MX2012006074A - Deteccion del evento de soja ariloxialcanoato dioxigenasa 416. - Google Patents

Deteccion del evento de soja ariloxialcanoato dioxigenasa 416.

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Abstract

La invención se refiere, en parte, a métodos para detectar un evento de soja AAD-12; la invención en cuestión de la presente provee ensayos para detectar la presencia del evento en cuestión de la presente en una muestra (de soja, por ejemplo); también se proveen kits y condiciones útiles para la realización de los ensayos; más específicamente, la presente invención se refiere, en parte, a un ensayo de PCR de TaqMan terminal para el evento de soja AAD-12; algunas formas de realización están dirigidas a ensayos que pueden ser sometidos a análisis de cigosidad de alto rendimiento; la invención en cuestión de la presente también se refiere, en parte, al descubrimiento de un gen de referencia preferido para su uso en la determinación de la cigosidad; esta invención también se refiere, en parte, al fitomejoramiento mediante el uso de cualquiera de los métodos objeto de la presente; en algunas formas de realización, dicha secuencia de polinucleótido/evento puede ser "agrupada" con otras características; los procedimientos en cuestión de la presente pueden ser utilizados para identificar en forma unívoca líneas de soja que comprenden el evento de la invención en cuestión de la presente.

Description

DETECCIÓN DEL EVENTO DE SOJA ARILOXIALCANOATO DIOXIGENASA 416 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El gen aad-12 (originalmente de Delftia acidovorans) codifica la proteína de ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-12). El rasgo confiere tolerancia a ácido 2,4-diclorofenoxiacétíco, por ejemplo, y a herbicidas de piridiloxiacetato. El gen aad-12, en sí, para la tolerancia a herbicidas en plantas se reveló por primera vez en el documento WO 2007/053482.
La expresión de genes heterólogos o extranjeros en plantas es influenciada por el lugar en que se inserta el gen extraño en el cromosoma. Esto se puede deber a la estructura de la cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o la proximidad de elementos de regulación transcripcional (por ejemplo, mejoradores) cercanos al sitio de integración (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988), por ejemplo. El mismo gen en el mismo tipo de planta transgénica (u otro organismo) puede exhibir una amplia variación en el nivel de expresión entre diferentes eventos. También puede haber diferencias en patrones espaciales o temporales de expresión. Por ejemplo, las diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos tejidos vegetales pueden no corresponder a los patrones esperados de elementos de regulación transcripcional presentes en el constructo génico introducido.
De esta manera, a menudo se crean y controlan grandes cantidades de eventos a fin de identificar un evento que expresa un gen introducido de interés en un nivel satisfactorio para un fin dado. Para fines comerciales, es común producir cientos a miles de diferentes eventos y controlar estos eventos para un evento individual que tiene niveles de expresión y patrones de transgenes. Un evento que tiene niveles y/o patrones de expresión de transgenes deseado es de utilidad para introgresar el transgén en otros antecedentes genéticos por cruzamiento sexual usando métodos de cría convencionales. La progenie de tales cruzas mantiene las características de la expresión del transgén del transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar una expresión génica confiable en una cantidad de variedades que se adaptan bien a las condiciones de crecimiento locales.
Se pueden usar diversos métodos previos para detectar la presencia de un evento en una muestra de tejido vegetal. Un ejemplo es la técnica de pirosecuenciación tal como describe Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En este método, se diseña un oligonucleótido que superpone el ADN genómico adyacente y la unión de ADN de inserto. El oligonucleótido se híbrida en un producto de PCR monocatenario desde la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y lucíferina. Los DNTP se añaden individualmente y la incorporación da como resultado una leve señal que se mide. Una leve señal indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueo de transgenes debido a una amplificación, hibridación y extensión de bases simples o múltiples exitosas. (Esta técnica se emplea usualmente para la secuenciación inicial, no para la detección de un gen específico cuando se conoce).
La polarización de fluorescencia es otro método que se puede usar para detectar un amplicón. Según este método, se diseña un oligonucleótido para superponer la unión de ADN flanqueante genómica e insertada. El oligonucleótido se híbrida en un producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en el ADN insertado y uno en la secuencia de ADN genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP rotulado fluorescente. La extensión de bases individuales resulta en la incorporación de ddNTP. La incorporación se puede medir como un cambio de polarización usando un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueo de transgenes debido a una amplificación, hibridación y extensión de bases individuales exitosas.
Se describieron balizas moleculares para usar en la detección de secuencias. Brevemente, se diseña una sonda de oligonucleótido FRET que superpone la unión de ADN genómica flanqueante y de inserción. La única estructura de la sonda FRET resulta en que contiene una estructura secundaria que mantiene próximos los restos fluorescentes y de neutralización. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN de inserto y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Según la amplificación de PCR exitosa, la hibridación de la sonda FRET en la secuencia blanco resulta en la eliminación de la estructura secundaria de sonda y la separación espacial de los restos fluorescentes y de neutralización. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia genómica flanqueante/de inserto de transgén debido a una amplificación e hibridación exitosas.
El ensayo de hidrólisis por sonda, también conocido como TAQMAN (Life Technologies, Foster City, Calif.), es un método de detección y cuantificación de la presencia de una secuencia de ADN. Brevemente, una sonda de oligonucleótido FRET se diseña con un oligo dentro del transgén y uno en la secuencia genómica flanqueante para la detección específica de eventos. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN de insertos y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de la sonda FRET da como resultado el clivaje y la liberación del resto fluorescente del resto de neutralización en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/de inserción del transgén debido a una amplificación e hibridación exitosas.
Otro desafío, entre muchos otros, es descubrir un gen de referencia adecuado para una prueba dada. Por ejemplo, de acuerdo con lo mencionado en el resumen de Czechowski et al., "Un conjunto excepcionalmente grande de datos de los estudios de GeneChip de genoma completo Affymetrix ATM" proveyó los medios para identificar una nueva generación de genes de referencia con niveles de expresión muy estables en las especies vegetales modelo Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Se encontraron cientos de genes Arabidopsis que superan los genes de referencia tradicionales en términos de estabilidad de expresión a través del desarrollo y según una variedad de condiciones ambientales. "(Czechowski et al. (2005) Identificación y pruebas de todo el genoma de genes de referencia superiores para normalización de transcripción en Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17.) Broadmann et al. (2002) hace referencia a la detección de PCR cuantitativa en tiempo real del contenido de maíz transgénico en alimentos para cuatro variedades diferentes de maíz aprobadas en la Unión Europea. Broadmann, P. D., P. D., Ilg E. C, Berthoud H., y Herrmann, A. Métodos de reacción en cadena de polimerasa cuantitativos en tiempo real para cuatro variedades de maíz genéticamente modificadas y contenido de ADN del maíz en los alimentos ("Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Contení in Food"). J. ofAOAC intemational 2002 85 (3) Hernández et al. (2004) mencionan cuatro genes posibles para su uso con PCR en tiempo real. Hernández, M. Duplan, M.-N., Berthier, G., Vaitilingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pía, M., y Bertheau, Y. Desarrollo y comparación de cuatro sistemas de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real para la detección y cuantificación específicas de Zea Mays L. ("Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L") J. Agrie. Food Chem. 2004, 52, 4632-4637.
Costa et al. (2007) observaron estos cuatro genes (también en el contexto de PCR en tiempo real) y llegaron a la conclusión de que los genes de zeína y alcohol deshidrogenasa eran los mejores genes de referencia para detectar un "evento" muestra (un gen de lectina) para cuestiones de mezcla de alimentos transgénicos. Costa, L D., y Martinelli L. Desarrollo de un método de PCR en tiempo real basado en plásmidos blanco dobles para determinar una mezcla de soja genéticamente modificada no esperada con componentes alimenticios. "Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components". J. Agrie. Food Chem. 2007, 55, 1264-1273.
Huang et al. (2004) empleó pMulM2 plásmido como moléculas de referencia para detectar los transgenes MON810 y NK603 en el maíz. Huang y Pan, Detección de MON810 y NK603 de maíz genéticamente modificado a través de métodos de multiplexación y reacción en cadena de polimerasas en tiempo real, ("Detection of Genetically Modified Maíze MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods") J. Agrie. Food Chem., 2004, 52 (11), pp 3264-3268.
Gasparic et al. (2008) sugieren una tecnología de LNA a partir de una comparación de tecnología de sonda cíclica, TaqMan, y varias químicas de PCR en tiempo real, para analizar en forma cuantitativa eventos de maíz (como ser MON810). Gasparic, Cankar, ¿el, y Gruden, Comparación de diferentes químicas de PCR en tiempo real y su adecuación en la detección y cuantificación de organismos genéticamente modificados ("Comparison of different real-time PCR chemistries and theirsuitability fordetection and quantification of genetically modified organisms") BMC Biotechnol. 2008; 8: 26.
