CN102084005A - 用于生物化学反应的冷冻干燥的组合物 - Google Patents
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Abstract
蜜三糖用作冷冻干燥的组合物所使用的玻璃形成用试剂的用途,该组合物预期用于进行化学或生物化学反应如PCR。因此,例如,提供用于进行化学或生物化学反应的组合物,该组合物呈现冷冻干燥的形式并且包括(i)包括至少一些为进行该化学或生物化学反应所必需的化学或生物化学试剂的试剂组,和(ii)蜜三糖。包括这些组合物的试剂盒以及使用它们的方法构成了本发明的再一个方面。
Description
本发明涉及用于化学或生物化学反应如聚合酶链式反应中的包括试验试剂的组合物和涉及制备这些组合物的方法。
冷冻干燥是材料,尤其生物材料如细胞和蛋白质,的长期储存的常用方法。然而,包括蛋白质在内的许多材料在这一方法中是不稳定的。该问题一定程度上通过糖如二糖如蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖在用于冷冻干燥中的配制剂中的添加来解决的。这些糖用作玻璃形成用的试剂,而且和看来似乎在冷冻干燥过程中保护蛋白质。已经表明这归因于蛋白质与二糖之间的经由氢键所进行的直接相互作用,该氢键作用对于稳定效果是必要的,因为这会防止在冷冻干燥过程中蛋白质的构象变化。
这意味着冷冻干燥现在可以用来稳定包括蛋白质如酶和细胞在内的复杂反应体系,尤其为了储存目的。然而,一般来说,另外的稳定剂如聚合物(包括聚合化合物,如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和/或多糖(如Ficoll或Dextran))用来维持酶活性。这些聚合物通常是有助于形成均匀的饼块结构的饼块稳定化赋形剂。这通过允许形成均匀的基质使得在升华过程中实现水的有效离开而有助于该干燥过程。它们因此影响最终饼块结构。
此外,在例如化学或生物化学反应中常常一起使用的一些试剂的冷冻干燥的混合物的制备中引起复杂化。例如,广泛使用的聚合酶链式反应(PCR)(包括逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR))采用一定范围的标准试剂,包括盐如氯化镁(MgCl2)和氯化钾,聚合酶酶如Taq聚合酶,缓冲剂如Tris-HCl,和为核酸的扩增所需要的核苷酸。此类制剂例如作为“即可使用的PCR珠粒(ready-to-go PCR beads)”从Amersham
BioSciences(UK)/Pharmacia获得。
一般而言,这些是通过冷冻干燥方法制备的,它是在玻璃形成用试剂和针对所形成的结构的稳定剂以及任选的填料的存在下进行的(参见例如US专利No.5,250,429,US专利No.5,763,157和EP-0726310)。海藻糖尤其已经用于PCR混合物中以协助稳定化和作为PCR增强剂用于非冷冻干燥的配制剂中。然而,在这些反应混合物中用作玻璃形成用试剂和稳定剂的试剂的选择中应当注意确保它们不会干涉或过度地抑制其中所述组合物需要参与的化学或生物化学反应。
尽管如此,当需要时,此类珠粒为实验室进行它们的选择的PCR反应提供方便的和容易可行的手段。一般,使PCR适用于特殊靶向物(target)的特定试剂,如为了例如与实时PCR相关联使用所需要的引物(primer)和任何探针,连同芯珠粒(core bead)一道在反应准备好的“现场”被添加进去。
然而,在很多情况下,尤其在诊断领域中,这些靶向物(target)在许多情况下是相同的,并且探针和引物在珠粒中的包含(这样该珠粒变成测定特异性的)是便于使用所希望的。
通过以这种方法添加另外的反应组分,稳定性问题增大,因为为了维持稳定形式将需要更多的组分。由于测定的性质变得更复杂,在反应中的其它组分如玻璃形成用试剂和稳定剂将干涉或抑制反应的风险会增大。
此外,所述其它反应组分可以包括可以包含相对敏感的化学部分,如标记和尤其光学标记(如荧光标记或染料),的试剂。这些尤其用于“实时”进行测定。敏感性部分常常结合于低聚核苷酸,后者可以被设计用作探针或标记的引物。这些将在PCR的过程中杂交(hybridise)以扩增核酸。在PCR的过程中探针的历程和在来自于该标记的相关信号上的变化以各种方式用于监测PCR的进展。
然而,这样的部分的存在能够加剧与组合物的形成相关的问题,这是因为在组合物中的稳定化用添加剂可能导致信号发出功能(尤其来自荧光标记)的减少或抑制。
蜜三糖以前已经在细胞或蛋白质以及药物制剂的冷冻干燥中用作玻璃形成用试剂(Kajuwara et al.
