CN1370842A - 基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法和试剂盒,属分子生物学检测领域。具体的是从基因改造农作物及其加工产品中提取脱氧核糖核酸(DNA),应用多聚酶链式反应(PCR)和限制性内切酶(R.E.)分析技术(酶切技术)对基因改造农作物及其加工产品中的基因改造成分(genetically modified organisms,GMOs)进行定性检测的方法和试剂盒。采用本发明的方法和试剂盒,可以方便准确地判定一种农作物或其加工产品是否含有基因改造成分。
Description
本发明属分子生物学检测领域，涉及基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法和试剂盒。具体的是从基因改造农作物及其加工产品中提取脱氧核糖核酸(DNA)，应用多聚酶链式反应(PCR)和限制性内切酶(R.E.)分析技术(酶切技术)对基因改造农作物及其加工产品中的基因改造成分(genetically modifiedorganisms，GMOs)进行定性检测的方法和试剂盒。
1983年，世界上第一例基因改造植物问世，这标明生物技术的发展已经可以使植物遵从人类的意愿生长。1994年，美国Calgene公司研制的基因改造番茄成为世界上第一个获准商品化生产的基因改造农作物。此后，在美国、加拿大、阿根廷和欧洲，先后有数十种基因改造农作物获准商品化生产，这主要包括基因改造的大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、西葫芦、番木瓜、番茄和南瓜等。在我国，目前有五种基因改造农作物获准商品化生产，其中三种为基因改造的番茄，另外两种是基因改造的甜椒和棉花，还有一种基因改造的花卉——矮牵牛也获准了商品化生产。
基因改造农作物由于具有抗虫、抗除草剂、抗病毒以及品质改善等优点而得到大面积推广。据统计，去年全球基因改造农作物的种植面积已达到4000万公顷，其中超过半数为基因改造的大豆，另有近30％为基因改造的玉米。作为全球最大的基因改造农作物种植国，美国出口的食品中约60％含有基因改造成分。
1998年英国的一位科学家实验发现，老鼠食用了基因改造的马铃薯后，体重减轻，器官出现异常，且免疫系统受到破坏。这在英国引起了轩然大波，尽管后来其所在的实验室对这一结果进行了更正，但基因改造农作物及其加工产品的安全性依然引起人们的质疑：尽管目前没有直接的证据显示基因改造农作物及其加工产品对人类有现实的危害，但科学家们也无法证明已食用的基因改造农作物及其加工产品对人类的未来不存在危害。
因此，在西方发达国家，尤其是欧洲，人们对基因改造农作物及其加工产品表现出了强烈的抵触情绪。政府也采取相应的措施，对基因改造农作物及其加工产品进行检测并加以标签，标明是否含有基因改造成份及其含量，使消费者具有知情权，可以自由选择基因改造农作物及其加工产品。
但由于在基因改造农作物中基因改造成分在农作物的基因组中所占的比例是非常微小的，且由于产品加工过程中的高温高压处理对基因的破坏，以及所加工的产品中存在的抑制因子，因此对基因改造农作物及其加工产品中基因改造成分的检测是很困难的。
在国外，科学家们正在努力研究与改进基因改造农作物及其加工产品的检测方法，以适应种类繁多的基因改造农作物及其加工产品。而在我国，目前政府还未出台与基因改造农作物及其加工产品相关的法规和管理标准，在基因改造农作物及其加工产品的检测方法上还是空白。
本发明的目的旨在提供通用的对基因改造农作物及其加工产品进行定性检测的方法及试剂盒。
本发明的基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法如下：
标准的检测流程包括四个部分：基因改造农作物及其加工产品DNA的提取；利用PCR技术扩增出基因改造成分；利用酶切技术对所扩增的基因改造成分进行鉴定；对检测结果进行科学的通用的解释。
为防止PCR结果对样品的污染，DNA的提取、PCR的准备、PCR的运行及PCR结果的分析要分开不同的房间进行。
第一步、基因改造农作物及其加工产品DNA的提取
(一)待测样品的前处理：
粉末状的待测样品不需处理；非粉末状的固体待测样品要处理成粉末状；液态待测样品采用冷冻干燥法干燥并研碎成粉末状；新鲜的待测样品清洗干净即可。如：
对于坚硬的食品，例如黄豆、玉米粒等，采用食品加工机或研钵进行研磨，成为粉末状；
对于固体的非坚硬食品，例如饼干、薯片等，采用研钵或镊子将其捣碎，成为粉末状；
对于固体的粉末状的食品，例如豆粉、面粉等，可直接用于分析；
对于半固体的食品，例如番茄酱、腐乳等，采用冷冻干燥法，并研碎成为粉末；
对于液体的食品，例如豆奶、啤酒等，采用冷冻干燥法，并研碎成为粉末；
对于新鲜的食品，例如新鲜的马铃薯、番茄等，可清洗干净后，直接用于分析。
在进行前处理的时候，每处理完一个样品，要及时清理器具，采用洗涤液、酒精及高温灭菌等方式，防止食品的交叉污染。
(二)提取待测样品的DNA，方法一如下：
1.称取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)离心管中，缓慢加入700微升(μl)CTAB提取缓冲液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/LCTAB，pH8.0，使用前加入体积比为1％的巯基乙醇)，充分混匀。
若是新鲜食品，则直接称取200mg放入盛有700μl提取缓冲液的1.5ml离心管中，用镊子在缓冲液中捣碎食品。
2.将离心管置于60℃水浴中，放置45分钟，期间混匀数次。
3.加入等体积氯仿，充分混匀。
4.室温下12,000rpm离心10min。
5.将上清转移到一个新的离心管中，重复氯仿抽提过程一遍。
6.将上清转移到一个新的离心管中，加入1ml树脂，例如Promega公司的Resin，充分混匀。
7.将混合液通过一个过滤柱(column)，例如Promega公司的Minicolumn。
8.用2ml清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗过滤柱，重复一遍。
9.室温下11,000rpm离心过滤柱2min。
10.向过滤柱上加入70℃重蒸水50μl，温育5分钟。
11.室温下11,000rpm离心过滤柱2min。
12.收集洗脱液。
13.用紫外分光光度计测定DNA的浓度，稀释成终浓度为50ng/μl，储存于-20℃冰箱，备用。
提取待测样品的DNA的方法二如下：
