CN105039556A - 转基因大豆mon87769的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
转基因大豆mon87769的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种转基因大豆MON87769的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由6条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1~6所示。检测试剂盒包括检测引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTPs溶液、显色剂。检测方法是采用特异性引物及具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，并采用加入显色剂观察颜色变化的方法，判断样品是否含有转基因大豆MON87769成分。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强等特点，适合现场检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测转基因大豆MON87769的引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
2014年全球转基因作物种植面积高达1.815亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，其中全球种植面积最大的为转基因大豆，2014年达到9070万公顷，占全球转基因作物总面积的50%。转基因大豆MON87769是美国孟山都公司研发的一种品质改良转基因大豆新品种，已在我国申请进口用作加工原料。针对转基因大豆MON87769开展快速精准的检测方法研究，是转基因生物安全管理相关法律法规顺利实施的技术支撑和保障。
转基因成分检测技术主要分为两大类：一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，目前PCR技术应用最为广泛，但基于PCR的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长（约3~4h），难以达到现场快速检测目的，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。
LAMP技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件（60~65℃）进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在1h内完成；③高特异性：针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：可通过肉眼或浊度仪观察反应管内的沉淀变化，或在反应管中加入染色剂后通过肉眼观察颜色变化等方法，对扩增产物进行便捷的检测。
LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测转基因大豆MON87769的检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种转基因大豆MON87769的LAMP检测引物组。
本发明的另一个目的在于公开一种转基因大豆MON87769的LAMP检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因大豆MON87769的LAMP检测方法。
本发明所采用的技术方案如下：
根据转基因大豆MON87769的转化体特异性的核苷酸序列，设计转基因大豆MON87769的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQIDNO:1~6；确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性进行验证。
转基因大豆MON87769的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物F3：GTAGATTTCCCGGACATGAA（SEQIDNO：1）；
外引物B3：TCTTGACATTCTTCAAACAATCA（SEQIDNO：2）；
内引物FIP：TCGACACTTGTCTTTTCTTTCTCTTTTTTACAATTGACCATCATACTCAA（SEQIDNO：3）；
内引物BIP：TACACTTTAGATGCAACAAGCCTTCTTTAAAAGCAAGCAATTGAATTTGG（SEQIDNO：4）；
环引物LF：TTAGCAAGTTGCTCGTGAAGTT（SEQIDNO：5）；
环引物LB：AATGGGCCATGAAGATGGTTT（SEQIDNO：6）。
转基因大豆MON87769的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：
（1）检测引物溶液：由上述6条引物配制的检测引物溶液，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB的浓度依次为4~6μmol/L、4~6μmol/L、32~48μmol/L、32~48μmol/L、4~6μmol/L和4~6μmol/L；
（2）具有链置换活性的DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；
（3）10×反应缓冲液：200mmol/LTris-HCl、pH8.8，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，40~100mmol/LMgSO4，6~14mol/L甜菜碱；
（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
（5）显色剂：1000×SYBRGREENI荧光染料。
优选的，所述的检测引物溶液中含有5μmol/L外引物F3、5μmol/L外引物B3、40μmol/L内引物FIP、40μmol/L内引物BIP、5μmol/L环引物LF、5μmol/L环引物LB。
优选的，所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μL。
优选的，所述的10×反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80mmol/L和8mol/L。