Pharmaceutical Research Vol 16,9 1999),但是迄今还没有用于复杂化学或生物化学反应混合物的冷冻干燥中。在此类混合物中,如以上所述,包括玻璃形成用试剂的全部组分必须小心地选择,这样它们产生稳定的和持久的干燥的组合物,并且不会以任何有害方式抑制或参与后续的化学反应。WO2006/119280描述了用于反应如PCR中的冻干团粒,它包括防冻剂。各种各样的防冻剂已列于该参考文献中,其中包括蜜三糖与一种或多种“多元醇类”的混合物,该多元醇类似乎在这一背景下在它指糖醇而不是任何多元醇的意义上使用(因为它有时候就是),因为提供的例子是甘露糖醇或山梨糖醇。然而仅仅海藻糖被表明是可使用的。
申请人已经发现了手段来提供用于进行化学或生物化学反应的改进型冷冻干燥组合物,其中包括采用荧光标记的那些组合物。
根据本发明,提供了蜜三糖作为冷冻干燥组合物的玻璃形成用试剂的用途,该组合物预期用于进行化学或生物化学反应如聚合酶链式反应(PCR)或逆转录酶(RT)PCR。申请人已经发现,蜜三糖可用作这些组合物的有效的玻璃形成用试剂和稳定剂并且与化学或生物化学反应如PCR相容。该蜜三糖不适宜与单体多元醇类或糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇混合,而且这些附加化合物在本发明的组合物中也不需要。当以这种方式使用时,蜜三糖不会抑制反应,甚至对于复杂的‘实时’PCR反应而言。因此,附加的稳定剂的使用可以避免,因此例如荧光信号发出系统的抑制被降低。
因此本发明提供用于进行化学或生物化学反应的组合物,该组合物呈现冷冻干燥的形式并包括(i)包括至少一些为进行实时化学或生物化学反应所需要的化学或生物化学试剂的一组试剂,和(ii)蜜三糖。
蜜三糖(它可以呈现蜜三糖五水合物形式)用作与化学或生物化学反应相容的有效的玻璃形成用试剂。合适的冷冻干燥的组合物将包括用于化学或生物化学反应中的那些,它们采用荧光标记或部分作为信号发出或指示手段。
此外,蜜三糖已经发现产生比普通的糖如海藻糖更稳定的饼块。这可以归因于以下事实:它也能够用作干燥剂。与含有海藻糖的组合物相比,通过冷冻干燥蜜三糖组合物所获得的饼块可具有更好的结构和处置(handling)性能。在一些情况下,用蜜三糖可获得的结果优于用含有海藻糖的组合物所获得的那些结果,如下面所说明。
蜜三糖必须以玻璃形成用量存在于组合物中。然而,它不应该以如下大的量存在:通过水的添加实现组合物的重新组成而生产出用于化学或生物化学反应中的“最终组合物”时,它以抑制或以另外方式限制反应的量存在。它适宜以一种用量存在于组合物中,该用量使得它占最终反应组合物的约1-10%m/v或1-10%w/w,例如2.5-10%m/v或2.5-10%w/w和适宜约5%m/v或5%w/w,当配制好准备用于进行化学或生物化学反应时。下面将更详细地讨论,为干燥所制备的组合物(即"饼块组合物")可以适宜是更稀的,因此在最初制备的组合物中蜜三糖的重量百分数(按体积)可以相应地降低。下面提供的实施例中,配制剂是以各试剂的体积的列表所给出的(在给定的浓度或比活性下)。当该体积是指“饼块体积”时,这表示用于该冷冻干燥过程中的试剂的体积。当该体积称为反应或最终体积时,这是在PCR/RT-PCR反应中该试剂的体积或浓度。
然而,本申请人已经发现,甚至当以10%m/v或10%w/w存在时,蜜三糖不会抑制实时的PCR测定。
根据本发明制备的组合物具有良好的稳定性和饼块形成性能。复杂反应如PCR和尤其实时的PCR没有显著受抑制,甚至当荧光信号发出功能发生时。
组合物适宜进一步包括抗氧化剂和/或抗-梅拉德(maillard)试剂。本申请人已经发现,苏氨酸用作特别有效的抗氧化剂和/或抗梅拉德试剂,并且增强该冷冻干燥的组合物的稳定性。尤其,使用L-苏氨酸。不希望受理论束缚,苏氨酸似乎与所产生的任何氧进行反应并且因此有助于混合物的稳定化。
此外已经发现,苏氨酸的存在可以导致从包括在组合物中的荧光标记可获得的信号发出功能稳定化,尤其当在升高的温度下贮存时。
在组合物中苏氨酸的量将根据组合物的准确性质来变化。该用量适宜地进行选择,以使得它不影响组合物的pH,该pH值在一些化学或生物化学反应中是重要的。然而,典型地,它可以以2-10mM,例如约2.5mM的量存在于组合物中。
当组合物在玻璃形成用试剂的存在下被冷冻干燥时,它一般形成“饼块”型3维结构。该结构任选地通过包含饼块结构用的合适稳定剂来支撑,因此这是混合物的附加组分。
可包含在组合物中的合适稳定剂的例子包括聚合化合物,如聚乙二醇(PEG),聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和/或多糖如Ficoll或Dextran。然而在特殊的实施方案中,从组合物中省去该稳定剂,因为已经发现化合物如PEG可以促使荧光信号的抑制。当蜜三糖用作玻璃形成试剂时,本申请人已经发现对此类化合物的需要减少。
同样在一些情况下,明胶可用来为饼块增加稳定性。明胶可以从各种的来源获得,其中包括牛(如奶牛),猪(如猪),海藻(角叉菜胶)或鱼明胶。(所使用的任何牛(肉)材料适宜来自于鉴定的不含BSE的来源。)鱼明胶尤其可以是优选的明胶组分。
上述的一组的试剂(i)将根据所进行的化学或生物化学反应的特殊性质来选择。它们可以包括在多个或重复的场合上进行的反应,如诊断性试验,筛选试验,核酸扩增反应,核酸排序列反应等等。
组合物可以适合用于任何测定或反应中,包括其中采用荧光发生团或荧光部分或生物发光试剂如莹光素酶和莹光素的那些反应,尤其依赖于使用酶进行该程序的那些反应。特定组的此类测定是核酸排序列反应和核酸扩增反应(其中包括聚合酶链式反应(PCR),连接酶链式反应(LCR),链置换扩增(SDA),转录媒介的扩增(TMA),环媒介的等温扩增(LAMP),滚圆DNA扩增,多路转换的连接依赖性探针扩增(MLPA)和多重置换扩增。)
