JP5647204B2 - 除草剤抵抗性遺伝子 - Google Patents
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Description
雑草は、作物および他の望ましい植物によって必要とされる価値のある土壌中の栄養素を急速に枯渇させうる。雑草の制御のために現在使用されている多くの異なる型の除草剤が存在している。1つの極めて評判のよい除草剤がグリホセートである。
本発明は、2,4-Dに対してのみならず、ピリジルオキシ酢酸除草剤にもまた抵抗性である新規な植物を提供する。従来、これらの有利な特性の両方を有する植物が、単一の遺伝子の導入によって産生することができるという予測または示唆は存在しなかった。本発明はまた、より広くかつより強固な雑草の制御、および除草剤抵抗性管理の選択肢と適合できる除草剤耐性植物を提供するために、グリホセート抵抗性遺伝子、ALS(イミダゾリノン、スルホニルウレア)抵抗性遺伝子、アリールオキシアルカノエート抵抗遺伝子、HPPD抵抗性遺伝子、PPO抵抗性遺伝子、およびグルホシネート抵抗性遺伝子を含むがこれらに限定されない、1種または複数の他の除草剤抵抗性遺伝子とともに「重ね合わせた(stack)」本発明の1種または複数の酵素を産生する植物を含む。本発明はさらに、本明細書に例示される遺伝子およびタンパク質のホモログを使用する方法および組成物を含む。
対象の2,4-D抵抗性遺伝子の開発および引き続く抵抗性作物は、作物適用における、広葉のグリホセート抵抗性(またはかなり耐性でありかつ転じた)雑草種の制御のための優秀な選択肢を提供する。より多くの作物耐性が双子葉植物および単子葉植物において同様に提供され得る場合には、2,4-Dは、栽培者のための優秀な有用性を提供する、広い範囲の、比較的安価な、かつ強固な広葉除草剤である。2,4-D耐性トランスジェニック双子葉植物作物はまた、適用のタイミングおよび割合においてより大きな柔軟性を有する。2,4-Dについての対象となる除草剤耐性形質のさらなる有用性は、2,4-Dの漂流、揮発、反転(または場所から離れた他の移動現象)、適用の誤り、汚損などから、通常感受性である作物への損傷を予防するその有用性であると考えられる。AAD-12遺伝子のさらなる利点は、現在まで特徴付けされているすべてのtfdAホモログと異なり、AAD-12は、アキラルフェノキシオーキシン(例えば、2,4-D、MCPA、4-クロロフェノキシ酢酸)に加えて、ピリジルオキシ酢酸オーキシン(例えば、トリクロピル、フルロキシピル)を分解可能であることである。表1を参照されたい。本発明のAAD-12酵素によって触媒される化学反応の一般的図式は図1に示される(O2の付加は立体特異的であり;フェノールおよびグリオキシレートへの中間体の分解は自発的である)。図1における化学構造は分子骨格を図示すること、および種々のR基など(例えば、表1に示されるものなど)が含まれるが、これらは図1において必ずしも具体的に図示されないことが理解されるべきである。異なるフェノキシオーキシンの組み合わせの複数の混合物が、特定の雑草の範囲および様々な地域の環境条件に取り組むために世界的に使用されてきた。植物でのAAD-12遺伝子の使用は、はるかに広い範囲のオーキシン除草剤に対する保護を与え、それによって、制御され得る雑草の幅および範囲を増加させる。本発明はまた、市販のフェノキシオーキシンの最大限の広がりによる、漂流(drift)または用地外の他の合成オーキシン除草剤損傷から保護するためにも使用することができる。表1は、市販のピリジルオキシオーキシンおよびフェノキシオーキシンを定義し、関連する化学構造を提供する。
本発明は機能的タンパク質を提供する。「機能的活性」(または「活性な」)は、本明細書では、本発明による使用のためのタンパク質/酵素が、除草剤を分解するか、またはその活性を減少する能力を有する(単独でまたは他のタンパク質と組み合わせて)ことを意味する。本発明のタンパク質を産生する植物は、植物が除草剤で処理される場合に、タンパク質発現のレベルが、植物を、除草剤に対して完全もしくは部分的に抵抗性に、または耐性にするための十分であるような、タンパク質の「有効量」を好ましく産生する(他に特定されない限り典型的な割合において;典型的な適用割合は、例えば、周知のHerbicide Handbook (Weed Science Society of America, Eighth Edition, 2002) において見い出され得る)。除草剤は、通常の圃場使用割合および濃度において、正常に標的植物を死滅させる割合で適用され得る(本発明のために、レベルおよび/または濃度は、以前に使用されたものよりも任意により高くあり得る)。好ましくは、本発明の植物細胞および植物は、除草剤処理によって引き起こされる生育阻害または損傷に対して保護される。本発明の形質転換植物および植物細胞は、好ましくは、本明細書で議論されるように、除草剤に対して抵抗性または耐性にされ、このことは、形質転換植物および植物細胞が、本明細書で議論されるように、有効量の1種または複数の除草剤の存在下で生育することができることを意味する。本発明の好ましいタンパク質は、1種または複数のアリールオキシアルカノエート化合物を代謝するための触媒活性を有する。
本発明はさらに、本発明による使用のためのタンパク質をコードする核酸配列を提供する。本発明はさらに、所望の除草剤活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を同定および特徴付けする方法を提供する。1つの態様において、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブおよび/またはPCR技術のためのプライマーとして有用である独特なヌクレオチド配列を提供する。これらのプライマーは、関心対象の特定の遺伝子の同定、特徴付け、および/または単離において有用であり得る特徴的な遺伝子フラグメントを産生する。本発明のヌクレオチド配列は、以前に記載されているタンパク質から区別できるタンパク質をコードする。
Tm = 81.5 C + 16.6 Log [Na+] + 0.41(%G+C) - 0.61(ホルムアルデヒド%) - 600/塩基対中の二重鎖の長さ。
(1)1×SSPE、0.1% SDS中での室温で15分間、2回(低ストリンジェンシー洗浄)。
(2)0.2×SSPE、0.1% SDS中でのTm-20℃で15分間、1回(中程度ストリンジェンシー洗浄)。
Tm(℃)= 2(T/A塩基対の数)+ 4(G/C塩基対の数)(Suggs et al., 1981)。
(1)1×SSPE、0.1% SDS中での室温で15分間、2回(低ストリンジェンシー洗浄)。
(2)1×SSPE、0.1% SDS中でのハイブリダイゼーション温度で15分間、1回(中程度ストリンジェンシー洗浄)。
低:1または2×SPPE、室温
低:1または2×SSPE、42℃
中程度:0.2×または1×SSPE、65℃
高:0.1×SSPE、65℃。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、反復性の、酵素的な、プライマーを用いる、核酸配列の合成である。この手法は周知であり、当業者によって一般的に使用されている(Mullis, 米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、および同第4,800,159号; Saiki et al., 1985を参照されたい)。PCRは、標的配列の反対の鎖にハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドプライマーによって隣接される関心対象のDNAフラグメントの酵素的増幅に基づく。これらのプライマーは、好ましくは、3'末端が互いに対して向けられて配置される。鋳型の熱変性、それらの相補的配列へのプライマーのアニーリング、およびDNAポリメラーゼを用いてのアニールされたプライマーの伸長は、PCRプライマーの5'末端によって規定されるセグメントの増幅を生じる。各プライマーの伸長産物は、他のプライマーのための鋳型として働くことができ、従って、各サイクルは、以前のサイクルで産生されたDNAフラグメントの量を本質的に倍加させる。これにより、特定の標的フラグメントの指数関数的な蓄積が、数時間以内に数百万倍にまでになる。耐熱性細菌サーマス アクアティカス(Thermus aquaticus)から単離されたTaqポリメラーゼなどの耐熱性DNAポリメラーゼを使用することによって、この増幅プロセスは、完全に自動化することができる。使用することができる他の酵素は、当業者に知られている。
対象の遺伝子およびタンパク質は、キメラタンパク質または融合タンパク質を産生するために、他の遺伝子およびタンパク質に融合され得る。本発明に従って有用な遺伝子およびタンパク質は、特に例示された全長配列のみならず、これらの配列、これらの配列の変種、変異体、キメラ、ならびに融合物の一部分、セグメント、および/またはフラグメント(隣接するフラグメント、ならびに全長分子と比較して内部および/または末端の欠失を含む)。本発明のタンパク質は、これらが所望の機能的活性を保持する限りは、置換されたアミノ酸を有することができる。「変種」遺伝子は、例示されたタンパク質に対して等価であるかまたは類似している活性を有する、同じタンパク質または等価なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
植物での異種遺伝子の高発現を得るために、遺伝子が植物細胞(の細胞質)においてより効率的に発現されるように、その遺伝子を再操作することが一般的に好ましい。トウモロコシは、1つのこのような植物であり、ここでは、該植物で遺伝子の発現レベルを増加させるために、形質転換の前に異種遺伝子を再設計することが好ましい場合がある。それゆえに、細菌タンパク質をコードする遺伝子の設計における追加の工程は、双子葉植物種または単子葉植物種に関わらず、標的植物配列とより密接に整列されるコドンの偏りを使用する、最適な発現のための異種遺伝子の再操作である。配列はまた、本明細書の別の箇所で議論される、より特定な型の植物のいずれかにおける発現のために最適化することができる。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、広範な種々の微生物または植物の宿主に導入することができる。本発明は、トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を含む。好ましい植物(および植物細胞)は、トウモロコシ、アラビドプシス、タバコ、ダイズ、ワタ、アブラナ、イネ、コムギ、芝草、マメ科飼草(アルファルファおよびクローバー)、および牧草などである。他の型のトランスジェニック植物、例えば、果物、野菜、観賞用植物、および木もまた、本発明に従って作製することができる。より一般的には、双子葉植物および/または単子葉植物は、本発明の種々の局面において使用することができる。
本発明の種子の1つの局面は、本発明のタンパク質を発現する本発明のポリヌクレオチドを用いる、植物、植物種子、および他の宿主細胞の形質転換/トランスフェクションである。この様式で形質転換された植物は、異なる作用の様式を有する種々の除草剤に対して抵抗性にされ得る。
本発明の植物は、収量を含む表現型に対して観察可能な有害な効果を伴うことなく、新たな除草剤抵抗性形質を付与できることが本明細書で示される。このような植物は本発明の範囲内にある。本明細書に例示されかつ示唆される植物は、例えば、典型的な適用レベルの2×、3×、4×、および5×の少なくとも1種の対象となる除草剤に耐えることができる。これらの耐性レベルの改善は本発明の範囲内にある。例えば、種々の技術が当技術分野において知られており、所定の遺伝子の発現を増加させるために、予見可能に最適化でき、およびさらに開発できる。
植物において除草剤分解活性を有する遺伝子を同定するための方法として、NCBI(National Center for Biotechnology Information)などの現在の公的なデータベースを調査することが可能である。このプロセスを開始するために、所望の特性(すなわち、α-ケトグルタレートジオキシゲナーゼ活性)を有するタンパク質をコードする、すでに同定された機能的遺伝子配列を持っていることが必要である。次いで、このタンパク質配列は、使用可能である寄託されたNCBIタンパク質配列に対して比較するために、BLAST(基礎局所的アラインメント検索ツール (Basic Local Alignment Search Tool))(Altschul et al. , 1997)アルゴリズムのためのインプットとして使用する。デフォルト設定を使用すると、この検索は、様々なレベルで100個までの相同タンパク質配列を回答する。これらは、アミノ酸レベルが、高い同一性(85〜98%)から非常に低い同一性(23〜32%)までの範囲である。伝統的には、高い相同性を有する配列のみが、インプット配列と同様の特性を保持していることが予測される。この場合、≦50%相同性を有する配列のみが選択される。本明細書において例示されるように、わずか31%のアミノ酸保存性(ラルストニア ユートロファ由来のtfdAと比較して)を有するホモログをクローニングおよび組換えにより発現することが、意図された除草剤に対してのみならず、これらの酵素を用いて以前に試験されなかった基質に対しても、商業的レベルの抵抗性を付与するために使用できることを続けて例示する。
2.1-背景
植物における異種遺伝子のより高いレベルの発現を得るために、これらが植物細胞でより効率的に発現されるように、タンパク質をコードする遺伝子を再操作することが好ましい場合がある。トウモロコシは、1つのこのような植物であり、該植物でのその発現レベルおよびコード化タンパク質のレベルを増加させるために、形質転換の前に、異種のタンパク質コード領域を再設計することが好ましい場合がある。それゆえに、細菌タンパク質をコードする遺伝子の設計におけるさらなる工程は、最適な発現のために異種遺伝子の再操作である。
ネイティブAAD-12コード領域の876塩基対(bp)のDNA配列(SEQ ID NO:1)の広範な分析は、最適な植物発現に対して有害であると考えられているいくつかの配列モチーフの存在、ならびに最適でないコドン組成を明らかにした。SEQ ID NO:1によってコードされるタンパク質(AAD-12)はSEQ ID NO:2として提示される。単子葉植物ならびに双子葉植物における組換えタンパク質の産生を改善するために、1つのタンパク質(SEQ ID NO:4)をコードする「植物に最適化された」DNA配列AAD-12(v1)(SEQ ID NO:3)を開発した。これは、2位のアラニン残基(SEQ ID NO:4において下線を付した)の付加以外は、ネイティブなSEQ ID NO:2と同じである。付加的なアラニンコドン(GCT;SEQ ID NO:3において下線を付した)は、ATG翻訳開始コドンに及ぶNcoI制限酵素認識部位(CCATGG)の一部をコードしている。従って、これは、翻訳の開始を最適化するためにATG開始コドンを取り囲む配列の状況を改善しながら、引き続くクローニング操作を容易にするという二重の目的に役立つ。ネイティブのコード領域および植物に最適化されたコード領域(v1)によってコードされるタンパク質は99.3%同一であり、アミノ酸番号2においてのみ異なる。対照的に、ネイティブのコード領域のDNA配列および植物に最適化されたコード領域(v1)のDNA配列は79.9%だけ同一である。表5は、ネイティブ配列(カラムAおよびD)および植物に最適化された配列(カラムBおよびE)のコドン組成の違いを示し、ならびに理論的な植物に最適化された配列(カラムCおよびF)に対する比較を可能にする。