1.称取200mg食品粉末，放入1.5ml离心管中，缓慢加入860μl提取缓冲液(10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)，充分混匀。
若是新鲜食品，则直接称取200mg放入盛有860μl提取缓冲液的1.5ml离心管中，用镊子在缓冲液中捣碎食品。
2.加入100μl 5M盐酸胍溶液，混匀。
3.加入40μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀。
4.将离心管置于60℃水浴中，放置3小时，期间混匀数次。
5.在室温下冷却5分钟。
6.室温下13,000rpm离心10min。
7.将上清转移到一个新的离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀。
8.室温下12,000rpm离心10min。
9.将上清转移到一个新的离心管中，重复氯仿抽提过程一遍。
10.将上清转移到一个新的离心管中，加入1ml树脂，例如Promega公司的Resin，充分混匀。
11.将混合液通过一个过滤柱(column)，例如Promega公司的Minicolumn。
12.用2ml清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗过滤柱，重复一遍。
13.室温下11,000rpm离心过滤柱2min。
14.向过滤柱上加入70℃重蒸水50μl，温育5分钟。
15.室温下11,000rpm离心过滤柱2min。
16.收集洗脱液。
17.用紫外分光光度计测定DNA的浓度，稀释成终浓度为50ng/μl，储存于-20℃冰箱，备用。
第二步、利用PCR技术扩增出基因改造成分
(一)检测标记及对照基因的确定
由于在植物基因转化过程中所使用的大部分的植物转化中间载体均含有CaMV35S启动子、Nos终止子、抗生素筛选标记基因NPTII以及除草剂筛选标记基因Bar，因此可以将它们作为通用的基因改造农作物及其加工产品检测标记。另外由于Monsanto公司的“Roundup Ready”抗除草剂大豆和Novartis公司的“Event176”抗虫玉米在基因改造农作物的市场上占有较大的份额，因此“Roundup Ready”所含有的基因改造成分EPSPS基因和CaMV 35S-CTP基因结构，以及“Event 176”所含有的CryIA(b)基因也可以作为特定的含有“Roundup Ready”大豆或“Event 176”玉米以及其它的含有这些基因改造成分的基因改造农作物及其加工产品的检测标记。还有一些基因由于能够提供抗虫、抗病毒、耐贮存及改善品质等特点，而在农作物的基因改造中被广泛使用，因此它们也可以作为基因改造农作物及其加工产品检测标记，例如：
存在于基因改造的抗虫马铃薯中的CryIIIA基因；
存在于基因改造的月桂酸含量增高的油菜中的ACP基因；
存在于基因改造的耐贮存的番茄中的CaMV 35S-反义PG基因结构；
存在于基因改造的抗病毒的烟草中的CaMV 35S-TMV CP基因结构。
为防止基因改造农作物及其加工产品检测中的假阴性结果，需要设立一系列的对照基因，包括针对所有农作物的DNA降解对照，例如来源于植物的叶绿体特异性基因UAA，和针对基因改造大豆的大豆特异基因Lectin基因，针对基因改造玉米的玉米特异基因Zein和Invertase基因。
(二)鉴定检测体系的可靠性和灵敏度
在开始对样品进行检测以前，应首先进行检测体系的可靠性和灵敏度的鉴定。
选定混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米(购自欧洲的Joint Research Center，Institute for Reference Material and Measurements)，作为标准来鉴定基因改造农作物及其加工产品检测体系的可靠性和灵敏度。按照前面所述的基因改造农作物及其加工产品DNA的提取方法，分别提取它们的DNA，然后对各个检测标记和对照基因进行PCR扩增，同时设立用重蒸水代替DNA模板的空白对照。只有当检测结果如下时，才能证明检测体系的可靠性，同时可以确定检测体系的灵敏度：
以重蒸水代替DNA模板的空白对照，不能扩增出任何检测标记和对照基因片段。
“Roundup Ready”0％的大豆，可以扩增出植物通有的UAA基因和大豆特异的Lectin基因片段。
“Event 176”0％的玉米，可以扩增出植物通有的UAA基因和玉米特异的Zein或Invertase基因片段(Zein和Invertase，可以二者任选其一)。
“Roundup Ready”0.1％和以上的大豆，可以扩增出大豆特异的Lectin基因、CaMV 35S启动子、Nos终止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因结构片段(EPSPS和CaMV 35S-CTP，可以二者任选其一)。则此时检测体系的灵敏度为0.1％，即该检测体系最低可以检测出基因改造成分含量为0.1％的基因改造农作物及其加工产品。若无法从“Roundup Ready”0.1％的大豆中扩增出CaMV 35S启动子、Nos终止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因结构片段，而可以从“Roundup Ready”0.5％和以上的大豆中扩增出这些基因片段，则检测的灵敏度为0.5％，即该检测体系最低可以检测出基因改造成分含量为0.5％的基因改造农作物及其加工产品。依此类推。
“Event 176”0.1％和以上的玉米，可以扩增出玉米特异的Zein或Invertase基因、CaMV 35S启动子、Nos终止子、CryIA(b)基因片段，则此时检测体系的灵敏度为0.1％，即该检测体系最低可以检测出基因改造成分含量为0.1％的基因改造农作物及其加工产品。若无法从“Event 176”0.1％的玉米中扩增出CaMV 35S启动子、Nos终止子、CryIA(b)基因片段，而可以从“Event 176”0.5％和以上的玉米中扩增出这些基因片段，则此时检测体系的灵敏度为0.5％，即该检测体系最低可以检测出基因改造成分含量为0.5％的基因改造农作物及其加工产品。依此类推。
(三)确定基因改造农作物及其加工产品的定性检测PCR引物和限制性内切酶
由于产品的加工过程会对DNA造成降解，因此所扩增的检测标记和对照基因片段应控制在200碱基对(bp)以内，且该片段内最好含有限制性内切酶位点，以利于随后对PCR产物进行酶切鉴定。PCR引物的长度应控制在18-30bp之间，GC含量应控制在30-50％之间。我们选定符合以上条件的PCR引物的位置范围和限制性内切酶如下表：基因改造农作物及其加工产品的定性检测PCR引物位置范围和限制性内切酶列表(表一)
