CN1772919A - 转基因大豆深加工产品三重巢式pcr检测方法 - Google Patents
转基因大豆深加工产品三重巢式pcr检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1772919A CN1772919A CN 200510010517 CN200510010517A CN1772919A CN 1772919 A CN1772919 A CN 1772919A CN 200510010517 CN200510010517 CN 200510010517 CN 200510010517 A CN200510010517 A CN 200510010517A CN 1772919 A CN1772919 A CN 1772919A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- triple
- amplification
- pcr
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 53
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 title claims abstract description 51
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 34
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 19
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 17
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 16
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 7
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 7
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 claims description 7
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 6
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 claims description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 238000007670 refining Methods 0.000 claims description 6
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 claims description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000013215 result calculation Methods 0.000 abstract 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 abstract 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 8
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 6
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 3-[[oxo(pyridin-4-yl)methyl]hydrazo]-N-(phenylmethyl)propanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNC(=O)CCNNC(=O)C1=CC=NC=C1 NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种转基因大豆深加工产品三重巢式PCR检测方法。其检测方法为：1.DNA提取；2.DNA样品浓度检测；3.引物设计；4.第一、二轮三重巢式PCR反应体系及反应条件；5.扩增产物检测；6.结果计算和灵敏度分析。本发明提高了检测效率、减少了检测时间和检测成本，并可以有效减少假阳性的结果，因此，可以应用于对豆油等转基因深加工食品进行DNA检测，具有实际意义。
Description
技术领域：
本发明是一种转基因成分的准确检测方法，具体地说是转基因大豆深加工产品进行定性检测和对产品中的GMO含量进行定量检测以便标识的方法。
技术背景：
随着各国有关转基因生物(genetically modified organism，GMO)标签法的建立和不断完善，转基因成分的准确检测也显得日趋重要，很多国家不但要求对转基因产品进行定性检测，还需要对产品中的GMO含量进行定量检测，以便标识。欧盟等国家和地区先后出台转基因产品的标签制度，出入境产品必须出具是否含有转基因成分的检测报告。近年来，我国大量进口转基因大豆用于加工，由于市场标识不够，使我国加工产品出口贸易遭受损失。为了加强对农业转基因生物的安全管理，保障人体健康，规范转基因产品的销售行为，引导和保护消费者的知情权，农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》，该办法规定了在中国境内需要标识的第一批转基因生物及其产品，即大豆、玉米、油菜、棉花和番茄等5类17种产品。目前国内的相关标准较为混乱，出现了一些技术标准不一致、法规滞后、与国际惯例不接轨等现象，致使某些产品实行国际、国内市场“双重标准”，没有依照中国有关转基因食品的规定贴上相关标识，侵害了中国消费者的利益。