合适的荧光试剂包括荧光染料类或嵌入剂类如SYBR® Green I,SYBR® Gold,溴化乙锭,YOPRO-I,和SYTO染料类,其中包括绿色染料如SYTO 9和红色SYTO染料如SYTO® 17,SYTO® 59,SYTO® 60,SYTO® 61,SYTO® 62,SYTO® 63和SYTO® 64。
它们也可包括低聚核苷酸,后者用作探针或引物并且用荧光标记物进行标记。合适的标记(物)包括荧光素或荧光素衍生物,如羧基荧光素化合物,如5-羧基荧光素,6-羧基荧光素,或它们的琥珀酰亚氨基(succinimidyl)酯,菁染料或若丹明染料。此类染料的特殊例子包括荧光素,JOE,FAM,HEX,TET,TAMRA,ROX Cy5,Cy3,Cy5.5,BoDIPY FL,若丹明,若丹明绿,若丹明红,Oregon Green 488,500或514,德克萨斯红,LightCycler Red 610,640,670或705。其它此类染料包括IDT染料MAX550,TEX615,TYE563,TYE665和TYE705。
深色的淬灭剂也可存在。这些一般用于测定系统中来改进荧光信号但是本身不发射可检测信号。这些实质上是非荧光染料,其中尤其包括偶氮染料(如DABCYL或DABSYL染料和它们的结构类似物),三芳基甲烷染料如孔雀绿或酚红,4’,5-二醚取代的荧光素(例如描述在美国专利No. 4,318,846中),不对称菁染料淬灭剂(例如描述在WO 99/37717中)(这些专利中的每一篇通过引用结合进来)和甲基红。
尤其,淬灭部分是DABCYL(4-(二甲基氨基偶氮)苯-4-羧酸)或它的衍生物,如卤化物或酰胺衍生物,它促进该部分连接到低聚核苷酸的氨基酸上。
在另一个实施方案中,该淬灭部分是在一个或多个氨基氮原子上被芳族或杂芳族环体系取代的3-和/或6-氨基夹氧杂蒽的实质上非荧光衍生物(例如描述在US专利No. 6,399,392中,该专利的内容物通过引用结合进来)。这些淬灭染料典型地在高于530 nm处具有最高吸收率,几乎没有或没有可观察到的荧光和有效地淬灭宽谱带的发射光,如由化学发色团(chemilumiphores)、磷光体或荧光发生团所发射的光。在一个实施方案中,该淬灭染料是取代的若丹明。在另一个实施方案中,该淬灭化合物是取代的硫酸合对甲氨基酚。
在特殊的实施方案中,试剂组是特别适合于进行聚合酶链式反应(PCR)的一组试剂。在这种情况下,(i)项将一般包括当在聚合酶链式反应的过程中粘附于模板核酸序列上时能够延伸(extending)引物的聚合酶。模板核酸可以是DNA或,对于RT-PCR的情况下,RNA序列。
有几种类型的能够进行引物延伸的聚合酶;
1. DNA依赖性DNA聚合酶将DNA作为模板产生互补DNA。Taq(从栖热菌属水生生物(Thermus aquaticus)获得)是一个例子并且这是热稳定的pol酶。它的正常功能是修复在细胞(细菌)DNA中的断裂和不匹配。
2. RNA依赖性DNA聚合酶将RNA作为模板并且在称作逆转录酶(RT)的过程中产生互补DNA。MMULV和AMV是这些酶的例子。一般,通常已知的RNA依赖性DNA聚合酶是非热稳定的。一些DNA依赖性DNA聚合酶如Taq具有非常少量的RNA依赖性DNA聚合酶,但是该量是太低的并且因此对于任何目前已知的应用几乎没有用处。
3. RNA/DNA依赖性DNA聚合酶是这样的酶,该酶在某些条件下可将DNA和/或RNA在引物延伸反应中用作模板以产生DNA。Tth(从栖热菌属嗜热生物(Thermus thermophilus)获得)是这一类型的酶的普通例子,该酶也是热稳定的,但是还有其它酶如可从Genesys UK Limited获得的Tsec酶。大部分的这些RNA聚合酶的活性的关键要求是作为二价金属离子的锰的存在,而不是镁(为大部分其它酶所使用)的存在。
上述聚合酶类型中的任何一种或这些的组合可以用于本发明的组合物中,并且该选择是以组合物的预期目的为基础所进行的。
逆转录酶PCR (RT-PCR)是RNA在PCR周期中按指数规律扩增之前通过其让RNA首先转化成DNA的过程。这能够在三个不同的反应情况下进行:
1. 两步骤RT-PCR,其中RNA依赖性DNA聚合酶或RNA/DNA依赖性DNA聚合酶用于第一个反应中。这一反应可以通过使用特定的引物,随意的引物,或甚至poly dT来引发(primed)以扩增聚腺苷酸化(polyadenylated)细胞信息。等分试样然后被转移到单独的PCR反应中以进行指数式扩增。
2. 两步骤“结合的”RT-PCR是这样的反应,其中RNA依赖性DNA聚合酶与DNA依赖性DNA聚合酶在同一的反应容器中掺混。使用特定的引物,但是,该过程事实是两个离散的过程(有关RNA扩增和DNA扩增)。在其中RNA转化成DNA的第一个反应的完成之后,在热循环的PCR阶段的第一个高温步骤中非热稳定的RNA依赖性DNA聚合酶发生变性。
3. 单步骤RT-PCR使用DNA/RNA依赖性DNA聚合酶,这样在同一个反应容器中附随地进行该过程的两个阶段。RNA和DNA可以在整个PCR中的引物延伸的全部阶段中产生。这具有增加的优点,即在整个过程中采用单一的热稳定酶。因此,它常常是在整个扩增步骤的生产和自动化所用的诊断简化配制剂中的优选途径。
然而,单步骤RT-PCR比通常的PCR在技术上更有挑战性,因为镁被锰替代以刺激足够的RT活性。这具有下列一些效果,发现最佳的反应更具挑战性:
1. 镁影响DNA结合动力学。它通过减少在Watson-Crick B-DNA双螺旋结构中的电荷排斥性来帮助DNA双螺旋形成。与可能有利于DNA结合的情况相比,针对最佳PCR所需要的锰的浓度范围低得多。
2. 高浓度的锰会引起DNA pol活性以错参核苷酸,因此在有利于引物和模板结合的浓度下PCR的保真度可能降低。