大腸菌(Escherichia coli)の特別に操作された株および関連するベクター系は、生化学的研究および分析的研究のために比較的大量のタンパク質を産生するためにしばしば利用されている。所望のタンパク質をコードするネイティブ遺伝子は、その遺伝子の供給源生物が別の細菌属である場合があるにしても、大腸菌における高レベルの発現のためには十分に適してはいないことが時折見い出される。このような場合において、その遺伝子のタンパク質コード領域を再操作して、大腸菌における発現のためにより適切にすることが可能でありかつ望ましい。大腸菌クラスII遺伝子は、大腸菌細胞の対数増殖期の間に高度にかつ連続して発現されるものとして定義されている(Henaut, A. and Danchin, A. (1996) Escherichia coli and Salmonella typhimurium cellular and molecular biology, vol. 2, pp. 2047-2066. Neidhardt, F., Curtiss III, R., Ingraham, J., Lin, E., Low, B., Magasanik, B., Reznikoff, W., Riley, M., Schaechter, M. and Umbarger, H. (eds.) American Society for Microbiology, Washington, DC所収)。大腸菌クラスII遺伝子のコード領域のコドン組成の検討を通して、これらの大腸菌クラスII遺伝子コード領域の平均コドン組成を工夫することができる。クラスII遺伝子の平均コドン組成を模倣する平均コドン組成を有するタンパク質コード領域は、大腸菌の対数増殖期の間の発現のために好ましい。これらの指針を使用して、上述のように2位にさらなるアラニンを含む、AAD-12タンパク質をコードする新規なDNA配列(SEQ ID NO:4)を、大腸菌クラスII遺伝子コード領域の平均コドン組成に従って設計した。その設計がコドン組成にのみ基づいた初期の配列は、大腸菌発現ベクターへのクローニングのために適切である特定の制限酵素認識配列を含むようにさらに操作した。高度に安定なステムループ構造のような有害な配列の特徴は、16SリボソームRNAの3'末端に相同な遺伝子内配列(すなわち、シャイン-ダルガーノ配列)と同様に回避した。大腸菌に最適化された配列(v2)はSEQ ID NO:5として開示され、SEQ ID NO:4に開示されるタンパク質をコードする。
本実施例は、変異を有するダイズ5-エノールピルボイルシキミ酸 3-リン酸シンターゼ(EPSPS)をコードするが、ダイズ細胞における発現のために最適化されている新規なDNA配列の設計を教示する。三重変異を有するダイズEPSPSのアミノ酸配列は、WO 2004/009761のSEQ ID NO:5に開示されている。このように開示された配列における変異したアミノ酸は、残基183(イソロイシンで置き換えられたネイティブタンパク質のスレオニン)、残基186(リジンで置き換えられたネイティブタンパク質のアルギニン)、および残基187(セリンで置き換えられたネイティブタンパク質のプロリン)においてである。従って、WO 2004/009761のSEQ ID NO:5の置換されたアミノ酸を、適切な位置でネイティブなアミノ酸で置き換えることによって、ネイティブなダイズEPSPSタンパク質のアミノ酸配列を推定することができる。このようなネイティブタンパク質配列は、(2005年5月2日に提出された)PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:20として本明細書に開示される。残基183(イソロイシンで置き換えられたネイティブタンパク質のスレオニン)、および残基187(セリンで置き換えられたネイティブタンパク質のプロリン)における変異を含む、二重変異を有するダイズEPSPSタンパク質配列は、PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:21として本明細書に開示される。
C1の加重%=1/(%C1 + %C2 + %C3 + など) x %C1 x 100
を使用して、各コドンについての加重した平均表示を計算した。ここで、C1は問題のコドンであり、C2、C3などは、残りの同義語コドンを表し、および関連するコドンについての%値は、表7のカラムDおよびHから取られる(太字フォントのまれなコドン値は無視する)。各コドンについての加重した%値は、表7のカラムCおよびGに与えられる。TGAは、翻訳ターミネーターとして任意に選択した。次いで、偏ったコドン使用頻度を、OptGene(商標)遺伝子設計プログラム(Ocimum Biosolutions LLC, Indianapolis, Indiana)による使用のために特定化された遺伝コード表に入れた。
3.1-大腸菌pET発現ベクターの構築
さらなるクローニングリンカーを加えた部位に対応する制限酵素(Xba 1、Xho 1)を使用して、AAD-12(v2)をピコスクリプト(picoscript)ベクターから切断し、pET280ストレプトマイシン/スペクチノマイシン抵抗性ベクターにライゲーションした。次いで、連結した生成物をTOP10F'大腸菌に形質転換し、ルリアブロス(Luria Broth)+50μg/ml ストレプトマイシン(Streptomycin)およびスペクチノマイシン(Spectinomycin)(LB S/S)寒天プレートにプレートした。
AAD-12(v2)オープンリーディングフレームは、XbaI-XhoIフラグメントとして、改変pET発現ベクター(Novagen)「pET280 S/S」に最初にクローニングした。得られたプラスミドpDAB725は、制限酵素消化および配列決定反応を用いて確認した。pDAB725からのAAD-12(v2)オープンリーディングフレームは、XbaI-XhoIフラグメントとして、シュードモナス発現ベクターpMYC1803に移入した。陽性コロニーは制限酵素消化を介して確認した。完成した構築物pDAB739は、MB217およびMB324シュードモナス発現株に形質転換した。
植物に最適化された遺伝子AAD-12(v1)を、Picoscriptから受容した(遺伝子再構築設計を完成し(上記を参照されたい)および構築のためにPicoscriptに外注し、内部の配列(SEQ ID NO:3)を検証し、予測された配列の変化が存在していないことを確認した)。配列決定反応を、M13フォワードプライマー(SEQ ID NO:6)およびM13リバースプライマー(SEQ ID NO:7)を用いて、Beckman Coulter「Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit」試薬を使用して以前と同様に実行した。配列データを分析し、結果は、植物に最適化されたAAD-12(v1)DNA配列に異常が存在しなかったことを示した。AAD-12(v1)遺伝子を、NcoI-SacIフラグメントとして、pDAB726にクローニングした。得られる構築物はpDAB723と称し、これは[AtUbi10プロモーター: Nt OSM 5'UTR: AAD-12 (v1): Nt OSM3'UTR: ORF1 ポリA 3'UTR]を含んだ(PvuIIおよびNotI制限消化物で確認)。次いで、記載されたカセットを含むNot I-Not Iフラグメントを、バイナリーベクターpDAB3038のNotI部位にクローニングした。以下のカセット[AtUbi10プロモーター: Nt OSM5'UTR: AAD-12 (v1): Nt OSM 3'UTR: ORF1 ポリA 3'UTR: CsVMVプロモーター: PAT: ORF25/26 3'UTR]を含む、得られるバイナリーベクターpDAB724を、正確な方向の確認のために制限消化した(Bam HI、Nco I、Not I、SacI、およびXmn Iを用いる)。確認した完成した構築物(pDAB724)を、アグロバクテリウムへの形質転換のために使用した(7.2節を参照されたい)。
適切な植物種への形質転換のために作製したすべての他の構築物は、本明細書で以前に記載したのと類似の手順、および他の標準的な分子クローニング方法(Maniatis et al., 1982)を使用して構築した。表8は、適切なプロモーターおよび定義した特徴、ならびに形質転換した作物とともに使用したすべての形質転換構築物を列挙する。
*A=アラビドプシス
T=タバコ
S=ダイズ
Ct=ワタ
R=イネ
Cn=トウモロコシ
Ca=アブラナ
CsVMV=キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター
AtUbi10=アラビドプシス・サリアナ ユビキチン10プロモーター
AtUbi3=アラビドプシス・サリアナ ユビキチン3プロモーター
AtAct2=アラビドプシス・サリアナ アクチン2プロモーター
RB7 Mar v2=ニコチアナ タバカム(Nicotiana tabacum)マトリックス結合領域(MAR)
Nt Osm=ニコチアナ タバカム オスモチン5'非翻訳領域およびニコチアナ タバカム オスモチン3'非翻訳領域
ZmUbi1=ジー メイ(Zea mays)ユビキチン1プロモーター
Hptll=ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ
4.1-蛍光菌発酵
フラスコ実験のために、AAD-12(v2)構築物pDAB739(3.2節)を有する蛍光菌株MB324グリセロールストックの200μlを使用して、30μg/mlテトラサイクリン/HClを補充した50mlの新鮮なLB培地に接種した。培養物(250mLのバッフル付きErlenmeyerフラスコ中)をシェーカー(New Brunswick Scientific モデルInnova 44)上で、300rpmにて、30℃で16時間インキュベートした。20mlの種培養を、2.8Lのバッフル付きErlenmeyerフラスコ中で、20μg/mlテトラサイクリン/HClおよび250μlのPluronic L61(消泡剤)を補充した蛍光菌培養培地(酵母抽出物、5g/L; K2HPO4、5g/L; (NH4)2PO4、7.5g/L; (NH4)2SO4; MgSO4-7H2O、1g/L; KCl、0.5g/L; CaCl2-2H2O、0.5g/L; クエン酸Na-2H2O、15g/L; グリセロール、95g/L; 微量元素溶液、10ml/L; 微量元素溶液: FeCl3-6H2O、5.4g/L; MnCl2-4H2O、1g/L; ZnSO4-7H2O、1.45g/L; CuSO4-5H2O、0.25g/L; H3BO3、0.1g/L; (NH4)6MO7O24、0.1g/L; 濃HCl、13ml/L)1Lに移した。培養物を300rpmにて30℃で24時間インキュベーションした。イソプロピルβ-D-1-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)を培養物に最終1mMで加え、25℃で約48時間、インキュベートを継続した。細胞を7krpmにて4℃で15分間の遠心分離によって収集し、細胞ペーストを-80℃で保存するか、または精製のためにすぐに処理した。
約100〜200gの凍結した(または新鮮な)シュードモナス細胞を融解し、20mM Tris-HCl、pH 8.5を含む1〜2Lの抽出緩衝液、および25mlのプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigmaカタログ番号P8465)に再懸濁した。細胞は、マイクロフルイダイザー(モデルM110Lまたは110Y)(Microfluidics, Newton, MA)を使用し、氷上にて11,000〜12,000psiで1回通して破壊した。溶解物は24,000rpmで20分間遠心分離した。上清を移し、10倍体積の20mM Tris-HCl、pH 8.5に対して4℃で一晩透析し、またはこの緩衝液でダイアフィルトレーションを行い、および0.45μmメンブレンを通して濾過し、その後カラム分離への適用を行った。引き続くすべてのタンパク質分離はPharmacia AKTA Explorer 100を使用して実施し、4℃で操作した。ローディングの前に、Q Sepharose Fast Flowカラム(Pharmacia XK 50/00、500mlベッドサイズ)を、20mM Tris-HCl、pH 8.5緩衝液で平衡化した。試料を15ml/分でカラムに適用し、次いで、溶離液のOD280がベースラインに戻るまで、この緩衝液で洗浄した。タンパク質は、2Lの0〜0.3M NaCl直線勾配で、15ml/分の流速で溶出し、一方45mlの画分を収集した。比色定量的酵素アッセイによって決定され、AAD-12タンパク質の推定分子量(SDS-PAGE上で約32kDaバンド)にもまた対応するAAD-12活性を含む画分をプールした。最終0.5Mまでの固体硫酸アンモニウムを試料に添加し、次いで、20mM Tris-HCl、pH 8.0中の0.5M硫酸アンモニウム中で平衡化したPhenyl HPカラム(Pharmacia XK 50/20、250mlベッドサイズ)に適用した。このカラムは、溶離液のOD280がベースラインに戻るまで、10ml/分の結合緩衝液で洗浄し、タンパク質は、20mM Tris-HCl、pH 8.0中の0.5M〜0 硫酸アンモニウム直線勾配で、10ml/分の流速にて2カラム体積以内で溶出し、12.5mlの画分を収集した。AAD-12を含む主ピーク画分をプールし、必要な場合、MWCO 10 kDaカットオフメンブレン遠心分離用フィルター装置(Millipore)を使用して濃縮した。ある場合において、試料は、1ml/分の流速のPBS緩衝液を用いて、Superdex 75ゲル濾過カラム(Pharmacia XK 16/60、110mlベッドサイズ)にさらに適用した。純粋なAAD-12を含むピーク画分をプールし、-80℃で保存した。多くの場合において、AAD-12タンパク質の純度は、連続的なイオン交換カラムおよび疎水性相互作用カラムの2段階分離後に、99%に近づくかまたはそれ以上である。精製AAD-12の典型的な収率は12〜18mg/湿細胞gである。バルクタンパク質試料は、20mM Tris-HCl、pH 8.0、0.1M NaCl、2mM DTT、および1%トレハロース中でダイアフィルトレーションによって原液とし、長期保存のためにVirtis Freezemobileモデル25EL(Virtis, Gardiner, NY)上で凍結乾燥した。
5.1-比色定量的フェノール検出を介するアッセイ
酵素活性は、96ウェルマイクロプレート形式での配置を可能にするために、Fukumori and Hausinger (1993) (J. Biol. Chem. 268: 24311-24317) のプロトコールから改変したプロトコールを使用する、生成物フェノールの比色定量的検出によって測定した。比色定量的アッセイは、2,4-Dおよびジクロルプロップを切断して生成物2,4-ジクロロフェノールを遊離するジオキシゲナーゼの活性を測定する際の使用について記載されてきた。どのフェノール生成物が容易に検出可能であるかを確認するために以前に記載された検出方法を使用して、いくつかのフェノールからの色の産生を、2,4-ジクロロフェノールのそれと比較した。フェノールおよびフェノールアナログを、200μM NH4(FeSO4)2、200μM アスコルビン酸ナトリウムを含む、0.15mlの20mM MOPS pH 6.75中で、100μMの最終濃度で試験した。フルロキシピルおよびトリクロピルに由来するピリジノールは、有意な色を生じなかった。2,4-ジクロロフェノールの色の産生は直線状であり、〜500μMまでアッセイ中のフェノールの濃度に比例した。標準アッセイ条件下(160μl最終アッセイ量)で実行した較正曲線は、510nmにおける0.1の吸光度が17.2μMフェノールから得られたことを示した。
置換ピリジン(ベンゼン環でなく)を含む除草剤トリクロピルなどの潜在的な基質に対するAAD-12の作用は、アリールオキシアルカノエート結合の切断に際してピリジノールを遊離する。ピリジノールは、先の節において記載されたアミノアンチプリン/フェリシアン化物フェノール検出を使用して検出されなかった。しかし、生成物クロロピリジノールは、pH 7において325nmのλmaxで、近紫外で強力な吸収を示す(吸光係数〜8,400M-1.cm-1)ことが見い出された。このことを、連続的なマイクロプレートベースの吸光光度法的アッセイを作製するために使用した。アッセイは、200μM NH4FeSO4、200μM アスコルビン酸ナトリウム、1mM α-ケトグルタレート、適切な基質(DMSO中で作製された100mM保存液から加えた)、および酵素を含む、総量0.2mlの20mM MOPS pH 6.75中で実行した。アッセイを、時間=0における、アリールオキシアルカノエート基質、酵素またはα-ケトグルタレートの添加によって開始し、吸光度の増加を10分間、325nmでマイクロプレートリーダー中で追跡した。反応の最初の2分間は初速度を決定するために使用した。標準アッセイ条件下(200μl最終アッセイ量)で実行した較正曲線は、510nmにおける0.1の吸光度が11.9μMクロロピリジノールから得られたことを示した。
