CN103642918A - 一种抗草甘膦转基因大豆lamp快速检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种抗草甘膦转基因大豆LAMP快速检测方法及应用。根据CP4-EPSPS基因序列特异性设计筛选了6条LAMP引物F3、B3、FIP、BIP、LB和LF；配制并优化了LAMP反应体系。通过对抗草甘膦转基因大豆DNA提取，环介导等温扩增、扩增产物显色和观察，从而快速检测出抗草甘膦转基因大豆。本发明的检测方法特异性强、灵敏度高、检测迅速、成本低廉、操作简便，在转基因大豆及其加工品快速检测和田间监测转基因大豆基因漂移情况有很高的应用价值。

Description

一种抗草甘膦转基因大豆LAMP快速检测方法及应用

技术领域

本发明涉及一种抗草甘膦转基因大豆LAMP快速检测方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

自1983年第一株转基因烟草问世以来，转基因作物的研究得到飞速发展，至今已有30年的历史。根据国际农业生物技术产业应用服务中心(ISAAA)2012年报告显示，转基因作物种植面积从1996年到2012年的17年间增长了100倍，由170万公顷增长至1.7亿公顷。2012年，发展中国家转基因作物的种植面积占全球的52％，超过了发达国家的转基因作物种植面积（48％），前五个种植转基因作物的发展中国家有中国、印度、巴西、阿根廷以及南非（CliveJames,International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA.）在所有的转基因作物中，转基因大豆的种植面积超过其他任何转基因作物，占转基因作物种植面积一半以上。目前，至少有超过1000种抗草甘膦大豆品种在广泛应用(Lawton,K.,1999.Roundup of amarket.Farm Industry News,February,pp.4–8)。

抗草甘膦（Glyphosate）转基因大豆由美国Monsanto公司1994年5月研制开发，在生产上迅速推广。抗草甘膦转基因大豆针对草甘膦的作用机理,导入能够使植物表达更多的EPSPS合成酶的基因,使植株对草甘膦不敏感从而能够忍受正常剂量或更高剂量的草甘膦而不被杀死。抗草甘膦大豆的种植使得田间杂草的管理措施发生巨大的改变，在解决粮食短缺、改善作物营养构成及缓解环境压力等方面带来了显著效益。但同时，转基因作物的种植的生态安全问题也受到人们的密切关注，有些学者认为转基因作物的种植会引起生态风险、基因漂移、影响生物多样性。我国虽然还未批准抗草甘膦转基因大豆的商业化种植，但作为草甘膦的生产和使用大国，抗草甘膦转基因作物在我国具有巨大的商业化应用潜力，因此，建立一套可靠、严谨而又简便的监管制度势在必行。同时，中国是全球最大的大豆进口国，转基因大豆的食品安全问题也成为人们相当关注的问题。2000年1月，113个国家在加拿大签署了联合国《生物安全议定书》，其中规定，消费者对于转基因食品拥有知情权，转基因产品越境转移时，进口国可以对其实施安全评价与标识管理（金芜军，贾士荣，彭于发.不同国家和地区转基因产品标识管理政策的比较[J].农业生物技术学报，2004,(12):7-12.）。2002年1月我国农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》要求对转基因食品及含有转基因成分的食品实行产品标识制度。

目前的转基因大豆的检测手段有外源蛋白检测和外源基因检测。外源基因检测主要有两类。一类是检测非目的基因序列，包括启动子序列，终止子序列，以及克隆载体自身序列，例如P-35S,T-35S,T-NOS,或nptII。另一类是检测目的基因序列，例如内源基因Lectin，外源基因EPSPS等，主要方法有巢式PCR、RT-PCR、荧光定量PCR，Southern Blot等方法。这些方法操作繁琐，对仪器、试剂有较高要求，不适宜进行田间检测。