La patente estadounidense 200770148646 hace referencia a un método de ampliación de cebador para la cuantificación que requiere una administración controlada de nucleótidos individuales que pueden ser detectados y cuantificados por la cantidad de nucleótidos incorporados. Esto es diferente del método de PCR de TaqMan que utiliza un gen de referencia interno.
Para distinguir entre genotipos homocigota y hemicigota de TC1507, se realizó con éxito un ensayo Invader para este evento. Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, T., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. y Thompson, S. Un ensayo Invader no basado en PCR detecta en forma cuantitativa genes de copia única en genomas vegetales complejos ("A nón-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes"). Mol. Breeding 2008, 21 , 173-181.
Huabang (2009) hace referencia a una prueba de cigosidad basada en PCR de maíz transgénico. No obstante, aparentemente no se emplearon genes de referencia. Huabang, Un método de prueba de cigosidad basada en PCR rápido y preciso para el maíz genéticamente modificado ("An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize") Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.3, 619-623.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, en parte, a métodos para detectar el evento de soja (Glycine max) AAD-12 designado como DAS-68 16- con semillas registradas ante la American Type Culture Collection (ATCC) con número de registro PTA-10442.
Más específicamente, la presente invención se refiere, en parte, a ensayos de PCR de TaqMan para el evento de soja AAD-12. Algunas formas de realización hacen referencia a ensayos que pueden ser sometidos a análisis de cigosidad de alto rendimiento. La invención en cuestión de la presente también se refiere, en parte, al descubrimiento de un gen de referencia de lectina preferido para su uso en la determinación de la cigosidad. Estos y otros procedimientos relacionados pueden ser utilizados para identificar en forma unívoca líneas de soja que comprenden el evento de la invención en cuestión de la presente.
Esta invención también se refiere, en parte, al cultivo mediante el uso de cualquiera de los métodos objeto de la presente. En algunas formas de realización, dicho evento/secuencia de polinucleótidos puede ser "agrupada" con otras características, entre las que se encuentran, por ejemplo, otro u otros genes de tolerancia a herbicidas y/o proteínas inhibidoras de insectos. No obstante, la invención en cuestión de la presente incluye plantas con el evento único, de acuerdo con lo descripto en la presente.
En forma adicional, la invención en cuestión de la presente provee ensayos para detectar la presencia del evento en cuestión de la presente en una muestra (de soja, por ejemplo). También se proveen kits y condiciones útiles para la realización de los ensayos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Se digirió ADN genómico del evento de soja DAS-68416-4 con EcoRV, o Pvu II y se lo utilizó para generar bibliotecas de GENOMEWALKER™ correspondientes, que fueron empleadas como plantillas para ampliar las secuencias de ADN blanco.
Figura 2. El diagrama esquemático representa las ubicaciones del cebador y la estrategia de clonación para una secuenciación de longitud completa del evento de soja DAS-68416-4 de bordes de 5' a 3'.
Figura 3. El diagrama esquemático representa las ubicaciones del cebador para confirmar la secuencia de longitud completa del evento de soja DAS-68416-4 de bordes de 5' a 3'.
Figura 4. El diagrama esquemático representa las ubicaciones del cebador para conformar la secuencia del sitio de inserción del evento de soja AAD-12 DAS-68416^.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 provee una secuencia de secuencias flanqueantes genómicas 5' y 3' en otro sitio del inserto de AAD- 2, incluyendo el inserto. Las secuencias flanqueantes se encuentran subrayadas.
SEQ ID NOs: 2 a 7 proveen secuencias para cebadores sondas para su uso de acuerdo con la invención en cuestión de la presente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se generó un evento de soja AAD-12 transgénica (con tolerancia a herbicidas) pDAB4468-416 mediante transformación Agrobacteríum. Se clonaron las secuencias flanqueantes 5' y 3' de este inserto transgénico AAD-12, se secuenció y caracterizó de acuerdo con lo detallado en la USSN 61/263.950 (presentada el 24 de noviembre de 2009). En algunas modalidades específicas, la AAD-12 está presente en sojas como el evento designado DAS-68416-4 que tiene la semilla depositada con la American Type Culture Collection (ATCC) con número de registro PTA-10442, y progenie derivada de la misma. 2500 semillas se depositaron de acuerdo con el Tratado de Budapest el 22 de octubre del 2009. El depósito se probó el 2 de noviembre del 2009, y en esa fecha las semillas estaban viables.
Se designaron cebadores y sondas TAQMAN específicos, según lo detallado en la presente, en parte, de acuerdo con las secuencias de ADN ubicadas en la región de unión entre el transgén y el ADN genómico huésped. La especificidad del evento de los cebadores y de la sonda fue testeada con éxito en formato doble con la lectina de soja como gen de referencia en PCR en tiempo real contra eventos de soja AAD-12 diferentes y soja no transgénica de variedad Maverick. Se desarrollaron los procedimientos para ensayos TAQMAN de evento específico terminal para el evento de soja AAD-12, de acuerdo con lo detallado en la presente.
La secuencia que abarca la región de la unión de integración entre el ADN de la planta huésped y el constructo de gen integrado en este evento de soja AAD-12 es una secuencia única. Fue utilizada para desarrollar ensayos de evento específico (PCR convencional o PCR en tiempo real) para detectar la presencia de un evento de soja AAD-12 pDAB4468-416 para una prueba de GMO y determinar el estado de cigosidad de las plantas en poblaciones de cultivo. El ensayo TAQMAN de evento específico informado en la presente puede ser empleado para ambas aplicaciones.
La invención en cuestión de la presente provee ensayos para detectar la presencia de un evento de soja transgénica DAS-68416 en una muestra. Entre los aspectos de la invención en cuestión de la presente se incluyen métodos para crear y/o producir cualquier molécula de ácido nucleico de diagnóstico ilustrada o sugerida en la presente. Las líneas de plantas que comprenden este evento pueden ser detectadas utilizando secuencias divulgadas y sugeridas en la presente.
De esta manera, en algunas formas de realización, la presente invención se refiere a la identificación de líneas de soja que toleran herbicidas. La invención en cuestión de la presente se refiere, en parte, a la detección de la presencia del evento en cuestión de la presente con el fin de determinar si la progenie de una cruza sexual contiene el evento en cuestión. Además, se incluye un método para detectar el evento y resulta útil, por ejemplo, para cumplir con las reglamentaciones que exigen la aprobación previa a la comercialización y el etiquetado de alimentos derivados, por ejemplo, de plantas de cultivos recombinantes.
Más específicamente, el evento es un evento AAD-12 también denominado pDAB4468-0416. La presente invención puede ser empleada para la selección y caracterización de estabilidad y expresión en toda la planta y en los niveles moleculares de generación en generación.
El gen sintético objeto de la presente (aad-12) utilizado de acuerdo con la invención en cuestión de la presente fue derivado de Delftia acidovorans y codifica una enzima capaz de desactivar varios herbicidas con un resto ariloxialcanoato, que incluye fenoxi-auxina (por ejemplo, 2,4-D, MCPA), así como también piridiloxi-auxinas (por ejemplo, fluoxipir, tricíopir). El gen aad-12, activado por activadores atUbUO, fue introducido en la línea de soja Maverick a través de técnicas Agrobacterium tumefaciens.
La invención en cuestión de la presente se refiere, en parte, a un ensayo de PCR TaqMan terminal basado en fluorescencia que utiliza un gen endógeno como control de referencia (número de copia) para el análisis de cigosidad de alto rendimiento del evento de soja AAD-12. La invención en cuestión de la presente también se refiere, en parte, al descubrimiento de un gen de referencia, invertasa. Se identificaron varios genes de referencia como opciones posibles.
La invención en cuestión de la presente también se refiere, en parte, al desarrollo de una PCR TaqMan terminal biplex para el análisis de cigosidad de evento de soja AAD-12 específico. Además, la invención en cuestión de la presente se refiere, en parte, al desarrollo de kits de prueba de cultivo de AAD-12.
Los ensayos TaqMan terminales se basan en una estrategia más/menos, donde "más" significa que la muestra es positiva para el gen sometido a ensayo, y "menos" significa que la muestra es negativa para el gen sometido al ensayo. Estos ensayos utilizan, típicamente, dos conjuntos de oligonucleótidos para identificar la secuencia de transgén AAD-12 y la secuencia de genes de tipo salvaje, respectivamente, así como también las sondas de doble etiqueta para medir el contenido de transgén y secuencia de tipo salvaje.
