CN1370841A - 基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法和试剂盒,属分子生物学检测领域。具体的是从基因改造农作物及其加工产品中提取脱氧核糖核酸(DNA),应用实时多聚酶链式反应(real－time PCR)技术对基因改造农作物及其加工产品中的基因改造成分(genetically modifiedorganisms,GMOs)进行定量检测的方法和试剂盒。采用本发明的方法和试剂盒,可以定量地判定一种农作物或其加工产品是否含有基因改造成分。
Description
本发明属分子生物学检测领域，涉及基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法和试剂盒。具体的是从基因改造农作物及其加工产品中提取脱氧核糖核酸(DNA)，应用实时多聚酶链式反应(real-time PCR)技术对基因改造农作物及其加工产品中的基因改造成分(genetically modified organisms，GMOs)进行定量检测的方法和试剂盒。
1983年，世界上第一例基因改造植物问世，这标明生物技术的发展已经可以使植物遵从人类的意愿生长。1994年，美国Calgene公司研制的基因改造番茄成为世界上第一个获准商品化生产的基因改造农作物。此后，在美国、加拿大、阿根廷和欧洲，先后有数十种基因改造农作物获准商品化生产，这主要包括基因改造的大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、西葫芦、番木瓜、番茄和南瓜等。在我国，目前有五种基因改造农作物获准商品化生产，其中三种为基因改造的番茄，另外两种是基因改造的甜椒和棉花，还有一种基因改造的花卉——矮牵牛也获准了商品化生产。
基因改造农作物由于具有抗虫、抗除草剂、抗病毒以及品质改善等优点而得到大面积推广。据统计，去年全球基因改造农作物的种植面积已达到4000万公顷，其中超过半数为基因改造的大豆，另有近30％为基因改造的玉米。作为全球最大的基因改造农作物种植国，美国出口的食品中约60％含有基因改造成分。
1998年英国的一位科学家实验发现，老鼠食用了基因改造的马铃薯后，体重减轻，器官出现异常，且免疫系统受到破坏。这在英国引起了轩然大波，尽管后来其所在的实验室对这一结果进行了更正，但基因改造农作物及其加工产品的安全性依然引起人们的质疑：尽管目前没有直接的证据显示基因改造农作物及其加工产品对人类有现实的危害，但科学家们也无法证明已食用的基因改造农作物及其加工产品对人类的未来不存在危害。
因此，在西方发达国家，尤其是欧洲，人们对基因改造农作物及其加工产品表现出了强烈的抵触情绪。政府也采取相应的措施，对基因改造农作物及其加工产品进行检测并加以标签，标明是否含有基因改造成份及其含量，使消费者具有知情权，可以自由选择基因改造农作物及其加工产品。
但由于在基因改造农作物中基因改造成分在农作物的基因组中所占的比例是非常微小的，且由于产品加工过程中的高温高压处理对基因的破坏，以及所加工的产品中存在的抑制因子，因此对基因改造农作物及其加工产品中基因改造成分的检测是很困难的。
在国外，科学家们正在努力研究与改进基因改造农作物及其加工产品的检测方法，以适应种类繁多的基因改造农作物及其加工产品。而在我国，目前政府还未出台与基因改造农作物及其加工产品相关的法规和管理标准，在基因改造农作物及其加工产品的检测方法上还是空白。
本发明的目的旨在提供通用的对基因改造农作物及其加工产品进行定量检测的方法及试剂盒。
本发明的基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法，步骤如下：
标准的检测流程包括三个部分：基因改造农作物及其加工产品DNA的提取；利用实时PCR(real-time PCR)技术定量检测基因改造农作物及其加工产品中的基因改造成分；对检测结果进行科学的通用的解释。
为防止PCR结果对样品的污染，DNA的提取、PCR的准备、PCR的运行及PCR结果的分析要分开不同的房间进行。
第一步、基因改造农作物及其加工产品DNA的提取
(一)待测样品的前处理；
粉末状的待测样品不需处理；非粉末状的固体待测样品要处理成粉末状；液态待测样品采用冷冻干燥法干燥并研碎成粉末状；新鲜的待测样品清洗干净即可。如：
对于坚硬的食品，例如黄豆、玉米粒等，采用食品加工机或研钵进行研磨，成为粉末状；
对于固体的非坚硬食品，例如饼干、薯片等，采用研钵或镊子将其捣碎，成为粉末状；
对于固体的粉末状的食品，例如豆粉、面粉等，可直接用于分析；
对于半固体的食品，例如番茄酱、腐乳等，采用冷冻干燥法，并研碎成为粉末；
对于液体的食品，例如豆奶、啤酒等，采用冷冻干燥法，并研碎成为粉末；
对于新鲜的食品，例如新鲜的马铃薯、番茄等，可清洗干净后，直接用于分析。
在进行前处理的时候，每处理完一个样品，要及时清理器具，采用洗涤液、酒精及高温灭菌等方式，防止食品的交叉污染。
(二)提取待测样品的DNA，方法一如下：
1.称取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)离心管中，缓慢加入700微升(μl)CTAB提取缓冲液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/LCTAB，pH8.0，使用前加入体积比为1％的巯基乙醇)，充分混匀。