外源蛋白的检测方法都以免疫分析技术为基础，主要有酶联免疫吸附法（ELISA）以及胶体金快速检测试纸条法。ELISA技术特异性高，操作简便，且具有很好的稳定性和灵敏度。胶体金检测试纸条利用胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团能通过静电吸引牢牢结合的原理而发明的一种新型免疫诊断技术。它的优点是简介迅速，结果易于判定，特异性好。除了上述蛋白检测技术以外，近年在基因芯片的基础上又发展出一种蛋白芯片技术。它是一种高通量监测系统，通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用，该技术为同时检测转基因植物中多种标志蛋白及与标志蛋白相关联的蛋白提供了有效手段。尽管这些蛋白检测技术已经运用于转基因植物检测中，但是，由于这些方法的检测范围狭窄，易出现假阴性结果，且价格比较昂贵，在日常检测中不易普及。

环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)是2000年日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术（Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic acids research,2000,28(12):e63-e63.）。该技术通过设计4条引物来识别靶序列上6个特异区域，在具有链置换功能的Bst DNA聚合酶的作用下，在恒温条件下能特异、高敏、快速地扩增靶序列。2001年，Nagamine等人又在LAMP四组引物的基础上，增设了一组环引物，该引物直接与LAMP反应过程中产生的“茎环”结构结合，将常规的LAMP反应时间缩短了1半以上(Nagamine K,HaseT,Notomi T.Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J].Molecular and cellular probes,2002,16(3):223-229.)。该技术操作简便，特异性强，反应结束产生的焦磷酸镁浑浊沉淀物，用肉眼就可以判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过染料颜色变化来判定结果，也可通过琼脂糖凝胶电泳进行观察可以看到梯形条带，尤其适宜于基层的快速检测。由于该检测方法具有特异性强，灵敏度高，快速简便等特点，已广泛引用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测中。

目前，LAMP技术开始应用于转基因检测。Lee等在2009年根据35S启动子（P-35S）,农杆菌胭脂碱合成酶启动子（P-NOS）以及农杆菌胭脂碱合成酶终止子and（T-NOS）的特异序列设计LAMP引物，鉴定转基因油菜中的外源基因，LAMP结果检测仍然是通过电泳检测（LeeD,La Mura M,Allnutt T,et al.Detection of genetically modified organisms(GMOs)using isothermalamplification of target DNA sequences[J].BMC biotechnology,2009,9(1):7.）；2009年，王永等人以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）为主要研究对象，利用LAMP技术同时对7种转基因作物进行LAMP检测，并且添加SBRY GREEN I荧光染料作为指示剂来判断反应是否发生（王永,兰青阔,赵新,等.转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用[J].中国农业科学,2009,42(4):1473-1477.）；陈金松等人在2011年通过LAMP法检测含有CaMV35S的转基因玉米（陈金松,黄丛林,张秀海,等.环介导等温扩增技术检测含有CaMV35S的转基因玉米[J].华北农学报,2011,26(4):8-14.）；2012年，Chen X等人将羟基萘酚蓝（HNB）作为指示剂应用到转基因水稻的LAMP检测中（Chen X,Wang X,Jin N,et al.Endpoint visual detection of three genetically modified rice events byloop-mediated isothermal amplification[J].International journal of molecular sciences,2012,13(11):14421-14433.）；Li Q等于2013年通过LAMP法检测转基因水稻中的cry1Ab基因(Li Q,Fang J,Liu X,et al.Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)method for rapid detection of cry1Abgene in transgenic rice(Oryza sativa L.)[J].European Food Research and Technology,2013:1-10.)；2013年，Randhawa G J等分别对启动子(P-35S和P-FMV)及报告基因（aadA、nptII和uidA）的特异序列设计LAMP引物，比较5组LAMP引物检测转基因棉花的灵敏度及效率（RandhawaG J,Singh M,Morisset D,et al.Loop-mediated Isothermal Amplification:Rapid Visual and Real-TimeMethods for Detection of Genetically Modified Crops[J].Journal of agricultural and food chemistry,2013.）；广州迪奥生物科技公司于2012年发明了转基因水稻BT63及其衍生物的LAMP检测方法（广州迪澳生物科技有限公司.转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法:中国,CN201210128794.0[P].2012-08-15）；同年，该公司还发明了提高油酸含量的转基因大豆DP-305423的LAMP检测方法（广州迪澳生物科技有限公司.转基因大豆DP-305423及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法:中国,CN201210128764.X[P].2012-08-15）以及抗草甘膦转基因大豆GTS40-3-2的LAMP检测方法（广州迪澳生物科技有限公司,转基因大豆GTS40-3-2及其衍生品种的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法:中国，CN201210128801.7[P].2012-08-15）。

