CN101906473A - 一种检测转epsps基因作物的核酸恒温扩增试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

一种检测转EPSPS基因作物的核酸恒温扩增试剂盒及方法公开了一组检测转EPSPS基因作物的核苷酸序列，如下：1)5’-GCCACCCATCTCGATCAC-3’(SEQ ID NO：1)，2)5’-GATCGGGAATTGGATCCGG-3’(SEQ ID NO：2)，3)5’-TCGTCCACCGTGACAGGGTTTTTTCATCGCCATGAGCTTCCTC-3’(SEQ ID NO：3)，4)5’-AGTTCATGGACCTGATGGCCGTTTTTCATCAGGCAGCCTT CGTAT-3’(SEQ ID NO：4)，5)5’-CGACACGAGGCCCATGAC-3’(SEQ ID NO：5)，6)5’-CGAAGATCGAACTCTCCG-3’(SEQ ID NO：6)并提供了一种基于核酸恒温扩增及核酸试纸条，可简单、快速进行结果判定的转EPSPS基因作物检测试剂盒，属于检验检疫领域。适用于对转EPSPS基因作物的简单、快速检测，可用于检测机构实验室对进出口商品的标识复验，转基因育种研究单位对转基因作物田间快速筛查等。本发明优点是：1)快速：检测时间仅为1-1.5小时；2)特异；3)灵敏；4)反应成本低：仅需一个普通的水浴锅；5)稳定。

Description

一种检测转EPSPS基因作物的核酸恒温扩增试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及基于EPSPS修饰基因CP4序列和核酸免疫试纸条的一种快速检测转EPSPS基因作物的方法，尤指在反应结束后无需任何仪器、而直接用核酸免疫试纸条简单快速的对结果进行判定的检测转EPSPS基因作物的核酸恒温扩增方法和试剂盒。已有的专利是利用荧光PCR对EPSPS基因进行检测，或者对EPSPS蛋白进行，但都需要昂贵的仪器设备，而且不利于现场快速检测。我们通过选择EPSPS修饰基因CP4的一段特异性序列设计引物，利用恒温扩增方法，而且采用核酸免疫试纸条对结果进行检测，反应结束后直接用核酸免疫试纸条对结果进行检测，无需任何特殊仪器，结果判读直观、明确、快速，而且操作简单、快速。适用于对转EPSPS基因作物的简单、快速检测，可用于检测机构实验室对于进出口商品的标识复验，转基因育种研究单位对转基因作物田间快速筛查等，属于检验检疫领域。

背景技术

转基因技术使开发农作物新品种的时间大为缩短，研究人员利用转基因技术培育出了抗除草剂、抗干旱、耐盐碱、抗重金属和抗病虫害、营养价值高的品种，这对于提高粮食产量、减少收获后损失以及增加农产品营养价值具有重要作用。随着转基因技术的发展，越来越多的转EPSPS基因作物新品种被培育出来。多个国家和地区相继批准了转EPSPS基因作物进入商业化生产，种植面积急剧扩大。然而转EPSPS基因作物在带来巨大社会和经济效益的同时也存在许多问题，主要集中在转基因食品的安全性及对生态环境的安全性方面。

转基因食品对人类健康及生态环境的潜在影响日益受到人们的普遍关注，转基因食品的安全性不容忽视。世界各国都在加强对转基因食品的管理，欧盟、日本、加拿大都已制定了对转基因食品进行标签标识管理的法规，欧盟(EC)49/2000号条例规定食品中含有超过1％的转基因成分时，必须在标签上做出标识。

为了加强对农业转基因生物的安全管理，保障人体健康，规范转基因产品的销售行为，引导和保护消费者的知情权，2002年中国农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》，2006年通过了《中华人民共和国农产品质量安全法》，明确规定在中国境内销售列入标识的转基因生物及其产品，必须进行是否含有转基因成分的标识。转基因作 物标识管理必须以有效的检测方法为基础。因此，建立针对转EPSPS基因作物快速检测方法具有十分重要的现实意义。

目前国际上，对转基因农产品采取的主要检测方法是建立在核酸水平上的PCR检测，包括竞争PCR(competitive PCR)、实时定量PCR(Real-time PCR)、PCR-ELISA方法；建立在蛋白质水平上的Western印记、酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫试纸条的检测方法。由于这些方法存在操作步骤繁琐，检测时间较长；不适合于现场实时检测和跟踪检测；检测成本过高；对检验人员的知识、操作水平和仪器水平要求过高等不足之处，方法较难普及。