AAD-12の簡便なアッセイは、2-(2-クロロ,4-ニトロフェノキシ)プロピオン酸(CNPP)を基質として使用して考案した。AAD-12によるCNPPの切断は、2-クロロ,4-ニトロフェノールを遊離する。このフェノールは、pH 7で410nmにおける明るい黄色の吸収を有し、反応が連続的にまたは終点分析によって追跡されることを可能にする。AAD-12活性の存在は、さらなる試薬の添加の必要性を伴うことなく、視覚的にモニターすることが可能である。マイクロプレートベースの分光測定的アッセイは、200μM NH4FeSO4、200μM アスコルビン酸ナトリウム、1mM α-ケトグルタレート、適切な量のCNPP(DMSO中で作製された10mMストックから加えた)、および酵素を含む、総量0.2mlの20mM MOPS pH 6.75中で実行した。アッセイを、時間=0における、CNPP、酵素、またはα-ケトグルタレートの添加によって開始し、吸光度の増加を10分間、410nmでマイクロプレートリーダー中で追跡した。反応の最初の2分間は初速度を決定するために使用した。標準アッセイ条件下(200μl最終アッセイ量)で実行した較正曲線は、410nmにおける0.1の吸光度が25.1μM 2-クロロ,4-ニトロフェノールから得られたことを示した。このアッセイを使用して、基質としてのCNPPの反応速度論定数は、Km=31±5.5μMおよびkcat=16.2±0.79分-1であると決定した。
6.1-(R,S)-ジクロルプロップ、(R)-ジクロルプロップ、(S)-ジクロルプロップ、および2,4-Dに対するAAD-12(v2)活性
実施例5.1に記載されるフェノール検出アッセイを使用して、4種のフェノキシアルカノエートを、4.4μg精製AAD-12(v2)を含む反応混液中でアッセイした。(R,S)-ジクロルプロップ(R,S-DP)は1mMで試験し、(R)-ジクロルプロップ、(S)-ジクロルプロップ、および2,4-Dは0.5mMで試験した。結果を図3に示し、これは、2,4-Dおよびジクロルプロップのエナンチオマーに対するAAD-12(v2)の活性を図示する。4.4μg AAD-12(v2)を0.5mM 基質((R,S)-ジクロルプロップについては1mM)とともにインキュベートし、反応はα-ケトグルタレートの添加によって開始した。5分後、反応を消失させ、比色分析用検出試薬の添加後に510nmにおける吸収を決定した。酵素なしのバックグラウンド値を減算した。
実施例5.2に記載されるピリジノールアッセイを使用して、6.8μg精製AAD-12(v2)を含む反応混液中で、5種のピリジルオキシアルカノエートを1mMでアッセイした。各反応の速度をモニターし、表9に提示する。5種すべてのピリジルオキシアルカノエートはAAD-12(v2)によって切断され、ピリジノールを遊離した。オキシプロピオン酸基質116844および91767の速度は、対応する酢酸(それぞれトリクロピルおよび93833)の速度よりもいくぶん速く、オキシ酢酸側鎖よりもオキシプロピオン酸側鎖へのAAD-12(v2)の優先度を示す。これらのデータは、AAD-12(v2)が、トリクロピルなどのピリジルオキシアルカノエート除草剤を効率的に分解可能であることを示す。
除草剤2,4-D、(R,S)-ジクロロプロップ、およびトリクロピルについての精製AAD-12(v2)のKm値およびkcat値は、適切なアッセイ方法を使用して決定した。高濃度(>1mM)の2,4-Dおよび(R,S)-DCPでは基質阻害が起こったので、これよりも低い濃度を使用して、Grafit 4.0(Erithacus Software, UK)を使用してミカエリス-メンテン式にデータをフィットさせた。2mMまでではトリクロピルについて、基質阻害は認められなかった。反応速度論定数を表10に要約する。これらのデータから、トリクロピルのAAD-12(v2)切断の速度は、最大速度条件の下では、2,4-Dの速度の〜5%である。
*AAD-12の(S)-エナンチオマーの優先度のため、50%のラセミ混合物が基質として利用可能であることを想定して、Km値を計算した。
7.1-アラビドプシス・サリアナ生育条件
野生型アラビドプシス種子を、0.1%アガロース(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)溶液中に懸濁した。懸濁した種子を、4℃で2日間保存し、休止要件を完了し、かつ同調的な種子の発芽を確実にした(層形成)。
画線したDH5αコロニーを含み、エリスロマイシン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)(200mg/L)またはスペクチノマイシン(100mg/L)を含むLB+寒天を使用して、4mlミニプレップ培養(液体LB+エリスロマイシン)に接種するためにコロニーを提供した。この培養物を、定常的に攪拌しながら、37℃で一晩インキュベートした。製造業者の指示に従って実施するQiagen(Valencia, CA)Spin Mini Prepsを使用して、プラスミドDNAを精製した。
アラビドプシスを、フローラルディップ法を使用して形質転換した。選択したコロニーを、エリスロマイシン(200mg/L)またはスペクチノマイシン(100mg/L)およびストレプトマイシン(250mg/mL)を含むYEPブロスの1つまたは複数の15〜30mlのプレ培養物に接種するために使用した。培養物を、220rpmで定常的に攪拌しながら、28℃で一晩インキュベートした。各プレ培養を、エリスロマイシン(200mg/L)またはスペクチノマイシン(100mg/L)およびストレプトマイシン(250mg/mL)を含むYEPブロスの2つの500ml培養に接種するために使用し、培養物を、定常的に攪拌しながら、28℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を、約8700×gで10分間、室温でペレット化し、得られる上清を廃棄した。この細胞ペレットを、1/2×MurashigeおよびSkoog塩/GamborgのB5ビタミン、10% (w/v)スクロース、0.044μM ベンジルアミノプリン(DMSO中の1mg/ml保存液の10μl/リットル)および300μl/リットルSilwet L-77を含む500mlの浸透培地に穏やかに再懸濁した。約1ヶ月齢の植物を15秒間、培地に浸し、最新の花序を確実に沈める。次いで、植物を、それらの側面を下にして横たえ、24時間覆い(透明または不透明)、次いで水で洗浄し、および直立状態で配置した。植物を22℃で、16時間明期/8時間暗期の光周期で生育させた。浸漬の約4週間後、種子を収集した。
直前に収集したT1種子[AAD-1 (v3)]を、室温で7日間乾燥させた。T1種子を、26.5×51cm発芽トレイ(T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN)中に播種し、各々は、40mlの0.1%アガロース溶液に事前に懸濁された、層形成されたT1種子(〜10,000種子)の200mgアリコートを受容し、4℃で2日間保存し、休止要件を完了し、かつ同調的な種子の発芽を確実にした。
最初のアラビドプシス形質転換は、AAD-12(v1)(植物に最適化された遺伝子)を使用して行った。T1形質転換体を、最初に、グルホシネート選択スキームを使用して、形質転換していない種子のバックグラウンドから選択した。300,000個を超えるT1種子をスクリーニングし、316個のグルホシネート抵抗性植物を同定した(PAT遺伝子)。これは、PAT+Libertyが選択のために使用される、構築物の選択頻度の正常範囲にある0.10%の形質転換/選択頻度と同等であった。上記で選択したT1植物は、引き続き個々のポットに移植し、様々な割合の市販のアリールオキシアルカノエート除草剤を噴霧した。表11は、アラビドプシスT1形質転換体に2,4-D抵抗性を付与するためのAAD-12(v1)遺伝子および対照遺伝子の応答を比較する。応答は、視覚的損傷% 2WATによって提示する。データは、ほとんど損傷なしもしくは損傷なし(<20%)、中程度の損傷(20〜40%)、または深刻な損傷(>40%)を示す個体のヒストグラムとして提示する。各T1は独立した形質転換事象であるので、所定の割合の範囲内での個々のT1応答の有意な変動が予測可能である。算術平均および標準偏差を各処理について提示する。個々の応答の範囲もまた、各割合および形質転換について、最後のカラムにおいて示す。PAT/Cry1F-形質転換アラビドプシスは、オーキシン感受性形質転換対照として働いた。AAD-12(v1)遺伝子は、個々のT1アラビドプシス植物に除草剤抵抗性を付与した。所定の処理の範囲内で、植物応答のレベルは大きく変化し、これは、各植物が独立した形質転換事象を表すという事実に起因する可能性がある。重要な注目点として、試験した各2,4-Dの割合において、影響を受けなかった個体が存在し、一方、あるものは深刻に影響を受けた。割合による全体的な集団の損傷平均は、単にAAD-12(v1)で形質転換した植物対野生型またはPAT/Cry1F-形質転換対照の間の有意な違いを実証するために、表11み提示する。損傷レベルはより大きい傾向があり、損傷していない植物の頻度は、3,200g ae/ha(または6×圃場割合)まで上昇した割合でより低かった。これらの高い割合においてもまた、噴霧溶液は、緩衝されない限り、高度に酸性になる。生育チャンバー中で大部分生育されたアラビドプシスは、非常に薄いクチクラを有し、深刻な枯れ効果が、これらの上昇した割合において試験を複雑化する可能性がある。それにも関わらず、多くの個体は、3,200g ae/haの2,4-Dで生き残り、ほとんど損傷がないか、全く損傷がなかった。
選択剤として2,4-Dを使用して、選択マーカーとしてのAAD-12(v1)を使用する能力を、上記のように形質転換されたアラビドプシスを用いて最初に分析した。約50個のT4世代アラビドプシス種子(AAD-12(v1)についてホモ接合性)を、約5,000個の野生型(感受性)種子に加えた(spiked)。いくつかの処理を比較した。植物の各トレイは、以下の処理スキーム:7 DAP、11 DAP、または7および続く11 DAPの1つで、1回または2回のいずれかの2,4-Dの適用のタイミングを受けた。すべての個体は、同じ形質転換ベクター中にPAT遺伝子もまた含んだので、2,4-Dを用いて選択したAAD-12は、グルホシネートを用いて選択したPATと直接的に比較することができた。
種々のT1事象は、T2種子を産生するために自家受粉した。これらの種子は、100個のランダムなT2同胞に2,4-D(200g ae/ha)を適用することによって、子孫を試験した。各個々のT2植物を、噴霧適用(187L/ha適用割合のトラック噴霧器)の前に、7.5cm四方のポットに移植した。T1ファミリー(T2植物)の75%が、χ二乗検定によって決定されるように(P>0.05)、メンデル遺伝に伴う優性遺伝する単一遺伝子座についての予測された3抵抗性:1感受性モデルに分離した。
トランスジェニックアラビドプシスにおいて他のアリールオキシアルカノエートオーキシン除草剤に対する抵抗性を提供するAAD-12(v1)の能力を、種々の基質の葉適用によって決定した。T2世代アラビドプシス種子を層形成し、アラビドプシスの選択トレイ(実施例6.4)と全く同様に選択トレイに播種した。PATおよび昆虫抵抗性遺伝子Cry1Fを含む形質転換した対照系統を、同様の様式で植えた。苗を、温室内の個別の3インチポットに移した。すべての植物に、187L/haに設定したトラック噴霧器を使用して噴霧した。これらの植物に、一定の範囲のピリジルオキシ酢酸除草剤:280〜2240g ae/ha トリクロピル(Garlon 3A, Dow AgroSciences)および280〜2240g ae/ha フルロキシピル(Starane, Dow AgroSciences);およびAAD-12活性から生じる2,4-D代謝物、2,4-ジクロロフェノール(DCP、Sigma)(2,4-Dの280〜2240g ae/haに等価なモル濃度、工業グレードDCPを使用した)を噴霧した。すべての適用は水中で製剤化した。各処理は3〜4回反復した。植物は、処理の3日後および14日後に評価した。
*本実験における植物は、発育不良かつ深刻に上偏生長性であったが、緑色のままででありかつ>75%の損傷評価を受けなかった。
PAT遺伝子コピー数分析のためのインベーダーアッセイ(Third Wave Agbioキット手順の方法)を、Qiagen DNeasyキットから入手した全DNAを用いて、複数のAAD-12(v1)ホモ接合性系統に対して実施して、PATおよびAAD-12(v1)を含む植物形質転換単位の安定な組み込みを決定した。分析は、これらの遺伝子の直接的な物理的連鎖を前提とした。これらが同じプラスミド上に含まれたからである。
推定のグリホセート抵抗性形質をコードするpDAB3759プラスミド(AAD-12(v1)+EPSPS)を含むT1アラビドプシス種子を、以前に記載したように産生した。実施例7.6に記載したように、T1形質転換体を、選択マーカーとしてAAD-12(v1)を使用して選択した。T1植物(個別の形質転換した事象)を、以前に記載したように、最初の選択試行から回収し、温室内の3インチポットに移した。3つの異なる対照アラビドプシス系統:野生型Columbia-0、AAD-12 (v1) + PAT T4 ホモ接合性系統(pDAB724-形質転換)、およびPAT + Cry1Fホモ接合性系統(形質転換対照)もまた試験した。pDAB3759およびpDAB724形質転換植物を、2,4-D耐性のために苗の段階であらかじめ選択した。移植の4日後、水中の0、26.25、105、420、または1680g ae/haグリホセート(Glyphomax Plus, Dow AgroSciences)を用いる、以前に記載したようなトラック噴霧器による葉処理のために、植物を均等に分けた。すべての処理を、5〜20回複製した。植物を、処理の7日後または14日後に評価した。
AAD-12(v1)(pDAB724)およびAAD-1(v3)(pDAB721)植物は、逆交雑し、F1種子を収集した。8個のF1種子を植え、種子を産生するために生育させた。組織試料を8個のF1植物から採取し、ウエスタン分析に供して、両方の遺伝子の存在を確認した。試験した8個すべての植物がAAD-1とAAD-12の両方のタンパク質を発現したことが結論付けられた。種子は一緒にし、播種の前1週間、乾燥させた。
8.1-AAD-12(v1)のクローニング
AAD-12(v1)遺伝子は、NcoI/SacIフラグメントとして中間体ベクターpDAB3283から切断した。これを、ZmUbi1単子葉プロモーターを含む同様に切断したpDAB3403ベクターに直接的にライゲーションした。2つのフラグメントを、T4 DNAリガーゼを使用して一緒にライゲーションし、DH5α細胞に形質転換した。ミニプレップを、QiagenのQIA Spinミニプレップキットを使用して、得られるコロニー上で実施し、これらのコロニーを消化して、方向について確認した。この最初の中間体構築物(pDAB4100)は、ZmUbi1:AAD-12(v1)カセットを含む。この構築物を、Not1およびPvu1で消化して遺伝子カセットを遊離させ、望ましくないバックボーンを消化した。これを、イネアクチンプロモーターOsAct1によって駆動されるAHAS選択マーカーを含む、NotI切断したpDAB2212にライゲーションした。最終構築物は、pDAB4101またはpDAS1863と名付け、ZmUbi/AAD-12(v1)/ZmPer5::OsAct1/AHAS/LZmLipを含む。
カルス培養の開始のために未成熟胚を得るために、温室で生長したHi-II親AおよびBの間のF1交雑を実施した(Armstrong et al. 1991)。胚が1.0〜1.2mmのサイズになった場合(受粉後約9〜10日)、穂を収集し、表面を、Liqui-Nox(商標)で磨いて洗浄することによって表面殺菌し、70%エタノールに2〜3分間浸漬し、次いで20%の市販の漂白剤(0.1%次亜塩素酸ナトリウム)に30分間浸漬した。
