μg/mlのプロテインA精製したヤギ抗-PAT IgG、100μlをプレートに加え、ゆっくりと振とうしながら、室温で 1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、1:30,000の希釈率で、アルカリホスファターゼ（ピアス（Pierce）社製）に結合した100μlの抗ヤギ抗体を加えて、ゆっくりと振とうしながら、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、200 m lのSIGMA FAST pNPP基質を加えて、プレートを振とうせずに1時間から3時間静置し、1時間毎に、595nm（405nmを参照として）での吸光度を読み取った。定量は、精製したPATタンパク質を陰性対照抽出物に10倍ずつの希釈率で加えて作製した標準曲線をもつ吸光度と比較して行った。サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションの手順サザンブロッティングおよびプレハイブリダイゼーション：サザンブロッティング法は、本質的には、マレー（Murray）ら、[1992]Plant Molecular Biology Reporter，vol．10(2)で述べているところにしたがって行われた。かいつまんで言うと、適当な制限酵素で消化したゲノムDNA（5〜10ug）を１×ローディング緩衝液中に懸濁して、アガロース/TAEゲル（0.85%）中にロードする。このDNAを電気泳動（75W/4h）で分離してから、ケルを30分間染色（0.1ug/ml EtBrを含む10m M NaPO）して写真撮影する。次に、このゲルを20分間変性させる（150mM NaPO）。次に、毛細管作用によって、分離したDNAを一晩かけてナイロン膜に移動させる。このナイロン膜を80℃で2時間焼固して、2時間ブロッキング（2%SDS，0.5%B SA，1mM EDTA，1mMオルトフェナントロリン）し、2時間プレハイブリダイゼーション（100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.8）、20mMピロリン酸ナトリウム、5m M EDTA，1mM 1,10オルトフェナントロリン，0.1%SDS，10%デキストラン硫酸、50 0ug/mlヘパリン硫酸、50ug/ml酵母RNA，50ug/mlニシン精子DNA）を行う。ハイブリダイゼーション：プローブとして用いる鋳型DNAは、プライムイットR mTランダムプライミング標識キット（Prime-It RmT Random Priming Labeling K it）（ストラタジーン（Stratagene）社製）を用いて、P cCTPで標識する。プローブの標識効率を測定して、プレハイブリした膜に約1×10⁶のCPM/MLを加える。この膜をプローブと65℃で12〜16時間ハイブリダイズさせる。次に、非結合プローブを除去するために、この膜を３回洗浄（5mMリン酸ナトリウム（pH7.8）、1. 25mMピロリン酸ナトリウム、0.25mM EDTA，0.1%SDS）してから、コダック（Koda k）社製の科学用画像化フィルムに感光させる。以下は、本発明を実施するための手順を例示するものである。これらの実施例を限定的なものと解してはならない。別途記載がないかぎり、割合はすべて重量によるものであり、溶媒の混合比率はすべて容量によるものである。実施例１発現カセット中にSARをもつものおよびもたないものを用いて形質転換したトウモロコシ細胞について、一過的および安定的な形質転換効率の両方を判定するために、いくつかの実験を行った。トウモロコシの全細胞をそのままエレクトロポレーション法により形質転換処理を行った。この実験の結果を下の表１に示す。この表から分かるように、SAR陽性クローン（+SAR）は、一過的な形質転換効率は低い（19.7%対29.49%）が、安定した形質転換効率はより高い（3.62%対0.51 %）。実施例２本明細書の材料および方法の節で説明した、PAT遺伝子を含むいくつかのSAR陰性およびSAR陽性クローンに対して、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（PAT）を検出するためのELISAを行った。クローンT34-1は、PATを最高に発現させるSAR陰性クローンの一つで、陽性対照を表している。この解析結果を表２に示す。いくつかのSAR-陽性クローンが、高レベルでPATタンパク質を産生することが分かった。実施例３本明細書の材料および方法の節で説明したとことにしたがって、PAT遺伝子を検出するために、いくつかの形質転換したトウモロコシカルスクローンのサザン解析を行った。用いられた制限酵素はBamHI、プローブはPAT(PCR)であった。対照を含む、サザンブロッティング実験の結果が図１〜３に示されている。PAT特異的な放射活性プローブとインキュベートするとバンドが出現することから、図１の結果は、選ばれたカルスのすべてがPAT遺伝子を含んでいたことを示している。図２は、選ばれたカルスから再生した植物体は、PAT遺伝子をももつ植物体を形成したことを示している。ほとんどの系統が、PAT遺伝子の挿入コピーを一つか数個持っているが、レーン24、すなわちST-8の１系統だけは、多数のPAT遺伝子が挿入されていることを示す複雑なバンドパターンを示した。