Notomi等在2000年首次报道一种新的DNA扩增方法即DNA环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。LAMP法不需要常规PCR必需的反复升温解链过程，可在60～65℃恒温条件下持续扩增，扩增效率高，几十分钟可达10⁹～10¹⁰个拷贝，因此不需特殊设备，检测时间更短、敏感性更高；同时6条特异性引物识别靶基因的8个特定区域，特异性更高，因此在转基因检测上明显优于PCR。

本发明首次基于EPSPS基因序列和核酸试纸条建立LAMP技术应用于转EPSPS基因作物的检测，提供了针对转EPSPS基因作物的EPSPS引物序列、试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测转EPSPS基因作物的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供快速、准确、便于结果判定，易于控制污染的检测转EPSPS基因作物的检测试剂盒(基于核酸试纸条)。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

选择CP4-EPSPS基因特定保守序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物设计。

一组检测转EPSPS基因作物的核苷酸序列，如下：

1)5’-GCCACCCATCTCGATCAC-3’(SEQ ID NO：1)

2)5’-GATCGGGAATTGGATCCGG-3’(SEQ ID NO：2)

3)5’-TCGTCCACCGTGACAGGGTTTTTTCATCGCCATGAGCTTCCTC-3’(SEQ ID NO：3)

4)5’-AGTTCATGGACCTGATGGCCGTTTTTCATCAGGCAGCCTTCGTAT-3’(SEQID NO：4)

5)5’-CGACACGAGGCCCATGAC-3’(SEQ ID NO：5)

6)5’-CGAAGATCGAACTCTCCG-3’(SEQ ID NO：6)

其中序列1)和2)分别为EPSPS检测的外引物F3和B3，序列3)和4)为EPSPS检测的内引物FIP和BIP，序列5)和6)为EPSPS检测的探针Df和Db，分别标记荧光素和生物素。

我们采用LAMP检测技术建立了转EPSPS基因作物检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物的筛选，主要组分使用浓度的优化，以及对反应后产物直接用核酸试纸条进行检测，得到以下试剂盒。

检测转EPSPS基因的核酸恒温扩增试剂盒，由以下组分组成：

1)LAMP反应液，表1为LAMP反应液配方。

表1 LAMP反应液配方

组分	加入量/终浓度
		双蒸水	2.7μL
10×buffer	2.0μL
		5mol/L Betaine	1.0μL
0.1mol/L MgSO4	0.6μL
		10mmol/L dNTP	1.5μL
20μmol/L F3	0.2μL

20μmol/L B3	0.2μL
		20μmol/L FIP	3.2μL
20μmol/L BIP	3.2μL
		20μmol/L Db	1.2μL
20μmol/L Df	1.2μL

Betaine购自SIGMA公司，10×缓冲液，0.1mol/L MgSO4购自NEB公司，10mmol/LdNTP购自Promega公司；引物委托大连宝生物生物工程有限公司合成，其中10×缓冲液的组成为：500mM KCl、100mM Tris-HCl(pH9.025℃)、1.0％Triton X-100。

2)Bst DNA聚合酶，8U/μL，购自NEB公司。

3)阴性对照：灭菌双蒸水。

4)阳性对照：为含有EPSPS基因片段的质粒。回收转EPSPS基因作物EPSPS基因PCR扩增产物，与PGEM-T easy载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为PGEM-EPSPS。用灭菌双蒸水将纯化质粒进行稀释，至质粒拷贝数调整为10⁶拷贝/μl，即为检测转EPSPS基因作物的阳性对照品。

216bp EPSPS目的片段基因序列如下：

1  GCCACCCATC TCGATCACCG CATCGCCATG AGCTTCCTCG TCATGGGCCT CGTGTCGGAA

61 AACCCTGTCA CGGTGGACGA TGCCACGATG ATCGCCACGA GCTTCCCGGA GTTCATGGAC

121CTGATGGCCG GGCTGGGCGC GAAGATCGAA CTCTCCGATA CGAAGGCTGC CTGATGAGCT

181CGAATTCGAG CTCGGTACCG GATCCAATTC CCGATC

对合成的引物做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间，即视为合格引物。从转EPSPS基因大豆中提取的DNA为模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对扩增效果较好。

用CTAB法提取转EPSPS基因作物的DNA。由于引物、MgSO4，Betaine，dNTP的浓度以及反应时间和温度对LAMP反应效率有一定影响，通过逐一优化，确定了如下反应体系和条件(表2)，分别对转EPSPS基因大豆核酸以及转EPSPS基因棉花核酸进行检测。反应条件为：60℃/1h，然后用核酸试纸条检测。