大豆深加工制品已越来越多，如卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆油等食品，其加工呈现复杂化和多元化的特点，在国内外仍然没有适合的标准依据进行检测。“乐之事件”以及“雀巢食品含转基因”事件都表明，我国在转基因市场的管理上确实存在漏洞，对转基因食品的监督力度不足，造成了企业有法律空子可钻。要完善、健全我国的转基因产品管理制度，首要问题是要解决我国尚未统一的检测标准问题，同时要提高转基因检测的精确度，以保证我国消费者的利益。
目前，欧盟率先倡导并实行转基因标识并要求产品成分中转基因含量大于1％时必须进行标识，因此其检测技术早已经成熟，检测下限达0.1％。国内一些机构，尤其进出口检疫局也相继建立检测实验室，技术趋于成熟，但还只限于对转基因原料的检测，在深加工产品的检测技术的研究上还很不成熟，没有统一的检测标准，检测结果不稳定。深加工产品转基因检测所需的DNA提取技术在国外尚处于研究阶段，并没有形成系列化技术，商品化的提取试剂盒种类单一。由于深加工产品种类繁多，生产工艺复杂，而深加工品DNA提取技术应该是一系列技术，提取试剂盒也应该是多样化，不同产品采用不同试剂盒，因此，缺乏针对不同深加工转基因产品的DNA提取技术。
发明内容：
本发明目的是公开一种转基因大豆深加工产品三重巢式PCR检测方法。其检测方法为：
1.DNA提取
将大豆标准品粉末及其它待检样品根据WizardMagnetic DNAPurification System for Food试剂盒操作说明分别进行DNA提取，并稍做改动。
2.DNA样品浓度检测
DNA浓度通过核酸蛋白分析仪和电泳-EB染色的荧光强度双重测定。
3.引物设计
利用Primer Premier V5.0软件进行三重巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物。引物所扩增目的片段及扩增产物大小为。
(1)第一轮三重PCR所用引物
引物名称：Lec EF 序列(5′→3′)cgccgcttccttcaactt
Lec ER 序列(5′→3′)gctggtggaggcatcatag
位置：Lectin内源基因外引物
扩增片段大小：310
引物名称：SC EF 序列(5′→3′)： gacgcacaatcccactatcc
SC ER 序列(5′→3′)：ctgtagccactgatgctgaaa
位置：35S启动子与CTP接合区域外引物
扩增片段大小：357
引物名称：EN EF 序列(5′→3′)：cgtgatgaacggtctggaa
EN ER 序列(5′→3′)： caggcagccttcgtatcg
位置：CP4-EPSPS外源基因与NOS接合区域外引物
扩增片段大小：421
(2)第二轮三重PCR所用引物
引物名称：Lec EF 序列(5′→3′)：caagtcgtcgctgttgagt
Lec IR 序列(5′→3′)：gtcgttttgatggatctgatag
位置：Lectin内源基因内引物
扩增片段大小：101
引物名称：SC IF 序列(5′→3′)：cgcacaatcccactatcct
SC IR 序列(5′→3′)：agcttgtcagcgtgtcctc
位置：35S启动子与CTP接合区域内引物
扩增片段大小：82
引物名称：EN IF 序列(5′→3′)：aaaaccctgtcacggtgga
EN IR 序列(5′→3′)：caggcagccttcgtatcg
位置：CP4-EPSPS外源基因与NOS接合区域内引物
扩增片段大小：115
4.三重巢式PCR反应体系
4-1.第一轮三重PCR反应体系及反应条件
在第一轮三重PCR反应体系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR缓冲液，引物混合液I 10μL，DNA聚合酶4U，补水至50μL。扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性40s，54℃退火45s，65℃延伸60s，共30个循环；最后65℃延伸10min。
4-2.第二轮三重PCR反应体系及反应条件
取第一轮多重PCR产物1μL作为模板，进行三重巢式PCR第二轮扩增。反应体系加引物混合液II 10μL，DNA聚合酶3U，其余同前。扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火45s，65℃延伸45s，共38个循环；最后65℃延伸5min。
5.扩增产物检测
两轮扩增产物用琼脂糖电泳检测。琼脂糖胶浓度为3％，胶中溴化乙锭浓度为0.5μg/mL，电泳缓冲液为1×TAE，以50bp ladder DNA和DL 2000DNA做分子质量标准，电泳条件为以10V/cm电压，电泳1h。
6.结果
6-1DNA提取
所选材料均是大豆深加工产品，使用WizardMagnetic DNAPurification System for Food试剂盒可以满足三重巢式PCR扩增的需要，但实际测量所提取DNA样品的OD260值低于0.1以及OD260/OD280也小于1.5，进行电泳检测时也观察不到DNA条带，说明所提取DNA样品浓度很低。
6-2第一轮扩增结果
第一轮扩增结果见图1，仅阴性对照和阳性对照能够观察到扩增条带，其它泳道未看到扩增结果。阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为310bp、357bp和421bp。阴性对照结果表明实验过程中无假阳性结果，排除RR大豆转基因成分污染的可能；阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；空白对照无扩增条带说明PCR反应体系无污染。
6-3第二轮扩增结果
