CN1544657A - 用电化学发光pcr进行基因检测的方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用电化学发光PCR进行基因检测的方法及装置，所述装置包括反应样品池、定时器、检测样品池、恒电位仪、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机构成，其中检测样品池内安装有进样管、工作电极、对电极、参比电极、出样管；反应样品池、检测样品池、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机依次相连；定时器与反应样品池相连；检测样品池与恒电位仪相连。所述检测方法的特点是待测序列可以在仪器中进行聚合酶链式反应，然后用探针杂交筛选待测样品，进行电化学发光检测。本发明方法和装置检测灵敏度高、安全、快速、准确、操作简便。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种基因检测技术，更详细的是一种用电化学发光PCR进行基因检测的方法及其装置。
(二)背景技术
目前，基因检测的方法主要有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析；聚合酶链式反应-单链构象多态性分析；荧光能量传递技术(Taqman探针技术，LightCycler探针技术，Amplisensor探针技术，复合探针技术)；分子灯塔技术；基因探针技术等。但是，这些技术都存在各自的不足：灵敏度低，含有有害物质，放射性元素，检测时有荧光背景，操作繁琐，检测时间长等。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种用电化学发光PCR进行基因检测的方法，待测序列可以在仪器中进行聚合酶链式反应，然后用探针杂交筛选待测样品，进行电化学发光检测。
本发明的目的还在于提供实现所述方法使用的用电化学发光PCR进行基因检测的装置。
本发明的基因检测方法包括基因序列检测方法和基因点突变检测方法。
本发明用电化学发光PCR进行基因序列检测的方法包括以下步骤：
(1)反应样品池中加入PCR反应物，进行聚合酶链式反应，扩增待测序列，两条引物分别标记有三连吡啶钌复合物和生物素；
(2)在(1)得到的扩增样品中加入分别标记有生物素和三连吡啶钌复合物的寡核苷酸探针，使样品和探针进行杂交反应；
(3)杂交反应后的样品用链酶亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；
(4)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压，使三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；
(5)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；
(6)计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。
本发明用电化学发光PCR进行基因点突变检测的方法包括以下步骤：
(1)反应样品池中加入PCR反应物，进行聚合酶链式反应，扩增待测序列；
(2)将扩增样品分为两份；
(3)在一份扩增样品中加入限制性内切酶，使样品进行酶切反应，另一份扩增样品作为对比样；
(4)酶切反应后的样品用链酶亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；
(5)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压，使三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；
(6)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；
(7)计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。
本发明实现所述方法使用的用电化学发光PCR进行基因检测的装置包括反应样品池、定时器、检测样品池、恒电位仪、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机构成，其中检测样品池内安装有进样管、工作电极、对电极、参比电极、出样管。反应样品池、检测样品池、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机依次相连；定时器与反应样品池相连；检测样品池与恒电位仪相连。
检测样品池可以用清洗液反复清洗。所述的计算机数据采集软件，如：National Instruments公司开发的LabVIEW软件。所述的光电倍增管，如PerkinElmer公司研制的光电倍增管系列。
本发明的基本原理为：
在电场的作用下，三连吡啶钌复合物与三丙胺在阳极表面发生氧化还原反应，并放出一个光子。生物素可以与包被有链酶亲和素的磁珠结合，进一步被磁极选择性吸附，从而起到筛选目标序列的作用。控制温度时间可以使PCR体系进行反应，扩增待测序列。用分别标记有三连吡啶钌复合物和生物素的两条探针进行杂交，最终使只有同时连接三连吡啶钌和生物素的目标序列才能被收集到检测样品池中并检测到发光信号。通过发光信号的强度来区别目标序列进行定量。
本发明与现有技术相比具有如下有点及效果：
(1)电化学发光PCR仪将普通PCR仪的特点与电化学发光技术有机的结合起来；
(2)电化学发光PCR仪可以对待测样品进行快速、准确的检测。
(3)电化学发光PCR仪检测灵敏度很高，并且可以有效的去除普通PCR中假阳性结果对检测结果的干扰。
(4)电化学发光PCR仪操作方便，安全，没有溴化乙锭、同位素等有害物质的使用。
(5)电化学发光PCR技术发光原理为电致发光，可以避免荧光PCR技术中荧光背景对结果的影响。
(四)附图说明
图1是本发明装置结构框图；
图2是图1的装置的灵敏度测试图；
图3是实施例1用本发明装置检测转基因大豆中CaMV35S启动子发光信号对比图；(样品1为TE缓冲液+三丙胺(本底)，样品2为非转基因大豆(豫豆1号)，样品3为巴西转基因大豆1号，样品4为巴西转基因大豆2号，样品5为阿根廷转基因大豆1号)；
图4是实施例2用本发明装置检测转基因番木瓜中CaMV35S启动子发光信号对比图；(样品1为TE缓冲液+三丙胺(本底)，样品2为非转基因番木瓜(华南农大1号)，样品3为转基因番木瓜(华南农大抗病1号))；
图5是实施例3中用本发明装置检测PS-1基因密码子点突变发光信号对比图(1和2为同一样品酶切前信号强度，3和4为样品酶切后信号强度)；
图6是实施例4中用本发明装置检测膀胱癌基因点突变发光信号对比图；(1为TE缓冲液+三丙胺(本底)，2和3为同一样品酶切前信号强度，4和5为样品酶切后信号强度)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步具体的描述，但本发明的实施方式不限于此。
图1给出了本发明基因检测的电化学发光PCR仪的具体结构示意图。由图一可知本装置包括：反应样品池、定时器、检测样品池、恒电位仪、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机构成，其中检测样品池内安装有进样管、工作电极、对电极、参比电极、出样管。反应样品池、检测样品池、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机依次相连；定时器与反应样品池相连；检测样品池与恒电位仪相连。选用各构件组成本装置，其中：所述的光电倍增管，如PerkinElmer公司研制的光电倍增管系列。所述的计算机数据采集软件，如：National Instruments公司开发的LabVIEW软件。
如图2所示，本发明装置可以检测到0.1pmol的标记样品，并在样品含量0.1pmol至256pmol之间有很好的线性度。说明该仪器具有很高的灵敏度，而且可以进行定量的检测。
实施例1
将上述装置应用于转基因大豆的检测：转基因大豆中都含有CaMV35S启动子。
(1)提取非转基因大豆(豫豆1号)和转基因大豆DNA(巴西转基因大豆1号，巴西转基因大豆2号，阿根廷转基因大豆1号)；
