CN1188531C - 对虾白斑综合症病毒基因诊断试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对虾白斑综合症病毒(WSSV，White Spot Syndrome Virus)的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以根据白斑综合症病毒基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对白斑综合症病毒的特异性DNA核酸片段进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于对虾各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

Description

对虾白斑综合症病毒基因诊断试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及水生经济动物病害的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对对虾白斑综合症病毒(WSSV，White Spot Syndrome Virus)基因诊断的试剂盒及检测方法。

背景技术

90年代以来，亚洲许多国家和地区虾病爆发性流行，对虾养殖产量锐减，造成了重大的经济损失。虾病尤其是对虾病毒病严重阻碍了对虾养殖业的持续发展。在众多的对虾病毒中，对虾白斑综合症病毒(WSSV)的危害最为严重，是对虾养殖业的头号杀手。关于WSSV的研究也是近年来水产养殖病害研究的热点。目前对于对虾病毒病还未有特效的治疗方法，推行对虾的健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对于对虾病毒的检测方法主要包括传统组织学方法、电子显微技术、生物指示法、生化检测法、免疫学方法(主要有荧光抗体技术、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫电镜技术、细胞培养方法、分子生物学方法(主要有分子杂交方法、聚合酶链式反应(PCR))等。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长，有些所需要的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大虾农掌握关键的技术难度很大，难以推广，限制了这些技术的应用和发展。

早期快速诊断对虾白斑综合症病毒是目前对虾养殖的主要预防措施和减少对虾损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大对虾养殖者急切盼望的。

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。

发明内容

本发明的目的是利用WSSV基因保守区序列设计两对引物，建立WSSV套式PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供对虾白斑综合症病毒的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可运用于对虾各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

本发明的对虾白斑综合症病毒的基因诊断试剂盒包括下列部件：

1).样品稀释液A液，1管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4；

2).模板提取液B液，1管，内装蛋白酶K；

3).PCR反应液C液，1管，内装PCR一扩反应液，包括ddH₂O、10×Buffer(含mg²⁺)、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE；

4).PCR反应液D液，1管，内装PCR二扩反应液，包括ddH₂O、10×Buffer(含mg²⁺)、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE；

5).阳性对照E液，1管，内装WSSV阳性DNA；

6).盒子；

7).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。

上述WSSV基因诊断试剂盒中所述的内外两对引物是根据WSSV基因保守区序列设计的，其DNA序列分别如下：

F1：5’-CGT GCC TGA ATC AGT ATG TAG GC

R1：5’-GAC GTT ACA ATA GAC CCA TGT TCG AT

F2：5’-CTC ATG TAC CAA ATC TGG GTT ACG A

R2：5’-CGA TAG ACC ACA AGT TCC GTA GGA

用本发明上述试剂盒检测对虾白斑综合症病毒的方法，按下列步骤进行：

1).取待测样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆；

2).6000～10000r/min离心5～10min；

3).取50μl上清加入1μl模板提取液B液，煮沸15～20min，立刻放于冰上5～10min；

4).8000～10000r/min离心10～15min，上清作为PCR模板；

5).分别取模板和E液，加入到PCR反应液C液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；

6).按下列条件扩增：

95℃2min预变性  →94℃ 45sec  34个循环→72℃  10min→4℃保存

                  55℃ 45sec

                  72℃ 1min

7).分别取一扩反应液，加入到PCR反应液D液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；

8).按下列条件扩增：

95℃ 2min预变性  →94℃ 45sec  34个循环→72℃  10min→4℃保存

                   55℃ 45sec

                   72℃ 1min

9).一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在328bp处出现明亮的反应条带，则为WSSV阳性；若无反应条带显示则进行PCR二扩反应；二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在258bp处出现明亮的反应条带，则为WSSV阳性，否则为阴性。

本发明的有益效果：

本发明的对虾白斑综合症病毒的基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据WSSV基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。利用该两对引物，可以特异性地扩增携带WSSV病毒的待测样品的有关基因片段，所建立的优化的套式PCR反应体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异地检测感染WSSV的对虾，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于对虾各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

附图说明

图1是感染白斑综合症病毒的对虾样品的PCR一扩检测结果。其中M：DNA分子量标准；1：WSSV阳性对照；2：WSSV阴性对照；3：检测样品；

图2是感染白斑综合症病毒的对虾样品的PCR二扩检测结果。其中M：DNA分子量标准；1：WSSV阳性对照；2：WSSV阴性对照；3-6：检测样品。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：对虾白斑综合症病毒的基因诊断试剂盒

该试剂盒由下列部件构成(10样份)：

1.样品稀释液(A液)，1管，5ml/管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4。

2.模板提取液(B液)，1管，10μl/管，内装蛋白酶K。

3.PCR反应液(C液)，1管，250μl/管，内装PCR一扩反应液(25μl体系)，包括ddH₂O、10×Buffer(含mg²⁺)、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE。