第二轮扩增结果，阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为101bp、82bp和115bp。卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出三条特异性条带；大豆粗油仅扩增出Lectin基因；大豆精炼油和大豆色拉油未检出任何条带。
6-4外引物扩增灵敏度分析
第一轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.5％RR大豆标准品利用三对外引物能够同时扩增出三个目的基因，0.05％标准品只能扩增出Lectin和EPSPS-NOS基因，说明第一轮三重PCR的灵敏度为0.5％。
6-5内引物扩增灵敏度分析
第二轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.005％RR大豆标准品利用三对内引物能够同时扩增出较为清晰的三个目的基因，0.0005％标准品只能扩增出Lectin和35S-CTP基因，说明第二轮三重PCR的灵敏度为0.005％。
本发明提高了检测效率、减少了检测时间和检测成本，并可以有效减少假阳性的结果，因此，可以应用于对豆油等转基因深加工食品进行DNA检测，具有实际意义。
附图说明
图1为本发明三重巢式PCR各引物间位置关系示意图；
图2为本发明外引物扩增结果的电泳图；
图3为本发明内引物扩增结果的电泳图；
图4为本发明第一轮扩增检测灵敏度分析；
图5为本发明第二轮扩增检测灵敏度分析。
具体实施方式：
图1为三重巢式PCR各引物间位置关系；
第一轮扩增结果；
第一轮扩增结果见图1，仅阴性对照和阳性对照能够观察到扩增条带，其它泳道未看到扩增结果。阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为310bp、357bp和421bp。阴性对照结果表明实验过程中无假阳性结果，排除RR大豆转基因成分污染的可能；阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；空白对照无扩增条带说明PCR反应体系无污染。
图2为外引物扩增结果的电泳图，其中：
M1，DL 2000分子质量标准；1，卵磷脂；2，大豆蛋白质粉；3，巧克力饮品；4，婴儿米粉；5，大豆粗油；6，大豆精炼油；7，大豆色拉油；8，阴性对照；9，阳性对照；10，空白对照；M2，50bp DNA ladderDNA分子质量标准。
第二轮扩增结果
第二轮扩增结果见图2，阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为101bp、82bp和115bp。卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出三条特异性条带；大豆粗油仅扩增出Lectin基因；大豆精炼油和大豆色拉油未检出任何条带。
图3为内引物扩增结果的电泳图，其中：
M1，DL 2000分子质量标准；1，卵磷脂；2，大豆蛋白质粉；3，巧克力饮品；4，婴儿米粉；5，大豆粗油；6，大豆精炼油；7，大豆色拉油；8，阴性对照；9，阳性对照；10，空白对照；M2，50bp DNA ladderDNA分子质量标准
外引物扩增灵敏度分析：
第一轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.5％RR大豆标准品利用三对外引物能够同时扩增出三个目的基因，0.05％标准品只能扩增出Lectin和EPSPS-NOS基因，说明第一轮三重PCR的灵敏度为0.5％。
图4为第一轮扩增检测灵敏度分析为：
M1，DL 2000分子质量标准；1-7：RR大豆含量分别为5％、5×10-1％、5×10-2％、5×10-3％、5×10-4％、5×10-5％、5×10-6％；8，阴性对照；9，阳性对照；10，空白对照；M2，50bp DNA ladder分子质量标准M1，DL 2000Marker 1-7：The content of RR soy is 5％，5×10-1％，5×10-2％，5×10-3％，5×10-4％，5×10-5％，5×10-6％，respectively；8，negative control；9，positive control；10，blank control；M2，50bp DNA ladder Marker
内引物扩增灵敏度分析
第二轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.005％RR大豆标准品利用三对内引物能够同时扩增出较为清晰的三个目的基因，0.0005％标准品只能扩增出Lectin和35S-CTP基因，说明第二轮三重PCR的灵敏度为0.005％。
图5为第二轮扩增检测灵敏度分析，其中：
M1，DL2000分子质量标准；1-7：RR大豆含量分别为5％、5×10-1％、5×10-2％、5×10-3％、5×10-4％、5×10-5％、5×10-6％；8，阴性对照；9，阳性对照；10，空白对照；M2，50bp DNAladder分子质量标准
M1，DL 2000Marker 1-7：The content of RR soy is 5％，5×10-1％，5×10-2％，5×10-3％，5×10-4％，5×10-5％，5×10-6％，respectively；8，negative control；9，positive control；10，blank control；M2，50bp DNA ladder Marker
本发明检测方法的用途：
多重巢式PCR技术是十分有效的基因检测技术，在国内外刚刚兴起，因此建立有效的多重巢式PCR技术对于深加工制品的检测技术研究具有重要的意义。本研究将在国内外率先建立大豆深加工制品的有效检测技术，技术具有快捷、准确、灵敏、经济的诸多优点，将切实解决大豆深加工制品的检测技术难题，本研究成果将成为大豆深加工制品转基因检测的行业标准，在大豆深加工制品转基因检测中发挥重要的作用。
本检测方法的适用范围