Aunque el ensayo Invader ha sido una técnica sólida para caracterizar eventos, es muy sensible a la calidad del ADN. Además, este ensayo requiere de una alta calidad de ADN. El ensayo Invader también requiere de un paso de desnaturalizado adicional que, de no ser manejado con propiedad, puede provocar el fracaso del ensayo Invader. En forma adicional, el tiempo más prolongado del ensayo Invader está limitado en su flexibilidad para que pueda manejar con eficiencia grandes cantidades de muestras de evento AAD-12 416 para su análisis en un ámbito comercial. Una ventaja principal de la invención en cuestión de la presente consiste en el ahorro de tiempo y en la eliminación del paso de desnaturalizado.
El análisis TaqMan terminal objeto de la presente para detectar eventos de AAD-12 416 ofrece ventajas sorprendentes respecto del ensayo Invader, en particular en el análisis de una gran cantidad de muestras.
En la presente, se proveen definiciones y ejemplos para colaborar en la descripción de la presente invención y guiar a los expertos en el arte para poner en práctica la invención. A menos que se lo indique de otra manera, los términos deben entenderse de acuerdo al uso convencional de los expertos en el arte relevante. Se emplea la nomenclatura para las bases de ADN de la forma establecida en 37 CFR §1.822.
De la forma utilizada en la presente, el término "progenie" indica la descendencia de cualquier generación de una planta madre que comprenda el evento de soja AAD-12 DAS-68416-4.
Un "evento" transgénico es producido por transformación de células de una planta con ADN heterólogo, es decir, un constructo de ácido nucleico que incluye un transgén en cuestión, la regeneración de una población de plantas que resulta de la inserción del transgén en un genoma de la planta, y la selección de una planta en particular caracterizada por la inserción en una ubicación del genoma especial. El término "evento" hace referencia al transformante original y a la progenie del transformante que incluye el ADN heterólogo. El término "evento" también hace referencia a la progenie producida por un cruzamiento sexual entre el transformante y otra variedad que incluye ADN genómico/transgénico. Incluso después de un retrocruzamiento repetido con un progenitor recurrente, el ADN de transgenes insertados y ADN genómico flanqueante (ADN genómico/de transgenes) desde el progenitor transformado está presente en la progenie de la cruza en la misma ubicación cromosómica. El término "evento" también hace referencia al ADN del transformante original y a la progenie del mismo que comprende el ADN insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado que se esperaría fuera transferido a una progenie que reciba el ADN insertado incluyendo el transgén en cuestión como resultado de una cruza sexual de una línea parenteral que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y la progenie resultante de autofecundación) y una línea parenteral que no contenga el ADN insertado.
Una "secuencia de unión" abarca el punto en el que el ADN insertado en el genoma es vinculado con el ADN desde el genoma nativo de la soja que flanquea el punto de inserción, la identificación o la detección de una o las otras secuencias de unión en el material genético de la planta que es suficientemente diagnóstico para el evento. Se incluyen las secuencias de ADN que abarcan las inserciones en los eventos de soja descriptos en la presente y longitudes similares de ADN flanqueante. En la presente, se proveen ejemplos específicos de dichas secuencias de diagnóstico; no obstante, otras secuencias que se superponen con las uniones de las inserciones, o las uniones de las inserciones y la secuencia genómica, también son de diagnóstico y podrían ser utilizadas de acuerdo con la invención en cuestión de la presente.
La invención en cuestión de la presente se refiere a la identificación de dichas secuencias flanqueantes, de unión y de inserción. Los cebadores de PCR relacionados y los amplicones están incluidos en la invención. De acuerdo con la invención en cuestión de la presente, los métodos de análisis de PCR que emplean amplicones que abarcan ADN insertado, y sus limites pueden ser utilizados para detectar o identificar variedades de soja transgénica comercializada de las líneas de soja transgénica de propiedad exclusiva.
Todas las secuencias de cada uno de estos insertos, junto con las porciones de las secuencias flanqueantes respectivas, son provistas en la presente como SEQ ID NO: 1. Las coordenadas de las secuencias de inserto y flanqueantes para este evento respecto de la SEQ ID NO: 1 (10.212 pares base en total) se encuentran indicadas a continuación.
Flanqueante 5' De inserción Flanqueante 3' N.° de residuo 1-2730 2731-9121 9122-10.212 (SEQ: 1): longitud (bp): 2.730 bp 6.391 bp 1.091 bp Los componentes de las secuencias de inserción y flanqueantes son ¡lustradas en forma adicional en las Figuras 1 a 4.
Las técnicas de detección de la invención en cuestión de la presente son especialmente útiles junto con el cultivo de plantas, con el fin de determinar qué plantas de la progenie comprenden un evento dado, después de que una planta progenitora que comprenda un evento en cuestión sea cruzada con otra línea de plantas en un esfuerzo por impartir una o más características adicionales en cuestión en la progenie. Estos métodos de análisis benefician los programas de cultivo de soja, así como también el control de calidad, en especial, para semillas de soja transgénicas comercializadas. Ahora también pueden producirse y utilizarse kits de detección para estas líneas de soja transgénica. Asimismo, puede beneficiar el registro y la administración del producto. Esto puede emplearse para estrategias de cultivos acelerados y para establecer datos de vinculación.
Las secuencias provistas en la presente pueden ser utilizadas para estudiar y caracterizar procedimientos de integración de transgenes, características de sitio de integración genómica, clasificación de eventos, estabilidad de transgenes y sus secuencias flanqueantes, y expresión de genes (en especial, relacionado con el silenciamiento de genes, los patrones de metilación de transgenes, efectos de posición y elementos relacionados con la expresión potencial como ser MARS (regiones de anclaje de matriz), y similares).
Además, la invención en cuestión de la presente incluye la selección de plantas descendientes y/o de progenie, de preferencia, una planta de soja resistente a los herbicidas, donde dicha planta presente un genoma que comprenda un inserto de ADN detectable de acuerdo con lo descripto en la presente. Según se lo emplea en la presente, el término "soja" significa Glycine max e incluye todas las variedades que puedan ser cultivadas con una planta de soja.
Esta invención incluye, además, procesos de realización de cruzas utilizando una planta de la invención en cuestión de la presente como al menos un progenitor. Esta invención incluye un método para producir una semilla híbrida Fi mediante el cruzamiento de una planta ejemplificada con una planta diferente (por ejemplo, un progenitor endogámico) y la cosecha de la semilla híbrida resultante. Las características de las plantas resultantes (cualquiera femenina) pueden ser mejoradas mediante una consideración minuciosa de las plantas progenitoras.
Una planta de soja que tolera los herbicidas puede ser producida por un primer cruzamiento sexual de una primera planta de soja parenteral que consiste en una planta de soja que se desarrolla a partir de una semilla de una cualquiera de las líneas referidas en la presente, y una segunda planta de soja parenteral, lo cual produce una pluralidad de plantas de primera progenie; y luego, por la selección de una planta de primera progenie que resista a un herbicida (o que procese al menos uno de los eventos de la invención en cuestión de la presente); y la autofecundación de la planta de primera progenie, lo cual produce una pluralidad de plantas de segunda progenie; y luego, la selección a partir de las plantas de segunda progenie, de una planta que sea resistente a un herbicida (o que posea al menos uno de los eventos de la invención en cuestión de la presente). Estos pasos pueden incluir, además, el retrocruzamiento de la planta de primera progenie o la planta de segunda progenie con la segunda planta de soja parenteral o una tercera planta de soja parenteral. Luego, puede plantarse un cultivo de soja que comprende semillas de la invención en cuestión de la presente, o su progenie.
Asimismo, cabe destacar que también pueden cruzarse dos plantas transgénicas diferentes para producir descendencia que contenga dos genes exógenos, agregados, de segregación independiente. La autofecundación de una progenie apropiada puede producir plantas que sean homocigotas para ambos genes exógenos agregados. También se contempla el retrocruzamiento con una planta parenteral y el cruzamiento con una planta no transgénica, como la propagación vegetativa. En el arte, se conocen otros métodos de cruzamiento comúnmente utilizados para diferentes características y cultivos. La producción por retrocruzamiento ha sido utilizada para transferir genes respecto de una característica altamente heredable, de simple herencia. La fuente de la característica a ser transferida es denominada progenitor donante. Se espera que la planta resultante presente los atributos del progenitor recurrente (por ejemplo, el cultivar) y la característica conveniente transferida desde el progenitor donante. Después de la cruza inicial, los individuos que procesan el fenotipo del progenitor donante son seleccionados y cruzados repetidas veces (retrocruzamiento) con el progenitor recurrente. Se espera que el progenitor resultante presente los atributos del progenitor recurrente (por ejemplo, el cultivar) y la característica conveniente transferida desde el progenitor donante.