若是新鲜食品，则直接称取200mg放入盛有700μl提取缓冲液的1.5ml离心管中，用镊子在缓冲液中捣碎食品。
2.将离心管置于60℃水浴中，放置45分钟，期间混匀数次。
3.加入等体积氯仿，充分混匀。
4.室温下12,000rpm离心10min。
5.将上清转移到一个新的离心管中，重复氯仿抽提过程一遍。
6.将上清转移到一个新的离心管中，加入1ml树脂，例如Promega公司的Resin，充分混匀。
7.将混合液通过一个过滤柱(column)，例如Promega公司的Minicolumn。
8.用2ml清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)、清洗过滤柱，重复一遍。
9.室温下11,000rpm离心过滤柱2min。
10.向过滤柱上加入70℃重蒸水50μl，温育5分钟。
11.室温下11,000rpm离心过滤柱2min。
12.收集洗脱液。
13.用紫外分光光度计测定DNA的浓度，稀释成终浓度为50ng/μl，储存于-20℃冰箱，备用。
提取待测样品的DNA的方法二如下：
1.称取200mg食品粉末，放入1.5ml离心管中，缓慢加入860μl提取缓冲液(10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)，充分混匀。
若是新鲜食品，则直接称取200mg放入盛有860μl提取缓冲液的1.5ml离心管中，用镊子在缓冲液中捣碎食品。
2.加入100μl 5M盐酸胍溶液，混匀。
3.加入40μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀。
4.将离心管置于60℃水浴中，放置3小时，期间混匀数次。
5.在室温下冷却5分钟。
6.室温下13,000rpm离心10min。
7.将上清转移到一个新的离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀。
8.室温下12,000rpm离心10min。
9.将上清转移到一个新的离心管中，重复氯仿抽提过程一遍。
10.将上清转移到一个新的离心管中，加入1ml树脂，例如Promega公司的Resin，充分混匀。
11.将混合液通过一个过滤柱(column)，例如Promega公司的Minicolumn。
12.用2ml清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗过滤柱，重复一遍。
13.室温下11,000rpm离心过滤柱2min。
14.向过滤柱上加入70℃重蒸水50μl，温育5分钟。
15.室温下11,000rpm离心过滤柱2min。
16.收集洗脱液。
17.用紫外分光光度计测定DNA的浓度，稀释成终浓度为50ng/μl，储存于-20℃冰箱，备用。
第二步、利用实时PCR(real-time PCR)技术定量检测基因改造农作物及其加工产品中的基因改造成分
Real-time PCR是一项近几年才发展起来的可用于定量分析样品中的DNA含量的技术。在它的PCR反应体系中，除设计有一对PCR引物，还设计有一个位于这两个引物之间的PCR探针，在探针的5`端标记有荧光素，在探针的3`端标记有荧光的淬火剂。探针处于游离状态时，因淬火剂的作用，荧光受到抑制。当引物和探针都结合到DNA模板上，随着PCR反应的进行，淬火剂被从探针上切下，荧光开始激发。Real-time PCR仪(例如Perkin Elmer公司的ABI Prism 7700Sequence Detector)能够随时记录荧光的发射。荧光的发射与反应体系中PCR产物的积累量呈一定关系，且与反应体系中最初的DNA模板量有关。因此将待检测样品与一系列已知DNA模板量的标准样品一同进行PCR反应，则可从标准曲线得到待检测样品中DNA模板的含量。
(一)确定检测标记及对照基因
由于在植物基因转化过程中所使用的大部分的植物转化中间载体均含有CaMV35S启动子、Nos终止子、抗生素筛选标记基因NPTII以及除草剂筛选标记基因Bar，因此可以将它们作为通用的基因改造农作物及其加工产品检测标记。另外由于Monsanto公司的“Roundup Ready”抗除草剂大豆和Novartis公司的“Event176”抗虫玉米在基因改造农作物的市场上占有较大的份额，因此“Roundup Ready”所含有的基因改造成分EPSPS基因和“Event 176”所含有的CryIA(b)基因也可以作为特定的含有“Roundup Ready”大豆或“Event 176”玉米以及其它的含有这些基因改造成分的基因改造农作物及其加工产品的检测标记。
为防止基因改造农作物及其加工产品检测中的假阴性结果，需要设立一系列的对照基因。选择大豆特异基因Lectin和玉米特异基因Invertase作为对照基因。
(二)确定Real-time PCR标准曲线
选定混有基因改造的“Roundup Ready”5％的大豆和混有基因改造的“Event176”5％的玉米的DNA，分别稀释成浓度为20，10，2，1，0.2，0.04ng/ul，各取5ul作为模板，进行Real-time PCR反应，则形成相对于内源基因(Lectin和Invertase)为100，50，10，5，1，0.2ng的标准曲线，形成相对于基因改造成分EPSPS和CryIA(b)为5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.01ng的标准曲线。对应标准曲线，就可以计算出所检测的样品中所含大豆(或玉米)成分的比例，以及基因改造的“Roundup Ready”大豆(或“Event 176”玉米)的比例。