| 引物名称 | 方向 | GenBank序列号 | 位置范围 | 限制性内切酶 |
| CaMV 35启动子引物1 | 5`引物 | AJ251014 | 2401-2601 | EcoRV |
| 3`引物 | 2621-2702 | |||
| CaMV 35启动子引物2 | 5`引物 | 2341-2551 | XmnI | |
| 3`引物 | 2581-2702 | |||
| Nos终止子引物1 | 5`引物 | U84006 | 2786-2896 | AflIII |
| 3`引物 | 2915-3051 | |||
| Nos终止子引物2 | 5`引物 | 2786-2898 | NsiI | |
| 3`引物 | 2925-3051 | |||
| Nos终止子引物3 | 5`引物 | 2787-2899 | NsiI | |
| 3`引物 | 2926-3052 | |||
| NPTII基因引物1 | 5`引物 | V00618 | 161-435 | NciI |
| 3`引物 | 455-856 | |||
| NPTII基因引物2 | 5`引物 | Y18316 | 3841-4075 | PvuII |
| 3`引物 | 4095-4311 | |||
| Bar基因引物 | 5`引物 | X17220 | 31-288 | SalI |
| 3`引物 | 305-571 | |||
| EPSPS基因引物 | 5`引物 | I43998 | 5-170 | NruI |
| 3`引物 | 190-490 | |||
| CryIA(b)基因引物1 | 5`引物 | I41419 | 5-235 | PvuII |
| 3`引物 | 255-555 | |||
| CryIA(b)基因引物2 | 5`引物 | 556-1260 | ||
| 3`引物 | 1261-1861 | |||
| CryIIIA基因引物 | 5`引物 | X70979 | 465-865 | EcoRI |
| 3`引物 | 885-1283 | |||
| ACP基因引物 | 5`引物 | U17097 | 265-565 | KpnI |
| 3`引物 | 585-885 | |||
| CaMV 35S-反义PG基因结构引物 | 5`引物 | AJ251014 | 2461-2702 | |
| 3`引物 | A15981 | 1201-1421 | ||
| CaMV 35S-TMV CP基因结构引物 | 5`引物 | AJ251014 | 2461-2702 | |
| 3`引物 | V01408 | 5715-5941 | ||
| UAA基因引物 | 5`引物 | V00178 | 5-300 | |
| 3`引物 | 301-635 | |||
| Lectin基因引物1 | 5`引物 | K00821 | 981-1115 | StyI |
| 3`引物 | 1125-1425 | |||
| Lectin基因引物2 | 5`引物 | 1201-1300 | ||
| 3`引物 | 1301-1600 | |||
| Zein基因引物 | 5`引物 | X07535 | 5-240 | |
| 3`引物 | 241-541 | |||
| Invertase基因引物 | 5`引物 | U16123 | 770-1070 | NaeI |
| 3`引物 | 1090-1390 | |||
| CaMV 35S-CTP基因结构引物1 | 5`引物 | AJ251014 | 2461-2702 | |
| 3`引物 | M21084 | 5-150 | ||
| CaMV 35S-CTP基因结构引物2 | 5`引物 | AJ251014 | 2461-2702 | |
| 3`引物 | M21084 | 150-350 |
(表一)
针对上面列表中的PCR引物位置范围，我们寻找到最佳的引物序列：基因改造农作物及其加工产品的定性检测最佳PCR引物和限制性内切酶列表(表二)
| 引物名称 | 方向 | 序列 | GenBank序列号 | 位置 | 限 制性 内切酶 |
| CaMV 35启动子引物1 | 5`引物 | 5`-ccg aca gtg gtc cca aagatg gac-3` | AJ251014 | 2512-2535 | EcoRV |
| 3`引物 | 5`-ata tag agg aag ggt cttgcg aag g-3` | 2649-2673 | |||
| CaMV 35启动子引物2 | 5`引物 | 5`-gct cct aca aat gcc atc a-3` | 2455-2473 | XmnI | |
| 3`引物 | 5`-gat agt ggg att gtg cgtca-3` | 2630-2649 | |||
| Nos终止子引物1 | 5`引物 | 5`-gaa tcc tgt tgc cgg tcttgc gat g-3` | U84006 | 2835-2859 | AflIII |
| 3`引物 | 5`-tcg cgt att aaa tgt ataatt gcg gga ctc-3` | 2951-2980 | |||
| Nos终止子引物2 | 5`引物 | 5`-gaatcctgttgc cggtcttg-3` | 2835-2854 | NsiI | |
| 3`引物 | 5`-tta tcc tag ttt gcg cgcta-3` | 2995-3014 | |||
| Nos终止子引物3 | 5`引物 | 5`-tta aga ttg aat cct gtt gccg-3` | 2827-2848 | NsiI | |
| 3`引物 | 5`-taa ttt atc cta gtt tgcgcg c-3` | 2997-3018 | |||
| NPTII基因引物1 | 5`引物 | 5`-cac gac ggg cgt tcc ttgc-3` | V00618 | 363-381 | NciI |
| 3`引物 | 5`-ggt ggt cga atg ggc aggtag c-3` | 535-556 | |||
| NPTII基因引物2 | 5`引物 | 5`-gcc atg atg gat act ttctcg gca gga gc-3` | Y18316 | 3972-4000 | PvuII |