La presente invención se puede utilizar con marcadores moleculares en un método de cruzamiento asistido por marcadores (MAB). Las moléculas de ADN de la presente invención pueden ser empleadas en métodos (como ser marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, SNPs y SSRs) que identifican características útiles desde el punto de vista agronómico genéticamente vinculadas, de acuerdo con lo conocido en el arte. La característica de resistencia a un herbicida puede rastrearse en la progenie de una cruza con una planta de soja de la invención en cuestión de la presente (o su progenie y otro cultivar de soja o variedad) mediante el uso de métodos MAB. Las moléculas de ADN son marcadores para esta característica, y los métodos MAB que resultan conocidos en el arte también pueden ser empleados para realizar un seguimiento de la o las características de resistencia a un herbicida en plantas de soja donde al menos una línea de soja de la invención en cuestión de la presente, o su progenie, fuera un progenitor o ancestro. Los métodos de la presente invención pueden ser empleados para identificar cualquier variedad de soja que presente el evento en cuestión de la presente.
Los métodos de la invención en cuestión de la presente incluyen un método para producir una planta de soja que tolere un herbicida donde dicho método comprende el cruzamiento con una planta de la invención en cuestión de la presente. Más específicamente, dichos métodos pueden comprender el cruzamiento de dos plantas de la invención en cuestión de la presente, o una planta de la invención en cuestión de la presente y cualquier otra planta. Los método preferidos comprenden, además, la selección de la progenie de dicho cruzamiento mediante el análisis de dicha progenie para un evento que puede detectarse de acuerdo con la invención en cuestión de la presente. Por ejemplo, la invención en cuestión de la presente puede ser utilizada para rastrear el evento en cuestión de la presente a través de ciclos de cruzamiento con plantas que comprenden otras características convenientes, como ser características agronómicas como ser las que son puestas a prueba en la presente en sus diversos ejemplos. Las plantas que comprenden el evento en cuestión de la presente y la característica conveniente pueden ser detectadas, identificadas, seleccionadas y rápidamente utilizadas, por ejemplo, en otros cruzamientos. La característica/evento en cuestión de la presente también pueden ser combinados por cruzamiento, y pueden ser rastreados de acuerdo con la invención en cuestión de la presente, con una o más características de resistencia a un insecto y/o con otras características de tolerancia a un herbicida. Una forma de realización preferida de esto último es una planta que comprende el evento en cuestión de la presente combinada con un gen que codifique la resistencia al herbicida dicamba.
El evento en cuestión de la presente puede combinarse, por ejemplo, con características que codifiquen la resistencia al glifosato (por ejemplo, una planta resistente o EPSPS, GOX, GAT bacterial), resistencia al glufosinato (por ejemplo, Pat, Bar), resistencia al herbicida inhibidor de acetolactato sintasa (ALS) (por ejemplo, imidazoles [como ser imazetapir], sulfonilureas, tríazolopirimidina sulfonanilída, pirmidiniltiobenzoatos, y otros químicos [Csr1, SurA, et al.]), resistencia al bromoxinil (por ejemplo, Bxn), resistencia a inhibidores de enzima HPPD (4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenasa), resistencia a inhibidores de fitoeno desaturasa (PDS), resistencia a herbicidas inhibidores de fotosistema II (por ejemplo, psbA), resistencia a herbicidas inhibidores de fotosistema I, resistencia a herbicidas inhibidores de protoporfirinogen oxidasa IX (PPO) (por ejemplo PPO-1), resistencia a herbicidas de fenilurea (por ejemplo, CYP76B1), enzimas degradantes de Dicamba (referirse, por ejemplo, al documento US 20030135879), y otros podrían estar agrupados solos o en múltiples combinaciones de forma de proveer la capacidad de controlar o evitar con efectividad los cambios de malezas y/o la resistencia a cualquier herbicida de las clases arriba mencionadas.
Respecto de los herbicidas adicionales, algunos inhibidores preferidos de ALS (también conocidos como AHAS) incluyen las triazolopirimidina sulfonanilidas (como ser cloransulametilo, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam y penoxsulam), pirimidiniltiobenzoatos (como ser bispiribac y piritiobac), y flucarbazona. Entre algunos inhibidores de HPPD preferidos se encuentran la mesotriona, isoxaflutol y la sulcotriona. Algunos inhibidores de PPO preferidos incluyen flumiclorac, flumioxazina, flufenpir, piraflufeno, flutiacet, butafenacilo, carfentrazona, sulfentrazona y los éteres difenílicos (como ser acifluorfeno, fomesafeno, lactofeno y oxifluorfeno).
En forma adicional, el AAD-12 solo o junto con una o más características de HTC adicionales puede ser agrupado con una o más características adicionales de entrada (por ejemplo, resistencia a insectos, resistencia fúngica, o tolerancia a la tensión, ef al.) o de salida (por ejemplo, un mayor rendimiento, mejor perfil oleoso, mejor calidad de fibra, et al.). De esta forma, la invención en cuestión de la presente puede ser utilizada para proveer un paquete agronómico completo de calidad de cultivo mejorada con la capacidad de controlar en forma flexible y con una buena relación costo-beneficio de cualquier cantidad de plagas agronómicas.
La enzima AAD-12 objeto de la presente permite una expresión transgénica que da como resultado la tolerancia a combinaciones de herbicidas que controlarían casi todas las malezas y hierbas latifoliadas. AAD-12 puede servir de excelente característica para cultivos tolerantes a herbicidas (HTC) para ser unida a otras características de HTC (por ejemplo resistencia al glifosato, resistencia al glufosinato, resistencia a la imidazolinona, resistencia al bromixinilo, et al.) y características de resistencia a insectos (CrylF, CryIAb, Cry 34/45, era/.) por ejemplo. En forma adicional, AAD-12 puede servir de marcador susceptible de ser seleccionado para colaborar en la selección de transformantes primarios de plantas creadas por ingeniería genética con un segundo gen o grupo de genes.
Las características de HTC de la invención en cuestión de la presente pueden ser empleadas en combinaciones nuevas con otras características de HTC (entre las que se incluyen, pero sin que la enumeración sea taxativa, la tolerancia al glifosato). Estas combinaciones de características dan origen a nuevos métodos para controlar las especies de malezas (y similares), debido a la resistencia recientemente adquirida o tolerancia inherente a los herbicidas (por ejemplo, glifosato). De esta manera, además de las características de HTC, nuevos métodos para controlar malezas mediante el uso de herbicidas, para los que se creó una tolerancia al herbicida a través de dicha enzima en cultivos transgénicos, se encuentran dentro del alcance de la invención.
En forma adicional, prevalecen los cultivos tolerantes al glifosato que se desarrollan en todo el mundo. Muchas veces, en la rotación con otros cultivos tolerantes al glifosato, el control de voluntarios resistentes al glifosato puede ser difícil en los cultivos de rotación. De esta manera, el uso de características transgénicas objeto de la presente, agrupadas o transformadas en forma individual en cultivos, provee una herramienta para controlar otros cultivos voluntarios de HTC.
A menos que se lo indique de otra manera, las menciones a secuencias flanqueantes hacen referencia a aquellas identificadas con respecto a la SEQ ID NO: 1 (referirse al cuadro anterior). Nuevamente, SEQ ID NO: 1 incluye el ADN heterólogo insertado en el transformante original y secuencias genómicas flanqueantes ilustrativas inmediatamente adyacentes al ADN insertado. Podría esperarse que la totalidad o parte de estas secuencias flanqueantes sean transferidas a la progenie que recibe el ADN insertado como resultado de un cruzamiento sexual de una línea parental que incluye el evento.
De la forma utilizada en la presente, el término "línea" hace referencia a un grupo de plantas que muestran un poco o ninguna variación genética entre los individuos en al menos una característica. Dichas líneas pueden ser creadas por varias generaciones de autopolinización y selección, o propagación vegetativa a partir de un único progenitor mediante el uso de técnicas de cultivo de tejido o células.
De acuerdo con lo utilizado en la presente, los términos "cultivar" y "variedad" son sinónimos y hacen referencia a una línea que es empleada para producción comercial.
El término "estabilidad" o "estable" significa que, respecto del componente dado, el componente es mantenido de generación en generación y, de preferencia, al menos tres (3) generaciones básicamente en el mismo nivel, por ejemplo, de preferencia ± 15%, de mayor preferencia ± 10%, siendo el más preferido de ± 5%. La estabilidad puede verse afectada por la temperatura, la ubicación, la tensión y el momento en que se planta. La comparación de generaciones posteriores en condiciones de campo debe producir el componente en una forma similar.
