CN104212880B - 基于lamp的转基因玉米mon863基因快检试剂盒及检测方法 - Google Patents

基于lamp的转基因玉米mon863基因快检试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测试剂及方法，具体是指转基因玉米MON863的环介导等温扩增引物的设计及其环介导等温扩增检测试剂和方法。本发明针对MON863基因整合图谱中Cry3Bb1基因和tahsp17基因的连接区域设计一套引物，由两对引物构成，特异性好。检测方法包括基因组的提取、环介导等温扩增以及显色反应，操作简便、灵敏度高、反应快速、结果判定方便。另外本发明的试剂盒由引物、反应液、Bst？DNA？聚合酶、显色剂等组成，利用该试剂盒检测MON863品系，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、肉眼判定结果等优点，为转基因植物检测提供了有效、快速的检测方法。

Description

基于LAMP的转基因玉米MON863基因快检试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测试剂及方法，基于环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）,涉及一种转基因植物检测方法，具体涉及一种用于检测转基因玉米MON863特定基因Cry3Bb1和tahsp17的环介导等温扩增引物及其环介导等温扩增检测方法。
背景技术
MON863为孟山都公司产品，抗虫基因为Cry3Bb1，来自苏云金芽孢杆菌熊本亚种（B.thuringiensissubsp.Kumamotoensis）。Cry3Bb1蛋白对鳞翅目家族的昆虫具有抗性，由于公众对转基因食品安全性的质疑，各国设定了相应的限量标准。并且目前基于MON863品系的检测技术，主要集中在普通的定性及定量PCR方法和标准，尚无关于检测转基因玉米MON863品系特定位点的环介导等温检测技术。
环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplificationmethod,LAMP）是Notomi等于2000年发明的一种新型的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（BstDNApolymerase）在等温条件下（60-65℃）反应，在1h内即可完成核酸扩增反应，目的片段可以扩增109倍。该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增效率高、省时、操作简单等优点，在核酸检测方面具有明显优势。
本发明具有较高的检测灵敏度，最低检测限可达约4个单倍体基因组拷贝数，为转基因植物检测提供了一种快速的筛检方法。
发明内容
为了建立了一种针对于转基因玉米MON863的恒温检测方法，本发明的一个目的是提供了一套环介导等温扩增技术快速检测用引物；本发明的第二个目的是建立了环介导等温扩增检测方法；根据检测方法实现了本发明的第三个目的，提供了使用上述检测用引物的试剂盒；本发明的试剂盒和检测方法具有简便、灵敏、快速、特异性好等特点，提供了一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米MON863的检测方法。
本发明的第一个目的提供的用于MON863鉴定的环介导等温扩增的引物，包括两条外引物（MON863-F3/MON863-B3）、两条内引物（MON863-FIP/MON863-BIP）、两条环引物（MON863-LF/MON863-LB），该引物组对于检测MON863具有特异性。上述引物的核苷酸序列分别为：
MON863-F3：CCTACCAGACCTTCGACCTC
MON863-B3：GCTCCAACCTGAATGAGCA
MON863-FIP：TGGAGACGAAGGACTCAGCACCCCACCACGAACTCCAACAT
MON863-BIP：AGATCGAGTTCATCCCCGTCCACGTCCAAACGCATGCAGAA
MON863-LF：TCATTCTTGTCGCCCGAGAAGC
MON863-LB：GCTGTGATAGGAACTCTGATTGAA
本发明的第二个目的就是提供了一种转基因玉米MON863的检测方法，本发明采用以下技术方案：
1、样品的制备和模板的提取：将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB方法提取基因组。
2、环介导等温扩增：配置反应体系，加入DNA模板后，进行扩增反应。
3、环介导等温扩增产物的检测：
(1)电泳法：将LAMP扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳图呈现LAMP典型的阶梯状条带，则样品中有目的基因，若电泳图无任何条带则为阴性。
(2)染色法：加入SYBRGreenI，观察颜色变化：在反应管中加入1μLSYBRGreenI（1000X），混匀后观察颜色变化，若颜色变为绿色，则样品中有目的基因，若颜色仍保持SYBRGreenI的橙色，则为阴性。
本发明的第三个目的提供了快速诊断试剂盒，包括所述的引物组、上述检测方法的反应液、BstDNA聚合酶以及一张阳性定量标准曲线。
其中引物组由体积比为1:1:6:6:4:4的上下游外引物、上下游内引物与上下游环引物组成。反应液是由体积比为5:8:1:10的1xThermopolbuffer、1.4-2.0mMdNTP、2-8mMMgSO4、0.6-1.0M甜菜碱组成。BstDNA聚合酶每微升含3-10个活性单位。还有20XSYBRGREENⅠ荧光染料，稀释到1000X后可作为显色剂。另外还有一份定量标准曲线图，可以用来鉴定未知样品的浓度。
本发明所述的环介导等温扩增技术检测MON863具有以下优点：
1、反应快速，在加入环引物后，一般情况下在15-30min即可有大量的扩增产物生产，为了保证检测的准确度，本发明选择反应时长为40min，在此时间内即可将模板扩增109倍，该方法操作简便，适于转基因产品的快速检测。
2、特异性好，该技术对靶基因的6个区域设计引物，引物具有更高的特异性。
