CN100569955C - 多元基因探针检测转基因的方法及其装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用非PCR扩增的多元基因探针检测转基因的方法及装置，所述装置包括杂交样品池、定时器、检测样品池、恒电位仪、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机构成，其中检测样品池内安装有进样管、工作电极、对电极、参比电极、出样管；杂交样品池、检测样品池、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机依次相连；定时器与杂交样品池相连；检测样品池与恒电位仪相连。所述检测方法的特点是待测样品可以在仪器中用探针杂交筛选，然后进行电化学发光检测，判断待测样品是否含有转基因成分。本发明方法和装置检测灵敏度高、安全、快速、准确、操作简便。该方法可用于转基因植物、转基因粮食和转基因食品的检测。

Description

多元基因探针检测转基因的方法及其装置

技术领域

本发明涉及一种转基因检测方法，更详细的是一种非PCR扩增的多元基因探针检测转基因的方法及其装置。

背景技术

目前，基因检测的方法主要有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析；聚合酶链式反应-单链构象多态性分析；荧光能量传递技术(Taqman探针技术，LightCycler探针技术，Amplisensor探针技术，复合探针技术)；分子灯塔技术；基因探针技术等。但是，这些技术都存在各自的不足：有假阳性，灵敏度低，放射性元素，检测时有荧光背景，操作繁琐，检测时间长等。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种检测灵敏度高、安全、快速、准确、操作简便的非PCR扩增的多元基因探针检测转基因的方法，用于检测转基因植物、转基因粮食和转基因食品，待测样品可以在仪器中进行探针杂交反应，然后进行电化学发光检测。

本发明的目的还在于提供实现所述方法使用的非PCR扩增的多元基因探针检测转基因的装置。

本发明非PCR扩增的多元基因探针检测转基因的方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)用FOK I和BsrD I两种限制性内切酶对样品DNA进行酶切；

(3)用DNA凝胶回收试剂盒将酶切片纯化回收169bp的DNA片段；

(4)用一条标记有生物素和三条标记有三连吡啶钌的寡核苷酸探针与纯化DNA片段进行杂交；

非转基因样品DNA里面不含有169bp特异性序列，不能与探针杂交。

(5)杂交反应后的样品用链霉亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；

(6)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压，三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；

(7)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；

(8)计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。

本发明实现所述方法使用的非PCR扩增的多元基因探针检测转基因的装置包括杂交样品池、定时器、检测样品池、恒电位仪、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机构成，其中检测样品池内安装有进样管、工作电极、对电极、参比电极、出样管；杂交样品池、检测样品池、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机依次相连；定时器与杂交样品池相连；检测样品池与恒电位仪相连。

检测样品池可以用清洗液反复清洗。所述的计算机数据处理软件，如：微软公司的Excel软件。所述的光电倍增管，如PerkinElmer公司研制的光电倍增管系列，所述的计数卡，如台湾研华公司(Advantech)的PCL-836计数卡。

本发明的基本原理为：

根据绝大多数转基因植物种都采用了CaMV35S启动子，针对其设计四条寡核苷酸探针进行检测(其中一条标记生物素，其余三条标记三连吡啶钌)。提取转基因物种基因组DNA，经过Fok I和BsrD I两种限制性内切酶进行酶切并回收169bp目的片断，加入四种探针与目的片断杂交，生物素可以与包被有链霉亲和素的磁珠结合，进一步被磁极选择性吸附，从而起到筛选目标序列的作用。最终使只有同时杂交上三连吡啶钌和生物素的目标序列才能被收集到检测样品池中并检测到发光信号。在电场的作用下，三连吡啶钌复合物与三丙胺在阳极表面发生氧化还原反应，并放出一个光子。经过光纤收集到光电倍增管中，然后将其转化电信号，经过模数转换器，电信号被转化为数字信号，被计算机采集处理。通过发光信号的强度来区别目标序列进行定量。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