ST2-1由来のT 1世代において、PAT遺伝子に関して分離する植物体からの葉組織からとったDNA のサザン解析は、２つ例外はあるが、除草剤感受性だと思われるすべての植物が、PAT遺伝子の存在について陰性であることを示していた（図３）。除草剤抵抗性と考えられる植物体には、例外なしに、すべてPAT遺伝子が存在することを示した。このデータはまた、挿入された遺伝子が、減数分裂を通して、T₁後代植物にも伝わっていくことを示している。実施例４ HiII遺伝子型の12日目の穂軸から未成熟の接合体胚を単離した。これらを、N₆ 塩、1mg/Lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、および10μMのAgNO₃を含むカルス誘導培地（CIM）上に胚盤を上にしてまき、暗所、27〜29℃で8日間インキュベートしてから、II型カルス形成について調べた。250個のカルス化胚を選び、1.5mlの滅菌マイクロキュベットに、各キュベット当たり5個の胚を置いた。20 μlのAGM285AプラスミドDNA（1μg/μl）を導入した後、200μlのEPM緩衝液（80 mM KCl，5mM CaCl₂、10mM hepes、0.425Mマンニトール、pH7.2）を加えた。キュベットの一つにpAGM243（Ubi-pat-Nos::Ubi-gus-Nos遺伝子構築物を含む）を加えた。別のキュベットにはプラスミドDNAを入れなかった。キュベットの内容物を撹拌してから室温に１時間放置した。ジーンザッパー（gene ZAPPER）450/250 0（IBI社製）を用いて、850μF、150V、１パルスで、エレクトロポレーションを行った。このキュベットを室温に20分間放置した後、胚を取り出し、胚盤を上にして CIMの上に置き、暗所、27〜29℃に戻した。３日後、pAGM243で処理した胚を、GU S染色液の中に入れて、９日後にGUS+事象があるかどうか観察した。これらの胚は、242個のGUS+事象を示したので、各胚当たり48.4個のGUS事象が見られたことになる。処理後７日目に、pAGM285Aで処理した胚およびプラスミドDNAなしでエレクトロポレーションを行った胚のすべてを、N₆塩、1mg/Lの2,4-D、および5μMのビアラホスを含むカルス維持培地（CMM）に移した。これらは、22日後に再び、同じ型の培地に移植した。約３週間後、この組織を再び移植した。実施例５トウモロコシのSAR+材料による圃場試験では、19事象のうち13事象が、異型接合挿入に合致する分離比（自家受粉させたときに3：1の比；野生型と交配したときに1：1の比）を示した。さらに、調査したSAR+系統のみが、3世代目において、通常の圃場施用量よりも８倍高い割合で施用した場合（27.3オンス/エーカーの除草剤リムーブ（Remov e））にも、リバティー（Liberty）除草剤に対して優れた抵抗性を示した。この結果は、数世代経過後にもPat遺伝子の高発現が、非常に安定していることを示している。通常、トランスジェニック植物は、所定のトランスジェニック系統が次の世代に進むにつれて、かなり高頻度で導入遺伝子の遺伝子サイレンシングを示す。遺伝子サイレンシングは、トランスジェニック作物を商業化する上での主要な問題となっている。これは、0.1%よりも低い割合から、3％までの割合で起こり、それよりも高いこともある。こうして、挿入導入遺伝子の3'および5'末端に用いた場合に、SARがこの現象を回避することが示されたことになる。両末端にRb7 SAR 領域を付着させたユビキチンプロモーター-ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ-ナウ（now）ターミネーター（Ubi-pat-nos）を含むトランスジェニックトウモロコシ系統によって、本特許において説明されている方法、または別の既知の形質転換法によって、圃場において何世代かにわたって製造されたトランスジェニックトウモロコシにおける遺伝子サイレンシングが回避される。本明細書に記載の実施例および態様は例示目的のためだけのものであり、当業者にとっては、これに照らしてさまざまな改変または変更が示唆されることとなるが、それらも本出願の意図および範囲に含まれることになると理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】 1．所期のポリヌクレオチドを植物細胞に挿入し、形質転換に成功した細胞が同定および選抜できるような条件下で、該細胞を維持することを含む植物の形質転換法において、所期の該ポリヌクレオチドに操作可能なように結合している少なくとも１個のスカフォールド付着領域のポリヌクレオチド配列を提供し、それによって安定した形質転換事象を回収する頻度を増加させることを含む改良法。 2．所期のポリヌクレオチドが、その5'末端および3'末端のそれぞれに操作可能なように結合している少なくとも1個のスカフォールド付着領域を含む、請求項１記載の改良法。 3．スカフォールド付着領域のポリヌクレオチドが、配列番号：1記載のヌクレオチド配列、またはその機能的な断片もしくは変異配列を含む、請求項１記載の改良法。 4．スカフォールド付着領域のポリヌクレオチドが、植物で発現可能なDNA発現カセットの形で提供される、請求項１記載の改良法。 