3、灵敏度高，该技术反应速度快，对于痕量目的基因可以达到很好的检测效果，灵敏度比PCR方法高一到两个数量级，该技术为转基因产品的监督检测提供了技术支持。
4、操作简单，适于基层使用。本发明设计了检测MON863的试剂盒，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层检测使用。
附图说明
图1引物特异性实验与引物酶切验证图，A从左至右分别为DL2000DNAmarker,MON863,notemplatecontrol(NTC),MON810,LY038,GA21,NK603,Bt176,Bt11,3272,GTS-40-3-2andMON863non-GMparent
图2灵敏度实验加入SYBRGreenI显色图，从左至右分别为105，104,103,102,10pg基因组
图3灵敏度实验电泳图，从左至右分别为105，104,103,102,10pg基因组
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1MON863检测方法的建立
（1）、通过日本荣岩株式会社环介导引物在线设计软件LAMPprimerdesigningsoftwareprimerexplorerV4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)针对MON863基因整合图谱中Cry3Bb1基因和tahsp17基因的连接区域设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成，将引物稀释为10μmol/L,转基因玉米粉MON863提取基因组,测定基因组的浓度并调整为105pg/μL,然后将此浓度的基因组10倍倍比稀释为104,103,102,10pg/μL，制备成系列剃度浓度的标准DNA模板。
（2）、对影响环介导等温扩增技术的因素(dNTPs,甜菜碱,引物,Mg2+,BstDNA聚合酶,温度,反应时间)进行了优化，最终优化的LAMP扩增反应体系：1.4-2.0mMdNTP、2-8mMMgSO4、0.6-1.0M甜菜碱，1.6μM外引物（MON863-F3,MON863-B3）、0.2μM内引物（MON863-FIP,MON863-BIP），0.8μM环引物（MON863-LF,MON863-LB）、3.2-8.0UBstDNA聚合酶、1xThermopolbuffer(包含:20mMTris-HCl(pH8.825℃),10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,2mMMgSO4,0.1%.TritonX-100)。扩增反应程序：65℃反应40min，85℃放置3min，终止反应。
（3）、定量环介导等温扩增反应：制备了五个不同MON863基因组浓度（105，104，103，102，10pg/μL）的样品，以这些样品为模板进行扩增。
（4）结果检测：
4.1、电泳法：采用2%的琼脂糖凝胶电泳检测LAMP产物，紫外下观察电泳条带。为为确定该引物扩增MON863的产物是正确的，将产物稀释后做酶切验证。在该套引物扩增的区域中含有EcoRI位点，经计算，酶切产物大小在226和162bp，酶切结果与预期相符（图1）。
4.2、染料法：反应结束后，直接向反应液中加入1μL1000xSYBRGreenI，混匀，肉眼观察颜色变化。有扩增反应的管颜色变为绿色，无扩增反应的管仍然保持SYBRGreenI的橙色。由图2可见，与电泳图结果相符
4.3、定量测试的所有样品都可以被检测到（图3）
实施例2MON863试剂盒的制备
本发明所提供的试剂盒由一套引物组、反应液、BstDNA聚合酶、显色剂以及一张阳性定量标准曲线等组成。
（1）其中所说的引物为：
MON863-F3：CCTACCAGACCTTCGACCTC
MON863-B3：GCTCCAACCTGAATGAGCA
MON863-FIP：TGGAGACGAAGGACTCAGCACCCCACCACGAACTCCAACAT
MON863-BIP：AGATCGAGTTCATCCCCGTCCACGTCCAAACGCATGCAGAA
MON863-LF：TCATTCTTGTCGCCCGAGAAGC
MON863-LB：GCTGTGATAGGAACTCTGATTGAA
（2）反应液是由体积比为5:8:1:10的1xThermopolbuffer、1.4-2.0mMdNTP、2-8mMMgSO4、0.6-1.0M甜菜碱组成；其中1xThermopolbuffer含有20mMTris-HCl(pH8.825℃),10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,2mMMgSO4,0.1%.TritonX-100
（3）BstDNA聚合酶为BstDNApolymerase，每微升含3-10个活性单位；还有20XSYBRGREENⅠ荧光染料，稀释到1000X后可作为显色剂。
实施例3试剂盒检测MON863
（1）、样品的制备和模板的提取：将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB方法提取基因组。
（2）、环介导等温扩增：在200μLPCR管中配置反应体系，引物混合物11μL，反应液12μL，BstDNA聚合酶8U，DNA模板1μL，ddH2O1μL，盖紧管盖，65℃水浴锅中反应40min。
（3）、环介导等温扩增产物的检测：
3.1、电泳法：采用2%的琼脂糖凝胶电泳检测LAMP产物，紫外下观察电泳条带。
3.2、染料法：反应结束后，直接向反应液中加入1μL1000xSYBRGreenI，混匀，肉眼观察颜色变化。有扩增反应的管颜色变为绿色，无扩增反应的管仍然保持SYBRGreenI的橙色。
（4）、环介导等温定量扩增：在200μLPCR管中配置反应体系，引物混合物11μL，反应液12μL，BstDNA聚合酶8U，DNA模板1μL，20XSYBRGreenI1μL，盖紧管盖放于定量PCR中，65℃3min，50循环[65℃30s，65℃30s]。
（5）、环介导等温定量扩增产物的检测
将未知样品测得的Ct值代入在标准曲线方程中，算出样品的浓度。的根据2.725pg的玉米基因组相当于1个单倍体基因组，算出样品中MON863D的拷贝数约为24个单倍体基因组拷贝数。