兰青阔等2008年用LAMP方法检测抗草甘膦转基因大豆中的CP4-EPSPS基因，根据CP4-EPSPS基因设计了四条特异性引物，外引物1：GCCACCCATCTCGATCAC；外引物2：GATCGGGAATTGGATCCGG；内引物1：TCGTCCACCGTGACAGG GTTTTTTCATCGCCATGAGCTTCCTC；内引物2：AGTTCATGGACCTGATGGCCGTTTTTCATCAGGCAGCCTTCGTAT；但是检测手段仍然停留在电泳检测，仍然需要凝胶成像才能观察（兰青阔,王永,赵新,等.LAMP在检测转基因抗草甘膦大豆cp4-epsps基因上的应用[J].安徽农业科学,2008,36(24):1037-1037.）。

本发明研发出了抗草甘膦转基因大豆的LAMP通用检测方法，该方法与兰青阔等人设计的LAMP检测抗草甘膦大豆CP4-EPSPS基因方法的不同及创新点在于：（1）引物序列完全不同。同样选取CP4-EPSPS作为目的基因，兰青阔等人设计的引物是外引物1：GCCACCCATCTCGATCAC；外引物2：GATCGGGAATTGGATCCGG；内引物1：TCGTCCACCGTGACAGGGTTTTTTCATCGCCATGAGCTTCCTC；内引物2：AGTTCATGGACCTGATGGCCGTTTTTCATCAGGCAGCCTTCGTAT；而本发明设计的引物是F3：TCCTCGACGGCCTTCC；B3：GCACCGTGACGCCCTT；BIP：CGAAGTCATCAACCCGCGCCAGCGTGGAGGAGCGAAC；FIP：TGGGGTTCATCAGCACGTTGAGTTGCGGCCCTGCTTGT；（2）本发明在四条LAMP基本引物的基础上增设两条环引物（LB和LF），特异性更强，LB：GAAGACGTGGCGGACCT；LF：ATGGTGACGTCGGAGCC；（3）检测手段和结果呈现的方式不同。本发明使用SBRYGreen I荧光染料，检测手段简单，无需PCR，检测结果用肉眼可以直观观察，省时和便捷；而兰青阔等人的方法仍然需要电泳和凝胶成像检测，繁琐并耗时。LAMP检测的目标之一就是不用电泳，不用凝胶成像，可以直接在紫外光下观察或者直接用肉眼观察判断反应结果。因此，从严格意义上来说，兰青阔等人的文章名字虽然叫LAMP检测，但是实际上不是LAMP检测，论文中没有提供任何LAMP检测的图片。（4）检测灵敏度更高。本发明的检测灵敏度是常规PCR的100倍，比兰青阔等人的检测方法的灵敏度高10倍。