La expresión "de uso comercial" es definida como una planta de gran vigor y alta fertilidad, de manera que los cultivos puedan ser generados por los productores mediante el uso de equipos agropecuarios convencionales, y pueda extraerse el aceite de la semilla con los componentes descriptos a través del uso de equipos de trituración y extracción convencionales. Para que el rendimiento sea de uso comercial, según su medición por peso en semillas, contenido de aceite y aceite total producido por hectárea, debe encontrarse dentro del 15% del rendimiento promedio de una variedad de soja comercial comparable de otra manera sin las características de primera calidad desarrolladas en la misma región.
La expresión "selecta desde el punto de vista agronómico" significa que una línea cuenta con características agronómicas convenientes como ser rendimiento, madurez, resistencia conveniente, y similares, además de la resistencia a insectos debido al o los eventos objeto de la presente. Las características agronómicas, tomadas en forma individual o en cualquier combinación, de la manera establecida en los Ejemplos, más abajo, en una planta que comprende un evento de la invención en cuestión de la presente, se encuentran dentro del alcance de la invención en cuestión de la presente. Cualquiera o la totalidad de estas características agronómicas y puntos de datos pueden ser empleados para identificar dichas plantas, ya sea como un punto o en uno o en ambos extremos de una variedad de características empleadas para definir dichas plantas.
De la forma que puede reconocer el experto en el arte a la luz de esta divulgación, las formas de realización preferidas para kits de detección, por ejemplo, pueden incluir sondas y/o cebadores, entre los que se cuenta con sondas polinucleótidas y/o amplicones.
El o los cebadores que "anotan un tanto" en la secuencia flanqueante no están típicamente creados para hibridarse más allá de alrededor de 200 bases o más allá de la unión. De esta forma, los cebadores flanqueantes típicos estarían diseñados para comprender al menos 15 residuos de cualquier cadena dentro de las 200 bases en las secuencias flanqueantes a partir del comienzo del inserto. Es decir que los cebadores que comprenden una secuencia de un tamaño apropiado a partir de residuos (o hibridándose en ellos) -2530-2730 y/o -9122-9322 de la SEQ ID NO: 1 se encuentran dentro del alcance de la invención en cuestión de la presente. Los cebadores del inserto pueden ser creados, de otra forma, en cualquier lugar en el inserto, pero los residuos -2731-2931 y -8921-9121 pueden ser utilizados, por ejemplo, en forma no exclusiva para dicho diseño de cebador.
El experto en el arte también puede reconocer que los cebadores y las sondas pueden ser creados para hibridarse, según una variedad de condiciones de PCR y/o de hibridación estándar, en un segmento de la SEQ ID NO: 1 (o el complemento), y sus complementos, donde el cebador o la sonda no es perfectamente complementario con la secuencia ejemplificada. Es decir que puede tolerarse cierto grado de falta de correspondencia. Para un cebador nucleótido de aproximadamente 20, por ejemplo, lo típico es que uno o dos o más nucleótidos no necesiten unirse con la cadena opuesta si la base que no se corresponde es interna o en el extremo del cebador que es opuesto al amplicón A continuación, se proveen varias condiciones de hibridación apropiadas. También pueden emplearse en sondas, análogos de nucleótidos sintéticos como ser inosina. Las sondas de ácido péptido nucleico (PNA), así como también las sondas de ADN y ARN, también pueden ser utilizadas. Lo importante es que dichas sondas y dichos cebadores son de diagnóstico para (permitir identificar y distinguir en forma unívoca) la presencia de un evento de la invención en cuestión de la presente.
Los componentes del "inserto" son ilustrados en- las Figuras. Las secuencias de polinucleótido de ADN de estos componentes, o fragmentos de los mismos, pueden ser empleadas como sondas o cebadores de ADN en los métodos de la presente invención.
En algunas formas de realización de la invención, se proveen composiciones y métodos para detectar la presencia de la región de inserción de transgenes/genómica, en plantas y semillas y similares, a partir de una planta de soja. Se proveen secuencias de ADN, así como también los segmentos de ellas, y los complementos de las secuencias ejemplificadas y cualquier segmento de ellas.
Pueden emplearse estos y otros procedimientos relacionados para identificar en forma unívoca estas líneas de soja.
En algunas formas de realización, las secuencias de ADN que comprenden un fragmento contiguo de la región de inserción de transgenes/genómica nueva son un aspecto de esta invención. Se incluyen las secuencias de ADN que comprenden una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia de inserción de transgenes y una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia genómica de la soja a partir de una o más de las tres (3) plantas de soja arriba mencionadas y/o secuencias que resultan útiles como secuencias de cebador para la producción de un diagnóstico del producto de amplicón para una o más de estas plantas de soja.
Formas de realización relacionadas pertenecen a secuencias de ADN que comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, o más nucleótidos contiguos de una porción de transgenes de una secuencia de ADN identificada en la presente (como ser la SEQ ID NO: 1 y sus segmentos), o sus complementos, y una longitud similar de la secuencia de ADN de soja flanqueante a partir de estas secuencias, o sus complementos. Dichas secuencias son útiles como cebadores de ADN en métodos de amplificación de ADN. Los amplicones producidos mediante el uso de estos cebadores son de diagnóstico para cualquiera de los eventos de soja mencionados en la presente. Por lo tanto, la invención también incluye los amplicones producidos por dichos cebadores de ADN y cebadores homólogos.
Esta invención también incluye métodos para detectar la presencia de ADN, en una muestra, que corresponde al evento de soja mencionado en la presente. Dichos métodos pueden comprender: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un conjunto de cebadores que, cuando se los utiliza en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN a partir de al menos uno de estos eventos de soja, produce un amplicón que es de diagnóstico para dicho o dichos eventos; (b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, lo que produce el amplicón; y (c) detectar el amplicón.
Entre otros métodos de detección de la invención en cuestión de la presente se incluye un método para detectar la presencia de un ADN, en una muestra, correspondiente a al menos uno de dichos eventos, donde dicho método comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se híbrida bajo condiciones de hibridación restrictivas con el ADN de al menos uno de dichos eventos de soja y que no se híbrida bajo condiciones de hibridación restrictivas con una planta de soja control (ADN que no se corresponde con el evento en cuestión); (b) someter la muestra y la sonda a condiciones de hibridación restrictivas; y (c) detectar la hibridación de la sonda en el ADN.
En otras formas de realización, la invención en cuestión de la presente incluye métodos para producir una planta de soja que comprende el evento aad-12 de la invención en cuestión de la presente, donde dicho método comprende los pasos de: (a) cruzar sexualmente una primera linea de soja parental (que comprende un cásete de expresión de la presente invención, que le confiere dicha característica de resistencia al herbicida a las plantas de dicha línea), y una segunda línea de soja parental (que carece de esta característica de tolerancia al herbicida), lo cual produce una pluralidad de plantas de progenie; y (b) seleccionar una planta de progenie mediante el uso de la invención en cuestión de la presente. Dichos métodos pueden comprender, en forma opcional, el otro paso de retrocruza miento de la planta de progenie con la segunda línea de soja parental para producir una planta de soja de cruzamiento puro que comprende dicha característica de tolerancia al herbicida.
De acuerdo con algunas formas de realización de la invención en cuestión de la presente, se proveen métodos para determinar la cigosidad de la progenie de un cruzamiento. Dichos métodos pueden comprender poner en contacto una muestra, que comprenda ADN de soja, con un conjunto de cebadores de la invención en cuestión de la presente. Dichos cebadores, al ser utilizados en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico a partir de al menos uno de dichos eventos de soja, producen un primer amplicón que es de diagnóstico para al menos uno de dichos eventos de soja. Dichos métodos comprenden, además, llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, lo que produce el primer amplicón; detectar el primer amplicón; y poner en contacto la muestra que comprende ADN de soja con dicho conjunto de cebadores, que al ser utilizados en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico a partir de plantas de soja, produce un segundo amplicón que comprende el ADN genómico de soja nativo homólogo a la región genómica de soja; y llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, lo que produce el segundo amplicón. Los métodos comprenden, además, detectar el segundo amplicón y comparar el primero y el segundo amplicones en una muestra, donde la presencia de ambos amplicones indica que la muestra es heterocigótica para la inserción de transgenes.