3. 锰要求Tris缓冲液(用于全部其它类型的PCR缓冲剂中)被N-二羟乙基甘氨酸缓冲剂替代。
对于给定的单步骤RT-PCR方法,以上因素的结合增大复杂性和优化过程。在配制剂和动力学两者上,该化学过程与通常的PCR和两步骤RT-PCR过程不同。许多研究组已经尝试解决这些差异来克服和固化该化学过程。例如US专利7179590描述了新型变异在Tth聚合酶中的应用,它让聚合酶RT活性被镁离子所刺激。
在特殊的实施方案中,当组合物预期用于RT-PCR时,所使用的聚合酶是Tsec(GeneSys Ltd,UK) RNA/DNA依赖性DNA聚合酶。正如下面在实施例7中所述,它可以通过使用蜜三糖,按照在本发明的组合物中的环境稳定形式被冻干。
适宜地,以上(i) 项的试剂组进一步包括缓冲剂,盐(如镁和/或锰盐,这取决于以上列出的聚合酶的要求),一种或多种引物以及为了构造引物的延伸部分所需要的核苷酸,后者是进行聚合酶链式反应以扩增靶DNA序列所需要的。在典型的PCR中,所使用的缓冲剂一般使得该pH在7和9之间,例如在8.5和8.8之间,例如在8.0和8.8之间。然而有可能的是,一种或多种的这些成分可以省略,尤其当这些成分能够随后容易添加到例如在用于重新构成随时可使用的干燥组合物的再水合缓冲剂中。尤其,所需的盐能够以这样的方式添加并且因此(i)项的试剂组可以省略该盐。当这样做时,该组合物能够以含有所需的盐补充物的、具有再水合缓冲剂的试剂盒形式供应。
可替换地,盐类如镁可以存在,但是可以以低于在该反应中所用所需浓度的那些浓度(例如以低于500 μM的浓度)包括在组合物中。正如在WO2006/003439中所述,已经发现如此少量的镁盐可以事实上有益于组合物的稳定性。
组合物可以进一步包括标记的低聚核苷酸,如可用于实时监测聚合酶链式反应的进程的荧光标记的低聚核苷酸。在这里使用的表达短语“实时”是指,随着聚合酶链式反应进展能够监测聚合酶链式反应,无需停止或打开反应器。通过监测扩增如何发生和特别在哪些周期下扩增子(amplicon)的指数增长变得显著,从而允许在进行PCR的样品中存在的靶核酸的量可以被定量,这是现有技术中众所周知的和得到理解的。
包含在组合物中的各种组分的量将根据各种因素来变化,如具体组分的准确性质、预期应该进行的PCR的性质等等。然而,通过使用现有技术中会理解的已建立的规程和程序,这在各情况下是可确定的。
合适的已标记的低聚核苷酸是可用于聚合酶链式反应的实时监测中的标记的探针或标记的引物当中的任何。因此在特殊的实施方案中它们将包括探针,所述探针能够杂交到扩增的核酸序列上并且携带标记物,尤其光学标记,如提供信号(根据PCR的进展而发生变化)的荧光标记。
因此例如对于预期用于Taqman® 测定中的探针,它们一般包括携带两个标记的探针,其中的一个标记能够用作能量和尤其荧光能量的给体,其中的另一个能够用作该能量的受体或“淬火剂”。尽管该探针是完整的,但是这些标记物彼此保持紧密接近,以使得能量的相互作用得以发生。对于荧光标记,这已知为荧光能量转移(FET)或荧光共振能量转移(FRET)。
该探针经设计以结合于在模板核酸的一个链条上的特定区域。在PCR引物和该链条“退火”(annealing)之后,Taq酶以5’-3’聚合酶活性来延伸该DNA。Taq酶还显示有5’-3’核酸外切酶活性。Taqman® 探针在3’末端上通过磷酸化来加以保护,以防止它们引发Taq延伸。如果Taqman® 探针杂交到产品链条(strand)上,则延伸Taq分子将会水解该探针,从受体中释放出给体。这是指,在给体和受体之间的相互作用被中断,这样来自每一的信号发生变化以及这一变化能够用作检测的基础。在这种情况下的信号是累积的,游离给体和受体分子的浓度随着该扩增反应的各周期而提高。
杂交探针能够以许多形式获得并且这些也可包括在组合物中。分子信标(beacons)是低聚核苷酸,后者具有互补5’和3’序列,使得它们形成发夹环(hairpin loops)。当形成发夹结构时,末端荧光标记紧密接近以便于FRET发生。在分子信标(beacons)杂交到互补序列上之后该荧光标记物被分离,因此FRET不会发生,这形成了在聚合酶链式反应中的检测基础。
一对的已标记的低聚核苷酸也可在聚合酶链式反应的检测中用作探针。这些在PCR产品链条上紧密接近地杂交-将给体和受体分子置于一起,以便FRET能够发生。增强的FRET是检测的基础。这一类型的方法例如已描述在欧洲专利申请No.0912760中,它的整个内容通过引用结合进来。这一类型的变型包括使用具有单个相邻的探针的已标记的扩增引物。
WO99/28500(它的整个内容通过引用结合进来)描述了用于检测靶核酸序列在样品中的存在的非常成功的测定方法。在这一方法中,DNA双螺旋结合剂和该靶序列特异性探针被添加到样品中。该探针包括反应性的分子,后者能够吸收来自所述DNA双螺旋结合剂中的荧光或将荧光能量给予所述DNA双螺旋结合剂。该混合物然后进行扩增反应,其中靶核酸被扩增,并且在其中探针杂交到靶序列上的扩增过程中或之后诱导各种条件。监测来自所述样品的荧光。
因此,也可制备适合用于该测定(已知为“Resonsense”TM)中的组合物。在这种情况下,组合物将适宜地进一步包括DNA双螺旋结合剂如插入性染料。
采用能够吸收从探针上的荧光标记物发出的荧光能量但不发射可见光的DNA双螺旋结合剂的这一测定方法的可替换形式已描述在WO2004/033726中,该文献通过引用结合进来。
一般,用于这些类型的测定中的全部探针例如通过磷酸化或通过标记直接连接到3'羟基上,被阻断到不在3’末端处延伸。这防止探针用作二次引物并在PCR过程中延伸,从而消除干扰性产品。可替换性地,一个标记可以经过定位使得该标记在空间上抑制被该酶引起的延伸而不是受到化学抑制,和/或3’碱基或探针可以含有不匹配以使得延伸的效率显著地降低,这是现有技术中众所周知的。