(三)鉴定检测体系的可靠性和灵敏度
在开始对样品进行检测以前，应首先进行检测体系的可靠性和灵敏度的鉴定。
选定混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，作为标准来鉴定基因改造农作物及其加工产品定量检测体系的可靠性。按照前面所述的基因改造农作物及其加工产品DNA的提取方法，分别提取它们的DNA，各取100ng作为模板，分别对各个检测标记和对照基因进行Real-time PCR扩增，同时设立用重蒸水代替DNA模板的空白对照。只有当检测结果如下时，才能证明检测体系的可靠性：
以重蒸水代替DNA模板的空白对照，不能扩增出任何检测标记和对照基因；
“Roundup Ready”0％的大豆，只能够扩增出大豆特异的Lectin基因；
“Event 176”0％的玉米，只能够扩增出玉米特异的Invertase基因；
“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆，均能够扩增出大豆特异的Lectin基因，且含量基本相同，变异系数在1％以内；
“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，均能够扩增出玉米特异的Invertase基因，且含量基本相同，变异系数在1％以内；
“Roundup Ready”0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆，均能够扩增出EPSPS基因，且EPSPS基因的含量随样品中“Roundup Ready”含量的上升而呈上升趋势；
“Event 176”0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，均能够扩增出CryIA(b)基因，且CryIA(b)基因的含量随样品中“Event 176”含量的上升而呈上升趋势。
选定混有基因改造的“Roundup Ready”5％的大豆(或混有基因改造的“Event176”5％的玉米)的DNA，分别稀释成浓度为20，10，2，1，0.2，0.04ng/ul，作为标准来鉴定基因改造农作物及其加工产品定量检测体系的灵敏度。各取5ul作为模板，进行Real-time PCR反应，则相对于基因改造成分EPSPS(或CryIA(b))，模板的含量分别为5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.01ng。
如果EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.01ng和以上的大豆(或玉米)的DNA模板，可以扩增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，且检测出的基因含量随样品中已知的EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量的上升而呈上升趋势，则此时检测体系的灵敏度为0.01ng，即该检测体系最低可以检测出的基因改造成分含量为0.01ng。若无法从EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.01ng大豆(或玉米)中扩增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，而可以从EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.05ng和以上的大豆(或玉米)中扩增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，且检测出的基因含量随样品中已知的EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量的上升而呈上升趋势，则此时检测体系的灵敏度为0.05ng，即该检测体系最低可以检测出的基因改造成分含量为0.05ng。依此类推。
(四)确定基因改造农作物及其加工产品的定量检测PCR引物和探针
Real-time PCR要求所扩增的片段长度在50-150碱基对(bp)之间，5`端不能出现连续的G，引物的复性温度在58-60℃之间，探针的复性温度比引物的复性温度高10℃。
我们选定符合以上条件的PCR引物和探针的位置范围见下表：
基因改造农作物及其加工产品的定量检测PCR引物和探针位置范围列表(表一)
| 基因名称 | 引物和探针 | GenBank序列号 | 位置范围 |
| CaMV 35启动子 | 5`引物 | AJ251014 | 2221-2701 |
| 3`引物 | |||
| 正向探针 | |||
| Nos终止子 | 5`引物 | U84006 | 2801-3041 |
| 3`引物 | |||
| 正向探针 | |||
| NPTII基因 | 5`引物 | Y18316 | 3541-4311 |
| 3`引物 | |||
| 正向探针 | |||