| 3`引物 | 5`-acc tgt ccg gtg ccc tgaatg aac tgc-3` | 4141-4167 | |||
| Bar基因引物 | 5`引物 | 5`-ggc acg caa cgc cta cgact-3` | X17220 | 264-283 | SalI |
| 3`引物 | 5`-agc ccg atg aca gcg acc ac-3` | 394-413 | |||
| EPSPS基因引物 | 5`引物 | 5`-gca aat cct ctg gcc tttcc-3` | I43998 | 99-118 | NruI |
| 3`引物 | 5`-ctt gcc cgt att gat gacgtc-3` | 224-244 | |||
| CryIA(b)基因引物1 | 5`引物 | 5`-ctg gtg gac atc atc tggggc atc ttc g-3` | I41419 | 178-205 | PvuII |
| 3`引物 | 5`-ttg gta cag gtt gct caggcc ctc c-3` | 300-324 | |||
| CryIA(b)基因引物2 | 5`引物 | 5`-gtg gac agc ctg gac gagat-3` | 1219-1238 | ||
| 3`引物 | 5`-tgc tga agc cac tgc ggaac-3` | 1305-1324 | |||
| CryIIIA基因引物 | 5`引物 | 5`-acc tta ggg gtt atg gaa c-3` | X70979 | 797-815 | EcoRI |
| 3`引物 | 5`-ctt ggt ctg gtg gaa acat-3` | 947-965 |
| ACP基因引物 | 5`引物 | 5`-gat gga ttc ggt gag aca c-3` | U17097 | 499-517 | KpnI |
| 3`引物 | 5`-tcg cgg aca aga aaa tgg c-3` | 650-668 | |||
| CaMV35S-反义PG基因结构引物 | 5`引物 | 5`-tga tgt gat atc tcc actgac g-3` | AJ251014 | 2601-2622 | |
| 3`引物 | 5`-att tca gag gat gaa gctctt-3` | A15981 | 1389-1409 | ||
| CaMV35S-TMVCP基因结构引物 | 5`引物 | 5`-tca ttt cat ttg gag aggaca-3` | AJ251014 | 2682-2702 | |
| 3`引物 | 5`-gaa cac gaa ctg aga tgg ag-3` | V01408 | 5731-5750 | ||
| UAA基因引物 | 5`引物 | 5`-cga aat cgg tag acg cta cg-3` | V00178 | 91-110 | |
| 3`引物 | 5`-ggg gat aga ggg act tga ac-3` | 603-622 | |||
| Lectin基因引物1 | 5`引物 | 5`-gtg cta ctg acc agc aaggca aac tca gcg-3` | K00821 | 1038-1067 | StyI |
| 3`引物 | 5`-gag ggt ttt ggg gtg ccgttt tcg tca ac-3` | 1173-1201 | |||
| Lectin基因引物2 | 5`引物 | 5`-aac cgg tag cgt tgc cag-3` | 1253-1270 | ||
| 3`引物 | 5`-agc cca tct gca agc cttt-3` | 1315-1333 | |||
| Zein基因引物 | 5`引物 | 5`-tgc agc aac tgt tgg ccttac-3` | X07535 | 203-223 | |
| 3`引物 | 5`-tgt tag gcg tca tca tctgtg g-3` | 250-271 | |||
| Invertase基因引物 | 5`引物 | 5`-ggc cgg atc gtc atg ctctac a-3` | U16123 | 1011-1032 | NaeI |
| 3`引物 | 5`-ttg gcg tcc gac ttg acccac t-3` | 1111-1132 | |||
| CaMV35S-CTP基因结构引物1 | 5`引物 | 5`-tca ttt cat ttg gag aggaca-3` | AJ251014 | 2682-2702 | |
| 3`引物 | 5`-gga att ggg att aag ggtttg tat c-3` | M21084 | 57-81 | ||
| CaMV35S-CTP基因结构引物2 | 5`引物 | 5`-tga tgt gat atc tcc actgac g-3` | AJ251014 | 2601-2622 | |
| 3`引物 | 5`-tgt gct gta gcc act gatgc-3` | M21084 | 223-242 |
(表二)
(四)确定PCR反应体系
PCR反应体系如下：
PCR buffer 1×
MgCl2 2.1mM
dNTPS 0.2mM
Taq DNA polymerase 0.5U
Pfu DNA polymerase 0.5U
Primer 0.5μM
DNA template 100ng
重蒸水 补至20μl
(五)确定PCR反应条件
PCR反应条件如下：
预变性： 94℃ 2分钟
变性： 94℃ 40秒
复性： 50-62℃ 40秒
延伸： 72℃ 40秒
40个循环，最后在72℃延伸10分钟。
PCR产物在3％琼脂糖胶上，110V恒压下电泳30分钟。在紫外灯下检测电泳结果。
第三步、利用酶切技术对所扩增的基因改造成分进行鉴定
为避免所扩增的基因改造成分(即PCR产物)的假阳性情况，需要采用合适的限制性内切酶对PCR产物进行酶切鉴定，只有通过酶切得到相应的基因片段，才能证实PCR产物的正确性。对于扩增片段过短，而无法通过酶切鉴定的，可以通过杂交或测序进行PCR产物的鉴定。
酶切体系如下：
PCR产物 15μl
限制性内切酶buffer 2μl
重蒸水 2μl
限制性内切酶 1μl(10U)
总反应体系 20μl在37℃保温3个小时。然后在3％琼脂糖胶上，110V恒压下电泳30分钟。在紫外灯下检测电泳结果。