4.PCR反应液(D液)，1管，250μl/管，内装PCR二扩反应液(25μl体系)，包括ddH₂O、10×Buffer(含mg²⁺)、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE。

5.阳性对照(E液)，1管，20μl/管，内装WSSV阳性DNA。

6.长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm³。

7.一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于长方体盒子中。

该试剂盒中的内外两对引物的DNA序列如下：

F1：5’-CGT GCC TGA ATC AGT ATG TAG GC

R1：5’-GAC GTT ACA ATA GAC CCA TGT TCG AT

F2：5’-CTC ATG TAC CAA ATC TGG GTT ACG A

R2：5’-CGA TAG ACC ACA AGT TCC GTA GGA

该试剂盒中的E液为阳性对照液，包含WSSV病毒的DNA质粒标准。具体操作是在PCR反应后，用试剂盒回收相关片段，然后酶切，通过载体连接到质粒上，转入大肠杆菌E.coli，经氨苄培养基平板扩大培养，挑取阳性克隆，进一步酶切检查验证，测定质粒DNA的浓度，稀释到10⁸即为阳性对照标准。

PCR一扩反应液体系(25μl体系)如下：

ddH₂O                    19μl

10×Buffer(含mg²⁺)  2.5μl

dNTP                  0.4μl

外引物F1              0.4μl

外引物R1              0.4μl

TaqE                  0.3μl

PCR二扩反应液体系(25μl体系)如下：

ddH₂O               19μl

10×Buffer(含mg²⁺)  2.5μl

dNTP                  0.4μl

内引物F2              0.4μl

内引物R2              0.4μl

TaqE                  0.3μl

实施例2：对虾白斑综合症病毒的检测方法

使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行：

1.取待测样品0.05g，加入样品稀释液(A液)500μl稀释10倍，于匀浆器中冰浴匀浆。

2.6000r/min离心5min。

3.取50μl上清加入1μl模板提取液(B液)，煮沸15min，立刻放于冰上5min。

4.8000r/min离心10min，上清作为PCR模板。

5.分别取模板和E液2μl，加入到PCR反应液(C液)中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上。

6.按下列条件扩增：

95℃ 2min预变性   →94℃ 45sec  34个循环→72℃  10min→4℃保存

                    55℃ 45sec

                    72℃ 1min

7.分别取一扩反应液2μl，加入到PCR反应液(D液)中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上。

8.按下列条件扩增：

95℃ 2min预变性  →94℃ 45sec  34个循环→72℃ 10min→4℃保存

                   55℃ 45sec

                   72℃ 1min

9.一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在328bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为WSSV阳性，说明待测样品携带白斑综合症病毒(见图1)。若无反应条带显示则进行PCR二扩反应。二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在258bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为WSSV阳性，说明待测样品携带白斑综合症病毒，否则为阴性(见图2)。

Claims (2)

1.一种对虾白斑综合症病毒的基因诊断试剂盒，其特征是该试剂盒包括下列部件：

1).样品稀释液A液，1管，内装磷酸缓冲液，pH7.4；

2).模板提取液B液，1管，内装蛋白酶K；

3).PCR反应液C液，1管，内装PCR一扩反应液，包括ddH₂O、含mg²⁺的10×Buffer、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE；F1为：5’-CGT GCC TGA ATC AGT ATG TAG GC，R1为：5’-GAC GTT ACA ATA GAC CCA TGT TCG AT；

4).PCR反应液D液，1管，内装PCR二扩反应液，包括ddH₂O、含mg²⁺的10×Buffer、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE；F2为：5’-CTC ATG TAC CAA ATC TGG GTT ACG A，R2为：5’-CGA TAG ACC ACA AGT TCC GTA GGA；

5).阳性对照E液，1管，内装WSSV阳性DNA；

6).盒子；

7).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。

2.一种检测对虾白斑综合症病毒的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行：

1).取待测样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆；

2).6000～10000r/min离心5～10min；

3).取50μl上清加入1μl模板提取液B液，煮沸15～20min，立刻放于冰上5～10min；

4).8000～10000r/min离心10～15min，上清作为PCR模板；

5).分别取模板和E液，加入到PCR反应液C液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；

6).按下列条件扩增：

95℃ 2min预变性  →94℃ 45sec  34个循环→72℃  10min→4℃保存

                   55℃ 45sec

                   72℃ 1min

7).分别取一扩反应液，加入到PCR反应液D液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；

8).按下列条件扩增：

95℃ 2min预变性  →94℃ 45sec  34个循环→72℃ 10min→4℃  保存

                   55℃ 45sec

                   72℃ 1min

9).一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在328bp处出现明亮的反应条带，则为WSSV阳性；若无反应条带显示则进行PCR二扩反应；二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在258bp处出现明亮的反应条带，则为WSSV阳性，否则为阴性。

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