CN1180092C

CN1180092C - 石斑鱼病毒性神经坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN1180092C
Application number: CNB031143695A
Authority: CN
Inventors: 何建国; 黄剑南; 黄志坚; 邓敏; 吕玲; 陈晓艳; 翁少萍
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2003-05-06
Filing date: 2003-05-06
Publication date: 2004-12-15
Anticipated expiration: 2023-05-06
Also published as: CN1448520A

Abstract

本发明提供一种石斑鱼病毒性神经坏死病毒(VNNV，Viral Nervous Necrosis Virus)的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以根据病毒性神经坏死病毒保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对病毒性神经坏死病毒的特异性DNA核酸片段进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于石斑鱼各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

Description

石斑鱼病毒性神经坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及水生经济动物病害的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对石斑鱼病毒性神经坏死病毒(VNNV，Viral Nervous Necrosis Virus)基因诊断的试剂盒及检测方法。

背景技术

石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类之一，由于其生长快、市场价格高而稳定，因而倍受养殖者的欢迎，是我国南方传统海水养殖鱼类。近年来，随着我国海水养殖业的迅速发展，网箱养殖石斑鱼类的规模也不断扩大。由于养殖海区网箱数量增多，养殖密度增大，养殖水域环境逐渐恶化，疾病的发生也越来越频繁。常见病有寄生虫病、细菌病、病毒病等。在石斑鱼类的种苗生产过程中，不同的发育阶段，主要疾病的种类也不一样。在稚鱼期，主要疾病为病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis，VNN)。死亡率高达100％，可直接导致种苗生产的失败，是限制石斑鱼类养殖业的重要因素之一。目前对于石斑鱼病毒病还未有特效的治疗方法，推行石斑鱼的健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对于石斑鱼病毒的检测方法主要包括传统组织学方法、电子显微技术、生物指示法、生化检测法、免疫学方法(主要有荧光抗体技术、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫电镜技术、细胞培养方法、分子生物学方法(主要有分子杂交方法、聚合酶链式反应(PCR))等。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长，有些所需要的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大水产养殖户掌握关键的技术难度很大，难以推广，限制了这些技术的应用和发展。

早期快速诊断石斑鱼病毒性神经坏死病毒(VNNV，Viral Nervous Necrosis Virus)是目前石斑鱼养殖的主要预防措施和减少石斑鱼损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大水产养殖者急切盼望的。

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。

发明内容

本发明的目的是利用VNNV基因保守区序列设计两对引物，建立VNNV RT-PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供石斑鱼病毒性神经坏死病毒的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可运用于石斑鱼各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

本发明的石斑鱼病毒性神经坏死病毒的基因诊断试剂盒包括下列部件：

1).RNA提取液A液，2管，内装Trizol液；

2).B液，1管，内装氯仿；

3).C液，1管，内装异戊醇；

4).D液，1管，内装70％乙醇；

5).E液，1管，内装DEPC水；

6).RT反应液F液，1管，内装RT反应液，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H₂O、随机引物、RNA酶抑制剂RNasin RI、反转录酶M-MLV RT；

7).RT-PCR反应液G液，1管，内装RT-PCR反应液，包括10×Buffer(含Mg²⁺)、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH₂O和TaqE；

8).阳性对照H液，1管，内装VNNV阳性模板；

9).盒子；

10).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。

上述VNNV基因诊断试剂盒中所述的内外两对引物是根据VNNV基因保守区序列设计的，其DNA序列分别如下：

F1：5’-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT

R1：5’-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA

用本发明上述试剂盒检测石斑鱼病毒性神经坏死病毒的方法，按下列步骤进行：

1).取样品加A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆，室温静置3～5min；

2).在上述匀浆液中加入200μl B液，上下颠倒混匀，静置5～10min；

3).4℃，10000～12000r/min离心10～15min；

4).取400μl上清，加入到500μl C液中，轻轻晃动，静置10～15min；

5).4℃，10000～12000r/min离心10～15min；

6).弃上清，用1ml预冷的D液洗涤2次，4℃，7500～10000r/min离心5～10min；

7).空气干燥或在超净工作台上吹干，加50μl E液水溶解(若不能完全溶解可于55～60℃放置10～15min)，得到RNA提取液(可于-20℃保存)；

8).RNA提取液在95℃预热5～10min；

9).取2μl预热的RNA提取液，加入到F液中，37℃孵育1h。然后95℃水浴5～10min使失活，得到RT-PCR反应模板；

10).分别取模板和H液加入到G液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；

11).按下列条件扩增：

95℃10min预变性，→94℃40sec 35个循环→72℃7min→4℃保存；

55℃40sec

72℃40sec

12).反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在426bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为VNNV阳性，说明待测样品携带病毒性神经坏死病毒，否则为阴性。

本发明的有益效果：

本发明的石斑鱼病毒性神经坏死病毒的基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据VNNV基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。利用该两对引物，可以特异性地扩增携带VNNV病毒的待测样品的有关基因片段，所建立优化的RT--PCR反应体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异地检测感染VNNV的石斑鱼，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于石斑鱼各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