(2)在反应样品池中加入PCR反应体系和大豆DNA，进行聚合酶链式反应，扩增待测序列；
(3)在(2)得到的扩增样品中加入分别标记有生物素和三连吡啶钌复合物的寡核苷酸探针，控制温度95℃5分钟，然后降温至65℃，30分钟，使样品和探针进行杂交反应；
(4)杂交反应后的样品用链酶亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；
(5)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压1.25V，使三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；
(6)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；
(7)计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。
如图3所示，是本例中用图1装置检测转基因植物中CaMV35S启动子发光信号对比图。样品1为TE缓冲液+三丙胺(本底)，样品2为非转基因大豆(豫豆1号)，样品3为巴西转基因大豆1号、样品4为巴西转基因大豆2号、样品5为阿根廷转基因大豆1号，由图可知本底与非转基因大豆的电化学发光信号值分别为9.6和12.8，而转基因大豆电化学发光信号分别可以达到207、111.6、83。结果信号很明显，信噪比很高，可以准确的判断待测基因是否存在。
实施例2
将上述装置应用于转基因番木瓜的检测：
(1)提取非转基因番木瓜(华南农大1号)和转基因番木瓜(华南农大抗病1号)DNA；
(2)在反应样品池中加入PCR反应体系和DNA，进行聚合酶链式反应，扩增待测序列；
(3)在(2)得到的扩增样品中加入分别标记有生物素和三连吡啶钌复合物的寡核苷酸探针，控制温度94℃5分钟，然后降温至65℃，60分钟，使样品和探针进行杂交反应；
(4)杂交反应后的样品用链酶亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；
(5)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压1.25V，使三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；
(6)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；
(7)计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。
图4为检测结果：样品1为TE缓冲液+三丙胺(信号值：6.5)，样品2为非转基因番木瓜DNA(信号值：8.9)，样品3为转基因番木瓜DNA(信号值：101)。
实施例3
本发明装置还可以用于点突变基因的检测。例如用于检测PS-1基因密码子235处点突变基因检测：
(1)在反应样品池中加入PCR反应体系和PS-1基因模板，进行聚合酶链式反应，扩增待测序列，两条引物分别标记有三连吡啶钌复合物和生物素；
(2)将扩增样品分为两份；
(3)在扩增样品一份中加入HpaII限制性内切酶控制温度37℃60分钟，然后降温至65℃20分钟，使样品进行酶切反应；
(4)酶切反应后的样品用链酶亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；
(5)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压1.25V，使三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；
(6)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；
(7)计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。
由图5可知，在酶切前电化学发光信号分别为241.4和242，酶切后电化学发光信号降低为114和108。由此可以准确的判断PS-1基因密码子235处发生了点突变。
实施例4
本发明装置用于检测膀胱癌点突变基因检测：
(1)在反应样品池中加入PCR反应体系和膀胱癌基因模板，进行聚合酶链式反应，扩增待测序列，两条引物分别标记有三连吡啶钌复合物和生物素；
(2)将扩增样品分为两份；
(3)在扩增样品一份中加入HpaII限制性内切酶控制温度37℃120分钟，然后降温至65℃60分钟，使样品进行酶切反应；
(4)酶切反应后的样品用链酶亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；
(5)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压1.25V，使三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；
(6)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；
(7)计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。
由图6可知，在酶切前电化学发光信号分别为182和215，酶切后电化学发光信号降低为36和55。由此可以准确的判断膀胱癌基因发生了点突变。
Claims (3)
1、一种用电化学发光PCR进行基因序列检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在反应样品池中加入PCR反应物，进行聚合酶链式反应，扩增待测序列，两条引物分别标记有三连吡啶钌复合物和生物素；
(2)在(1)得到的扩增样品中加入分别标记有生物素和三连吡啶钌复合物的寡核苷酸探针，使样品和探针进行杂交反应；
(3)杂交反应后的样品用链酶亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；
(4)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压，使三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；
(5)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；
(6)计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。
2、一种用电化学发光PCR进行基因点突变检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在反应样品池中加入PCR反应物，进行聚合酶链式反应，扩增待测序列；
(2)将扩增样品分为两份；
(3)在一份扩增样品中加入限制性内切酶，使样品进行酶切反应；另一份扩增样品作为对比样；
(4)酶切反应后的样品用链酶亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；
(5)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压，使三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；
(6)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；
(7)计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。
3、实现权利要求1或2所述方法的装置，起特征在于包括反应样品池、定时器、检测样品池、恒电位仪、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机构成，其中检测样品池内安装有进样管、工作电极、对电极、参比电极、出样管；反应样品池、检测样品池、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机依次相连；定时器与反应样品池相连；检测样品池与恒电位仪相连。
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