| Bar基因 | 5`引物 | X17220 | 41-581 |
| 3`引物 | |||
| 正向探针 | |||
| EPSPS基因 | 5`引物 | I43998 | 5-1981 |
| 3`引物 | |||
| 正向探针 | |||
| Lectin基因 | 5`引物 | K00821 | 1001-1801 |
| 3`引物 | |||
| 正向探针 | |||
| CryIA(b)基因 | 5`引物 | I41419 | 5-1921 |
| 3`引物 | |||
| 正向探针 | |||
| Invertase基因 | 5`引物 | U16123 | 5-4211 |
| 3`引物 | |||
| 正向探针 |
(表一)
针对上面列表中的PCR引物和探针位置范围，我们寻找到最佳的引物和探针序列见下表：
基因改造农作物及其加工产品的定量检测最佳PCR引物和探针列表(表二)
| 基因名称 | 引物和探针 | 序列 | GenBank序列号 | 位置 |
| CaMV 35启动子 | 5`引物 | 5`-ttc gtc aac atg gtg gag ca-3` | AJ251014 | 2277-2296 |
| 3`引物 | 5`-gca atg gaa tcc gag gag gt-3` | 2389-2408 | ||
| 正向探针 | 5`-FAM-cag tct cag aag acc aaa ggg caattg a-3` | 2332-2359 | ||
| Nos终止子 | 5`引物 | 5`-ttc aaa cat ttg gca ata aag ttt c-3` | U84006 | 2802-2826 |
| 3`引物 | 5`-aac cca tct cat aaa taa cgt cat g-3` | 2916-2940 | ||
| 正向探针 | 5`-FAM-ctg ttg ccg gtc ttg cga tgatta tca-3` | 2840-2866 | ||
| NPTII基因 | 5`引物 | 5`-cag tcc ctt ccc gct tca-3` | Y18316 | 4050-4067 |
| 3`引物 | 5`-gcg ccc ggt tct ttt tgt-3` | 4176-4193 | ||
| 正向探针 | 5`-FAM-cgc tgc ctc gtc ctG CAG TTCA-3` | 4127-4148 | ||
| Bar基因 | 5`引物 | 5`-gcg tgg tcg ctg tca tcg-3` | X17220 | 392-409 |
| 3`引物 | 5`-gcc agt tcc cgt gct tga-3` | 488-505 | ||
| 正向探针 | 5`-FAM-tgc acg agg cgc tcg gat atgc-3` | 437-458 | ||
| EPSPS基因 | 5`引物 | 5`-gca aat cct ctg gcc ttt cc-3` | I43998 | 99-118 |
| 3`引物 | 5`-ctt gcc cgt att gat gac gtc-3` | 224-244 | ||
| 正向探针 | 5`-FAM-ttc atg ttc ggc ggt ctc gcg-3` | 164-184 | ||
| Lectin基因 | 5`引物 | 5`-tcc cga gtg ggt gag gat ag-3` | K00821 | 1664-1683 |
| 3`引物 | 5`-tca tgc gat tcc cca ggt at-3` | 1710-1729 | ||
| 正向探针 | 5`-TET-tct ctg ctg cca cgg gac tcg a-3` | 1687-1708 | ||
| CryIA(b)基因 | 5`引物 | 5`-cat gtt ccg cag tgg ctt c-3` | I41419 | 1302-1320 |
| 3`引物 | 5`-cgg cac tgc ggt gaa tc-3` | 1365-1381 | ||
| 正向探针 | 5`-FAM-agc atc atc cgt gca cct atg ttcagc-3` | 1336-1362 | ||
| Invertase基因 | 5`引物 | 5`-aac tga atc cgg tct gaa aat tg-3` | U16123 | 2159-2181 |
| 3`引物 | 5`-gcg cgt aca ggg acg tgt-3` | 2215-2232 | ||
| 正向探针 | 5`-TET-tca agc aga aga gcc ccg atc ctc-3` | 2183-2206 |
(五)确定PCR反应体系
PCR反应体系如下：
TaqMan buffer A 1×
MgCl2 4mM
dATP 0.2mM
dCTP 0.2mM
dGTP 0.2mM
dUTP 0.4mM
AmpliTaqGod DNA polymerase0.025U/μl
Amp Erase UNG 0.01U/μl
Primer 0.2μM
TaqMan Probe 0.2μM
DNA template 100ng(样品)
重蒸水 补至25μl
(六)确定PCR反应条件
PCR反应条件如下：
