CN1537953A - 炭疽菌诊断基因芯片的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物工程类检测产品及其用途，具体地说是联合PCR技术和基因芯片技术检测炭疽杆菌。本发明可同时检测炭疽的PXO1、PXO2质粒及染色体等多个标志物，并能同时分析多份标本，具有特异性好、灵敏度高的特点，可作为战时或平时生物战剂检测、临床诊断、环境监测、卫生检疫等的检测工具。

Description

炭疽菌诊断基因芯片的制备及应用

炭疽杆菌是人畜共患致病菌，可通过消化道、呼吸道及皮肤接触感染入和动物，具有高度致病性，其芽孢能大量繁殖，易在空气中传播，并可存活十年以上，所以被认为是最有效的生物武器之一。它的存在对人类的健康和生命构成了极大的威胁，其检测和防御一直倍受重视。炭疽检测现在面临两个主要问题：一、如何快速确定某人是接触了炭疽芽胞还是其他无害细菌；二、如何快速诊断出有可能致命的吸入性炭疽感染以挽救病人的生命。

通常炭疽的检测诊断都是基于形态学特征或表型特征，如：革兰氏阳性染色试验、噬菌体试验、串珠和青霉素抑制试验、拉丝试验(粘型菌落)、溶血试验、芽孢形成试验等，这些方法在一定程度上都存在着费时、操作繁琐、灵敏度低等缺点。PCR等技术的出现为炭疽的快速、高效检测提供了有力的工具，也越来越受注视。

炭疽与苏云金、蜡样杆菌、蕈状杆菌等同属蜡样菌群，都是哺乳动物和昆虫的病原体。它们之间具有很高的同源性，属同一种属。炭疽杆菌与蜡样菌群的其他菌株的重要区别在于它有两个毒性质粒即编码炭疽热毒素的pXO1(185kb)和编码荚膜的pXO2(95kb)，缺失任何一个质粒其毒性都会下降。荚膜为D-谷氨酸聚合物，其合成酶由capA，capB，capC基因编码；而毒素由三个因子组成：pag基因编码的保护性抗原，lef基因编码的致命因子，cya基因编码的水肿因子。这些基因都可被用做PCR法鉴定炭疽的标志物，检测这些特异致病因子成为鉴定炭疽的主要手段。然而质粒非常不稳定，易缺失，现已发现自然界中存在缺失上述一种或两种质粒的菌株；而且质粒可被导入其它菌株，在异源系统中也发现毒素基因(如：aslef、cya等)的表达。因此，应用质粒鉴定炭疽的方法并不完全可靠。而染色体表达相对稳定，在炭疽的准确鉴定中起着重要的作用。染色体标志物：rpoB基因、16sRNA、vrrA基因、Ba813及SG-850标志物等都可用于炭疽的鉴定。但常规PCR检测一般是将扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，在紫外灯下通过观察有无特异性的荧光条带的出现判定阴阳结果，其结果的准确性、可靠性受主观及客观因素影响较大，同时溴化乙锭有强致癌毒性。而基因芯片技术的出现为基因检测提供了一个更高通量、更安全、更有效的手段。

基因芯片是近年来发展成熟的一种高通量基因检测技术(Hacia J.Naturegenetics(Supl)，1999，21(1)：42-47)。他可用于基因表达分析、突变检测、药物筛选等，用途非常广泛。基因条码识别通用芯片属于寡核苷酸芯片，是由F.Barany等(J.MOL.BIO.1999，292：251-262)发明的，它最初用于进行高通量的单碱基点突变检测，是通过结合PCR、连接酶检测技术(LDR)以及基因编码杂交技术而实现的，其中所采用的可寻址的基因条码序列是随机产生的人工设计探针，其序列独一无二，因此由这些序列组成的芯片可作为通用芯片，用于任意基因的突变检测，只需变换一下可寻址条码序列后所连接的靶核酸的序列就可实现。我们在试验中发现利用寻址编码识别通用芯片不仅可进行突变检测，而且还可实现多基因、多样本分析。其检测多样品、多基因的原理如下(附图1)：设计合成待检基因的特异扩增引物及报告探针(可按复合探针设计原则设计Wang SQ et al，Anal.BioChem.2002)，其中一条引物向5’端延伸一段寻址条码序列，该序列与引物间有一间隔臂，可阻止PCR延伸，并且该序列与固定在通用芯片上的可寻址捕获探针互补，通过PCR扩增使产物的末端连上一段可寻址的条码序列，然后将所有PCR扩增产物混合，与报告探针一起加入到杂交体系，与通用芯片进行杂交，这样这些PCR产物上连接的可寻址条码序列与芯片上互补的寻址捕获探针杂交，从而将扩增产物定向地锚定在芯片对应位置上，被锚定的PCR产物再与荧光或生物素等报告分子标记的特异报告探针杂交，通过信号扫描等分析即可检测出每份样品的结果。因为一条寻址条码序列可对应一份样本或一个基因，有多条寻址条码序列就可对应多分样本或多个基因，这样通过一次杂交就能同时检测出多份样本或多个基因，从而实现多样本、多基因检测的目的。