Claims (10)

1.转基因玉米MON863品系环介导等温扩增的检测用引物组，其特征在于，所述引物组为一套特征引物组，一套引物组由三对引物组成，一对引物为外引物，一对引物为内引物，一对引物为环引物，序列分别为：
上游外引物，MON863-F3：CCTACCAGACCTTCGACCTC
下游外引物，MON863-B3：GCTCCAACCTGAATGAGCA
上游内引物，MON863-FIP：TGGAGACGAAGGACTCAGCA-
CCCCACCACGAACTCCAACAT
下游内引物，MON863-BIP：AGATCGAGTTCATCCCCGTCC-
ACGTCCAAACGCATGCAGAA
上游环引物，MON863-LF：TCATTCTTGTCGCCCGAGAAGC
下游环引物，MON863-LB：GCTGTGATAGGAACTCTGATTGAA。
2.一种转基因玉米MON863品系的检测方法，其特征在于，权利要求1的引物组是以MON863的Cry3Bb1基因和tahsp17基因的连接片段为靶基因设计的，通过环介导等温扩增方法用权利要求1所述的检测引物组对样品的DNA选择性扩增所述的靶基因片段，确认是否存在有扩增产物。
3.根据权利要求2所述的转基因玉米MON863品系的检测方法，其特征在于，该检测方法具体为：
(1)模板的提取：将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB方法提取基因组；
(2)环介导等温扩增体系包括：1.4-2.0mMdNTP、2-8mMMgSO4、0.6-1.0M甜菜碱，0.2-1.6μM外引物MON863-F3,MON863-B3、0.2μM内引物MON863-FIP,MON863-BIP，0.8μM环引物MON863-LF,MON863-LB、3.0-10.0UBstDNA聚合酶、1xThermopolbuffer；
(3)环介导等温反应产物的检测：
利用电泳检测、荧光检测环介导反应产物是否有扩增产物。
4.转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求1所述的引物组、由权利要求3体系中1xThermopolbuffer、dNTP、MgSO4、甜菜碱组成的反应液，还包括BstDNA聚合酶以及一张阳性定量标准曲线图。
5.根据权利要求4所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，所述的引物组由体积比为1:1:6:6:4:4的上下游外引物、上下游内引物与上下游环引物组成。
6.根据权利要求4所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，反应液是由体积比为5:8:1:10的1xThermopolbuffer、1.4-2.0mMdNTP、2-8mMMgSO4、0.6-1.0M甜菜碱组成。
7.根据权利要求4所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，BstDNA聚合酶每微升含3-10个活性单位。
8.根据权利要求4所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括20XSYBRGREENⅠ荧光染料，稀释后可作为显色剂，以及一份阳性定量标准曲线图。
9.根据权利要求4所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，普通定性环介导等温扩增反应程序：64℃反应40min，反应所使用的仪器为普通PCR仪，水浴锅以及恒温培养箱。
10.根据权利要求4所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，定量环介导等温扩增反应程序：64℃反应40min，85℃放置3min，终止反应，反应所使用的仪器为定量PCR仪。
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