50℃2分钟，95℃ 10分钟，然后在如下条件进行50个循环：95℃ 15秒和60℃ 1分钟。
第三步、对检测结果进行解释
在检测体系的可靠性得到确认以后，对基因改造农作物及其加工产品的定量检测结果解释如下：
如果得到Lectin基因的含量(以X表示，单位为ng)，则证明该样品中含有大豆成分，且大豆的含量为X％；
如果同时得到Lectin基因的含量(以X表示，单位为ng)和EPSPS基因的含量(以P表示，单位为ng)，则证明该样品含有基因改造成分，且所含的大豆中(P/X)％为“Roundup Ready”基因改造大豆；
如果得到Invertase基因的含量(以Y表示，单位为ng)，则证明该样品中含有玉米成分，且玉米的含量为Y％；
如果同时得到Invertase基因的含量((以Y表示，单位为ng)和CryIA(b)基因的含量(以Q表示，单位为ng)，则证明该样品含有基因改造成分，且所含的玉米中(Q/Y)％为“Event 176”基因改造玉米。
本发明的专用于实施基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法的试剂盒，由如下试剂构成：
DNA提取缓冲液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者：10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％SDS，pH8.0)；树脂；过滤柱(column)；清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；TaqMan缓冲液A；MgCl2；dATP；dCTP；dGTP：dUTP；AmpliTaqGod DNA polymerase；Amp Erase UNG；PCR引物，为前述表一或表二中全部的引物；PCR探针，为前述表一或表二中全部的探针。
采用本发明的方法和试剂盒，可以定量地判定一种农作物或其加工产品是否含有基因改造成分。
实施例：
用于实施基因改造农作物及其加工产品定量检测的试剂盒由下列试剂组成：
DNA提取缓冲液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者：10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)；树脂；过滤柱(column)；清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；TaqMan缓冲液A；MgCl2；dATP；dCTP；dGTP；dUTP；AmpliTaqGod DNA polymerase；Amp Erase UNG；PCR引物，为表二中全部的引物；PCR探针，为表二中全部的探针。
所检测的食品为购自超市的豆奶。用冷冻抽干机将豆奶冻干，并研成粉末。采用前述基因改造农作物及其加工产品DNA的提取方法一得到样品的DNA，同时提取混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米的DNA，并按前述确定Real-time PCR标准曲线的方法分别稀释成一系列的用于作标准曲线的浓度。按照前述PCR反应体系和反应条件，分别利用各对引物对各个检测标记和对照基因进行实时PCR扩增，同时进行检测系统可靠性和灵敏度的鉴定。从标准曲线可以得到所检测食品中的大豆和玉米含量，并可以得到基因改造的“RoundupReady”大豆和“Event 176”玉米的含量。按照前述对检测结果的解释整理出相应的检测报告。
Claims (3)
1.基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法，包括如下步骤：
第一步、基因改造农作物及其加工产品DNA的提取
(一)待测样品的前处理：
粉末状的待测样品不需处理；非粉末状的固体待测样品要处理成粉末状；液态待测样品采用冷冻干燥法干燥并研碎成粉末状；新鲜的待测样品清洗干净即可：
(二)提取待测样品的DNA，方法如下：
DNA的提取方法一：
(1)称取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)离心管中，缓慢加入700微升(μl)CTAB提取缓冲液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0，使用前加入体积比为1％的巯基乙醇)，充分混匀；
若是新鲜食品，则直接称取200mg放入盛有700μl提取缓冲液的1.5ml离心管中，用镊子在缓冲液中捣碎食品；
(2)将离心管置于60℃水浴中，放置45分钟，期间混匀数次；
(3)加入等体积氯仿，充分混匀；
(4)室温下12,000rpm离心10min；
(5)将上清转移到一个新的离心管中，重复氯仿抽提过程一遍；
(6)将上清转移到一个新的离心管中，加入1ml树脂，充分混匀；
(7)将混合液通过一个过滤柱(column)；
(8)用2ml清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗过滤柱(column)，重复一遍；
(9)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；
(10)向过滤柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，温育5分钟；