Los kits de detección de ADN que emplean las composiciones son divulgados en la presente y los métodos conocidos en el arte de la detección de ADN. Los kits resultan útiles para la identificación del ADN del evento de soja objeto de la presente en una muestra y pueden ser aplicados a métodos para el cruzamiento de plantas de soja que contengan este ADN. Los kits contienen secuencias de ADN homologas o complementarias a los amplicones, por ejemplo, divulgados en la presente, o a las secuencias de ADN homologas o complementarias al ADN contenido en los elementos genéticos de transgenes de los eventos objeto de la presente. Estas secuencias de ADN pueden ser utilizadas en reacciones de amplificación de ADN o como sondas en un método de hibridación de ADN. Los kits también pueden contener los reactivos y los materiales necesarios para llevar a cabo el método de detección.
Una "sonda" es una molécula de ácido nucleico aislada que está unida a una etiqueta detectable convencional o molécula informante (como ser un isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima). Una sonda como esta es complementaria a una cadena de ácido nucleico blanco, en el caso de la presente invención, respecto de una cadena de ADN genómico a partir de uno de dichos eventos de soja, ya sea a partir de una planta de soja o de una muestra que incluya ADN del evento. Las sondas de acuerdo con la presente invención incluyen no solo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otro tipo de materiales de sonda que se unen en forma específica a una secuencia de ADN blanco y pueden ser utilizadas para detectar la presencia de esa secuencia de ADN blanco.
Los "cebadores" son ácidos nucleicos aislados/sintetizados que son templados a una cadena de ADN blanco complementaria mediante la hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN blanco, luego ampliada a lo largo de la cadena de ADN blanco por una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Los pares de cebadores de la presente invención hacen referencia a su uso para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico blanco, por ejemplo, por medio de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácido nucleico convencionales.
Las sondas y los cebadores, en general, tienen una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471 , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491 , 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ó 500 polinucleótidos o más. Dichas sondas y cebadores se hibridan en especial con una secuencia blanco según condiciones de hibridación de alta rigurosidad. De preferencia, las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente invención cuentan con una similitud de secuencia completa con la secuencia blanco, aunque las sondas que difieren de la secuencia blanco y retienen la capacidad de hibridación en secuencias blanco pueden ser creadas por métodos convencionales.
Los métodos para preparar y utilizar las sondas y los cebadores son descriptos, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° edición, vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Los pares de PCR-cebador pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo, mediante el uso de programas de computación destinados a ese fin.
Los cebadores y las sondas que se basan en el ADN flanqueante y secuencias de inserción divulgados en el presente pueden ser empleados para confirmar (y, de ser necesario, para corregir) las secuencias divulgadas mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante la nueva clonación y secuenciación de dichas secuencias.
Los cebadores y las sondas de ácido nucleico de la presente invención se hibridan según condiciones restrictivas a una secuencia de ADN blanco. Puede emplearse cualquier método de amplificación o hibridación de ácido nucleico convencional para identificar la presencia de ADN a partir de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o sus fragmentos son capaces de hibridarse es particular con otras moléculas de ácido nucleico según determinadas circunstancias. De acuerdo con lo utilizado en la presente, se considera que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse en particular entre sí si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico de cadena doble, antiparalela. Se considera que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si muestran una complementariedad total. De la forma utilizada en la presente, se considera que las moléculas muestran una "complementariedad total" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario con un nucleótido de la otra. Se considera que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridarse entre sí con la suficiente estabilidad como para permitirles permanecer templadas entre sí según al menos condiciones convencionales de "baja rigurosidad". De forma similar, se considera que las moléculas son "complementarias" si pueden hibridarse entre sí con la suficiente estabilidad como para permitirles permanecer templadas entre sí según condiciones convencionales de "alta rigurosidad". Las condiciones de rigurosidad convencionales son descriptas por Sambrook er a/., 1989. Por lo tanto, resultan permisibles las desviaciones de una complementariedad total, siempre que dichas desviaciones no imposibiliten por completo la capacidad de las moléculas de formar una estructura de cadena doble. Con el fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, necesita solo ser lo suficientemente complementaria en secuencia de manera de permitir formar una estructura de cadena doble estable según las concentraciones de sales y solventes particulares empleadas.
De acuerdo con lo utilizado en la presente, una secuencia sustancialmente homóloga es una secuencia de ácido nucleico que se híbrida en especial con el componente de la secuencia de ácido nucleico con la que es comparada según las condiciones de alta rigurosidad. La expresión "condiciones de rigurosidad" es definida en términos funcionales respecto de la hibridación de una sonda de ácido nucleico con un ácido nucleico blanco (es decir, con una secuencia de ácido nucleico en particular de interés) mediante el procedimiento de hibridación específico analizado en Sambrook et al., 1989, en 9.52-9.55. Referirse asimismo a Sambrook et al., 1989 en 9.47-9.52 y 9.56-9.58. En consecuencia, las secuencias nucleótidas de la invención pueden ser empleadas por su capacidad de formar, de manera selectiva, moléculas dobles con tramos complementarios de fragmentos de ADN.
Según la aplicación prevista, puede utilizarse una variedad de condiciones de hibridación para lograr diversos grados de selectividad de sonda respecto de la secuencia blanco. Para aplicaciones que requieren de una alta selectividad, se emplearán típicamente, condiciones relativamente restrictivas para formar los híbridos, por ejemplo, se seleccionarán condiciones de alta temperatura y/o bajas sales, como las provistas por NaCI entre aproximadamente 0.02 M y aproximadamente 0.15 a temperaturas de alrededor de entre 50 °C y alrededor de 70 °C. Por ejemplo, las condiciones restrictivas podrían involucrar el lavado del filtro de hibridación al menos dos veces con un tampón de lavado de alta rigurosidad (0.2X SSC, 0.1% SDS, 65 °C). Los expertos en el arte conocen las condiciones restrictivas apropiadas que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6.0X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de un lavado de 2.0X de SSC a 50 °C. Por ejemplo, la concentración de sal en el paso de lavado puede ser seleccionada entre una baja rigurosidad de alrededor de 2.0X de SSC a 50 °C y una alta rigurosidad de alrededor de 0.2 de SSC a 50 °C. Además, la temperatura en el paso de lavado puede ser aumentada desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, a alrededor de 22 °C, hasta condiciones de alta rigurosidad a alrededor de 65 °C. Tanto la temperatura como la sal pueden variar, o bien puede mantenerse constante la temperatura o la concentración de sal mientras cambia la otra variable. Dichas condiciones selectivas toleran un poco de la falta de correspondencia, de presentarse, entre la sonda y la cadena blanco o plantilla. La detección de secuencias de ADN a través de hibridación resulta conocida para los expertos en el arte, y las enseñanzas de las patentes estadounidenses números 4.965.188 y 5.176.995 ilustran los métodos de análisis de hibridación.
En una forma de realización en particular preferida, un ácido nucleico de la presente invención se hibridará de manera específica con uno o más de los cebadores (o amplicones u otras secuencias) ejemplificados o sugeridos en la presente, incluso componentes y fragmentos de ellos, según condiciones de alta rigurosidad. En un aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcador de la presente invención tiene la secuencia de ácido nucleico de la forma establecida en la presente en una de las secuencias ejemplificadas, o sus componentes y/o fragmentos.
En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcador de la presente invención comparte entre 80% y 100% o entre 90% y 100% de la identidad de secuencia con dichas secuencias de ácido nucleico. En otro aspecto de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcador de la presente invención comparte entre 95% y 100% de la identidad de secuencia con dicha secuencia. Dichas secuencias pueden ser empleadas como marcadores en métodos de fitomejoramiento para identificar la progenie de entrecruzamientos genéticos. La hibridación de la sonda con la molécula de ADN blanco puede ser detectada mediante cualquier cantidad de métodos conocidos para los expertos en el arte; entre ellos, se encuentran los siguientes, sin que la enumeración sea taxativa: etiquetas fluorescentes, etiquetas radioactivas, etiquetas basadas en anticuerpos y etiquetas quimioluminiscentes.
Respecto de la amplificación de una secuencia de ácido nucleico blanco (por ejemplo, por PCR), mediante el uso de un par de cebadores de amplificación en particular, las "condiciones de rigurosidad" son condiciones que permiten que el par de cebadores se hibriden solo con la secuencia de ácido nucleico a la que solo un cebador con la secuencia de tipo salvaje correspondiente (o su complemento) estaría unido y de preferencia, daría un producto de amplificación único, el amplicón.
La expresión "especifico para (una secuencia blanco)" indica que una sonda o un cebador se híbrida según condiciones de hibridación restrictivas solo con la secuencia blanco en una muestra que comprende la secuencia blanco.