本发明研发出的抗草甘膦转基因大豆的LAMP通用检测方法与“GTS40-3-2的LAMP检测方法”区别及创新点在于：⑴选用目的基因不同。本发明选用抗草甘膦转基因大豆外源基因CP4-EPSPS进行特异性扩增，适用于所有的抗草甘膦转基因大豆通用检测，而“GTS40-3-2的LAMP检测方法”在外源基因与内源基因结合处设计引物，针对GTS40-3-2进行转基因检测;⑵设计引物序列完全不同，“GTS40-3-2的LAMP检测方法”设计的四条引物序列为：外引物1：GCTTCAACATGTGAAGGAGTA;外引物2：AACTACCTTCTCACCGCA；内引物1：CAACGAGAAGCTATATGTAGATGCTCACTCACCAGTGACCCTA；内引物2：CAAAACTATTTGGGATCGGAGAAGAGAACTTCTCGACGATGGC;而本发明设计的引物是F3：TCCTCGACGGCCTTCC；B3：GCACCGTGACGCCCTT；BIP：CGAAGTCATCAACCCGCGCCAGCGTGGAGGAGCGAAC；FIP：TGGGGTTCATCAGCACGTTGAGTTGCGGCCCTGCTTGT；（3）本发明在四条LAMP基本引物的基础上增设两条环引物（LB和LF），特异性更强，LB：GAAGACGTGGCGGACCT；LF：ATGGTGACGTCGGAGCC；（4）检测灵敏度更高。本发明的检测灵敏度是常规PCR的100倍，比"GTS40-3-2的LAMP检测方法"的灵敏度高10倍；（5）扩增效率更高。在四条LAMP基本引物的基础上增设两条环引物，将扩增时间缩短到45min，比"GTS40-3-2的LAMP检测方法"节约了半小时左右。

发明内容

本发明的目的是采用环介导等温扩增技术（LAMP）建立检测抗草甘膦转基因大豆的LAMP快速检测方法。

一种抗草甘膦转基因大豆LAMP快速检测方法，以抗草甘膦转基因大豆DNA为模板，LAMP反应体系试剂中包括引物混合物、探针、反应缓冲液和反应酶，所述引物混合物有如下引物：

①F3：5’-TCCTCGACGGCCTTCC-3’;

②B3：5’-GCACCGTGACGCCCTT-3’;

③BIP：5’-CGAAGTCATCAACCCGCGCCAGCGTGGAGGAGCGAAC-3’;

④FIP：5’-TGGGGTTCATCAGCACGTTGAGTTGCGGCCCTGCTTGT-3’;

⑤LB：5’-GAAGACGTGGCGGACCT-3’;

⑥LF：5’-ATGGTGACGTCGGAGCC-3’

其中六条引物包括两条外引物（F3和B3）、两条内引物（FIP和BIP）和两条环引物（LB和LF），FIP由F1c-F2组成，BIP由B1c-B2组成，F1c和B1c分别是F1和B1的互补序列。

所述反应体系包括：（1）所述引物混合液：外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，环引物LB和LF各0.4μmol/L，（2）反应缓冲液：6mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，5mmol/L MgS0₄，10mmol/L(NH₄)₂S0₄，0.1%Tritonx-100；反应酶：8U Bst DNA聚合酶大片段。

所述LAMP反应条件：将引物混合液、反应缓冲液、反应酶混合均匀后加入1μl DNA模板后，61～65℃保温30～60min，85℃保温2min。

所述方法还包括观察检测结果步骤，其特征在于：在LAMP反应体系中加入显色剂，观察显色情况。

所述显色剂为SYBR green I。

本发明利用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）建立针对抗草甘膦转基因大豆的检测方法。本方法具有多条引物的扩增，并在两端形成了具有引物功能的环状结构，这种多引物结合和能自行产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于LAMP反应操作步骤简单及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，加入荧光剂显色后可以直接用肉眼观察判定反应结果，也可以用2%的琼脂糖凝胶电泳观察反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用，也适合在实验条件不足的室外检测。

本发明所提供的抗草甘膦转基因大豆的LAMP快速检测方法具有以下优点：

一、适用性广。该检测方法针对抗草甘膦转基因大豆的CP4-EPSPS特异基因进行特异性扩增，适合所有品种的抗草甘膦转基因大豆的检测。

二、灵敏度高。对抗草甘膦转基因大豆的检测检测灵敏度比常规PCR高100倍。

三、特异性强。所用的特异引物根据抗草甘膦转基因大豆CP4-EPSPS特异基因不同区域设计出6条引物，特异性比常规PCR要强。

四、快速高效。环引物的使用，将反应时间缩短到45min，比常规LAMP检测节省30～45min。

五、仪器设备要求低，操作简单，结果明显，适合基层实验室检测以及进行田间检测。不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅就可以完成检测，结果清晰明显，肉眼即可观察结果。