(11)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；
(12)收集洗脱液；
(13)用紫外分光光度计测定DNA的浓度，稀释成终浓度为50ng/μl，储存于-20℃冰箱，备用；
DNA的提取方法二：
(1)称取200mg食品粉末，放入1.5ml离心管中，缓慢加入860μl提取缓冲液(10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％SDS，pH8.0)，充分混匀；
若是新鲜食品，则直接称取200mg放入盛有860μl提取缓冲液的1.5ml离心管中，用镊子在缓冲液中捣碎食品；
(2)加入100μl 5M盐酸胍溶液，混匀；
(3)加入40μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀；
(4)将离心管置于60℃水浴中，放置3小时，期间混匀数次；
(5)在室温下冷却5分钟；
(6)室温下13,000rpm离心10min；
(7)将上清转移到一个新的离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀；
(8)室温下12,000rpm离心10min；
(9)将上清转移到一个新的离心管中，重复氯仿抽提过程一遍；
(10)将上清转移到一个新的离心管中，加入1ml树脂，充分混匀；
(11)将混合液通过一个过滤柱(column)；
(12)用2ml清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗过滤柱(column)，重复一遍；
(13)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；
(14)向过滤柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，温育5分钟；
(15)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；
(16)收集洗脱液；
(17)用紫外分光光度计测定DNA的浓度，稀释成终浓度为50ng/μl，储存于-20℃冰箱，备用；
第二步、利用实时PCR(real-time PCR)技术定量检测基因改造农作物及其加工产品中的基因改造成分
(一)确定检测标记及对照基因
选定下列要素作为检测标记：
存在于植物基因转化过程中所使用的大部分的植物转化中间载体中的CaMV35S启动子、Nos终止子、抗生素筛选标记基因NPTII以及除草剂筛选标记基因Bar；
存在于Monsanto公司的“Roundup Ready”抗除草剂大豆中的基因改造成分EPSPS基因；
存在于Novartis公司的“Event 176”抗虫玉米中的CryIA(b)基因；
同时，选择大豆特异基因Lectin和玉米特异基因Invertase作为对照基因；
(二)确定Real-time PCR标准曲线
选定混有基因改造的“Roundup Ready”5％的大豆和混有基因改造的“Event176”5％的玉米的DNA，分别稀释成浓度为20，10，2，1，0.2，0.04 ng/ul，各取5ul作为模板，进行Real-time PCR反应，则形成相对于内源基因(Lectin和Invertase)为100，50，10，5，1，0.2ng的标准曲线，形成相对于基因改造成分EPSPS和CryIA(b)为5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.01ng的标准曲线；对应标准曲线，就可以计算出所检测的样品中所含大豆(或玉米)成分的比例，以及基因改造的“Roundup Ready”大豆(或“Event 176”玉米)的比例；
(三)鉴定检测体系的可靠性和灵敏度
选定混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，作为标准来鉴定基因改造农作物及其加工产品定量检测体系的可靠性；按照前面所述的DNA提取方法，分别提取它们的DNA，各取100ng作为模板，分别对各个检测标记和对照基因进行Real-time PCR扩增，同时设立用重蒸水代替DNA模板的空白对照；只有当检测结果如下时，才能证明检测体系的可靠性：
以重蒸水代替DNA模板的空白对照，不能扩增出任何检测标记和对照基因；
“Roundup Ready”0％的大豆，只能够扩增出大豆特异的Lectin基因；
“Event 176”0％的玉米，只能够扩增出玉米特异的Invertase基因；
“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆，均能够扩增出大豆特异的Lectin基因，且含量基本相同，变异系数在1％以内；
“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，均能够扩增出玉米特异的Invertase基因，且含量基本相同，变异系数在1％以内；
“Roundup Ready”0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆，均能够扩增出EPSPS基因，且EPSPS基因的含量随样品中“Roundup Ready”含量的上升而呈上升趋势；