継代培養の2日後、4ml PCVの懸濁細胞および4mlの馴化培地を8mlの凍結防止剤(ココナッツ水を含まないH9CP+培地に、1Mグリセロール、1M DMSO、2Mスクロースを溶解、フィルター滅菌する)に加え、125mlフラスコ中、125rpmで、4℃、1時間振盪させた。1時間後、4.5mlを冷やした5.0mlのCorning凍結バイアルに加えた。一旦充填されると、個々のバイアルを、制御速度フリーザー中にて4℃で15分間保持し、次いで、-40℃の最終温度に達するまで、-0.5℃/分の速度で凍結させた。最終温度に到達した後、バイアルを、液体窒素蒸気で満たしたCryoplus 4貯蔵ユニット(Forma Scientific)の内側のラック中の箱に移した。
8.4-安定的な形質転換
形質転換の約24時間前に、12ml PCVの以前に凍結した胚形成トウモロコシ懸濁細胞プラス28mlの馴化培地を、500 mlのErlenmeyerフラスコ中の80mlのGN6液体培地(Gelriteを欠くGN6培地)に継代培養し、125rpm、28℃のシェーカー上に配置した。全体で36ml PCVが3つのフラスコに分布するように、同じ細胞系統を使用して、これを2回反復した。24時間後、GN6液体培地を取り出し、細胞に原形質分離を起こさせるために、フラスコあたり72ml GN6 S/M振盪培地(N6培地、2.0 mg/L 2,4-D、30g/L スクロース、45.5g/L ソルビトール、45.5 g/L マンニトール、100mg/L ミオ-イノシトール、pH 6.0)で置き換えた。フラスコを、暗所で125RPMで振動するシェーカー上に28℃で30〜35分間配置し、この時間の間、適切な量8.1mlのGN6 S/M液体培地を、〜405mgのあらかじめオートクレーブした無菌シリコンカーバイドウィスカー(Advanced Composite Materials, Inc.)に加えることによって、シリコンカーバイドウィスカーの50mg/ml懸濁液を調製した。
推定の形質転換事象は、形質転換の約9週間後に、60×20mmプレート中の同じ濃度の新鮮な選択培地に移すことによって、Pursuit(登録商標)を含有する包埋プレートを単離した。持続性の増殖が約2〜3週間後に明白であれば、その事象は抵抗性であると見なされ、分子分析に提出した。
8.5.1-組織の収集、DNAの単離および定量
新鮮な組織をチューブに配置し、4℃で2日間凍結乾燥する。組織を完全に乾燥させた後、タングステンビーズ(Valenite)をチューブ中に配置し、試料を、1分間、Kelcoビーズミルを使用する乾式粉砕に供する。次いで、標準的なDNeasy DNA単離手法に従う(Qiagen, DNeasy 69109)。次いで、抽出したDNAのアリコートをPico Green(Molecular Probes P7589)で染色し、濃度をng/μlで得るために既知の標準を用いてフルオロメーター(BioTek)で読み取る。
DNA試料を20ng/μlに希釈し、次いで95℃で10分間、サーモサイクラー中のインキュベーションによって変性させる。次いで、Signal Probeミックスを、提供されるオリゴミックスおよびMgCl2を使用して調製する(Third Wave Technologies)。7.5μlのアリコートをインベーダーアッセイプレートの各ウェルに配置し、続いて対照、標準、および20ng/μlに希釈した未知の試料の7.5μlのアリコートを配置する。各ウェルに15μlのミネラルオイル(Sigma)を重層する。次いで、プレートを、63℃で1時間インキュベートし、フルオロメーター(Biotek)上で読み取る。バックグラウンド内部対照プローブよりも上のシグナル%で除算した、標的プローブについてのバックグラウンドよりも上のシグナル%の計算は、比率を計算する。サザンブロット分析を用いて開発されかつ確証された既知のコピー標準の比率を使用して、未知の事象の見積もったコピーを同定する。
全体で100ngの全DNAを鋳型として使用する。20mMの各プライマーを、Takara Ex Taq PCR Polymeraseキット(Mirus TAKRR001A)とともに使用する。AAD-12(v1)PTUのためのプライマーは、フォワード-
およびリバース-
である。PCR反応を、9700 Geneampサーモサイクラー(Applied Biosystems)において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、63℃で30秒間、および72℃で1分間と45秒間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行する。
および、リバース-
である。PCR反応を、9700 Geneampサーモサイクラー(Applied Biosystems)において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、65℃で30秒間、および72℃で1分間と45秒間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行する。PCR産物を、EtBrで染色した1%アガロースゲル上での電気泳動によって分析する。
サザンブロット分析を、Qiagen DNeasyキットから得たゲノムDNAを用いて実施する。全体で2μgの葉ゲノムDNA、または10μgのカルスゲノムDNAを、BSM IおよびSWA I制限酵素を使用する一晩消化に供し、PTUデータを得る。
4つのT0事象を温室内で馴化させ、2〜4枚の新たな正常な外見の葉が輪生から現れるまで生育させた(すなわち、植物は、組織培養から温室生育条件に移行した)。植物を、温室内で、16時間明期:8時間暗期条件で27℃で生育させた。次いで、植物を、Pursuit(登録商標)(イマゼタピル)または2,4-D Amine 4のいずれかの市販の製剤で処理した。Pursuit(登録商標)は、試験した事象の中に存在する選択マーカー遺伝子の機能を実証するために噴霧した。除草剤適用は、トラック噴霧器を用いて、187L/haの噴霧量、50cm噴霧高さで行った。植物に、致死用量のイマゼタピル(70g ae/ha)、または非形質転換トウモロコシ系統に有意な損傷を与えることが可能である割合の2,4-D DMA塩(2240g ae/ha)のいずれかを噴霧した。致死用量は、Hi-II近交系に対する>95%損傷を引き起こす割合として定義される。Hi-IIは、本発明の形質転換体の遺伝的バックグラウンドである。
T1 AAD-12(v1)種子は、Metro Mix培地を含む3インチポットに植え、2葉段階で、ヌルを除去するために70g ae/haイマゼタピルを噴霧した。生存している植物を、Metro Mix培地を含む1ガロンポットに移植し、前と同じ生育条件に配置した。V3-V4段階において、植物に、560または2240g ae/ha 2,4-D DMAのいずれかで、187L/haに設定したトラック噴霧器で噴霧した。植物は、3および14 DATで等級付けし、5XH751×Hi H対照植物と比較した。0〜10の等級スケール(極度のオーキシン損傷までの損傷なし)は、支柱根損傷を区別するために開発した。支柱根損傷の等級は14DATに取り、2,4-D耐性を示した。2,4-Dは支柱根の奇形を引き起こし、トウモロコシでのオーキシン除草剤損傷の一貫した指標である。支柱根データは(以下の表に見られるように)、試験した3つの事象の中の2つが、2240g ae/ha 2,4-D DMAに対して強固に耐性であったことを実証する。事象「pDAB4101(0)001.001」は見かけ上不安定であった;しかし、他の2つの事象は2,4-Dおよび2,4-D+イマゼタピル、または2,-4D+グリホセートに対して強固に耐性であった(表16を参照されたい)。
子孫試験もまた、5XH751と交配させた7つのAAD-12(v1)T1ファミリーに対して実施した。種子は、上記のように3インチポットに植えた。3葉段階において、すべての植物に、以前に記載したようにトラック噴霧器で70g ae/haイマゼタピルを噴霧した。14 DAT後、抵抗性植物および感受性植物を計数した。χ二乗検定によって決定されるように、試験した6つの系統のうちの4つが、単一の遺伝子座である優性メンデル形質(1R:1S)として分離した。生存している植物に、引き続いて2,4-Dを噴霧し、すべての植物は2,4-Dに対して耐性であると見なした(割合≧560g ae/ha)。AAD-12は、市販の雑種に逆交配した場合に、複数の種において強固なアリールオキシアルカノエートオーキシン抵抗性遺伝子として遺伝性である。
AAD-12(v1)(pDAB4101)および優良Roundup Ready同系繁殖体(BE1146RR)を逆交配し、F1種子を収集した。2つのF1系統からの種子を植え、ヌルを除去するためにV2段階で70g ae/ha イマゼタピルで処理した。生存している植物に対して、代表を分離し、1120g ae/ha 2,4-D DMA+70g ae/haイマゼタピル(AHAS遺伝子の存在を確認するため)または1120g ae/ha 2,4-D DMA+1680g ae/haグリホセート(Roundup Ready遺伝子の存在を確認するため)のいずれかで、187L/haに較正したトラック噴霧器中で処理した。植物を3 DATおよび16 DATに等級付けした。噴霧データは、AAD-12(v1)が、トウモロコシに安全に適用される可能性がある除草剤の増加した範囲を提供するために、グリホセート耐性遺伝子(例えば、Roundup CP4-EPSPS遺伝子)または他の除草剤耐性遺伝子と、簡便に重ね合わせ可能であることを示した。同様に、イミダゾリノン+2,4-D+グリホセート耐性をF1植物において観察し、この耐性は、これらの複数の導入遺伝子の分子的または育種的な重ね合わせの組み合わせによって負の表現型を示さなかった。
圃場レベル耐性試験は、2つのAAD-12(v1)pDAB4101事象(4101(0)003.R.003.AFおよび4101(0)005.ROOl.AF)および1つのRoundup Ready(RR)対照雑種(2P782)に対して、インディアナ州ファウラー(Fowler, Indiana)およびミシシッピー州ウェイサイド(Wayside, Mississippi)において実施した。種子は、トウモロコシ種まき機を用いて、ウェイサイドでは40インチの作条間隔で、およびファウラーでは30インチ間隔で植えた。実験設計は、3つの複製を用いるランダム化された完全なブロック設計であった。除草剤処理は、1120、2240、および4480g ae/haの2,4-D(ジメチルアミン塩)、840g ae/haのトリクロピル、280g ae/haのフルロキシピル、ならびに未処理対照であった。AAD-12(v1)事象は、選択マーカーとしてAHAS遺伝子を含んだ。F2トウモロコシ事象は分離であったので、AAD-12(v1)植物は、ヌル植物を除去するために70g ae/haのイマゼタピルで処理した。除草剤処理は、トウモロコシがV6段階に到達したときに、130〜200kpa圧力で187L/haキャリア体積を送達する圧縮空気バックパック噴霧器を使用して適用した。視覚的損傷評価は、処理の7日後、14日後、および21日後に取った。支柱根損傷評価は、0〜1:わずかに支柱根融合である、1〜3:中程度の支柱根の膨張/遊走および根の増殖である、3〜5:中程度の支柱根融合である、5〜9:深刻な支柱根融合および奇形である、ならびに10:支柱根の全体的な阻害である、の0〜10のスケールで、28DATにおいて取った。
9.1-植物葉からのAAD-12(v1)の抽出
約50〜100mgの葉組織を小片(または単一の穴をあけた4枚の葉ディスク)に切断し、2つのステンレス鋼BBビース(4.5 mm; Daisy Co., カタログ番号145462-000)を含む2mlクラスターチューブに入れた。500μLの植物抽出緩衝液(0.05 % Tween 20および1% ウシ血清アルブミンを含むPBS)を各試料に加えた。チューブにふたをして、Geno/Grinder(モデル2000-115、Certiprep, Metuchen, NJ)に固定し、1×500rpmの設定を用いて6分間振盪した。チューブを5000×gで10分間遠心分離し、可溶性タンパク質を含む上清を、ウエスタンブロットおよびELISAを使用して、AAD-12(v1)について分析した。
他に言及しない限り、アッセイ法を室温で行った。100μLの精製抗AAD-12抗体(0.5μg/mL)を、96ウェルマイクロタイタープレートウェル上にコートし、4℃で16時間インキュベートした。このプレートを、洗浄緩衝液(0.05% Tween 20を含む100mM リン酸緩衝化生理食塩水 (PBS; pH 7.4))を用いて、プレートウォッシャーを使用して4回洗浄し、続いてPBS中に溶解した4%スキムミルクを用いて1時間ブロッキングした。洗浄後、100μLの既知の濃度のAAD-12標準または異なる試料由来の植物抽出物を、ウェル中でインキュベートした。標準曲線のために、精製AAD-12を3回通り52〜0.813ng/mLの範囲で連続的に2倍希釈した。植物抽出物を、PBS中で5倍、10倍、20倍、および40倍希釈し、2回通り分析した。1時間のインキュベーション後、プレートを上記のように洗浄した。100μLの抗AAD-12抗体-HRP結合体(0.5μg/mL)を、各ウェル中で1時間インキュベートし、その後洗浄した。100μLのHRP基質、1-Step(商標)Ultra TMB-ELISA(Pierce, Rockford, IL)を、10分間各ウェル中でインキュベートし、その後反応を、100μL 0.4N H2SO4を添加することによって停止した。各ウェルのODを、マイクロプレートリーダーを使用して、450nmで測定した。植物抽出物中のAAD-12(v1)の濃度を決定するために、2通りOD値を平均し、Softmax(商標)Pro ver. 4.0(Molecular Devices)を使用して標準曲線から外挿した。
植物抽出物またはAAD-12標準(5および0.5μg/mL)を、Laemmli試料緩衝液とともに95℃で10分間インキュベートし、8〜16% Tris-グリシンプレキャストゲル中で電気泳動的に分離した。次いで、タンパク質を、標準的なプロトコールを使用して、ニトロセルロースメンブレンに電気泳動的に転写した。PBS中の4%スキムミルク中でのブロッキング後、AAD-12(v1)タンパク質を、抗AAD-12抗血清、続いてヤギ抗ウサギ/HRP結合体によって検出した。検出したタンパク質を、化学発光異質ECLウエスタン分析試薬(Amersham, NJ)によって可視化した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いるタバコの形質転換を、公開されている方法(Horsch et al., 1988)と類似しているが同一ではない方法によって実行した。形質転換のための供給源組織を提供するために、タバコ種子(ニコチアナ タバカム(Nicotiana tabacum) cv. KY160)を表面殺菌し、寒天で固化したホルモンフリーのMurashigeとSkoogの培地(Murashige and Skoog, 1962)である、TOB培地の表面に植えた。植物を6〜8週間、光照射インキュベータールームで、28〜30℃で生育させ、形質転換プロトコールにおける使用のために、葉を無菌的に収集した。約1平方cmの小片をこれらの葉から無菌的に切断し、中肋を除去した。250rpm、28℃に設定したシェーカー上のフラスコ中で一晩増殖させたアグロバクテリウム株(pDAB3278、別名pDAS1580、AAD-12 (v1)+PATを含むEHA101S)の培養物を、遠心分離でペレット化し、滅菌したMurashigeとSkoogの塩溶液中で再懸濁し、および600nmにおいて0.5の最終光学密度まで調整した。葉の小片をこの細菌懸濁物中に約30秒間浸漬し、次いで、滅菌ペーパータオル上で吸い取って乾燥させ、およびTOB+培地(1mg/L インドール酢酸および2.5mg/L ベンジルアデニンを含むbenzyladenineMurashigeとSkoogの培地)上に表面を上にして配置し、暗所にて28℃でインキュベートした。2日後、葉の小片を、250mg/Lセフォタキシム(Agri-Bio, North Miami, Florida)および5mg/Lグルホシネートアンモニウム(Basta, Bayer Crop Sciences中の活性成分)を含むTOB+培地に移動し、明所で28〜30℃でインキュベートした。葉の小片を、最初の2週間は1週間に2回、その後は1週間に1回、セフォタキシムおよびBastaを含む新鮮なTOB+培地に移動した。葉の小片を細菌で処理した4〜6週間後、形質転換した点から生じる小植物をこの組織調製物から取り出し、Phytatray(商標)IIベッセル(Sigma)中の250mg/L セフォタキシムおよび10mg/L Basta inを含むTOB培地に植えた。これらの小植物を、光照射インキュベータールーム生育させた。3週間後、茎の切除を取り、同じ培地で再発根させた。植物は、次の2〜3週間後に温室に送ることができる状態にあった。