六、污染率低。在LAMP反应体系配置完成后，滴加20μl石蜡油，开盖后反应液被密封在石蜡油内，降低气溶胶污染。

七、对人和环境友好。检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。

综上所述，本发明具有比现有PCR技术检测抗草甘膦转基因大豆的方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性,比现有的LAMP技术检测抗草甘膦大豆的方法具有更高的时效性，低污染性。可以在实际生产中现场应用检测。在抗草甘膦转基因大豆及其加工品快速检测和田间监测转基因大豆基因漂移情况有很高的应用价值。

附图说明

图1抗草甘膦转基因大豆LECTIN内源基因以及CP4-EPSPS外源特异基因一步双重PCR扩增结果，

M:D2000DNA标准分子量（Takara），1：中作J9331，2：中黄13，3：中黄30，4：AG5601，5：SNK500，6：阴性对照。

图2抗草甘膦转基因大豆CP4-EPSPS特异序列的LAMP引物和探针设计示意图，

图3抗草甘膦转基因大豆LAMP方法检测，

A为加荧光染料检测结果，1：阳性结果，具有绿色荧光，2：阴性对照，为深褐色。

B为检测结果为电泳图，M:D2000DNA标准分子量（Takara）1：阳性结果，为LAMP扩增梯形条带，2：阴性对照，无扩增产物。

图4加环引物LAMP检测时间效率检测，

A为加荧光染料和加环引物检测结果：1:15mim，2：30min，3：45min，4:60min，5:75min，6:90min，7：阴性对照；

B为加环引物的电泳检测结果：M:D2000DNA标准分子量（Takara），1:15mim，2：30min，3：45min，4:60min，5:75min，6:90min，7：阴性对照；

C为加荧光染料和不加环引物检测结果：1:15mim，2：30min，3：45min，4:60min，5:75min，6:90min，7：阴性对照；

D为不加环引物的电泳检测结果：M:D2000DNA标准分子量（Takara），1:15mim，2：30min，3：45min，4:60min，5:75min，6:90min，7：阴性对照。

图5抗草甘膦转基因大豆LAMP方法特异性检测结果

A为加荧光染料检测结果，1：中作J9331，2：中黄13，3：中黄30，4：AG5601，5：SNK500，6：阴性对照；

B为电泳检测结果，M:D2000DNA标准分子量（Takara），1：中作J9331，2：中黄13，3：中黄30，4：AG5601，5：SNK500，6：阴性对照。

C为加荧光染料检测的结果，1：抗线9，2：黑农44，3：黑农48，4：黑农66，5：黑农68，6：黑农69，7：中作J9331，8：阴性对照；

D为电泳检测结果，M:D2000DNA标准分子量（Takara），1：抗线9，2：黑农44，3：黑农48，4：黑农66，5：黑农68，6：黑农69，7：中作J9331，8：阴性对照。

图6抗草甘膦转基因大豆LAMP方法灵敏度检测结果

A为加荧光染料检测结果图，1～8分别为：单片子叶DNA，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和阴性对照；

B为LAMP检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量（Takara），1～8分别为：单片子叶DNA，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和阴性对照；

C为普通PCR法检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量（Takara），1～8分别为：单片子叶DNA，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和阴性对照。

图7抗草甘膦转基因大豆LAMP检测法的田间应用。

A为PCR检测电泳结果，其中两排电泳图示分别为1-46号样品,47号为无模板阴性对照；

B、C、D、E、F为LAMP检测添加荧光染料结果，47号为无模板阴性对照。

具体实施方式

实验材料

抗草甘膦转基因大豆品种中作J9331，AG5601，非转基因大豆品种中黄13,中黄30，SNK500（本实验室自有品种，可以对公众发放）

主要试剂：Taq DNA聚合酶和DNA marker购自大连TaKaRa公司；引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成；；Bst DNA聚合酶大片段购自美国New England Biolabs公司；SYBR green I购自美国Invitrogen公司。