“Event 176”0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，均能够扩增出CryIA(b)基因，且CryIA(b)基因的含量随样品中“Event 176”含量的上升而呈上升趋势；
选定混有基因改造的“Roundup Ready”5％的大豆(或混有基因改造的“Event176”5％的玉米)的DNA，分别稀释成浓度为20，10，2，1，0.2，0.04ng/ul，作为标准来鉴定基因改造农作物及其加工产品定量检测体系的灵敏度；各取5ul作为模板，进行Real-time PCR反应，则相对于基因改造成分EPSPS(或CryIA(b))，模板的含量分别为5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.01ng；
如果EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.01ng和以上的大豆(或玉米)的DNA模板，可以扩增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，且检测出的基因含量随样品中已知的EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量的上升而呈上升趋势，则此时检测体系的灵敏度为0.01ng，即该检测体系最低可以检测出的基因改造成分含量为0.01ng；若无法从EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.01ng大豆(或玉米)中扩增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，而可以从EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.05ng和以上的大豆(或玉米)中扩增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，且检测出的基因含量随样品中已知的EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量的上升而呈上升趋势，则此时检测体系的灵敏度为0.05ng，即该检测体系最低可以检测出的基因改造成分含量为0.05ng；依此类推；
(四)确定基因改造农作物及其加工产品的定量检测PCR引物和探针
所扩增的片段长度在50-150碱基对(bp)之间，5`端不能出现连续的G，引物的复性温度在58-60℃之间，探针的复性温度比引物的复性温度高10℃；
我们选定符合以上条件的PCR引物和探针的位置范围见下表：
基因改造农作物及其加工产品的定量检测PCR引物和探针位置范围列表(表一)
基因名称
引物和探针
GenBank序列号
位置范围
CaMV 35启动子
5`引物 AJ251014 2221-2701
3`引物
正向探针
Nos终止子
5`引物 U84006 2801-3041
3`引物
正向探针
NPTII基因
5`引物 Y18316 3541-4311
3`引物
正向探针
Bar基因
5`引物 X17220 41-581
3`引物
正向探针
EPSPS基因
5`引物 I43998 5-1981
3`引物
正向探针
Lectin基因
5`引物 K00821 1001-1801
3`引物
正向探针
CryIA(b)基因
5`引物 I41419 5-1921
3`引物
正向探针
Invertase基因
5`引物 U16123 5-4211
3`引物
正向探针
(表一)
(五)确定PCR反应体系
PCR反应体系如下：
TaqMan buffer A 1×
MgCl2 4mM
dATP 0.2mM
dCTP 0.2mM
dGTP 0.2mM
dUTP 0.4mM
Ampli TaqGod DNA polymerase 0.025U/μl
Amp Erase UNG 0.01U/μl
Primer 0.2μM
TaqMan Probe 0.2μM
DNA template 100ng(样品)
重蒸水 补至25μl
(六)确定PCR反应条件
PCR反应条件如下：
50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，然后在如下条件进行50个循环：95℃ 15秒和60℃ 1分钟；
第三步、对检测结果进行解释
在检测体系的可靠性得到确认以后，对基因改造农作物及其加工产品的定量检测结果解释如下：
如果得到Lectin基因的含量(以X表示，单位为ng)，则证明该样品中含有大豆成分，且大豆的含量为X％；
如果同时得到Lectin基因的含量(以X表示，单位为ng)和EPSPS基因的含量(以P表示，单位为ng)，则证明该样品含有基因改造成分，且所含的大豆中(P/X)％为“Roundup Ready”基因改造大豆；
如果得到Invertase基因的含量(以Y表示，单位为ng)，则证明该样品中含有玉米成分，且玉米的含量为Y％；
如果同时得到Invertase基因的含量((以Y表示，单位为ng)和CryIA(b)基因的含量(以Q表示，单位为ng)，则证明该样品含有基因改造成分，且所含的玉米中(Q/Y)％为“Event 176”基因改造玉米。