第四步、对检测结果进行解释
在检测体系的可靠性得到确认以后，对基因改造农作物及其加工产品的检测结果解释如下：
如果得到相应的Lectin基因片段，则证明该样品中含有大豆成分；
如果得到相应的Zein或Invertase基因片段，则证明该样品中含有玉米成分；
如果得到相应的CaMV 35S启动子、Nos终止子和NPTII基因片段中的一个或几个，则证明该样品中含有基因改造成分；
如果得到相应的EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因结构片段，则证明该样品含有基因改造成分，且为EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因结构；
如果得到相应的CryIA(b)基因片段，则证明该样品含有基因改造成分，且为CryIA(b)基因；
如果仅得到相应的UAA基因片段，则证明该样品不含有基因改造成分；
如果没有得到任何相应的片段，则证明从该样品提取的DNA中含有PCR反应的抑制成分，所提取的DNA需要进一步纯化。
本发明的实施基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法的试剂盒由如下试剂构成：
DNA提取缓冲液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者：10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)；树脂；过滤柱(column)；清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；PCR缓冲液；MgCl2；dNTPS；Taq DNA polymerase；Pfu DNA polymerase；PCR引物，为表一或表二中的引物的全部或部分组合；限制性内切酶，为表一或表二中的限制性内切酶的全部或部分组合。
采用本发明的方法和试剂盒，可以方便准确地判定一种农作物或其加工产品是否含有基因改造成分。
实施例：
用于实施基因改造农作物及其加工产品定性检测方法的试剂盒由下列试剂组成：
提取缓冲液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者：10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)；树脂；过滤柱(column)；清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；PCR缓冲液；MgCl2；dNTPS；Taq DNA polymerase；Pfu DNA polymerase；表二中的CaMV35启动子引物1，Nos终止子引物1，NPTII引物1，CaMV 35S-CTP基因结构引物1，CryIA(b)基因引物1，UAA基因引物，Lectin基因引物1和Invertase基因引物；限制性内切酶EcoRV，AflIII，NciI，PvuII，StyI和NaeI。
所检测的食品为购自超市的进口薯片。用研钵磨成粉末状，采用前述基因改造农作物及其加工产品DNA的提取方法一，得到样品的DNA，同时提取混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米的DNA。按照前述PCR反应体系和反应条件，分别利用各对引物对各个检测标记和对照基因进行扩增，同时进行检测系统可靠性和灵敏度的鉴定。最后对各个PCR产物用相应的限制性内切酶进行鉴定。按照前述对检测结果的解释整理出相应的检测报告。
Claims (3)
1.基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法，步骤包括：
第一步、基因改造农作物及其加工产品DNA的提取
(一)待测样品的前处理：
粉末状的待测样品不需处理；非粉末状的固体待测样品要处理成粉末状；液态待测样品采用冷冻干燥法干燥并研碎成粉末状；新鲜的待测样品清洗干净即可；
(二)提取基因改造农作物及其加工产品的DNA，方法如下：
(1)称取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)离心管中，缓慢加入700微升(μl)CTAB提取缓冲液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0，使用前加入体积比为1％的巯基乙醇)，充分混匀；
若是新鲜食品，则直接称取200mg放入盛有700μl提取缓冲液的1.5ml离心管中，用镊子在缓冲液中捣碎食品；
(2)将离心管置于60℃水浴中，放置45分钟，期间混匀数次；
(3)加入等体积氯仿，充分混匀；
(4)室温下12,000rpm离心10min；
(5)将上清转移到一个新的离心管中，重复氯仿抽提过程一遍；
(6)将上清转移到一个新的离心管中，加入1ml树脂，充分混匀；
(7)将混合液通过一个过滤柱(column)；
(8)用2ml清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗过滤柱(column)，重复一遍；
(9)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；
(10)向过滤柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，温育5分钟；
(11)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；
(12)收集洗脱液；
(13)用紫外分光光度计测定DNA的浓度，稀释成终浓度为50ng/μl，储存于-20℃冰箱，备用；
提取DNA还可以采取如下方法：
(1)称取200mg食品粉末，放入1.5ml离心管中，缓慢加入860μl提取缓冲液(10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)，充分混匀；
若是新鲜食品，则直接称取200mg放入盛有860μl提取缓冲液的1.5ml离心管中，用镊子在缓冲液中捣碎食品；
(2)加入100μl 5M盐酸胍溶液，混匀；
(3)加入40μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀；
(4)将离心管置于60℃水浴中，放置3小时，期间混匀数次；
(5)在室温下冷却5分钟；