5．植物形質転換法が、DNAで被覆された微小粒子によるパーティクルガン法、アグロバクテリウムによる形質転換法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、磁気泳動法（magnetophoresis）、炭化ケイ素ウィスカー法、PEGによる形質転換法、およびプロトプラスト形質転換法からなる群より選択される、請求項１記載の改良法。 6．所期の該遺伝子が、抗生物質抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子、レポーター遺伝子、マーカー遺伝子、疾病抵抗性遺伝子、脂肪生合成遺伝子、アンチセンス遺伝子、殺虫剤抵抗性遺伝子、および栄養性を向上させる遺伝子からなる群より選択される、請求項１記載の改良法。 7．植物細胞が、胚形成懸濁細胞、非胚形成懸濁細胞、植物外植片細胞、生殖系列細胞、小胞子細胞、およびカルス組織細胞からなる群より選択される、請求項１記載の改良法。 8．植物細胞が、ワタ、トマト、ラッカセイ、アルファルファ、イネ、コムギ、トウモロコシ、木本、果樹作物、果物、野菜、ダイズ、キャノーラ、芝草、タイマ、ヒマワリ、サトウキビ、サトウダイコン、およびバレイショからなる群より選択される種のものである、請求項１記載の改良法。 9．発現カセットが、5'側プロモーター領域、所期のポリヌクレオチドを含む構造遺伝子領域、3'側非翻訳領域、および該構造遺伝子領域の片側または両側に隣接するSARを含む、請求項４記載の改良法。 10．レポーター遺伝子が、グルクロニダーゼ、ホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、およびルシフェラーゼからなる群より選択される、請求項６記載の改良法。 11．マーカー遺伝子が、Pat/bar、グリフォセート抵抗性遺伝子、NPTII、HPT 、ブロモキシル（bromoxil）抵抗性遺伝子、AHAS、ALS、シアマミドヒドロターゼ（cyamamide hydrotase）、アデニンデアミナーゼ、2,4-Dモノオキシゲナーゼからなる群より選択される、請求項６記載の改良法。 12．請求項１記載の方法により製造される形質転換植物細胞。 13．細胞が、配列番号：1記載のヌクレオチド配列、またはその機能的な断片もしくは変異配列をもつスカフォールド付着領域ポリヌクレオチドを含む、請求項12記載の形質転換細胞。 14．請求項12記載の細胞の系統を引く形質転換細胞。 15．後代細胞が、配列番号：1記載のヌクレオチド配列、またはその機能的な断片もしくは変異配列をもつスカフォールド付着領域を含む、請求項14記載のトランスジェニック後代細胞。 16．請求項12記載の細胞から再生されたトランスジェニック植物。 17．植物が、配列番号：1記載のヌクレオチド配列、またはその機能的な断片もしくは変異配列をもつスカフォールド付着領域を有する細胞を含む、請求項16 記載のトランスジェエニック植物。 18．所期の構造遺伝子に操作可能なように結合している少なくとも一個のスカフォールド付着領域ポリヌクレオチド配列によって、植物細胞または組織を形質転換させることを含む、植物の形質転換法におけるコピー数の少ない形質転換体を増加させるための方法。 19．所期の遺伝子が、その5'末端および3'末端のそれぞれに操作可能なように結合している少なくとも1個のスカフォールド付着領域を含む、請求項18記載の方法。 20．スカフォールド付着領域のポリヌクレオチドが、配列番号：1記載のヌクレオチド配列、またはその機能的な断片もしくは変異配列を含む、請求項18記載の方法。 21．スカフォールド付着領域のポリヌクレオチドが、植物で発現可能な構造遺伝子領域を含むDNA発現カセットの形で提供される、請求項18記載の方法。 22．植物形質転換法が、DNAで被覆された微小粒子によるパーティクルガン法、アグロバクテリウムによる形質転換法、およびエレクトロポレーション法からなる群より選択される、請求項18記載の方法。 23．所期の該遺伝子が、抗生物質抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子、レポーター遺伝子、真菌類抵抗性遺伝子、脂肪生合成遺伝子、アンチセンス遺伝子、および殺虫剤抵抗性遺伝子からなる群より選択される、請求項18記載の方法。 24．植物細胞が、胚形成懸濁細胞、非胚形成懸濁細胞、植物外植片細胞、生殖系列細胞、小胞子細胞、およびカルス組織細胞からなる群より選択される、請求項18記載の方法。 25．植物組織が、カルス、分裂組織、葉組織、芽組織、根組織、および胚形成組織からなる群より選択される、請求項18記載の方法。 26．植物細胞または組織が、ワタ、トマト、ラッカセイ、アルファルファ、イネ、コムギ、およびトウモロコシからなる群より選択される種のものである、請求項18記載の方法。 27．発現カセットが、5'側プロモーター領域、構造遺伝子領域、および3'側非翻訳領域、ならびに該構造遺伝子領域の片側または両側に隣接するSARを含む、請求項21記載の方法。 28．レポーター遺伝子が、グルクロニダーゼおよびホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項23記載の方法。