标准品RR大豆，非转基因大豆，待检深加工产品卵磷脂、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆蛋白质粉、大豆粗油、大豆精炼油和大豆色拉油。
实验试剂
Wizard Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒；TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液(含MgCl2)、50bp ladder DNA和DLDNA2000分子质量标准；特异引物。
仪器设备
离心机(上海安亭，TDL-40B)、PCR仪(德国Biometra，BiometraTgradient)、核酸电泳仪(杭州大合，GE-100)、紫外分光光度仪(美国BECKMAN，DU640)、凝胶成像系统(美国UVP，G8000)。
本发明检测方法的优点：
多重巢式PCR是近几年兴起的检测技术，它结合了巢式PCR的灵敏度高和多重PCR的操作简单、特异性高的特点，这两种方法的结合不但可以减少假阳性的出现，可以同时检测多个目的片段，而且可以使检测的下限下降几个数量级。多重PCR技术多应用在疾病诊断和病毒鉴定具有快速、灵敏、专一、可靠等特点，可以代替传统的诊断方式。目前为止该技术还未应用在转基因加工产品的检测中。
多重巢式PCR的检测，提高了检测效率、减少了检测时间和检测成本，并可以有效减少假阳性的结果，因此，可以应用于对豆油等转基因深加工食品进行DNA检测，具有实际意义。
Claims (1)
1.一种转基因大豆深加工产品三重巢式PCR检测方法，其检测方法为：
(1).DNA提取
将大豆标准品粉末及其它待检样品根据WizardMagneticDNA Purification System for Food试剂盒操作说明分别进行DNA提取，并稍做改动；
(2).DNA样品浓度检测
DNA浓度通过核酸蛋白分析仪和电泳-EB染色的荧光强度双重测定；
(3).引物设计
利用Primer Premier V5.0软件进行三重巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物；引物所扩增目的片段及扩增产物大小为；
(3-1)第一轮三重PCR所用引物
引物名称：Lec EF 序列(5′→3′)cgccgcttccttcaactt
Lec ER 序列(5′→3′)gctggtggaggcatcatag
位置：Lectin内源基因外引物
扩增片段大小：310
引物名称：SC EF 序列(5′→3′)：gacgcacaatcccactatcc
SC ER 序列(5′→3′)：ctgtagccactgatgctgaaa
位置：35S启动子与CTP接合区域外引物
扩增片段大小：357
引物名称：EN EF 序列(5′→3′)：cgtgatgaacggtctggaa
EN ER 序列(5′→3′)：caggcagccttcgtatcg
位置：CP4-EPSPS外源基因与NOS接合区域外引物
扩增片段大小：421
(3-2)第二轮三重PCR所用引物
引物名称：Lec EF 序列(5′→3′)：caagtcgtcgctgttgagt
Lec IR 序列(5′→3′)：gtcgttttgatggatctgatag
位置：Lectin内源基因内引物
扩增片段大小：101
引物名称：SC IF 序列(5′→3′)：cgcacaatcccactatcct
SC IR 序列(5′→3′)：agcttgtcagcgtgtcctc
位置：35S启动子与CTP接合区域内引物
扩增片段大小：82
引物名称：EN IF 序列(5′→3′)：aaaaccctgtcacggtgga
EN IR 序列(5′→3′)：caggcagccttcgtatcg
位置：CP4-EPSPS外源基因与NOS接合区域内引物
扩增片段大小：115
(4).三重巢式PCR反应体系
(4-1).第一轮三重PCR反应体系及反应条件
在第一轮三重PCR反应体系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR缓冲液，引物混合液I 10μL，DNA聚合酶4U，补水至50μL；扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性40s，54℃退火45s，65℃延伸60s，共30个循环；最后65℃延伸10min；
(4-2).第二轮三重PCR反应体系及反应条件
取第一轮多重PCR产物1μL作为模板，进行三重巢式PCR第二轮扩增；反应体系加引物混合液II 10μL，DNA聚合酶3U，其余同前；扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火45s，65℃延伸45s，共38个循环；最后65℃延伸5min；
(5).扩增产物检测
两轮扩增产物用琼脂糖电泳检测；琼脂糖胶浓度为3％，胶中溴化乙锭浓度为0.5μg/mL，电泳缓冲液为1×TAE，以50bp ladder DNA和DL 2000 DNA做分子质量标准，电泳条件为以10V/cm电压，电泳1h；
(6).结果
(6-1)DNA提取
所选材料均是大豆深加工产品，使用WizardMagnetic DNAPurification System for Food试剂盒可以满足三重巢式PCR扩增的需要，但实际测量所提取DNA样品的OD260值低于0.1以及OD260/OD280也小于1.5，进行电泳检测时也观察不到DNA条带，说明所提取DNA样品浓度很低；
(6-2)第一轮扩增结果
第一轮扩增结果，仅阴性对照和阳性对照能够观察到扩增条带，其它泳道未看到扩增结果；阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为310bp、357bp和421bp；阴性对照结果表明实验过程中无假阳性结果，排除RR大豆转基因成分污染的可能；阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；空白对照无扩增条带说明PCR反应体系无污染；