(1)电化学发光探针杂交仪可以对待测样品进行准确的检测。

(2)三条连有三连吡啶钌的探针与待测样品进行杂交，不仅可以提高检测的灵敏度，而且可以提高检测的特异性。

(3)电化学发光探针杂交仪检测灵敏度很高，并且可以有效的去除PCR中假阳性结果对检测结果的干扰。

(4)非PCR检测待测样品，可以排除PCR操作的复杂性。

(5)电化学发光探针杂交仪操作方便，安全，没有同位素等有害物质的使用。

(6)电化学发光探针杂交技术发光原理为电致发光，可以避免荧光PCR技术中荧光背景对结果的影响。

附图说明

图1是本发明装置结构框图；

图2是图1的装置的灵敏度测试图；

图3是实施例1用本发明装置检测转基因烟草中CaMV35S启动子发光信号对比图；(样品1为TE缓冲液+三丙胺(本底)，样品2为非转基因烟草(花叶青)，样品3为转基因烟草(K306-2)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步具体的描述，但本发明的实施方式不限于此。

图1给出了本发明基因检测的电化学发光PCR仪的具体结构示意图。由图一可知本装置包括：杂交样品池、定时器、检测样品池、恒电位仪、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机构成，其中检测样品池内安装有进样管、工作电极、对电极、参比电极、出样管。杂交样品池、检测样品池、光纤、光电倍增管、模数转换器、计算机依次相连；定时器与杂交样品池相连；检测样品池与恒电位仪相连。选用各构件组成本装置，其中：所述的光电倍增管，如PerkinElmer公司研制的光电倍增管系列。所述的计算机数据采集软件，如：National Instruments公司开发的LabVIEW软件。

如图2所示，本发明装置可以检测到0.1pmol的标记样品，并在样品含量0.1pmol至256pmol之间有很好的线性度。说明该仪器具有很高的灵敏度，而且可以进行定量的检测。

实施例1

将上述装置应用于转基因烟草的检测：转基因烟草中都含有CaMV35S启动子。

(1)提取非转基因烟草(花叶青)，转基因烟草DNA(K306-2)，转基因烟草(K306-13)，转基因烟草(G28-1)。

(2)在杂交样品池中加入烟草DNA，Fok I酶切反应体系，进行反应。

(3)用-20℃的无水乙醇沉淀DNA。

(4)在DNA中再加入BsrD I酶切反应体系，进行反应。

(5)使用DNA凝胶回收试剂盒，回收169bp片断大小的DNA。

(6)在回收的DNA样品中加入三条分别标记有三连吡啶钌和一条标记有生物素的寡核苷酸探针，控制温度95℃，5分钟，然后降温至55℃，30分钟，使样品和探针进行杂交反应；

(7)杂交反应后的样品用链霉亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；

(8)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压1.25V，使三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；

(9)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；

(10)使用计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。

如图3所示，是本例中用图1装置检测转基因烟草中CaMV35S启动子发光信号对比图。样品1为TE缓冲液十三丙胺(本底)，样品2为非转基因烟草(花叶青)，样品3为转基因烟草(K306-2)，样品4为转基因烟草(K306-13)，样品5为转基因烟草(G28-1)，由图可知本底与非转基因烟草的电化学发光信号值低于阈值，而三种转基因烟草电化学发光信号可以达到500左右。结果信号很明显，信噪比很高，可以准确的判断待测基因是否存在。

Claims (1)

1、一种多元基因探针检测转基因的方法，用于检测含CaMV35S启动子的转基因，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)用FOK I和BsrD I两种限制性内切酶对样品DNA进行酶切；

(3)用DNA凝胶回收试剂盒将酶切片纯化回收169bp的DNA片段；

(4)用一条标记有生物素和三条标记有三连吡啶钌的寡核苷酸探针与纯化DNA片段进行杂交；

(5)杂交反应后的样品用链霉亲和素包被的磁珠在缓冲液中进行连接、清洗、收集并转入检测样品池中；

(6)在检测样品池中加入三丙胺，给定电压，三连吡啶钌复合物与三丙胺发生电化学发光反应；

(7)通过光纤接收检测样品池中发出的光信号，通过单光子计数模块放大并转换成电信号，通过计数卡进行数据采集并导入计算机中进行处理；

(8)计算机根据采集的数据对待测序列进行定量分析。

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