および
であった。PCR反応は、9700 Geneampサーモサイクラー(Applied Biosystems)において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、64℃で30秒間、および72℃で1分間と45秒間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行した。PCR産物は、EtBrで染色した1%アガロースゲル上での電気泳動によって分析した。PAT遺伝子の1〜3個コピー(およびおそらく、AAD-12(v1)、なぜなら、これらの遺伝子は物理的に連鎖しているから)を有する18個のPCR陽性事象の各々からの4〜12個のクローン系統を再生し、温室に移した。
19個の事象の各々からのT0植物を、3〜4インチの高さであった植物に噴霧した広い範囲の2,4-D、トリクロピル、またはフルロキシピルで攻撃した。噴霧適用は、以前に記載されたように、トラック噴霧器を使用し、187L/haの噴霧量で行った。2,4-Dジメチルアミン塩(Riverside Corp)を、脱イオン水中で混合した0、140、560、または2240g ae/haで、各事象からの典型的なクローンに適用した。フルロキシピルは、同様に、35、140、または560g ae/haで適用した。トリクロピルは、70、280、または1120g ae/haで適用した。各処理は、1〜3回反復した。損傷の割合は3および14DATで記録した。試験したすべての事象は、2,4-Dに対して、非形質転換対照系統KY160よりも耐性であった。いくつかの事象において、ある初期オーキシン性除草剤関連上偏生長は、560g ae/ha以下の2,4-Dの用量で起こった。ある事象は、2240g ae/ha(4×圃場割合に等しい)で適用された2,4-Dで損傷されなかった。全体的に見ると、AAD-12(v1)は、フルロキシピルに対してより感受性であり、次にトリクロピルに感受性であり、および2,4-Dによる影響が最も少なかった。抵抗性の規模に関する事象の品質は、560g ae/ha フルロキシピルに対するT0植物応答を使用して識別した。事象は、「低い」(>40%損傷 14DAT)、「中程度」(20〜40%損傷)、「高い」(<20%損傷)に分類した。ある事象は、複製の間の応答において一貫しておらず、「変動性」と見なした。
@事象の除草剤耐性の性能の区別は、耐性が事象にわたって変動性である場合に、560g ae/haフルロキシピルで処理したときに、相対的な耐性の評価を必要とした。
高い割合の2,4-Dおよびフルロキシピルで生存している2〜4個のT0個体は、各事象から確保し、T1種子を生じるために温室の中で自家受精させた。T1種子を層形成し、アラビドプシスの選択トレイ(実施例7.4)と全く同様に選択トレイにまき、続いて、560g ai/haグルホシネートを有する、この分離集団における非形質転換ヌルの選択的除去を行った(PAT遺伝子選択)。生存個体は、温室中で個別の3インチポットに移した。これらの系統は、T0世代において2,4-Dに対する高いレベルの抵抗性を提供した。応答の一貫性の改善は、組織培養から直接的に得られたものではないT1植物において予期された。これらの植物は、野生型KY160タバコに対して比較した。すべての植物に、187L/haに設定したトラック噴霧器で噴霧した。これらの植物に、140〜2240g ae/ha 2,4-Dジメチルアミン塩(DMA)、70〜1120g ae/ha トリクロピル、または35〜560g ae/haフルロキシピルの範囲から噴霧した。すべての適用は、水中で製剤化した。各処理は2〜4回反復した。植物は、処理の3日後または14日後に評価した。植物は、成長阻害、萎黄病、および壊死に関して、損傷割合を割り当てた。T1世代は分離であるので、接合生殖性の違いに起因して、何らかの変動性の応答が予測される。
100個の植物子孫試験もまた、AAD-12(v1)系統の7個のT1系統に対して実施した。ヌル植物をLiberty選択によって取り除かなかった以外は、種子は、上記の手法に従って、種子を層形成し、まき、および移植した。次いで、すべての植物に、以前に記載したように、560g ae/ha 2,4-D DMAを噴霧した。14 DAT後、抵抗性植物および感受性植物を計数した。χ二乗検定によって決定されるように、試験した7つの系統のうちの5つが、単一遺伝子座の優性メンデル形質(3R:1S)として分離した。AAD-12は、複数の種において、強固なアリールオキシアルカノエートオーキシン抵抗性遺伝子として遺伝性である。
圃場レベル耐性試験は、3つのAAD-12(v1)系統(事象pDAS1580-[1]-018.001、pDAS1580-[1]-004.001、およびpDAS1580-[1]-020.016)および1つの野生型系統(KY160)に対して、インディアナ州およびミシシッピー州の圃場農場で実施した。タバコ移植は、上記に示した生育条件に従い、Metro 360培地を含む72ウェル移植フラット(Hummert International)の中にT1種子を植えることによって、温室内で生育させた。ヌル植物は、以前に記載したように、Liberty選択によって選択的に除外した。移植植物は圃場農場に移し、産業用植物プランターを使用して、14インチまたは24インチのいずれかで離して植えた。ミシシッピーの現場において滴下注水、およびインディアナの現場においてはオーバーヘッド注水を使用して、植物を元気に保った。
温室内での2,4-D DMAの割合の上昇に対するAAD-12(v1)保護を示す結果は表23に示す。T1 AAD-12(v1)植物は、以前に記載したのと同じプロトコールを使用して、560g ai/ha Libertyで選択したときに、1つの事象である分離3R:1Sからであった。T1 AAD-1(v3)種子もまた、形質転換タバコ対照のために植えた(PCT/US2005/014737を参照されたい)。非形質転換KY160は感受性対照として働いた。植物に、140、560、2240、8960、および35840g ae/ha 2,4-D DMAで187 L/haに設定したトラック噴霧器を使用して噴霧し、3および14 DATで評価した。
ホモ接合性AAD-12(v1)(pDAS1580)植物およびAAD-1(v3)(pDAB721)植物(後者についてはPCT/US2005/014737を参照されたい)の両方を逆交配し、F1種子を収集した。各遺伝子の2つの逆交配からのF1種子を層形成し、処理した各交配の4つの複製を、以下の処理の1つを用いる他の試験のために使用されるのと同じ噴霧レジメン下で処理した:70、140、280g ae/haフルロキシピル(AAD-12(vl)遺伝子に選択的);280、560、112Og ae/ha R-ジクロロプロップ(AAD-1(v3)遺伝子に選択的);または560、1120、2240g ae/ha 2,4-D DMA(2,4-D耐性を確認するため)。各遺伝子のホモ接合性T2植物もまた、対照としての使用のために植えた。植物は3および14 DATで等級付けした。噴霧結果を表24に示す。
遺伝子移入技術を介するダイズの改善は、除草剤耐性(Padgette et al., 1995)、アミノ酸改変(Falco et al., 1995)、および昆虫抵抗性(Parrott et al., 1994)などの形質について達成されてきた。作物種への外来性形質の導入は、単純な挿入を含む選択マーカーを使用する、トランスジェニック系統の日常的な産生を可能にする方法を必要とする。導入遺伝子は、育種を単純化するために単一の機能的遺伝子座として遺伝されるべきである。接合胚軸または体細胞胚形成培養(Finer and McMullen, 1991)の微粒子銃ボンバードメント(McCabe et al., 1988)、および子葉移植片(Hinchee et al., 1988)または接合胚(Chee et al., 1989)のアグロバクテリウム媒介形質転換による、培養されたダイズへの外来性遺伝子の送達が報告されてきた。
AAD-12(v1)コード配列は、異なる植物プロモーターを含む5つの異なるGatewayドナーベクターにクローニングした。得られたAAD-12(v1)植物発現カセットは、LR Clonase反応(Invitrogen Corporation, Carlsbad Ca、カタログ番号11791-019)を介して、Gateway Destinationバイナリーベクターに引き続いてクローニングした。
ダイズ形質転換の最初の報告は、ダイズ子葉節領域における成長点細胞(Hinchee et al., 1988)および頂端分裂組からのシュート増殖(McCabe et al., 1988)を標的とした。A.チュメファシエンスを用いる子葉節方法において、移植片調製および培地組成は、節における補助成長点の増殖を刺激する(Hinchee et al., 1988)。真に脱分化されたが、全能性であるカルス培養がこれらの処理によって開始されるか否かは依然として不明である。単一の移植片からの形質転換事象の複数のクローンの回収、およびまれなキメラ植物の回収(Clemente et al., 2000; Olhoft et al., 2003)は、単一細胞起源、その後のトランスジェニック成長点培養、またはさらなるシュート増殖を受ける均一に形質転換されたシュートのいずれかを産生するためのトランスジェニック細胞の増殖を示す。もともとは微粒子銃ボンバードメント(McCabe et al., 1988)に基づき、より最近では、アグロバクテリウム媒介形質転換のために適合された(Martinell et al., 2002)ダイズシュート増殖法は、明らかに、子葉節法と同じレベルまたは型の脱分化を受けない。なぜなら、この系は、生殖系列キメラの首尾よい同定に基づくからである。アグロバクテリウムに基づく子葉節法を介して形質転換された遺伝子型の範囲は、着実に増えている(Olhoft and Somers, 2001)。このデノボでの成長点およびシュートの増殖は、特定の遺伝子型に限られることが少ない。また、これは、2,4-D選択系のために理想的である、非2,4-Dを用いるプロトコールである。従って、子葉節法は、2,4-D抵抗性ダイズ品種を発生するための選り抜きの方法であり得る。この方法は、1988年という早い時期に記載されたが(Hinchee et al., 1988)、いくつかのダイズ遺伝子型の日常的な高頻度形質転換のために最適化されたのはほんのごく最近のことである(Zhang et al. , 1999; Zeng et al., 2004)。
種子に誘導された「マーベリック(Marverick)」の移植物およびアグロバクテリウム媒介性の子葉節(cot-node)形質転換プロトコールを使用してAAD-12(v1)トランスジェニック植物を産生した。
5種の各々のバイナリーpDABベクター(表8)を有するアグロバクテリウム株EHA101(Hood et al. 1986)を使用して形質転換を開始した。各バイナリーベクターは、T-DNA領域にAAD-12(v1)遺伝子および植物選択遺伝子(PAT)カセットを含む。各遺伝子は表8に列挙されたプロモーターによって駆動され、これらのプラスミドはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムのEHA101株に動員された。次いで、選択したコロニーは、ダイズ移植物のアグロバクテリウム処理の前に遺伝子の組み込みについて分析した。マーベリック種子はすべての形質転換実験において使用し、種子はUniversity of Missouri, Columbia, MOから得た。
結果を観察して推定の形質転換体をスクリーニングするために、これらの植物体の選択した葉の末端の小葉を、1週間の間隔で2回、50mg/Lのグルホシネートを葉に塗布した。次いで、スクリーニングした植物体を温室に移し、馴化後、再度グルホシネートで染色し、温室内でのこれらの植物体の耐性状態を確認し、推定の形質転換であると見なした。
11.2.4.1-組織から収集したDNAの単離および定量
新鮮な組織をチューブ中に配置し、4℃で2日間凍結乾燥した。組織を完全に乾燥させた後、タングステンビーズ(Valenite)をチューブ中に配置し、試料を、Kelcoビーズミルを使用する1分間の乾式粉砕に供する。次いで、標準的なDNeasy DNA単離手法に従った(Qiagen, DNeasy 69109)。次いで、抽出したDNAのアリコートを、Pico Green(Molecular Probes P7589)で染色し、既知の標準とともにフルオロメーター(BioTek)で読み取り、濃度をng/μLで得た。
全体で100ngの全DNAを鋳型として使用する。20mMの各プライマーを、Takara Ex Taq PCR Polymeraseキット(Mirus TAKRR001A)とともに使用した。AAD-12(v1)PTUのためのプライマーは、
および
である。PCR反応を、9700 Geneampサーモサイクラー(Applied Biosystems)において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、63℃で30秒間、および72℃で1分間と45秒間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行する。AAD-12(v1)コード領域PCRのためのプライマーは、
および
である。PCR反応を、9700 Geneampサーモサイクラー(Applied Biosystems)において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、65℃で30秒間、および72℃で1分間と45秒間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行した。PCR産物を、EtBrで染色した1%アガロースゲル上での電気泳動によって分析した。
サザンブロット分析を、Qiagen DNeasyキットから得た全DNAを用いて実施する。全体で10μgのゲノムDNAを一晩消化に供し、統合データを得る。一晩消化の後、〜100ngのアリコートを1%ゲル上で泳動し、完全な消化を保証した。この保証後、試料を、大きな0.85%アガロースゲル上で、一晩40ボルトで泳動する。次いで、このゲルを、0.2M NaOH、0.6M NaCl中で30分間変性させる。次いで、このゲルを、pH 7.5の0.5M Tris HCl、1.5M NaCl中で30分間中和した。次いで、20×SSCを含むゲル装置を、ゲルからナイロンメンブレン(Millipore INYC00010)への重力による転写を得るために一晩設定する。一晩の転写後、次いで、このメンブレンを、1200 X100マイクロジュールで、クロスリンカー(Stratagene UV stratalinker 1800)によりUV光に供する。次いで、このメンブレンを、0.1% SDS、0.1 SSC中で45分間洗浄する。45分間の洗浄後、このメンブレンを80℃で3時間焼き、次いでハイブリダイゼーションまで4℃に保存する。ハイブリダイゼーション鋳型フラグメントは、プラスミドDNAを使用する上記のコード領域PCRを使用して調製する。産物を1%アガロースゲル上で泳動し、切除し、および次いで、Qiagen(28706)ゲル抽出手法を使用してゲル抽出する。次いで、このメンブレンを、Perfect Hyb緩衝液(Sigma H7033)中で1時間、60℃段階のプレハイブリダイゼーションに供する。Prime it RmT dCTP-labeling rxn(Stratagene 300392)手法を使用して、p32に基づくプローブを開発する(Perkin Elmer)。このプローブを、Probe Quant. G50 カラム(Amersham27-5335-01)を使用して精製する。200万カウントCPMを使用して、サザンブロットを一晩ハイブリダイズさせる。一晩のハイブリダイゼーションの後、次いで、このブロットを、0.1% SDS、0.1 SSC中で65℃における2回の20分間の洗浄に供する。次いで、このブロットを、-80℃でインキュベートしてフィルムに一晩露光させる。