利用以上所述的试剂盒检测转基因大豆MON87769的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200μLPCR反应管内加入模板DNA2~5μL、检测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液2~5μL，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25μL；
（3）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；
（4）LAMP扩增结果的鉴定：在反应管中加入1~2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。
通过实验证明，本发明提供的转基因大豆MON87769的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强等优点。
附图说明
图1是实施例2中进行特异性检测的结果图，1~17依次为转基因大豆MON87701、MON87705、MON87708、MON87769、非转基因大豆对照、转基因大豆混合样品S1（含有MON87701、MON87705、MON87708、MON87769）、转基因大豆混合样品S2（含有MON87701、MON87705、MON87708、MON87769）、转基因大豆混合样品S3（含有MON87701、MON87705）、转基因大豆混合样品S4（含有MON87708、MON87769）、转基因大豆混合样品S5（含有MON89788、40-3-2、A5547、A2704、305423、356043、CV127）、转基因玉米混合样品S6（含有Bt11、Bt176、MON810、MON863、NK603、GA21、TC1507、T25）、转基因水稻混合样品S7（含有KF-6、TT51-1）、转基因棉花混合样品S8（含有MON531、MON15985、GHB614）、转基因油菜混合样品S9（含有MS1、RF1、T45、Oxy235）、非转基因大豆对照S10、非转基因作物对照S11（含有非转基因玉米、水稻、棉花、油菜）、空白对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1试剂盒及其检测方法。
按下列配方制备转基因大豆MON87769的LAMP检测试剂盒，每个试剂盒的规格为100次反应：
（1）检测引物溶液：合成外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，将引物干粉用灭菌去离子水或超纯水分别配成浓度为100μmol/L的母液，然后分别取5μL外引物F3、5μL外引物B3、40μL内引物FIP、40μL内引物BIP、5μL环引物LF、5μL环引物LB，放入一个新的1.5mL离心管中，充分混匀，配成100μL的LAMP检测引物溶液，其中引物序列分别为：
外引物F3：GTAGATTTCCCGGACATGAA（SEQIDNO：1）；
外引物B3：TCTTGACATTCTTCAAACAATCA（SEQIDNO：2）；
内引物FIP：TCGACACTTGTCTTTTCTTTCTCTTTTTTACAATTGACCATCATACTCAA（SEQIDNO：3）；
内引物BIP：TACACTTTAGATGCAACAAGCCTTCTTTAAAAGCAAGCAATTGAATTTGG（SEQIDNO：4）；
环引物LF：TTAGCAAGTTGCTCGTGAAGTT（SEQIDNO：5）；
环引物LB：AATGGGCCATGAAGATGGTTT（SEQIDNO：6）；
（2）BstDNA聚合酶：浓度为8U/μL，分装100μL放入一个新的1.5mL离心管中；
（3）10×反应缓冲液：包含200mmol/LTris-HCl、pH8.8，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，80mmol/LMgSO4和8mol/L甜菜碱，分装250μL放入一个新的1.5mL离心管中；
（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成，分装500μL放入一个新的1.5mL离心管中；
（5）显色剂：1000×SYBRGREENI荧光染料，分装200μL放入一个新的棕色1.5mL离心管中。
用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：
（1）提取待测样品的基因组DNA：采用北京天根公司生产的植物DNA提取试剂盒方法，提取待测样品的基因组DNA，稀释至25ng/μL；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：采用25μL的反应体系，在200μL反应管内依次加入灭菌去离子水或超纯水15.5μL、模板DNA2μL、检测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液3μL；
（3）运行LAMP扩增反应：将反应管放置在恒温水浴锅中，65℃孵育60min，80℃孵育5min终止反应；
（4）LAMP扩增结果的鉴定：在LAMP扩增产物中加入1μL的显色剂，混匀，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
实施例2试剂盒及检测方法的特异性实验。
对实施例1所述的试剂盒及其检测方法的特异性进行实验，测试样品既包括转基因大豆样品，也包括一些常见的转基因玉米、水稻、棉花、油菜样品，共17种，分别为：
（1）转基因大豆MON87701（含量为1%）；
（2）转基因大豆MON87705（含量为1%）；
（3）转基因大豆MON87708（含量为1%）；
（4）转基因大豆MON87769（含量为1%）；
（5）非转基因大豆阴性对照；
（6）转基因大豆混合样品S1（含有MON87701、MON87705、MON87708、MON87769，每种转基因成分的含量为5%）；
（7）转基因大豆混合样品S2（含有MON87701、MON87705、MON87708、MON87769，每种转基因成分的含量为1%）；
（8）转基因大豆混合样品S3（含有MON87701、MON87705，每种转基因成分的含量为1%）；
（9）转基因大豆混合样品S4（含有MON87708、MON87769，每种转基因成分的含量为1%）；
（10）转基因大豆混合样品S5（含有MON89788、40-3-2、A5547、A2704、305423、356043、CV127，每种转基因成分的含量为1%）；