(6)室温下13,000rpm离心10min；
(7)将上清转移到一个新的离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀；
(8)室温下12,000rpm离心10min；
(9)将上清转移到一个新的离心管中，重复氯仿抽提过程一遍；
(10)将上清转移到一个新的离心管中，加入1ml树脂，充分混匀；
(11)将混合液通过一个过滤柱(column)；
(12)用2ml清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗过滤柱(column)，重复一遍；
(13)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；
(14)向过滤柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，温育5分钟；
(15)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；
(16)收集洗脱液；
(17)用紫外分光光度计测定DNA的浓度，稀释成终浓度为50ng/μl，储存于-20℃冰箱，备用；
第二步、利用PCR技术扩增出基因改造成分，方法如下：
(一)确定检测标记及对照基因
选定下列要素作为检测标记：
存在于植物基因转化过程中所使用的大部分的植物转化中间载体中的CaMV35S启动子、Nos终止子、抗生素筛选标记基因NPTII以及除草剂筛选标记基因Bar；
存在于Monsanto公司的“Roundup Ready”抗除草剂大豆中的基因改造成分EPSPS基因和CaMV 35S-CTP基因结构；
存在于Novartis公司的“Event 176”抗虫玉米中的CryIA(b)基因；
存在于基因改造的抗虫马铃薯中的CryIIIA基因；
存在于基因改造的月桂酸含量增高的油菜中的ACP基因；
存在于基因改造的耐贮存的番茄中的CaMV 35S-反义PG基因结构；
存在于基因改造的抗病毒的烟草中的CaMV 35S-TMV CP基因结构；
设立一系列的对照基因，包括针对所有农作物的DNA降解对照，例如来源于植物的叶绿体特异性基因UAA，针对基因改造大豆的大豆特异基因Lectin基因，针对基因改造玉米的玉米特异基因Zein和Invertase基因；
(二)鉴定检测体系的可靠性和灵敏度
选定混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，作为标准来鉴定基因改造农作物及其加工产品检测体系的可靠性和灵敏度；按照前面所述的基因改造农作物及其加工产品DNA的提取方法，分别提取它们的DNA，然后对各个检测标记和对照基因进行PCR扩增，同时设立用重蒸水代替DNA模板的空白对照；只有当检测结果如下时，才能证明检测体系的可靠性，同时可以确定检测体系的灵敏度：
以重蒸水代替DNA模板的空白对照，不能扩增出任何检测标记和对照基因片段；
“Roundup Ready”0％的大豆，可以扩增出植物通有的UAA基因和大豆特异的Lectin基因片段；
“Event 176”0％的玉米，可以扩增出植物通有的UAA基因和玉米特异的Zein或Invertase基因片段(Zein和Invertase，可以二者任选其一)；
如果“Roundup Ready”0.1％和以上的大豆，可以扩增出大豆特异的Lectin基因、CaMV 35S启动子、Nos终止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因结构片段(EPSPS和CaMV 35S-CTP，可以二者任选其一)，则此时检测体系的灵敏度为0.1％，即该检测体系最低可以检测出基因改造成分含量为0.1％的基因改造农作物及其加工产品；若无法从“Roundup Ready”0.1％的大豆中扩增出CaMV 35S启动子、Nos终止子、EPSPS基因或CaMV 35S-CTP基因结构片段，而可以从“RoundupReady”0.5％和以上的大豆中扩增出这些基因片段，则检测的灵敏度为0.5％，即该检测体系最低可以检测出基因改造成分含量为0.5％的基因改造农作物及其加工产品；依此类推；
如果“Event 176”0.1％和以上的玉米，可以扩增出玉米特异的Zein或Invertase基因、CaMV 35S启动子、Nos终止子、CryIA(b)基因片段，则此时检测体系的灵敏度为0.1％，即该检测体系最低可以检测出基因改造成分含量为0.1％的基因改造农作物及其加工产品；若无法从“Event 176”0.1％的玉米中扩增出CaMV 35S启动子、Nos终止子、CryIA(b)基因片段，而可以从“Event 176”0.5％和以上的玉米中扩增出这些基因片段，则此时检测体系的灵敏度为0.5％，即该检测体系最低可以检测出基因改造成分含量为0.5％的基因改造农作物及其加工产品；依此类推；
(三)确定PCR引物和限制性内切酶：
所扩增的检测标记和对照基因片段应控制在200碱基对(bp)以内，且该片段内最好含有限制性内切酶位点；PCR引物的长度应控制在18-30bp之间，GC含量应控制在30-50％之间；
我们选定符合以上条件的PCR引物的位置范围和限制性内切酶如下表：基因改造农作物及其加工产品的定性检测PCR引物位置范围和限制性内切酶列表(表一)
引物名称
方向
GenBank序列号
位置范围
限制性内切酶
CaMV 35启动子引物1
5`引物 AJ251014
2401-2601
EcoRV
3`引物
2621-2702
CaMV 35启动子引物2
5`引物
2341-2551
XmnI
3`引物
2581-2702
Nos终止子引物1
5`引物 U84006
2786-2896
AflIII
3`引物
2915-3051
Nos终止子引物2
5`引物
2786-2898
NsiI
3`引物
2925-3051
Nos终止子引物3
5`引物
2787-2899
NsiI
3`引物
2926-3052
NPTII基因引物1
5`引物
V00618
161-435
NciI
3`引物
455-856
NPTII基因引物2
5`引物 Y18316
3841-4075
PvuII
3`引物
4095-4311
Bar基因引物
5`引物
X17220
31-288
SalI
3`引物
305-571
EPSPS基因引物
5`引物
I43998
5-170
NruI
3`引物
190-490
CryIA(b)基因引物1
5`引物 I41419
5-235
PvuII
3`引物
255-555
CryIA(b)基因引物2