用于任何特殊组合物中的探针的量将根据各种因素来变化,如它在PCR过程中是否被消耗或水解,以及信号发出系统的性质。这些是本领域中那些技术人员所能够理解的。然而,一般来说,被添加到组合物中的该探针或每一探针的量将足以确保在最终组合物中探针的浓度是在0.05μM至1μM之间,例如约0.2μM。
其它的实时测定采用标记的引物,以便提供监测系统。这些引物中的一些可以包括自探测性“尾”并且已知为“蝎子(Scorpion)”引物。标记的探针利用“封端基团”连接到用作反应的引物的DNA序列上,所述封端基团适宜地是化学连接剂或非扩增性单体如六乙二醇并且它防止延伸反应(其扩增该低聚核苷酸的探针区域)。该一般类型的探针/引物组合已知为“蝎子(Scorpions)”并且这些例如已描述在WO 99/66071中。该蝎子可以沿着它的长度包括给体/淬火剂对,以使FRET信号发出是可能的,如上所述。
称作LUXTM(延伸时的光)荧光产生性引物的其它类型的实时探针也可获得。这些是“发夹”状探针,类似于如上所述的分子信标。然而,LUX引物在溶液中采取茎-环结构,并且与蝎子探针类似,LUX引物预期用作PCR引物。它们不含有淬火剂部分,因为它们是发荧光的低聚核苷酸,经过设计可以基于序列范围(sequence context)发生自淬灭。当在溶液中游离时LUX引物发生淬灭,当变性时微弱地发荧光,当引入到DNA中时强烈地发光。这些也可包括在本发明的组合物中。
包括在试剂组(i)中的聚合酶经过选择以使得它可用于进行所需的“实时”测定。因此对于一些测定如Taqman® (其中探针的水解是主要的,以便引发可检测信号),具有高水平的5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶是适宜使用的,而对于一些测定如ResonsenseTM测定(其中使用探针杂交),该活性可以是低的或缺乏的。该聚合酶适宜是热稳定的聚合酶,它将在为了进行聚合酶链式反应所需要的升高的温度下进行操作并承受该升高的温度。添加的聚合酶的量应该足以进行PCR反应,这是现有技术中所能够理解的。典型地,聚合酶的添加量足以提供0.02-1.0 U/μl反应组合物和典型地约0.025 U/μl反应组合物的最终浓度。
适宜地,反应组合物可进一步包括用于确保聚合酶链式反应不过早起始的试剂。所谓的“热起始(Hot-Start)”PCR可以受到各种方法影响。
由“热起始”PCR解决的问题出现了,这是因为成功的PCR依赖于按照非常精确的顺序并且在某步骤的操作所需要的精确温度下发生的各个步骤的序列:变性,退火(annealing)和延伸。例如在反应的起始之前,当各种试剂在不同温度下被混合在一起时,甚至短时间,会引起问题。引物可以与核酸模板相互作用,导致模板的引物延伸。这能够导致所需产物的总收率的减少和非特异性产物的生产。
为克服该问题的最初尝试是使用蜡阻隔层,以在试管中将各种PCR试剂彼此分离开(参见例如USP 5,565,339)。作为反应混合物所熔化的蜡被加热至初始变性温度,从而使这些试剂在最后可能的时刻被混合在一起,这样副反应的可能性减到最少,并且这样产生了短语“热起始(Hot Start)”。
已经尝试了用于实现副反应的抑制的其它化学方法。例如,US专利No.5,677,152描述如下方法:其中DNA聚合酶经过化学改性以确保它仅仅在升高的温度下变得有活性。为了实施该方法,需要在以上(i)项中仅仅包括适当改性的DNA聚合酶。
在另一个实施方案中,栖热菌属水生生物(Taq)DNA聚合酶的单克隆抗体如可从Clontech,Sigma & Invitrogen获得的抗Taq DNA聚合酶抗体,被包含在组合物中。该抗体结合于酶活性部位,从而使它在环境温度下失去活性。然而,在扩增周期中所使用的升高温度下该抗体会变性并且从酶上离解,因此该酶变得有活性。
包含在组合物中的任何抗-Taq抗体的相对量适宜足以确保它能够实现抑制Taq酶的功能,直至根据要求为止。因此,一般来说,将使用比Taq酶过量的抗-Taq抗体。因此例如对于在组合物中每单位的Taq酶,将包括至少1.5单位和优选至少2单位的抗-Taq抗体。Taq抗体通常是以μg销售并且该浓度非常依赖于抗体的来源和质量以及测定的性质。太多的抗体可以是有害的并且能够在一些测定中实际上引起更多的引物二聚体。然而,Taq抗体的精确量将根据通常的实践来确定并且典型地是在0.001-0.004μg/μl最终反应混合物的范围内。
牵涉到防止引物延伸发生的抑制性用量的焦磷酸盐与在升高的温度下消化该焦磷酸盐的焦磷酸酶的联合使用从而允许PCR进行的又一种热起始(Hot-Start)方法已描述在WO02/088387中,它的整个内容被结合进来作为参考。
在这种情况下,该焦磷酸盐和焦磷酸酶可以作为本发明组合物的附加组分包含进来。
任选的稳定剂的使用和精确选择将在一定程度上取决于预期使用该最终组合物所进行的具体测定方法并且这能够通过使用常规方法来测试。例如,已经发现,当组合物包括DNA双螺旋结合剂和有意使用的已标记的探针时葡聚糖是不太优选的并且试图用于进行如上所述的ResonSenseTM测定。然而,PEG是大多数的这些组合物可容许的稳定剂。当使用时稳定剂适宜以如下量添加:该量使得它占最终组合物的约1-3%m/v或1-3%w/w。
如以上所讨论,(i)项的试剂组可包含组分如缓冲剂、引物、核苷酸和任选的盐,其含量一般是对于PCR反应混合物的制备所理解的用量。引物适宜过量存在并且这典型地通过包括足够的引物以确保在最终的反应组合物中各引物的浓度是大约0.1μM-1μM而实现。然而,正如下面更详细讨论,为干燥制备成饼块组合物形式的组合物适宜是更稀的,因此在这些组合物中引物(和实际上全部其它试剂)的摩尔浓度将会相应地降低。
在特殊的实施方案中,在PCR反应混合物中常用的阻断化合物可包括在组合物中。该阻断化合物被认为通过防止因为与反应器壁之间的相互作用所引起的PCR的抑制,例如通过防止金属的浸析或通过螯合在反应过程中可能从反应器壁浸析出的任何金属,来起作用。还可减少酶和核苷酸析出(abstraction)到反应器壁上。阻断化合物的性质将取决于将在其中进行反应的容器的性质。
阻断化合物的具体例子是玻璃涂覆化合物或玻璃阻断化合物类如牛血清清蛋白(BSA),单独使用或与其它阻断材料如明胶相结合使用。如上所述,明胶可以从各种的来源获得,其中包括牛,猪,海藻(角叉菜胶)或鱼明胶。
阻断剂适宜以有效量包含在其中,该量取决于所选择的具体化合物。然而,例如对于BSA,该量适宜足以在最终的反应组合物(即,为进行化学或生物化学反应所配制的组合物)中提供0.1-1 mg/ml和优选约0.25 mg/ml(的浓度)。明胶适宜是以约0.0025%-0.01%m/v或约0.0025%-0.01%w/w范围内的量存在。应该小心阻断剂的量不是高得足以显著地抑制最终的反应。
其它组分可以包含在组合物中,这是PCR技术领域中所理解的。这些可以包括用作内部对照的序列以及用于扩增这些序列的引物和发信号系统如以上对于检测内部对照序列的扩增所列出的那些。
本发明的组合物适宜通过如下来制备:将以上所述的所需组分混合在一起形成组合物,然后将水(优选,已经用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的无菌水)添加到组合物中进行混合,例如通过添加最终反应组合物体积的至少等体积的水,优选1-1.5倍体积的水。尤其,在这一阶段中形成的该体积的饼块混合物是比预期被形成后用于化学或生物化学反应本身中的混合物更稀。尤其添加足够的水来确保组合物的体积或含有为进行化学或生物化学反应如PCR所使用的足够材料的各等分试样的体积是预期进行该PCR的最终反应组合物的建议体积的1.5-5倍,适宜约两倍。所形成的混合物如果需要的话被分配成合适的等分试样(每一个等分试样含有为在单个反应罐中的PCR所使用的足够材料),然后进行冷冻干燥过程。如果冷冻干燥没有立即进行,则最终的混合物适宜在低温下,例如在冰上或在电冰箱中贮存(如果该延迟时间段被延长超过了约0.5小时),直到进行冷冻干燥为止。
所使用的冷冻干燥规程在一定程度上取决于被干燥的具体组合物并且在各情况下通过使用常规程序来测定。典型地,组合物进行冷冻步骤,其中该组合物被冷却至低温例如约-20℃至-60℃和一般约-40℃,压力为300-400托,然后在这一温度下保持足够的时间以确保发生完全的冷冻。
然后根据所使用的具体冷冻干燥器,该压力然后被降低至合适的水平。一些可以在低至6毫托(Mtorr)的压力下操作,但是对于本发明的目的,10-100 毫托(m Torr)的压力可以适合让水升华。适宜地,然后组合物回到室内温度和压力。这可以通过在释放真空以最大程度减少冷凝效果之前通过让组合物在减压下逐渐回到室温来进行。
任选地,该真空是在惰性气氛如氮气的存在下释放,因此该产品保持在惰性环境中。这支持寿命并且防止水分进入。
以这种方法获得的冷冻干燥的产物,它适宜立即包装在例如箔包装材料中,以便最大程度降低污染风险。如果组合物装在容器如试剂罐内,则这些适宜在释放真空之前被密封。箔包装材料包括由铝箔、含铝聚合物层压箔或挤出物制成的包装材料。它还包括诸如Mylar® 之类的材料,它有高强度以便制成理想的包装材料供长期贮存用。该包装材料提供次级阻隔层以减少气体交换和水分进入。
必须小心以确保在该组合物中所使用的全部试剂不含有能够在可以发现的水平上抑制或防止冷冻干燥的那些物质或污染物。因此例如,可能需要除去物质如甘油,这些物质有时包含在商购的酶如聚合酶、逆转录酶聚合酶和RNA酶抑制剂中,和/或需要减少物质如二甲基亚砜(DMSO)的量,这类物质可以在可以用作DNA双螺旋结合剂的插入性染料中发现。这可以通过现有技术中公知的标准方法例如透析、超分离法和排阻色谱法来实现。
以上所述的组合物已经发现可稳定更长的时间,其中包括长达3个月和进一步长达9个月,在这些时间的末尾,根本没有见到活性损失。
形成以上所述的组合物的方法构成本发明的再一个方面。在具体的实施方案中,本发明提供了制备冷冻干燥组合物的方法,该方法包括将至少以上(i)-(ii)项混合在一起,并冷冻干燥所形成的混合物。
在使用中本发明的组合物通过使用常规方法,例如通过使用再水合缓冲剂进行水合,然后进行合适的化学或生物化学反应。一般,在进行反应之前组合物与化学样品或生物化学样品混合。例如,对于聚合酶链式反应的情况,反应混合物与含有或被怀疑含有靶核酸且任选还含有再水合缓冲剂的样品组合,然后最终的混合物经历PCR条件。当包括发信号试剂时,根据需要在该过程之前、过程中或之后监测信号例如来自荧光试剂的荧光。尤其,根据需要实时监测该信号,从而允许监测反应的进程和量化在样品中靶的量,这是现有技术中可理解的。此类方法构成了本发明的再一个方面。
本发明现在参考附图通过实施例来具体描述,其中:
图1是在室温和30℃经过21天的时间贮存的冷冻干燥试剂的平均Ct值(+/-sd)的图解对比;和
图2是一系列的曲线,它们显示了在30℃经过9个月时间贮存的冷冻干燥的试剂的Ct值(+/-sd)和荧光值。
实施例1
用于在海藻糖和蜜三糖存在下检测枯草芽孢杆菌var. globigii(BG) DNA和孢子的PCR抑制测定的研究
通过将用于20μL或25μL反应的多个下列试剂组合来制备PCR母体混合物(mastermix)。
表1
向该母体混合物的样品中,将添加剂,或者是50% (m/v)海藻糖(对于20μL反应混合物使用2μL或对于25μL反应混合物使用2.5μL)或者是25%(m/v)蜜三糖(对于 20μL反应使用4μL或对于 25μL反应使用5μL)添加进去,以生产5% (m/v)海藻糖或5%(m/v)蜜三糖组合物。在海藻糖或蜜三糖不存在的情况下进行对照反应。通过使用水代替模板DNA来制备阴性对照。
这些非冷冻干燥的配制剂然后转移到LightcylerTM毛细管中,然后毛细管被封端。它们简单地进行离心和然后装入针对LightCycler 1.0(Roche)的转子上,然后使用下面的规程进行PCR反应:
经过一定范围的系列稀释,在每一周期中用单次收获来读取来自Taqman® 探针的信号。平均浓度(Ct)、荧光和信号/噪音比在表1A中进行对比。
表1A
用不同组的BG引物和探针重复该实验,结果总结在表2中。
表2
结果表明,所有的测定都没有不利地受到5% (m/v)海藻糖或5% (m/v)蜜三糖的添加所影响,其中在BG DNA的任何浓度下所观察到的Ct值、平均荧光或信号/噪音比上没有差异。
实施例2
用于在冷冻干燥之后在海藻糖和蜜三糖存在下检测枯草芽孢杆菌var. globigii(BG) DNA和孢子的PCR抑制测定的研究
因为蜜三糖或海藻糖都不抑制在非冷冻干燥的配制剂/反应混合物中的任何一个测定,所以这些赋形剂是在有或没有1% (m/v) PEG(最终)的存在下作为冷冻干燥的配制剂进行测试的。制备按照在实施例1中所述但是添加或没有添加1% (m/v)PEG的反应混合物,然后使用VirTis Advantage冷冻干燥机进行冷冻干燥,该冷冻干燥机经过设定以执行在表3中列出的程序。
表3
所得到的冷冻干燥混合物(饼块)立即再悬浮在缓冲剂中,然后进行在实施例1中所述的PCR规程。全部的饼块制备成50μL溶液(2x)形式和再悬浮至25μL。
对于所述两个Taqman® BG测定,将平均Ct、荧光和信号/噪音反应的比较结果分别列于表4和5中。
表4
表5
对于两个测定使用全部四个配制剂获得了阳性的PCR曲线,对于任何一种的混合物在Ct值上没有明显的差异。
在第一个测定中,对于两种浓度的BG DNA来说,含有海藻糖但没有PEG的配制剂和含有蜜三糖且包括1% (m/v)PEG的配制剂具有与非冷冻干燥(湿)的配制剂对照例类似的信号/噪音比值(上述 表4)。在第二个测定中,含有单独蜜三糖的配制剂或含有蜜三糖与1% (m/v)PEG的配制剂保持了与在非冷冻干燥的配制剂混合物中所观察到的那些值最接近的信号/噪音比值,表明这些是优选的混合物。
实施例3
蜜三糖在用于在双杂交测定中检测BG的组合物中作为玻璃形成用试剂和稳定剂时的评价。
宽泛地按照实施例1的程序,只是使用双杂交探针对代替单个Taqman® 标记的探针,并且使用在表6中所列出的试剂。在这种情况下,探针被设计以杂交到扩增的BG DNA上,这样FAM和Cy5标记彼此非常靠近。
表6
如前所述,一旦这些试剂已经结合在反应管中,它们被放置在冷冻干燥器(Virtis Advantage)内,该冷冻干燥器已经预先被冷却至+5℃,然后经过设定以执行在以上表3中所列出的程序。
制备每种混合物的五个复制品。对冷冻干燥的饼块的外观进行分析,结果列于下表7中。
这些然后通过干燥混合物的重构和BG DNA的添加来进行进一步对比。各混合物然后通过使用下面的规程在LightCyclerTM中进行PCR:
5个复制品的平均Ct值和平均信号的结果列于表7中。
表7:用不同浓度的海藻糖和蜜三糖制备的冷冻干燥的饼块的属性的观察结果。
冷冻干燥的饼块看起来更干燥,因为海藻糖或蜜三糖的浓度提高且在两者之间没有明显的差异。在蜜三糖和海藻糖之间和在所述两种试剂的不同浓度内,Ct值都类似。一般来说,蜜三糖的结果与海藻糖的那些类似,表明它能够在没有不利影响的情况下在冷冻干燥的配制剂中被替代。然而,蜜三糖具有附加的性能,即作为就地干燥剂,因此预期会改进组合物的稳定性。
实施例6
苏氨酸对于组合物的影响
用在表8中列出的组分来配制Taqman® 混合物:
表8
没有L-苏氨酸的情况下,制备类似的混合物。然后按照在实施例2中所述,两种混合物进行冷冻干燥。将含有所述冷冻干燥的试剂的双箔层罐放入到在室温和在30℃的塑料皮氏培养皿中。将该室温罐在非温度控制的实验室中在橱柜中贮存。通过使用下列规程以25μL的最终反应体积进行PCR,在0天和然后在第1,6,9,14,21和28天测试每一种所述冷冻干燥的试剂配制剂。
该结果与新制备的组合物的结果进行对比。
通过使用LightCycler® 1.0数据来确定Ct、信号和信噪比值。使用以下方程式得到信号/噪音比值:
其中,信号 = 所记录的最后值(在第50个周期)
噪音 = 在首先10个周期中记录的最高值和最低值之间的差值
在室温下贮存的组合物的结果示于表9中,和在30℃贮存的组合物的结果示于表10中。
表9
表10
结果表明,两种配制剂经过试验的时间在室温下是稳定的。当在30℃贮存时,结果表明组合物稳定了21天。
然而,当在30℃贮存时含有L-苏氨酸的配制剂在全部时间点具有更好的信号发出功能(参见图1)。来自含有L-苏氨酸的组合物中的信号明显较低程度受抑制,与省略L-苏氨酸的类似组合物的信号相比。因此看起来由于抗氧化剂/抗梅拉德性能的结果,L-苏氨酸的使用不仅有助于稳定性,而且它将会降低荧光信号的损失。
实施例7
在用于RT-PCR测定的组合物中作为玻璃形成用试剂和稳定剂的蜜三糖和海藻糖的比较。
制备在表11中所列出的组合物。
表11
*RT缓冲剂配制剂是600 mM乙酸钾(120mM最终),200mM N-二(羟乙基)甘氨酸(40mM最终),牛血清清蛋白2.5 mmg/ml(500 ng/μL最终),和1 mM dNTP(20μM最终)。
按照在以上实施例2中所述,它们然后进行冷冻干燥。通过在冷冻干燥之前将混合物A和B混合在一起来制备海藻糖饼块配制剂。在两种情况下(海藻糖和蜜三糖),在这一阶段的饼块配制剂是实际反应体积(25μL)的体积的两倍(50μL)。
在冷冻干燥之后,对于海藻糖和蜜三糖产物进行下面观察。海藻糖饼块具有澄明的“太妃糖”稠度,它还没有形成饼块。由于所得饼块的性质,溶解是困难的。蜜三糖饼块已经形成,虽然它看起来有一点塌陷。然而,它容易再悬浮并优选操作。