De la forma empleada en la presente, la expresión "ADN amplificado" o el término "amplicón" hace referencia al producto de la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico blanco que es parte de una plantilla de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si la planta de soja que resulta de una cruza sexual contiene ADN genómico del evento transgénico a partir de la planta de soja de la presente invención, el ADN extraído de una muestra de tejido vegetal de soja puede ser sometido al método de amplificación de ácido nucleico mediante el uso de un par de cebadores que incluye un cebador derivado de una secuencia flanqueante en el genoma de la planta adyacente al sitio de inserción del ADN heterólogo insertado, y un segundo cebador derivado del ADN heterólogo insertado para producir un amplicón que es de diagnóstico para la presencia del ADN del evento. El amplicón tiene una longitud y una secuencia que también es de diagnóstico para el evento. El amplicón puede variar de longitud desde una longitud combinada de los pares de cebadores más un par de base nucleótida, y/o la longitud combinada de los pares de cebadores más aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 121, 122, 123 , 124, 125, 126, 127 128 129, 130, 131 132, 133 134, 135 136 137 138, 139 , 140, 141, 142, 143 144 145, 146, 147 148, 149 150, 151 152 153 154, 155 , 156, 157, 158, 159 160 161, 162, 163 164, 165 166, 167 168 169 170, 171 , 172, 173, 174, 175 176 177, 178, 179 180, 181 182, 183 184 185 186, 187 , 188, 189, 190, 191 192 193, 194, 195 196, 197 198, 199 200 201 202, 203 , 204, 205, 206, 207 208 209,210,211 212,213 214,215 216 217 218,219 ,220, 221,222, 223 224 225, 226, 227 228, 229 230, 231 232 233 234, 235 , 236, 237, 238, 239 240 241,242,243 244, 245 246, 247 248 249 250,251 , 252, 253, 254, 255 256 257, 258, 259 260, 261 262, 263 264 265 266, 267 , 268, 269, 270, 271 272 273, 274, 275 276, 277 278, 279 280 281 282, 283 , 284, 285, 286, 287 288 289, 290, 291 292, 293 294, 295 296 297 298, 299 , 300, 301, 302, 303 304 305, 306, 307 308, 309 310,311 312 313 314, 315 , 316, 317, 318, 319 320 321, 322, 323 324, 325 326, 327 328 329 330, 331 , 332, 333, 334, 335 336 337, 338, 339 340, 341 342, 343 344 345 346, 347 , 348, 349, 350, 351 352 353, 354, 355 356, 357 358, 359 360 361 362, 363 , 364, 365, 366, 367 368 369, 370, 371 372, 373 374, 375 376 377 378, 379 ,380, 381,382, 383 384 385, 386, 387 388, 389 390, 391 392 393 394, 395 , 396, 397, 398, 399 400401,402,403404, 405 406, 407 408 409 410,411 ,412,413,414, 415 416417,418,419 420, 421 422, 423 424 425426, 427 , 428, 429, 430, 431 432 433, 434, 435 436, 437 438, 439 440 441 442, 443 , 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 , 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 , 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471 , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491 , 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, o 500, 750, 1000, 250, 1500, 1750, 2000, o más pares de base nucleótida (más o menos cualquiera de los aumentos mencionados con anterioridad). En forma alternativa, un par de cebadores puede derivar de una secuencia flanqueante a ambos lados del ADN insertado de manera de producir un amplicón que incluya la secuencia de nucleótido de inserción total. Puede colocarse un miembro de un par de cebadores derivados de la secuencia fitogenómica a una distancia de la secuencia de ADN insertada. Esta distancia puede variar de un par de base nucleótida hasta alrededor de veinte mil (20.000) pares de base nucleótida. El uso del término "amplicón" excluye específicamente los dímeros de cebador que pueden formarse en la reacción de amplificación térmica del ADN.
La amplificación del ácido nucleido puede lograrse por medio de cualquiera de los diversos métodos de amplificación de ácido nucleico conocidos en el arte, incluso la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el arte, se conoce una variedad de métodos de amplificación y son descriptos, interalia, en las patentes estadounidenses números 4.683.195 y 4.683.202. Se han desarrollado métodos de amplificación de PCR para amplificar hasta 22 kb de ADN genómico. Estos métodos, así como también otros conocidos en el arte de la amplificación de ADN pueden ser empleados en la práctica de la presente invención. La secuencia de la secuencia genómica flanqueante o inserto de ADN de transgenes heterólogo a partir de un evento de soja objeto de la presente puede ser verificada (y corregida, de ser necesario) mediante la amplificación de dichas secuencias a partir del evento a través del uso de cebadores derivados de las secuencias provistas en la presente seguido de la secuenciación de ADN estándar del amplicón de PCR o del ADN clonado.
El amplicón producido por estos métodos puede ser detectado mediante una pluralidad de técnicas. Un método conocido para detectar amplicones de ADN es el de electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Otro de dichos métodos es el Genetic BitAnalysis donde se diseña un oligonucleótido de ADN que superpone ambas secuencias, la de ADN genómico flanqueante adyacente y la de ADN insertado. El oligonucleótido es inmovilizado en cubetas de una placa de microcavidades. Después de la PCR de la región de interés (mediante el uso de un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), puede hibridarse un producto de PCR de cadena única con el oligonucleótido inmovilizado y sirve como plantilla para una reacción de extensión de base única mediante el uso de una ADN polimerasa con etiqueta ddNTPs especifica para la base que se espera a continuación. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueante debido a una amplificación exitosa, hibridación y extensión de base única.
Todas las patentes, solicitudes de patentes, solicitudes provisorias y publicaciones mencionadas o citadas en la presente son incorporadas a modo de referencia en su totalidad siempre que no sean contradictorias con las enseñanzas explícitas de esta memoria.
Los siguientes ejemplos son incluidos para ilustrar procedimientos para poner en práctica la invención y demostrar ciertas formas de realización preferidas de la invención. Estos ejemplos no deben ser interpretados como limitativos. Los expertos en el arte sabrán apreciar que las técnicas divulgadas en los siguiente ejemplos representan abordajes específicos empleados para ilustrar modos preferidos para esta práctica. No obstante, los expertos en el arte deben apreciar, a la luz de la presente divulgación, que pueden realizarse muchos cambios en estas formas de realización específicas mientras se continúan obteniendo resultados similares sin alejarse del espíritu ni del alcance de la invención. A menos que se lo indique de otra manera, todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla solvente son en volumen a menos que se lo especifique de otra forma.
Se emplean las siguientes abreviaturas, a menos que se lo indique de otra manera.
AAD-12 ariloxialcanoato dioxigenasa-1 bp par de bases °C grados Celsius ADN ácido desoxirribonucleico DIG digoxigenina EDTA ácido etilendiamintetraacético kb kilobase g microgramo pL microlitro mi mililitro M masa molar OLP sonda de superposición PCR reacción en cadena de polimerasa PTU unidad de transcripción en plantas SDS dodecilsulfato sódico SOP procedimiento estándar de operación SSC una solución tampón que contiene una mezcla de cloruro de sodio y citrato de sodio, pH 7.0 TBE una solución tampón que contiene una mezcla de base Tris, ácido bórico y EDTA, pH 8.3 V voltios EJEMPLOS EJEMPLO 1.
Ensayo TaqMan de evento específico Se desarrolló un ensayo TAQMAN ASSAY® de evento específico para detectar la presencia del evento de soja DAS-68416-4 y para determinar el estado de cigosidad de plantas en poblaciones de cruzamiento. Para desarrollar un ensayo de evento específico, se diseñaron sondas y cebadores TaqMan específicos de acuerdo con las secuencias de ADN ubicadas en la unión 5' de inserto a planta. Para una detección especifica del evento de soja DAS-684 6-4, se amplificó un fragmento de ADN de 128 bp que abarca esta unión de integración de 5' mediante el uso de dos (2) cebadores específicos. La amplificación de este producto de PCR fue medida a través de una sonda MGB de blanco específico sintetizada por Applied Biosystems que contenía el informante de FAM en su extremo 5'. La especificidad de este método de detección de TaqMan para el evento de soja DAS-68416-4 fue testeada en comparación con 5 eventos de soja aad-12 diferentes y una variedad de soja no transgénica (Maverick) en formato doble con el gen de referencia endógeno de soja específico, lectina.
EJEMPLO 1.1.
Aislamiento de qADN Se sometieron a prueba muestras de gADN de 15 eventos de soja AAD-12 diferentes y variedades de soja no transgénica en este estudio. Se extrajo el ADN genómico mediante el uso del kit Qiagen DNeasy 96 Plant. Se utilizaron discos de hoja de soja fresca, ocho por muestra, para la extracción del gADN mediante el uso de un protocolo del kit Qiagen DNeasy 96 Plant modificado. Se cuantificó el gADN con el método de Pico Green de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR). Se diluyeron muestras en agua libre de DNasa, lo que dio como resultado una concentración de 10 ng/µ?. para el propósito de este estudio.