5`引物
556-1260
3`引物
1261-1861
CryIIIA基因引物
5`引物
X70979
465-865
EcoRI
3`引物
885-1283
ACP基因引物
5`引物
U17097
265-565
KpnI
3`引物
585-885
CaMV 35S-反义PG基因结构引物
5`引物
AJ251014
2461-2702
3`引物
A15981
1201-1421
CaMV 35S-TMV CP基因结构引物
5`引物
AJ251014
2461-2702
3`引物
V01408
5715-5941
UAA基因引物
5`引物
V00178
5-300
3`引物
301-635
Lectin基因引物1
5`引物 K00821
981-1115
StyI
3`引物
1125-1425
Lectin基因引物2
5`引物
1201-1300
3`引物
1301-1600
Zein基因引物
5`引物
X07535
5-240
3`引物
241-541
Invertase基因引物
5`引物
U16123
770-1070
NaeI
3`引物
1090-1390
CaMV 35S-CTP基因结构引物1
5`引物
AJ251014
2461-2702
3`引物
M21084
5-150
CaMV 35S-CTP基因结构引物2
5`引物
AJ251014
2461-2702
3`引物
M21084
150-350
(表一)
(四)确定PCR反应体系
PCR反应体系如下：
PCR buffer 1×
MgCl2 2.1mM
dNTPS 0.2mM
Taq DNA polymerase 0.5U
Pfu DNA polymerase 0.5U
Primer 0.5μM
DNA template 100ng
重蒸水 补至20μl
(五)确定PCR反应条件
PCR反应条件如下：
预变性： 94℃ 2分钟
变性： 94℃ 40秒
复性： 50-62℃ 40秒
延伸： 72℃ 40秒
40个循环，最后在72℃延伸10分钟；
PCR产物在3％琼脂糖胶上、110V恒压下电泳30分钟，在紫外灯下检测电泳结果；
第三步、利用酶切技术对所扩增的基因改造成分进行鉴定
采用合适的、可以避免所扩增的基因改造成分(即PCR产物)假阳性情况的限制性内切酶对PCR产物进行酶切鉴定，只有通过酶切得到相应的基因片段，才能证实PCR产物的正确性；对于扩增片段过短，而无法通过酶切鉴定的，可以通过杂交或测序进行PCR产物的鉴定；
酶切体系如下：
PCR产物 15μl
限制性内切酶buffer 2μl
重蒸水 2μl
限制性内切酶 1μl(10U)
总反应体系 20μl
在37℃保温3个小时，然后在3％琼脂糖胶上、110V恒压下电泳30分钟，在紫外灯下检测电泳结果；
第四步、对检测结果进行解释
在检测体系的可靠性得到确认以后，对基因改造农作物及其加工产品的检测结果解释如下：
如果得到相应的Lectin基因片段，则证明该样品中含有大豆成分；
如果得到相应的Zein或Invertase基因片段，则证明该样品中含有玉米成分；
如果得到相应的CaMV 35S启动子、Nos终止子和NPTII基因片段中的一个或几个，则证明该样品中含有基因改造成分；
如果得到相应的EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因结构片段，则证明该样品含有基因改造成分，且为EPSPS基因和/或CaMV 35S-CTP基因结构；
如果得到相应的CryIA(b)基因片段，则证明该样品含有基因改造成分，且为CryIA(b)基因；
如果仅得到相应的UAA基因片段，则证明该样品不含有基因改造成分；
如果没有得到任何相应的片段，则证明从该样品提取的DNA中含有PCR反应的抑制成分，所提取的DNA需要进一步纯化。
2.如权利要求1所述的基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法，其特征在于PCR引物序列和限制性内切酶如下表：基因改造农作物及其加工产品的定性检测最佳PCR引物和限制性内切酶列表(表二)
引物名称
方向
序列
GenBank序列号
位置
限制性内切酶
CaMV 35启动子引物1
5`引物
5`-ccg aca gtg gtc cca aagatg gac-3` AJ251014
2512-2535
EcoRV
3`引物
5`-ata tag agg aag ggt cttgcg aag g-3`
2649-2673
CaMV 35启动子引物2
5`引物
5`-gct cct aca aat gcc atc a-3`
2455-2473
XmnI
3`引物
5`-gat agt ggg att gtg cgtca-3`
2630-2649
Nos终止子引物1
5`引物
5`-gaa tcc tgt tgc cgg tcttgc gat g-3` U84006
2835-2859
AflIII
3`引物
5`-tcg cgt att aaa tgt ataatt gcg gga ctc-3`
2951-2980
Nos终止子引物2
5`引物
5`-gaa tcc tgt tgc cgg tct tg-3`
2835-2854
NsiI
3`引物
5`-tta tcc tag ttt gcg cgcta-3`
2995-3014
Nos终止子引物3
5`引物
5`-tta aga ttg aat cct gtt gccg-3`
2827-2848
NsiI
3`引物
5`-taa ttt atc cta gtt tgcgcg c-3`
2997-3018
NPTII基因引物1
5`引物
5`-cac gac ggg cgt tcc ttgc-3`
V00618
363-381
NciI
3`引物
5`-ggt ggt cga atg ggc aggtag c-3`
535-556
NPTII基因引物2
5`引物
5`-gcc atg atg gat act ttctcg gca gga gc-3` Y18316
3972-4000
PvuII
3`引物
5`-acc tgt ccg gtg ccc tgaatg aac tgc-3`
4141-4167
Bar基因引物
5`引物
5`-ggc acg caa cgc cta cgact-3`
X17220
264-283
SalI
3`引物
5`-agc ccg atg aca gcg acc ac-3`
394-413
EPSPS基因引物
5`引物
5`-gca aat cct ctg gcc tttcc-3`
I43998
99-118