（11）转基因玉米混合样品S6（含有Bt11、Bt176、MON810、MON863、NK603、GA21、TC1507、T25，每种转基因成分的含量为1%）；
（12）转基因水稻混合样品S7（含有KF-6、TT51-1，每种转基因成分的含量为1%）；
（13）转基因棉花混合样品S8（含有MON531、MON15985、GHB614，每种转基因成分的含量为1%）；
（14）转基因油菜混合样品S9（含有MS1、RF1、T45、Oxy235，每种转基因成分的含量为1%）；
（15）非转基因大豆对照S10；
（16）非转基因作物对照S11（含有非转基因玉米、水稻、棉花、油菜）；
（17）超纯水空白对照。
本实施例中，仅在含有转基因大豆MON87769的样品反应管中显现绿色，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对转基因大豆MON87769具有很好的特异性。
应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110>吉林省农业科学院
<120>转基因大豆MON87769的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
<130>
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MON87769大豆的LAMP检测外引物F3
<400>1
gtagatttcccggacatgaa20
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MON87769大豆的LAMP检测外引物B3
<400>2
tcttgacattcttcaaacaatca23
<210>3
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MON87769大豆的LAMP检测内引物FIP
<400>3
tcgacacttgtcttttctttctcttttttacaattgaccatcatactcaa50
<210>4
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MON87769大豆的LAMP检测内引物BIP
<400>4
tacactttagatgcaacaagccttctttaaaagcaagcaattgaatttgg50
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MON87769大豆的LAMP检测环引物LF
<400>5
ttagcaagttgctcgtgaagtt22
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MON87769大豆的LAMP检测环引物LB
<400>6
aatgggccatgaagatggttt21
Claims (6)
1.转基因大豆MON87769的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物F3：GTAGATTTCCCGGACATGAA（SEQIDNO：1）；
外引物B3：TCTTGACATTCTTCAAACAATCA（SEQIDNO：2）；
内引物FIP：TCGACACTTGTCTTTTCTTTCTCTTTTTTACAATTGACCATCATACTCAA（SEQIDNO：3）；
内引物BIP：TACACTTTAGATGCAACAAGCCTTCTTTAAAAGCAAGCAATTGAATTTGG（SEQIDNO：4）；
环引物LF：TTAGCAAGTTGCTCGTGAAGTT（SEQIDNO：5）；
环引物LB：AATGGGCCATGAAGATGGTTT（SEQIDNO：6）。
2.转基因大豆MON87769的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：
（1）检测引物溶液：由权利要求1所述的6条引物配制的检测引物溶液，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB的浓度依次为4~6μmol/L、4~6μmol/L、32~48μmol/L、32~48μmol/L、4~6μmol/L和4~6μmol/L；
（2）具有链置换活性的DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；
（3）10×反应缓冲液：200mmol/LTris-HCl、pH8.8，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，40~100mmol/LMgSO4，6~14mol/L甜菜碱；
（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
（5）显色剂：1000×SYBRGREENI荧光染料。
3.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的检测引物溶液中含有5μmol/L外引物F3、5μmol/L外引物B3、40μmol/L内引物FIP、40μmol/L内引物BIP、5μmol/L环引物LF、5μmol/L环引物LB。
4.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μL。
5.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的10×反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80mmol/L、8mol/L。
6.利用权利要求2~6任一项所述的试剂盒检测转基因大豆MON87769的方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200μL反应管内加入模板DNA2~5μL、检测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液2~5μL，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25μL；
（3）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；
（4）LAMP扩增结果的鉴定：在反应管中加入1~2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。
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