附图说明

图1是感染石斑鱼病毒性神经坏死病毒的石斑鱼样品的PCR检测结果。其中M：DNA分子量标准；1：VNNV阳性对照；2：VNNV阴性对照；3：检测样品。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：石斑鱼病毒性神经坏死病毒的基因诊断试剂盒

1.RNA提取液(A液)，2管，5ml/管，内装Trizol液。

2.B液，自备，主要为氯仿，200μl/份×10份，共2ml。

3.C液，自备，主要为异戊醇，500μl/份×10份，共5ml。

4.D液，自备，主要为70％乙醇，1ml/份×10份，共10ml。

5.E液，1管，0.5ml/管，内装DEPC水。

6.RT反应液(F液)，1管，0.1ml/管，内装RT反应液(10μl体系)，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H₂O、

随机引物、RNA酶抑制剂RNasin(RI)、反转录酶M-MLV(RT)。

7.RT-PCR反应液(G液)，1管，0.5ml/管，内装RT-PCR反应液(50μl体系)，包括10×Buffer(含Mg²⁺)、dNTP、正向引物、反向引物、ddH₂O和TaqE。

8.阳性对照(H液)，1管，20ul/管，内装VNNV阳性模板。

9.长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm³。

10.一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于长方体盒子中。

该试剂盒中的内外一对引物的DNA序列如下：

F1：5’-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT

R1：5’-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA

RT反应液体系(10μl体系)如下：

5×Buffer 19μl

dNTP 1μl

DEPC-H₂O 3.3μl

随机引物 1μl

RNA酶抑制剂RNAsin(RI) 0.2μl

反转录酶M-MLV(RT) 0.5μl

RT-PCR反应液体系(50μl体系)如下：

10×Buffer(含mg²⁺) 10μl

dNTP 1μl

正向引物F1 1μl

反向引物R1 1μl

ddH₂O 34.7μl

TaqE 0.3μl

实施例2：石斑鱼病毒性神经坏死病毒的检测方法

使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行：

1.取样品0.1g加1ml A液稀释，于匀浆器中冰浴匀浆，室温静置3～5min。

2.在上述匀浆液中加入200μl B液，上下颠倒混匀，静置5min。

3.4℃，12000r/min离心15min。

4.取400μl上清，加入到500μl C液中，轻轻晃动，静置10min。

5.4℃，12000r/min离心15min。

6.弃上清，用1ml预冷的D液洗涤2次，4℃，7500r/min离心5min。

7.空气干燥或在超净工作台上吹干，加50μl E液水溶解(若不能完全溶解可于55-60℃放置10min)。得到的RNA提取液可于-20℃保存。

8.将RNA提取液在95℃预热5min。

9.取2μl预热的RNA提取液，加入到F液中，37℃孵育1h。然后95℃水浴5min使失活，得到RT-PCR反应模板。

10.分别取2μl模板和H液加入到G液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上。

11.按下列条件扩增：

95℃10min预变性，→94℃40sec 35个循环→72℃7min→4℃保存

55℃40sec

72℃40sec

12.反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在426bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为VNNV阳性，

说明待测样品携带病毒性神经坏死病毒，否则为阴性(见图1)。

Claims

1.一种石斑鱼病毒性神经坏死病毒的基因诊断试剂盒，其特征是该试剂盒包括下列部件：

1).RNA提取液A液，2管，内装Trizol液；

2).B液，1管，内装氯仿；

3).C液，1管，内装异戊醇；

4).D液，1管，内装70％乙醇；

5).E液，1管，内装DEPC水；

6).RT反应液F液，1管，内装RT反应液，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H₂O、随机引物、RNA酶抑制剂RNasin RI、反转录酶M-MLVRT；

7).RT-PCR反应液G液，1管，内装RT-PCR反应液，包括含Mg²⁺的10×Buffer、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH₂O和TaqE；F1为：5′-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT，R1为：5’—CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA；

8).阳性对照H液，1管，内装病毒性神经坏死病毒阳性模板；

9).盒子；

2.一种检测石斑鱼病毒性神经坏死病毒的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行：

2).在上述匀浆液中加入200μlB液，上下颠倒混匀，静置5～10min；

3).4℃，10000～12000r/min离心10～15min；

4).取400μl上清，加入到500μlC液中，轻轻晃动，静置10～15min；

5).4℃，10000～12000r/min离心10～15min；

7).空气干燥或在超净工作台上吹干，加50μlE液水溶解，得到RNA提取液；

8).RNA提取液在95℃预热5～10min；

9).取2μl预热的RNA提取液，加入到F液中，37℃孵育1h，然后95℃水浴5～10min使失活，得到RT-PCR反应模板；

11).按下列条件扩增：

95℃10min预变性，→94℃40sec 35个循环→72℃7min→4℃保存；

55℃40sec

72℃40sec

12).反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经08％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在与阳性对照同一位置的426bp处出现明亮的反应条带，则为病毒性神经坏死病毒阳性，说明待测样品携带病毒性神经坏死病毒，否则为阴性。