(6-3)第二轮扩增结果
第二轮扩增结果，阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为101bp、82bp和115bp；卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出三条特异性条带；大豆粗油仅扩增出Lectin基因；大豆精炼油和大豆色拉油未检出任何条带；
(6-4)外引物扩增灵敏度分析
第一轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.5％RR大豆标准品利用三对外引物能够同时扩增出三个目的基因，0.05％标准品只能扩增出Lectin和EPSPS-NOS基因，说明第一轮三重PCR的灵敏度为0.5％；
(6-5)内引物扩增灵敏度分析
第二轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.005％RR大豆标准品利用三对内引物能够同时扩增出较为清晰的三个目的基因，0.0005％标准品只能扩增出Lectin和35S-CTP基因，说明第二轮三重PCR的灵敏度为0.005％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510010517 CN1772919A (zh) | 2005-11-11 | 2005-11-11 | 转基因大豆深加工产品三重巢式pcr检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510010517 CN1772919A (zh) | 2005-11-11 | 2005-11-11 | 转基因大豆深加工产品三重巢式pcr检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1772919A true CN1772919A (zh) | 2006-05-17 |
Family
ID=36760057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200510010517 Pending CN1772919A (zh) | 2005-11-11 | 2005-11-11 | 转基因大豆深加工产品三重巢式pcr检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1772919A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101319996B (zh) * | 2007-07-20 | 2010-05-19 | 中国科学院海洋研究所 | 一种适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒及检测方法 |
| CN101935701A (zh) * | 2010-08-10 | 2011-01-05 | 南京农业大学 | 检测转cp4-epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒 |
| CN101250586B (zh) * | 2008-03-11 | 2012-01-04 | 东华大学 | 一种微量dna检测的方法 |
| CN103436595A (zh) * | 2013-04-29 | 2013-12-11 | 冯家望 | Nos终止子的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN105420359A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-23 | 许昌学院 | Lectin检测的LAMP引物组及基因等温扩增方法 |
| CN105682452A (zh) * | 2013-09-04 | 2016-06-15 | 美国陶氏益农公司 | 用于在作物中确定供体插入的快速靶向分析 |
-
2005
- 2005-11-11 CN CN 200510010517 patent/CN1772919A/zh active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101319996B (zh) * | 2007-07-20 | 2010-05-19 | 中国科学院海洋研究所 | 一种适用于饲料的转基因大豆检测试剂盒及检测方法 |
| CN101250586B (zh) * | 2008-03-11 | 2012-01-04 | 东华大学 | 一种微量dna检测的方法 |
| CN101935701A (zh) * | 2010-08-10 | 2011-01-05 | 南京农业大学 | 检测转cp4-epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒 |
| CN101935701B (zh) * | 2010-08-10 | 2012-07-04 | 南京农业大学 | 检测转cp4-epsps基因大豆及其深加工产品中转基因成份的方法及试剂盒 |
| CN103436595A (zh) * | 2013-04-29 | 2013-12-11 | 冯家望 | Nos终止子的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN105682452A (zh) * | 2013-09-04 | 2016-06-15 | 美国陶氏益农公司 | 用于在作物中确定供体插入的快速靶向分析 |