实施例1抗草甘膦转基因大豆LECTIN内源基因以及CP4-EPSPS外源特异基因PCR扩增。

内源基因LECTIN扩增引物参照GB/T19495.4-2004，外源特异基因CP4-EPSPS扩增引物参照孙红炜等人的方法（孙红炜,路兴波,杨崇良,等.9种大豆制品中转基因成分定性PCR检测[J].食品科学,2008,29(2):234-237.），详细引物序列见表1。

表1PCR扩增引物序列

采用一步双重PCR进行扩增，所用PCR体系为25μl，10×Buffer(含Mg2+)2.5μl，10mMdNTP2μl，引物Lectin-F、Lectin-R、Cp4-epsps-F和Cp4-epsps-R(10μmol/L）各1μl，Taq酶（5U/μl,Takara）0.5μl，模板DNA1μl，灭菌ddH₂O补足至25μl。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1.5min；35个循环；72℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测。如图1所示，第1和第4泳道分别是抗草甘膦转基因大豆中作J9331和AG5601的DNA，均含有LECTIN基因及CPE-EPSPS基因，第2、3、5泳道分别是中黄13、中黄30和SNK500的DNA，只有LECTIN基因，第6泳道为无模板阴性对照。

实施例2LAMP技术检测抗草甘膦转基因大豆方法的建立

2.1抗草甘膦转基因大豆LAMP引物设计

根据CP4-EPSPS基因序列，设计并筛选下述LAMP引物和探针（如图2所示），引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。序列如下：

①F3：5’-TCCTCGACGGCCTTCC-3’；

②B3：5’-GCACCGTGACGCCCTT-3’;

③BIP：5’-CGAAGTCATCAACCCGCGCCAGCGTGGAGGAGCGAAC-3’;

④FIP：5’-TGGGGTTCATCAGCACGTTGAGTTGCGGCCCTGCTTGT-3’;

⑤LB：5’-GAAGACGTGGCGGACCT-3’;

⑥LF：5’-ATGGTGACGTCGGAGCC-3’

2.2LAMP反应体系配置：外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，环引物LB和LF各0.4μmol/L，10mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，5mmol/L MgS0₄，10mmol/L(NH₄)₂S0₄，0.1%Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段，1μl DNA模板，用灭菌双蒸馏水补足25μl。

2.3LAMP反应扩增条件：将以上各成分加入反应管中混合后，然后置于60～65℃恒温水浴中等温扩增30～60min，在85℃保温2min。

2.4LAMP反应产物检测

LAMP反应产物的检测方法有二种：反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后观察结果（如图3A所示）；取2μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相（如图3B所示），可看到有LAMP的特征性梯形带。

实施例3加环引物反应时间检测

取大豆中作J9331的DNA为模板，分别进行加环引物与不加环引物LAMP检测，反应条件一致。设置15、30、45、60、75、90min六个反应时间，进行LAMP反应。反应结束后，在反应物中添加2μL配置好的SBRY Green I混匀后，观察颜色变化。如图4A所示，加环引物LAMP反应在45min就出现扩增，颜色变成绿色，如图4C所示，不加环引物LAMP检测在75min才出现扩增，颜色变成绿色。取2μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相。图4B所示，可以观察到加环引物的LAMP反应在45min就出现梯形条带，而不加环引物的LAMP反应在75min出现梯形条带（图4D）。这说明加环引物使得反应时间比原始反应缩短30min左右。

实施例4抗草甘膦转基因大豆LAMP特异性检测

收集大豆转基因品种AG5601、中作9331，非转基因品种SNK500、中黄13、中黄30（本实验室自有品种）、抗线9、黑农44、黑农48、黑农64、黑农66、黑农68、黑农69（黑龙江省农科院提供），分别提取其DNA作为模板进行LAMP检测，以检测抗草甘膦转基因大豆LAMP检测方法的特异性。将上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入1μl模板DNA，按2.3的反应条件进行，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化。如图5A所示，第1管和第4管分别为中作9331和AG5601的DNA，可以观察到绿色荧光，其他管的品种DNA和阴性对照均为红褐色。取2μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相，可看到第1泳道和第4泳道有LAMP的特征性梯形带，其他泳道均未发现有扩增产物(图5B)。如图5C所示，第7管为中作J9331的阳性对照，可以观察到绿色荧光，其他管的品种DNA和阴性对照均为红褐色。相应的琼脂糖凝胶电泳图可以看到第7泳道有LAMP的特征性梯形带，其他泳道均为发现有扩增产物(图5D)。结果表明上述LAMP引物和反应体系在检测抗草甘膦转基因大豆时具有很高的特异性。