表2建立的LAMP反应体系

组分	加入量/终浓度
		10×buffer	2.0μL
5mol/L B etaine	1.0μL
		0.1mol/L MgSO4	0.6μL
10mmol/L dNTP	1.5μL
		20μmol/L F3	0.2μL
20μmol/L B3	0.2μL
		20μmol/L FIP	3.2μL
20μmol/L BIP	3.2μL
		20μmol/L Db	1.2μL
20μmol/L Df	1.2μL
		8U/μL Bst DNA聚合酶	1.0μL
补灭菌双蒸水至	18μL

提取的DNA模板

2μL

1)样本的处理：取待检样品0.2mg置于研钵中，用液氮磨至粉状，加入700μL65℃水浴预热的2％CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动，将磨碎液倒入1.5ml的灭菌离心管中，65℃水浴30min，编号备用。处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融2次)。

2)DNA的提取：在样本处理区进行。

1.1 取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数)，作好标记。首先加入600μL氯仿-异戊醇(24∶1)，然后加入600μL处理好的待测样本(一份样本换用一个吸头)，混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。阴性对照、阳性对照无需处理，直接使用。

1.2 12,000g离心10min(如有条件，于4℃进行离心)。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入500μL异丙醇(-20℃预冷)，作好标记。

1.3 吸取步骤1.2各管中的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

1.4 12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600μL 75％乙醇(-20℃预冷)，颠倒洗涤。

1.5 12,000g离心5min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min(不宜过于干燥，以免DNA不溶)。

1.6 加入50μL 0.1×TE(含RNase)缓冲液，轻轻混匀，溶解管壁上的DNA，2,000g离心5sec，4℃保存备用，若需长期保存，请保存于-20℃。

3)LAMP扩增：从试剂盒中取出LAMP反应液、8U/μL Bst DNA聚合酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需LAMP管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系需要17μL LAMP反应液和1μL Bst DNA聚合酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向每个管中各分装18μL，转移至样本处理区。在各设定的管中分别加入制备的DNA溶液各2μL，盖紧管盖，于4,000g离心5sec。60℃/1h。

4)结果的判定：可用核酸试纸条对产物进行检测。也可对产物进行电泳进行结果判定。

核酸试纸条判定：阴性对照只有一条紫色的线；阳性对照有两条紫色的线。检测样品显示两条紫线的为阳性，否则为阴性。

电泳判定：需要用1.5％琼脂糖进行凝胶电泳，如出现特定的梯状条带，判为阳性，否则判为阴性。

本发明的优点和创新之处在于：

1)快速：检测时间仅为1-1.5小时；

2)特异：由于采用了针对8个区域的4条特异性引物和2条特异性探针，引物多聚体及非特异性扩增几率大大降低，从而使结果准确性大大提高；与其他转基因作物未发现交叉反应；

3)灵敏：该方法的扩增效率非常高，比传统的PCR方法灵敏度高100-1000倍；用所建立的方法对以10倍梯度稀释的PGEM-EPSPS质粒进行检测，结果表明稀释到10个拷贝仍为阳性；

4)反应成本低：采用一次性核酸试纸条进行检测，不需任何特殊设备，而直接根据核酸试纸条显色进行判断，结果更加直观，比PCR简单，且成本大大降低，因此极易推广；

5)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为转EPSPS基因作物核酸恒温扩增检测方法阴阳性核酸试纸条判定(左边2根试纸条为阳性，右边2根试纸条为阴性)。

图2为转EPSPS基因作物核酸恒温扩增检测方法阴阳性电泳判定(左边2个泳道为阳性，右边2个泳道为阴性)。

具体实施方式

实施例1、试剂盒的配制和使用

1、试剂盒的配制组成，见表3。

表3试剂盒配制组成

组成(48tests/盒)	数量
		转EPSPS基因作物LAMP反应液	850μL×1管
8U/μL Bst DNA聚合酶	50μL
		灭菌双蒸水	1mL×2管
阴性对照	1mL×2管
		阳性对照	1mL×2管

2、试剂盒的使用方法

2.1 DNA提取：

1.1 取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数)，作好标记。首先加入600μL氯仿-异戊醇(24∶1)，然后加入600μL处理好的待测样本(一份样本换用一个吸头)，混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。阴性对照、阳性对照无需处理，直接使用。

1.2 12,000g离心10min(如有条件，于4℃进行离心)。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入500μL异丙醇(-20℃预冷)，作好标记。

1.3 吸取步骤1.2各管中的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

1.4 12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600μL 75％乙醇(-20℃预冷)，颠倒洗涤。

1.5 12,000g离心5min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面)，室温干燥3min(不宜过于干燥，以免DNA不溶)。