11.2.5.1-組織サンプリングおよびダイズ葉からのAAD-12(v1)タンパク質の抽出
約50〜100mgの葉組織を、葉に2,4-Dを塗布したが、1DAT後であったN-2葉からサンプリングした。末端N-2小葉を取り出し、小さな小葉または単一の穴をあけた2枚の葉ディスク(直径〜0.5cm)のいずれかに切断し、すぐにドライアイス上で凍結した。さらなるタンパク質分析(ELISAおよびウエスタン分析)は、実施例9に記載される方法に従って完了した。
T0植物は、自花受精させてT1系統群を誘導する。子孫試験(分離分析)は、V1〜V2生長段階で適用した選択剤として560g ai/haでグルホシネートを使用してアッセイする。生き残っている植物は、V2〜V6の1つまたは複数の生長段階において2,4-D耐性についてさらにアッセイする。種子は、自家受精を通して産生し、トランスジェニックダイズ上でのより広い除草剤試験を可能にする。
胚形成ダイズカルス組織の培養および引き続くビームは、米国特許第6,809,232号(Held et al.)において記載されるように実施することができ、表8における1つまたは複数の構築物を使用して形質転換体を作製する。
これは、成熟種子で誘導される胚軸分裂組織を使用して達成することができる(McCabe et al. (1988))。微粒子銃ボンバードメントの確立された方法に従って、形質転換ダイズ植物の回収を予測することが可能である。一旦植物が再生されると、事象の評価は実施例11.2に記載されるように行うことができた。
ウィスカー調製およびウィスカー形質転換は、Terakawa et al. (2005)によって以前に記載された方法に従って予期することができる。微粒子銃ボンバードメントの確立された方法に従って、形質転換ダイズ植物の回収を予測することができる。一旦植物が再生されると、事象の評価は実施例11.2に記載されるように行うことができた。
胚形成カルス組織のための粒子ボンバードメント媒介形質転換は、以前の方法に従って最適化することができる(Khalafalla et al., 2005; El-Shemy et al., 2004, 2006)。再生した植物もまた、実施例11.2に従って評価することができる。
12.1-ワタの形質転換プロトコール
ワタ種子(Co310遺伝子型)を、95%エタノール中で1分間、表面殺菌し、すすぎ、50%漂白剤で20分間殺菌し、次いで滅菌蒸留水で3回すすぎ、その後、Magenta GA-7容器中のG培地(表26)に播種し、40〜60 μE/m2の高光強度下で、16時間明期および8時間暗期で28℃に設定した光周期で維持した。
35mlのY培地(表26)(ストレプトマイシン(100mg/ml保存液)およびエリスロマイシン(100mg/ml保存液)を含む)に、1ループ(白金耳)の細菌を接種し、150rpmで振盪しながら、暗所にて28℃で一晩増殖させる。翌日、滅菌オークリッジ(oakridge)チューブ(Nalge-Nunc, 3139-0050)にアグロバクテリウム溶液を注ぎ、およびBeckman J2-21で、8,000rpmにて5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを25mlのM液体(表26)に再懸濁し、およびボルテックスにより激しく撹拌する。アリコートを、Klett読み取り(Klett-Summerson, モデル800-3)のためにガラス培養チューブ(Fisher, 14-961-27)に配置する。M液体培地を使用して、新たな懸濁物を、40mlの全体量で、mLあたり108コロニー形成単位のKlettメーター読み取りまで希釈する。
子葉セグメントがpDAB724を含有するアグロバクテリウムで処理された数種の実験を開始した。得られたセグメントの2000個より多くが、pDAB724ワタカルスの増殖のために、種々のオーキシン選択肢:0.1または0.5mg/L R-ジクロルプロップのいずれか、標準2,4-D濃度、およびオーキシンなし処理を使用して処理した。カルスは、構築物中にPAT遺伝子を含むことに起因して、グルホシネート-アンモニウム上で選択した。PCRおよびインベーダーの型でのカルス系統分析は、遺伝子がカルス段階において存在したか否か、およびそのことが確実であることを決定するために使用し;次いで、胚形成性であるカルス系統は、とりわけ11.2.3節に記載されるように、ウエスタン分析に送る。胚形成ワタカルスには、回収した組織の品質および量を改善するために、乾燥(dessication)技術を使用してストレスを加えた。
上記のプロトコールに従って植物を生じたAAD-12(v1)ワタ系統は温室に送る。AAD-12(v1)遺伝子がワタにおいて2,4-Dに対する抵抗性を提供することを実証するために、AAD-12(v1)ワタ植物と野生型ワタ植物の両方に、187L/haの噴霧体積で560g ae/ha 2,4-Dを送達するトラック噴霧器を用いて噴霧する。植物を、処理の3日後および14日後に評価する。2,4-Dの選択割合で生存している植物は、T1種子を作製するために自家受粉し、またはF1種子を産生するために優良ワタ系統と外部交配する。引き続いて生じた種子を、以前に記載したように植え、除草剤抵抗性について評価する。AAD-12(v1)事象は、実施例(experimens)18、19、22、および23に記載されるように、所望の他のHTまたはIR形質と組み合わせることができる。
本開示に鑑みて、さらなる作物を、本発明に従って、当技術分野において公知である技術を使用して形質転換することができる。ライムギのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Popelka and Altpeter (2003)を参照されたい。ダイズのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Hinchee et al., 1988を参照されたい。ソルガムのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Zhao et al., 2000を参照されたい。オオムギのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Tingay et al., 1997を参照されたい。コムギのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Cheng et al., 1997を参照されたい。イネのアグロバクテリウム媒介形質転換については、例えば、Hiei et al., 1997を参照されたい。
14.1-AAD-2(v1)初期クローニング
別の遺伝子を、tfdAに対して44%のみのアミノ酸同一性を有するホモログとしてNCBIデータベース(ncbi.nlm.nih.gov ウェブサイト; アクセッション番号AP005940を参照されたい)から同定した。この遺伝子は、一貫性のために、本明細書ではAAD-2(v1)と呼ばれる。同一性パーセントは、AAD-2とtfdAの両方のDNA配列(それぞれ、PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:12およびGENBANKアクセッション番号M16730)をタンパク質(それぞれ、PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:13およびGENBANKアクセッション番号M16730)に最初に翻訳すること、次いで、VectorNTIソフトウェアパッケージ中のClustalWを使用して複数配列アラインメントを実施することによって決定した。
[(brjap 5'(speI) PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:14(SpeI制限部位およびリボソーム結合部位(RBS)を加えた)]およびリバース:
[(br jap 3'(xhol) PCT/US2005/014737のSEQ ID NO:15(XhoI部位を加えた)]。
およびリバースプライマー
を使用して、製造業者の指示に従って実行した。この遺伝子配列およびその対応するタンパク質に、内部整合性のための新たな一般的な名称、AAD-2(v1)を与えた。
AAD-2(v1)遺伝子を、pDAB3202からPCR増幅した。PCR反応の間、5'プライマーおよび3'プライマーにおいてそれぞれAflIIIおよびSacI制限部位を導入するために、プライマー中に変化を作製した。PCT/US2005/014737を参照されたい。プライマー「ブラディのNcoI」
および「ブラディのSacI」
を、フェイルセーフPCRシステム(Epicentre)を使用してDNAフラグメントを増幅するために使用した。PCR産物を、pCR 2.1 TOPO TAクローニングベクター(Invitrogen)にクローニングし、および配列を、M13フォワードおよびM13リバースプライマーを用いて、Beckman Coulter「Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit」配列決定試薬を使用して確認した。配列データは、正確な配列(pDAB716)を有するクローンを同定した。次いで、AflIII/SacI AAD-2 (vl) 遺伝子フラグメントを、NcoI/SacI pDAB726ベクターにクローニングした。得られる構築物(pDAB717); AtUbi10プロモーター: Nt OSM 5'UTR: AAD-2 (vl): Nt OSM3'UTR: ORF1 ポリA 3'UTRを、制限消化(NcoI/SacIを用いる)を用いて確認した。この構築物を、NotI-NotI DNAフラグメントとして、バイナリーpDAB3038にクローニングした。得られる構築物(pDAB767); AtUbi10プロモーター: Nt OSM5'UTR: AAD-2 (vl): Nt OSM 3'UTR: ORF1 ポリA 3'UTR: CsVMVプロモーター: PAT: ORF25/26 3'UTRを、正確な方向の確認のために制限消化した(NotI、EcoRI、HinDIII、NcoI、PvuII、およびSalIを用いた)。次いで、完成した構築物(pDAB767)を、アグロバクテリウムへの形質転換のために使用した。
植物に最適化したAAD-12(v1)またはネイティブAAD-2(v1)遺伝子で形質転換した、直前に収集したT1種子を、以前に記載されたように、植え、グルホシネートに対する抵抗性について選択した。次いで、植物は、種々の割合の2,4-D(50〜3200g ae/ha)にランダムに割り当てた。除草剤適用は、187L/ha噴霧体積で、トラック噴霧器によって適用した。使用した2,4-Dは、市販のジメチルアミン塩製剤であり(456g ae/L、NuFarm, St Joseph, MO)、200mM Tris緩衝液(pH 9.0)または200mM HEPES緩衝液(pH 7.5)に混合した。
本実施例および以下の実施例は、対象のAAD-12の発明によって可能にされた、新規な除草剤の特定の例である。
AAD-12(v1)は、通常2,4-Dに対して感受性である作物において直接的に、広い範囲の広葉雑草の直接的な制御のためにフェノキシオーキシン除草剤(例えば、2,4-DおよびMCPA)およびピリジルオキシオーキシン(トリクロピルおよびフルロキシピル)の使用を可能にすることができる。280〜2240 g ae/haでの2,4-Dの適用は、農学的環境に存在する大部分の広葉雑草種を制御する。最も典型的には、560〜1120 g ae/haが使用される。トリクロピルについては、適用割合は、典型的には、70〜1120g ae/ha、より典型的には140〜420g ae/haの範囲である。フルロキシピルについては、適用割合は、典型的には、35〜560g ae/ha、より典型的には70〜280g ae/haの範囲である。
類似の様式において、AAD-12(v1)を用いる草類種(例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、または芝草および牧草であるがこれらに限定されない)の形質転換は、高い効力があるフェノキシオーキシンおよびピリジルオキシオーキシンの、選択性が通常明らかでない作物における使用を可能にする。多くの草類種は、フェノキシオーキシン(すなわち、2,4-D)のようなオーキシン除草剤に対して天然の耐性を有する。しかし、比較的低レベルの作物選択性が、適用のタイミングの短い期間または容認できない損傷のリスクに起因して、有用性の減少を生じてきた。それゆえに、AAD-12(v1)形質転換単子葉植物作物は、多くの広葉雑草種を制御するための、双子葉植物について記載したのと同様の処理の組み合わせの使用、例えば、280〜2240 g ae/haの2,4-Dの適用を可能にする。より典型的には、560〜1120 g ae/haが使用される。トリクロピルについては、適用割合は、典型的には70〜1120g ae/ha、より典型的には140〜420g ae/haの範囲である。フルロキシピルについては、適用割合は、典型的には35〜560g ae/ha、より典型的には70〜280g ae/haの範囲である。
北米において栽培されるワタ、アブラナ、トウモロコシ、およびダイズのエーカーの大部分がグリホセート耐性形質を含み、GTトウモロコシの採用は上昇している。さらなるGT作物(例えば、例えば、コムギ、イネ、テンサイ、芝草など)が開発中であるが、現在まで商業的に発売されていない。多くの他のグリホセート抵抗性種が、開発段階のために実験中である(例えば、アルファルファ、サトウキビ、ヒマワリ、ビート、エンドウマメ、ニンジン、キュウリ、レタス、タマネギ、イチゴ、トマト、およびタバコ;ポプラおよびスイートガムのような林業種;ならびにマリゴールド、ペチュニア、およびベゴニアなどの園芸種;World Wide Web上のisb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm , 2005)。GTCは、この系によって提供される制御された雑草の完全な広がりおよび便利さおよびコスト効果のための価値のあるツールである。しかし、現在標準であるベース処理としてのグリホセートの有用性は、グリホセート抵抗性雑草を選択することである。さらに、グリホセートが固有に効力が弱い雑草は、グリホセートのみの化学物質プログラムが実施されている場合には、圃場で優勢な種に転じている。従来的な育種を通して、または新規な形質転換事象として一緒にのいずれかで、GT形質とAAD-12(v1)を重ね合わせることによって、雑草制御の効力、柔軟性、ならびに雑草の変化および除草剤抵抗性の発生を管理する能力が改善できる。以前の実施例において言及したように、AAD-12(v1)で作物を形質転換することによって、単子葉植物作物は、フェノキシオーキシンまたはピリジルオキシオーキシンの安全性のより高い限界を有し、かつフェノキシオーキシンは、双子葉植物作物に選択的に適用することができる。雑草制御オプションの改善のためのいくつかのシナリオが想定でき、ここで、AAD-12(v1)およびGT形質は、任意の単子葉植物種または双子葉植物種において重ね合わせられる。
a)グリホセートは、大部分のイネ科雑草種および広葉雑草種の制御のために、標準的な発芽後適用割合(420〜2160g ae/ha、好ましくは560〜840g ae/ha)で適用することができる。コニザ カンデンシス(Conyza canadensis)のような広葉雑草またはグリホセートを用いる制御に対して固有に困難である雑草(例えば、コメリナ(Commelina)種、イポメア(Ipomoea)種)の制御のために、280-2240g ae/ha(好ましくは560〜1120g ae/ha)2,4-Dが、効果的な制御を提供するために、連続して、容器で混合して、またはグリホセートとのプレミックスとして適用することができる。トリクロピルについては、適用割合は、典型的には70〜1120g ae/ha、より典型的には140〜420g ae/haの範囲である。フルロキシピルについては、適用割合は、典型的には35〜560g ae/ha、より典型的には70〜280 ae/haの範囲である。