实施例5抗草甘膦转基因大豆LAMP灵敏度检测

将一片抗草甘膦转基因大豆的叶片提取的DNA模板按10倍稀释成1～1.0×10^-56个浓度，各取1μl DNA做为模板，将上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，按2.3的反应条件进行，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图6A所示)，1～5管均可以看到绿色荧光。取2μl产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相，可以看出1～5泳道均有LAMP的特征性梯形带，检测最低限能达到1/200000（图6B）。同时以上述稀释DNA为模板，以CP4-epsps-F和CP4-epsps-R为引物，进行常规PCR检测，体系如下：2.5μl10×PCR Buffer(含Mg2+)，2μl10Mm dNTP（2.5mM），2μl引物对CP4-epsps-F/CP4-epsps-R(10uM)，0.5μl TaqDNA聚合酶（5U/ul），1μl模板DNA，灭菌ddH2O补足至25μl，采用无DNA模板为阴性对照。凝胶电泳观察结果（如图6C所示）。结果表明在DNA稀释到10^-2倍时，能够观察到扩增条带，再次稀释时常规PCR则不能检测。

以上结果说明：上述LAMP检测体系最低检测限度能够达到1/200 000。具有极高的灵敏度，比常规PCR检测灵敏100倍。

实施施6抗草甘膦转基因大豆LAMP田间检测

所选取的试验地位农科院廊坊基地转基因大豆试验基地，随机选取46个样（采样序号及品种见表2），各取1片子叶提取DNA，同时进行LAMP检测以及一步双重PCR。反应完成后，LAMP检测直接肉眼观察，取PCR产物10ul在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相。结果表明，LAMP扩增结果与PCR扩增结果一致。

表2：农科院廊坊基地采样品种（下述品种可以对公众免费发放）

Claims (5)

1.一种抗草甘膦转基因大豆LAMP快速检测方法，其特征在于：其中LAMP反应体系所使用的引物是：

①F3：5’-TCCTCGACGGCCTTCC-3’;

②B3：5’-GCACCGTGACGCCCTT-3’;

③BIP：5’-CGAAGTCATCAACCCGCGCCAGCGTGGAGGAGCGAAC-3’;

④FIP：5’-TGGGGTTCATCAGCACGTTGAGTTGCGGCCCTGCTTGT-3’;

⑤LB：5’-GAAGACGTGGCGGACCT-3’;

⑥LF：5’-ATGGTGACGTCGGAGCC-3’。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：其中的LAMP反应体系包括：

1）引物混合液：外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L,环引物LB和LF各为0.4μmol/L；

2）反应混合液：6mmol/L dNTP,20mmol/L Tris-HCl(pH8.8),10mmol/L KCl,3mmol/LMgS0₄,10mmol/L(NH4)₂S0₄,0.1%Triton x-100,8U Bst DNA聚合酶大片段。

3.根据权利要求2所述方法，其中LAMP反应条件为：将引物混合液和反应混合液混合均匀后，加入1μl DNA模板后，加灭菌双蒸馏水补全到25μl，在反应体系配置完成后滴加20μl石蜡油，置于61～65℃温育30～90min，85℃保温2min。

4.根据权利要求3所述的方法，还包括LAMP反应后观察检测结果步骤，其特征在于：在LAMP反应后的体系中加入2μl显色剂SYBR green I，观察显色情况。

5.权利要求1-4所述任一检测方法在转基因大豆及其加工后的产品快速检测和田间转基因大豆基因漂移的监测中的应用。

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