本发明的目的是，联合PCR技术和基因条码识别通用芯片检测炭疽杆菌，可同时鉴定炭疽杆菌的PXO1、PXO2两个质粒及染色体标志物，并实现多份标本同时分析的目的，为快速确定某人是接触了炭疽芽胞还是其他无害细菌以及指导临床合理用药提供快速高效的检测手段。本发明的主要内容包括：通用芯片的制备、针对炭疽两个质粒及染色体的基因条码引物以及报告探针的设计与合成、通用芯片检测炭疽标志物的杂交条件的优化以及特异性/灵敏度的分析、通用芯片在检测多份炭疽标本中的应用。

结合附图说明本发明的具体实施过程

附图1  基因编码识别通用芯片检测多标本的示意图

附图2  通用芯片的外观示意图及点阵布局

附图3  杂交时间对杂交信号的影响

附图4  杂交温度对杂交信号的影响

附图5  通用芯片检测炭疽的特异性分析

(a)检测染色体标志物(b)检测PXO2标志物(c)检测PXO1标志物

附图6  通用芯片在多份标本检测中的应用

实施例

1.寻址条码捕获探针的设计与合成

根据F.Barany等(J.MOL.BIO.1999，292：251-262)介绍的寻址条码探针设计原则，设计16条(探针数量可按需要增减)长24mer，Tm值相近(由OLIGO6.0软件计算)，且相互之间无同源性的探针，其序列及对应的编号见表1。合成在391 DNA合成仪(Applied Biosystems)上完成，探针的3′端进行氨基修饰。利用以四缩乙二醇为基础的氰乙基-N′，N′-二异丙基亚磷酰氨试剂在氨基试剂及寡核苷酸探针之间引入间隔臂。合成完毕后浓氨水55℃脱保护/切割15hr，经反相柱纯化，紫外定量后真空浓缩至干，-20℃保存备用。

        表1  寻址条码捕获探针的序列及编号

编号            序列(5’→3’)   Tm(℃)

bar1  GTCT TCTG GCAA TCGT CTCA CGTT-spacer-NH2 71.1

bar2  GCAA TCTG ACCT TCGT CCAT CGTT-spacer-NH2 72.9

bar3  ACCT TCTG AGGA TCGT TGTC CGTT-spacer-NH2 71.7

bar4  AGGA TCTG GTCT TCGT CTTG CGTT-spacer-NH2 72.0

bar5  TCTG TGTC TCGT GCAA CGTT CTCA-spacer-NH2 71.4

bar6  TCGT TGTC CGTT GCAA CTGT CTCA-spacer-NH2 71.4

bar7  CGTT TGTC CTGT GCAA TCTG CTCA-spacer-NH2 73.6

bar8  CTGT TGTC TCTG GCAA TCGT CTCA-spacer-NH2 70.7

bar9  CGTT GGTA CTCA TGTC CCAT CTGT-spacer-NH2 69.4

bar10 CTCA GGTA CTTG CGTT TGTC CCAT-spacer-NH2 71.0

bar11 CTGT GGTA CCAT TGTC CGTT GAGT-spacer-NH2 71.4

bar12 CTTG CCAT CTCA GGTA TGTC GGTT-spacer-NH2 70.9

bar13 TCTG CGAA TGTC CTGT ACCT TCGT-spacer-NH2 71.5

bar14 TGTC CAGA AGTG CTTG CTGT TCGT-spacer-NH2 72.5

bar15 TCGT AGTG CTTG ACCT TCTG CTGT-spacer-NH2 69.7

bar16 CTTG GCAA AGTG CTGT TCGT ACTC-spacer-NH2 69.7

bar17 TGTC TCTG AGTG CTTG CTCA ATCG-spacer-NH2 70.2

bar18 CGTT TCTG ACCT CTTG CCAT ATCG-spacer-NH2 70.4

bar19 TGTC CGTT ATCG CTCA TCTG TGTC-spacer-NH2 71.5

bar20 CCAT TCTG GTCT CTTG CGTT ATCG-spacer-NH2 71.5

2.通用芯片的制备

用厚约50微米的防水纸制成方形格栅，将其紧密贴于醛基化的玻片上，使玻片分割成10个互相分开的方形小区，  每个区的边长为9毫米。然后将氨基修饰的捕获探针以50μmol/L的浓度溶于3×SSC溶液中，用Pix sys 5500芯片制备仪(Catesian Technologies)点到醛基化玻片上的各个方形小区中，这样就得到了包含10个完全一样探针矩阵的芯片，探针矩阵的排列及芯片示意图见附图2，其中前三行的每一列分别对应检测一份标本的三个基因，最后一行分别用于检测三个基因的阳性对照及阴性对照，以监测实验是否成功，芯片点制完毕后晾干，放载玻片盒上室温放置备用。

3.炭疽检测特异引物及探针的设计与合成

以PXO1的pag基因、PXO2的cap基因以及染色体的rpoB基因为检测对象，参照引物设计原则，设计PCR扩增检测这些基因的上下游引物p1/p2，其序列见表2。报告探针F的设计可参照f复合探针设计的原则(Wang SQ et al，Anal.BioChem.2002)，引物与探针均用391A型DNA合成仪合成。

           表2  炭疽检测的特异引物及探针序列

靶基因名称               序列(5’→3’)                     序列位置(nt)

PXO1(pag)

F-PAG       CY3-ACA TGT ACA ATC GGA TAA GCT GCC ACA A-NH2    926-899

PAGp1           ACC AAT ATC AAA GAA CGA CGC                  1086-1066

PAGp2           ATC ACC AGA GGC AAG ACA CCC                  876-896

PXO2(cap)

F-CAP       CY3-ATC CAA GAG TAG CAA CCC TAA CAC CAT T-NH2    2548-2521

CAPp1           GCT CCT GCT ACA AAT GCA TCT G                2573-2552

CAPp2           GCT GAT CTT GAC TCC TGT GGG TG               2452-2474

染色体(rpoB)

F-rpoB      CY3-TCC AAA GCG CTA TGA TTT AGC AAA TGT-NH2      1871-1897

rpoBp1          CCA CCA ACA GTA GAA AAT GCC                  1821-1841

rpoBp2          ATG TTT CAG CTA AAC GTT GG                   1973-1954

4.寻址基因条码引物的设计

根据基因条码识别芯片的检测原理，所设计的报告探针应与连有条码识别序列的扩增片段互补才能通过芯片扫描检测出信号，因此将将与寻址捕获探针互补的序列与分别连于CAPp2、PAGp2、rpoBp2的5’端，合成时在两序列之间引入一个乙二醇作为间隔基团，以阻止PCR扩增，各引物序列及编号见表3。

表3  检测炭疽三个基因的含有基因条码序列的引物

编号                      序列(5’→3’)

rpoB

bar1R1  AACGTGAGACGATTGCCAGAAGAC-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGG

bar2R1  AACGAGTTACGAAGGTCAGATTGC-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGG

bar3R1  AACGGACAACGATCCTCAGAAGGT-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGG

bar4R1  AACGCAAGACGAAGACCAGATCCT-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGG

bar5R1  TGAGAACGTTGCACGAGACACAGA-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGG

bar16R1 GAGTACGAACAGCACTTTGCCAAG-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGG

bar19R1 GACACAGATGAGCGATAACGGACA-OCH2CH2O-ATGTTTCAGCTAAACGTTGG

CAP

bar6R1  TGAGAACGTTGCACGAGACACAGA-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTG

bar7R1  TGAGCAGATTGCACAGGACAAACG-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTG

bar8R1  TGAGACGATTGCCAGAGACAACAG-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTG

bar9R1  ACAGATGGGACATGAGTACCAACG-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTG

bar10R1 ATGGGACAAACGCAAGTACCTGAG-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTG

bar17R1 CGATTGAGCAAGCACTCAGAGACA-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTG

bar20R1 CGATAACGCAAGAGA CAGAATGG-OCH2CH2O-GCTGATCTTGACTCC TGTGGGTG

PAG

bar11R1 ACTCAACGGACAATGGTACCACAG-OCH2CH2O-ATCACCAGAGG AAGACACCC

bar12R1 AACCGACATACCTGAGATGGCAAG-OCH2CH2O-ATCACCAGAGGCAAGACACCC

bar13R1 ACGAAGGTACAGGACATTCGCAGA-OCH2CH2O-ATCACCAGAGGCAAGACACCC

bar14R1 ACGAACAGCAAGCACTTCTGGACA-OCH2CH2O-ATCACCAGAGGCAAGACACCC

bar15R1 ACAGCAGAAGGTCAAGCACTACGA-OCH2CH2O-ATCACCAGAGGCAAGACACCC

bar18R1 CGATATGGCAAGAGGTCAGAAACG-OCH2CH2O-ATCACCAGAGGCAAGACACCC

5.炭疽DNA的PCR扩增

将炭疽杆菌悬液在沸水中煮20min，然后10000rpm离心15min，收集上清，取5μl加入如下反应体系中：PCR Mix 20μl，上游引物0.5μM，下游寻址基因条码引物1μM，TaqPolymerase(5u/μl)0.2μl。94℃ 5min；[94℃ 20Sec，55℃ 30Sec，72℃ 10Sec]40 cycles；72℃3min。每个PCR管做上与寻址条码引物及对应标本相应的标志，以防弄混。同时设阳性对照及无模板阴性对照。扩增后将这些PCR产物等体积混匀，准备进行芯片杂交检测。

6.炭疽检测的阳性对照构建

分别以PAGp1/PAGp2、CAPp1/CAPp2和rpoBp1/rpoBp2为引物，提取的炭疽DNA为模板，进行PCR扩增，将扩增产物用Wizard PCR Preps DNA Purification System纯化后，连接到pGEM-T载体上，并转化至JM-109菌株中，挑取克隆，进行PCR及测序鉴定。重组质粒采用Wizard PlusSV Minipreps DNA Purification System提取。紫外定量后，备用。

7.寡核苷酸通用芯片处理

Oligochip先用0.2％SDS清洗2次，接着以水清洗2次，空气凉干。用NaBH₄溶液[100ml含20％乙醇的PBS溶液中加入1.3g NaBH₄]作用10min，封闭玻片表面的醛基。0.2％SDS清洗1次，水清洗1次，晾干后用于杂交。

8.杂交及其杂交条件的优化：将PCR混合物与杂交液按比例混匀后，取10μl加到芯片的各个方型小区上，并置于杂交盒中，在一定温度下杂交一定时间，芯片杂交完成后用洗液A(1×SSC，0.2％SDS)；洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)各清洗2分钟。然后用Axon4000扫描仪对其进行扫描，并记录结果，根据信号强度对结果进行判定。

(1)杂交体系的组成：5×SSC，0.2％SDS，10％甲酰氨，PCR混合物，0.02μM报告探针。

(2)杂交时间的确定：将同一杂交体系分成多份，分别加在多张芯片上于45℃进行杂交，在杂交5，10，20，30，60及90分钟分别取出一张芯片进行扫描，分析并比较结果显示(附图3)，随杂交时间的增长，信号逐渐增强，到30分钟后信号已基本饱和。

(3)杂交温度的确定：将同一杂交体系分成多份，分别加在多张芯片上，于37℃，42℃，45℃，50℃，55℃杂交30分钟后，取出芯片进行扫描，分析并比较结果显示(附图4)，42℃-50℃杂交信号强度无明显差异，37℃杂交则特异性较差，55℃杂交信号减弱。