| CN105420359A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-23 | 许昌学院 | Lectin检测的LAMP引物组及基因等温扩增方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1772919A (zh) | 转基因大豆深加工产品三重巢式pcr检测方法 | |
| CN110195123B (zh) | 基于叶绿体基因组序列开发的苦蘵cpSSR标记引物及其应用 | |
| Cheng et al. | Genetic diversity and relationship among peach cultivars based on Random Amplified Microsatellite Polymorphism (RAMP) | |
| CN102605092A (zh) | 柑橘黄龙病的lamp快速检测方法 | |
| Luo et al. | Development of a rapid one-step PCR protocol to distinguish between alfalfa (Medicago sativa) and sweet clover (Melilotus spp.) seeds | |
| Hu et al. | Design, optimization and verification of 16S rRNA oligonucleotide probes of fluorescence in-situ hybridization for targeting Clostridium spp. and Clostridium kluyveri | |
| Jiang et al. | Conventional octaplex PCR for the simultaneous identification of eight mainstream closely related Dendrobium species | |
| Lee et al. | Molecular authentication of Pinelliae Tuber and its common adulterants using RAPD-derived multiplex sequence characterized amplified region (multiplex-SCAR) markers | |
| Shu-San Loo et al. | Comparison of molecular methods for the detection of Eimeria in domestic chickens in Malaysia | |
| JP6413122B2 (ja) | キノコの同定方法、及び、同定キット | |
| CN1274010A (zh) | 鉴别冬虫夏草的特征性核苷酸序列和方法 | |
| CN1932037A (zh) | 一种筛查转基因小麦的方法 | |
| CN109929943B (zh) | 甘草issr荧光分子标记引物及其应用 | |
| JP4359824B2 (ja) | 米の品種識別方法 | |
| Guo et al. | DNA isolation, optimization of ISSR-PCR system and primers screening of Scutellaria baicalensis | |
| CN1544657A (zh) | 用电化学发光pcr进行基因检测的方法及其装置 | |
| KR101429185B1 (ko) | Ｐｃｒ을 이용한 병자각균 포마 글로메라타 균주의 진단 방법 | |
| CN101402996A (zh) | 粮食作物深加工制品高通量五重巢式pcr转基因检测方法 | |
| KR101429188B1 (ko) | Ｐｃｒ을 이용한 병자각균 포마 엑시구아 균주의 진단 방법 | |
| CN1749265A (zh) | 用于issr分析的芍药dna提取方法 | |
| CN1370842A (zh) | 基因改造农作物及其加工产品的定性检测方法和试剂盒 | |
| CN1831143A (zh) | 一种用于检测霍乱弧菌核苷酸片段的引物和探针序列 | |
| CN1281755C (zh) | 中国葡萄属野生种麦黄葡萄抗白粉病基因片断或基因标记及应用 | |
| KR101747243B1 (ko) | 천연 벌꿀 내 쌀시럽 혼합 여부의 판별방법 | |
| CN101041859A (zh) | 一种香菇507菌种aflp快速检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NORTHEAST AGRICULTURAL UNIVERSITY Free format text: FORMER OWNER: GAO XUEJUN; APPLICANT Effective date: 20060623 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20060623 Address after: 150030 No. 59 Wood Street, Xiangfang District, Heilongjiang, Harbin Applicant after: Northeast Agricultural University Address before: 150030, Northeast Agricultural University, 59 Wood Street, Xiangfang District, Heilongjiang, Harbin Applicant before: Gao Xuejun Co-applicant before: Zhang Minghui Co-applicant before: Yu Yanbo |
|
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |