CN105420359A - Lectin检测的LAMP引物组及基因等温扩增方法 - Google Patents

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张永清
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Abstract

用于检测大豆内源基因Lectin的LAMP扩增用核酸引物，上述LAMP扩增用核酸引物包含FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物、LF引物和LB引物，本发明的LAMP检测体系具有良好的特异性、灵敏度，能快速、方便、高效的检测样品中是否含有大豆内源基因Lectin，以及所抽提大豆基因组DNA的质量，有助于大豆转基因成分的快速准确检测，以能满足国家对大豆转基因成分检测的迫切需要。

Description

Lectin检测的LAMP引物组及基因等温扩增方法
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，提供了利用等温扩增技术对大豆内源基因Lectin的检测的引物组，用于检测所抽提基因组DNA的质量，对市场上大豆及其加工产品是否是转基因产品的判断有辅助作用。
背景技术
伴随着转基因技术的迅猛发展，全球农业生物技术的产业化速度也随之大大加快，转基因作物的推广种植面积逐年递增，然而，由于目前对转基因产品的安全性尚无定论，各国政府和消费者普遍对此采取谨慎的态度，纷纷出台一系列法规对转基因产品的贸易加以限制，要求对转基因作物及其加工产品进行标识。因此，建立完善的转基因农产品及食品检测体系显得尤其重要。
由于普通PCR方法、实时荧光PCR检测方法需要变温过程及其相应的快速升降温及温度控制，也就需要价格高昂的专用PCR设备，昂贵的仪器设备以及严重的污染问题(假阳性率高)，限制了PCR检测方法的推广。而现场检测要求降低对仪器的依赖，等温扩增方法可以解决目前转基因生物安全检测对仪器依赖程度高的缺陷和不足，满足现场检测需要。
环介导等温扩增技术(英文名称为loop-mediatedisothermalamplification，简称LAMP)能在等温(60-65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。
凝集素基因(Lectin)是大豆中的特异性基因，在转基因大豆产品检测中被用作检测大豆基因组DNA提取数量和质量的指标。
本发明将LAMP技术运用于大豆内源基因Lectin的快速检测，可以免除高昂的仪器投入，便于基层及现场检测使用。
发明内容
本发明的目的是提供一套用于检测大豆内源基因Lectin的LAMP引物组。
本发明用于检测大豆内源基因Lectin的LAMP引物序列为：
Lec-F3：5`-GCCGAAGCAACCAAACATG-3`
Lec-B3：5`-GGGGCATAGAAGGTGAAGTT-3`
Lec-FIP：5`-TGGGGTGCCGTTTTCGTCAACTTTTATCCTCCAAGGAGACGCTAT-3`
Lec-BIP：5`-ACCCTCGTCTCTTGGTCGCGTTTTGCAACGCTACCGGTTTCT-3`
Lec-LF：5`-CTTTCCCGAGGAGGTCACA-3`
Lec-LF：5`-CCCCATCCACATTTGGGACAA-3`
用上述引物组对待测样品DNA进行恒温扩增，若结果产生梯状DNA条带，则该样品含有大豆内源基因Lectin，若扩增结果没有出现条带，则该样品中不含有大豆内源基因Lectin。
与现有技术相比，本发明的进步在于：检测仪器简单，无需昂贵的PCR仪投入，只需简单的水浴锅即可，降低了实验室投入，适合基层实验室推广使用。
具体实施方式
本发明的目的是提供一套用于检测大豆内源基因Lectin的LAMP引物组。
本发明用于检测大豆内源基因Lectin的LAMP引物序列为：
Lec-F3：5`-GCCGAAGCAACCAAACATG-3`
Lec-B3：5`-GGGGCATAGAAGGTGAAGTT-3`
Lec-FIP：5`-TGGGGTGCCGTTTTCGTCAACTTTTATCCTCCAAGGAGACGCTAT-3`
Lec-BIP：5`-ACCCTCGTCTCTTGGTCGCGTTTTGCAACGCTACCGGTTTCT-3`
Lec-LF：5`-CTTTCCCGAGGAGGTCACA-3`
Lec-LF：5`-CCCCATCCACATTTGGGACAA-3`
用上述引物组对待测样品DNA进行恒温扩增，若结果产生梯状DNA条带，则该样品含有大豆内源基因Lectin，若扩增结果没有出现条带，则该样品中不含有大豆内源基因Lectin。
与现有技术相比，本发明的进步在于：检测仪器简单，无需昂贵的PCR仪投入，只需简单的水浴锅即可，降低了实验室投入，适合基层实验室推广使用。
(1)引物设计
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出大豆内源基因Lectin基因序列，针对该序列的六个位点设计出LAMP引物并合成，引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成，得到如下引物：
Lec-F3：5`-GCCGAAGCAACCAAACATG-3`
Lec-B3：5`-GGGGCATAGAAGGTGAAGTT-3`
Lec-FIP：5`-TGGGGTGCCGTTTTCGTCAACTTTTATCCTCCAAGGAGACGCTAT-3`
Lec-BIP：5`-ACCCTCGTCTCTTGGTCGCGTTTTGCAACGCTACCGGTTTCT-3`
Lec-LF：5`-CTTTCCCGAGGAGGTCACA-3`
Lec-LF：5`-CCCCATCCACATTTGGGACAA-3`
(2)反应体系(反应总体积为25μl)
核酸模板：阳性对照为浓度为5％的大豆的基因组DNA或含有大豆内源基因lectin基因序列的大肠杆菌重组质粒，阴性对照为不含lectin基因的其他物种基因组DNA。
(3)恒温扩增反应：在60℃恒温水浴60分钟。
(4)检测结果：电泳步骤(3)中的LAMP扩增产物，若产生特异梯状条带，则待测样品中含有大豆内源基因lectin；若为产生特异梯状条带，则待测样品中不含有大豆内源基因lectin。

Claims (4)

1.一种Lectin检测LAMP引物组，其特征在于，序列为：
Lec-F3：5`-GCCGAAGCAACCAAACATG-3`
Lec-B3：5`-GGGGCATAGAAGGTGAAGTT-3`
Lec-FIP：5`-TGGGGTGCCGTTTTCGTCAACTTTTATCCTCCAAGGAGACGCTAT-3`
Lec-BIP：5`-ACCCTCGTCTCTTGGTCGCGTTTTGCAACGCTACCGGTTTCT-3`
Lec-LF：5`-CTTTCCCGAGGAGGTCACA-3`
Lec-LF：5`-CCCCATCCACATTTGGGACAA-3`。
2.根据权利要求1所述的一种Lectin检测LAMP引物组，其特征在于，用于大豆内源基因Lectin检测的核酸检测试剂盒。
3.一种基因成分CaMV35S等温扩增方法，其特征在于，用权利要求1中的LAMP引物组对待测样品进行DNA扩增，扩增条件63℃1小时，如果电泳结果产生特异梯状谱带，则该样品含有大豆内源基因Lectin，如果结果没有出现特异梯状谱带，则样品中不含有大豆内源基因Lectin。
4.根据权利要求3所述的一种基因成分CaMV35S等温扩增方法，其特征在于，用于大豆内源基因Lectin检测的核酸检测试剂盒。
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