9.通用芯片特异性分析

将基因条码引物用于扩增其对应的质粒，然后将这些PCR产物混合后进行杂交，但在杂交时只加入一种报告探针，其结果显示(见附图5)，当只加F-CAP报告探针时，只有bar6-10及bar17对应的点有信号，只加F-PAG时，只有bar11-15及bar18对应的点有信号，而当加F-rpoB报告探针时，bar1-5及bar16对应的点亮，说明探针之间互相不存在交叉杂交。

10.芯片检测灵敏度分析

将含炭疽CAP、PAG及rpoB基因的质粒10倍系列稀释，制成浓度为10⁶-10²拷贝/ul的系列模板，然后用基因条码引物分别扩增同一已知浓度的对应质粒，再将PCR产物混合后杂交，对杂交结果分析显示，芯片上每个点的检测限都能达到10⁴拷贝。

11.基因条码识别通用芯片分析多份标本

将提取的5份细菌DNA分别用基因条码引物进行PCR扩增，各取2uLPCR产物混合，加入0.02μM的三种报告探针，5×SSC，0.2％SDS，10％甲酰氨，使终体积为50μL，取出10μL加在通用芯片的一个小区上，放入杂交盒，置于45℃杂交30分钟后取出，甩去表面的杂交液，用Axon4000扫描仪扫描，其扫描结果见附图5，图中，bar1，bar6，bar11分别对应第一份细菌rpoB、CAP及PAG基因，从图看出，bar1，bar6亮，而bar11没有信号，说明该细菌不含PXO1质粒，而bar3，bar8，bar13对应的第三份细菌，三个点都亮，说明该细菌三个基因都有，以此类推，第二份细菌、第五份细菌PXO1质粒缺失，第四份细菌则包含完整的基因信息。

总之，利用本发明进行炭疽检测，不但可同时分析多份标本，还可同时分析炭疽的多个特异标志，确定细菌有无毒性，，可做为生物战剂检测、临床诊断、环境监测、卫生检疫等的分析工具，指导是否该采取措施尽快避免更大的危害。

Claims (7)

1.一种利用PCR技术结合基因芯片检测炭疽杆菌的方法及其在炭疽检测中的应用。其特征在于，针对炭疽PXO1、PXO2及染色体上的基因，设计合成特异扩增引物及报告探针，其中每组中各有一条引物向5’端延伸一段寻址条码序列，该序列与引物间有一间隔臂，可阻止PCR延伸，并且该序列与固定在通用芯片上的可寻址捕获探针互补，通过PCR扩增使产物的末端连上一段可寻址的条码序列，然后将所有PCR扩增产物混合，与报告探针一起加入到杂交体系，与通用芯片进行杂交，这样这些PCR产物上连接的可寻址条码序列与芯片上互补的识别捕获探针杂交，从而将扩增产物定向地锚定在芯片对应位置上，被锚定的PCR产物再与荧光等报告分子标记的特异报告探针杂交，通过信号扫描等分析即可检测出每份样品的结果。

2.权利要求1中PXO1上的基因可以包括pag、lef、cya等任何一个特异基因或片段，PXO2上的基因可以包括capA、capB、capC等任何一个特异基因或片段，染色体上的基因包括rpoB、Ba813、16sRNA等任何一个特异基因或片段。

3.根据权利要求1和2，一次杂交可以同时检测炭疽的三个标志物PXO1、PXO2及染色体DNA。

4.权利要求1中的靶特异报告探针，按照复合探针设计原则设计，长15-80mer，位于扩增片段内，5，末端标记荧光素或生物素等报告分子，且与连有可寻址条码序列的引物所延伸的链互补。

5.权利要求1中的芯片可被分隔成多个杂交孔，最佳为2-12个，每个杂交孔点制有相同的捕获探针阵列。

6.根据权利要求1，一条寻址条码序列可对应一份样本的一个基因，有多条寻址条码序列就可对应多份样本的多个基因，这样通过一次杂交就能同时检测出多份样本中炭疽标志物PXO1、PXO2及染色体等基因的表达情况。

7.根据权利要求5和6，每张芯片的每个杂交孔可以同时检测多份标本，最佳为2-96份。

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