表11的组合物然后通过将水和DNA以所需浓度添加到25μL水的总体积中来重构。
这些组合物,以及新鲜制备的且没有进行冷冻干燥的组合物,然后进行RT-PCR。通过使用下面的热和光学规程,在Roche LightCycler 1.0仪器上扩增样品。
结果列于下表中。
Ct值
荧光值
在这些表中,“非冷冻干燥的配制剂”是指没有进行冷冻干燥的组合物。“赋形剂”是指根据在各列中的实验,海藻糖或蜜三糖的包含。
该蜜三糖组合物一致地得到以下结果:它们与非冷冻干燥的配制剂组合物的结果更相符,因此被认为是优选的配制剂。
实施例8
本发明组合物的长期稳定性
用于最终测定中的包含质粒DNA作为内部对照的竞争性的双螺旋Taqman® 混合物是用列于表12中的组分配制的:
表12
按照实施例2中所述方法,混合物进行冷冻干燥。
冷冻干燥的试剂配制剂在30℃贮存,通过使用下面的规程以25μL的最终反应体积进行PCR,测试9个月的时间的稳定性。
结果示于图2中。图2A和2B显示了在30℃贮存,九个月时间所达到的Ct值。数据显示了分别使用特异性模板DNA(添加的)和内部对照DNA(包含在冷冻干燥的饼块中)所进行的扩增的结果。图2C和2D显示了分别对于模板DNA和内部对照DNA,9个月时间的荧光值(在曲线平台处的最高平均值)。
在每一时间点使用两种浓度的DNA和大约2000份(虚线,菱形)和200份拷贝(实线,圆)并且PCR按照一式三份进行重复,该曲线显示了在每一时间点上的平均(+/-)1标准偏差。
虽然该Ct值是变量,但是,对于模板DNA或对于IC DNA来说,在0天与9个月之间在DNA的最低浓度在Ct值上没有明显差异。随着时间的推移荧光值稍微降低,但是对于模板或内部对照扩增都没有导致阴性结果。
Claims (27)
1.用于进行化学或生物化学反应的组合物,所述组合物呈现冷冻干燥的形式并包括(i)试剂组,所述试剂组包括至少一些进行所述化学或生物化学反应所必需的化学或生物化学试剂,和(ii)蜜三糖;
其中所述组合物不含有单体型糖醇。
2.根据权利要求2的组合物,其中所述蜜三糖是蜜三糖五水合物。
3.根据权利要求2或权利要求3的组合物,其中所述蜜三糖的存在量使得在为了进行化学或生物化学反应而由所述组合物重构的最终组合物中,它以2.5-10% (m/v)的量存在。
4.根据权利要求2-4中任何一项的组合物,进一步包括抗氧化剂或抗梅拉德剂。
5.根据权利要求5的组合物,其中所述抗氧化剂或抗梅拉德剂是苏氨酸。
6.根据权利要求1-5中任何一项的组合物,进一步包括针对玻璃形成用试剂的稳定剂。
7.根据权利要求6的组合物,其中所述稳定剂选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)或多糖。
8.根据权利要求1-7中任何一项的组合物,其中所述试剂组包括荧光试剂或生物发光试剂。
9.根据权利要求1-8中任何一项的组合物,其中所述试剂组(i)是特别适合于进行聚合酶链式反应(PCR)或逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)的一组试剂。
10.根据权利要求9的组合物,其中所述试剂组包括当在聚合酶链式反应中粘附于模板核酸序列上时能够延伸引物的聚合酶。
11.根据权利要求10的组合物,其中所述聚合酶是RNA/DNA依赖性聚合酶,如Tsec。
12.根据权利要求10或权利要求11的组合物,其中(i)的混合物包括缓冲剂、引物和适合于进行聚合酶链式反应以扩增DNA序列的核苷酸。
13.根据权利要求12的组合物,其中所述试剂组进一步包括适合于进行聚合酶链式反应以扩增DNA序列并且与所述聚合酶相容的镁和/或锰盐。
14.根据权利要求9-13中任何一项的组合物,它进一步包括选自可用于实时监测聚合酶链式反应的进程的荧光染料或DNA结合剂或荧光标记的低聚核苷酸中的荧光试剂。
15.根据权利要求14的组合物,其中所述荧光试剂是在测定中用作探针并且携带两个标记物的已标记的低聚核苷酸,其中的一个标记物能够用作能量给体,另一个标记物能够用作该能量的受体。
16.根据权利要求14或权利要求15的组合物,其中所述荧光试剂是分子信标形式的已标记的低聚核苷酸。
17.根据权利要求14的组合物,它包括成对已标记的探针,其中的一个已标记的探针携带属于荧光能量给体的标记物,其中的另一个已标记的探针携带能够接受来自所述能量给体的荧光能量的标记物,和其中该探针在PCR产物链条上紧密接近地杂交。
18.根据权利要求15-17中任何一项的组合物,其中所述组合物进一步包括DNA双螺旋结合剂,后者能够与所述荧光标记的低聚核苷酸交换能量。
19.根据权利要求9-18中任何一项的组合物,它进一步包括能够控制PCR反应的引发的一种或多种试剂。
20.根据权利要求19的组合物,其中所述试剂是抗-Taq抗体。
21.根据权利要求1-19中任何一项的组合物,它进一步包括阻断化合物。
22.制备根据权利要求1-21中任何一项的组合物的方法,所述方法包括将所述组合物的组分与水混合在一起,并冷冻干燥所形成的混合物。
23.根据权利要求22的方法,其中所述所形成的混合物的浓度低于从所述冷冻干燥的组合物重构的所建议的最终组合物的浓度。
24.试剂盒,它包括根据权利要求1-21中任何一项的组合物和再水合缓冲剂。
25.根据权利要求24的试剂盒,其中所述组合物不含有进行PCR所必需的盐,并且所述再水合缓冲剂包括所述盐。
26.用于进行化学或生物化学反应的方法,该方法包括将根据权利要求1-21中任何一项的组合物进行水合,并让所述组合物经历如下条件:在所述条件下将发生化学或生物化学反应。
27.蜜三糖在单体型糖醇(多元醇类)不存在下用作冷冻干燥的组合物所使用的玻璃形成用试剂的用途,该组合物预期用于进行化学或生物化学反应。
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