b)現在、GTCにおいて適用されるグリホセートの割合は、一般的に、適用のタイミングあたり、560〜2240 g ae/haの範囲である。グリホセートは、広葉雑草種よりも、イネ科植物雑草に対してはるかにより効力がある。AAD-12(v1)+GTの重ね合わせた形質は、イネ科植物に有効な割合のグリホセート(105〜840g ae/ha、より好ましくは210〜420g ae/ha)を可能にする。次いで、2,4-D(280〜2240g ae/ha、より好ましくは560〜1120g ae/ha)を、必要な広葉雑草の制御を提供するために、連続して、容器で混合して、またはイネ科雑草に有効な割合のグリホセートとのプレミックスとして適用することができる。上述した割合のトリクロピルおよびフルロキシピルは、処置計画において容認できる成分である。低い割合のグリホセートもまた、広葉雑草制御に対して何らかの利点を提供する。しかし、主要な制御は2,4-D、トリクロピル、またはフルロキシピルからである。
グルホシネート耐性(PATまたはbar)は、昆虫抵抗性タンパク質のようなインプット形質のための選択マーカーとして、または特異的にHTC形質としてのいずれかで、現在、北米において栽培される多数の作物に存在している。作物には、グルホシネート耐性のアブラナ、トウモロコシ、およびワタが含まれるがこれらに限定されない。さらなるグルホシネート耐性作物(例えば、イネ、テンサイ、ダイズ、および芝草)が開発中であるが、現在まで商業的に発売されていない。グルホシネートは、グリホセートのように、比較的選択性でなく、広い範囲のイネ科雑草および広葉雑草除草剤である。これはより早く作用し、除草剤適用の24〜48時間後に、処理された葉の乾燥および「焼け」を生じる。これは、迅速な雑草制御の出現のために有利である。しかし、これはまた、標的植物の成長点領域へのグルホシネートの移行を制限し、多くの種において2つの化合物の相対的な雑草制御性能の評価によって証明されるように、乏しい雑草制御を生じる(Agriliance, 2005)。
a)グルホシネートは、多くのイネ科雑草種および広葉雑草種の制御のために、標準的な発芽後適用割合(200〜1700g ae/ha、好ましくは350〜500g ae/ha)で適用することができる。今日まで、グルホシネート抵抗性雑草は確認されていない。しかし、グルホシネートは、グリホセートよりも、固有により耐性である非常に多くの雑草を有する。
i)固有に耐性である広葉雑草種(例えば、サオシウム アーベンシス(Cirsium arvensis)、アポシナム キャノビナム(Apocynum cannabinum)、およびコニザ カナデンシス)は、これらのより制御することが困難である多年生植物の効果的な制御のため、および一年生植物の広葉雑草種に対して制御の強固さを改善するために、280〜2240g ae/ha、より好ましくは560〜2240g ae/ha 2,4-Dを容器で混合することによって制御できる。トリクロピルおよびフルロキシピルは、雑草制御レジメンにおいて考慮するための受け入れ可能な成分である。トリクロピルについては、適用割合は、典型的には70〜1120g ae/ha、より典型的には140〜420g ae/haの範囲である。フルロキシピルについては、適用割合は、典型的には35〜560g ae/ha、より典型的には70〜280 ae/haの範囲である。
b)グルホシネート(200〜500g ae/ha)+/- 2,4-D(280〜1120g ae/ha)+/- トリクロピルまたはフルロキシピル(上記の割合で)の複数の組み合わせは、例えば、より強固な、重複する雑草制御範囲を提供することができる。加えて、重複する範囲は、除草剤抵抗性雑草の管理および遅延のためのさらなるメカニズムを提供する。
イミダゾリノン除草剤耐性(AHASなど)は、トウモロコシ、イネ、およびコムギを含むがこれらに限定されない、現在、北米において栽培される多数の作物に存在している。さらなるイミダゾリノン耐性作物(例えば、ワタおよびテンサイ)が開発中であるが、現在まで商業的に発売されていない。多くのイミダゾリノン除草剤(例えば、イマザモクス、イマゼタピル、イマザキン、およびイマザピク)は、種々の従来的な作物において選択的に使用されている。イマゼタピル、イマザモクス、および非選択性イマゼタピル(imazapyr)の使用は、AHASなどのようなイミダゾリノン耐性形質を通して可能にされてきた。この化学クラスは、有意な土壌残留活性を有し、従って、グリホセートまたはグルホシネートに基づく系とは異なり、適用のタイミングを超えて広がる雑草制御を提供することが可能である。しかし、イミダゾリノン除草剤によって制御される雑草の範囲は、グリホセートほどは広くない(Agriliance, 2005)。加えて、イミダゾリノン除草剤は、多くの雑草が抵抗性を発生する作用の様式(アセトラクテートシンターゼ、ALSの阻害)を有する(Heap, 2005)。従来的な育種を通して、または新規な形質転換事象として一緒にのいずれかで、イミダゾリノン耐性形質とAAD-12(v1)を重ね合わせることによって、雑草制御の効力、柔軟性、ならびに雑草の変化および除草剤抵抗性の発生を管理する能力が改善できる。以前の実施例において言及したように、AAD-12(v1)で作物を形質転換することによって、単子葉植物作物は、フェノキシオーキシンまたはピリジルオキシオーキシンの安全性のより高い限界を有し、かつこれらのオーキシンは、双子葉植物作物に選択的に適用することができる。雑草制御オプションの改善のためのいくつかのシナリオが想定でき、ここで、AAD-12(v1)およびイミダゾリノン耐性形質は、任意の単子葉植物種または双子葉植物種において重ね合わせられる。
a)イマゼタピルは、多くのイネ科雑草種および広葉雑草種の制御のために、標準的な発芽後適用割合(35〜280g ae/ha、好ましくは70〜140g ae/ha)で適用することができる。
i)アマランサス ルディス(Amaranthus rudis)、アンブロシア トリフィダ(Ambrosia trifida)、チェノポジウム アルブム(Chenopodium album)のようなALS阻害剤抵抗性広葉雑草(とりわけ、Heap, 2005)は、280〜2240g ae/ha、好ましくは560〜1120g ae/ha)2,4-Dを容器で混合することによって制御できる。トリクロピルについては、適用割合は、典型的には70〜1120g ae/ha、より典型的には140〜420g ae/haの範囲である。フルロキシピルについては、適用割合は、典型的には35〜560g ae/ha、より典型的には70〜280 ae/haの範囲である。
ii)イポモエア(Ipomoea)種のようなイミダゾリノン除草剤に対して固有により耐性である広葉雑草種は、280〜2240g ae/ha、より好ましくは560〜1120g ae/ha 2,4-Dを容器で混合することによってもまた制御できる。トリクロピルまたはフルロキシピルについては上記の割合を参照されたい。
b)イマゼタピル(35〜280g ae/ha、好ましくは、70〜140g ae/ha)+/- 2,4-D(280〜1120g ae/ha)+/- トリクロピルまたはフルロキシピル(上記の割合で)の複数の組み合わせは、例えば、より強固な、重複する雑草制御範囲を提供することができる。加えて、重複する範囲は、除草剤抵抗性雑草の管理および遅延のためのさらなるメカニズムを提供する。
21.1-培地の説明
使用する培地を1M KOHでpH 5.8に調整し、2.5g/1 Phytagel(Sigma)で固化した。胚形成カルスを、40ml半固形培地を含む100×20mm ペトリ皿中で培養した。イネ小植物をMagentaボックス中の50ml培地上で生育させた。細胞懸濁液を、35ml液体培地を含む125mlコニカルフラスコ中で維持し、125rpmで回転させた。胚形成培養の誘導および維持は、暗所にて25〜26℃で行い、植物の再生および全植物培養は16時間光周期で行った(Zhang et al. 1996)。
オリザ サティバ(Oryza sativa)L.ジャポニカ 栽培種タイペイ(L. japonica cv. Taipei)309の成熟乾燥種子を、Zhang et al. 1996において記載されるように殺菌した。胚形成組織を、暗所でNB培地上で殺菌成熟イネ種子を培養することによって誘導した。約1mm直径の一次カルスを胚盤から取り出し、SZ液体培地中で細胞懸濁を開始するために使用した。次いで、懸濁物を、Zhang 1995に記載されるように維持した。懸濁物に由来する胚発生組織を、以前の継代培養の3〜5日後に液体培養から取り出し、NBO浸透培地に移し、ペトリ皿中で約2.5cmの横方向の円を形成して、ボンバードメントの前4時間培養した。ボンバードメントの16〜20時間後、組織を、NBO培地からNBH50ハイグロマイシンB選択培地に移し、ボンバードメント表面が上側を向くことを確実にし、および暗所で14〜17時間インキュベートした。次いで、新たに形成されたカルスを、もともとのボンバードメント移植片から分離し、同じ培地のすぐ近くに配置した。さらに8〜12時間後、比較的緻密な、不透明なカルスが目視的に同定され、および暗所で7日間、PRH50プレ再生培地に移した。次いで、より緻密でかつ不透明になった生長しているカルスを、16時間光周期下で、14〜21日間の期間、RNH50再生培地に継代培養した。再生しているシュートを、1/2MSH50培地を含むMagentaボックスに移した。単一の移植片から再生された複数の植物は同胞と見なされ、1つの独立した植物系統として扱った。植物を、それが厚い白色の根を生じ、1/2MSH50培地上で元気に生長した場合には、hph遺伝子について陽性と点数付けした。一旦小植物がMagentaボックスの上端に達したら、これらは1週間、100%湿度下で、6cmポット中の土壌に移し、次いで、30℃の14時間明期、および21℃の暗期の生育チャンバーに移し、2〜3週間後、温室中の13cmポットに移植した。種子を収集し、37℃で1週間乾燥させ、その後保存した。
すべてのボンバードメントは、Biolistic PDS-1000/He(商標)システム(Bio-Rad, Laboratories, Inc.)を用いて実施した。3mgの1.0ミクロン直径の金粒子を1回、100%エタノールで、2回滅菌蒸留水で洗浄し、およびシリコン処理したEppendorfチューブ中の50μl水中に懸濁した。1:6モル比のpDOW3303(Hpt含有ベクター):pDAB4101(AAD-12(v1) + AHAS)を表す5μgプラスミドDNA、20μlスペルミジン(0.1M)および50μl 塩化カルシウム(2.5M)を金懸濁物に加えた。この混合物を室温で10分間インキュベートし、10000rpmで10秒間ペレット化し、60μl冷100%エタノール中に再懸濁し、および8〜9μlを各マイクロキャリアに分配した。組織試料を、Zhang et al. (1996)によって記載されるように、1100psiおよび27inのHg真空でボンバードメントした。
3〜5葉段階のイネ小植物に、187L/haに較正したトラック噴霧器を使用して、1% Snit II(v/v)および1.25% UAN(v/v)を含むPursuitの0.16%(v/v)の致死用量(AHAS遺伝子の存在を確認するため)を噴霧した。感受性または抵抗性のための割合は、処理後36日(DAT)に実施した。温室に送った33個の事象のうちの10個はPursuitに対して強固に耐性であった;他の事象は様々なレベルの除草剤損傷を被った。植物をサンプリングし(以下の21.7節に従う)、分子的特徴付けは、実施例8において以前に記載されたように実施し、これらの10個の事象のうちの7個をAAD-12(v1)PTUと完全なAHAコード領域の両方を含むと同定した。
100個の植物子孫試験を、AAD-12(v1)PTUとAHASの両方のコード領域を含んだAAD-12(v1)の5つのT1系統に対して実施した。種子は、上記の手法に関連して播種、以前に記載されたようにトラック噴霧器を使用して、140g ae/haイマゼタピルを噴霧した。14DAT後、抵抗性および感受性植物を計数した。試験した5つの系統のうちの2つは、χ二乗検定によって決定されるように、単一遺伝子座の、優性メンデル形質(3R:1S)として分離した。AAD-12は、以下の2,4-D耐性試験によって決定されるように、AHAS選択マーカーとともに同時分離した。
以下のT1 AAD-12(v1)単一分離遺伝子座系統を、Metro Mix培地を含む3インチポットに植えた:pDAB4101(20)003およびpDAB4101(27)002。2〜3枚葉段階で、140g ae/haイマゼタピルを噴霧した。ヌルは除外し、個体には、V3〜V4段階で、1120、2240、または4480g ae/ha 2,4-D DMA(それぞれ、2×、4×、および8×の典型的な商業的使用割合)で、187L/haに設定したトラック噴霧器で噴霧した。植物は、7および14DATで等級付けし、陰性対照植物として、形質転換されていない商業的なイネ品種「Lamont」と比較した。
新鮮な組織をチューブに配置し、4℃で2日間凍結乾燥した。組織を完全に乾燥させた後、タングステンビーズ(Valenite)をチューブ中に配置し、試料を、1分間、Kelcoビーズミルを使用する乾式粉砕に供した。次いで、標準的なDNeasy DNA単離手法に従った(Qiagen, Dneasy 69109)。次いで、抽出したDNAのアリコートをPico Green(Molecular Probes P7589)で染色し、濃度をng/μlで得るために既知の標準を用いてフルオロメーター(BioTek)で読み取った。
試料調製および分析条件は以前に記載したものと同様であった。33個すべてのT0トランスジェニックイネ系統および1個の非トランスジェニック対照を、ELISAブロットを使用してAAD-12発現について分析した。AAD-12は、20個の系統のクローンにおいて検出し、しかしタイパイ(Taipai)309対照植物においては検出しなかった。イマゼタピルに対して耐性であったクローンのいくつかを有する20個の系統のうちの12個がAAD-12タンパク質を発現しており、AAD-12 PCR PTU陽性であり、そしてAHASコード領域陽性であった。発現レベルは、全体の可溶性タンパク質の2.3から1092.4ppmまでの範囲であった。
圃場レベル耐性試験は、AAD-12(v1)事象pDAB4101[20]および1つの野生型イネ(Clearfield 131)を用いて、ミシシッピー州ウェイサイド(Wayside, Mississippi)において実施した(非トランスジェニックイミダゾリノン抵抗性変種)。実験設計は、単一の複製を有するランダム化された完全なブロック設計であった。除草剤処理は、2240g ae/haである2×割合の2,4-D(ジメチルアミン塩)、および560g ae/haであるトリクロピル、加えて未処理対照であった。各除草剤処理の中で、T1世代pDAB4101[20]の2つの作条およびClearfieldイネの2つの作条は、8インチ作条間隔で小さなプロットドリルを使用して植えた。pDAB4101[20]イネはAAD-12(v1)の選択マーカーとしてAHAS遺伝子を含んだ。イマゼタピルは、プロットからの任意のAAD-12(v1)ヌル植物を除去するための選択剤として、1枚葉段階で適用した。除草剤処理は、130〜220 kpa圧力で187L/haキャリア体積を送達する圧縮空気バックパック噴霧器を使用して、イネが2枚葉段階に達したときに適用した。損傷の目視的な割合は、適用の7日後、14日後、および21日後に取った。
22.1-アブラナ形質転換
2,4-Dに対する抵抗性を付与するAAD-12(v1)遺伝子を、アグロバクテリウム媒介形質転換およびプラスミドpDAB3759を用いて、セイヨウアブラナ(Brassica napus)var.Nexera* 710を形質転換するために使用した。構築物は、CsVMVプロモーターによって駆動されるAAD-12(v1)遺伝子、およびAtUbi10プロモーターによって駆動されるPat遺伝子、およびAtUbi10プロモーターによって駆動されるEPSPSグリホセート抵抗性形質を含んだ(2.4節を参照)。
22.2.1-DNAを収集する組織の単離および定量
新鮮な組織をチューブに配置し、4℃で2日間凍結乾燥した。組織を完全に乾燥させた後、タングステンビーズ(Valenite)をチューブ中に配置し、試料を、1分間、Kelcoビーズミルを使用する乾式粉砕に供した。次いで、標準的なDNeasy DNA単離手法に従った(Qiagen, DNeasy 69109)。次いで、抽出したDNAのアリコートをPico Green(Molecular Probes P7589)で染色し、濃度をng/μlで得るために既知の標準を用いてフルオロメーター(BioTek)で読み取った。