NruI
3`引物
5`-ctt gcc cgt att gat gacgtc-3`
224-244
CryIA(b)基因引物1
5`引物
5`-ctg gtg gac atc atc tggggc atc ttc g-3` I41419
178-205
PvuII
3`引物
5`-ttg gta cag gtt gct caggcc ctc c-3`
300-324
CryIA(b)基因引物2
5`引物
5`-gtg gac agc ctg gac gagat-3`
1219-1238
3`引物
5`-tgc tga agc cac tgc ggaac-3`
1305-1324
CryIIIA基因引物
5`引物
5`-acc tta ggg gtt atg gaa c-3`
X70979
797-815
EcoRI
3`引物
5`-ctt ggt ctg gtg gaa acat-3`
947-965
ACP基因引物
5`引物
5`-gat gga ttc ggt gag aca c-3`
U17097
499-517
KpnI
3`引物
5`-tcg cgg aca aga aaa tgg c-3`
650-668
CaMV35S-反义PG基因结构引物
5`引物
5`-tga tgt gat atc tcc actgac g-3`
AJ251014
2601-2622
3`引物
5`-att tca gag gat gaa gctctt-3`
A15981
1389-1409
CaMV35S-TMVCP基因结构引物
5`引物
5`-tca ttt cat ttg gag aggaca-3`
AJ251014
2682-2702
3`引物
5`-gaa cac gaa ctg aga tgg ag-3`
V01408
5731-5750
UAA基因引物
5`引物
5`-cga aat cgg tag acg cta cg-3`
V00178
91-110
3`引物
5`-ggg gat aga ggg act tga ac-3`
603-622
Lectin基因引物1
5`引物
5`-gtg cta ctg acc agc aaggca aac tca gcg-3` K00821
1038-1067
StyI
3`引物
5`-gag ggt ttt ggg gtg ccgttt tcg tca ac-3`
1173-1201
Lectin基因引物2
5`引物
5`-aac cgg tag cgt tgc cag-3`
1253-1270
3`引物
5`-agc cca tct gca agc cttt-3`
1315-1333
Zein基因引物
5`引物
5`-tgc agc aac tgt tgg ccttac-3`
X07535
203-223
3`引物
5`-tgt tag gcg tca tca tctgtg g-3`
250-271
Invertase基因引物
5`引物
5`-ggc cgg atc gtc atg ctctac a-3`
U16123
1011-1032
NaeI
3`引物
5`-ttg gcg tcc gac ttg acccac t-3`
1111-1132
CaMV35S-CTP基因结构引物1
5`引物
5`-tca ttt cat ttg gag aggaca-3`
AJ251014
2682-2702
3`引物
5`-gga att ggg att aag ggtttg tat c-3`
M21084
57-81
CaMV35S-CTP基因结构引物2
5`引物
5`-tga tgt gat atc tcc actgac g-3`
AJ251014
2601-2622
3`引物
5`-tgt gct gta gcc act gatgc-3`
M21084
223-242
(表二)
3.一种实施如权利要求1或2所述的基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法的试剂盒，其特征在于试剂盒由如下试剂构成：
提取缓冲液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者：10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％SDS，pH8.0)；树脂；过滤柱(column)；清洗缓冲液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；PCR缓冲液；MgCl2；dNTPS；Taq DNA polymerase；Pfu DNA polymerase；用于扩增出基因改造成分的PCR引物，为表一或表二中的PCR引物的全部或部分组合；用于酶切鉴定PCR产物的限制性内切酶，为表一或表二中的限制性内切酶的全部或部分组合。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 01104214 CN1370842A (zh) | 2001-02-26 | 2001-02-26 | 基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 01104214 CN1370842A (zh) | 2001-02-26 | 2001-02-26 | 基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法和试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
| CN 01104214 Pending CN1370842A (zh) | 2001-02-26 | 2001-02-26 | 基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法和试剂盒 |
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|---|---|
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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2001
- 2001-02-26 CN CN 01104214 patent/CN1370842A/zh active Pending
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