EJEMPLO 1.2.
Ensayo de TaqMan y sus resultados Se diseñaron sondas y cebadores de TaqMan específicos para un ensayo de TaqMan de evento de soja DAS-68416-4 específico. Estos reactivos pueden ser empleados con las condiciones enumeradas a continuación con el fin de detectar aad-12 dentro del evento de soja DAS-68416-4. El cuadro 1 enumera las secuencias de cebador y sonda que fueron desarrolladas en forma específica para la detección del evento DAS-68416-4.
CUADRO 1.
Las condiciones de PCR múltiple para la amplificación son las siguientes: 1X PCR tampón, .5 - 2.5 mM MgCI2, 0.2 mM dNTP, 0.2 µ? cebador de soja 416-F, 0.2 µ? cebador de soja 416-R, 0.2 µ? cebador ZN_007, 0.2 µ? cebador ZN_008, 0.08 µ? soja 416-sonda, 0.08 uM ZN_LT_002, 40 U/ml HotStart Taq, 30 ng gADIM en una reacción total de 25 µ?. Se amplificó el cóctel mediante el uso de las siguientes condiciones: i) 95 °C durante 15 min., ii) 95 °C durante 20 seg, iii) 60 °C durante 60 seg, iv) se repiten los pasos ii-iii para 35 ciclos, v) se mantiene a 4 °C. Se llevó a cabo la PCR en tiempo real en los termocicladores BIO-RAD ICYCLER™ y ABI Gene Amp PCR System 9700. Los análisis de los datos se basaron en la medición del umbral de ciclo (CT), que es el número de ciclo de PCR cuando la medición de fluorescencia alcanza un valor establecido. Se calculó un valor de CT en forma automática por medio del software iCycler.
El método de detección de TaqMan para el evento de soja DAS-68416—4 fue testeado en comparación con 16 eventos de soja aad-12 diferentes y variedades de soja no transgénica en formato doble con lectina endógena de soja específica como gen de referencia. Este ensayo detectó en forma específica el evento de soja DAS-68416-4 y no produjo ni amplificó ningún resultado positivo falso a partir de los controles (es decir, los 15 eventos de soja aad-12 diferentes y las variedades de soja no transgénica). Las sondas y los cebadores de evento específico pueden ser empleados para detectar el evento de soja DAS-68416-4 y estas condiciones y reactivos son aplicables para ensayos de cigosidad.

Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un método para determinar la cigosidad de eventos de una planta de soja que comprende un evento de soja de AAD-12 pDAB4468-0416, dicho evento comprende un constructor de transgén que comprende un gen AAD-12, dicho constructor de transgén está flanqueado por un ADN genómico de soja flanqueante 5' y un ADN genómico de soja flanqueante 3', dicho método comprende: obtener una muestra de ADN de ADN genómico de dicha planta de soja; producir una muestra en contacto al poner en contacto dicha muestra de ADN con a. un primer cebador de evento y un segundo cebador de evento, en donde dicho primer cebador de evento se une específicamente con dicho constructor de transgén, dicho segundo cebador de evento se une específicamente con dicho ADN flanqueante genómico de soja 5' o dicho ADN flanqueante genómico de soja 3', y en donde dicho primer cebador de evento y dicho segundo cebador de evento producen un amplicón de evento cuando se somete a condiciones de PCR TAQMAN, b. un cebador hacia delante de referencia y un cebador inverso de referencia que producen un amplicón de referencia de un gen de referencia de soja endógeno cuando se somete a condiciones de PCR TAQMAN, c. una sonda de evento fluorescente que se híbrida con dicho amplicón de evento d. una sonda de referencia fluorescente que se híbrida con dicho amplicón de referencia; sometiendo dicha muestra en contacto a condiciones de PCR TAQMAN de punto final basado en fluorescencia; cuantificando dicha sonda de evento fluorescente que híbrida a dicho amplicón de evento; cuantificando dicha sonda de referencia fluorescente que híbrida a dicho amplicón de referencia; comparando cantidades de sonda de evento fluorescente hibridada con la sonda de referencia fluorescente hibridada; y determinando la cigosidad de pDAB4468-0416 al comparar las proporciones de fluorescencia de sonda de evento fluorescente hibridada y sonda de referencia fluorescente hibridada.
2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos amplicones consisten en 50-150 residuos.
3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho ADN flanqueante 5' comprende los residuos 1-2730 de la SEQ ID NO: 1 , y dicho ADN flanqueante 3' comprende 9122-10,212 de la SEQ ID NO:1.
4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho constructor de transgén consiste en los residuos 2731-9121 dé la SEQ ID NO:1.
5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho gen de referencia es un gen de lectina de soja endógeno.
6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho segundo cebador de evento se une con los residuos 2530-2730 de la SEQ ID NO:1 o su complemento.
7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho segundo cebador de evento se une con los residuos 9122-9322 de la SEQ ID NO:1.
8. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho método se usa para criar la introgresión del evento en otra línea de soja.
9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha otra línea de soja carece de dicho evento.
10. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos amplicones consisten en 100-200 pares de bases.
11. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho gen de referencia comprende o híbrida a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, y SEQ ID NO:7.
12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos cebadores de referencia comprenden las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6, y dicha sonda de referencia comprende la SEQ ID NO:7.
13. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichas sondas se rotulan con una tintura fluorescente y neutralizados
14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha sonda de evento comprende FAM como dicha tintura fluorescente en el extremo 5' de dicha sonda de evento y un neutralizador MGB en el extremo 3' de dicha sonda de evento.
15. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha sonda de referencia se rotula con HEX en el extremo 5' de dicha sonda de referencia y un Black Hole Quencher 1 (BHQ1 ) en el extremo 3' de dicha sonda de referencia.
16. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha sonda de evento comprende la SEQ ID NO:4.
17.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos cebadores de evento están seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3.
18. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los resultados de dicho método se leen directamente en un lector de placas.
19. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha muestra de ADN se obtiene de una planta de soja en un campo.
20. - Un kit para realizar el método de la reivindicación 1 , dicho kit comprende dicho primer cebador de evento, dicho segundo cebador de evento, dicho cebador hacia delante de referencia, dicho cebador inverso de referencia, dicha sonda de evento y dicha sonda de referencia.
21. - El kit de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dichos cebadores de evento consisten en la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:3, dichos cebadores de referencia consisten en la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO:6, dicha sonda de evento consiste en la SEQ ID NO:4, y dicha sonda de referencia consiste en la SEQ ID NO:7.
22.- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 7.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA112408C2 (uk) 2009-11-24 2016-09-12 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб боротьби з дводольними самосійними aad-12 рослинами в однодольних сільськогосподарських культурах
CA2962242A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Agrigenetics, Inc. Low lignin non-transgenic alfalfa varieties and methods for producing the same
US20180100162A1 (en) 2016-10-11 2018-04-12 Dow Agrosciences Llc Modulation of Transgene Expression in Plants
CN116676417B (zh) * 2023-07-24 2023-09-29 捷康生物科技(海南)有限公司 转基因大豆事件jk1001-3及其检测方法
CN116694813B (zh) * 2023-07-25 2023-10-03 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因大豆事件lp086-1及其检测方法
CN116694812B (zh) * 2023-07-25 2023-10-03 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因大豆事件lp086-2及其检测方法
CN116694815B (zh) * 2023-08-01 2023-10-03 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因大豆事件lp012-2及其检测方法
CN116694814B (zh) * 2023-08-01 2023-10-10 隆平生物技术(海南)有限公司 转基因大豆事件lp012-1及其检测方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060127889A1 (en) * 2000-07-25 2006-06-15 Dotson Stanton B Method for assessing transgene expression and copy number
CN1370841A (zh) * 2001-02-26 2002-09-25 安利忻 基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法和试剂盒
US7955800B2 (en) * 2002-06-25 2011-06-07 Advpharma Inc. Metastasis-associated gene profiling for identification of tumor tissue, subtyping, and prediction of prognosis of patients
RU2270254C2 (ru) * 2004-04-30 2006-02-20 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа
BRPI0618025B1 (pt) * 2005-10-28 2016-12-27 Dow Agrosciences Llc método para controlar ervas daninhas em uma área, polinucleotídeo isolado, célula de planta e planta resistente a herbicida
MX2009011319A (es) * 2007-04-20 2009-12-11 Enzon Pharmaceuticals Inc Adenosina desaminasa recombinante estable.
UA112408C2 (uk) * 2009-11-24 2016-09-12 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб боротьби з дводольними самосійними aad-12 рослинами в однодольних сільськогосподарських культурах

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