2.如权利要求1所述的基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法，其特征在于基因改造农作物及其加工产品的定量检测最佳PCR引物和探针见下表：
基因改造农作物及其加工产品的定量检测最佳PCR引物和探针列表(表二)
基因名称
引物和探针
序列
GenBank序列号
位置
CaMV 35启动子
5`引物
5`-ttc gtc aac atg gtg gag ca-3` AJ251014
2277-2296
3`引物
5`-gca atg gaa tcc gag gag gt-3`
2389-2408
正向探针
5`-FAM-cag tct cag aag acc aaa ggg caa ttga-3`
2332-2359
Nos终止子
5`引物
5`-ttc aaa cat ttg gca ata aag ttt c-3` U84006
2802-2826
3`引物
5`-aac cca tct cat aaa taa cgt cat g-3`
2916-2940
正向探针
5`-FAM-ctg ttg ccg gtc ttg cga tga ttatca-3`
2840-2866
NPTII基因
5`引物
5`-cag tcc ctt ccc gct tca-3` Y18316
4050-4067
3`引物
5`-gcg ccc ggt tct ttt tgt-3`
4176-4193
正向探针
5`-FAM-cgc tgc ctc gtc ctG CAG TTC A-3`
4127-4148
Bar基因
5`引物
5`-gcg tgg tcg ctg tca tcg-3` X17220
392-409
3`引物
5`-gcc agt tcc cgt gct tga-3`
488-505
正向探针
5`-FAM-tgc acg agg cgc tcg gat atg c-3`
437-458
EPSPS基因
5`引物
5`-gca aat cct ctg gcc ttt cc-3` I43998
99-118
3`引物
5`-ctt gcc cgt att gat gac gtc-3`
224-244
正向探针
5`-FAM-ttc atg ttc ggc ggt ctc gcg-3`
164-184
Lectin基因
5`引物
5`-tcc cga gtg ggt gag gat ag-3` K00821
1664-1683
3`引物
5`-tca tgc gat tcc cca ggt at-3`
1710-1729
正向探针
5`-TET-tct ctg ctg cca cgg gac tcg a-3`
1687-1708
CryIA(b)基因
5`引物
5`-cat gtt ccg cag tgg ctt c-3` I41419
1302-1320
3`引物
5`-cgg cac tgc ggt gaa tc-3`
1365-1381
正向探针
5`-FAM-agc atc atc cgt gca cct atg ttc agc-3`
1336-1362
Invertase基因
5`引物
5`-aac tga atc cgg tct gaa aat tg-3` U16123
2159-2181
3`引物
5`-gcg cgt aca ggg acg tgt-3`
2215-2232
正向探针
5`-TET-tca agc aga aga gcc ccg atc ctc-3`
2183-2206
(表二)
3.一种实施如权利要求1或2所述的基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法的试剂盒，其特征在于试剂盒由如下试剂构成：
DNA提取缓冲液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者：10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)；树脂；过滤柱(column)；清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；TaqMan缓冲液A；MgCl2；dATP；dCTP；dGTP；dUTP；AmpliTaqGod DNA polymerase；Amp Erase UNG；PCR引物，为表一或表二中全部的引物；PCR探针，为表一或表二中全部的探针。
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|---|---|---|---|---|
| CN102084005A (zh) * | 2008-07-02 | 2011-06-01 | 恩尼格马诊断有限公司 | 用于生物化学反应的冷冻干燥的组合物 |
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| US11060126B2 (en) | 2016-02-19 | 2021-07-13 | Nutrasource Pharmaceutical And Nutraceutical Services Inc. | Methods for detecting genetically modified organisms (GMO) |
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