1.6 加入50μL 0.1×TE(含RNase)缓冲液，轻轻混匀，溶解管壁上的DNA，2,000g离心5sec，4℃保存备用，若需长期保存，请保存于-20℃。

3)LAMP扩增：从试剂盒中取出LAMP反应液、8U/μL Bst DNA聚合酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需LAMP管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系需要17μL LAMP反应液和1μL Bst DNA聚合酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向每个管中各分装18μL，转移至样本处理区。在各设定的管中分别加入制备的DNA溶液各2μL，盖紧管盖，于4,000g离心5sec。60℃/1h。

4)结果的判定：可用核酸试纸条对产物进行检测。也可对产物进行电泳进行结果判定。

核酸试纸条判定：阴性对照只有一条紫色的线；阳性对照有两条紫色的线。检测样品显示两条紫线的为阳性，否则为阴性。

电泳判定：需要用1.5％琼脂糖进行凝胶电泳，如出现特定的梯状条带，判为阳性，否则判为阴性。

Claims (3)

1.一组基于核酸试纸条的检测转EPSPS基因作物的核苷酸序列，如下：

1)5’-GCCACCCATCTCGATCAC-3’(SEQ ID NO：1)

2)5’-GATCGGGAATTGGATCCGG-3’(SEQ ID NO：2)

3)5’-TCGTCCACCGTGACAGGGTTTTTTCATCGCCATGAGCTTCCTC-3’(SEQ ID NO：3)

4)5’-AGTTCATGGACCTGATGGCCGTTTTTCATCAGGCAGCCTTCGTAT-3’(SEQ ID NO：4)

5)5’-CGACACGAGGCCCATGAC-3’(SEQID NO：5)

6)5’-CGAAGATCGAACTCTCCG-3’(SEQ ID NO：6)

其中序列1)和2)分别为EPSPS检测的外引物F3和B3，序列3)和4)为EPSPS检测的内引物FIP和BIP，序列5)和6)为EPSPS检测的探针Df和Db，分别标记荧光素和生物素。

2.一种基于核酸试纸条可简单快速进行结果判定的转EPSPS基因作物检测试剂盒，48tests/盒，由以下组分组成：

1)LAMP反应液，分别为850μL×1管，含有1×缓冲液、Betaine、MgSO4、dNTP、引物F3和B3、引物FIP和BIP以及探针Db和Df；

2)Bst DNA聚合酶8U/μL，50μL×1管；

3)灭菌双蒸水，1mL×2管；

4)阴性对照：1mL×1管，灭菌双蒸水；

5)阳性对照：1mL×2管，为含有EPSPS基因片段的质粒。回收转EPSPS基因作物EPSPS基因PCR扩增产物，与PGEM-T easy载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为PGEM-EPSPS。用灭菌双蒸水将纯化质粒进行稀释，至质粒拷贝数调整为10⁶拷贝/μl，即为检测转EPSPS基因作物的阳性对照品。

6)核酸试纸条：48tests。

216bp EPSPS目的片段基因序列如下：

1  GCCACCCATC TCGATCACCG CATCGCCATG AGCTTCCTCG TCATGGGCCT CGTGTCGGAA

61 AACCCTGTCA CGGTGGACGA TGCCACGATG ATCGCCACGA GCTTCCCGGA GTTCATGGAC

121CTGATGGCCG GGCTGGGCGC GAAGATCGAA CTCTCCGATA CGAAGGCTGC CTGATGAGCT 181CGAATTCGAG CTCGGTACCG  GATCCAATTC  CCGATC

3.根据权利要求2所述的转EPSPS基因作物检测试剂盒，其特征在于：所述检测EPSPS基因引物序列为：

1)5’-GCCACCCATCTCGATCAC-3’(SEQ ID NO：1)

2)5’-GATCGGGAATTGGATCCGG-3’(SEQ ID NO：2)

3)5’-TCGTCCACCGTGACAGGGTTTTTTCATCGCCATGAGCTTCCTC-3’(SEQ ID NO：3)

4)5’-AGTTCATGGACCTGATGGCCGTTTTTCATCAGGCAGCCTTCGTAT-3’(SEQ ID NO：4)

5)5’-CGACACGAGGCCCATGAC-3’(SEQ ID NO：5)

6)5’-CGAAGATCGAACTCTCCG-3’(SEQ ID NO：6)

其中序列1)和2)分别为EPSPS检测的外引物F3和B3，序列3)和4)为EPSPS检测的内引物FIP和BIP，序列5)和6)为EPSPS检测的探针Df和Db，分别标记荧光素和生物素。

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