全体で100ngの全DNAを鋳型として使用した。20mMの各プライマーを、Takara Ex Taq PCR Polymeraseキット(Mirus TAKRR001A)とともに使用した。コード領域PCR AAD-12(v1)のためのプライマーは、(SEQ ID NO:10)(フォワード)および(SEQ ID NO:11)(リバース)であった。PCR反応を、9700 Geneampサーモサイクラー(Applied Biosystems)において、試料を、94℃で3分間、ならびに94℃で30秒間、65℃で30秒間、および72℃で2分間の35サイクル、続いて72℃で10分間に供することによって実行した。PCR産物を、EtBrで染色した1%アガロースゲル上での電気泳動によって分析した。試験したAAD-12(v1)事象を有する35植物からの35個の試料が陽性と試験された。3個の陰性対照は陰性と試験された。
以前の節において確立されたELISAを使用して、AAD-12タンパク質を、5個の異なるアブラナ形質転換植物事象において検出した。発現レベルは、全可溶性タンパク質(TSP)の14〜700ppm以上の範囲であった。3つの異なる非形質転換植物試料を並行して試験し、これはシグナルを検出しなかった。このことは、このアッセイ法において使用した抗体が、アブラナ細胞マトリックスに対して最小限の交差反応性を有することを示す。これらの試料はまた、ウエスタン分析によって陽性であることが確認された。結果の要約を表29に示す。
構築物pDAB3759で形質転換したものからの45個のT0事象を一定時間温室内に送り、温室内で馴化させた。これらの植物を、2〜4枚の新たな正常な外見の葉が現れるまで生育させた(すなわち、植物は、組織培養から温室生育条件に移行した)。次いで、植物を、2,4-D Amine 4の市販の製剤の致死用量である560g ae/haの割合で処理した。除草剤適用は、トラック噴霧器を用いて、187L/haの噴霧量、50cm噴霧高さで行った。致死用量は、非形質転換対照に対する>95%損傷を引き起こす割合として定義される。
100個の植物の子孫試験もまた、AAD-12(v1)の11種のT1系統に対して実施した。種子をまき、Metro Mix培地で満たした3インチポットに移植した。次いで、すべての植物に、以前に記載したように560g ae/ha 2,4-D DMAを噴霧した。14 DAT後、抵抗性植物および感受性植物を計数した。χ二乗検定によって決定されるように、試験した11個の系統のうちの7つが、単一の遺伝子座である優性メンデル形質(3R:1S)として分離した。AAD-12は、複数の種において強固なアリールオキシアルカノエートオーキシン抵抗性遺伝子として遺伝性であり、1つまたは複数のさらなる除草剤抵抗性遺伝子と重ねあわせることができる。
T1 AAD-12(v1)については、5〜6mgの種子を層形成し、まき、そしてSunshine Mix # 5培地の微細な層を土壌の上端に加えた。現れる植物を、播種後7日後および13日後に、560g ae/ha 2,4-Dで選択した。
圃場レベル耐性試験は、2つのAAD-12(v1)事象3759(20)018.001および3759(18)030.001および野生型アブラナ(Nex710)に対して、インディアナ州ファウラーにおいて実施した。実験設計は、3つの複製を用いるランダム化された完全なブロック設計であった。除草剤処理は、280、560、1120、2240、および4480g ae/haの2,4-D(ジメチルアミン塩)、840g ae/haのトリクロピル、280g ae/haのフルロキシピル、ならびに未処理対照であった。各除草剤処理の中で、事象3759(18)030.0011、3759(18)018.001、および野生型系統(Nex710)のための単一の20フィート作条/事象を、8インチ作条間隔で4作条ドリルを使用して植えた。除草剤処理は、130〜220 kpa圧力で187L/haキャリア体積を送達する圧縮空気バックパック噴霧器を使用して、アブラナが4〜6枚葉段階に達したときに適用した。視覚的な損傷割合は、適用の7日後、14日後、および21日後に取った。
1つのカラムで異なる文字を用いた平均は、最小有意差によって定義されるように有意に異なっている(p=0.05)。
トランスジェニック形質によって供給される作物における昆虫抵抗性は、北米において、または世界中でのトウモロコシおよびワタの生産において普及している(prevelant)。IRおよびHTの合わせた形質を有する市販の製品は、複数の種子企業によって開発されている。これらには、Bt IR形質(例えば、lifesci.sussex.ac.ukウェブサイト, 2006に列挙されるBt毒素)および上述のHTC形質のいずれかまたはそのすべてが含まれる。この提供物がもたらす価値は、単一の提供物中の遺伝的手段を通して、複数の厄介な問題を制御する能力である。この提供物の便利さは、雑草制御および昆虫制御が互いと独立して達成されるならば、制限される。単独の、または1つもしくは複数のさらなるHTC形質と重ね合わされたAAD-12(v1)は、従来的な育種を通して、または新たな形質転換事象として合同してのいずれかで、1つもしくは複数のインプット形質(例えば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、またはストレス耐性など)(isb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl. cfm, 2005)と重ね合わせることができる。利点には、AAD-12および関連する除草剤耐性によって提供される雑草制御の改善に加えて、害虫および/または他の農学的なストレスを管理する能力ととともに、上記の実施例15〜20に記載される簡便さおよび柔軟性が含まれる。従って、本発明は、任意の数の農学的な問題を柔軟かつ費用効率よく制御する能力を有する、作物品質の改善の完全な農学的パッケージを提供するために使用することができる。
植物細胞、組織、器官、および植物またはオルガネラ、例えば、プラスチドの遺伝子操作は、適切な送達方法を使用して、関心対象の遺伝子を植物細胞に挿入するプロセスで開始する。しかし、遺伝子が植物細胞に送達される場合、極めて小さなパーセンテージの細胞のみが、異種遺伝子をそれらのゲノムに組み込む。関心対象の遺伝子を取り込んだこれらのわずかな細胞を選択するために、研究者達は、ベクター中の関心対象の遺伝子(GOI)に、選択可能なまたはスクリーニング可能な「マーカー遺伝子」を連結する。これらのマーカーを含む細胞は、DNAプラスミドベクターが送達された細胞/組織の全体の集団から同定される。マーカー遺伝子を発現するこれらの細胞を選択することによって、研究者達は、細胞のゲノムにGOIを組み込んだ可能性があるこれらのわずかな細胞を同定することが可能である。
AAD-12(v1)は2,4-Dを分解するが、オーキシン生長調節因子の構造的要件を同時に有するR-2,4-ジクロロフェノキシプロピオン酸(R-ジクロルプロップ)を分解しない。細胞培養において使用されてもよい他の非代謝性植物オーキシン模倣物には、NAA(ナフタレン酢酸)、IAA(インドール酢酸)、ジカンバ、ピクロラム、およびR-メコプロップが含まれる。R-ジクロルプロップを置き換え、かつ2つの異なるタバコ培養物PHL(ペチト ハバナ(Petite Havanna))およびBY2懸濁物を首尾よく維持することが可能であったか否かを調べた。逆に、ワタ移植物のために、R-ジクロルプロップ、ジカンバ、およびピクロラムは代替オーキシンとして試験し、標準生長調節因子、2,4-Dと比較した胚形成カルス誘導性応答を評価した。ペチト ハバナタバコ(PHL)およびコーカー(Coker)ワタ子葉をこれらの実験において使用した。
24.1.1-タバコ細胞懸濁物-選択剤としての2,4-D
培養培地中でR-ジクロルプロップが2,4-Dの代わりに直接的に置き換えられた場合に、R-ジクロルプロップに慣れたPHL細胞と、R-ジクロルプロップに慣れたBY2細胞の両方を用いて、用量応答研究を実施した。焦点はPHLに注がれていたが、用量応答はまた、可能な将来の研究の場合にはBY2を用いて、ならびにPHLについては用量応答を予測することを補助するためにも行った。ジクロルプロップに慣れたPHL用量応答のために、使用した2,4-Dのレベル(R-ジクロルプロップを伴うLSBY2C上で)は0(対照)、1、2、3、5、8、10、12、15、18、20、40、60、80、10、110、120mg/L 2,4-Dであった。濃度あたり4つの複製が存在した。R-ジクロルプロップに慣れたBY2用量応答については、使用した2,4-Dのレベル(LSBY2C培地上で)は0(対照)、1、2、3、5、8、10、20、30、40、mg/L 2,4-Dであった。
タバコ形質転換実験のために、全体で11通りの処理:LS-BY2C+ジクロルプロップ培地上にプレートした対照セット、およびLSBY2C+ジクロルプロップ+様々な濃度レベル(1、2、3、5、8、10、12、15、18、20mg/L)の2,4-Dの10セットが存在した。処理あたり4つの複製が存在した。使用したプラスミドDNAベクターはpDAB724であり、形質転換のために使用したベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのEHA101S株であった。0.6 OD660のPHL懸濁物の4mLを、滅菌ペトリプレート中で、1.0 OD660のアグロバクテリウム(EHA101株またはLBA4404株のいずれか)懸濁物の100μlと混合し、徹底的に混合し、および非振盪条件下で、暗所生長チャンバーで、25℃にて3日間、一緒に同時培養した。同時培養時間後、1.5mlのアグロ-タバコ懸濁混合物を、上記の11セットのプレートにプレートした。実験を13通りの処理:LS-BY2C+ジクロルプロップ培地(2,4-Dなし)の対照、およびLS-BY2C+ジクロルプロップ+2.4-D(1、2、3、5、8、10、12、15、18、20mg/L);LSBY2C+1mg/L 2,4-D+B10(ビアロフォス(Bialophos));LSBY2C+10 2,4-D+B10+R-ジクロルプロップで反復した。再度、処理あたり4つの複製、ならびに陽性および陰性対照が存在した。すべての培地は、選択培地中のアグロバクテリウム増殖を含めるよう制御するために、500mg/L カルベニシリン(C)を含む。
用量応答研究は、ワタにおける生長調節因子としての2,4-Dの使用の代用品として複数のオーキシン代替物を試験するために開始した。試験した代替オーキシンは、2,4-ジクロルプロップ、ジカンバ、およびピクロラムであった。これらの化合物は、それぞれ、0.2、2.0、および20.0μM濃度で試験した。2,4-Dは、0.02μM濃度の対照処理として使用した。使用した培地は、ワタカルス誘導のための基礎培地である(実施例12)。培養の初期相を超えると、オーキシンは、組織を再生プロセスに向けて促すために培地から除去する。
SEQ ID NO:1は、デルフティア アシドボランス(Delftia acidovorans)からのAAD-12のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:2は、SEQ ID NO:1によってコードされている翻訳したタンパク質配列である。
SEQ ID NO:3は、植物に最適化されたAAD-12(v1)のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:4は、SEQ ID NO:3によってコードされている翻訳したタンパク質配列である。
SEQ ID NO:5は、大腸菌に最適化されたAAD-12(v2)のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:6は、M13フォワードプライマーの配列である。
SEQ ID NO:7は、M13リバースプライマーの配列である。
SEQ ID NO:8は、フォワードAAD-12(v1)PTUプライマーの配列である。
SEQ ID NO:9は、リバースAAD-12(v1)PTUプライマーの配列である。
SEQ ID NO:10は、フォワードAAD-12(v1)コーディングPCRプライマーの配列である。
SEQ ID NO:11は、リバースAAD-12(v1)コーディングPCRプライマーの配列である。
SEQ ID NO:12は、「sdpacodF」AAD-12(v1)プライマーの配列を示す。
SEQ ID NO:13は、「sdpacodR」AAD-12(v1)プライマーの配列を示す。
SEQ ID NO:14は、「BrandyのNcoI」プライマーの配列を示す。
SEQ ID NO:15は、「BrandyのSacI」プライマーの配列を示す。
Claims (12)
- アリールオキシアルカノエート除草剤のアリールオキシアルカノエート化学構造を酵素的に分解するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む種子を区域の土に植える工程を含み、
該アリールオキシアルカノエート除草剤を該区域に適用する工程をさらに含む、
区域で雑草を制御する方法であって、
該タンパク質をコードする核酸分子が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、およびSEQ ID NO:5からなる群より選択される配列の完全な相補体と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、
方法。 - タンパク質が、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一である、請求項1記載の方法。
- アリールオキシアルカノエート除草剤のアリールオキシアルカノエート化学構造を酵素的に分解するタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、植物細胞において機能的であるプロモーターに機能的に連結されており、かつ該タンパク質をコードする核酸分子が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、およびSEQ ID NO:5からなる群より選択される配列の完全な相補体と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
- タンパク質が、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一である、請求項3記載のポリヌクレオチド。
- アリールオキシアルカノエート除草剤が、
(a)フェノキシアルカノエート除草剤;
(b)フェノキシプロピオン酸除草剤;
(c)ピリジルオキシアルカノエート除草剤;および
(d)前記除草剤の活性成分の酸、塩、またはエステルの形態
からなる群より選択される、請求項1記載の方法。 - フェノキシアルカノエート除草剤がフェノキシ酢酸除草剤であり、かつピリジルオキシアルカノエート除草剤がピリジルオキシ酢酸除草剤である、請求項5記載の方法。
- (a)フェノキシ酢酸除草剤が、2,4-DおよびMCPAからなる群より選択され、
(b)フェノキシプロピオン酸除草剤が、ジクロルプロップ、メコプロップ、およびそれらのエナンチオマーからなる群より選択され、かつ
(c)ピリジルオキシ酢酸除草剤が、トリクロピルおよびフルロキシピルなどからなる群より選択される、
請求項6記載の方法。 - 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含む、植物の部分であって、穀粒、収集した種子及びダイズからなる群から選ばれる、前記部分。
- 請求項3記載のポリヌクレオチドを植物が含むか否かを検出する方法であって、
該植物から試料を収集する工程;および
該ポリヌクレオチドの存在について該試料をアッセイする工程
を含む方法。 - ポリヌクレオチドがコードするタンパク質の存在について前記試料をアッセイする工程を含む、請求項9記載の方法。
- ポリヌクレオチドの存在を検出するためにPCRプライマーまたはプローブを使用する工程を含む、請求項9記載の方法。
- タンパク質の存在を検出するために抗体を使用する工程を含む、請求項10記載の方法。
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